KR20080082124A

KR20080082124A - 저니코틴 형질전환 담배식물체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR20080082124A
Application number: KR1020070022526A
Authority: KR
Inventors: 김영국; 김현순; 정혁; 노문철; 이현선; 이중구; 전재흥; 권석윤
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2007-03-07
Filing date: 2007-03-07
Publication date: 2008-09-11
Also published as: KR100899993B1

Abstract

본 발명은 RNA 저해 기술을 이용하여 담배식물체에서 푸트레신-N-메틸트랜스퍼라아제(putrescine-N-methyltransferase, PMT) 유전자의 발현을 억제하여 형질전환된 저니코틴 담배 및 그 생산방법에 관한 것으로, 구체적으로 상기 RNA 저해를 위하여 제한효소 BamHI 과 XbaI 또는 BamHI 과 SacI의 인식부위를 포함하는 프라이머를 이용하여, 목표유전자를 증폭하고, 상기 증폭된 목표 유전자 사이에 스페이서(spacer) 유전자를 삽입하여 목표유전자의 발현을 저해하는 RNA 저해기술을 이용하여 저니코틴 형질전환 담배를 생산하는 방법 및 이에 의하여 생산된 저니코틴 담배식물체에 관한 것이다.

RNAi, 저니코틴 담배, 형질전환식물

Description

저니코틴 형질전환 담배식물체 및 이의 제조방법{A Low Nicotine Transgenic Tabacco and A method of producing thereof}

도 1은 pGEM-T easy vector^TM내에 클로닝된 PMT B-S 및 B-X 목표 유전자의 제한효소 반응 결과이다(Lane M : 1kbp ladder, Lane 1 : PMT B-S intact, Lane 2 : PMT B-X intact, Lane 3 : PMT B-X EcoRI cut, Lane 4 : PMT B-X BamHI cut, Lane 5 : PMT B-S EcoRI cut, Lane 6 : PMT B-S BamHI cut).

도 2는 크기가 확인된 유전자절편을 pGEM-T easy vector^TM 내에 삽입하고 벡터 내에 들어간 플라스미드를 확인한 결과이다(lane M: molecular size marker, lane 1, 2, 3 PCR products).

도 3은 서열번호 1,2,3에 제한효소 XbaI, SacI 및 BamHI 인식부위가 첨가된 프라이머를 이용한 PCR 수행 후 결과물의 전기영동 결과이다(lane M: molecular weight marker, lane 1-4 : PCR product S-B, lane 5-6 : PCR product X-B).

도 4는 제한효소 EcoRI 인식부위가 제거된 pXBpmt(pXBpmtΔEcoRI)를 선발하기 위하여 제한효소 XbaI으로 절단한 후 다시 self ligation된 pXBpmt DNA를 추출하여 제한효소 EcoRI으로 절단하여 전기영동한 결과이다(M: molecular weight marker, * : 벡터에 존재하는 EcoRI 인식부위가 제거된 clone, lane 2, 4, 5, 6, 10이 선발되었음).

도 5는 버어리종 담배의 PMT유전자(Group1, Group2)와 잔티종 담배의 PMT유전자(PMT1, PMT2, PMT3, PMT4)의 염기서열이다. 파란색은 공통부분 클로닝을 위한 프라이머 제작에 이용한 서열이다.

도 6은 BamHI 인식부위가 제거된 pBluescript II SK (-) 벡터와 역반복 DNA 절편을 SacI 및 XbaI으로 중복 절단한 후 ligation 반응을 통해 재조합한 결과의 모식도이다.

도 7은 역방향으로 재조합된 목표 PMT 유전자 사이에 약 3.0kbp 크기의 스페이서 유전자를 도입한 후 실시한 전기영동 결과이다.(Lane M; molecular size marker, Lane1: restriction enzyme digested, Lane2: intact)

도 8은 역방향으로 재조합된 목표 PMT 유전자 사이에 삽입하기 위해 증폭된 다양한 크기의 스페이서 유전자이다(도 8a, Lane M: 1kbp ladder, Lane 1-10: spacer 유전자, 도 8b, 스페이서 유전자가 삽입된 후 생성 예측되는 RNA hairpin 구조의 모식도).

도 9는 재조합 유전자가 식물형질전환용 벡터 pBI121에 도입되었음을 확인하는 결과이다.

도 10은 형질 전환된 담배 관련 사진이다(도 10a는 재조합 유전자를 도입시킨 후 배양중인 담배 조직이고, 도 10b는 지상부와 뿌리가 유도된 담배 형질전환체이며. 도 10c는 온실에서 육성중인 형질 전환 담배 식물체이다).

도 11은 형질전환 담배식물체내에 재조합된 유전자가 도입되었음을 확인하는 사진이다(Lane M;100bp ladder marker, Lane 1-3;transgenic plant number 1-3, Lane C1-C2;Control plant number 1-2, : positive signal).

도 12 는 PMT 유전자의 RNAi 용 뉴클레오타이드를 제작하기 위한 목표유전자를 나타낸다. PMT 유전자의 공통부분(서열번호 4)에서 노란색으로 표시되어 있는 cccaaaaa에서 agtatgatcgagt까지(서열번호 11)와 aaatgctt에서 agtatgatcgagt까지(서열번호 12)가 목표유전자로서 벡터에 역반복적으로 도입되고 그사이에 스페이서 유전자가 삽입된다.

담배는 인간의 기호품으로 많은 사람들이 즐겨 왔으나, 최근 건강에 대한 관심이 증가되면서 전세계적으로 금연운동이 확산되고 있으며, 담배향미는 그대로 유지하면서 저니코틴 이고, 저타르인 담배 수요가 증가되고 있다. 따라서, 담배제조회사들은 담배 원료엽의 품질 및 가격경쟁력을 제고할 수 있는 획기적인 기술을 필요로 하고 있는 실정이다.

담배의 니코틴을 포함한 식물의 알칼로이드(alkaloid)는 그 약리적 활성 때문에 생합성과 관련된 많은 연구가 수행(De Luca 1993, Hashimoto and Yamada 1992, Hashimoto and Yamata 1993)되어 왔고, 알칼로이드의 대량생산에 대한 관심도 증가되고 있다(Kinnersley and Dougall 1980, Saitoh et al. 1985, Tiburcio et al. 1985a, 1985b). 그리고 최근에는 알칼로이드의 생합성 과정을 조절하고자 하는 연구도 보고되고 있는 등(Fumihiko 등, 1999) 니코틴 생합성과 관련된 연구가 활발히 이루어지고 있다.

담배에서 알칼로이드는 최근 분석기술의 발달로 니코틴, 노르니코틴(nornicotine) 및 아나바신(anabasine) 등 10여종의 알칼로이드가 검출되었고, 니코틴을 비롯하여 스코폴라민(scopolamine), 버버린(bernerine) 등의 생산과 관련된 몇몇의 유전자가 클로닝되기도 하였다. 또한, Fumihiko 등(1999)은 Hibi 등이 발표한 푸트레신-N-메틸트랜스퍼라아제(putrescine-N-methyltransferase, PMT) 유전자를 이용하여 담배에서 알칼로이드 생합성 과정을 변형하려는 연구를 수행하고 있다.

담배의 대표적 알칼로이드인 니코틴은 트로판 알칼로이드(tropane alkaloid)와 같이 뿌리에서 오르니틴(ornithine)과 아르기닌(arginine)으로부터 생합성 되어진 푸트레신(putrescine)이 N-메틸푸트레신(N-methylputrescine)으로 전환되고 디아민 옥시다아제(diamine oxidase)에 의해 산화된 후 4-메틸아미노부타놀(4-methylaminobutanol)을 거쳐 1-메틸-Δ1-피롤리니움 양이온(1-methyl-Δ1-pyrrolinium cation)이 되고 니코틴산(nicotinic acid)을 거쳐 생합성된다. 그 중에서 푸트레신-N-메틸트랜스퍼라아제(putrescine-N-methyltransferase)는 니코틴의 생합성과정에서 아주 중요한 효소로 니코틴의 생합성과정에서 속도제한효소(Rate limiting enzyme)라고 할 수 있다. Hibi(1994)등은 저니코틴 돌연변이체와 정상 담배를 비교하여 PMT유전자를 클로닝하는데 성공한 바 있다. 또한 Riechers,D.E. 와 Timko,M.P.등(1999)은 담배종 Nicotiana tabacum cv. Xanthi로부터 PMT 유전자를 클로닝하여 염기서열을 보고하였으며, 그 외에도 N.tomentosiformis, N. otophora, N. attenuata등 담배(Nicotiana) 속의 여러 종에 대하여 PMT 유전자의 분석이 이루어진 바 있다. 그러나 PMT 유전자는 Nicotiana 속의 여러 종들 간에서 그 염기서열상 차이점이 발견되고 있으며, N. tabacum 내에서도 cultivar Xanthi로부터는 PMT1, PMT2, PMT3, PMT 4등 네가지의 서로 다른 PMT 유전자가 보고되어 있으나 버 어리종에는 한 종류의 PMT만이 보고되어 있다. 본 발명자들은 담배에서 알칼로이드(alkaloid) 생합성의 효소인 푸트레신-N-메틸트랜스퍼라아제(putrescine N-methyltransferase, PMT)의 유전자의 발현을 억제하여 니코틴 생합성이 저해된 담배를 개발하고, 본 발명을 완성하였다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명의 목적은 RNA 저해 기술을 이용하여 PMT 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 저니코틴 형질전환 담배식물체 생산 방법을 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환 담배식물체 생산 방법에 의하여 생산된 저니코틴 담배식물체를 제공함에 있다.

상기와 같은 목적을 위하여, 본 발명에서는 하나의 양태로, RNA 저해(interference) 기술을 이용하여 푸트레신-N-메틸트랜스퍼라아제(putrescine-N-methyltransferase, PMT) 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 저니코틴 형 질전환 담배식물체 생산 방법을 제공한다. 구체적으로 본 발명은, 상기 RNA 저해를 위해 제한효소 BamHI 과 XbaI 또는 BamHI 과 SacI의 인식부위를 포함하는 프라이머를 이용하여 목표유전자를 증폭하고, 증폭된 상기 목표 유전자 사이에 스페이서 유전자가 삽입되도록 설계된 RNA 저해용 벡터를 이용하는 것을 포함한다.

최근, 유전자 발현 억제 기술로서 안티센스(antisense) 핵산에 의한 방법보다 더 효율적인 유전자 발현 억제 방법으로 RNA 저해(RNA interference, RNAi) 방법이 각광받고 있다.

안티센스 핵산이란 특정 mRNA의 서열에 상보적인 핵산 서열을 함유하고 있는 DNA 또는 RNA 또는 이들의 유도체를 의미하고, mRNA내의 상보적인 서열에 결합하여 mRNA의 단백질로의 번역을 저해한다.

이에 반해, “RNAi”는 식물과 동물에 자연적으로 존재하는 것으로, 어떤 유전자를 특이적으로 ‘침묵하게(silenced)’한다. 이것은 유전자 발현의 조절을 도우며, 바이러스 감염과 복제하여 게놈으로 퍼질 수 있는 ‘점핑 유전자들(jumping genes)’이 가지는 위험으로부터 숙주를 보호한다. 이러한 과정은 인위적으로 만들어진 유전자 서열(tailor-made genetic sequences)을 세포로 삽입하여 실험적으로 유도될 수 있으며, 따라서 표적 유전자를 의도적으로 침묵시키는 한 방법이 된다. 현재 이 방법은 기본적인 유전 도구의 하나로서 널리 이용되고 있으며 또한 유망한 미래 치료 요법 중 하나로 여겨지고 있다. 특정 이중 나선 RNA를 주입하면 상응 유전자를 침묵시킬 수 있으며 수개의 분자만 주입해도 이러한 현상이 일어날 수 있 다.

이중 나선 RNA는 단백질 절단효소(Dicer)에 의해 인식되어, 작은 이중 나선 절편들로 잘린다. 그런 다음, 이 단편들이 단백질 복합체 RISC(RNA-induced silencing complex)에 결합되는데, 이 복합체는 이중 나선 중 한 가닥을 풀어내버리고 작은 한 가닥 RNA(a tiny strip of RNA)를 가지는 복합체가 된다. 이 과정에서 단일 가닥들로 되며, 따라서 단일 가닥의 RNA로 출발될 때는 Dicer나 RISC를 활성화시키지 않기 때문에 그 같은 효과를 가지지 않는다. 이렇게 만들어진 복합체는 자연적으로 생성되는 mRNA에 결합하여 가닥들을 잘라내고 분해함으로써 그의 모 유전자(parent gene)를 침묵시킨다.

표적 유전자의 mRNA를 절단(cleavage)하여 RNA 저해 현상을 유도할 수 있는 이중사슬을 siRNA(short interfering RNA)라고 한다. siRNA는 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 80 염기, 바람직하게는 15 내지 60 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 40 염기이다. siRNA 말단 구조는 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 쪽이 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하고 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예 를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서, 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다. siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트 등을 세포 안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다.

본 발명에서, 용어 “특이적” 또는 “특이적인”은 세포내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 표적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 PMT에 특이적이다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는 이미 클로닝하여 보고된 바 있는 버어리종 담배 PMT유전자와 잔티종 담배의 PMT 유전자를 사용하였다.

본 발명의 siRNA는 담배 식물체에서 PMT의 mRNA를 특이적으로 감소시킬 수 있으며 서열과 길이는 특별히 제한되지 않는다. 상기 유전자 특이적인 siRNA를 포함하는 조성물은 세포사멸을 억제하는 추가의 물질을 포함할 수 있으며, 또한 siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제를 포함할 수 있다. siRNA의 세포내 유입을 촉진시키는 제제에는 일반적으로 핵산 유입을 촉진하는 제제를 사용할 수 있다. 예들 들어, 리포좀을 이용하거나 콜레스테롤, 콜레이트 및 데옥시콜산을 비롯한 다수의 스테롤류중 1종의 친유성 담체와 함께 배합할 수도 있다. 또한 폴리-L-라이신(poly-L-lysine), 스퍼민(spermine), 폴리실아잔(polysilazane), 폴리에틸레민(PEI: polyethylenimine), 폴리디하이드로이미다졸레늄(polydihydroimidazolenium), 폴리알리라민(polyallylamine), 키토산(chitosan) 등의 양이온성 고분자(cationic polymer)를 이용할 수도 있고, 숙실화된 PLL(succinylated PLL), 숙실화된 PEI(succinylated PEI), 폴리글루타믹산(polyglutamic acid), 폴리아스파틱산(polyaspartic acid), 폴리아크릴산(polyacrylic acid), 폴리메타아크릴산(polymethacylic acid), 덱스트란 설페이트(dextran sulfate), 헤파린(heparin), 히아루릭산(hyaluronic acid) 등의 음이온성 고분자(anionic polymer)를 이용할 수도 있다.

담배 식물체의 PMT 유전자의 발현 억제를 위해 상기 RNA 저해 방법을 이용하는데 있어서, 여러 담배개체의 조금씩 다른 PMT 타입에 따라 영향 받을 수 있기 때문에, 여러 담배개체에 사용하기 용이하도록, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 여러 담배개체의 PMT 유전자의 공통염기서열부분(서열번호 4)을 탐색하고, 이를 기초로 서열번호 1,2, 및 3으로 나타낸 특정염기서열에 제한효소 인식부위를 추가한 RNAi용 프라이머를 제작하였다. 이들 프라이머를 이용하여 PMT 유전자의 공통 염기 서열 부분의 단편을 증폭하고, 이들 증폭된 단편이 서로 반대방향으로 반복되게 재조합될 수 있도록 벡터에 도입하였다.

본 발명에서는 상기 역방향으로 반복되어 재조합된 유전자가 생체 내에서 활성을 갖게 하기 위하여 스페이서를 도입하였다. “스페이서”(spacer)는 <시작코돈>-발현부위(코돈들)-<종결코돈>으로 구성되는 2이상의 시스트론(cistron) 사이에 존재하는 유전자로 intergenic DNA 또는 intercistronic sequence 라고도 한다. 스페이서는 특정 단백질을 암호화하지 않으며, 각 코돈사이를 구분해 주는 역할을 한다. 본 발명에서는 스페이서 도입이 가능한 부위를 재조합하여 유전자를 조작하고, 다양한 크기의 스페이서들을 제조하였다. 본 발명의 구체적인 실시예에서는, 약 100bp 내지 3kb 크기의 스페이서들을 제작하여 증폭된 PMT 목표 유전자 절편 사이에 도입하였다. 재조합이 완료된 PMT 유전자에 대한 RNAi용 핵산을 식물 형질전환용 벡터에 재조합하고, 유전자의 증식을 위해 대장균(E.coli) DH5α에 도입하였다. 또한 증식된 상기 재조합 벡터를 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens LBA4404) 균주에 형질 전환하였으며, 형질 전환된 아그로박테리움 균주를 이용하여 식물체내 형질전환을 완성하였다.

본 발명에서는 또 하나의 양태로, RNA 저해 기술을 이용하여 생산된 저니코틴 형질전환 담배식물체를 제공한다. 유전공학적 방법을 이용하여 형질전환 식물체를 얻기 위해서는 목표하는 세포 내로 외래 유전자를 효과적으로 이식시키는 방법, 이에 적합한 목표시료를 얻는 방법, 그리고 형질 전환된 세포에서 완전한 식물체를 얻는 재분화 기술이 반드시 필요하다. 효과적인 식물 세포의 형질전환(유전자 이 식) 방법은 크게 두 가지가 있는데, 첫 번째는 생물학적 벡터를 이용하여 식물세포로 외래 유전자 DNA를 전달하는 방법으로 주로 토양 식물 병원균인 아그로박테리움(Agrobacterium tumefaciens)을 이용하는 방법이고, 두번째는 식물 세포 내로 외래 유전자 DNA를 직접 전달하는 방법으로 DNA로 코팅한 금속미세입자를 투사하는 방법을 들 수 있다 (Hansen and Wright, Trends Plant Sci. 4; 226-231, 1999).

오늘날 가장 보편적으로 이용되고 있는 식물 형질전환 기술은 식물 병원균 아그로박테리움을 이용하는 것으로, 이들 세균은 그들의 Ti(종양 유도성, tumor-inducing) 또는 Ri(뿌리 유도성, root-inducing) 플라스미드 DNA 중 일부(T-DNA)를 감염된 식물 세포 내로 전이 이식시키는 능력을 지니고 있다. 따라서 목적 유전자를 T-DNA 내에 재조합한 후 이를 보유한 균과 식물체를 공동 배양하면 식물 세포의 형질전환이 가능해진다. 그러나, 이 기술의 결정적인 한계는 아그로박테리움과 형질전환 목표 세포와의 숙주 범위(host range)를 포함한 화합성에 있으며, 궁극적으로는 형질전환 세포의 성공적인 재분화까지 영향을 미치게 된다. 따라서 경제적으로 유용한 많은 작물들이 아직 이 방법에 의하여 형질전환이 되지 않고 있다 (Hansen and Wright, Trends Plant Sci. 4; 226-231, 1999).

식물종이나 유전형에 관계없이 유전자 이식이 가능한 방법을 개발하기 위한 노력의 일환으로, DNA를 식물 세포로 직접 전달하는 몇 가지 기술이 연구되었으며, 이들에는 전기충격에 의한 DNA 주입법(electroporation), 미세주사 법(microinjection), PEG- 또는 리포좀-매개를 이용한 DNA 흡입, 탄화실리콘 휘스커스(silicon carbide whiskers), 그리고 미세입자 투사법 등이 있다. 이들 가운데 바이오리스틱스(biolistics) 또는 마이크로 프로젝타일스 (microprojectiles)로 알려져 있는 미세입자 투사 기술은 작은 캐리어 금속 입자들에 목적재조합 유전자 DNA를 코팅하고, 이 입자들을 물리적으로 식물 세포 내로 투사시키는 것이다 (Klein et al., Nature 327; 70-73, 1987: Sanford, Plant Physiol. 79; 206-209, 1990). 이러한 방법은 몇 가지 장점을 가지고 있다. 첫째, DNA를 도입하는 데에 세포벽의 제거가 필요하지 않다. 둘째, DNA를 분열조직 및 분화된 조직의 세포 내로 쉽게 도입할 수 있다. 셋째, 특별한 생물학적 운반체의 조작이 필요하지 않다. 마지막으로, 세포 내로 DNA를 전이하는 데에 형질전환 목표 세포와 생물학적 벡터의 결합 내지 상호 인식에 의존하지 않는다. 이들 입자투사 방법으로 형질 전환된 사례를 보면 옥수수 (Fromm et al.,1990 Biotechnology 8; 833-839, 1990), 쌀 (Christou et al., Biotechnology 9; 957-962, 1991), 보리 (Wan and Lemaux, Plant Physiol. 104; 37-48, 1994), 밀 (Vasil et al., 1992 Biotechnology 10; 667-674, 1992), 대두(McCabe et al., Biotechnology 6; 923-926, 1988), 사탕수수 (Bower and Birch, Plant J. 2; 409-416, 1992) 등 중요 작물에서 증명되어진 바 있다. 이 방법의 장점은 형질전환 세포에서 재 분화되는 신초를 일차 및 이차 분열조직으로부터 직접 발생시킬 수 있어 식물 호르몬의 처리를 줄이고 체세포변이를 최소화할 수 있다는 것이다.

본 발명의 구체적인 실시예에서는 동결-해동법(Freeze-thaw법, An et al. 1988)에 의하여 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 유전자를 도입하였다. 유전자가 도입된 후 배양하여 얻은 형질전환 아그로박테리움은 LB(카나마이신) 배지에서 증식시켜 다시 플라스미드를 추출하였으며, 대장균으로 백 트랜스포메이션(back transformation)을 실시한 후 다시 플라스미드를 추출하여 제한효소 처리 등을 통해 확인하였다.

본 발명에서, 유전자의 증식을 위한 균주로는 대장균(E. coli) DH5α를 사용하였고, 식물 형질전환용 균주로는 Agrobacterium tumefacience LBA4404를 사용하였다. 균주의 증식을 위한 배지로는 LB배지(1% Bacto tryptone, 0.5% Bacto yeast extract, 1% NaCl)를 사용하였으며 필요에 따라 항생제 앰피실린(ampicillin), 세파탁심(cefataxime) 및 카나마이신(kanamycin)을 첨가하여 사용하였다. 기타 제한효소, 리가아제(ligase), Taq polymerase등은 InvitrogenTM, TakaraTM, LocheTM등의 제품을 사용하였다.

본 발명의 형질 전환된 식물체제조를 위한 형질전환 담배 조직은 호르몬 BAP(6-Benzylaminopurine이 첨가된 배지에서 발아 유도하였고, 뿌리의 발생은 식물 호르몬인 IAA(Indole 3-acetic acid)로 뿌리의 발생을 유도하였다. 이 중에서 16 개체가 완전한 식물체로 육성되었으며 재조합 유전자가 도입되었음을 확인하였다. 재분화된 식물체의 T₀세대 및 T₁세대 식물체들은 형질 전환되기 이전의 정상식물체와 비교하여 니코틴 합성이 70% 이상 억제되었으며, 형질전환 2세대 식물에서는 니코틴 합성이 94% 억제된 식물체를 선발하였다.

본 발명의 니코틴 합성이 억제된 식물 중 계통명 R-6의 종자(seed)를 2007년 2월 23일 한국생명공학연구원 유전자은행에 Nicotiana tabacum denico R-6로 기탁하였다(기탁번호 KCTC11072BP).

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1. RNA 간섭( interference )을 위한 목표 유전자 제조

RNAi 기술을 도입하기 위하여 목표 PMT 유전자의 절편이 반대방향으로 반복되게 클로닝된 핵산서열을 제조할 필요가 있다. PMT 타입에 따라 영향을 받지 않도록 하기 위하여 버어리종 PMT 유전자와 잔티종의 PMT 1,2,3, 및 4유전자의 공통부분(서열번호 4)을 탐색한 후 이를 기초로 PCR을 통해 클로닝하기 위한 프라이머를 선정하였다(아래 서열번호 4에서 밑줄친 부분 및 서열번호 1 내지 3 참조). 서열번호 1,2,3의 양 끝에 SacI, XbaI 및 BamHI등 제한효소 인식부위를 삽입하여 목표 유 전자를 역방향으로 반복하여 클로닝하기 용이하도록 설계 하였으며, 이 프라이머와 공통부분을 주형으로 한 PCR을 수행하여 목표 유전자를 증폭하였다. 전기영동을 통해 크기가 확인된 유전자절편은 pGEM-T easy vector^TM 내에 삽입하고 삽입여부를 제한효소로 처리하여 확인한 뒤, 염기서열을 분석하여 유전자를 확인하였다(도 1, 도 2). 서열번호 1 과 3을 프라이머의 부분으로 이용하여 증폭한 PMT 목표 유전자(서열번호 11)와 서열번호 2 와 3을 프라이머의 부분으로 이용하여 증폭한 PMT 목표 유전자 사이(서열번호 12)에 스페이서 유전자를 삽입하여 RNAi용 재조합 뉴클레오타이드를 제조하였다. 상기 목표 유전자들은 도 12에서 나타낸 바와 같이 노란색으로 표시되어 있는 cccaaaaa에서 agtatgatcgagt까지의 서열(서열번호 11)과 aaatgctt에서 agtatgatcgagt까지의 서열(서열번호 12)로 나타낼 수 있고, 이들은 재조합 벡터내에 역반복적으로 도입된다.

a forward primer1 for target PMT gene PCR (서열번호 1)

cccaaaaaag gttttgatca tcg

a forward primer2 for target PMT gene PCR(서열번호 2)

aatgcttcgt tatccttcaa tcg

a reverse primer for target PMT gene PCR(서열번호 3)

atctttcgcc agaagtatga tcgag

<공통부분 클로닝을 위하여 탐색한 PMT 유전자(서열번호 4)>

tccgactcta ttaagcctgg ctggttttca gagtttagcg cattatggcc aggtgaagca ttctcactta aggttgagaa gttactattc caggggaagt ctgattacca agatgtcatg ctctttgagt cagcaactta tgggaaggtt ctgactttgg atggagcaat tcaacataca gagaatggtg gatttccata cactgaaatg attgttcatc taccacttgg ttccatccca aacccaaaaa aggttttgat catcggcgga ggaattggtt ttacattatt cgaaatgctt cgttatcctt caatcgaaaa aattgacatt gttgagatcg atgacgtggt agttgatgta tccagaaaat ttttccctta tctggcagct aattttaacg atcctcgtgt aaccctagtt ctcggagatg gagctgcatt tgtaaaggct gcacaagcgg gatattatga tgctattata gtggactctt ctgatcccat tggtccagca aaagatttgt ttgagaggcc attctttgag gcagtagcca aagcccttag gccaggagga gttgtatgca cacaggctga aagcatttgg cttcatatgc atattattaa gcaaatcatt gctaactgtc gtcaagtctt taagggttct gtcaactatg cttggacaac cgttccaaca tatcccaccg gtgtgatcgg ttatatgctc tgctctactg aagggccaga agttgacttc aagaatccag taaatccaat tgacaaagag acaactcaag tcaagtccaa attaggacct ctcaagttct acaactctga tattcacaaa gcagcattca ttttaccatc tttcgccaga agtatgatcg agtc

밑줄친 부분(서열번호 1, 2, 3)의 양 끝에 SacI(GAGGCT/C), XbaI(T/CTAGA) 및 BamHI(G/GATCC) 등 제한효소 인식부위를 첨가한 서열을 프라이머로 이용하였다.

실시예 2. 관련유전자의 클로닝 및 시퀀싱

PCR 생산물을 Invitrogen^TM사의 PCR 클로닝 벡터 pDrive^TM에 라이게이션(ligation)하였으며, 클로닝된 인서트(insert)를 확인하기 위하여 추출한 DNA를 EcoRI으로 절단 후 1% 아가로스 겔에서 전기영동하여 비교하였다(도 4). 기타 라이게이션, 제한효소반응 및 전기영동 등은 Sambrook 등의 "Melocular cloning laboratory manual" 및 제조회사의 제품 매뉴얼(product manual)을 따라 수행하였다. 클로닝된 유전자는 BigDyeTM 사이클 시퀀싱 키트로 반응시킨 후 ABITM사의 자동 염기서열분석장치(autosequencer) 377TM에서 시퀀싱을 수행하였으며 그 결과를 Genebank의 데이터 베이스와 ClustalW을 이용하여 분석하였다. (도 5)

실시예 3. RNAi 용 재조합 벡터의 개발

RNAi의 효과적인 작용을 위해 목표 유전자를 역방향으로 반복 도입시켜 재조합하는 것이 필수적이므로, 실시예 1에서 제조한 목표 유전자인 PMT 유전자의 절편을 제한효소를 사용하여 서로 역방향이 되도록 pBluescriptⅡSK(-)벡터에 도입하였다(도 6참조). 도 6과 같이 작제된 유전자가 역방향으로 도입된 벡터에 상기 목표 유전자 사이에 형성된 스페이서 삽입 부위에 약 3kbp 크기의 스페이서 유전자를 삽입하고 이를 확인하였다(도 7).

상기 스페이서 유전자는, 스페이서 크기에 따라 RNAi 활성에 영향을 미칠 것을 예상하여, 다음과 같은 서열(서열번호 5)을 반복 단위로서 연이어 붙여 10종의 다양한 크기의 스페이서 유전자를 합성 하였으며, 이를 실시예 1에서 제조한 목표유전자가 역방향으로 도입된 pBluescript II SK+ 에 재조합한 후 확인하였다(도 8a).

5‘-TACGAGGATC CTTTGAGGTA ATTAATATTC TAATACACAT GCTTTAATTT

3'-ATGCTCCTAG GAAACTCCAT TAATTATAAG ATTATGTGTA CGAAATTAAA

AAAGTGATAC TTTTAATTTA CTTTTAGTTT ATTGCATGTG CACGTACAGT

TTTCACTATG AAAATTAAAT GAAAATCAAA TAACGTACAC GTGCATGTCA

CAGCAACTTA TGGATCCTAC GA-3'

GTCGTTGAAT ACCTAGGATG CT-5'(서열번호 5)

목표 유전자 사이에 스페이서 유전자가 재조합된 RNAi 뉴클레오티드는 도 8b에 나타낸 바와 같이 스페이서 유전자의 크기에 따라 헤어핀 루프의 크기가 다른 헤어핀 구조를 나타내는 것으로 예상된다(도 8b). 이와 같이 제작한 RNAi 용 뉴클레오티드를 틀로닝하여 식물형질전환용 벡터인 pB1121에 도입하고 이를 확인하였다(도 9).

실시예 4. 관련유전자의 식물체 도입

동결-해동법(Freeze-thaw법, An et al. 1988)에 의하여 실시예 3에서 제조한 형질전환용 벡터 pB1121을 Agrobacterium tumefaciens LBA4404에 도입하였다. 형질전환된 아그로박테리움은 LB(카나마이신) 배지에서 증식시켜 이로부터 다시 플라스미드를 추출하였으며, 추출된 플라스미드를 대장균 DH5α에 백 트랜스포메이션(back transformation)시킨 후 다시 플라스미드를 추출하여 제한효소 처리 등을 통해 관련 유전자의 도입을 확인하였다.

실시예 5. RNAi 기술을 이용한 담배 형질 전환체의 개발

RNAi 유전자가 도입될 담배 식물체의 엽육조직을 70% 알콜 및 1% sodium hypochloride를 이용하여 제균한 후 0.5 X 0.5 (cm X cm)의 크기로 절단하였으며, 이를 MS 배지(Murashige & Skoog, 1962)에서 실시예 5에 따라 형질전환된 아그로박테리아 (agrobacteria)와 함께 배양하여 형질 전환하였다. 형질 전환된 작은잎(leaflet)은 4주간 1.0mg/l 벤질아미노퓨린(6-Benzylaminopurine)과 100mg/l 카나마이신을 포함하는 MS 배지인 발아유도배지에서 4주간 배양하여 발아(shoot) 및 캘러스를 유도하였다. 이를 다시 0.1mg/l 초산인돌 (Indole 3-acetic acid), 300mg/l 세포탁심(cefotaxim) 및 100mg/l 카나마이신을 포함하는 MS 배지인 발근(root) 유도배지에 옮겨 뿌리를 유도하였다(도 10a). 배양된 형질전환 담배 조직은 호르몬 BAP(6-Benzylaminopurine)가 첨가된 배지에서 발아 유도하였고, 식물 호 르몬인 IAA(Indole 3-acetic acid)로 뿌리의 발생을 유도하였으며(도 10b), 이 중 8개체는 완전한 식물체로 육성되어 온실에서 생육하였다(도 10c).

실시예 6. 형질전환 식물체의 검정

온실에서 생육한 형질전환식물체 내에 RNAi 재조합 벡터가 도입되었음을 확인하기 위하여 형질전환 식물체로부터 DNA를 추출하고, 추출된 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였으며, 그 결과 재조합된 유전자가 정상적으로 도입되었음을 확인하였다(도 11).

Qiagen^TM사 DNA isolation kit를 사용하여 형질전환 식물체에서 DNA를 추출하였고, Qiagen^TM사의 One Shot RT-PCR cloning kit을 이용하여 RT-PCR 반응을 수행하였다. PCR은 PerkinElmer^TM 사의 GeneAmp 9600^TM에서 Takara^TM사의 ExTaq^TM을 사용하여 수행하였으며, RT-PCR 반응은 총 20ul의 반응액에서 94℃에서 15분간 가열한 후, 94℃에서 1분30초간 denature, 72℃에서 1분간 anealing, 55℃에서 1분간 extension의 반응을 35cycle로 하여 반응하였다. 이 후 72℃에서 15분간 반응하고 4℃에서 보관하였다. RT-PCR을 통해 얻어진 product를 확인하기 위해 실시한 second PCR의 반응은 94℃에서 15분간 가열한 후, 94℃에서 1분30초간 denature, 72℃에서 1분간 anealing, 55℃에서 1분간 extension의 반응을 35cycle로 하여 반응하였다. RT-PCR 및 PCR에 사용한 프라이머는 Nicotiana 속의 다양한 종으로부터 알려진 PMT 유전자의 염기서열을 Gene Bank로부터 검색하여 잘 보존되어 있는 부분 을 프라이머(서열번호 6 내지 10)로 제작하여 사용하였다. 결과 반응물은 0.8% ～ 1.2% 아가로스 겔 상에서 전기영동으로 확인하였다(도 3).

1F(first forward) : 5'- ggaagtcatatctaccaacac- 3',(서열번호 6)

2R(second reverse) :5'- gccataatgcgctaaactctg -3', (서열번호 7)

3F(third forward): 5'- tttgcaggtgaagcattctcac -3', (서열번호 8)

4R(forth reverse): 5'- gactcgatcatacttctggcg -3', (서열번호 9)

5R(fifth reverse): 5'- atcaactaccacgtcatcg -3', (서열번호 10)

실시예 7. 형질전환 식물체의 니코틴 합성조사

형질전환 담배 식물체의 잎을 생육시기별로 채취하여 60℃에서 2일간 건조시킨 후 니코틴 합성량을 GC-FID를 사용하여 정량분석하였다. T₀세대 형질전환 식물체에서 재분화된 형질전환 1세대 8계통 식물체들의 니코틴 합성정도를 조사한 결과는 표 1과 같다.

표 1. 형질전환연초식물체(T ₀ 세대)의 적심후 니코틴 함량조사(1차년 재분화, ug/g)

계통명	구분	적심 후
R-1	형질전환식물	2622(73%감소)
R-1	정상식물	9836
R-2	형질전환식물	1493(72%감소)
R-2	정상식물	5301
R-3	형질전환식물	2019(51%감소)
R-3	정상식물	4099
R-4	형질전환식물	1794(60%감소)
R-4	정상식물	4472
R-5	형질전환식물	1686(60%감소)
R-5	정상식물	4170
R-6	형질전환식물	645(64%감소)
R-6	정상식물	1815
R-7	형질전환식물	660(77%감소)
R-7	정상식물	2871
R-8	형질전환식물	634(71%감소)
R-8	정상식물	2190

니코틴 합성 억제 정도는 대조구와 비교하여 51% 에서 77% 까지 억제되었으며, 식물체별로 차이가 있었다.

새롭게 재분화된 형질전환 식물체 1세대 7계통을 생육시기별로 유식물체, 적심전과 적심후 각각의 시료를 채취하여 니코틴 합성 억제 정도를 조사하였다(표 2).

본 발명에서 니코틴 합성이 억제된 식물 중 계통명 R-6의 종자를 2007년 2월 23일 한국생명공학연구원 유전자은행에 Nicotiana tabacum denico R-6로 기탁하였다(기탁번호 KCTC11072BP).

표 2. 형질전환연초식물체(T ₀ 세대)의 생육시기별 니코틴 함량조사( 2차년 재분화, ug /g)

계통명	구분	유식물체	적심전	적심후27일
R-9	형질전환식물	2090(29%감소)	5353(37%감소)	20752(43%감소)
R-9	정상식물	2957	8480	36248
R-10	형질전환식물	1715(18%감소)	3330(60%감소)	23567(48%감소)
R-10	정상식물	2081	8269	45028
R-11	형질전환식물	875(54%감소)	3242(68%감소)	6564(87%감소)
R-11	정상식물	1922	10044	50233
R-12	형질전환식물	1148(82%증가)	8716(1%증가)	32980(36%감소)
R-12	정상식물	631	8612	51254
R-13	형질전환식물	606(26%감소)	4965(54%감소)	6597(5%감소)
R-13	정상시물	821	10702	6959
R-14	형질전환식물	953(44%감소)	1751(84%감소)	3869(45%감소)
R-14	정상식물	1715	10811	6972
R-15	형질전환식물	-	-	7235(34%감소)
R-15	정상식물	-	-	10939

유식물체와 적심 전 식물체에서는 니코틴 합성 억제 정도가 다양하였으며 R-11 형질전환 식물체는 적심 전에는 68%억제되고 적심 후에는 87%감소되었다. 형질전환된 식물체는 형질전환되지 않은 정상식물체와 비교하여 니코틴 합성이 억제되었으며 합성 억제정도는 다양하였고 최대 87%까지 억제된 식물체도 선발되었다. 이들 형질전환 식물체들의 2세대식물체들의 니코틴 합성 억제정도를 조사하기 위하여 각각 식물체들의 채종을 실시하였다.

실시예 8. 형질전환 2세대 식물체의 니코틴 함량 조사

채종된 형질전환 식물체들을 온실과 포장에서 각각 T₁ 세대에서 생육시기별로 니코틴 합성 억제정도를 조사하였다(표 3, 표 4). 형질전환 식물에 2세대 식물체들은 생육시기에 무관하게 니코틴 합성이 억제되었으며, 니코틴 최대 합성기인 적심 후에도 다양하게 합성이 억제되었고, 이 결과는 형질전환 식물체 1세대와 유사하였다. R-8계통에서는 최대 94%까지 니코틴 합성이 억제되는 식물체가 선발되었 다.

표 3. 온실에서 재배한 형질전환 2세대식물체(R ₁ 세대)의 생육시기별 평균 니코틴 함량 조사(ug/g)

계통명	유식물체	적심전	적심후
R-1	2666(46%감소)	2134(53%감소,최저84%감소)	2417(66%감소,최저84.3%감소)
R-2	3603(27%감소)	2183(52%감소,최저79%감소)	2779(61%감소,최저85.1%감소)
R-3	5467(10%증가)	3490(23%감소,최저61%감소)	7967(11%감소,최저78.5%감소)
R-4	6840(37%증가)	4126(9%감소,최저62%감소)	6460(10%감소,최저59.5%감소)
R-5	6362(28%증가)	5230(15%증가,최저59%감소)	7924(10%증가,최저46.8%감소)
R-5-1	5496(10%증가)	5188(14%증가,최저39%감소)	9507(32%증가,최저23%감소)
R-6	2791(44%감소)	2731(40%감소,최저82%감소)	3352(53%감소,최저83%감소)
R-7	3965(20%감소)	2902(36%감소,최저83%감소)	3751(48%감소,최저87%감소)
R-8	1776(64%감소)	853(82%감소,최저88%감소)	1130.7(84%감소,최저94%감소)
정상식물	4969	4551	7182

표 4. 포장에서 재배한 형질전환 2세대식물체 ( R1 세대)의 생육시기별 평균

니코틴 함량 조사( ug /g)

계통명	적심전	적심후
R-1	3310(61%감소,최저85%)	16468(53%감소,최저81%감소)
R-2	3573(58%감소,최저82%)	18779(46%감소,최저82%감소)
R-3	8890(6%감소,최저27%)	38672(10%감소,최저30%감소)
R-4	10.023(19%증가,최저18%)	32636(6%감소,최저46%감소)
R-5	10,495(25%증가,최저22%)	29624(15%감소,최저60%감소)
R-5-1	10,195(21%증가,최저26%)	31795(9%감소,최저42%감소)
R-6	5105(39%감소,최저84%)	15411(56%감소,최저85%감소)
R-7	6718(60%감소,최저69%)	22046(37%감소,최저82%감소)
R-8	2487(70%감소,최저89%)	7560(78%감소,최저94 %감소)
정상식물	8426	34880

본 발명에서는 RNA 저해 기술을 이용하여 담배 식물체에서 PMT 유전자의 발현을 억제한 저니코틴 담배를 육성하였는바, 이는 니코틴 함량이 적은 고품질의 담 배를 제조하기 위한 원료로 이용가치가 높다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and biotechnology <120> A Low Nicotine Transgenic Tabacco and A method of prodicing thereof <130> PA9612-985KR <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a forward primer1 for target PMT gene PCR <400> 1 cccaaaaaag gttttgatca tcg 23 <210> 2 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a forward primer2 for target PMT gene PCR <400> 2 aatgcttcgt tatccttcaa tcg 23 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> a reverse primer for target PMT gene PCR <400> 3 atctttcgcc agaagtatga tcgag 25 <210> 4 <211> 884 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PMT gene for common gene cloning <400> 4 tccgactcta ttaagcctgg ctggttttca gagtttagcg cattatggcc aggtgaagca 60 ttctcactta aggttgagaa gttactattc caggggaagt ctgattacca agatgtcatg 120 ctctttgagt cagcaactta tgggaaggtt ctgactttgg atggagcaat tcaacataca 180 gagaatggtg gatttccata cactgaaatg attgttcatc taccacttgg ttccatccca 240 aacccaaaaa aggttttgat catcggcgga ggaattggtt ttacattatt cgaaatgctt 300 cgttatcctt caatcgaaaa aattgacatt gttgagatcg atgacgtggt agttgatgta 360 tccagaaaat ttttccctta tctggcagct aattttaacg atcctcgtgt aaccctagtt 420 ctcggagatg gagctgcatt tgtaaaggct gcacaagcgg gatattatga tgctattata 480 gtggactctt ctgatcccat tggtccagca aaagatttgt ttgagaggcc attctttgag 540 gcagtagcca aagcccttag gccaggagga gttgtatgca cacaggctga aagcatttgg 600 cttcatatgc atattattaa gcaaatcatt gctaactgtc gtcaagtctt taagggttct 660 gtcaactatg cttggacaac cgttccaaca tatcccaccg gtgtgatcgg ttatatgctc 720 tgctctactg aagggccaga agttgacttc aagaatccag taaatccaat tgacaaagag 780 acaactcaag tcaagtccaa attaggacct ctcaagttct acaactctga tattcacaaa 840 gcagcattca ttttaccatc tttcgccaga agtatgatcg agtc 884 <210> 5 <211> 122 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> spacer gene <400> 5 tacgaggatc ctttgaggta attaatattc taatacacat gctttaattt aaagtgatac 60 ttttaattta cttttagttt attgcatgtg cacgtacagt cagcaactta tggatcctac 120 ga 122 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first forward primer for RT-PCR and PCR <400> 6 ggaagtcata tctaccaaca c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second reverse primer for RT-PCR and PCR <400> 7 gccataatgc gctaaactct g 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> third forward primer for RT-PCR and PCR <400> 8 tttgcaggtg aagcattctc ac 22 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forth reverse primer for RT-PCR and PCR <400> 9 gactcgatca tacttctggc g 21 <210> 10 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> fifth reverse primer for RT-PCR and PCR <400> 10 atcaactacc acgtcatcg 19 <210> 11 <211> 641 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target gene1 for RNAi <400> 11 cccaaaaaag gttttgatca tcggcggagg aattggtttt acattattcg aaatgcttcg 60 ttatccttca atcgaaaaaa ttgacattgt tgagatcgat gacgtggtag ttgatgtatc 120 cagaaaattt ttcccttatc tggcagctaa ttttaacgat cctcgtgtaa ccctagttct 180 cggagatgga gctgcatttg taaaggctgc acaagcggga tattatgatg ctattatagt 240 ggactcttct gatcccattg gtccagcaaa agatttgttt gagaggccat tctttgaggc 300 agtagccaaa gcccttaggc caggaggagt tgtatgcaca caggctgaaa gcatttggct 360 tcatatgcat attattaagc aaatcattgc taactgtcgt caagtcttta agggttctgt 420 caactatgct tggacaaccg ttccaacata tcccaccggt gtgatcggtt atatgctctg 480 ctctactgaa gggccagaag ttgacttcaa gaatccagta aatccaattg acaaagagac 540 aactcaagtc aagtccaaat taggacctct caagttctac aactctgata ttcacaaagc 600 agcattcatt ttaccatctt tcgccagaag tatgatcgag t 641 <210> 12 <211> 591 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target gene2 for RNAi <400> 12 aaatgcttcg ttatccttca atcgaaaaaa ttgacattgt tgagatcgat gacgtggtag 60 ttgatgtatc cagaaaattt ttcccttatc tggcagctaa ttttaacgat cctcgtgtaa 120 ccctagttct cggagatgga gctgcatttg taaaggctgc acaagcggga tattatgatg 180 ctattatagt ggactcttct gatcccattg gtccagcaaa agatttgttt gagaggccat 240 tctttgaggc agtagccaaa gcccttaggc caggaggagt tgtatgcaca caggctgaaa 300 gcatttggct tcatatgcat attattaagc aaatcattgc taactgtcgt caagtcttta 360 agggttctgt caactatgct tggacaaccg ttccaacata tcccaccggt gtgatcggtt 420 atatgctctg ctctactgaa gggccagaag ttgacttcaa gaatccagta aatccaattg 480 acaaagagac aactcaagtc aagtccaaat taggacctct caagttctac aactctgata 540 ttcacaaagc agcattcatt ttaccatctt tcgccagaag tatgatcgag t 591

Claims

RNA 저해(RNAi: RNA interference) 기술에 의해 푸트레신-N-메틸트랜스퍼라아제(putrescine-N-methyltransferase, PMT) 유전자의 발현을 억제하는 단계를 포함하는 저니코틴 형질전환 담배식물체의 생산 방법.
제1항에 있어서, 상기 RNA 저해 기술은 담배식물체의 PMT 유전자의 종간 공통되는 mRNA 부분에 상보적인 센스 RNA 가닥 및 이에 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 이루어지는 siRNA(small intereference RNA) 또는 상기 공통되는 mRNA 부분에 상보적인 서열로 이루어지는 둘 이상의 타겟 뉴클레오티드 사이에 스페이서 유전자가 삽입된 RNAi 용 재조합 뉴클레오티드를 담배식물체에 형질 전환하는 것을 포함하는 것인 저니코틴 형질전환 담배식물체의 생산 방법.
제2항에 있어서, 상기 RNAi 용 재조합 뉴클레오티드는 서열번호 11과 서열번호 12의 PMT 유전자 단편 사이에 스페이서 유전자가 삽입되어 있는 것을 특징으로하는 저니코틴 형질전환 담배식물체 생산 방법.
제3항에 있어서, 상기 스페이서 유전자는 서열번호 5인 것을 특징으로 하는 저니코틴 형질전환 담배식물체 생산 방법.
제2항 또는 제3항에 있어서, 상기 형질 전환은 상기 RNAi 용 재조합 뉴클레오티드가 도입된 아그리박테리움 균주를 담백식물체에 형질 전환시켜 이루어지는 것인 저니코틴 형질전환 담배식물체의 생산 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 방법으로 생산된 PMT 유전자의 발현이 억제되어 니코틴 생성량이 50 % 이상 감소된, 저니코틴 형질전환 담배식물체.
제6항에 있어서, 상기 담배식물체가 버어리종인 것을 특징으로 하는 저니코틴 형질전환 담배식물체.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 방법으로 생산된 니코틴 생성량이 50% 이상 감소된 저티코틴 형질전환 담배식물체인 Nicotiana tabacum denico R-6의 종자(seed)(기탁번호 KCTC11072BP).