CN101272682B - 红色莴苣 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种包括心的整个球具有红色叶片的莴苣物种的结球莴苣。心内的红色叶片即使在缺少短于400nm波长的辐射下还是红色，其中从播种到观测的整个时期，其生长环境中缺少短于400nm的波长辐射。花青素和叶绿素之间的比值在4和50之间，优选9和27之间。本发明还涉及植物的后代。

Description

红色莴苣
技术领域
本发明涉及一种红色莴苣植物，从其得到的莴苣球和引起莴苣着红色的基因复合体。
背景技术
生活方式的改变，以及来自饭店、食品公司对多彩有趣装饰的需求、甚至于家庭主妇对现成的已加工好的沙拉的需求不断上升。因此，育种公司正在寻找各种带有艳丽颜色，更佳风味和多种质地的品种。莴苣市场可分成三组，即完整的叶球，预切过的整叶球和鲜嫩叶片。
现在，有吸引力的红色的已预切过的莴苣配料常常由目前可得到的“红色”莴苣(Lactuca sativa)、或菊苣rosso(Cichorium intybus)、红球甘蓝或红色甜菜提供。到目前为止，已知的“红色”莴苣并不是真正的遍布叶片的红色。特别是成球类型或是仅仅在叶边缘红色，或是斑点状红色。叶心内决不会完全红色。原因就在于事实上红色仅在叶球上那些暴露在日光、尤其是紫外线下的部分中表达。因此所谓的“红色”莴苣的叶片主要是绿色，其红色很难让人对预切过的莴苣配料留下红色的印象。
通常，叶片红色部分和绿色部分的过渡状态是褐色。这种褐色视觉上认为是不美的。红色斑点莴苣会使人联想到植物病害或血迹。目前植物育种人员反对选择褐色和红色斑点。另外，甚至发现莴苣包装产业中和消费者经常丢弃斑点或褐色莴苣叶片。
使用莴苣以外的其它蔬菜的叶片的缺点在于这些其它蔬菜的不同味道常常在体验后认为不好吃。例如菊苣rosso就是带有些苦味的Cichorium intybus。红球甘蓝的质地完全不同于莴苣的较软质地。
莴苣中花青素合成由紫外线诱导(参见例如Voipio和Autio，1995年，Responses of red-leaved lettuce to light intensity，UV-A radiation androot zone temperature.在Acta Horticulturae 399.Greenhouseenvironmental control and automation.Eds.BJ Bailey，T Takakura.Kyoto，Japan.第183-187页；Benoit等，1998年，Effecto of a photoselectivegreenhouse film on a few vegetable crops in the Belgian North Sea climate.在14th International congress on plastics in agriculture，Tel Aviv，以色列，1997年3月，Laser Pages Publishing，Jerusalem，以色列，第81-92页；Krizek等，1998年，Inhibitory effects of ambient levels of solar UV-Aand UV-B radiation on growth of cv.New Red Fire lettuce.physiologiaPlantarum 103(1)，第1-7页；Kleinhenz等，2003年，Variety，shading，andgrowth stage effects on pigment concentrations in lettuce grown undercontrasting temperature regiment.Hortechnology 13(4)，第677-683页)。许多植物种类中红色的显示取决于花青素的产生。
许多不同种类的莴苣通常分成三种类型。最通常的就是具有脆球(或卷心(iceberg))和黄油(butter)球的结球莴苣。长叶莴苣(romaine)(或直立莴苣(cos lettuce))形成松散的直立球。“叶片”莴苣类型不结球，并且叶片松散。
结球莴苣类型中球心将或多或少不同程度紧闭，因此阳光无法照射到。这样在比如卷心莴苣(iceberg lettuce)和黄油莴苣(butter lettuce)闭合球体中或在具有松散的闭合球体的长叶莴苣(romaine lettuce)中不可能产生花青素。
相关问题是在玻璃温室、塑料拱棚或密闭容器中生长的红莴苣缺乏红色着色作用。由于缺少紫外线辐射，由于紫外线被玻璃或塑料覆盖物反射或者在人造吸收光谱中缺少紫外线，花青素的表达比室外条件下少得多。这样在室内条件下降低了生产红色莴苣的可能性，因此降低了生产免于受到如冷、热以及各种降水的恶劣天气影响的红色莴苣的可能性。
发明内容
现在，本发明提供了一种红莴苣，其中包括心的整个球具有红色叶片。本发明红莴苣的心叶片大体上完全红色，意味着其含有极高的花青素/叶绿素比值。这是令人惊奇的，因为认为花青素合成必须要的光尤其是紫外光不能进入球心。这证明本发明中莴苣中光-独立机制是产生花青素的原因。
这种光-独立性还允许结球或不结球红莴苣在玻璃温室或塑料拱棚或密闭容器中栽培。后者使用通常在红莴苣发育中带来问题的人造吸收光。这是因为花青素合成的诱导通常必须要紫外波长(280-400纳米)，而在光谱中或多或少缺乏该紫外波长。
在玻璃或塑料下，紫外辐射的类似缺乏通常是由遮盖物强烈的紫外阻截引起的。然而，由于本发明红莴苣的紫外光-独立花青素表达，所以其适合于玻璃温室，塑料大棚和密闭容器栽培。这是因为本发明的光-独立机制，所述光-独立机制还可表示为“紫外光-独立花青素表达”或“紫外光-独立红色着色作用”。
本发明的具体实施例中，花青素和叶绿素之间的吸光率比值A523/A665在4和50之间，优选9和27之间。
还没有完全了解本发明花青素表达是否完全独立于紫外辐射，或者其被比常规红莴苣植株中花青素表达通常所需的低的多的紫外辐射水平激发。但是，对于本发明实际有用性来说，这个差异不要紧。
尽管本发明在结球型莴苣中特别有效，但是本发明的光-独立红色着色也能用在其它类型莴苣，比如散叶莴苣和用于采收又小又鲜嫩叶片的幼小莴苣植株培养的小叶栽培中。
本发明红莴苣的谱系在实施例1中给出。
本发明涉及亲本的所有后代，其球心内具有红色叶片，并且符合本发明一个或多个其它要求，比如心叶片的花青素和叶绿素之间的比值。
另外，具有本发明紫外独立的红色着色作用的不结球、散叶或小叶莴苣植株也认为是完全红色结球莴苣植株的后代，因此是本发明的一部分。
选择已经是或者可能会向本发明莴苣植株发展的莴苣植株可能要根据视觉上的红色幼小植株的选择(步骤1)。在玻璃或塑料下培育它们可能随后在紫外-依靠花青素表达即少量的着红色，和紫外-独立花青素表达即相当强烈的着红色之间产生区别。种植培育后者，直到结球。接着，具有红色内心叶片的植株视觉上的选择是通过切掉每个植株的顶部进行。随后选择红心植株去繁殖后代种子。
选择杂交后代来提高着红色水平，和/或者得到所需要的成熟植株结球水平。
正如在此使用的，当莴苣植株得到“开放式球”或“闭合式球”时，根据UPOV对于特征“结球形成”的指导方针(“TG/13/9.Lettuce(Lactuca sativaL.)Guidelines for the conduct of tests for distinctness，uniformity andstability”，International Union for the Protection of New Varieties ofPlants，日内瓦，2004)来定义结球。
本发明莴苣心在花青素和叶绿素之间具有吸光率比值A523/A665，其优选高于9，更优选高于13或更高。在通常的红莴苣中这一比值从没发现超过3。用于确定本发明比值的叶绿素和花青素浓度是借助于分光光度测定法进行测定。样本制备和分析在实施例2中给出。
应当注意到，本发明心叶片中花青素水平可能和在其它不结球的莴苣品种中发现的水平一样高。这种不结球品种的一些例子为40-0203103-B(Knerr LD，2005，Lettuce cultivar 40-0203103-B。美国专利申请号US2005/0144672A1)，Galactic，New Red Fire，Rolina(Kleinhenz等，2003，Variety，shadingand growth stage effects on pigment concentrations in lettuce grown undercontrasting temperature regimens.Horttechnology 13(4)，第677-683页)Red Salad Bowl，和Sesam(Voipio I.and Autio J.，1995.Responses ofred-leaved lettuce to light intensity，UV-A radiation and root zonetemperature.Acta horticulturae 399.第183-187页)。
但是，与本发明心叶片相比，这些品种具有非常高的叶绿素水平的心叶片，这是不结球的特性导致的高曝光量的结果。另一方面，可能发现本发明心叶片中和结球品种心叶片中具有类似的低叶绿素水平。然而，这些结球品种心叶片与本发明心叶片相比，没有显示高的花青素水平。由于心叶片的低曝光量，所以通常少量地诱导花青素合成。本发明中，花青素的产生是紫外-独立。这就解释了为什么本发明花青素/叶绿素比值是无先例的高水平。
这种紫外-独立的红色着色新形式在结球莴苣植株中发现并发展，且不同于现有技术中红色着色作用。但是，本发明也涉及具有本发明的“紫外-独立红色着色作用”特征的不结球莴苣植株，比如松散叶片或幼小叶片莴苣植株，或生长在玻璃温室或塑料大棚内的莴苣植株，在那里紫外光的量更低。
心叶片红色着色作用也记在RHS颜色记录表(The Royal HorticulturalSociety，London，UK)。本发明心叶片薄层颜色(特别是叶片顶部)被评为183A，184A或187B，它们都在紫灰色记录组内。其它叶片薄层颜色被评为180B，180C，180D或181C，它们都在红灰色记录组内。
也可能对在温室或塑料下生长的植株的红色着色作用和花青素表达进行评定，所述在温室或塑料下即为和室外条件相比具有减少的紫外辐射水平的条件。此处本发明植株比常规红莴苣还能显示更高的花青素水平和更深的红色。尤其是本发明植株新长出的叶片比通常红莴苣植株新长出的叶片红得更多。
本发明红莴苣遗传分析在实施例2中描述。在此发现至少三个基因涉及球心着红色。
本发明涉及能表达花青素和具有另外至少三个涉及球心着红色基因的莴苣植株。优选地，本发明植株包括实施例2描述的完整基因复合体。
通过紧密连锁的DNA标记，比如AFLP，RFLP，RAPD，SCAR，CAPS，SSR或SNP，确定涉及本发明着红色的基因座的存在是可能的。例如，在上述种群和其后代中进行标记-性状连锁分析能提供这种紧密连锁的DNA标记。
莴苣植株内是否存在与本发明内部叶片着红色类似的基因组成即确定莴苣植林是否是根据本发明的植株能通过比较本发明这种可能植株的表型和本发明已知植株的表型来容易地确定。表型可以通过几个方面确定，例如内部叶片着红色情况，心叶片花青素/叶绿素比值，和/或者在玻璃或塑料下生长植株的着红色情况。
确定本发明的可能植株和本发明的已知植株之间基因组成相似性的另一方式是通过比较可能植株的标记基因型和本发明的已知植株标记基因型。标记基因型通过一套基于DNA标记进行定义，比如AFLP，RFLP，RAPD，SCAR，CAPS，SSR或SNP，它们与涉及本发明红色表达的基因座紧密连锁。
确定基因组成相似之处的另一方式是比较本发明可能植株的基因型和本发明已知植株的基因型。该基因型比较在F2-种群上进行，F2种群是由本发明可能植林和已知植林之间杂交得到的F1-代自花授粉而衍生的。F2-种群能用于调查表型即，内部叶片着红色分离的不存在。所有比较的表型也能通过几个方面确定，例如心叶片花青素/叶绿素比值，或者在玻璃或塑料下生长的植株中着红色情况。
根据本发明的红莴苣植株的种子在2005年7月18日保藏到NCIMB，登记号是NCIMB41337，NCIMB41338和NCIMB41339。
本发明还涉及这些种子的后代，以及涉及通过杂交或分子生物技术的方式而获得引起本发明着红色的植株基因组成或基因复合体的植株。本发明还涉及这些保持或者获得本发明着红色性状的植株的后代。
为了将对红色起作用的基因转到另一植株，可以使用回交育种。为此，期望的纯合栽培品种或自交种(inbred)作为回交亲本。待转的性状源称为供方亲本。最终得到的植株期望具有回交亲本的属性(例如，栽培品种)和转自供方亲本的所期望性状。初始杂交后，拥有供方亲本表型(心内叶片着红色)的个体被筛选出来并且和亲本重复杂交(回交)。最终得到的植株期望具有回交亲本的属性(例如，栽培品种)和转自供方亲本的所期望性状。倘若着红色遗传比其它期望性状或性状组合更加复杂，带有红色心叶片的亲本可用作回交亲本，而带有其它期望性状或性状组合的亲本可用作供方亲本。其它通常用于不同性状和作物的育种方法的描述可见几本参考书(例如，“Principles of PlantBreeding”John Wiley and Son，第115-161页，1960；Allard，1960；Simmonds，1979；Sneep等，1979；Fehr，1987)。
附图说明
本发明进一步在下述实施例描述，并且所述实施例仅仅是描述的目的，而在任何情况下不用于限制本发明。
图1出示了对于来自“99P.30637”×cv.“Sharp Shooter”杂交的212 F3-系种群而言，外部和内部叶片着红色的系内分离分布。红色着色的三个分类应用于如下种群：“红色外部”，即具有红色外部叶片植株的系内频率，而不考虑内部叶片颜色；“红色外和红色内”，即具有红色外部和红色内部叶片植株的系内频率；“红色内/红色外”，即在具有红色外部叶片的所有种系植株中具有红色内部叶片植株的频率。根据遗传模式，O＝观察的；E＝期望的。
图2出示了基于“99P.30637”×cv.“Sharp Shooter”杂交分离的花青素表达的遗传模式。
图3a出示了本发明植株。该幼小植株是从03P82421系种子得到的植株，03P82421系是植株99P38154的三代自花授粉25的后得到的。图3b，3c和3d分别出示了亲本Pierrot，Pippo和Gringo的幼小植株。图3e和3f分别出示了对照品种Apache和Bijou的幼小植株。所有这些幼小植林都生长在温度16℃下光照14小时和温度12℃下黑暗10小时的生长室中的泥炭块中。光通过Philips TLD 36 W 840 REFLEX管产生，每0.24平方米1管，距离上述植物之上0.6米。
图4出示了与商业品种Pippo，Pierrot和Gringo的幼小叶片相比较的本发明植株的幼小叶片，用“NEW”表示。这些幼小植株都生长在温度16℃光照14小时和温度12℃黑暗10小时的生长室中的泥炭块中。光通过Philips TLD 36W 840 REFLEX管产生，每0.24平方米1管，距离上述植物之上0.6米。
图5-8出示了本发明植株(01P80146)分别和商业品种Darkland(用“99R10044”表示；图5a-5d)，Pierrot(用“95G2237”表示；图6a-6d)，Roxy(用“99R10283”表示；图7a-7d)和Sierra(用“95G1986”表示，图8a-8d)之间的比较。a-图(5a，6a，7a，8a)出示了完整采收的叶球，b-图(5b，6b，7b，8b)出示了无外部叶片的心，c-图(5c，6c，7c，8c)出示了心的纵向切面。d-图(5d，6d，7d，8d)出示了切开的心叶片。本发明莴苣植株在叶球心里是完全红色，而其它莴苣植株并不是这样。所有植株于2002年都生长在法国Aramon：2002年1月10日播种，2002年2月15日移栽到可信任的露地，2002年4月25日采收。
实施例
实施例1
本发明红莴苣谱系
本发明莴苣根据下面谱系得到：1986年在cv.Pippo(Rijk Zwaan；着红色)植株和cv.Blonde Maraichere(Caillard；着绿色)植株之间杂交。
1988年，从上述杂交得到的红色后代植林用作和cv.Gringo(Rijk Zwaan；着红色)植株杂交的父本。同年，在cv.Pierrot(Rijk Zwaan；着红色)植株和cv.Roxette(Rijk Zwaan；着绿色)植株进行杂交。
1989年，从上述杂交得到的红色后代植林用作和cv.Krizet(Rijk Zwaan；着绿色)植株杂交的父本。
1992年，从上述Krizet×(Pierrot×Roxette)杂交选出红色F3-后代植株，并且用它作为和父本植株杂交中的母本，父本是从上述Gringo×(Pippo×Blonde Maraichere)杂交选出的红色后代植株。1995年从新得到的1992杂交种中选出红色F4-植株，并且用它作为和cv.Roxette(Rijk Zwaan；着绿色)植株杂交中的母本。
类型、成球和颜色的选择从杂交开始的F2-，F3-和F4-代进行，最终在1998年得到红色F4-植株(98P.31582)。F5-系从颜色(红色对比绿色)上出现分离，但是在下一代中的筛选得到具有完全红色心叶片的三个球F5-植株(99P.38152；99P.38154；99P.30637)，接下来几年繁殖这些植株。
显示了不分离绿色植株的后代和种子以编号02R.2413，01R.1439，02R.2418保藏。这些F5-植株和其后代已用作进一步育种具有光-独立红色着色作用的莴苣的亲本源。
总之，可以说在使用的亲本品种当中，也就是Pippo，Blonde Maraichere，Gringo，Pierrot，Roxette和Krizet在球心中都不具有特有的红色叶片。本发明包括来自这些红色和绿色亲本品种的独特的并且新的基因组合，其在球心内提供完全红色叶片。
实施例2
本发明红莴苣的遗传分析
正如在此使用的，基因座定义为染色体上基因所在的特定位置。(Griffiths AJF，Miller JH，Suzuki，DT，Lewontin RC，Gelbart，WM.‘Anintroduction to genetic analysis.’6th edition.1996.WH Freeman andCompany，New York.)给定植株中引起着红色的基因座数目可通过对该植株与着绿色cv“Sharp Shooter”杂交后代的遗传分析确定。
本发明红莴苣的遗传分析通过以下步骤进行：在编号99P.30637的F5-植株的后代植株，即本发明植株和色彩不鲜艳的着绿色的cv.Sharp Shooter卷心莴苣植株(SVS，Waycott等，1999：美国专利号5,973,232)之间杂交。将源自该杂交后代的212个随机F2-植株繁殖成F3-系。
对上述212个F3-系在荷兰Fijnaart的可信任的室外试验中进行测定。2002年6月17日在泥炭块上播种，幼苗在玻璃温室中生长，2002年7月5日移栽到田间。采收日期(观察时间)从2002年8月19日到8月23日。试验田大小是每一F3-系24棵植株，即4行，其中每行6棵植株。没有重复种系，因为一个试验中颜色特征的表达是非常稳定的。观察在每一F3-植株中进行。
观察特征是：a)颜色，并且如果是红色，其外部叶片上强度和表达图案，b)颜色，并且如果是红色，其内部叶片上强度和表达图案，c)结球程度，d)如果是绿色外部叶片：在如下2组中评定：鲜艳或不鲜艳。
以如下的递增顺序评定着红色强度和表达图案，所述递增顺序为：1)淡色或红色，即外部和内部叶片边缘，或内部叶片底部着淡红色，2)红斑，3)绿斑，即红叶片表面上的绿斑，4)完全红色，即外部叶片的曝光部分上无斑点的强烈红色，并且在内部叶片发生整体内部叶片上无斑点的强烈红色。
用1)稍微打开的叶球，象长叶莴苣(romaine)或直立莴苣(cos lettuce)，和2)带有清晰重叠叶片的强硬叶球、(象卷心莴苣(iceberg lettuce))两者记录结球。
试验中一些植株在采收前死亡。其中预期5088棵植株中，即212×24，有总数5007棵F3-植株到达采收期，并且对其进行了评定(见表1)。
所有植株出示了结球水平，该结球水平至少与长叶莴苣(romaine)或直立莴苣具有可比性。数据显示从总数212列里面有55列完全绿色分离。从具有至少一棵着红色植株的157列里面，有28列是包括外部叶片上全部显示花青素表达的植株。从上述28列里面，有8列是包括心叶片上全部显示花青素表达的植株。具有至少一棵着红色植株的157列中，33列中的着红色植株仅仅在外部叶片而不是在心叶片显示花青素表达。157列中着红色植株的另外33列中的着红色植株在外部叶片和心叶片上都显示了花青素表达。剩下的91列着红色植株里面都在外部叶片显示了花青素表达。然而，上述植株显示了在心叶片内花青素表达的种系内分离。5007棵植株里面没有一棵植株显示心叶片花青素表达与外部叶片着绿色表达结合。
因此，推导出在外部叶片中造成花青素表达的一个或多个基因对于心叶片中花青素表达是必要的。红色和绿色之间分离时，外部叶片着色中红色和绿色之间的分离比值范围从23∶1到1∶22。对于内部叶片，红色和绿色着色之间分离比值范围从18∶1到1∶23，其中排除了所有具有绿色外部叶片的植株。表1出示了对于随机来自“99P.30637”×cv.“Sharp Shooter”杂交的212个F3-系，其外侧和内侧叶片的红色和绿色着色植株的种系内分布。
表1
  具有绿色外部叶片的所有植株   具有红色外部叶片的部分植株   具有红色外部叶片的所有植株
  具有绿色内部叶片的所有植株   55   29   4
  具有红色外部叶片的部分植株具有红色内部叶片   0   75   16
  具有红色外部叶片和红色内部叶片的所有植林   0   25   8
上述分离数据在独立孟德尔分离比值约束下用于构建遗传模式。已发现至少三个基因座涉及内部叶片中获得紫外-独立花青素表达。第一基因座，进一步用A-a表示，在已知红莴苣中也发现，并且为获得花青素表达显性等位基因A在所有情况下是必要的。该基因座可能是C或G基因座(Robinson等，1983，Thegenes of lettuce and closely related species.In：Plant Breeding Reviews1.Ed.J Janick.第267-293页)。
第二基因座是通过调整模式发现的，进一步用B-b表示，其中纯合形成存在的隐性等位基因b连同A引起外部叶片的花青素表达。两个以上的基因座，进一步用C-c和D-d表示，也发现涉及外部叶片花青素表达。或存在显性等位基因C的至少一个复制，或纯合形式存在隐性等位基因d，都引起外部叶片中的花青素表达，但这仅仅是在等位基因A的至少一个复制也存在的情况下。
发现了三个以上的基因座，进一步用E-e，F-f和G-g表示。为了在内部叶片获得紫外-独立花青素表达，需要至少一个A-等位基因和两个b-等位基因的存在以及显性E-等位基因的一个复制或者纯合形式的f-等位基因或者纯合形式的g-等位基因的存在。因此在至少三个基因座，即A-a，B-b和E-e，F-f或G-g上存在的用于红色着色作用的等位基因对于内部叶片的紫外-独立花青素表达是必要的。此外，假设至少三个，但是可能上述所有七个基因座都涉及本发明着红色强度。
实施例3
莴苣颜色，花青素和叶绿素的确定
1.1.样本准备和分析
使用具有下述规格的分光光度计UltrospectIII(Pharmacia)：
-单色器：具有全息衍射光栅(1200行/毫米)的车尔尼旋转器
-波长准确度：±1纳米
-波长再现性：±0.5纳米
-传感器类型：单固体硅光敏二极管
-带宽：5纳米
2.原理
红色(花青素)和绿色(叶绿素)用生物化学方法确定。获得两个提取物，一个用于523纳米下吸光率的测定，该测定是总花青素的测定，一个用于665纳米下吸光率的测定，该测定是总叶绿素(叶绿素a和b)的测定。
3.样本准备
采收已结球并成熟的莴苣植株，同时剥去外部叶片，直到剩下心。莴苣心用于分析。心叶片在采收前应当没有直接暴露到阳光下，除了植株顶部上叶片(最多10％)的很小的顶部。心包括至少10片具有1厘米或更长的叶片。心里最老的叶片应当是凹入的。
将心放入塑料袋里，并且在低于-70℃温度下冷冻。在-70℃温度下至少几天后，用大锤将冷冻了的叶心捣碎。细小样本在液氮(样本应当保持冷冻)的存在下使用自由悬浮的盖子在Grindomix(GM 200，Retsch，5″3000rpm接着5″5000rpm)中研磨，以得到粉末。
接着将粉末放入试管，将盛有粉末的试管在液氮中冷冻，并且任选在低于-70℃温度下储存，直到进行分析。
4.分析
三克粉末称好后放入四个50毫升的试管。两个试管用于分析花青素，两个试管用于分析叶绿素。
为了花青素的测定，将50％甲醇中的1.0M盐酸立即加入两个试管。根据样本颜色和提出物，使用5-10毫升/克样本。使用的体积(毫升)要注意。样本溶液用手搅拌并置于冰块上。一部分溶液放入1.5毫升eppendorf试管，并且试管在4℃，13000转/分钟下离心4分钟。
光谱使用具有5纳米带宽的分光光度计进行测定。使用1厘米比色杯。
测定360-900纳米光谱，并测定523纳米的吸光率(如果必要的话，在用浸提液稀释后)和最大波长(λmax)。λmax应当接近523纳米。
立即向两个试管加入100％甲醇来测定叶绿素。根据样本颜色和提出物，使用5-10毫升/克样本的甲醇。使用的体积(毫升)要注意。样本溶液用手搅拌并时在‘set degas’下子超声波浴中振动5分钟进行超声处理。一部分溶液放入1.5毫升eppendorf试管，并且试管在4℃，13000转/分钟下离心4分钟。
测定360-900纳米光谱，并测定665纳米吸光率(如果必要的话，在用浸提液稀释后)和最大波长(λmax)。λmax应当接近665纳米。
校正A523和A665，以体现10毫升提取液体积中1克鲜重溶液的吸光率。使用下面公式计算已校正的A523和A665，其中使用对称重样本(单位：克)、提取液体积(单位：毫升)的校正，并且如果必要的话还使用时稀释度的校正：校正：
Figure S200680034527XD00121
计算A523/A665比值。
表2a出示了在法国Aramon莴苣(2002年1月10日播种，2002年2月15日移栽，2002年4月25日采收)观测到的叶绿素和花青素吸光率和花青素/叶绿素比值。01P.80146系是通过植株99P.38154两代自花授粉而获得的后代。Pierrot(Rijk Zwaan)，Darkland(Central Valley)，Sierra(Vilmorin)和Roxy(Enza)是普通莴苣品种。
表2b出示了在荷兰Fijnaart莴苣(2002年5月21日播种，2002年6月10日移栽，2002年8月20日采收)观测到的叶绿素和花青素吸光率和花青素/叶绿素比值。01P.80146系是通过植株99P.38154两代自花授粉而获得的后代系。Pierrot(Rijk Zwaan)，Pippo(Rijk Zwaan)，Red Rosalite(Johnny’s Selected & Orsetti)，Darkland(Central Valley)，Sierra(Vilmorin)和Roxy(Enza)是普通莴苣品种。
表2a
表2b
Figure S200680034527XD00141
保藏信息
2005年7月18日F5-植株01R.1439，02R.2413和02R.2418保藏在英国Aberdeen AB21 9YA Bucksburn Craibstone地产Ferguson大厦的NCIMB(Ferguson Building，Craibstone Estate，Bucksburn，Aberdeen AB21 9YA，United Kingdom)，其保藏登记号分别是NCIMB41337，NCIMB41338和NCIMB41339。

Claims (15)

1.用于产生莴苣物种(Lactuca dativa)的结球莴苣植株的方法，所述植株在缺少短于400nm波长的辐射下，在包括心在内的整个球中具有红色叶片，所述方法包括，
在期望的纯合栽培品种或自交种与供方亲本之间进行初始杂交，其中所述栽培品种或自交种用作回交亲本，所述供方亲本是具有心内叶片着红色的表型的植株；
选择拥有供方亲本表型的个体，并将所述个体和回交亲本重复杂交以产生这样的植株，其具有所述栽培品种或自交种的属性以及下述性状：心内叶片着红色，
其中所述具有心内叶片着红色的表型的植株具有引起包括心在内的的整个球的叶片都着红色的基因复合体，所述基因复合体存在于从种子生长得到的植株中，所述种子的代表性样品保藏在NCIMB，并且登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
2.权利要求1的方法，其中将所述期望的纯合栽培品种或自交种用作供方亲本，并且将具有心内叶片着红色的表型的植株用作回交亲本。
3.权利要求1或2的方法，其中具有心内叶片着红色的表型的植株是从种子生长得到的植株，所述种子的代表性样品保藏在NCIMB，并且登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
4.用于产生结球型莴苣的方法，其包括培育植株，直到结球，其中所述植株是莴苣物种(Lactuca sadtiva)的莴苣植株，其在缺少短于400nm波长的辐射下，在包括心在内的整个球中具有红色叶片，
其中所述植株具有引起包括心在内的的整个球的叶片都着红色的基因复合体，所述基因复合体存在于从种子生长得到的植株中，所述种子的代表性样品保藏在NCIMB，并且登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
5.用于小叶栽培的方法，其包括培养用于采收又小又鲜嫩叶片的幼小莴苣植株，其中所述植株是莴苣物种(Lactuca sativa)的莴苣植株，其在缺少短于400nm波长的辐射下，在包括心在内的整个球中具有红色叶片，
其中所述植株具有引起包括心在内的的整个球的叶片都着红色的基因复合体，所述基因复合体存在于从种子生长得到的植株中，所述种子的代表性样品保藏在NCIMB，并且登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
6.权利要求4-5任一项的方法，其中所述在缺少短于400nm波长的辐射下，在包括心在内的整个球中具有红色叶片的莴苣物种的莴苣植株是从种子生长得到的植株，所述种子的代表性样品保藏在NCIMB，并且登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
7.权利要求1-6任一项的方法，其中从播种到观测的整个时期，生长环境中缺少短于400nm波长的辐射。
8.权利要求1-7任一项的方法，其中心叶片的花青素和叶绿素之间吸光率比值A523/A665在4和50之间。
9.权利要求8的方法，其中心叶片的花青素和叶绿素之间吸光率比值A523/A665在9和27之间。
10.权利要求1-6任一项的方法，其中十片超过1厘米的最年轻心叶片的花青素和叶绿素之间吸光率比值A523/A665在4和50之间。
11.权利要求10的方法，其中十片超过1厘米的最年轻心叶片的花青素和叶绿素之间吸光率比值A523/A665在9和27之间。
12.莴苣植株用于获得莴苣植株的种子的用途，其中所述莴苣植株获得自于2005年7月18日保藏到NCIMB的种子，所述种子的登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
13.莴苣植株用于获得莴苣植株的后代的用途，其中所述莴苣植株获得自于2005年7月18日保藏到NCIMB的种子，所述种子的登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
14.莴苣植株用于获得莴苣植株的球的用途，其中所述莴苣植株获得自于2005年7月18日保藏到NCIMB的种子，所述种子的登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
15.莴苣植株用于通过将所述莴苣植株与散叶莴苣植株杂交来产生散叶莴苣的用途，其中所述莴苣植株获得自于2005年7月18日保藏到NCIMB的种子，所述种子的登记号是NCIMB41337，NCIMB41338或NCIMB41339。
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