KR20080084992A

KR20080084992A - 엘더베리 추출물의 용도

Info

Publication number: KR20080084992A
Application number: KR1020087015986A
Authority: KR
Inventors: 마들레인 멍쿠글루
Original assignee: 헬스케어 브랜즈 인터내셔날 리미티드
Priority date: 2006-01-17
Filing date: 2007-01-17
Publication date: 2008-09-22
Also published as: RU2008130825A; MX2008009117A; NO20083139L; IL173207A0; US20090186101A1; IL192700A0; AU2007206780A1; CN101384271A; WO2007083123A1; EP1976543A1; BRPI0706871A2; CA2632768A1

Abstract

본 발명은 바이러스 치료법에 관련된 것이다. 좀 더 특별하게는, 본 발명은 인플루엔자 (influenza) 바이러스 감염의 치료를 위한 약제학 공식의 준비에 있어 엘더베리 추출물의 용도에 관련한 것이다. 또한, 엘더베리 추출물의 투여를 통해, 조류 독감 바이러스(avian flu virus)의 새로운 치료방법에 관련한 것이다.

삼부콜, 조류 독감 인플루엔자 바이러스

Description

엘더베리 추출물의 용도{USE OF ELDERBERRY EXTRACT}

본 발명은 바이러스 치료분야에 관한 것이다. 보다 자세하게는, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 감염의 치료용 약제학적 제제의 제조에서의 엘더베리 추출물의 용도에 관한 것이다. 그것은 또한 엘더베리 추출물의 투여를 통한 조류 독감 바이러스의 치료의 새로운 방법에 관한 것이다.

본 출원 전반에 걸쳐 언급된 모든 간행물들은 그것들에 인용된 모든 참고자료를 포함해, 참고문헌으로 본 발명에 모두 포함된다.

극동지방부터 동부유럽 국가들에 이르기까지 조류 독감의 확산은 가능한 광역적인 인플루엔자의 연관성이 높으며 예방법 및/또는 치료법에 대한 조사를 위한 필요성을 강조하였다.

인플루엔자 바이러스는 RNA 바이러스의 광범위한 과(family) 즉, 오소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae, myxo=mucus)에 속한다. 밀접하게 연관된 RNA 바이러스과인, 파라믹소바이러스과(Paramyxoviridae) 바이러스 뿐만 아니라 오소믹소바이러 스과는 음성 가닥(negative strand)인 RNA 게놈(genome)이(분절되는 또는 분절되지 않는, 각각의), 스파이크들이 앞으로 뻗어 나오는 지질 이중 막 주변에 둘러싸인 내부 리보핵산 단백질(ribonucleoprotein:RNP) 코어(core)를 가지는 것을 특징으로 한다.

세 가지 종류의 스파이크(spike)가 있다: 적혈구를 교착시키는 해마글루티닌(Haemagglutinin:HA), 세포로부터 바이러스를 방출시키는 뉴라미니다제(Neuraminidase: NA) 효소, 및 이온 채널로서 사용되는 M2 단백질 적은 복제 수(copies). 인플루엔자에 있는(파라믹소바이러스과 바이러스에 있는 이러한 것들은 HN 및 F이다.) 이들 스파이크(spike)는 적혈구 등의 용혈 및 수용체(세포상) 항-수용체(바이러스 상) 결합의 깨짐인 혈구응집법(Haemagglutination)에 연관되있으며, 세포 내로 핵 단백질 코어를 들어가게 하는 바이러스의 능력을 반영한다.

지난 세기는 인플루엔자의 세 가지 유행병이 목격되었는데, 그 중 1918년 “스페니쉬 플루”(“Spanish flu”)가 가장 널리 유행했다. WHO(World Health Organisation) 및 세계적으로 전반의 전문가들은 근 미래에 새로운 인플루엔자 전염병이 발생할 것이라고 주장했다. 현재 세계적 관심은 조류 독감 A(H5N1) 바이러스인데, 이는 1997년 중국에서 조류들을 감염시키는 능력을 증명했으며, 조류들의 이동을 경유하여, 남동 아시아에 있는 다른 국가들 및 동부 유럽 국가들에도 확산되었다. WHO에 따르면, 2005년은 73건이 치명적이었던 전체 141의 확인된 인플루엔자 A(H3N1)의 인간 케이스로 마감되었다. [http://www. who.int/csr/disease/avian_influenza/en/index.html]. H5N1 지정은 인플루엔자 바이러스 명명을 위한 협약에 따랐다. H와 N은 각각 해마글루티닌과 뉴라미니다제를 나타낸다. 해마글루티닌은 인플루엔자 바이러스의 표면에 확인된 항원 글라이코프로테인이고, 이는 감염된 숙주세포에 바이러스를 결합시킨다. 뉴라미니다제는 인플루엔자 바이러스 표면에서 확인되는 글라이코프로테인 하이드롤라제 효소이다.

인플루엔자 바이러스는 “항원 소변이”(“antigenic drift”)및 “항원 대변이”(“antigenic shift”)로 알려진 두 가지 상이한 방법에서 변화할 수 있다. 항원 소변이는 인체의 면역체계에 의해 인식되어 지지 않을 수 있는 새로운 바이러스의 종을 생성하는 지속적으로 시간에 걸쳐 발생하는 바이러스에서의 작은 변화이다. 이것이 사람들이 한 번 이상 인플루엔자에 걸릴 수 있는 주요 원인 중 하나이다. 따라서, 독감으로부터 보호되길 원하는 사람들은 매년 독감 예방 주사를 맞을 필요가 있다. 항원 대변이는 새로운 해마글루티닌 및/또는 인체를 감염시키는 인플루엔자 바이러스에서 새로운 해마글루티닌 및 뉴라미니다제 단백질을 생기게 하는 인플루엔자 A 아형(subtype)상의 갑작스러우며, 주요한 변화이다. 대변이는 새로운 인플루엔자 A 아형(subtype)을 일으킨다. 대변이가 발생하면, 대부분의 사람들은 새로운 바이러스에 대항할 보호 장치가 적거나 없다. 인플루엔자 바이러스가 내내 항원 소변이에 의해 변화되는 동안, 항원 대변이는 때때로 발생하기만 한다. 유형 A는 두 가지 변화를 모두 겪는다: 인플루엔자 유형 B는 오직 항원 대변이의 좀더 점진적인 과정에 의해 변화한다.

그러므로, 엘더베리 추출물(또는 삼부콜(Sambucol^®))은 인플루엔자 바이러스 감염[US 4,742,046]에 효과적이었다는 보고가 있었음에도 불구하고, 본 발명자는 생체 내 및 시험관 내 모두에서, 조류 인플루엔자 H5N1에 대한 삼부콜(Sambucol^®)에 대한 효능에 대한 연구에서 출발하였다. 상기에서 언급한 바와 같이, 인플루엔자 유형 A의 H5N1 계통은 인플루엔자 바이러스의 비교적 새로운 계통이며, 백신 또는 해독제의 충분한 공급이 현재로서는 전혀 가능하지 않기 때문에 차 후의 인플루엔자 전염병의 예상되는 원인으로써 두려움의 대상이다.

삼부콜(Sambucol^®)은 유러피언 블랙 엘더베리(European Black Elderberry)(Sambucus nigra L.)의 기본적인 추출물을 기초로 하는 상품화된 허브제제이다. 엘더베리는 인동덩굴인, 인동과(Caprifoliaceae)의 구성원이다. 미국 딱총나무 무리(elder)는 캐나다딱총나무(Sambucus canadensis)로 구분되며, 삼부쿠스 캐룰리아(Sambucus caerulea)로는 블루 엘더(blue elder), 그리고 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra)로는 유러피언 블랙 엘더(European black elder)가 있다. 퍼플엘더는 유러피언 블랩 엘더의 변종인 삼부쿠스 니그라 푸푸레아(Sambucus nigra purpurea)이다.

삼부콜(Sambucol^®) 제제는(Razei Bar Industries, Israel)는 항바이러스 특징들을 가지고 있는 천연 성분들을 함유하고 있다[Flos Sambuci (2002) WHO monographs on selected Medicinal Plants 2:269-275]. 삼부콜(Sambucol^®)을 사용한 시험관 내 연구는 해모글루티네이션을 감소시키고 유형 A 칠면조 인플루엔자 바이러스를 포함하는 동물 계통 뿐만 아니라, 인체 인플루엔자 바이러스 A형 및 B형 의 복제를 제한하는 것을 보여준다[Zakay-Rones, Z. et al (1995) Inhibition of several strains of influenza virus in vitro and reduction of symptoms by an elderberry extract (Sambucus nigra L)during an outbreak of influenza B panama J. Altern. Complem. Med 1(4): 361-369]. 게다가, 두 개의 이중 맹검 위약 대조 임상적 시험은 인플루엔자의 치료와 증상에 있어 삼부콜(Sambucol^®)의 안정성 및 효능을 확립하였다. 두 개의 시험에서 삼부콜(Sambucol^®) 그룹은 표명된 개선점이 보였다(증상의 총체적인 시행과 심각성을 포함해서). 삼부콜(Sambucol^®)을 받은 환자들 각각은 대조군보다 일찍인 3,4일에 회복되었으며, 그 시험중 각각 6일과 8일에 비슷한 증상의 개선점을 얻을 수 있었다[Zakay-Rones (1995) ibid; Zakay-Rons, Z. (2004) Randomised study of the efficacy and safety of oral elderberry extract in the treatment of influenza A and B virus J. bit Med. Res. 32(2): 132-140].

US 4,742,046은 바이러스 A/PR/34 CHON1, 즉 인플루엔자 바이러스 유형 A상에서 분류된 엘더베리 추출물의 활성을 기술했다. 보다 상세하게는, 삼부쿠스 유래 랙틴(lectin)의 활성이 시험되었다. 본 발명에서, 발명자들은 조류 독감 바이러스의 가장 최근 발생에 연관된 H5N1, 인플루엔자 유형 A 바이러스로 감염된 세포에 삼부콜(Sambucol^®)로서 천연의 엘더베리 추출물을 적용하였다.

결국, 본 발명의 목적은 조류 독감 인플루엔자의 치료에 있어 삼부콜(Sambucol^®), 즉 블랙 엘더베리 추출물의 용도를 제공하는 것이다. 특히, 본 발명은 개체에 엘더베리 추출물의 투여를 통한, 바이러스 활성 및/또는 감염성의 억제를 제공하기 위함이다.

첫 번째 양태로서, 본 발명은 개체에서 인플루엔자 바이러스 감염의 치료를 위한 약제학적 제제의 제조에의 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L)의 용도를 제공하는 것이다. 특히, 상기 인플루엔자 바이러스 감염이 인플루엔자 유형 A 바이러스 H5N1에 의해 야기되었으며, 상기 감염 개체는 인간이다. 바람직하게는 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L)은 삼부콜(Sambucol^®)이다.

두 번째 양태로서, 본 발명은 개체에 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L) 추출물의 치료적 유효 용량을 투여하는 것을 포함하는 상기 방법, 인플루엔자 바이러스 감염을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 특히, 상기 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 유형 A 바이러스 H5N1에 의해 야기되었으며, 상기 감염 개체는 인간이다. 바람직하게는 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L)은 삼부콜(Sambucol^®)이다.

추가적인 양태로서, 본 발명은 환경(environment), 예를 들어 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L) 추출물의 유효 용량을 사용하여 인플루엔자 바이러스에 감염된 세포에 접촉시키는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 방법을 제공하는 것이고, 이때 상기 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 유형 A 바이러스 H5N1이다. 바람직하게는 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L)은 삼부콜(Sambucol^®)이다.

본 연구의 목적은 조류 독감 인플루엔자 NIBRG-14(H5N1) 바이러스에 대한 표준화된 블랙 엘더베리 추출물, 즉 삼부콜(Sambucol^®)의 항 바이러스 활성을 결정하기 위한 것이다. 항 바이러스 시험은 몇몇 배양 시각에 두 개의 삼부콜(Sambucol^®) 희석액을 사용한 MDCK 세포에서 시행되었다. 결과는 조류 독감 인플루엔자 NIBRG-14(H5N1)의 역가(titer), 다시 말해 2.0 log₁₀TCID/ml의 99%이상 감소하는 것을 보여준다. 치료 지수 산정은 역가 감소에서 삼부콜(Sambucol^®)의 직접적인 영향을 시사한다. 추가적인 본 연구는 동물 및 인간에게서 조류 독감 인플루엔자 (H5N1)에 대한 삼부콜(Sambucol^®)의 효능을 측정하였다.

여기에 나타난 결과는 엘더베리 추출물(삼부콜(Sambucol^®))이 하기 특징들 중 하나 이상을 갖는 것을 제안한다:

-해마글루티네이션(haemagglutination)을 유도하는 바이러스 억제 가능성;

-허용 가능한 숙주 세포로의 바이러스 흡수의 억제 가능성;

-감염되기 쉬운 숙주 세포내로의 바이러스 침투를(예를 들어 엔도사이토시스(endocytosis)) 억제 가능성;

-바이러스 자손의 번식을 억제함으로 인한, 바이러스 복제 억제 가능성.

일반적으로 본 발명의 엘더베리 추출물을 사용하여 치료될 인플루엔자 바이러스로 감염된 숙주 세포는, 상피 세포, 또는 기도에 있는 세포이다.

본 발명에 기재된 분리된 엘더베리 추출물은 바이러스 감염에 대한 개체의 치료에 효과가 있다. 본 발명에 따르면, “치료”(“treatment”)는 바이러스 감염의 치료학적 조치 또는 감염성 있는 바이러스, 특히 조류 인플루엔자 유형 A (H5N1) 바이러스에 노출시킨 물질에 있어 바이러스 감염 형성의 예방을 야기하는(프로필라틱 트리트먼트(prophylactic treatment))어떤 생리적인 효과를 의미한다.

이러한, 본 발명의 내용에 있어, 치료법은 다음에 나오는 것 중 하나 이상에 관련된 것이다; 감염되기 쉬운 세포에 대한 바이러스 흡수의 억제, 감염되기 쉬운 세포로 바이러스 침투의 억제, 바이러스 복제 억제, 개체에서 바이러스 수를(적은 항체 반응) 감소시키고, 바람직하게는 개체로부터 바이러스의 총체적인 제거를 야기시킨다. 치료는 바람직하게는 바이러스 감염으로부터 개체의 향상되고 보다 빠른 회복 또는 감염의 발생을 억제하는 결과를 낳는다.

엘더베리 추출물의 유효 용량은 당해 기술 분야에서 알려질 수도 있는 그러한 고안에 의해 결정된다. 용량은 요구되는 치료상 또는 상기 기재된 프로필라틱 효과(prophylactic effect)를 얻는 데 효과적이어야만 한다. 그 용량은 적절히 고안된 연구에서 결정되며 당해 기술 분야에서의 당업자는 요구되는 유효 용량을 결정하기 위해 그러한 연구를 어떻게 적절히 수행하는지 알 수 있을 것이다.

본 발명에 따른 바이러스 감염은 바람직하게는 기도 내, 상위 기도 또는 하위 기도, 또는 모두에 바람직하게 지역화된 감염이다.

일 실시예에 따르면, 감염의 원인이 되는 바이러스는 오소믹소바이러스과(Orthomyxoviridae)의 구성원이다. 특정 실시예에 따르면, 바이러스는 인플루엔자 바이러스, 특히 조류 인플루엔자 유형 A(H5N1)에서 선택되었다.

바이러스 감염 및 특히 인플루엔자 H5N1 바이러스 감염이 동물에서 동물로 전이될 수도 있으며, 동물에서 인간으로, 그리고 인간에서 인간으로 그리고 인간에서 동물로도 전이될 수 있는 것은 일반적으로 알려져 있다.

그러므로, 본 발명은 상기 바이러스가 동물에서 인간으로 전이되는 동물-유형 바이러스, 그리고 그 반대(인간에서 동물로 전이)인 개체를 치료하는 것에 또한 적용가능하다. 그러므로, 본 발명의 엘더베리 추출물에 의한 치료되는 개체들은 인간, 또는 오리, 닭, 거위, 칠면조, 꿩, 메추라기, 비둘기(dove), 큰 비둘기(pigeon), 타조, 조류(partridge), 돼지, 소, 버팔로, 양(sheep), 염소(goat), 또는 말과 같은 동물 일수도 있다.

엘더베리 추출물은 항 바이러스 치료를 위한 적절한 다양한 방법으로 투여될 수 있다. 건조 추출물(예를 들어 파우더)로, 또는 선택된 운반 경로에 대한 적절한 운반체 내로 투여될 수 있음을 알아야 한다. 추출물은 어떤 적절한 경로, 예를 들어, 경구 또는 비강내 적용, 예를 들어 흡입에 의해 투여될 수 있다.

여기에 기재된 엘더베리 추출물은 바람직하게는 경구 투여로 될 수 있고 그리고, 예를 들어 정제, 코팅된 정제, 츄잉 정제(chewing tablet), 다중-층으로 된 정제 및 캡슐들과 같은 고체 형태뿐만 아니라, 예를 들어 시럽 또는 경구 분무기와 같은 액체 형태로 투여될 수 있다. 다양한 투여 형태들이 활성 성분들의 지속 방출을 위해 디자인될 수 있다.

본 발명에 따른 액체 수성 제제의 예는, 항 바이러스 활성 삼부쿠스 니그라(Sambucus nigra) 추출물 및 선택적인 첨가물로서 라스베리 주스(raspberry juice), 구연산, 천연 또는 합성 달콤한 및/또는, 꿀과 같은 향미제, 및 p-하이드록시밴조익 산(p-hydroxybenzoic acid) 유도체들 같은 통상적인 보존제를 포함하는 시점이다.

정제 형태로의 고체 제제는 항 바이러스 활성 추출물에 추가적으로, 솔비톨(sorbitol), 자일리톨(xylitol) 및 임의적으로 비타민 C가 포함될 수도 있다.

본 발명의 엘더베리 추출물의 특정한 제제는 다음 성분들을 포함한다: 글루코오스 시럽, 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L) 추출물(38% w/w), 라스베리 추출물(raspberry extract), 구연산, 천연 향료 및 보존제.

다른 하나의 실시예에 따르면, 분리된 추출물은 예를 들어, 드롭스(drops) 또는 스프레이로서 비강내 투여를 위해 물 또는 등장성 식염수, 완충 된(buffered) 또는 비완충 된(unbuffered), 또는 현탁액과 같은 용액의 형태로 투여된다. 바람직하게는, 그러한 용액 또는 현탁액은 비 분비물(nasal secretions)에 대해 등장성이고, 예를 들어, 약 pH4.0부터 약 pH7.0까지, 또는 pH6.0부터 pH7.0까지의 범위에 대략 같은 pH이다. 버퍼는 생리적으로 사용가능하여야 하며 간단히 예를 들어, 인산화 버퍼를 포함하고 있어야 한다. 예를 들어, 대표적인 비 충혈 제거제는 약 pH6.2로 완충된 것으로 기재되어 있다[Remington's Pharmaceutical Sciences, Ed. By Arthur Osol, pl445 (1980)]. 물론, 당업자는 손쉽게 적합한 염분 성분 및 비 투여를 위해 해가 없는 수용성 운반체를 위한 pH를 결정할 수 있다.

다른 것으로, 비강내 투여의 비제한적인 예들은 약 10에서 3000cps 또는 약 2500에서 6500cps 또는 보다 큰, 점도를 가진 비 겔(nasal gel), 크림, 페이스트(paste), 연고(ointment)를 포함하고, 그것들은 비 점막 표면에 더욱 지속적인 접촉을 제공할 수도 있다. 그러한 운반체 점막성 제제는, 간단히 예를 들어서, 알킬셀룰로오스(alkylcellulose) 및/또는 당해 기술분야에서 잘 알려진 고점도의 생체 적합성인 운반체(carrier)와 같은 중합성 운반체(polymeric carrier)를 근간으로 한다[앞에서 인용된 Remington's 참조]. 분리된 분획(fraction)을 포함하는 운반체 역시 거즈와 같은, 직물성 물질로 스며들게 할 수도 있고, 이것은 점막에 투과시키기 위한 분리된 분획 내의 활성 물질을 위해 허용되도록 비 점막 표면에 적용될 수 있다.

다른 성분으로, 당해 분야의 알려진 보존제, 색소, 윤활유 또는 점성 미네랄 또는 식물성 유지, 향수, 아로마 오일과 같은 천연 또는 합성 식물 추출물, 및 예를 들어, 글리세롤과 같은 습윤제 및 점성 향상제가 제형을 위한, 추가적인 점성, 습윤 보유력 및 좋은 질감(texture) 및 향기를 제공하기 위해 역시 포함될 수 있다.

게다가, 분리된 분획(fraction)의 용액 또는 현탁액의 비 투여(nasal administration)를 위한, 다양한 방책들이, 액적(drop), 미소액적(droplet) 및 스프레이의 생성을 위해 당업계에서 이용가능하다. 예를 들어, 분리된 분획을 포함하는 용액은 내용물이 한 말단에 부착되는, 수공으로 힘을 주는 펌프(pump), 예를 들어, 유연한 고무 벌브(bulb)에 의해 공급되는 공기압을 사용하여 성분들이 한 방울씩 배출되게 하는 유리, 플라스틱, 금속 디스팬싱(dispensing) 튜브(tube)를 포함하는 간단한 드로퍼(dropper)(또는 파이펫(pipette))를 사용하여 비 통로(nasal passage)로 투여될 수 있다.

미세한 작은 물방울 및 스프레이는 당해 기술 분야에서 잘 알려진 바와 같이, 예를 들어, 비 통로로 공기 및 미세한 작은 물방울의 혼합물을 불어 넣도록 고안된 수공이나 전기적으로 동력이 있는 비강내 펌프 디스팬서(intranasal pump dispenser) 또는 스퀴즈 바틀(squeeze bottle)에 의해 공급될 수 있다.

추출물은 그 자체로서 또는 활성물질인, 엘더베리 추출물을 포함하는 조성물의 형태로 투여될 수도 있다. 그러한 조성물은 추가로 각각 특이적인 환자들의 치료의 부분이 될 수도 있는 추가적인 활성 제제들을 선택적으로 포함할 수도 있다. 따라서, 예를 들어, 상기 조성물들은 더 나아가 선택적으로 항생제, 비타민 등을 포함할 수도 있다.

약제학적인 조성물 및 제제의 제조는 당해 기술 분야에서 잘 알려져 있으며 많은 문헌 및 텍스트 북(textbook), 예를 들어 Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro A. R. ed, Mack publishing Co., Eaton, PA, 1990 and especially pp. 1521-1712에 나타나 있다.

본 발명은 청구항, 명세서의 개시 안에 포함됨으로써 이해하게 되는 내용들에 정의되어 있다.

개시되고 기재된 바에 의하면, 그러한 공정 단계 및 물질이 다소 다양할 수도 있기 때문에 본 발명이 여기에서 기재된 특별한 예, 공정 단계 및 물질들에 제한되지 않는 것으로 이해된다. 여기서 사용된 전문적 술어(terminology)는 단지 본 발명의 범위가 단지 첨부된 청구항 및 이의 등가물에 의해 제한될 것이기 때문에 특별한 실시예를 설명하기 위한 목적을 위해 사용되었고, 제한하기 위해 사용되는 것은 아니다.

명세서 및 첨부된 청구항에서 사용된, “하나”(“a”, “an”) 및 “그”(“the”)의 단수 형태는 내용이 분명히 다른점에서 구술하지 않는다면 복수의 레퍼런트(referent)를 포함하는 것을 명심하여야 할 것이다.

본 명세서, 및 후술되는 청구항을 통틀어, 문맥이 다르게 요구하지 않는다면, “포함한다”(“comprise”)란 용어와 “포함한다”(“comprises”)와 “포함”(“comprising”)과 같은 변화형은, 언급한 완전체(integer), 단계(step), 또는 완전체 또는 단계의 군을 포함하는 것을 의미하며 다른 완전체 또는 단계 또는 완전체의 군 또는 단계들을 배제하는 것이 아님을 이해할 것이다.

하기의 실시예는 본 발명의 양태를 수행함에 있어 발명자에 의해 적용된 기술의 대표물이다. 이 기술들은 본 발명의 실시를 위한 바람직한 실시예의 예로 평가되어야 하며, 당해 기술 분야에서의 기술자들은, 본 기재에 비추어, 본 발명의 의도된 범위에서 벗어나지 않는 수많은 변경을 만들 수 있다는 것을 인식할 것이다.

도 1은 세포에 적당히 희석시킨 삼부콜(Sambucol^®)은 비독성임을 나타내는 도면이다.

MDCK 세포는 4시간동안 삼부콜(Sambucol^®)을 순차적인 희석액을 가지고 배양하였다. 후에, 크리스탈 바이올렛 시험(crystal violet test)을 시행하였고 세포 활성은 광학 밀도에 의해 측정되었다. 데이터는 양성 대조군(세포만)에 비교함으로써 생존 비율로 나타내었다.

도 2는 삼부콜(Sambucol^®)은 극적으로 NIBRG-14 용량을 감소시킴을 나타낸 도면이다.

조류 인플루엔자 바이러스 NIBRG-14는 삼부콜(Sambucol^®)을 희석액 중 1/4(A)와 1/8(B)또는, 바이러스가 MDCK 세포를 감염시키는데 허용하기 전에 다른 시간 간격을 위해 구연산 버퍼(항바이러스 대조군)을 사용하여 배양하였다. 3일 후에, 바이러스 역가가 측정되었다. 그래프 디스플래이는 -log₁₀ TCID₅₀/ml 로서 결과가 나왔다. 바이러스 역가는 항 바이러스가 깔린 구연산 버퍼에서 회복되었다. 이 시험의 더 낮은 검출 한계는 y축상에 나타난 바와 같이 0.5-log₁₀ TCID₅₀/ml이다. TCID=조직 배양 감염 용량.

본 연구는 Retroscreen Virology Ltd., St Bartholomew's & The Royal London School of Medicine & Dentistry, University of London의 실험실에서 수행되었다.

모든 배양은 다르게 특정되지 않는다면 37℃, 5% CO₂에서 시행하였다.

바이러스

사용된 바이러스는 A/PR/8 백본(backbone), Ha 및 Na 유전자가 낮은 병원성을 갖는 H5N1 분리물(isolate)(A/Vietnam/ 1194/04)을 형성하는 것을 특징으로 하는 인플루엔자 N1BRG-14(H5N1)이었다(National Institute for Biological Standards and Control로부터 제공 받음).

삼부콜 ( Sambucol ^® )( 엘더베리 추출물)

삼부콜(Sambucol^®)은 살균한 필터된 희석되지 않은 제제로서 공급되었다. 시험 희석은 원 조제의 1/4 및 1/8이었다. 살 바이러스 시험(the virucidal assay)에서 삼부콜(Sambucol^®)의 각각의 희석은 바이러스를 사용하여 혼합하면서 9/10 희석하였다.

특히, 삼부콜(Sambucol^®) 시럽은 통상 다음을 함유한다(g/100ml):

- 글루코오스 시럽(85)

- 엘더베리 추출물(37.5)

- 라스베리 추출물(1)

- 구연산(0.5)

- 천연 향(Natural flavour)(1)

- 보존제.

하기의 삼부콜(Sambucol^®) 정제와 비슷하게, 낮은 칼로리 시럽은 글루코오스 시럽 대신에 액체 솔비톨(sorbitol)을 포함한다.

삼부콜(Sambucol^®)정제는 통상 다음을 포함한다:

- 블랙 엘더베리 추출물(Black elderberry extract)(동결 건조된)

- 솔비톨(Sorbitol)

- 바타민 C

표적 세포

MDCK (Madin-Darby Canine Kidney Epithelial cells)가 사용되었다. 5×10⁴cells/ml인 100㎕ 세포 부유액을 96-웰(well) 플레이트(plate)에 각각 접종하고 24시간 동안 배양한다. 시험에 있어 사용전에, 플레이트(plate)는 PBS(100㎕/well)로 두 번 세척하고 100㎕ 기본 MDCK 배양 배지를 각 웰에 참가한다.

삼부쿠스 니그라 L( Sambucus nisra L) 추출물의 제조

삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nisra L) 추출물(삼부콜(Sambucol^®))은 이미 [US 4,742,046]에 기재된 바대로 준비되었다. 간결하게, 삼부쿠스 니그라 (Sambucus nisra)(역시 엘더베리로 알려진)는 씨앗의 쪼개짐이 없이 압력을 가하고 추출물은 울트라 원심분리 후에 회수하여 여과를 한다.

실시예1 : 세포독성

크리스탈 바이올렛 어세이(Crystal Violet assay)

크리스탈 바이올렛 어세이(Crystal Violet assay)는 삼부콜(Sambucol^®)의 다양한 농도로 배양한 후 MDCK 세포의 생존가능성을 측정하기 위해 사용되었다. 그 결과는 도1에 나타나 있다.

삼부콜(Sambucol^®)의 1:80 또는 그 이상으로의 희석은 완벽하게 MDCK 세포에서 삼부콜(Sambucol^®)의 독성 효능을 제거하였다.

세포 관찰

이 시험에서 독성에 대한 생존가능성은 역치(threshold) 90%에 이른다고 생각된다.

실시예 2: 바이러스 역가 감소 시험

바이러스 40㎕(반에서의 총 역가 4.0-log₁₀ TCID₅₀/ml)는 360㎕ 시험 샘플에 추가되고 상온에서 0.5, 5, 10, 30, 및 60분 동안 배양되었다. 반응 혼합물은 표적 세포에 첨가되고 10배 희석 시리즈 따라 95-웰(well) 플레이트(plate)를 교차 적정하였다. 플레이트는 이후 60분 동안 배양하였다. 상층액은 제거되고, 플레이트는 100㎕ 기본 감염 배지를 각 웰에 첨가하기 전에 PBS로 두 번 세척한다. 포인트 바이러스 역가(point viral titre)를 측정할 때 세포는 3일간 배양하였다.

항 바이러스 양성 대조군은 pH 3.5에 구연산 버퍼로 바이러스를 5분간 사전 처리한 것으로 구성된다(인플루엔자 A 바이러스에 대한 항 바이러스 활성을 보이는 구연산 버퍼의 알려진 배양 시간 포인트-간행되지 않은 데이터).

치료 지수

치료 지수는 숙주 세포에 반대되게 기질의 바이러스에 대한 바이러스의 독성의 특징(specificity)을 가리키는 것으로, 그리고 그것은 세포 생존력에의 감소에 대한 바이러스 역가에의 감소의 비율로써 표현된다.

그 산정은 바이러스 적정에 있어 감소가 직접적으로 삼부콜(Sambucol^®)의 존재 때문이라는 것을 보여준다.

표1은 바이러스 역가 시험의 감소로부터 나온 데이터의 분석을 보여준다. 표에서 나타난 값으로부터 나온 것으로서, 삼부콜(Sambucol^®)은 농도와 시험된 모든 타임 포인트에서 99%이상 감염된 MDCK 세포로부터 회복된 바이러스 역가를 감소시킨다.

감소되는 바이러스 역가에 있어 삼부콜(Sambucol^®)이 99% 이상 효과를 보인다.

배양 시간(분)	삼부콜(Sambucol^®) 1/4 희석		삼부콜(Sambucol^®) 1/8 희석
배양 시간(분)	(-log₁₀ TCID₅₀/ml)	(%)	(-log₁₀ TCID₅₀/ml)	(%)
0.5	>4.0	>99.90	2.0	99.0
5	3.0	99.90	>3.0	>99.90
10	3.0	99.90	>3.0	>99.90
30	3.0	99.90	>3.0	>99.90
60	3.5	99.97	>4.0	>99.90

본 연구는 조류 NIBRG-14(H5N1) 인플루엔자 바이러스에 대한 삼부콜(Sambucol^®)의 항 바이러스 활성을 측정하는 것이 목표이다. 1/4 및 1/8 희석물은 99% 이상 효과를 보이고 2.0-log₁₀ TCID₅₀/ml에 의한 조류 독감 인플루엔자 NIBRG-14(H5N1)의 역가를 감소시킨다. 1-log₁₀ TCID₅₀/ml의 감소는 이미 중요하게 간주되었다[Oxford, J. S. et al. (1994) Sodium deoxycholate exerts a direct destructive effect on HIV and influenza viruses in vitro and inhibits retrovirus- induced pathology in an animal model. J. Antimicrob Chemother 45(5):617-621]. 삼부콜(Sambucol^®)은 따라서 조류 인플루엔자 NIBRG-14(H5N1) 바이러스 역가의 감소에 매우 효과적이었다. 삼부콜(Sambucol^®)은 감소되는 바이러스 역가로 양성 대조군인 구연산 버퍼에서 효과가 있다. 삼부콜(Sambucol^®)의 두 희석물에 대한 치료지수는 적정 감소가 조류 인플루엔자 NIBRG-14 바이러스에 있어 삼부콜(Sambucol^®)의 활성때문이라는 것을 지적한다.

기존에는 생체 내 및 시험관 내에서 인간 인플루엔자 바이러스 A와 B에 대하여 효과를 보인 삼부콜(Sambucol^®)은, 현재는 조류 인플루엔자 H5N1 바이러스에 대한 항 바이러스 특징을 가지는 것으로 증명된다.

실시예 3: H5N1 인플루엔자 바이러스 치료를 위한 삼부콜(Sambucol ^® )의 생체 내 투여

4내지 6주령되는 마우스들의 4그룹이 실험에 사용되었다. 그룹Ⅰ은 인플루엔자 유형 A 바이러스(H5N1)을 투여하였다. 그룹Ⅱ는 이미 삼부콜(Sambucol^®)을 처리한 인플루엔자 유형 A 바이러스(H5N1)를 투여하였다. 그룹Ⅲ은 삼부콜(Sambucol^®)만 투여하였다. 그룹Ⅳ는 바이러스 또는 삼부콜(Sambucol^®)이 없는 대조 그룹이다.

예비 결과는 그룹Ⅲ 및 그룹Ⅳ에서 사망률이 없다는 것을 보여주며, 본 발명의 제제가 동물에서 독성이 없다는 것은 고무적이다.

본 발명의 목적은 조류 독감 인플루엔자의 치료에 있어 삼부콜(Sambucol^®), 즉 블랙 엘더베리 추출물의 용도를 제공하는 것으로서, 특이하게는, 개체에 엘더베리 추출물의 투여를 통해, 바이러스 활성 및/또는 감염성의 억제를 제공하기 위한 조류 독감 인플루엔자 NIBRG-14(H5N1) 바이러스에 대한 블랙 엘더베리 추출물, 즉 삼부콜(Sambucol^®)의 항 바이러스 활성을 측정하기 위한 것이다.

항 바이러스 시험은 순차적인 배양 시간에 두 개의 삼부콜(Sambucol^®) 희석액을 사용한 MDCK 세포에서 시행한 결과 조류 독감 인플루엔자 NIBRG-14(H5N1)의 역가, 다시 말해 2.0log₁₀ TCID/ml의 99%이상 감소하는 것을 보여준다. 또한 치료학상 색인 추정을 통하여 적정 감소에서 삼부콜(Sambucol^®)의 직접적인 영향을 시사함은 물론, 더 나아가 연구는 동물과 인간에게서 조류 독감 인플루엔자 (H5N1)에 대한 삼부콜(Sambucol^®)의 뛰어난 효과를 보여 산업상 이용가능성이 용이함을 알 수 있다.

Claims

개체내의 인플루엔자 바이러스 감염의 치료를 위한 약제학적 제제의 제조에 있어서의 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L.) 추출물의 용도.
청구항 1항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 유형A 바이러스 H5N1에 의한 것인 용도.
청구항 1항 또는 청구항 2항에 있어서, 개체는 인간인 것으로 하는 용도.
청구항 1항 내지 청구항 3항 중 어느 한 항에 있어서, 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L.) 추출물은 삼부콜(Sambucol^®)인 것인 용도.
개체에 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L.) 추출물의 치료학적으로 유효 용량을 이를 필요로 하는 감염체에 투여하는 것을 포함하는 인플루엔자 바이러스 감염 치료 방법.
청구항 5항에 있어서, 인플루엔자 바이러스 감염은 인플루엔자 유형 A 바이러스 H5N1에 의한 것인 방법.
청구항 5항 또는 청구항 6항에 있어서, 개체는 인간인 것인 방법.
청구항 5항 내지 청구항 7항 중 어느 한 항에 있어서, 삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L.) 추출물은 삼부콜(Sambucol^®)인 것인 방법.
삼부쿠스 니그라 L(Sambucus nigra L.) 추출물의 유효량을 사용하여 인플루엔자 바이러스를 가지고 있는 감염 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 인플루엔자 바이러스 감염을 억제하는 방법.
청구항 9항에 있어서, 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 유형 A 바이러스 H5N1인 것인 방법.