KR20080059223A

KR20080059223A - 적상추

Info

Publication number: KR20080059223A
Application number: KR1020087009212A
Authority: KR
Inventors: 코르넬리스 마리너스 무어; 에그베르트 카롤루스 요한스 스밋츠; 아드리아누스 마르티누스 요제프 아메르란; 요한스 빌헬무스 슈트; 코르넬리우스 레닉크
Original assignee: 리즈크 즈완 자드틸트 엔 자드한델 비.브이.
Priority date: 2005-09-20
Filing date: 2006-09-20
Publication date: 2008-06-26
Also published as: JP5697305B2; UA68619U; US20090106867A1; JP2009508504A; TNSN08115A1; MA29863B1; CA2621566A1; JP2013162793A; ZA200802276B; CN103250625B; WO2007039137A1; NZ594424A; IL189973A; IL189973A0; CA2621566C; CN101272682B; AU2006299131A1; EP1763991A1; NZ566640A; RU2012114611A

Abstract

본 발명은 고갱이를 포함하여 결구 전체에 적색 잎이 있는 락투카 사티바(Lactuca sativa) 종의 결구 형성 상추 식물에 관한 것이다. 고갱이의 적색 잎은 400 nm 보다 짧은 파장의 광이 없는 조건에서도 적색이 되며, 상기 400 nm 보다 짧은 파장의 광이 없는 조건은 파종하여 관찰할 때까지의 전체 기간동안의 생육 조건이다. 안토시아닌 대 엽록소 비는 4 내지 50이고, 바람직하기로는 9 내지 27이다. 또한, 본 발명은 상기 식물의 자손에 관한 것이다.

Description

적상추{RED LETTUCE}

본 발명은 적상추 식물, 그로부터 수득가능한 상추의 결구(head) 및 상추의 적색을 담당하는 유전자 복합체에 관한 것이다.

라이프스타일 변화와 레스토랑 및 요식업계의 다채롭고 주의를 끄는 장식에 대한 요구 뿐만 아니라 심지어 주부들의 즉시 사용가능하게 가공된 샐러드에 대한 요구가 계속하여 증가하고 있다. 그 결과, 육종 회사들에서는 이목을 끄는 색상, 우수한 맛 및 매우 다양한 질감을 가진 변이체들을 모색하고 있다. 상추 시장은 3가지 그룹, 즉 온전한 전체 결구, 프리-컷(pre-cut) 전체 결구 및 새싹으로 나눌 수 있다.

현재, 프리-컷 상추 조합물들에서 매력적인 적색은 흔히 현재 시판되는 "적(red)" 상추(Lactuca sativa), 또는 라디끼오 로쏘(radicchio rosso)(Cichorium intybus), 적양배추 또는 적근대로 제공된다. 지금까지 알려진 "적" 상추는 실제 잎 전체가 적색을 띄는 것은 아니다. 특히, 결구를 형성하는 타입들은 잎 가장자리 부분만 적색이거나 또는 적색 반점을 가지고 있다. 이러한 타입은 고갱이 전체에 적색을 띄진 않는다. 이는 일광, 보다 구체적으로는 자외선에 노출된 결구 부분에서만 적색이 나타난다는 사실에 의한 것이다. 이른바 "적" 상추의 잎은 따라 서 주된 부분은 녹색이므로, 이의 적색이 프리-컷 상추 조합의 적색 효과를 제공하긴 거의 어렵다.

흔히 잎의 적색 부분과 녹색 부분 사이의 과도기적 부분은 갈색을 띈다. 이러한 갈색은 가시적으로는 매력적이지 않은 것으로 보인다. 적색 반점의 상추는 식물의 질병 또는 혈흔과 관련있다. 현재 식물 육종가는 갈색 뿐만 아니라 적색 반점이 아닌 것을 선택한다. 게다가, 갈색 반점이 있거나 갈색을 띄는 상추 잎은 상추 포장업계에서, 그리고 소비자에 의해 폐기된다.

상추 이외의 다른 야채의 잎을 이용하는 경우의 문제점은, 이들 다른 야채들의 상이한 맛은 흔히 탐탁지 않은 것으로 경험된다는 것이다. 예컨대 라디끼오 로쏘는 쓴맛을 가진 치코리움 인티버스(Cichorium intybus)이다. 적양배추의 질감은 상추의 훨씬 연한 질감과는 완전히 다르다.

상추에서 안토시아닌 합성은 자외선에 의해 유발된다(예로, Voipio & Autio, 1995, Responses of red-leaved lettuce to light intensity, UV-A radiation and root zone temperature. In: Acta Horticulturae 399. Greenhouse environmental control and automation. Eds. BJ Bailey, T Takakura. Kyoto, Japan, p 183-187; Benoit, et al., 1998, Effect of a photoselective greenhouse film on a few vegetable crops in the Belgian North Sea climate. In: 14th International congress on plastics in agriculture, Tel Aviv, Israel, March 1997. Laser Pages Publishing, Jerusalem, Israel, p 81-92; Krizek et al., 1998, Inhibitory effects of ambient levels of solar UV-A and UV-B radiation on growth of cv. New Red Fire lettuce. Physiologia Plantarum 103(1), p 1-7; Kleinhenz et al., 2003, Variety, shading, and growth stage effects on pigment concentrations in lettuce grown under contrasting temperature regimens. Hortechnology 13(4), p677-683을 참조함). 많은 식물종들에서 적색 발현은 안토시아닌 생산에 의해 좌우된다.

여러가지 많은 상추 변이체들은 흔히 3가지 타입으로 그룹화된다. 가장 일반적인 것은 크리습 헤드(crisp head)(또는 아이스버그) 및 버터 헤드(butter head)인 결구형 상추이다. 로메인 상추(또는 코스 상추)는 느슨한 직립 결구를 형성한다. "잎" 상추 타입들은 비-결구형이며 성기게 잎이 달려있다.

결구를 형성하는 상추 타입들에서, 결구의 고갱이(heart)는 어느 정도까지는 폐쇄된(closed) 상태이며, 따라서 빛이 미치지 않을 수 있다. 따라서, 아이스버그 상추 및 버터 상추와 같은 폐쇄형 결구(closed head)나, 또는 느슨한 폐쇄형 결구를 가진 로메인 상추에서는 안토시아닌이 생산되기 어렵다.

온실, 플라스틱 터널이나 폐쇄형 컨테이너에서 키운 적상추에서는 적색 결핍이 문제가 된다. 유리나 플라스틱 피복에 의해 반사되어 자외선이 부족하거나, 또는 인공 동화 광 스펙트럼의 결핍으로 인하여, 안토시아닌 발현은 야외 조건에 비해 훨씬 낮다. 이는 실내 조건에서의 적상추 생산 가능성을 감소시키고, 그로 인해 냉해, 더위 및 모든 종류의 강수와 같이 좋지않은 기상 조건으로부터 보호되는 적상추를 생산할 가능성을 감소시킨다.

이제 본 발명은 고갱이를 포함한 결구 전체에 적색 잎을 가지는 적상추를 제공한다. 본 발명에 따른 적상추의 고갱이 잎은 본질적으로 완전히 적색을 띄는데, 이는 적상추의 안토시아닌/엽록소 비가 특별히 높음을 의미한다. 안토시아닌 합성에 필수적인 것으로 생각되는 광, 보다 구체적으로는 자외선관은 결구의 고갱이 속으로 침투할 수 없기 때문에, 이러한 사실은 매우 놀라운 일이다. 이러한 결과는, 본 발명의 상추에서 광-비의존적인 기전이 안토시아닌 생산을 책임지고 있음을 나타낸다.

또한, 이러한 광-비의존성은 유리 컨테이너, 플라스틱 컨테이너 또는 폐쇄형 컨테이너에서 결구 또는 비-결구형 적상추 재배를 가능하게 한다. 상추는 인공적인 동화(assimilation) 광을 이용하는데, 이는 통상적으로 적색 발현에 문제가 된다. 그 이유는, 통상 안토시아닌 합성 유도에 필수적인 자외선 파장(280 - 400 nm)이 광 스펙트럼내에 다소 부족하기 때문이다.

유리나 플라스틱 하에서는 피복의 강력한 자외선 차단에 의해 이와 유사한 자외선 부족이 통상적으로 유발된다. 그러나, 본 발명의 적상추는 이의 자외선 비의존적인 안토시아닌 발현으로 인해, 온실, 플라스틱 하우스 및 폐쇄형 컨테이너에서의 재배에 적합하다. 이는, 또한 본 발명의 "자외선 비의존적인 안토시아닌 발현" 또는 "자외선 비의존적인 적색 발색"이라고 할 수 있는, 광-비의존적인 기전에 의한 것이다.

본 발명의 특정 예에서, 안토시아닌과 엽록소 간의 A523/A665 흡광비는 4 내지 50이며, 바람직하게는 9 내지 27이다.

본 발명에서 안토시아닌의 발현이 전적으로 자외선에 비의존적인지 또는 표준 적상추 식물에서 안토시아닌 발현에 정상적으로 필요한 수준 보다 훨씬 낮은 수준의 자외선에 의해 촉발되는지는, 아직 완전히 파악되진 않았다. 그러나, 본 발명의 실시 유용성에 있어 이러한 차이는 문제가 되지 않는다.

본 발명은 특히 결구를 형성하는 상추 타입에 유용하지만, 또한 잎 상추 및 새싹 생산과 같은 그외 상추 타입에서도 본 발명의 광-비의존적인 적색 발색을 이용하여, 작고 미성숙한 잎을 재배하기 위한 어린 상추 식물을 생산할 수 있다.

본 발명의 적상추 계통은 실시예 1에 나타낸다.

본 발명은 결구의 고갱이에 적색 잎이 있으며 고갱이 잎의 엽록소 대 안토시아닌의 비율 등의 본 발명의 한가지 이상의 요건을 만족시키는, 기원 모체의 모든 자손(progeny)에 관한 것이다.

아울러, 본 발명의 자외선 비의존적으로 적색을 발색하는 비-결구형의 낱장 잎(loose leaf) 또는 베이비 상추 식물도 완전히 적색 결구를 형성하는 상추 식물의 자손으로 간주되며, 따라서 본 발명의 일부분이다.

이미 본 발명의 상추 식물이거나 또는 이것이 될 수 있는 상추 식물의 선별은 적색의 어린 식물을 육안 선별(단계 1)하여, 실시할 수 있다. 이를 유리 또는 플라스틱에서 키움으로써, 나중에 자외선 의존적인 안토시아닌 발현, 즉 적색 발색 불량과 자외선 비의존적인 안토시아닌 발현, 즉 비교적 강한 적색 발색으로 구분할 수 있다. 이러한 상추 식물을 심은 후 결구가 형성될 때까지 키운다. 이후, 적색 고갱이 잎을 가진 식물의 육안 선별은 각 식물의 최상부를 잘라 수행한다. 적색 고갱이 식물을 선별하여, 자손 종자를 생산한다.

적색 발색 수준을 증가시키거나/증가시키고 성숙 식물의 필수 결구 수준을 달성하기 위해, 교배를 선택한다.

본원에서, 상추 식물은 '개방 결구(open head)' 또는 폐쇄 결구(closed head)'가 되었을 때, 특징적인 '결구 형성'('TG/13/9. Lettuce(Lactuca sativa L.) Guidelines for the conduct of tests for distinctness, uniformity and stability. 'International Union for the Protection of New Varieties of Plants. Geneva. 2004)에 대한 UPOV 가이드라인에 따라 결구형으로 정의된다.

본 발명의 상추 고갱이의 엽록소와 안토시아닌간의 흡광비 A523/A665은 바람직하게는 9 이상이며, 더 바람직하기로는 13 이상이다. 정상 적상추에서의 흡광비는 3보다 높게 나타나진 않는다. 본 발명의 흡광비을 결정하는데 사용되는 엽록소 및 안토시아닌 농도는 분광광도측정법으로 결정한다. 샘플 준비 및 분석은 실시예 2에 기재되어 있다.

본 발명의 고갱이 잎 수준으로 높은 안토시아닌 농도는 비-결구형의 다른 상추 변이체들에서도 볼 수 있음을 참조한다. 이러한 비-결구형 변이체의 예로는 40-0203103-B(Knerr LD, 2005. Lettuce cultivar 40-0203103-B. 미국 특허 공개공보 2005/0144672 Al), Galactic, New Red Fire, Rolina(Kleinhenz et al, 2003. Variety, shading and growth stage effects on pigment concentrations in lettuce grown under contrasting temperature regimens. Horttechnology 13(4) p.677-683), Red Salad Bowl 및 Sesam(Voipio I. and Autio J., 1995. Responses of red-leaved lettuce to light intensity, UV-A radiation and root zone temperature. Acta horticulturae 399. p.183-187)가 있다.

그러나, 이들 변이체의 고갱이 잎은, 비-결구형의 특징으로 인해 강한 광 노출 결과로서, 본 발명의 고갱이 잎에 비해 엽록소 농도가 매우 높다. 반면, 결구형 변이체들은 본 발명의 고갱이 잎에서와 유사하게 고갱이 잎의 엽록소 수준이 낮음을 확인할 수 있다. 그러나, 이들 결구형 변이체들의 고갱이 잎들은 본 발명의 고갱이 잎에 비하여 안토시아닌 수준이 높진 않다. 고갱이 잎의 낮은 광 노출로 인하여, 안토시아닌 합성은 통상 충분하게 유도되지 않는다. 본 발명에서, 안토시아닌 생산은 자외선 비의존적이다. 이는, 본 발명의 안토시아닌/엽록소 비율이 예측할 수 없을 정도로 높은 수준인 이유를 설명해준다.

이러한 자외선 비의존적인 새로운 적색 발색 형태는 결구형 상추 식물에서 발견되며 나타나지만, 종래의 적색 발색과는 구별된다. 그러나, 본 발명은 또한 비-결구형 상추 식물, 예컨대 낱장 잎 또는 베이비 잎 상추 식물과 같은 비-결구형 상추 식물, 또는 본 발명의 "자외선 비의존적인 적색 발색" 특징을 나타내는 자외선량이 낮은 온실이나 플라스틱에서 키운 상추 식물에 관한 것이다.

고갱이 잎의 적색 발색은 또한 RHS 색 차트(The Royal Horticultural Society, London, UK)로 수치를 매겼다. 본 발명의 특히 잎 상단의 고갱이 엽편 색상은 모두 회색-보라 그룹인 183A, 184A, 또는 187B로 평가되었다. 엽편의 나머지 부분의 색상은 모두 회색-적색 그룹인 180B, 180C, 180D 또는 181C로 평가되었다.

또한, 유리 또는 플라스틱에서 키운, 즉 실외 조건에서의 광과 비교하여 자외선 수준이 감소된 조건하에서 키운 식물에서의 적색 발색 및 안토시아닌 발현을 수치로 매길 수 있다. 또한, 본 발명의 식물은 좀더 높은 수준의 안토시아닌을 나타낼 수 있으며 표준 적상추 보다 진한 적색을 나타낼 수 있다. 본 발명에 따른 식물의 특히 새롭게 출현한 잎들은 일반적인 적상추 식물의 신생 잎에 비해 훨씬 더 진한 적색을 띈다.

본 발명의 적상추의 유전자 분석을 실시예 2에 개시한 바와 같이 수행하였다. 그 결과, 3종 이상의 유전자가 결구 고갱이의 적색 발색에 관여하는 것으로 확인되었다.

따라서, 본 발명은 안토시아닌을 발현할 수 있으며, 부가적으로 결구 고갱이의 적색 발색에 관여하는 2종 이상의 유전자를 가진 상추 식물에 관한 것이다. 바람직하기로는, 본 발명의 식물은 실시예 2에 개시된 완전한 유전자 복합체를 포함한다.

AFLP, RFLP, RAPD, SCAR, CAPS, SSR 또는 SNP와 같이 밀접하게 연결된 DNA-마커에 의해 본 발명의 적색 발색에 관여하는 유전자 좌(loci)의 존재를 분석할 수 있다. 예컨대, 전술한 개체군 및 그 자손에서의 마커-형질 계통 분석을 통해, 밀접하게 연결되어 있는 그러한 DNA-마커를 제공할 수 있다.

본 발명에서처럼 내엽의 적색 발색과 유사한 유전적 구성을 가진 상추 식물의 존재는, 즉 상추 식물이 본 발명에 따른 식물인지에 대한 분석은, 본 발명의 확인된 식물의 표현형과 본 발명의 그럴 가능성 있는 식물의 표현형을 비교함으로써 쉽게 평가할 수 있다. 표현형은 예컨대 내엽의 적색 발색, 고갱이 잎의 안토시아닌/엽록소 비율, 및/또는 유리 또는 플라스틱에서 키운 식물의 적색 발색에 의해 평가할 수 있다.

본 발명의 가능성있는 식물과 본 발명의 확인된 식물간의 유전적 구성의 유사성을 평가하는 다른 방법은, 본 발명의 확인된 식물의 마커 유전자형을 가능성있는 식물의 마커 유전자형과 비교하는 것이다. 마커 유전자형은 본 발명의 적색 표현에 관여하는 유전자 좌와 밀접한 관계가 있는 AFLP, RFLP, RAPD, SCAR, CAPS, SSR 또는 SNP와 같은 DNA 마커 세트에 의해 규정된다.

유전적 구성의 유사성을 평가하는 다른 방법은, 본 발명의 가능성 있는 식물의 유전자형을 본 발명의 확인된 식물의 유전자형과 비교하는 것이다. 이러한 유전자형 비교는 본 발명의 가능성있는 식물과 확인된 식물간의 교배로 수득한 F1-식물의 자가-수분으로 생긴 F2-개체군에서 수행한다. F2-개체군으로 표현형의 분리(segregation), 즉 내엽의 적색 발색 부재를 평가할 수 있다. 모든 비교에서, 표현형은 예컨대 고갱이 잎의 안토시아닌/엽록소 비율 또는 유리나 플라스틱에서 키운 식물에서의 적색 발색에 의해 평가할 수 있다.

본 발명에 따른 적상추 식물의 종자는 2005년 7월 18일에 NCIMB에 기탁번호 NCIMB 41337, NCIMB 41338 및 NCIMB 41339로 기탁하였다.

또한, 본 발명은 상기 종자의 자손 뿐만 아니라 교배나 또는 분자생물학적 기법에 의해 본 발명에 따른 적색 발색을 유도하는 본 발명의 식물의 유전적 구성 또는 유전자 복합체를 수득한 식물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 본 발명의 적색 발색 형질을 유지하거나 획득한 이들 식물의 자손에 관한 것이다.

다른 식물에 적색을 담당하는 유전자를 전달하기 위해, 역교배 육종을 사용할 수 있다. 이를 위한, 바람직한 동형접합성 품종(homozygous cultivar) 또는 근교계(inbred)는 반복친(recurrent parent)이다. 전달될 형질의 공급원을 공여친(donor parent)이라고 한다. 제조되는 식물은 반복친(예, 재배품종)의 특성과 공여친으로부터 전달된 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다. 첫 교배 후, 공여친의 표현형(고갱이 잎의 적색 발색)을 지닌 개체를 선별하고, 반복친과 반복 교배(역교배)한다. 제조된 식물은 반복친(예, 재배품종)의 특성과 공여친으로부터 받은 바람직한 형질을 가질 것으로 예상된다. 적색 발색 유전성이 그외 바람직한 형질 또는 형질들의 조합 유전성 보다 훨씬 복잡한 경우에, 적색의 고갱이 잎을 가진 부모를 반복친으로 사용할 수 있으며, 다른 바람직한 형질 또는 형질들의 조합을 가진 부모는 공여친으로서 사용할 수 있다. 여러가지 형질 및 작물에 일반적으로 사용되는 그외 육종 방법에 대한 내용은 여러가지 참고문헌에서 찾아볼 수 있다(예, "Principles of Plant Breeding" John Wiley and Son, pp.115-161, 1960; Allard, 1960; Simmonds, 1979; Sneep et al., 1979; Fehr, 1987).

본 발명은 단지 예시하기 위한 목적으로 후술한 실시예에서 더욱 설명되지만, 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하고자 하는 것은 아니다.

도 1은 '99P.30637' x cv. 'Sharp Shooter' 교배로부터 수득한 212 F3-식물주 개체군에서 외엽 및 내엽의 적색 발색의 품종내 분리 분포를 나타낸 것이다. 적색 발색 분류를 개체군에 적용하였다: '외측 적색', 즉 내엽 색상과 상관없는 적색 외엽을 가진 식물의 품종내 발생 빈도; '적색 외엽 & 적색 내엽', 즉 적색 외엽 및 적색 내엽을 가진 식물의 품종내 발생 빈도; '적색 내엽/적색 외엽', 즉 적색 외엽을 가진 품종내 총 식물에서 적색 내엽을 가진 식물의 발생 빈도. 유전적 모델에 따라 0 = 관찰됨; E = 예상됨임.

도 2는 '99P.30637' x cv. 'Sharp Shooter' 교배에서 분리를 토대로 한 안토시아닌 발현에 대한 유전적 모델을 나타낸 것이다.

도 3a는 본 발명의 식물을 나타낸 것이다. 이 어린 식물은 식물 99P38154의 자가 수정 25의 3회 계대한 후 수득한, 식물주 03P82421로부터 수득한 종자로부터 파생된 식물이다. 도 3b, 3c 및 3d는 각각 부모 Pierrot, Pippo 및 Gringo의 어린 식물이다. 도 3e 및 3f는 각각 비교 변이체 Apache 및 Bijou의 어린 식물이다. 이들 어린 식물들 모두 16℃에서 14시간의 명조건 및 12℃에서 10시간의 암조건으로 성장 챔버내 토탄 블록에서 키웠다. 명조건은 1관/0.24 평방미터의 필립스 TLD 36 W 840 REFLEX 관을 식물에서 0.6 m 높이에 설치하여 구현하였다.

도 4는 'NEW'로 표시한 본 발명의 식물의 어린 잎을, 시판되는 변이체 Pippo, Pierrot 및 Gringo의 어린 잎과 비교하여 나타낸 것이다. 이들 어린 식물들은 16℃에서 14시간의 명조건 및 12℃에서 10시간의 암조건으로 성장 챔버내 토탄 블록에서 키웠다. 명조건은 1관/0.24 평방미터의 필립스 TLD 36 W 840 REFLEX 관을 식물에서 0.6 m 높이에 설치하여 구현하였다.

도 5-8은 본 발명의 식물(01P80146)과 시판되는 각 변이체, Darkland('99R10044'로 표시함; 도 5a-5d), Pierrot('95G2237'로 표시함; 도 6a-6d), Roxy('99R10283'로 표시함; 도 7a-7d) 및 Sierra('95G1986'로 표시함; 도 8a-8d)을 비교하여 나타낸 것이다. a-도면(5a, 6a, 7a, 8a)은 수확한 완전한 결구이고, b-도면(5b, 6b, 7b, 8b)은 외엽이 제거된 고갱이고, c-도면(5c, 6c, 7c, 8c)은 고갱이의 종단면이다. d-도면(5d, 6d, 7d, 8d)은 자른 고갱이 잎이다. 본 발명의 상추 식물은 결구의 고갱이가 완전히 적색이지만, 다른 상추 식물들은 그렇지 않았다. 식물들은 모두 2002년에 프랑스 아라몬에서 재배하였다: 2002년 1월 10일에 파종하고, 2002년 2월 15일에 비공개 야외에 이식하고, 2002년 4월 25일에 수확함.

실시예 1

본 발명의 적상추 가계도

본 발명의 상추를 다음과 같은 가계도에 따라 수득하였다: 1986년도에 cv. Pippo(Rijk Zwaan; 적색)와 cv. Blonde Maraichere(Caillard; 녹색) 식물을 교배하였다.

1988년에, 상기 교배로 수득한 적색 자손 식물을 cv. Gringo(Rijk Zwaan; 적색) 식물과의 교배에서 부계로 사용하였다. 같은 해에, cv. Pierrot(Rijk Zwaan; 적색) 식물과 cv. Roxette(Rijk Zwaan; 녹색) 식물을 교배하였다.

1989년에, 상기 교배를 통해 수득한 적색 자손 식물을 cv. Krizet(Rijk Zwaan; 녹색) 식물과의 교배에서 부계로 사용하였다.

1992년에, 적색의 F3- 자손 식물을 전술한 Krizet x (Pierrot x Roxette)-교 배로부터 선별하여, 상기 Gringo x (Pippo x Blonde Maraichere) - 교배로부터 수득한 선별된 적색 자손 식물인 부계 식물과의 교배에서 모계로서 사용하였다. 1995년에, 1992-교배로 새롭게 수득한 식물로부터 적색의 F4-식물을 선별하여, cv. Roxette(Rijk Zwaan; 녹색) 식물과의 교배에 모계로서 사용하였다.

1998년에, 이러한 교배로 수득한 F2-, F3- 및 F4-세대에서 타입, 결구 및 색상 선별을 실시하여, 적색의 F4-식물(98P.31582)을 수득하였다. F5-식물주에서 색상(적색 대 녹색)이 분리되는 것으로 나타났지만, 다음 세대에서의 선별을 통해 완전히 적색인 고갱이 잎을 가진 3주(99P.38152; 99P.38154; 99P.30637)의 결구형 F5-식물을 수득하였으며, 이 식물은 이후 수년간 번식시켰다.

자손 중 분리성 녹색 식물은 관찰되지 않았고, 종자는 nrs. 02R.2413, 01R.1439, 02R.2418로 기탁하였다. 이들 F5-식물과 이들의 자손은 광-비의존적인 적색 발색을 보이는 추가적인 상추 육종에 부모 공급원으로서 제공되었다.

결론적으로, 사용된 부모 변이체들, 즉 Pippo, Blonde Maraichere, Gringo, Pierrot, Roxette, 및 Krizet 모두 결구의 고갱이에 특징적인 적색 잎을 나타내진 않는다고 할 수 있다. 본 발명은 이들 적색 및 녹색 부모 변이체들로부터 유래된 유전자들의 독특하고 새로운 조합을 포함하며, 이는 결구의 고갱이에 완전히 적색인 잎을 제공한다.

실시예 2

본 발명의 적상추의 유전자 분석

본원에서, 유전자 좌(locus 또는 loci)는 유전자가 위치한 염색체내 특정 위 치로서 정의된다(Griffiths AJF, Miller JH, Suzuki, DT, Lewontin RC, Gelbart, WM. 'An introduction to genetic analysis.' 6^th edition. 1996. WH Freeman and Company, New York.). 해당 식물에서 적색 발색을 담당하는 유전자 좌의 수는 이 식물과 녹색을 발색하는 cv 'Sharp Shooter' 식물을 교배하여 제조한 자손을 유전자 분석하여 확정할 수 있다.

본 발명의 적상추의 유전자 분석은 다음과 같이 수행하였다: F5-식물 nr. 99P.30637, 즉 본 발명에 따른 식물의 자손 식물과, 비광택성(non-brilliant) 녹색의 아이스버그 상추 식물 cv. Sharp Shooter(SVS, Waycott et. al., 1999: 미국 특허 5,973,232)를 교배하였다. 교배로 수득한 자손으로부터 212주의 랜덤 F2-식물을 F3-식물주로 번식시켰다.

이들 212주의 F3-식물주는 네덜란드 페이나르트에서 비공개 야외 실험으로 시험하였다. 2002년 6월 17일에 종자를 토탄 블럭에 심어 온실에서 모종을 키운 다음 2002년 7월 5일에 야외로 이식하였다. 수확일(관찰시기)은 2002년 8월 19에서 23일까지였다. 계획한 규모는 F3-식물주 당 식물 24주이며, 즉 식물 6주 4열로 실시하였다. 색 형질 발현은 한번의 시도에서 매우 안정적이었기 때문에 식물주들을 재생산하진 않았다. 각 F3-식물마다 관찰하였다.

관찰 형질은, a) 색, 적색인 경우에는 외엽에서의 진한 정도 및 발현 패턴, b) 색, 적색인 경우 내엽에서의 진한 정도 및 발현 패턴, c) 결구 정도, d) 외엽이 녹색인 경우에는 2가지 유형으로 분류: 광택성 또는 비광택성.

적색의 발색 강도 및 발현 패턴은 다음과 같이 오름차순으로 분류하였다: 1) 엷거나 붉은색을 띰, 즉 외엽과 내엽의 가장자리 또는 내엽의 엽저(leaf base)에 연한 적색을 발색함, 2) 붉은 반점, 3) 녹색 반점, 즉 적색 잎 표면에 녹색 반점, 4) 외엽의 광 노출된 부분과 내엽의 경우에는 내엽 전체가, 전부 적색, 즉 반점이 없고 강하게 적색을 발색함.

결구는, 1) 로메인 또는 코스 상추와 같은 약간 개방된 결구 및 2) 아이스버그 상추와 같이 분명하게 구분되는 중첩성 잎을 가진 견고한 결구로 분류하였다.

시험에서 일부 식물들은 수확하기 전에 죽었다. 5088개의 식물 중에서, 즉 214 x 24 중에서, 전체 5007주의 F3-식물들은 수확 단계까지 진행되었고, 이를 분류하였다(표 1 참조).

식물들 모두 적어도 로메인 또는 코스 상추와 비슷한 결구성을 보였다. 데이타는, 총 212개의 식물주 중에서 완전히 녹색인 식물주 55종의 분리를 나타내었다. 적색 발색을 보인 최소 하나 이상의 식물이 포함된 157개의 식물주 중에서, 28개의 식물주는 모두 외엽에 안토시아닌을 발현하는 식물이었다. 이들 28개의 식물주 중에서, 8개의 식물주는 모두 고갱이 잎에 안토시아닌을 발현하는 식물이었다. 최소 하나 이상의 적색을 발색하는 식물이 있는 157개의 식물주 중 33개의 식물주에서 적색을 발색하는 식물은 외엽에서만 안토시아닌을 발현하였고 고갱이 잎에서는 발현하지 않았다. 157개의 식물주 중 그외 33개의 식물주에서 적색을 발색하는 식물은 외엽과 고갱이 잎 모두에서 안토시아닌을 항상 발현하였다. 나머지 91개의 식물주들 중에서 적색을 발색하는 식물들 모두 외엽에서 안토시아닌을 발현 하였다. 그러나, 이들 식물은 고갱이 잎에서 계통내 안토시아닌 발현 분리를 보였다. 5007개의 식물주에서, 고갱이 잎에서 안토시아닌이 발현되고 동시에 외엽에서는 안토시아닌이 발현되지 않는 녹색 식물은 한 종도 없었다.

따라서, 외엽에서 안토시아닌을 발현하게 하는 하나 이상의 유전자가 고갱이 잎에서의 안토시아닌 발현에 필요한 것으로 결론지어진다. 적색과 녹색의 분리에서, 외엽 발색에 있어서의 적색 대 녹색의 분리비는 23:1 내지 1:22였다. 내엽에서의 적색 대 녹색의 분리비는 18:1 내지 1:23이며, 녹색 외엽을 가진 모든 식물은 제외하였다. 표 1은 '99P.30637' x cv. 'Sharp Shooter' 교배로 수득한 F3-식물주의 무작위 212개의 개체군에서, 외엽 및 내엽에 적색 및 녹색 발색을 보인 식물의 계통내 분포를 나타낸다.

표 1

	녹색 외엽을 보이는 모든 식물	적색 외엽을 보이는 식물의 일부	적색 외엽을 보이는 모든 식물
녹색 외엽이 있는 모든 식물	55	29	4
적색 외엽이 있는 식물의 일부가 적색 내엽을 가지는 경우	0	75	16
적색 외엽이 있는 식물 모두가 적색 내엽을 가지는 경우	0	25	8

이러한 분리 데이타를 사용하여, 비의존적인 멘델 분리 비라는 가정하에 유전자 모델을 구축하였다. 최소 3곳 이상의 유전자 좌가 내엽에서의 자외선 비의존적인 안토시아닌 발현 구현에 참여하는 것으로 확인되었다. 제1 유전자 좌, 즉 A-a는 확인된 적상추에서도 발견되며, 우성인 대립유전자 A는 안토시아닌을 발현하기 위해서는 모든 경우에서 필수적이다. 아마도 이 유전자 좌는 C 또는 G-유전자 좌일 것이다(Robinson et al., 1983, The genes of lettuce and closely related species. In: Plant Breeding Reviews 1. Ed. J Janick. p 267-293).

제2 유전자 좌는 모델 적용에 의해 확인되었고, B-b라고 명기하며, 우열인 대립유전자 b의 동형접합체의 존재는 A와 조합하여 외엽에서의 안토시아닌 발현을 형성한다. 2곳 이상의 유전자 좌는, 이후 C-c 및 D-d라고 명기되며, 이는 외엽에서의 안토시아닌 발현에도 참여하는 것으로 확인되었다. 우성 대립유전자 C 한 카피 이상 존재 또는 우열의 대립유전자 d의 동형접합체 존재 중 어느 한 경우는, 대립유전자 A 한 카피 이상이 존재되는 경우에서만, 외엽에서 안토시아닌을 발현시켰다.

E-e, F-f, 및 G-g이라고 하는 3곳 이상의 유전자 좌가 확인되었다. 내엽에서 자외선 비의존적인 안토시아닌 발현을 구현하기 위해서는, 적어도 하나 이상의 A-대립유전자 및 2개의 b-대립유전자가, 우성인 E-대립유전자 한 카피 이상, f-대립유전자의 동형접합체, 또는 b-대립유전자의 동형접합체와 함께 있어야 한다. 즉, 적색 발색을 위한 적어도 3곳 이상의 유전자 좌, 즉 A-a, B-b, 및 E-e, F-f 또는 G-g 중 하나의 대립유전자가 존재하는 것이, 내엽에서 자외선 비의존적인 안토시아닌 발현에 필수적이다. 더욱이, 적어도 3곳 이상, 아마도 전술한 유전자 좌 7곳 모두가 본 발명의 적색 발색 강도에 관여하는 것으로 추정된다.

실시예 3

상추에서의 색상, 안토시아닌 및 엽록소 결정

1. 샘플 준비 및 분석

하기한 내역의 분광광도계 UltrospecIII(Pharmacia)을 사용하였다:

- 모노크로메이터: 홀로그래프 회절 격자(1200 lines/mm)를 이용하는 Czerny Turner

- 파장 정확도: + 1 nm

- 파장 재현성: + 0.5 nm

- 검출 유형: 단일 고체상 실리콘 포토다이오드

- 주파수 대역폭: 5 nm

2. 원리

생화학적 방법으로 적색(안토시아닌) 및 녹색(엽록소)을 결정하였다. 523 nm에서 흡광도를 측정하여 총 안토시아닌 측정값과, 665 nm에서의 흡광도를 측정하여 총 엽록소(엽록소 a 및 b) 측정값, 2가지를 구하였다.

3. 샘플 준비

결구를 형성한 성숙형 상추 식물을 수확하고, 고갱이가 남을 때까지 외엽을 떼어냈다. 상추의 고갱이를 분석에 사용하였다. 고갱이 잎은 식물의 위쪽 잎의 일부 끝부분을 제외하고는 수확하기 전까지는 햇빛에 직접 노출되지 않아야 한다. 고갱이는 길이가 1 cm 이상인 잎 10장 이상을 포함한다. 고갱이에서 가장 오래된 잎은 오목한 형태이다.

고갱이를 플라스틱백에 넣어 < -70 ℃에서 동결시켰다. < -70 ℃에서 적어도 수일간 둔 다음, 동결된 고갱이를 큰 망치로 가루로 만들었다. 미세 샘플은 액 체 질소 하에서 자유 유동성 리드(free floating lid)를 이용하여 Grindomix(GM 200, Retsch, 5" 3000 rpm -> 5" 5000 rpm)로 갈아, 분말로 만들었다.

이후, 분말을 튜브에 넣고, 분말이 든 튜브를 액체 질소에서 냉각시키고, 분석하기 전까지 임의로 < -70 ℃에 보관하였다.

4. 분석

분말 3 g을 50 ml 시험관 4개에 측정하여 넣었다. 시험관 2개는 안토시아닌 분석에 사용하고, 나머지 2개는 엽록소 분석에 사용한다.

안토시아닌 분석을 위해 50% 메틴올 중의 1.0 M HCl을 시험관 2개에 즉시 첨가한다. 샘플과 추출물의 색상에 따라 샘플 5-10 ml/g을 사용한다. 사용된 부피(ml)를 기록해둔다. 샘플 용액은 손으로 흔든 다음 얼음 위에 둔다. 용액 일부는 1.5 ml 엔펜도르프 튜브에 넣고, 이를 4 ℃에서 13000 rpm으로 4분간 원심분리하다.

분광광도계를 이용하여 5 nm 대역폭에서 스펙트럼을 측정한다. 1 cm 큐벳을 사용한다.

360-900 nm에서의 스펙트럼을 측정하고, (추출 액체로 희석한 후 필요하다면) 523 nm에서의 흡광도와 최대 파장(λ_max)를 측정한다. λ_max는 523 nm에 근접하여야 한다.

시험관 2개에 100% 메탄올을 즉시 첨가하여 엽록소를 측정한다. 샘플과 추출물의 색상에 따라 샘플 5-10 ml/g을 사용한다. 사용된 부피(ml)를 기록해둔다. 샘플 용액은 손으로 흔든 다음 초음파조내에서 'set degas'로 5분간 초음파처리한다. 용액 일부는 1.5 ml 엔펜도르프 튜브에 넣고, 이를 4 ℃에서 13000 rpm으로 4분간 원심분리하다.

360-900 nm에서의 스펙트럼을 측정하고, (추출 액체로 희석한 후 필요하다면) 665 nm에서의 흡광도와 최대 파장(λ_max)를 측정한다. λ_max는 665 nm에 근접하여야 한다.

A523 및 A665를 10 ml 추출 부피내 생중량 1 g이 있는 용액의 흡광도를 나타내도록 보정한다. 보정된 A523 및 A665는 하기 계산식을 이용하여 측정된 샘플(g), 추출 부피(ml) 및 필요에 따라서는 희석 보정값으로 계산한다.

보정:

A_보정 = (A_측정 * 추출 부피 / 중량 * 10 ) * 희석

A523/A665 비를 계산한다.

표 2a는 프랑스 아라몬(2002년 1월 10일 파종, 2002년 2월 15일 이식, 2002년 4월 25일 수확)에서 키운 상추를 대상으로 관찰한 엽록소 및 안토시아닌 흡광도와, 안토시아닌/엽록소 비를 나타낸다. 식물주 01P.80146은 자가-수정을 2번하여 식물 99P.38154로부터 수득한 자손 식물주이다. Pierrot(Rijk Zwaan), Darkland(Central Valley), Sierra(Vilmorin) 및 Roxy(Enza)는 일반적인 상추 변이체들이다.

표 2b는 네덜란드 페이나르트(2002년 5월 21일 파종, 2002년 6월 10일 이식, 2002년 8월 20일 수확)에서 키운 상추를 대상으로 관찰한 엽록소 및 안토시아닌 흡광도와, 안토시아닌/엽록소 비를 나타낸다. 식물주 01P.80146은 자가-수정을 2번하여 식물 99P.38154로부터 수득한 자손 식물주이다. Pierrot(Rijk Zwaan), Pippo(Rijk Zwaan), Red Rosalita(Johnny's Selected & Orsetti), Darkland(Central Valley), Sierra(Vilmorin) 및 Roxy(Enza)는 일반적인 상추 변이체들이다.

표 2a 표 2b

기탁 정보

F5-식물 01R.1439, 02R.2413 및 02R.2418을 영국 애버딘 AB21 9YA 크라입스톤 이스테이트 퍼거슨 빌딩에 위치한 NCIMB에 2005년 7월 18일자로 기탁번호 NCIMB 41337, NCIMB 41338 및 NCIMB 41339로 각각 기탁하였다.

Claims

고갱이(heart)를 포함한 결구(head) 전체에 적색 잎을 가지는 락투카 사티바(Lactuca sativa) 종의 결구 형성 상추 식물.
400 nm 보다 짧은 파장의 광이 없는 조건에서도 고갱이(heart)에 적색 잎을 가지는 락투카 사티바(Lactuca sativa) 종의 상추 식물.
제 2항에 있어서, 상기 400 nm 보다 짧은 파장의 광이 없는 조건은 파종하여 관찰할 때까지의 전체 기간동안의 생육 조건인 상추 식물.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 고갱이 잎의 안토시아닌과 엽록소간의 A523/A665 흡광비가 4 내지 50인 상추 식물.
제 4항에 있어서, 고갱이 잎의 안토시아닌과 엽록소간의 A523/A665 흡광비가 9 내지 27인 상추 식물.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 크기가 1 cm 이상인 가장 어린 고갱이 잎 10개에서 안토시아닌과 엽록소간의 A523/A665 흡광비가 4 내지 50인 상추 식물.
제 6항에 있어서, 크기가 1 cm 이상인 가장 어린 고갱이 잎 10개에서 안토시아닌과 엽록소간의 A523/A665 흡광비가 9 내지 27인 상추 식물.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한항에 있어서, 고갱이 잎에 적색이 발색되게 하며, 안토시아닌 발현을 위한 유전자 좌, 결구 고갱이에서의 적색 발색에 관여하는 2개 이상의 유전자 좌 및 선택적으로 적색 발색의 강도에 관여하는 2개 이상의 유전자 좌를 포함하는 유전적 구성을 가진 상추 식물.
제 1항 내지 제 8항중 어느 한항에 있어서, NCIMB에 2005년 7월 18일자로 기탁번호 NCIMB 41337, NCIMB 41338 및 NCIMB 41339로 기탁된 종자로부터 수득가능한 상추 식물.
제 1항 내지 제 8항중 어느 한항에 있어서, 결구 고갱이 잎이 적색이 되게 하는, NCIMB에 2005년 7월 18일자로 기탁번호 NCIMB 41337, NCIMB 41338 및 NCIMB 41339로 기탁된 종자의 유전적 구성을 가진 상추 식물.
파종하여 관찰할 때까지의 전체 기간동안 400 nm 보다 짧은 파장의 광이 없는 생육 조건에서도 적색 잎을 가지는 락투카 사티바(Lactuca sativa) 종의 상추 식물.
제 11항에 있어서, 안토시아닌과 엽록소간의 A523/A665 흡광비가 4 내지 50인 상추 식물.
제 11항에 있어서, 안토시아닌과 엽록소간의 A523/A665 흡광비가 9 내지 27인 상추 식물.
제 11항 또는 제 12항에 있어서, 크기가 1 cm 이상인 가장 어린 고갱이 잎 10개에서 안토시아닌과 엽록소간의 A523/A665 흡광비가 4 내지 50인 상추 식물.
제 14항에 있어서, 크기가 1 cm 이상인 가장 어린 고갱이 잎 10개에서 안토시아닌과 엽록소간의 A523/A665 흡광비가 9 내지 27인 상추 식물.
제 1항 내지 제 15항중 어느 한항에 따른 상추 식물의 자손.
제 1항 내지 제 16항중 어느 한항에 따른 상추 식물의 종자.
제 1항 내지 제 16항중 어느 한항에 따른 상추 식물의 결구.
락투카 사티바(Lactuca sativa) 종의 상추 식물에서 결구 전체 잎이 적색이 되게 하는 유전자 복합체로서, 안토시아닌 발현을 위한 유전자 좌, 결구의 고갱이에서의 적색 발색에 관여하는 2개 이상의 유전자 좌 및 선택적으로 적색 발색의 강도에 관여하는 2개 이상의 유전자 좌를 포함하는 유전자 복합체.
제 19항에 있어서, NCIMB에 2005년 7월 18일자로 기탁번호 NCIMB 41337, NCIMB 41338 및 NCIMB 41339로 기탁된 종자에 존재하는 것과 같은 유전자 복합체.