KR20080046672A

KR20080046672A - 나노입자 제제를 보관하는 방법

Info

Publication number: KR20080046672A
Application number: KR1020087006804A
Authority: KR
Inventors: 웨이핑 위; 존 몬
Original assignee: 셀젼 코퍼레이션
Priority date: 2005-08-23
Filing date: 2006-08-23
Publication date: 2008-05-27
Also published as: ES2587583T3; CN101282715A; EP1937214B1; CN101282715B; WO2007024826A2; JP5227173B2; CA2620829A1; KR101209496B1; CA2620829C; TWI388344B; AU2006283465B2; JP2009506038A; TW200803918A; AU2006283465A1; KR20120104438A; WO2007024826A3; EP1937214A2; HK1120731A1

Abstract

본 발명은 하나 이상의 포스포리피드, 하나 이상의 계면 활성제 및 하나 이상의 친수성 폴리머에 의해 형성된 리포좀 또는 나노입자 제제를 보관하는 방법이다. 상기 방법은 이러한 제제를 동결시키고, 3일 이상의 기간동안 보관하는 단계를 포함한다.

나노입자, 리포좀, 동결건조, 포스포리피드, 친수성 폴리머, 계면 활성제

Description

나노입자 제제를 보관하는 방법{Method of storing nanoparticle formulations}

일반적으로 본 발명은 나노입자를 보관하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 강화된(enhanced) 안정성과 보관성(storage characteristic)을 갖는 리포좀을 보관하는 방법에 관한 것이다.

냉동, 동결/건조(또는 동결건조), 및 탈수와 같은, 수개의 표준 방법들이 리포좀과 나노입자 보관을 위해 사용되고 있다. 동결건조 방법에서는, 당류(sugar) 및 당류 유도체와 같은 보존 충진제(preservation filler)(항냉동제, cryoprotectant)가 보관성(storage)을 높이기 위해 사용될 수 있다. 이러한 보존 충진제가 도움은 되지만, 동결과 해동 과정 동안에 리포좀의 안정성 또는 리포좀 손상의 문제점을 항상 적절하게 극복하지는 못한다. 또한, 이러한 보존 충진제를 혼합하는(incorporating) 것은 냉동 또는 동결 조건에서 한정된 유효 기간(shelf life)에 이르게 할 수 있으므로, 현재 방법의 경제적 및 상업적 효율에 있어 한계점이 되어 왔다. 또한, 캡슐에 넣어진(encapsulated) 활성제(active agent)의 생물학적, 화학적, 및/또는 물리적 특징에서의 해로운 변화가 동결, 해동 및/또는 건조 과정, 또는 동결건조와 관련된 탈수 과정 동안에 일어날 수 있다. 또한, 현재 의 동결건조 과정(동결 및 건조 사이클)은 매우 느리고 시간을 소비하는 것일 수 있다. 중요한 관심사는, 동결 건조가 너무 빨리 또는 제어되지 않는 온도에서 수행된다면, 리포좀 막의 생물학적, 화학적, 및/또는 물리적 특징의 변화를 초래하여, 보관되는 동안에 불안정함에 이를 수 있게 한다는 것이다. 궁극적으로, 이것은 또한 캡슐에 넣어진 활성제의 특징에 불리한 영향을 미칠 수 있다.

단독으로 사용되거나 또는 다른 방법과 조합되어 사용되는 통상적인 동결 방법에서는, 예를 들면, 리포좀 소포(vesicle) 막이 얼음 결정 형성물(ice crystal formation)에 노출되는 결과로서 고압에 의한 물리적 스트레스(mechanical stress)에 의해, 또는 동결, 해동 및/또는 탈수 동안에 리포좀 내에서 용질의 팽창 및 수축에 의해, 손상이 발생될 수 있다. 동결 사이클 동안, 리포좀 막의 팽창은 리포좀 막의 약함(weakness), 및 기공(fistula)과 균열(crack)의 형성을 일으킬 수 있고, 이것은 차례로 누출(leakage) 문제에 이르게 할 수 있는 완전성(integrity) 및 안정성의 감소를 일으킬 수 있다. 또한, 개개의 리포좀들은 보통 서로서로 가깝게 무리지워져 있어서, 통상적인 동결 동안에는, 한 리포좀의 팽창이 인접한 리포좀의 완전성에 대해 부정적인 결과를 일으킬 수 있는 압력을 발생시킬 수 있다.

일반적으로, 기존의 방법들은 리포좀의 유효 기간, 보관, 취급, 및 함입 특징(entrapment property) 뿐만 아니라, (i) 리포좀 또는 나노입자 조성물; 및 (ii) 활성제의 완전성을 유지하는 능력에 있어 한계점을 갖고 있다. 또한, 상기 방법들 중 상당수는 공정을 수행하는데 필요한 시간상 걸림으로 인한 추가적인 한계점을 갖고 있고, 그 결과 공정의 생산 배치(production batch)의 크기가 전체적인 비용 을 증가시키게 된다.

발명의 요약

본 발명은 하나 이상의 포스포리피드, 하나 이상의 계면 활성제 및 하나 이상의 친수성 폴리머의 조합에 의해 형성된 리포좀 또는 나노입자 제제를 보관하는 방법이다. 상기 방법은 이러한 제제를 동결시키는 단계, 및 3일 이상의 기간 동안 상기 제제를 보관하는 단계를 포함한다.

발명의 상세한 설명

본 발명의 구체예는 하기에서 논의된다. 구체예를 기술할 때, 명확함을 위하여 특정 용어들이 사용된다. 그러나, 본 발명이 상기 선택된 특정 용어로 제한되는 것은 아니다. 특정한 대표적 구체예가 논의되지만, 이것은 단지 설명 목적을 위한 것으로만 이해되어야 한다. 관련 분야의 당업자는 본 발명의 정신과 범위로부터 벗어나지 않는다면, 기타 성분과 요소들이 사용될 수 있음을 이해할 것이다. 본 명세서에서 인용된 모든 참조 문헌은 각각 개별적으로 편입된 것처럼 참조로 통합되어 있다.

나노입자가 본원 명세서에서 사용될 때, 상기 나노입자는 내부 코어(inner core)를 둘러싸고 있는, 양친매성 물질(amphiphile) 즉 소수성 부분과 친유성 부분을 갖는 성분으로부터 형성된 외부 층 또는 외부 막을 갖는 일반적으로 구형인 소포(spherical vesicle)로 정의될 수 있다. 일반적으로, 나노입자의 크기는 약 1000 nm 미만이다. 본 발명에 대해 특히 관심이 가는 것은, 약물 전달 시스템에서 또는 약물 전달 시스템으로 사용될 수 있는 나노입자이다. 예를 들면, 본 발명에서 유용한 나노입자는 제한되지는 않지만 (i) 약물과 같은 생물학적 활성 화합물; 또는 (ii) 조영제(imaging agent)와 같은 비-생물학적(non-biologically) 활성 화합물을 포함하는, 생물학적 시스템으로 전달되는 화합물을 캡슐에 넣기 위해 사용될 수 있다. 리포좀은 본 발명으로 사용될 수 있는 나노입자의 대표적인 형태이다. 리포좀은 수성 코어(aqueous core)를 둘러싸는 리피드 이중층(lipid bilayer)을 포함하고, 또한 생물학적 활성 화합물과 비-생물학적 활성 화합물을 캡슐에 넣을 수 있는 소포이다. 본 발명은 동결, 해동 및 교반(agitation))과 같은 다양한 스트레스에 의해 발생되는 손상으로부터 나노입자 또는 리포좀 막의 완전성을 강화하고 보호한다. 따라서, 본 발명은 리포좀과 같은 나노입자의 특징인 안정성과 보관성을 높이고 및/또는 유효 기간을 길게 한다. 동결이 본원 명세서에서 사용될 때, 동결은 일반적으로 고체 상태를 제공하는 0℃ 미만의 온도, 예를 들면, 약 -20℃ 또는 그 미만, 약 -78℃ 또는 그 미만(즉, 드라이 아이스 온도) 또는 약 -196℃ 또는 그 미만(즉, 액체 질소 온도)에서 수행될 수 있다. 비록 본 발명이 대표적인 나노입자로서 리포좀을 갖는 구체예에 대해 일반적으로 설명되고 있지만, 이에 제한되지 않으며, 본 발명은 그 밖의 나노입자에도 적용가능하다.

다양한 리포좀 조성물 및 그 밖의 나노입자 제제가 당해 분야에서 잘 알려져 있고, 상업적으로는 의료용, 화장품용 및 그 밖의 목적으로 위해 사용되고 있다. 리포좀 제제는 다양한 몰 비(molar ratio)로 된 다양한 리피드뿐만 아니라, 제한되지는 않지만 표적 모이어티(targeting moiety)와 생물학적 활성 물질을 포함하는 그 밖의 구성성분(constitutent)의 조합이다. 리포좀 제조 방법은 일반적으로 알려져 있다. 리포좀은 다양한 크기로 만들어질 수 있는데, 예를 들면 직경이 20 nm 미만 내지 500 nm 미만 초과로 만들어질 수 있고; 및 단일라멜라(unilamellar) 또는 다중라멜라(multilamellar) 소포가 될 수 있다. 이들은 의료 목적 및 비-의료 목적을 위해 사용될 다양한 물질을 캡슐에 넣기 위해 사용될 수 있다. 리포좀은 약리학적 활성제, 향미제(flavor agent), 진단제, 영양제(nutritional agent), 유전자 생성물(gene product), 조영제와 같은 비-생물학적 활성 산물과 같은 활성제, 및 이들의 혼합물을 함입하기 위해 사용될 수 있고, 상기 활성제들을 특정 부위로 전달하기 위해 사용될 수 있다. 그러나, 리포좀 제제의 주요 문제점은 리피드들의 분해(degradation) 및/또는 활성제의 방출없이, 연구 또는 상업적 목적을 위해 상기 제제를 보관하는 능력(예를 들면, 유효 기간)이 되어 왔다. 따라서, 시간에 따른 누출 및 리포좀 분해에 대한 소포의 안정성(vesicle stability)이 주요한 문제점이 된다.

본 발명의 한 구체예는 나노입자형 제제, 예를 들면 리포좀 제제의 보관에 관한 것이지만, 리피드와 같은 양친매성 물질이 포함된 그 밖의 나노입자 유형에 대해서도 적용될 수 있다. 본 발명에서 사용하는데 적절한 제제는 하나 이상의 양친매성 물질, 하나 이상의 계면 활성제, 및 하나 이상의 친수성 폴리머를 포함하는 막 성분을 갖는 나노입자를 포함한다. 친수성 폴리머는 변형되지 않을 수 있고(unmodified); 나노입자 막과 결합될(associated) 작용기의 첨가에 의해 변형될 수 있고; 또는 나노입자 막의 양친매성 물질, 계면 활성제, 또는 그 밖의 성분에 화학적으로 결합될 수 있다. 친수성 폴리머와 나노입자 막을 결합하기 위한 변형의 한 예는 막-형성(membrane-forming) 양친매성 물질 또는 계면 활성제의 극성 작용기와 더 강한 결합을 생성하는 극성 작용기 또는 전하-형성(charge-forming) 작용기의 첨가를 포함할 수 있다. 택일적으로는, 친수성 폴리머는 막-형성 양친매성 물질 또는 계면 활성제에 공유 결합으로 결합되어, 나노입자 또는 리포좀의 막에 존재하여, 나노입자 또는 리포좀의 완전성을 보호하고 유지할 수 있으며, 또는 리포좀 또는 나노입자 제제의 내부 리피드 층으로 삽입될(incorporated) 수 있다. 친수성 폴리머는 예를 들면, 아미드 결합(linkage) 또는 에스테르 결합과 같은 생분해성 또는 가수분해성 결합을 통해, 또는 아민 결합 또는 에테르 결합과 같은 더 안정한 결합을 통해, 양친매성 물질 또는 계면 활성제에 결합될 수 있다.

이론에 의해 구속되지 않지만, 친수성 폴리머는 동결, 냉동, 동결건조, 탈수 및/또는 재수화(rehydration) 과정 동안에, 리포좀 또는 나노입자 막의 완전성을 보호한다고 믿어지고 있다. 나노입자와 리포좀 막의 완전성의 보호는 나노입자와 리포좀 제제의 물리적, 화학적 및 생물학적 특징을 유지시키고, 또한 나노입자 또는 리포좀 안에 함입되어 있거나 또는 그 안에 들어가 있는 소정의 화합물의 특징을 유지시킨다. 따라서, 리포좀 또는 나노입자 제제는 제한되지는 않지만, 생물공학, 전자기학, 방어(defense) 및 농업 분야와 같은 의학용, 수의학용, 및 비-의학용 용도를 위해 함입된 캡슐에 넣어진 물질(encapsulate)을 유지하고, 동결된 상태에서 리포좀 제제의 보관과 운반을 가능하게 한다.

양친매성 물질 대 계면 활성제의 비율은 가변적이고, 나노입자 또는 리포좀의 의도된 용도를 위해 적절한 소정의 비율이 될 수 있다. 양친매성 물질과 계면 활성제 모두 양친매성 및 표면 활성화(surface active) 특징을 가질 수 있다고 인식되고 있다; 그러나, 본원 명세서의 목적을 위하여, 상기 두 성분들이 유사한 특징을 가질 때에는, 양친매성 물질은 주요(major) 막 성분으로 간주될 수 있는 반면에, 계면 활성제는 부수적인(minor) 성분이 된다. 따라서, 양친매성 물질 대 계면 활성제의 비율은 적어도 약 51:49이고, 99:1 만큼 커질 수 있다. 대표적인 구체예에서, 양친매성 물질:계면 활성제 비율은 적어도 약 70:30이고, 약 80:20 또는 90:10이 될 수 있다. 당업자에게 알려진 바와 같이, 계면 활성제의 첨가는 나노입자 또는 리포좀의 물리적 또는 화학적 성질의 변형을 일으켜, 상 전이 온도(phase transition temperature) 또는 막 투과성의 감소와 같은 소정의 바람직한 특징을 달성할 수 있다. 나노입자 조성물에서 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 있다.

친수성 폴리머는 양친매성 물질과 계면 활성제의 전체 량에 대해, 약 0.1 내지 약 25 몰 퍼센트 범위에 있는 양으로, 나노입자 또는 리포좀의 막에 존재할 수 있다. 친수성 폴리머가 친수성 폴리머 약 75-90 중량%와 리피드 25-10 중량%를 포함하는 리포좀-형성 포스포리피드에 결합되어 있는 구체예에서는, 이것은 친수성 폴리머 변형된 포스포리피드의 약 0.11 내지 약 33 몰 퍼센트에 해당하게 된다. 당해 분야의 당업자에게 이해되어 있는 바와 같이, 친수성 폴리머 몰 퍼센트의 변형된 양친매성 물질의 몰 퍼센트로의 변환은 변형되지 않은 양친매성 물질의 분자량과 친수성 폴리머의 분자량에 의존할 것이다. 상기 비율의 계산은 당해 분야의 당업자의 시계(purview) 내에 있다. 본 발명의 구체예는 약 3 내지 20 몰 퍼센트 친수성 폴리머(예를 들면, 약 3 내지 약 27 몰 퍼센트 변형된 양친매성 물질), 또는 3 내지 10 몰 퍼센트 친수성 폴리머(예를 들면, 약 3 내지 약 13 몰 퍼센트 변형된 양친매성 물질)를 포함할 수 있다. 본 발명의 소정의 구체예는 약 4 내지 약 5 몰 퍼센트 변형된 양친매성 물질로부터 제조되어, 약 2.5 내지 약 4.5 몰 퍼센트 친수성 폴리머를 제공한다. 친수성 폴리머의 최적의 함량은 당해 분야의 당업자의 통상적인 실험을 통해 용이하게 결정될 수 있다.

본 발명의 조성물과 방법은, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리-2-에틸-2-옥사졸린, 폴리비닐피롤리돈, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(methoxypolyethylene glycol, mPEG) 유도체 및 이들의 혼합물과 같은 하나 이상의 친수성 폴리머와 조합되어 있는, 포스포리피드, 소이빈 리피드(soybean lipid), 포스포에탄올아민, 콜레스테롤, 리소리피드(lysolipid), 계면 활성제 및 이들의 혼합물을 포함하는 다양한 조성물로부터 제조된 나노입자와 리포좀에 유용할 수 있지만, 이들에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 포스포리피드의 예는 제한되지는 않지만, 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에탄올아민, 및 스핑고미엘린(sphingomyelin)을 포함한다. 본 발명에서 유용한 대표적인 계면 활성제는 제한되지는 않지만, 디체인 포스포리피드((dichain phospholipid), 리소리피드, 담즙산(bile acid), 미리스토일 계면 활성제, 팔미토일 계면 활성제, 스테아로일 계면 활성제, 글리세릴 모노올리에이트, 세라마이드(ceramide), PEG-세라마이드, C18-에테르 연결된 리소포스파티딜 콜린(C18-ether linked lysophosphatidyl choline), 폴리에틸렌 글리콜-폴리에틸렌 코폴리머, 블록 코폴리머(block copolymer), 지방산 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 리소리피드의 예는 제한되지는 않지만, 모노팔미토일 포스파티딜콜린(monopalmitoyl phosphatidylcholine, MPPC), 모노라우릴 포스파티딜콜린(monolauryl phosphatidylcholine, MLPC), 모노미리스토일 포스파티딜콜린(monomyristoyl phosphatidylcholine, MMPC), 모노스테아로일 포스파티딜콜린(monostearoyl phosphatidylcholine, MSPC) 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 대표적인 친수성 폴리머는 제한되지는 않지만, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리-2-에틸-2-옥사졸린, 폴리비닐피롤리돈, 및 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG), 및 이들의 혼합물을 포함한다. 본 발명에서 유용한 활성제의 예는 제한되지는 않지만, 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 조영제와 같은 비-생물학적 활성 산물과 같은 활성제, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 활성제의 대표적인 형태는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제(anti-neoplastic agent), 항-궤양제(anti-ulcerative agent), 항-발작제(anti-seizure agent), 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제(anti-infective agent), 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 대표적인 항 종양제는 제한되지는 않지만, 독소루비신과 에피루비신과 같은 안트라시클린(anthracycline); 탁솔 및 탁소테레(taxotere)와 같은 탁산(taxane); 및 시스-플라틴, 카르보플라틴(carboplatin) 및 옥살리플라틴(oxaliplatin)과 같은 플라틴을 포함한다.

본 발명의 한 구체예는 포스포리피드 DPPC, 리소리피드 MSPC, 및 친수성 폴리머를 포함하도록 작용기화된(functionalized) 1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DSPE) 예를 들면 DSPE-mPEG-2000 및/또는 DSPE-mPEG-5000과 같은 포스포리피드를 포함하는 리포좀 제제를 사용하며, 이때 상기 친수성 폴리머는 아미드 결합을 통하여 상기 리피드에 붙어있다. 90:10:1 만큼의 낮은, 포스포리피드:리소리피드:친수성 폴리머 작용기화된-포스포리피드의 몰 비를 포함하는 리포좀 조성물이 동결 및 보관 방법에서 효과적인 것으로 나타났다. 결과적으로, 본 발명은 상업적인 리포좀 제품에서 효율을 증가시키고, 제조 비용을 더 낮추는데 사용될 수 있는 광범위한-기초의 용도를 갖고 있다. 본 발명은 소정의 나노입자 또는 리포좀 제제에 적용되어, 동결, 냉동, 탈수 및 동결건조 동안 리포좀의 완전성을 보호할 수 있다.

하나의 구체예에서, 본 발명은 안정성, 보관성, 함입, 또는 방출 특성과 같은 강화된 특징을 갖는, 나노입자 제제 예를 들면 리포좀 제제를 보관하는 방법에 관한 것이다. 리포좀과 같은 나노입자의 막 내부로 친수성 폴리머의 삽입(incorporation)은 이러한 소포의 안정성, 보관성, 함입, 및 방출 특성을 강화시키는 것으로 밝혀졌다. 나노입자 및 리포좀 제제에서 친수성 폴리머의 함유는 동결, 냉동, 해동, 동결건조, 탈수, 또는 상기 제제의 보관, 안정성, 및 취급에 도움이 되도록 사용되는 그 밖의 방법에 의해 발생되는 나노입자 또는 리포좀 막의 생물학적, 화학적, 및 물리적 특징의 해로운 변화를 제한한다. 따라서, 나노입자 또는 리포좀 제제와 결합된(associated) 친수성 폴리머의 존재는 원래 상태 막의 완전성을 보호하고, 유지하고 및/또는 강화한다.

과거에는, 리포좀을 저장할 목적으로 동결만을 효과적으로 사용하는 것은 불가능하였다. 리포좀 제품의 대다수가 "동결시키지 마세요"라고 하는 경고용 라벨을 갖고 있다. 이러한 제품의 예는 Doxil, AmBisome, DepoCyt, 및 수개의 화장품용 리포좀과 같은, 상업적으로-입수가능한 제품의 라벨에서 보여질 수 있다. 본 발명에서 유용한 제제는 막의 완전성 또는 캡슐에 넣어진 내용물을 손상시키지 않고, 리포좀과 나노입자가 동결될 수 있는 조성물을 제공할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제제를 사용하는 것은 한 개의 바이알 및 복수 개-바이알 제품의 조합이 분배 목적으로 동결되고 저장되는 것을 가능하게 할 것이다. 즉, 본 발명의 특별한 장점은 사용하기 전에 즉시 재-제제화(re-formulation)를 필요로 하는 분리된 용기로 운반되기보다는, 단일 투여 제형(unit dosage form)으로 될 수 있도록, 리포좀 제제가 한 개의 용기로 동결되고 운반될 수 있다는 것이다.

또한 본 발명은 나노입자 또는 리포좀 제제(preparation)를 제제화하고 보관하는 방법을 포함하고, 상기 방법은 나노입자 또는 리포좀 조성물의 형성을 위해 적절한 양친매성 물질 또는 리피드와 친수성 폴리머를 결합하고, 동결시키고 및 보관하는 단계를 포함한다. 이러한 나노입자와 리포좀은 당해 분야에서 일반적으로 알려져 있는 방법을 사용하여 형성될 수 있다; 예를 들면, 양친매성 성분과 수용액을 적절한 조건하에서 혼합한다. 적절한 방법은 당해 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들면, 본원 명세서에서 참조로 통합되어 있는 Needham, 미국특허 제6,200,598호와 제6,726,925호; Ogawa, 미국특허 제5,094,854호를 참조한다. 나노입자와 리포좀 조성물은 단기간 동안; 예를 들면 수분 또는 수시간, 및 장기간 동안; 예를 들면 수일, 수주, 수개월, 또는 수년 동안 보관될 수 있다.

또한, 기술된 상기 방법은 나노입자와 리포좀 제제가 동결 및 보관되기 전에, 또는 그 이후에 복수 개 또는 한 개의 바이알에서 단위 투여형(unit dose)으로 분배되는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 나노입자와 리포좀 제제는 즉시 사용될수 있거나 또는 키트로서 동결시켜 포장될 수 있는, 세포 독성 및 비-세포 독성 약물, 유전자 생성물 또는 생물학적 제제뿐만 아니라 비-생물학적 제제 예를 들면 조영제 중 하나 이상을 캡슐에 넣을 수 있다.

인간 및/또는 동물에서 나노입자와 리포좀 조성물을 사용하는 동안에 또 다른 관심사는 상기 조성물의 유효 순환 시간(effective circulation time) 및 치료적 효용(therapeutic utility)을 제한하는 세망내피계(reticuloendothelial system, RES)와 같은 천연 생체 방어에 의해, 상기 조성물이 인식되어 제거될 수 있다는 것이다. 나노입자와 리포좀 조성물의 크기를 최적화하는 방법, 또는 천연 생물학적 제거 과정으로부터 상기 조성물을 보호하거나 "숨기기" 위하여 상기 조성물 막에 소정의 요소를 첨가함으로써 "숨겨진(stealth)" 조성물을 만드는 방법과 같은 수개의 방법들이 조사되었다. 보관하는 동안, 나노입자와 리포좀은 크기가 증가하는 경향을 가져, 막의 완전성과 안정성의 손실을 가져오게 된다. 목표로 하는 나노입자와 리포좀 크기 및 균일성을 유지하기 위한 방법을 개발하는 것은 이러한 "숨겨진" 특징을 생성하기 위해 별개의 요소들을 특이적으로 첨가하는 것에 대한 대안으로서, 객체 내에서 유효 순환 시간을 증가시키고 유지하는데 도움이 될 수 있다. 이러한 이유로, 동결, 냉동, 탈수, 또는 동결 건조 동안에 나노입자 또는 리포좀의 크기를 지키는 것은 이들의 완전성 및 수행에 매우 중요할 수 있다. 따라서, 나노입자 또는 리포좀의 안정성을 강화하는 제제는 보관하는 동안에 입자 크기 상수(particle size constant)를 유지할 수 있고, 치료 효율을 유지할 수 있다.

대표적인 구체예에서, 양친매성 물질, 계면 활성제 및 유효량의 친수성 폴리머(또는 친수성 폴리머를 포함하도록 변형된 양친매성 물질)가 공지된 방법을 사용하여 결합되어 나노입자를 형성하게 된다. 예를 들면, 양친매성 물질, 계면 활성제 및 친수성 폴리머(또는 친수성 폴리머를 포함하도록 변형된 양친매성 물질)는 유기 용매에서 결합될 수 있고, 그 유기 용매는 제거되고, 그 다음에 수용액이 첨가된다. 그런 다음, 활성제가 예를 들면, pH 구배(pH gradient)의 사용과 같은 공지된 방법을 사용하여 나노입자의 내부 공간 안으로 충진될(load) 수 있다. 나노입자는 예를 들면 적절한 폴리카보네이트 필터를 통한 압출(extrusion)과 같은 공지된 방법을 사용하여 크기를 만들 수 있다. 크기 만듬(sizing)은 활성제로 나노입자를 충진하기 전에 또는 충진한 후에 수행될 수 있다. 최종 나노입자 크기는 약 1000 nm 미만, 또는 약 10 내지 약 500 nm, 약 25 내지 약 500 nm, 약 50 내지 약 200 nm 또는 약 80 내지 약 125 nm가 될 수 있다. 친수성 폴리머의 유효량은 나노입자를 제조, 적절한 온도에서 동결, 적절한 기간 동안 보관, 제제를 해동 및 안전성의 지표가 되는 나노입자의 특징을 측정함으로써 결정될 수 있다. 측정된 특징은 예를 들면, 입자 크기 또는 활성제의 누출이 될 수 있다. 최초 제제에서 친수성 폴리머의 함량을 변경시켜, 목표로 하는 정도의 안정성을 달성할 수 있다.

나노입자의 제조 이후에, 제제는 동결되고 예를 들면 약 -20℃ 또는 그 미만, 약 -78℃ 또는 그 미만, 또는 약 -196℃ 또는 그 미만에서 고체 상태로 보관될 수 있다. 대표적인 구체예에서, 나노입자는 해동된 후 물리적 특징에서 유효한 변화없이 약 3일 내지 그 이상 동안 동결된 상태로 보관될 수 있다. 다른 구체예에서, 나노입자 제제는 약 7일 또는 그 이상 동안, 약 1개월 또는 그 이상 동안, 약 3개월 또는 그 이상 동안, 또는 약 24개월 동안, 심지어 더 연장된 시간 동안 보관될 수 있다. 제제는 벌크 용액(bulk solution)으로 보관될 수 있고, 또는 동결하기 전에 분배를 위해 단일 투여형으로 나누어질 수 있다. 보관뿐만 아니라, 동결된 나노입자 제제는 그것이 사용될 지역으로 운송될 수 있다. 예를 들면, 제제는 생산 설비에서 제조되고, 단일 투여형으로 분리되고 동결되어, 그 제제가 사용될 장소로 운반될 수 있다. 이것은 기존의 제제 및 분배 방법에 비해 더 나은 장점을 제공한다. 전통적인 방법을 사용할 때에는, 나노입자 제제는 종종 안정성의 손실을 막기 위하여 운송용 구성 부품(component part)으로 분리되어 진다. 예를 들면, 리포좀 제제는 종종 한 용기에는 리포좀 또 다른 용기에는 활성제 용액이 있는 복수 개의 바이알로 운송되었다. 사용하기 전에, 두 개의 분리된 용기는 투여하기 전 활성제의 충진을 확인할 수 있도록 결합되어야 한다. 이러한 최종 상태의 용액을 제조할 때의 잘못이 효율의 손실을 일으킬 수 있다. 본 발명을 사용할 때에는, 이러한 결합하는 단계가 없어지게 된다. 따라서, 사용하는 지점에서, 제제가 해동되어 바로 사용되거나 또는 투여될 수 있다. 이것은 조성물의 사용을 편리하게 하고, 조성물이 효과적인 투여를 위해 정확하게 제조되었는지를 확인가능하게 한다.

따라서, 본 발명은 나노입자 또는 리포좀 제제를 보관, 운반 및 투여하는 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 보관되고 및/또는 운반된 제제는 특정 제제를 위해 유용한 소정의 방식대로 투여될 수 있다. 활성제 및 그의 작용 부위에 따라 소정의 적절한 투여 경로가 사용될 수 있지만, 투여 방법은 경구, 직장, 복막, 정맥내, 및 구강 투여를 포함한다. 제제는 단독으로; 즉 제조된 그대로 투여될 수 있고, 또는 사용하기 전에 그 밖의 치료제 또는 비히클(vehicle)과 함께 결합되어 투여될 수 있다. 비히클은 수용액, 현탁액, 에멀젼, 고체 비히클, 분산제 등과 같은 그 밖의 고체 또는 액체 부형제를 포함할 수 있다. 나노입자 제제가 제조된 후에, 즉 보관 및 운송 전에 바로 사용된다면, 최종 용도는 나노입자 제제의 사용과 일치하게 된다.

본 발명의 상기 특징 및 그 밖의 특징과 장점이 하기 대표적인 실시예로부터 추가로 이해될 것이지만, 본 발명의 범위를 제한하기 위함은 아니다.

대표적 실시예 1

디팔미토일-포스파티딜콜린(DPPC), 1-스테아로일-2-리소-포스파티딜콜린(MSPC) 및 N-(카르보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포-에탄올아민(DSPE-mPEG-2000)을 90:10:4의 몰 비로 디클로메탄에 용해시켰다. 그런 다음, 회전식 증발(rotary evaporation)에 의해 유기 용매를 제거하였다. 그런 다음, 얻은 혼합물을 pH 4의 300 mM 시트릭 버퍼(citric buffer)로 수화시켜, 최종 리피드 농도를 약 100 mg/ml로 얻었다. 그런 다음, 생성된 현탁액을 두 개의 폴리카보네이트 막 필터(Hope, MJ. et al. Production of large unilamellar vesicles by a rapid extrusion procedure, characterization of size, trapped volume and ability to maintain a membrane potential. Biochim . Biophys. Acta . 812: 55-65, 1985)를 통해 압출시켰다. 이 실시예에서 최종 리포좀 제제는 98 내지 122 nm의 최초 평균 입자 크기를 가졌다(일반적으로, 본 발명 리포좀의 입자 크기는 압출 방법에 따라 50-500 nm가 될 것이다). 리포좀을 소듐 카보네이트 용액 및 약물인 독소루비신과 혼합함으로써, 리포좀 내부로 상기 약물을 충진시켰다. 간단하게는, 독소루비신 용액(5.8 mg/ml) 1. 6 ml와 0.5 mM 소듐 카보네이트 1.2 ml를 리포좀 혼합물 1.9 ml에 첨가하였고, 35℃에서 60분 동안 평형 상태를 유지하였다. 약물이 충진된 리포좀 뿐만 아니라, 내부가 빈 리포좀(empty liposome)을 -20℃에서 보관하였다. 입자 크기의 변화를 모니터하였다. mPEG의 첨가 없이, 리포좀 조성물을 동일한 방법으로 제조하였다. 표 1은 리포좀의 완전성 및 안정성의 표준 분석법으로 측정되었을 때, mPEG의 첨가로 인하여, 리포좀 입자 크기가 동결 및 해동 이후에 동일하게 유지되었으며, 리포좀이 24개월 이상 동안 안정하였음을 보여준다. 대조적으로, 친수성 폴리머 mPEG가 결여된 리포좀은 동결 및 해동 이후에도 안정하지 못하였다. 이러한 불안정함의 증거는 동결 이후에 입자 크기가 증가한다는 것이다. 도 1은 동결/해동 이후의 리포좀 제제를 보여준다. 동결/해동 전 및 이후에 가시적인 외관 및 입자 크기에 있어 유의성 있는 차이점이 없었다.

표 1. 동결과 해동 이후의 리포좀 입자 크기 변화

시간	입자 크기(nm)
	MPEG가 있는 리포좀		MPEG가 없는 리포좀
	내부가 빈 리포좀	독소루비신 리포좀	내부가 빈 리포좀	독소루비신 리포좀
최초	98.5	107	122	121
3 일	테스트하지 않음	테스트하지 않음	131	137
3 개월	100	105	테스트하지 않음	테스트하지 않음
24 개월	99.6	테스트하지 않음	테스트하지 않음	테스트하지 않음

대표적 실시예 2

또 다른 독소루비신-포함 리포좀 제제가 대표적 실시예 1에서와 같이 제조되었다.

시료를 -20℃에서 1주 동안, 1개월 동안, 및 3개월 동안 동결시켰다. 각각의 시간 지점에서, 독소루비신 함량, 1.2 ㎛에서 % 회수율(recovery), % 캡슐화(encapsulation), 리피드 농도, pH 및 소포 크기를 측정하였다. 최초 시간 지점(t = 0)에서, 세 개의 시료를 동결시키거나 또는 동결시키지 않고 테스트하여, 리포좀 제제에 대한 동결의 영향을 결정하였다. 또한, 한 개의 시료를 3회의 동결-해동 사이클에 노출시켜 복수회의 동결-해동 사이클이 해로울 수 있는지 여부를 결정하였다.

하기 표에서 보여지는 바와 같이, t=0에서 리포좀 제제는 주위 조건 또는 동결 조건에서 유사한 특징을 가졌다. 심지어, 3회의 동결-해동 사이클도 막의 완전성에 영향을 주지 못하였다. 상기 제제는 3-개월 보관 기간 동안 -20℃에서 안정하였다. 이러한 시간 계획에 따라, 소포 크기, 독소루비신 함량, 캡슐화 또는 리피드 함량에서 유의적인 변화가 관찰되지 않았다. 시료에 대해 측정된 외부 pH는 서로 다른 시간 지점에서 약간 변하였지만, 카보네이트 버퍼에서 제조된 리포좀의 pH 측정은 바이알로부터 CO₂ 가스가 빠져나오는 시간에 따라 변화하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 표 2에서 나타난 바와 같이, 3-개월 pH 결과는 1 주의 pH 결과와 유사하였므로, pH의 변화는 막의 안정성에 영향을 주지 않았다.

표 2. 반복된 동결과 해동 이후의 리포좀 안정성

	t=0 동결되지 않음	t=0 동결됨	t=0 동결/해동을 3회	1 주	1 개월	3 개월
DOX(mg/ml)	1.85	1.76	1.77	1.83	1.76	1.73
% 회수율 1.2㎛	99.2	99.8	99.9	100.2	99.3	100.5
% 캡슐화	99.9	99.5	99.4	99.5	99.5	98.2
전체 리피드(mg/ml)	35.1	35.2	35.0	34.9	34.9	35.7
pH	8.15	7.85	7.85	8.50	8.84	8.52
크기	97.0	98.0	98.3	98.9	96.7	97.8

본원 명세서에서 설명되고 논의된 구체예는 본 발명을 만들고 사용하도록 발명자에게 최적으로 알려진 방식을 당해 분야의 당업자들에게 개시하기 위함이다. 본원 명세서에서 어떤 것도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다. 제시된 모든 실시예는 대표적인 것이며, 비-제한적이다. 상기-기술된 본 발명의 구체예는 상기 개시물의 관점에서 당해 분야의 당업자들에게 이해되는 바에 따라, 본 발명의 범위를 벗어나지 않는다면, 변형될 수 있고, 변경될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 특별히 기술되지 않는다면 청구범위와 그 등가물의 범위 내에서, 실시될 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

도 1은 본 발명에 따른 동결과 해동 이후의 리포좀 제제를 보여준다.

Claims

하나 이상의 양친매성 물질(amphiphile), 하나 이상의 계면 활성제 및 하나 이상의 친수성 폴리머를 갖는 나노입자 제제를 보관하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 제제를 동결시키고 3일 이상의 기간 동안 보관하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 동결된 리포좀 제제를 운반하고 상기 제제를 또 다른 장소에서 해동시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 나노입자는 리포좀인 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 양친매성 물질은 하나 이상의 포스포리피드를 포함하는 것인 방법.
제4항에 있어서,

a. 상기 하나 이상의 포스포리피드는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에탄올아민, 스핑고미엘린 및 이들의 혼합물로부터 선택되고;

b. 상기 하나 이상의 계면 활성제는 디체인 포스포리피드(dichain phospholipid), 리소리피드(lysolipid), 담즙산, 미리스토일 계면 활성제, 팔미토일 계면 활성제, 스테아로일 계면 활성제, 글리세릴 모노올리에이트, 세라마이드(ceramide), PEG-세라마이드, C18-에테르 연결된 리소포스파티딜 콜린(C18-ether linked lysophosphatidyl choline), 폴리에틸렌 글리콜-폴리에틸렌 코폴리머, 블록 코폴리머(block copolymer), 지방산 및 이들의 혼합물로부터 선택되고; 및

c. 상기 하나 이상의 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리-2-에틸-2-옥사졸린, 폴리비닐피롤리돈, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(methoxypolyethylene glycol, mPEG) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 친수성 폴리머는 가수분해성 결합(hydrolysable linkage)을 통해 상기 포스포리피드에 결합된 것인 방법.
하나 이상의 포스포리피드, 하나 이상의 계면 활성제 및 하나 이상의 친수성 폴리머를 가지며 상기 포스포리피드가 하나 이상의 포스파티딜 콜린이고; 상기 계면 활성제가 하나 이상의 리소리피드이고; 및 상기 친수성 폴리머가 DSPE-mPEG-2000, DSPE-mPEG-5000 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 리포좀 제제를 보관하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 제제를 동결시키고 3일 이상 동안 보관하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 동결된 리포좀 제제를 운반하고 상기 제제를 또 다른 장소에서 해동시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 포스포리피드는 하나 이상의 포스파티딜 콜린이고; 상기 계면 활성제는 모노팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 모노라우릴 포스파티딜콜린(MLPC), 모노미리스토일 포스파티딜콜린(MMPC), 모노스테아로일 포스파티딜콜린(MSPC), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상이고; 및 상기 친수성 폴리머는 DSPE-mPEG-2000 또는 DSPE-mPEG-5000 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 포스포리피드는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)이고; 상기 계면 활성제는 모노팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC)이고; 및 상기 친수성 폴리머는 DSPE-mPEG-2000, DSPE-mPEG-5000 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 포스포리피드는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)이고; 상기 계면 활성제는 모노스테아로일 포스파티딜콜린(MSPC)이고; 및 상기 친수성 폴리머는 DSPE-mPEG-2000, DSPE-mPEG-5000 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 DPPC:MPPC:DSPE-mPEG의 몰 비는 약 90:10:4인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 DPPC:MSPC:DSPE-mPEG의 몰 비는 약 90:10:4인 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 나노입자 제제는 약리학적 활성제, 향미제(flavor agent), 진단제, 영양제(nutritional agent), 유전자 생성물(gene product), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제14항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제(anti-neoplasties), 항-궤양제(anti-ulcerative), 항-발작제(anti-seizure agent), 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제15항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제16항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영 양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제18항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제19항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제20항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제22항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히타민제, 항-종양제, 항-궤양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제23항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제24항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제26항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제27항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제28항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제6항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제30항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤 양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제31항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제32항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제34항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제35항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제36항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영 양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제38항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제39항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제40항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제42항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제43항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제44항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제46항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제47항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제48항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제12항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제50항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤 양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제51항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제52항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제54항에 있어서, 상기 활성제는 마취제, 항-히스타민제, 항-종양제, 항-궤양제, 항-발작제, 근육 이완제, 면역 억제제, 항-감염제, 비-스테로이드계 항-염증제, 조영제, 영양제, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제55항에 있어서, 상기 활성제는 하나 이상의 항-종양제인 것인 방법.
제56항에 있어서, 상기 활성제는 독소루비신인 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 친수성 폴리머는 비-가수분해성(non-hydrolysable) 결 합을 통해 상기 포스포리피드에 결합된 것인 방법.
제58항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제60항에 있어서, 상기 나노입자 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제3항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제62항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제4항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제64항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제5항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제66항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제7항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제68항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제9항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제70항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제72항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제11항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제74항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것 인 방법.
제12항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제76항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제13항에 있어서, 상기 동결시키는 단계는 동결건조 방법의 일 부분인 것인 방법.
제78항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
하나 이상의 양친매성 물질, 하나 이상의 계면 활성제 및 하나 이상의 친수성 폴리머를 갖는 나노입자 제제를 보관하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 제제를 탈수시키고 3일 이상의 기간 동안 보관하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제80항에 있어서, 상기 탈수된 리포좀 제제를 운반하고 상기 제제를 또 다른 장소에서 재수화시키는(rehydrating) 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제80항에 있어서, 상기 나노입자는 리포좀인 것인 방법.
제82항에 있어서, 상기 양친매성 물질은 하나 이상의 포스포리피드를 포함하는 것인 방법.
제83항에 있어서,

a. 상기 하나 이상의 포스포리피드는 포스파티딜 콜린, 포스파티딜 글리세롤, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 에탄올아민, 스핑고미엘린 및 이들의 혼합물로부터 선택되고;

b. 상기 하나 이상의 계면 활성제는 디체인 포스포리피드, 리소리피드, 담즙산, 미리스토일 계면 활성제, 팔미토일 계면 활성제, 스테아로일 계면 활성제, 글리세릴 모노올리에이트, 세라마이드, PEG-세라마이드, C18-에테르 연결된 리소포스파티딜 콜린, 폴리에틸렌 글리콜-폴리에틸렌 코폴리머, 블록 코폴리머, 지방산 및 이들의 혼합물로부터 선택되고; 및

c. 상기 하나 이상의 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜, 폴리아크릴로일모르폴린, 폴리-2-에틸-2-옥사졸린, 폴리비닐피롤리돈, 메톡시폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제84항에 있어서, 상기 친수성 폴리머는 가수분해성 결합을 통해 상기 포스포리피드에 결합된 것인 방법.
하나 이상의 포스포리피드, 하나 이상의 계면 활성제 및 하나 이상의 친수성 폴리머를 가지며 상기 포스포리피드가 하나 이상의 포스파티딜 콜린이고; 상기 계면 활성제가 하나 이상의 리소리피드이고; 및 상기 친수성 폴리머가 DSPE-mPEG-2000, DSPE-mPEG-5000 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 리포좀 제제를 보관하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 제제를 탈수시키고 3일 이상 동안 보관하는 단계를 포함하는 것인 방법.
제86항에 있어서, 상기 리포좀 제제를 운반하고 상기 제제를 또 다른 장소에서 수화시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
제87항에 있어서, 상기 포스포리피드는 하나 이상의 포스파티딜 콜린이고; 상기 계면 활성제는 모노팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC), 모노라우릴 포스파티딜콜린(MLPC), 모노미리스토일 포스파티딜콜린(MMPC), 모노스테아로일 포스파티딜콜린(MSPC), 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 하나 이상이고; 및 상기 친수성 폴리머는 DSPE-mPEG-2000 또는 DSPE-mPEG-5000 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제88항에 있어서, 상기 포스포리피드는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)이고; 상기 계면 활성제는 모노팔미토일 포스파티딜콜린(MPPC)이고; 및 상기 친수성 폴리머는 DSPE-mPEG-2000, DSPE-mPEG-5000 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제88항에 있어서, 상기 포스포리피드는 디팔미토일 포스파티딜콜린(DPPC)이고; 상기 계면 활성제는 모노스테아로일 포스파티딜콜린(MSPC)이고; 및 상기 친수성 폴리머는 DSPE-mPEG-2000, DSPE-mPEG-5000 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
제89항에 있어서, 상기 DPPC:MPPC:DSPE-mPEG의 몰 비는 약 90:10:4인 것인 방법.
제90항에 있어서, 상기 DPPC:MSPC:DSPE-mPEG의 몰 비는 약 90:10:4인 것인 방법.
제80항에 있어서, 상기 나노입자 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제82항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제83항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제84항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제86항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제88항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제89항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제90항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제91항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제92항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.
제62항에 있어서, 상기 친수성 폴리머는 비-가수분해성 결합을 통해 상기 포스포리피드에 결합된 것인 방법.
제103항에 있어서, 상기 리포좀 제제는 약리학적 활성제, 향미제, 진단제, 영양제, 유전자 생성물, 및 이들의 혼합물로부터 선택되는 활성제를 더 포함하는 것인 방법.