JP2023544454A - 植物抽出物を含む製剤 - Google Patents

Abstract

本発明は、一般に、ウイルス感染及び細菌感染の治療または予防に有用な植物抽出物を含む配合物及び組成物に関する。特に、本発明は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩から選択される2種以上の化合物を含む配合物及び組成物、ならびにウイルス感染及び細菌感染の治療または予防における前記配合物及び組成物の使用に関する。

Description

発明の属する分野

本発明は、一般に、ウイルス感染及び細菌感染の治療または予防に有用な植物抽出物を含む配合物及び組成物に関する。

発明の背景

コロナウイルスは、通常、風邪のような軽度から中等度の上気道疾患を引き起こすウイルスの大きな科のウイルスである。しかし、近年、動物の保有宿主から、深刻で広範囲に広がる病気や死亡を引き起こし得る新型コロナウイルスが出現している。重症急性呼吸器症候群コロナウイルス(SARS-CoV)及び中東呼吸器症候群コロナウイルス(MERS-CoV)は、高い死亡率を有する重度の気道疾患を引き起こす。

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2)は、世界的なCOVID-19大流行の原因物質である。SARS-CoV-2は、2019年後期に、中国の河北省で最初に報告された。COVID-19は、2002年から2003年までのSARSの流行と2012年のMERSの流行に続いて、21世紀における3番目の注目すべき流行である(Yang, T., et al. J. Autoimmun., 2020, 109, 102434; Da Costa, V.G. et al. Arch. Virol., 2020, 165(7), 1517-1526)。2020年9月20日の時点で、全世界で確認された感染者は、30,369,778人で、また、死亡者は、948,795人であった(https://covid19.who.int)。

SARS-CoV、MERS-CoV、及びSARS-CoV-2は、コロナウイルス科及びベータコロナウイルス属に属している。SARS-CoV-2は、SAR-CoVのゲノムと約79.6%の同一性を共有する球状のエンベロープ一本鎖陽性RNAウイルスである。そのウイルス粒子は、核酸及びヌクレオカプシドタンパク質から構成され、らせん状のヌクレオカプシドを形成する。その脂質エンベロープは、膜(M)糖タンパク質、エンベロープ(E)タンパク質、及び突起物(S)糖タンパク質を含む構造タンパク質で繁殖される。ウイルス感染は、S糖タンパク質と宿主細胞の表面受容体との相互作用によって開始される。前記S糖タンパク質は、細胞セリンプロテアーゼTMPRSS2によって切断され、受容体認識及び膜融合を担うS1及びS2サブユニットになる。膜融合は、ウイルスゲノムの細胞質への放出、続いてRNA複製を可能にする。

S糖タンパク質は、コロナウイルス科の他のウイルスで、細胞表面にある特定の宿主-受容体に接触することによってウイルスの侵入を媒介することが観察されている。宿主-ゲスト認識は、ウイルスに特異的であり、その特異性がウイルス指向性及び病原性によって決められる(Ou, X., et al. Nat. Commun, 2020, 11(1), 1620; Walls, A.C., et al. Cell, 2020, 181(2), 281-292)。SARS-CoV及びSARS-CoV-2の両方は、宿主細胞の膜上のアンジオテンシン変換酵素2(ACE2)受容体を介して宿主細胞に侵入する。ウイルスと宿主細胞との膜融合は結合後に活性化され、その後、ウイルスRNAは細胞質内に放出される。これによって、感染が確立される(Hoffmann, M., et al. Cell, 2020, 181(2), 271-280)。

コロナウイルスの特徴として、既知の最大のRNAウイルス ゲノムを有し（約26～32 kb）(Song, Z. et al. Viruses, 2019, 11(1) 59; Anand, K., et al. Science, 2003, 300(5626), 1763-1767)、また、少なくとも6つの翻訳領域を含む(Chen, Y., et al. J Med Virol, 2020, 92(4), 418-423; Gordon, D.E. et al. Nature, 2020, 10.1038)。主要な翻訳領域であるORF 1abは、2つの重複するポリタンパク質(pp1a及びpp1ab)をコードし、これらは、主要なプロテアーゼ(M^pro)及びパパイン様プロテアーゼ(PL^pro)によって16種の非構造タンパク質に切断される(Ullrich, S. and Nitsche, C. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters, 2020, 30(17), 127377)。

現在、SARS、MERS、またはCOVID-19等の、ヒトコロナウイルスまたは潜在的に致死性の動物由来感染症コロナウイルスに対する承認された治療がほとんどない。そのため、コロナウイルス感染を含むウイルス感染に対する強力かつ効果的な治療を開発する必要がある。

ウイルス感染の治療のための、新規な抗ウイルス性配合物、組成物、及び方法が提供される。

従って、一態様では、本発明は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩から選択される2種以上の化合物を含む抗ウイルス性配合物を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明による抗ウイルス性配合物及び少なくとも1種の薬剤的に許容される担体または希釈剤を含む医薬組成物を提供する。

一態様では、本発明は、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩と共に、Andrographis paniculataの抽出物を含む医薬組成物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、本発明による有効量の抗ウイルス性配合物または医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、前記被験者におけるウイルス感染を治療または予防する方法を提供する。

別の態様では、本発明は、本発明による有効量の抗ウイルス性配合物または医薬組成物を、それを必要とする被験者に投与することを含む、前記被験者における細菌感染を治療または予防する方法を提供する。

さらに別の態様では、本発明は、ウイルス感染の治療または予防に使用するための本発明による抗ウイルス性配合物または医薬組成物を提供する。

さらなる態様では、本発明は、細菌感染の治療または予防に使用するための本発明による配合物または医薬組成物を提供する。

当業者は、添付の実施例及び請求項と関連して以下の詳細な説明を読むと、本発明のこれら及び他の態様がより明白になるであろう。

以下の図面を参照して本発明を説明する。これらの図面は、本発明を限定するものではない。

図1は、ベロ(AGM)細胞におけるACE2 mRNAの発現に対するアンドログラホリド(UP-A)、ピセイド(UP-P)、及びウルソール酸(UP-U)の効果を示す。前記細胞をこれらの化合物と48時間インキュベートした。ACE2発現は、定量的逆転写酵素RT-PCTによって測定した。データは、平均±SEMを示す。* vsプレート対照p<0.05。

図2は、ベロ(AGM)細胞及びヒト肺上皮(A549)細胞におけるACE2 mRNAの発現に対するアンドログラホリド(UP-A)及びピセイド(UP-P)の効果を示す。前記細胞をこれらの化合物と24時間インキュベートした。ACE2発現は、定量的逆転写酵素RT-PCTによって測定した。データは、平均±SEMを示す。* vsプレート対照p<0.05。

図3は、アンドログラホリド(UP-A)及びピセイド(UP-p)(1 μM)で毎日の処置を3日間行った後の72時間にCACO-2細胞の細胞溶解におけるELISAによるACE2タンパク質の発現を示す。データは、平均±SEM；* p<0.05。

発明の詳細な説明

併用療法は、HIV感染の治療においてよく確立され、薬剤耐性による他のウイルス感染の治療において、また、治療が困難なウイルス感染と戦う手段として出現している。米国保健社会福祉省によって公開された治療ガイドラインによると、ウイルス抑制の達成には、併用療法が必要であり、即ち、少なくとも2つ以上の薬物クラスからの複数の薬物を使用する必要がある。

これを念頭において、特定の植物抽出物を含む併用療法は、ウイルス感染症に対する新規な治療レジメンを提供することが想定される。植物由来の天然物は、新しい治療薬の開発において重要な役割を果たす。これらは、ウイルス受容体(Chang & Woo, 2003; Keyaerts, et al. 2007)、ウイルス統合(Kim et al. 2010)、逆転写(Zhang et al. 2014)、ウイルス複製、及びウイルスタンパク質翻訳(Mansouri et al. 2009)を標的とすることにより、ウイルス感染と戦うことが示唆されている。特に、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩から選択される2種以上の化合物を含む配合物は、有望な抗ウイルス活性を有することが見出された。

従って、一実施形態では、本発明は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩から選択される2種以上の化合物を含む抗ウイルス性配合物を提供する。

本明細書で使用される"配合物"という用語は、上記で定義された組合せパートナーが非独立的に、または独立的に、または、異なる量の組合せパートナーとの異なる固定された組合せを使用することにより、即ち、同時にまたは異なる時点で投与できる部分の組成物またはキットを指す。次いで、前記組合せパートナーは、例えば、部分のキットの任意の部分について、異なる時点で、等しいまたは異なる時間間隔で、同時にまたは時間的にずらして投与することができる。例えば、治療される患者のサブ集団のニーズ、または年齢、性別、体重等によって変わり得る単独な患者のニーズに対処するため、前記配合物中に投与される組合せパートナーの総量の比率は、変動し得る。

一実施形態では、前記抗ウイルス性配合物は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及びウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩を含むことが想定される。別の実施形態では、前記抗ウイルス性配合物は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含むことが想定される。さらなる実施形態では、前記抗ウイルス性配合物は、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含むことが想定される。さらに別の実施形態では、前記抗ウイルス性配合物は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含むことが想定される。

アンドログラホリドは、以下の構造を有するラクトン ジテルペノイドである。
アンドログラホリド (3-[2-[デカヒドロ-6-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-5,8a-ジメチル-2-メチレン-1-ナフタレニル]エチリデン]ジヒドロ-4-ヒドロキシ-2(3H)-フラノン)

アンドログラホリドは、インドとスリランカ原産の草本植物であるクリエートまたはグリーン チレッタとして周知されるAndrographis paniculataの葉に非常に豊富に含まれている。Andrographis paniculataは、その薬効のため、南アジア及び東南アジアで広く栽培されている。Andrographis paniculata抽出物及びアンドログラホリドの両方は、例えば、抗炎症剤、抗腫瘍剤、及び抗高血糖剤として、種々の用途が見出された。

幸いなことに、アンドログラホリドは、アジアにおいて伝統医学で広く使用されており、安全に摂取できると考えられている。

ウルソール酸は、以下の構造を有する五員環トリテルペノイド化合物である。
ウルソール酸 (1S,2R,4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS)-10-ヒドロキシ-1,2,6a,6b,9,9,12a-ヘプタメチル-2,3,4,5,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-テトラデカヒドロ-1H-ピセン-4a-カルボン酸)

これは、Eriobotrya japonica, Cadamba, Mirabillis jalapa含む多くの植物、リンゴのワックスコーティング、及びローズマリー、タイム、バジル、ビルベリ、クランベリー、ニワトコの花、ペパーミント等の多数の果実やハーブに見出されている。

ピセイド(ポリダチン)は、スチルベノイド グルコシドであり、葡萄ジュース中に見出される主要なレスベラトロールである。ピセイドは、Picea sitchensisの樹皮中に見出されることができ、Reynoutria japonicaから単離することができる。ピセイドは、以下の構造を有する。
ピセイド (2-[3-ヒドロキシ-5-[(E)-2-(4-ヒドロキシフェニル)エテニル]フェノキシ]-6-(ヒドロキシメチル)オキサン-3,4,5-トリオール)

ピセイド及びその誘導体であるレスベラトロールは、抗酸化剤として作用することが示されており、赤ワインの健康上の利益に関連する化合物である。また、ピセイド及びレスベラトロールは、抗増殖作用及び抗炎症作用を有することが示唆されている(Cheng, S.D. et al. PLoS ONE, 8(1): e54505)。

ここで、ピセイドは、M^proを標的とする化合物として同定されている。初期のインシリコ試験及び酵素学的試験では、ピセイドはM^proを標的とする有望な候補であることが示めされている。

一実施形態では、前記抗ウイルス性配合物及び組成物は、アンドログラホリドの誘導体を含む。上述したように、アンドログラホリドは、Andrographis paniculataの葉に由来する。アンドログラホリドの他に、いくつかの誘導体も有益な治療的性質を有することが見出された。そのような誘導体には、以下のものが含まれるが、これらに限定されない。
14-デオキシ-ジデヒドロアンドログラホリド；
14-デヒドロキシアンドログラホリド-12-スルホン酸ナトリウム塩；
14-アルファ-リポイル アンドログラホリド；
アンドログラフィシド;
アンドログラパニン；
14-デヒドロキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド-3,19-ビス(コハク酸)カリウム塩；
14-デヒドロキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド-3,19-ビス(コハク酸)カリウムナトリウム塩；
(R)-((1R,5aS,6R,9aS)-1,5a-ジメチル-7-メチレン-3-オキソ-6-((E)-2-(2-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)エテニル)デカヒドロ-1H-ベンゾ[c]アザピン-1-イル)メチル2-アミノ-3-フェニルプロパン酸塩；
2-((1R,5R,6R,8aS)-6-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-5,8a-ジメチル-2-メチレンデカヒドロナフタレン-l-イル)エチル安息香酸塩；
(1S,2R,4aS,5R,8aS)-1-ホルムアミド-1,4a-ジメチル-6-メチレン-5-((E)-2-(2-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)エテニル)デカヒドロナフタレン-2-イル5-((R)-1,2-ペンタン酸塩；
(1S,2R,4aS,5R,8aS)-1-ホルムアミド-1,4a-ジメチル-6-メチレン-5-((E)-2-(2-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)エテニル)デカヒドロナフタレン-2-イル2-ニトロ安息香酸塩；及び
(S)-(1S,2R,4aS,5R,8aS)-1-ホルムアミド-1,4a-ジメチル-6-メチレン-5-((E)-2-(2-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)エテニル)デカヒドロナフタレン-2-イル-2-アミノ-3-フェニルプロパン酸塩。

別の実施形態では、前記抗ウイルス性配合物及び組成物は、ウルソール酸の誘導体を含む。このような誘導体には、レスベラトロールが含まれる。

理解されるように、本発明の化合物には、複数の等価な互変異性の形態が存在し得る。明確にするために、化合物は単一の互変異性体として示されているが、そのような互変異性体は、全て本発明の範囲内であると考えられる。

留意されたいこととして、本発明のいくつかの化合物の構造は、不斉炭素原子を含む。従って、理解されるように、このような非対称性に起因する異性体(例えば、全ての鏡像異性体、立体異性体、回転体、互変異性体、ジアステレオマー、またはラセミ体)は、本発明の範囲内に含まれる。本発明は、単離され(例えば、鏡像異性体の単離物)、または組み合わせられた(ラセミ混合物及びジアステレオマー混合物を含む)これらの立体異性体の全てをその範囲内に含む。

従って、本発明はまた、アミノ酸残基の不斉中心に関する実質的に純粋な立体異性体形態、例えば、約95%～97% deのような約90% deを超える、または99% deを超える、ならびにそのラセミ混合物を含む混合物にも関する。当業者は、ラセミ体、鏡像異性体、または鏡像体の形態にある、本発明の光学不活性の化合物を製造するために、利用可能な技術が多数存在することを理解するであろう。一例として、前記化合物のエナンチオ濃縮型またはエナンチオピュア型の形態は、立体選択的合成及び/またはクロマトグラフィーまたは選択的な再結晶化の技術の使用を通して製造し得る。

本発明の化合物は、結晶形態であってもよく、または溶媒和物(例えば、水和物)であってもよい。その両方の形態は、本発明の範囲内にあることが意図されている。"溶媒和物"という用語は、溶質(本発明では、本発明の化合物)及び溶媒によって形成された可変的なストイキオメトリの複合体である。そのような溶媒は、好ましくは、溶質の生物学的活性と干渉しないべきである。溶媒は、例として、水、アセトン、エタノール、または酢酸であってもよい。溶媒和の方法は、当技術分野で一般的に知られている。

前記化合物が(例えば、生理学的pHにおいて)プロトン化または脱プロトン化され得る1つ以上の官能基を含む場合、該化合物は、薬剤的に許容される塩として調製または単離し得る。理解されるように、前記化合物は、所与のpHで双性イオンであり得る。本明細書で使用される場合、"薬剤的に許容される塩"という表現は、所与の化合物の塩を指す。ここで、前記塩は、医薬品としての投与に適している。このような塩は、例えば、酸または塩基とアミンまたはカルボン酸基とそれぞれ反応することにより、化学合成において調製してもよい。前記化合物の薬剤的に許容される塩は、植物の抽出物から単離してもよい。

薬剤的に許容される酸付加塩は、無機酸及び有機酸から調製してもよい。無機酸としては、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸等が挙げられる。有機酸としては、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、ピルビン酸、シュウ酸、リンゴ酸、マロン酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、サリチル酸等が挙げられる。例えば、本発明の化合物の非環式部分の窒素原子は、酸と反応して酸付加塩を形成し得る。

薬剤的に許容される塩基付加塩は、無機塩基及び有機塩基から調製してもよい。無機塩基に由来する対応の対イオンには、ナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、及びマグネシウム塩が含まれる。有機塩基には、イソプロピルアミン、トリメチルアミン、ジエチルアミン、トリエチルアミン、トリプロピルアミン、エタノールアミン、2-ジメチルアミノエタノール、トロメタミン、リジン、アルギニン、ヒスチジン、カフェイン、プロカイン、ヒドラバミン、コリン、ベタイン、エチレンジアミン、グルコサミン、N-アルキルグルカミン、テオブロミン、プリン、ピペラジン、ピペリジン、及びN-エチルピペリジンを含む、1級、2級、及び3級アミン、天然に存在する置換アミンを含む置換アミン、及び環状アミンが含まれる。例えば、本発明の化合物がホスホン酸基を有する場合、該化合物は、塩基と反応して塩基付加塩を形成し得る。

酸付加塩または塩基付加塩は、対応する遊離酸の形態または遊離塩基の形態よりも水性溶媒により溶解し易い傾向がある。

本発明はまた、本発明の抗ウイルス性配合物を少なくとも1種の薬剤的に許容可能な担体または希釈剤と共に含む医薬組成物を提供する。従って、一実施形態では、前記医薬組成物は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及びウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩を含む。別の実施形態では、前記医薬組成物は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含む。さらなる実施形態では、前記医薬組成物は、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含む。さらに別の実施形態では、前記医薬組成物は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含む。

"組成物"という用語は、活性成分（他の担体を含むまたは含まない）が担体に取り囲まれているカプセルを提供するために、活性成分及び担体としての封入材料の製剤を含むことを意図している。

別の実施形態では、前記医薬組成物は、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及び1種以上の他の治療薬から選択される2種以上の化合物を含む。一実施形態では、前記1種以上の他の治療薬は、抗ウイルス剤である。好適な抗ウイルス剤は、上記に提供される。

別の実施形態では、前記抗ウイルス性配合物及び組成物は、1種以上の他の治療薬を含む。一実施形態では、前記1種以上の他の治療薬は、抗ウイルス剤である。

"抗ウイルス剤"という用語は、ウイルス感染を治療するための任意の現在知られている治療用化合物を意味する。適切な抗ウイルス剤には、限定されるものではないが、レムデシビル、デキサメタゾン、ギムシルマブ、サリルマブ、トシリズマブ、アナキンラ、ルキソリチニブ、バリシチニブ、フェドラチニブ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ロピナビル、リチノビル、ファビピラビル、EIDD-2801、バリシチニブ、メチルプレドニゾロン、ヘパリン、亜鉛、アルビジオール/ウミフェノビル、ダルナビル、オセルタミビル、エムトリシチビン、テノホビル、バロキサビル マルボキシル、ダノプレビル、ジピリダモール、フィンゴリモド、ロサルタン、アジスロマイシン、リバビリン、トリアザビリン、トラニラスト、エバスチン、ケルセチン、グリチルリチン、バイカリン、パチョリアルコール、ルテオリン、ヘスペリジン、エモジン、ケンフェロール、リグニン、ベツリン酸、タンシノン、クリプトタンシノン、ジヒドロタンシノン、I、タンシノンIIA、クルクミン、シコノン、及びマトリンが含まれる。

さらなる実施形態では、Andrographis paniculataの抽出物を、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩と共に含む医薬組成物が提供される。上述したように、アンドログラホリドは、抗ウイルス活性及び抗炎症活性を含む有益な治療的性質を有することが見出されたAndrographis paniculataに由来するいくつかの化合物のうちの1つである。

さらなる実施形態では、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及び/またはピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩も、植物抽出物の形態で提供される。従って、一実施形態では、本発明は、Andrographis paniculataの抽出物を、Eriobotrya japonica、ローズマリー及びタイムからなる群から選択された植物の抽出物、及び/またはReynoutria japonicaからの抽出物と共に含む医薬組成物を提供する。

本発明の抗ウイルス性配合物及び組成物は、広範囲のウイルス感染の治療及び/または予防において使用され得る。本明細書で使用されるように、治療は、ウイルス感染の重症度及び/または頻度を減少させることを含む、治療されているウイルス感染に関連する症状、疾患または状態を緩和または改善することを含み得る。本明細書で使用されるように、予防は、ウイルス感染に関連する特定の症状、疾患、または状態の発症を予防しまたは遅延させこと、その進行を阻害すること、またはその発症または進行を完全に停止させまたは逆転させることを含み得る。

従って、一実施形態では、本発明は、有効量の本発明による抗ウイルス性配合物または医薬組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者におけるウイルス感染を治療または予防する方法を提供する。

一実施形態では、前記方法は、有効量のアンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及びウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩を前記被験者に投与することを含む。別の実施形態では、前記方法は、有効量のアンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を前記被験者に投与することを含む。さらなる実施形態では、前記方法は、有効量のウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を前記被験者に投与することを含む。さらに別の実施形態では、前記方法は、有効量のアンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を前記被験者に投与することを含む。

別の実施形態では、前記方法は、有効量の、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及び1種以上の他の治療薬から選択される2種以上の化合物を前記被験者に投与することを含む。一実施形態では、前記1種以上の他の治療薬は、抗ウイルス剤である。好適な抗ウイルス剤は、上記に提供される。

本発明はさらに、ウイルス感染の治療または予防に使用するための、本発明による抗ウイルス性配合物または医薬組成物を提供する。

別の実施形態では、本発明は、ウイルス感染の治療または予防のための医薬の製造における、2種以上のアンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩の使用を提供する。

用語"ウイルス"は、宿主に感染を引き起こすことが知られている任意のウイルスを指す。一実施形態では、前記ウイルスは、ピコルナウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、及びメタニューモウイルスからなる群から選択される。ピコルナウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、及びメタニューモウイルスの好適な抗原は、当業者に精通するであろう。

一実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルス科のウイルスである。前記コロナウイルス科は、典型的には、Coronavirinae及びTorovirinae亜科に分けられ、さらにアルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、ガンマコロナウイルス、デルタコロナウイルス、トロウイルス、及びバフィニウイルスの6つの属に分けられる。アルファコロナウイルス及びベータコロナウイルス属のウイルスは、大部分の哺乳動物を感染させるが、ガンマコロナウイルスは、鳥類を感染させる。また、デルタコロナウイルス属のメンバーは、哺乳動物及び鳥両方の宿主に発見されている(Phan et al., Virus Evol. 2018; 4(2): vey035)。

コロナウイルス科の適切なウイルスは、当業者によく知られているものであり、その例には、アルファレトウイルス(例えば、Bukhari et al.; Virology. 2018; 524:160-171を参照)及びコロナウイルス(例えば、Fehr and Perlman; Coronaviruses. 2015; 1282:1-23を参照) が含まれる。従って、本明細書に開示される実施形態では、前記ウイルスは、アルファレトウイルス及びコロナウイルスからなる群から選択される。一実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルスである。本明細書に開示される実施形態では、前記コロナウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、及びガンマコロナウイルスからなる群から選択される。一実施形態では、前記コロナウイルスは、ベータコロナウイルスである。好適なベータコロナウイルスは、当業者によく知られているものであり、その例には、サルベコウイルスが含まれる。一実施形態では、前記ベータコロナウイルスは、サルベコウイルスである。好適なサルベコウイルスは、当業者によく知られているものであり、その例には、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルス、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（SARS-CoV）、及び重症急性呼吸器症候群コロナウイルス2(SARS-CoV-2) が含まれる。一実施形態では、前記サルベコウイルスは、重症急性呼吸器症候群関連コロナウイルスSARS-CoV及びSARS-CoV-2からなる群から選択される。一実施形態では、前記サルベコウイルスは、SARS-CoV-2である。一実施形態では、前記SARS-CoV-2は、NCBI受託番号NC_045512の核酸配列によってコードされる。

一実施形態では、前記ウイルス感染は、ピコルナウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、及びメタニューモウイルスからなる群から選択されるウイルスによって引き起こされる。好ましい実施形態では、前記ウイルスは、コロナウイルスである。好ましい実施形態では、前記コロナウイルスは、SARS-CoV-2である。

ウイルス感染の治療、減衰または予防に加えて、本明細書に記載されたように、アンドログラホリド、ウルソール酸、及びピセイドの配合物は、微生物または細菌の二次感染を含む微生物及び細菌感染の治療または予防に有益であり得る。例えば、重症急性呼吸器症候群を患う患者の疾患進行の主要な結果は、細菌の二次感染である。COVID-19患者の少なくとも7人に1人は、二次細菌感染にさらに感染していることが分かった。武漢でのSARS-CoV-2流行中の死亡者の50%は、未治療または治療不可能な細菌感染（その大部分の症例は肺におけるもの）によって引き起こされた(Zhou, F. et al. Lancet, 2020, 395, 1054-1062)。

従って、一実施形態では、有効量の本発明による抗ウイルス性配合物または医薬組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者における細菌感染を治療または予防する方法が提供される。一実施形態では、前記細菌感染は、ウイルス感染に対する二次感染である。

本明細書に開示される別の実施形態では、細菌感染を治療または予防するための医薬品の製造における、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩のうちの2種以上の使用が提供される。一実施形態では、前記細菌感染は、ウイルス感染に対する二次感染である。

二次細菌感染は、典型的には感染性病原体との初期感染中または初期感染後に患者において発症し、高い罹患率及び死亡率に関連している(Mallia, P., et al. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 2012, 186, 1117-1124)。1918年から 1919年にかけてのスペイン風邪の大流行では、約5,000万人が細菌の同時感染が原因で死亡したとされている(Kash, J.C., and Taubenberger, J.K. Am. J. Pathol. 2015, 185, 1528-1536)。細菌の二次感染は、病原体タイプの両方に適切に応答できない一次感染の結果として、損傷した免疫系によって促進される。

用語"微生物"は、任意の微小生物または藻類、細菌、真菌、及び原生動物等のカテゴリ中の分類学的に関連する巨視的生物を含む。細菌感染は、Acinetobacter、Actinobacillus、Bartonella、Bordetella、Brucella、Burkholderia、Campylobacter、Cyanobacteria、Enterobacter、Erwinia、Escherichia、Francisella、Helicobacter、Hemophilus、Klebsiella、Legionella、Moraxella、Morganella、Mycobacterium、Neisseria、Pasteurell、Proteus、Providencia、Pseudomonas、Salmonella、Serratia、Shigella、Stenotrophomonas、Treponema、Vibrio、及びYersiniaのグラム陰性細菌属の1つ以上から選択される1つ以上の種によって引き起こされ得る。具体的な例としては、Helicobacter pylori及びuropathogenic Escherichia coliに起因する感染症が挙げられるが、これらに限定されない。

細菌感染は、Actinobacteria、Bacillus、Clostridium、Corynebacterium、 Enterococcus、Listeria、Nocardia、Staphylococcus、及びStreptococcusのグラム陽性細菌属の1つ以上から選択される1つ以上の種によって引き起こされ得る。

原虫感染には、限定されないが、Leishmania、Toxoplasma、Plasmodia (マラリア感染の原因物質されている)、Theileria、Anaplasma、Giardia、Tritrichomonas、Trypanosoma、Schistosoma、Coccidia、及びBabesiaに起因する感染が含まれる。その具体的な例としては、Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium malariae, Plasmodium knowlesi, Plasmodium ovale、及びGiardia lambliaが含まれる。

"被験者"という用語は、哺乳動物、例えば、ヒト、イヌ、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ネコ、マウス、ウサギ、ラット、及び遺伝子組換えの非ヒト動物等の生物を含むことを意図している。特定の実施形態では、被験体は、ヒト、例えば、微生物感染に罹患しているリスクがあるか、または潜在的に罹患し得るヒトである。別の実施形態では、被験者は、細胞である。

"投与すること"または"投与"は、2種以上の治療用化合物を被験者または患者に送達することを指す。一実施形態では、投与は、治療の過程中に2種以上の治療化合物が一緒に送達されるように、同時投与である。一実施形態では、2種以上の治療用化合物は、単一剤形または"併用投与単位"のように同時に製剤化してもよく、または別々に製剤化して、次いで、単一または二層の錠剤またはカプセルとして経口投与するために、併用投与単位に組み合わせてもよい。

一実施形態では、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩から選択される2種以上の化合物は、それぞれの化合物の有効量、独立して1日当たり約0.1 mg～約1000 mgの化合物の量で、それを必要とするヒト患者に投与される。一実施形態では、前記配合物による治療における有効量は、独立して、1日当たり約0.1 mg～約500 mgの化合物である。一実施形態では、前記配合物による治療における有効量は、独立して、1日当たり約0.5 mg～約200 mgの化合物である。一実施形態では、前記配合物による治療における有効量は、独立して、1日当たり約1 mg～約100 mgの化合物である。他の実施形態では、前記配合物による治療における有効量は、成分ごとに、1日当たり約1 mg、約3 mg、約5 mg、約10 mg、約15 mg、約18 mg、約20 mg、約30 mg、約40 mg、約60 mg、約80 mg、約100 mg、約200 mg、または約500 mgである。

併用投与はまた、成分薬物、例えば、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩から選択される2種以上の化合物を投与することを含み得る。このようなアンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩から選択される2種以上の化合物の配合物は、各薬剤または配合物の薬物動態学的な特性及び/または薬物動力学的な特性に応じて、各投与の合理的な時間内に(例えば、約1分間～24時間)、同時にまたは順次に(例えば、次々と)投与されてもよい。併用投与はまた、固定された配合物で治療することも含み得る。ここで、治療レジメンの薬剤は、固定された用量で、または複合用量媒体（例えば、固体、液体、またはエアロゾル等）中で結合可能である。一実施形態では、薬物または薬物成分を投与するために、キットを使用してもよい。

本発明の抗ウイルス性配合物及び組成物は、活性化合物を病変部または感染部、即ち呼吸器系へ送達できるために、主に経口投与を意図している。当業者は、従来の方法を用いて、本発明の化合物のための適切な製剤を容易に決定し得る。

活性化合物を単独で投与することが可能であるが、医薬製剤として提示することが好ましい。動物及びヒトに使用する製剤は、本明細書で定義されるように、少なくとも2種の活性化合物を、1種以上の許容される担体及び任意に他の治療成分とともに、特に本明細書で論じられるような他の治療成分と一緒に含む。前記担体は、製剤の他の成分と適合し、その受容者に生理学的に無害であるという意味で、"許容可能"でなければならない。

全ての製剤は、任意選択で、"医薬賦形剤のハンドブック"(1986)に記載されたもの等の賦形剤を含有するであろう。賦形剤は、アスコルビン酸及び他の抗酸化剤、EDTA等のキレート剤、及びデキストラン、ヒドロキシアルキルセルロース、ヒドロキシアルキルメチルセルロース、ステアリン酸等の炭水化物を含む。製剤のpHは、約3～約11の範囲にあるが、通常は約7～10である。

前記製剤は、単位用量形態で簡便に提示してもよく、また、薬学の技術分野で周知される方法のいずれかで調製してもよい。該技術及び製剤は、一般に、Remington's Pharmaceutical Sciences(Mack Publishing Co., Easton, PA)に見出される。そのような方法は、有効成分を1種以上の副成分を構成する担体と接触させる工程を含む。一般に、前記製剤は、有効成分を液体の担体または細かく分割された固体担体またはその両方と本質的に接触させた後、必要に応じて製品を成形することによって調製される。

経口投与に適した製剤は、所定量の有効成分を含有するカプセル、キャッシュ、錠剤等の個別な単位で、粉末または顆粒として、水性または非水性液体中の溶液または懸濁液として、または水中油型の液体エマルジョンまたは油中水型の液体エマルジョンとして提供され得る。前記有効成分は、急速投与、エレクチュアリ、または糊状剤として投与されてもよい。

本発明の化合物は、二酸化炭素ガス、ジクロロジフルオロメタン、窒素、プロパン、または他の好適なガスまたはガスの組み合わせ等の噴射剤を含む、加圧ディスペンサまたは容器からエアロゾル噴霧の形態で吸入することによって投与されてもよい。前記化合物は、噴霧器を用いて投与されてもよい。

水性懸濁液は、水性懸濁液の製造に適した賦形剤との混合物中に活性物質を含有する。このような賦形剤には、カルボキシメチルセルロースナトリウム、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、アルギン酸ナトリウム、ポリビニルピロリドン、トラガントガム、及びアカシアガム等の懸濁剤、及び天然リン脂質（例えば、レシチン）、アルキレンオキシドと脂肪酸との縮合生成物（例えば、ポリオキシエチレンステアレート）、エチレンオキシドと長鎖脂肪族アルコールの縮合生成物（例えば、ヘプタデカエチレンオキシセタノール）、エチレンオキシドと脂肪酸由来の部分エステルとの縮合生成物、及びヘキシトール無水物（例えば、ポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート）等の分散剤または湿潤剤が含まれる。水性懸濁液は、p-ヒドロキシ安息香酸エチルまたはn-プロピル等の1種以上の保存剤、1種以上の着色剤、1種以上の着香剤、及びスクロースまたはサッカリン等の1種以上の甘味剤も含んでもよい。

水の添加による水性懸濁液の調製に適した分散性粉末及び顆粒は、分散剤または湿潤剤、懸濁剤、及び1種以上の保存剤との混合物中に有効成分を提供する。好適な分散剤または湿潤剤及び懸濁剤が、上記に開示されたものによって例示される。他の賦形剤、例えば甘味剤、着香剤、及び着色剤も存在し得る。

オイル懸濁液は、ラッカセイ油、オリーブ油、ゴマ油、またはココナッツオイル等の植物油、または液体パラフィン等の鉱油中に有効成分を懸濁させることによって製剤化してもよい。経口懸濁液は、ビエスワックス、硬質パラフィン、またはセチルアルコール等の増粘剤を含有してもよい。嗜好性経口製剤を提供するために、上記のような甘味剤、及び着香剤を添加してもよい。これらの組成物は、アスコルビン酸等の抗酸化剤を添加することによって保存してもよい。

前記医薬組成物はまた、水中油型のエマルジョンの形態であってもよい。油相は、オリーブ油またはヨット油等の植物油、液体パラフィン等の鉱油、またはこれらの混合物であってもよい。好適な乳化剤には、アカシアガムやトラガカントガム等の天然ガム、大豆レシチン等の天然リン脂質、脂肪酸由来のエステルまたは部分エステル、ソルビタンモノオレエート等のヘキシトール無水物、及びポリオキシエチレンソルビタンモノオレエート等の部分エステルとエチレンオキシドとの縮合生成物が含まれる。エマルジョンはまた、甘味剤及び着香剤を含有してもよい。シロップ及びエリキシルは、グリセロール、ソルビトール、またはスクロース等の甘味剤と製剤化してもよい。そのような製剤は、解乳化剤、保存剤、着香剤、または着色剤も含有してもよい。

錠剤は、任意選択的に、1つ以上の副成分を用いて、圧縮または成形によって製造する。圧縮錠剤は、粉末または顆粒等の自由流動形態で有効成分を適切な機械で圧縮し、任意選択で、結合剤、潤滑剤、不活性希釈剤、保存剤、界面活性剤、または分散剤と混合することによって調製してもよい。成形された錠剤は、不活性液体希釈剤で湿潤された粉末状有効成分の混合物を適切な機械で成形することによって製造してもよい。錠剤は、任意選択で、コーティングまたはスコアリングしてもよく、任意選択で、そこから活性成分の徐放または制御放出を提供するように製剤化してもよい。

錠剤の製造に適した、非毒性の薬剤的に許容される賦形剤との混合物中の有効成分を含有する錠剤は、許容される。これらの賦形剤は、例えば、カルシウムまたは炭酸ナトリウム、ラクトース、リン酸カルシウムまたはナトリウム等の不活性希釈剤、トウモロコシデンプン、またはアルギン酸等の造粒剤及び崩壊剤、デンプン、ゼラチン、またはアカシア等の結合剤、及びステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、またはタルク等の潤滑剤であってもよい。錠剤は、コーティングされなくてもよく、または胃腸管内での崩壊及び吸着を遅延させ、それによって、より長い期間にわたって持続的な効果を提供できるように、マイクロカプセル化を含む公知の技術によってコーティングされてもよい。例えば、モノステアリン酸グリセリルまたはステアリン酸グリセリルのような時間遅延材料を単独で、またはワックスと共に使用してもよい。前記錠剤は、チュアブル錠であってもよい。

望ましい場合、本発明による抗ウイルス性配合物及び組成物は、静脈内、髄腔内または硬膜外送達に適したものを含む非経口剤形で調製してもよい。注射可能な使用に適した薬剤的形態は、滅菌注射可能な溶液または分散物、及び滅菌注射可能な溶液を一時的に調製するための滅菌粉末を含む。それらは、製造及び貯蔵の条件下で安定でなければならず、また、還元または酸化及び細菌または真菌等の微生物の汚染作用を防ぐために保存してもよい。

注射可能な溶液または分散液のための溶媒または分散媒は、前記化合物のための従来の溶媒または担体システムのいずれかを含有してもよく、また、例えば、水、エタノール、ポリオール(例えば、グリセロール、プロピレングリコール、及び液体ポリエチレングリコール等)、それらの好適な混合物、及び植物油を含有してもよい。適切な流動性は、例えば、レシチン等のコーティングを使用することによって、分散時に必要な粒子サイズを維持することによって、また、界面活性剤を使用することによって、維持することができる。必要に応じて、種々の抗菌剤及び抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チメロサール等を加えることによって、微生物作用の防止をもたらすことができる。多くの場合、モル浸透圧濃度を調節するための薬剤、例えば、糖類または塩化ナトリウムを加えることが好ましいであろう。好ましくは、注射用製剤は、血液と等張である。吸収を遅延させる薬剤、例えば、モノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンを前記組成物に使用することによって、注射用組成物の吸収を延長することができる。注射可能な使用に適した医薬製剤は、静脈内、筋肉内、脳内、髄腔内、硬膜外注射、または点滴を含む任意の適切な経路によって送達され得る。

経腸製剤は、乳化塩基または水溶性塩基等の適切な塩基と混合することによって、座薬の形態で調製してもよい。また、本発明の化合物を局所的に、鼻腔内、膣内、眼内等の経路で投与しても可能であるが、必ずしも必要ではない。

投与の容易さ及び投与量の均一性のために用量単位形態で組成物を配合することは特に有利である。本明細書で使用される用量単位形態は、治療を受ける被験者のための単位用量として適した物理的に別個の単位を指し、各単位は、所望の薬剤的に許容される媒体に関連して、所望の治療効果を発生させるために計算された所定量の活性物質を含有する。本発明の新規用量単位形態の仕様は、(a)活性物質の固有な特性及び達成される特定の治療効果、及び(b) 本明細書で詳細に開示されているように、身体の健康が損なわれる疾患状態を有する生きている被験者における疾患を治療するための活性物質を配合する技術に内在する限界によって決定され、それらに直接に依存する。

上記のように、主要な有効成分は、便利で効果的な投与のために、治療的に有効な量で、適切な薬剤的に許容される媒体を用いて用量単位形態で配合されてもよい。単位用量形態は、例えば、0.25 μg～約200 mgの1種以上の前記活性化合物を含有することができる。比率で表される場合、前記活性化合物は、担体中に約0.25 μg～約200 mg/mLの濃度で存在してもよい。補助的な有効成分を含有する組成物の場合、その用量は、前記成分の通常の用量及び投与方法を参照して決定される。

本明細書及び以下の請求項を通して、文脈が別に要求しない限り、"含む"という用語、及びその変形"含む"及び"含んでいる"は、記載された整数、またはステップ、または整数またはステップのグループを包含することを意味するが、他の整数、またはステップ、または整数またはステップのグループを除外することを意味するものではないことを理解されよう。

本明細書における任意の先行する刊行物(またはそれに由来する情報)または任意の既知の事項への言及は、先行する出版物(またはそれに由来する情報)または既知の事項が、本明細書が関係する分野における共通の一般知識の一部を形成することの承知、承認、または何らかの形の提案ではなく、そのように解釈されるべきではない。

以下、いくつかの具体例及び図面を参照して本発明を説明する。しかし、以下の説明の特殊性は、前記した本発明の一般性にとって代わるものではないことを理解されたい。

実施例1：抗ウイルス活性のin vitro評価
方法(Tilmanis et al. Antiviral Therapy 2017, 147, 142-8; Dowall et al. Viruses, 2016を適用)

細胞及びウイルス：
SARS-CoV-2をベロ細胞において増殖させ、一定量ずつ小分けし、そして-80℃で保存した。選択された化合物の抗ウイルス活性は、ベロ細胞単層を有する96ウェルプレートにおいて、100 TCID50/ウェルの標準ウイルス濃度または他の特定の感染効率で評価した。

ステージ1A - 抗ウイルス活性
試験化合物：
試験化合物の保存原液を調製し、一定量ずつ小分けし、そして-20℃で凍結させた。一定分量を試験のために解凍し、40μM～0.078μMの濃度から、ウェル内に等しい体積の培地を加えて2倍連続希釈することによって調製し、20μM～0.039μMの最終濃度を得た。

いくつかの化合物は、ジメチルスルホキシド(DMSO)溶液中に調製する必要がある。細胞に適用した場合に、DMSOの最高濃度は、0.05%を超えない。

抗ウイルスアッセイ：
スクリーニングアッセイ：
PC3ラボでは、媒体は、96ウェルプレートのウェルから除去された。

方法：
50μlのSARS-CoV-2を100 TCID50(組織培養感染量50パーセント)で3つのウェルに加えた。他のウェルを偽感染した(50μlの培地)。1セットのウェルには、化合物及びウイルスのいずれも加えなかった(50μlの培地)。

室温で1時間吸着した後、接種物を除去し、ウェルをPBSで1回を洗浄し、100μlの培地を各ウェルに加えた。前記"化合物及びウイルスのいずれも加えられなかった"細胞に100μlの培地を追加した。

100μlの希釈された化合物を40μM～0.078μMの濃度で関連のウェル（3つのウイルス感染したウェル及び偽感染したウェル）に加えた。"化合物及びウイルスのいずれも加えられなかった"細胞をそのままにした。これらのプレートを37℃で3日間インキュベートした。

感染3日後、顕微鏡観察により、SARS-CoV-2に誘発された細胞変性効果について前記細胞を評価した。CPEを記録した後、前記ウイルスウェルからの上清をプールした。その140μlは、RNA抽出及びウイルスゲノム定量のためのRT-PCRに使用した。その100μlは、ベロ細胞(新鮮なものまたは凍結したもの)の96ウェルプレートでのウイルス力価測定のために取っておいた。そして、残りの300+μlは、TCID50を行うまでに-80℃で凍結した。

確認アッセイ：
PC3ラボでは、媒体は、96ウェルプレートの内側ウェルから除去された。エッジ効果により、外側ウェルを培地が添加されたままにした。これにより、1つのプレートでは、横に6個のウェル及び縦に10個のウェルが残された。

方法：
50μlのSARS-CoV-2を100 TCID50(組織培養感染量50パーセント)で3つのウェルに加えた。他のウェルを偽感染した(50μlの培地)。1セットのウェルには、化合物及びウイルスのいずれも加えなかった(50μlの培地)。

室温で1時間吸着した後、接種物を除去し、ウェルをPBSでl回を洗浄し、100μlの培地を各ウェルに加えた。前記"化合物及びウイルスのいずれも加えられなかった"細胞に100μlの培地を追加した。

100μlの希釈された化合物を40μM～2.5μMの濃度で関連のウェル（3つのウイルス感染したウェル及び偽感染したウェル）に加えた。"化合物及びウイルスのいずれも加えられなかった"細胞をそのままにした。これらのプレートを37℃で3日間インキュベートした。

感染3日後、顕微鏡観察により、SARS-CoV-2に誘発された細胞変性効果について前記細胞を評価した。各ウイルス感染したウェル及び1個の偽感染したウェルからの上清140μlは、RNA抽出及びウイルスゲノム定量のためのRT-PCRのために採取した。各ウイルス感染したウェル及び1個の偽感染したウェルの残りを96ウェルプレート内のベロ細胞(新鮮なものまたは凍結したもの)上で力価測定した。

ステージ1B - 細胞毒性試験
20μM未満の濃度での抗ウイルス活性を示す化合物を細胞毒性について評価した。細胞毒性は、プレートを37℃で3日間インキュベーションした後、CellTiterGlo細胞生存アッセイ(CTG；PROMEGA,USA)及びMTT(3-(4,5-ジ-メチルチアゾール-2-イル)-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド；MP Biomedicals,米国)アッセイで評価した。

CTGアッセイは、メーカーの説明書に従って実施し、発光は、FLUOstar Optimaルミノメーター(BMG Labtech,ドイツ)を用いて測定した。

MTTアッセイの手順は、前述の方法(Mosmann,1983)に基づいた。簡潔に述べると、1 mg/mLのMTTの存在下で、細胞単層を37℃で4時間インキュベートした。その上清が除去し、200μlのイソプロパノール(Sigma,米国)を加え、生成された紫色のホルマザンを溶解させた。吸光度は、Multiskan Ascentプレートリーダー(Thermo Fisher,米国)を用いて570 nmで測定した。

前記化合物の50%細胞毒性濃度(CC₅₀；細胞のみの対照と比較して、細胞生存率を50%減少させる化合物の濃度)は、両方の細胞毒性読み取りについて、非線形回帰分析(GraphPad Prism,米国)を用いて測定した。

ステージ2 - 抗ウイルス活性、確認アッセイ
トランスウェル
確認アッセイ：
気液界面(ALI)で増殖された正常なヒト気管支上皮(NHBE)細胞を用いて、ベロ細胞スクリーンにおいて有望な結果を示す化合物を確認用スクリーニングに移動させた。

ACDPの組織培養実験室において、NHBE細胞をALIで6～8週間分化した。

方法：
PC4ラボでは、24ウェル トランスウェル プレート中のNHBE細胞にSARS-CoV-2をMOI 0.01で3連のウェルに接種した。

室温で1時間吸着した後、接種物を除去し、ウェルをPBSで1回洗浄した。

100μLの希釈された化合物を、ベロ細胞スクリーンの結果に基づいて、3つの異なる濃度で関連のウェルに加えた。これらのプレートを37℃で3日間インキュベートした。

感染3日後、顕微鏡観察により、SARS-CoV-2に誘発された細胞変性効果について前記細胞を評価した。RNA抽出及びウイルスゲノム定量のためのRT-PCRのために、各ウイルス感染したウェルからの上清140μlを採取した。さらにその50μlを用いて、Cytotox 96非放射性細胞傷害(Promega)を使用して細胞毒性を評価した。TCID50を測定するために、96ウェルプレート中のベロ細胞(新鮮なものまたは凍結したもの)上で各ウイルス感染したウェルの残りを力価測定した。

実施例2：動物試験
試験：
SARS-CoV-2のフェレットモデルを用いて、この作業は、2つの試験にわたる抗ウイルス候補の有効性を評価する。最初に、フェレットをウェリビー動物施設に収容した。そこで、登録前に6週間以上の休薬期間を有する標準的な畜産要件の一部として、これらの動物に犬ジステンパーワクチン(CDV)の初回接種とブースト接種を行った。次いで、これらのフェレットを施設のACDP国家施設に移送し、SARS-CoV-2ワクチン候補を投与する前に、1週間に馴化した。各試験は、試験群の8匹の性別バランスの取れたフェレットで構成されていた。各試験には、生理食塩水を摂取する2匹の雄対照及び2匹の雌対照が含まれた。ウイルスチャレンジの前に、血液学的、臨床化学的、及び血清学的検査のベースラインのために、全てのフェレットを事前サンプリングした。また、これらのフェレットがSARS-CoV-2(10^5 TCID_50)で鼻腔内チャレンジされる前に、直腸スワブ、経口スワブ、及び鼻洗浄液を採取した。フェレットを臨床徴候について監視し、ウイルス学的評価のために、チャレンジ後2～3日ごとに直腸スワブ、口腔内スワブ、及び鼻洗浄液を2週間採取した。これらのフェレットを、発熱、無気力、落ち着きのなさ、他のフェレット/ハンドラーとの相互作用への関心の低下、下痢、及びくしゃみ、咳、鼻汁、呼吸努力の増加、または呼吸困難を含む呼吸器疾患の兆候について監視した。任意な中等度または重度の臨床徴候が最初に観察された時または試験終了時(21日目)に、これらの動物を人道的な手段で殺した。末梢血液の試料を採取し、組織パネルを剖検で採取し、SARS-CoV-2の有無を評価した。

実施例3：製剤
代表的な本発明の製剤を以下に示す：
KBDスプレー：
Eriobotrya japonica抽出物
12 mg/mLのEriobotrya japonica (乾燥葉)に相当する。
200 mg/mLのプロポリス
Reynoutria japonica抽出物
250 mg/mLのReynoutria japonica (乾燥根部)に相当する。

A+KBDスプレー：
Eriobotrya japonica抽出物
34.5 mg/mLのEriobotrya japonica (乾燥葉)に相当する。
100 mg/mLのプロポリス
Reynoutria japonica抽出物
56 mg/mLのReynoutria japonica(乾燥根部)に相当する。
Andrographis paniculata抽出物
2.8 mg/mlのAndrographis paniculata (乾燥品)に相当する。
2 mg/mlのメントール

KBDチュアブル錠：
Reynoutria japonica抽出物
25 gのReynoutria japonica(乾燥根部)に相当する。
Eriobotrya japonica抽出物
4.5 gのEriobotrya japonica(乾燥葉)に相当する。
Echinacea purpurea抽出物
840 mgのEchinacea purpurea(乾燥ハーブ)に相当する。
250 mgのプロポリス

KBDハードゲル カプセル：
Echinacea purpurea抽出物
840 mgのEchinacea purpurea(乾燥ハーブ)に相当する。
Reynoutria japonica抽出物
3 gのReynoutria japonica(乾燥根部)に相当する。
Andrographis paniculata抽出物
1.63 gのAndrographis paniculata(乾燥ハーブ)に相当する。
Eriobotrya japonica抽出物
2.25 g のEriobotrya japonica(乾燥葉)に相当する。
200 mgのプロポリス
5 mcg(200 IU)のビタミンD3

実施例4：ベロ細胞における抗ウイルス活性
方法：
室温で、24ウェルプレート中のベロ細胞に100μlの体積のSARS-CoV-2(Vic 01)を1000のTCID₅₀(0.005MOI)で1時間感染させた。接種物を除去し、単独でまたは組み合わせて、500μlの連続に希釈された化合物に置き換えて、37℃、5%CO₂で3日間インキュベートした。対照には、ウイルスも薬物も受けなかった細胞対照及び試験した薬物の最高濃度と同じ濃度で媒体を与えられた媒体対照が含まれた。NHC(ベータ-D-N⁴-ヒドロキシシチジン)をアッセイにおける陽性対照として用いた。3日目に、ウェルを顕微鏡法で細胞変性効果(CPE)の有無について調べた。複数のウェルからの上清を採取して、プールし、96ウェル形式のベロ細胞上の感染性ウイルスとウイルスRNA抽出のために試料を力価測定するまでに、-80℃で保存した。SARS-CoV-2 E遺伝子特異的プライマーを用いて、抽出したRNA試料について、RT-PCRを行った。GraphPadプリズムを用いて、グラフを作成し、TCID₅₀データからIC₅₀値を計算した。

結果：

GraphPadプリズムを用いてウイルス用量設定のデータをグラフ化し、アンドログラホリドのみの場合、IC₅₀は3.251μMと計算された。アンドログラホリドとピセイドとの配合物の場合、IC₅₀の計算値が2.475μMに低減した。アンドログラホリド、ピセイド、及びウルソール酸の配合物の場合、IC₅₀の計算値がさらに1.406μMに低減した。従って、化合物アンドログラホリドは、単独で、またピセイド及びウルソール酸と組み合わせて、SARS-CoV-2に対して抗ウイルス活性を示した。

実施例5：本化合物のACE2発現に対する効果
方法:
in vitro試験は、MCDB 131培地(l0 mMグルタミン、EGF、及びヒドロコルチゾンを含む10%FCS)中で培養されたヒト結腸上皮細胞(Caco-2)及びαMEM培地中で培養されたアフリカグリーンサル(Chlorocebus sp)由来のベロE6細胞を用いて行った。これらの細胞株は、ACE2の内因性高表面発現を有し、in vitroでSARS-CoVに感染することができる。24ウェルプレート中に細胞を80%コンフルエンスに増殖させた後、アンドログラホリド、ピセイド、及びウルソール酸(0～10μM)を含有する新鮮な培地で8回処理した。1～3日後に、細胞を掻爬して採取し、RNA抽出用のトリゾールに入れた。抽出されたRNAからCDNAを合成した。TaqManシステム(ABI Prism 7700, Perkin-Elmer Inc)を用いた定量的リアルタイムRT-PCRにより、蓄積された蛍光をリアルタイムに検出し、ACE2 mRNAの遺伝子発現を推定した。遺伝子発現を18S mRNAに正規化し、未処理試料における発現レベル(任意に1.0の値とされる)と比較した倍率変化として報告した。

ACE2タンパク質を測定するために、Caco-2細胞を各ウェルから掻爬し、氷冷されたELISAアッセイ用RIPA緩衝液に入れた。Caco-2細胞におけるACE2を定量するために、試料について、メーカーのプロトコルに従って、アンジオテンシン変換酵素2(ACE2)ELISAキット(CusaBio,中国河北省武漢市,カタログ番号：CSB-E17204m)を実施した。簡単に言えば、各試料を試料希釈剤と共に複数のウェル内に積載した。提供された標準溶液から標準曲線を作成した。標準溶液0、6.25、12.5、25、50、100、200、及び400pg/mLを一連のウェルに繰り返して加えた。 試料希釈剤を加えて、各標準ウェルの最終容積を250 mLにした。lOO mLの提供されたビオチン抗体を各ウェルに加えた(lx)後、洗浄工程を経て、lOO mLのHRP-アビジン抗体を加えた(lx)。よく混合するため、これらのプレートをCLARIOstarPlusマルチモードマイクロプレートリーダー(BMG Labtech, Ortenberg,ドイツ)上のシェイクモードに置き、エンドポイントモードにおいてEx/Em=570/540 nmでスキャンした。

結果：
図1から分かるように、アンドログラホリド (UP-A)は、48時間でベロ(AGM)細胞におけるACE2 mRNA発現を有意に減少させ、最も低い用量の1μMで最大な効果が見られた。ウルソール酸(UP-U)は、用量依存的により少ない程度でACE2 mRNA発現を減少させた。ピセイドは、ACE2 mRNA発現に識別可能な効果を有していなかった。

図2は、アンドログラホリド (UP-A)の、ACE2 mRNA発現の減少における有効性を検証し、ヒト肺上皮(A549)細胞において同様の効果が観察されることを示している。24時間で最大な効果は見られ、48時間で下降し、72時間で減少した。これは、複数の投与が必要とされ得ることを示唆している。これは、代謝され得る化合物にとって予期しないものではない。用量応答は、アンドログラホリドが1μMで最大な応答を達成し、0.5μM未満で有効性の喪失が観察され、より高い用量で実質的に活性が増加しないことを示唆している。

ACE2遺伝子発現の低下は、図3に示したデータと一致していた。即ち、ELISAで測定したACE2タンパク質のレベルは、UP-Pと比較して、1μMのアンドログラホリド (UP-A)で処理してから72時間後にCACO-2細胞で減少した。これらのデータに示唆されたように、UP-Aの抗ウイルス活性が少なくとも部分的にACE2の細胞表面発現の減少に起因し、ACE2がSARS-CoV-2の受容体結合ドメイン(RBD)の推定受容体であることが認められた。

Claims (26)

1. アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩から選択される2種以上の化合物を含む、抗ウイルス性配合物。
2. アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及びウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩を含む、請求項１に記載の抗ウイルス性配合物。
3. アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含む、請求項１に記載の抗ウイルス性配合物。
4. ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含む、請求項１に記載の抗ウイルス性配合物。
5. アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩を含む、請求項１に記載の抗ウイルス性配合物。
6. 前記アンドログラホリドの誘導体が、
   14-デオキシ-ジデヒドロアンドログラホリド；
   14-デヒドロキシアンドログラホリド-12-スルホン酸ナトリウム塩；
   14-アルファ-リポイル アンドログラホリド；
   アンドログラフィシド；
   アンドログラパニン；
   14-デヒドロキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド-3,19-ビス(コハク酸)カリウム塩；
   14-デヒドロキシ-11,12-ジデヒドロアンドログラホリド-3,19-ビス(コハク酸)カリウムナトリウム塩；
   (R)-((1R,5aS,6R,9aS)-1,5a-ジメチル-7-メチレン-3-オキソ-6-((E)-2-(2-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)エテニル)デカヒドロ-1H-ベンゾ[c]アザピン-1-イル)メチル2-アミノ-3-フェニルプロパン酸塩；
   2-((1R,5R,6R,8aS)-6-ヒドロキシ-5-(ヒドロキシメチル)-5,8a-ジメチル-2-メチレンデカヒドロナフタレン-l-イル)エチル安息香酸塩；
   (1S,2R,4aS,5R,8aS)-1-ホルムアミド-1,4a-ジメチル-6-メチレン-5-((E)-2-(2-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)エテニル)デカヒドロナフタレン-2-イル5-((R)-1,2-ペンタン酸塩；
   (1S,2R,4aS,5R,8aS)-1-ホルムアミド-1,4a-ジメチル-6-メチレン-5-((E)-2-(2-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)エテニル)デカヒドロナフタレン-2-イル2-ニトロ安息香酸塩；及び
   (S)-(1S,2R,4aS,5R,8aS)-1-ホルムアミド-1,4a-ジメチル-6-メチレン-5-((E)-2-(2-オキソ-2,5-ジヒドロフラン-3-イル)エテニル)デカヒドロナフタレン-2-イル-2-アミノ-3-フェニルプロパン酸塩
   からなる群から選択される、請求項１～５のいずれか1項に記載の抗ウイルス性配合物。
7. １種以上の他の治療薬をさらに含む、請求項１～６のいずれか1項に記載の抗ウイルス性配合物。
8. 前記1種以上の他の治療薬が、抗ウイルス剤である、請求項７に記載の抗ウイルス性配合物。
9. 前記1種以上の他の抗ウイルス剤が、レムデシビル、デキサメタゾン、ギムシルマブ、サリルマブ、トシリズマブ、アナキンラ、ルキソリチニブ、バリシチニブ、フェドラチニブ、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ロピナビル、リチノビル、ファビピラビル、EIDD-2801、バリシチニブ、メチルプレドニゾロン、ヘパリン、亜鉛、アルビジオール/ウミフェノビル、ダルナビル、オセルタミビル、エムトリシチビン、テノホビル、バロキサビル マルボキシル、ダノプレビル、ジピリダモール、フィンゴリモド、ロサルタン、アジスロマイシン、リバビリン、トリアザビリン、トラニラスト、エバスチン、ケルセチン、グリチルリチン、バイカリン、パチョリアルコール、ルテオリン、ヘスペリジン、エモジン、ケンフェロール、リグニン、ベツリン酸、タンシノン、クリプトタンシノン、ジヒドロタンシノン、I、タンシノンIIA、クルクミン、シコノン、及びマトリンからなる群から選択される、請求項８に記載の抗ウイルス性配合物。
10. 請求項１～９のいずれか1項に記載の抗ウイルス性配合物及び少なくとも1種の薬剤的に許容される担体または希釈剤を含む、医薬組成物。
11. Andrographis paniculataの抽出物を、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイド、または誘導体、またはその薬剤的に許容される塩と共に含む、医薬組成物。
12. Andrographis paniculataの抽出物を、Eriobotrya japonica、ローズマリー、及びタイムからなる群から選択される植物の抽出物、及び/またはReynoutria japonicaからの抽出物と共に含む、医薬組成物。
13. 前記組成物が、経口投与に製剤化される、請求項１０～１２のいずれか1項に記載の医薬組成物。
14. 有効量の請求項１～９のいずれか1項に記載の抗ウイルス性配合物または請求項１０～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者におけるウイルス感染を治療または予防する方法。
15. 前記ウイルスが、ピコルナウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、及びメタニューモウイルスからなる群から選択される、請求項１４に記載の方法。
16. 前記ウイルス感染が、COVID-19である、請求項１４または請求項１５に記載の方法。
17. 有効量の請求項１～９のいずれか1項に記載の抗ウイルス性配合物または請求項１０～１３のいずれか1項に記載の医薬組成物を被験者に投与することを含む、それを必要とする被験者における細菌感染を治療または予防する方法。
18. 前記細菌感染が、ウイルス感染に対する二次感染である、請求項１７に記載の方法。
19. ウイルス感染の治療または予防に使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ウイルス性配合物または請求項１０～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
20. 前記ウイルスが、ピコルナウイルス、コロナウイルス、インフルエンザウイルス、パラインフルエンザウイルス、呼吸器多核体ウイルス、アデノウイルス、エンテロウイルス、及びメタニューモウイルスからなる群から選択される、請求項１９に記載の使用のための、請求項１～９のいずれか1項に記載の抗ウイルス性配合物または請求項１０～１３のいずれか1項に記載の医薬組成物。
21. 前記ウイルス感染が、COVID-19である、請求項１９または２０に記載の使用のための、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ウイルス性配合物または請求項１０～１３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
22. 細菌感染の治療または予防に使用するための、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ウイルス性配合物または請求項１０～１３のいずれか1項に記載の医薬組成物。
23. 前記細菌感染が、ウイルス感染に対する二次感染である、請求項２２に記載の使用のための、請求項１～９のいずれか１項に記載の抗ウイルス性配合物または請求項１０～１３のいずれか1項に記載の医薬組成物。
24. ウイルス感染を治療または予防するための医薬品の製造における、アンドログラホリドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩、ウルソール酸、またはその薬剤的に許容される塩、及びピセイドまたは誘導体、またはその薬剤的に許容される塩のうちの2種以上の使用。
25. ウイルス感染を治療または予防するための医薬品の製造における、請求項１～９のいずれか1項に記載の配合物の使用。
26. 細菌感染を治療または予防するための医薬品の製造における、請求項１～９のいずれか1項に記載の配合物の使用。