KR20080044710A

KR20080044710A - 향상된 세포 투과능 및 조직재생 기능을 가지는 비활성폴리펩티드, 및 그 용도

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Publication number: KR20080044710A
Application number: KR1020060114114A
Authority: KR
Inventors: 김정문; 김정국; 김태한; 이종석; 육종인
Original assignee: 김정문; 김태한; 김정국; 이종석
Priority date: 2006-11-17
Filing date: 2006-11-17
Publication date: 2008-05-21

Abstract

본 발명은 향상된 세포 투과능 및 조직재생 기능을 가지는 비활성 폴리펩티드 및 그 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로는, 기존의 PTD, FAD 및 TRD를 함유하는 폴리펩티드(TRPs: tissue regenerative polypeptides)에 세포 투과율을 더 높이는 HA2 도메인(HD)이 결합되어 있는 비활성 폴리펩티드, 그 제조방법 및 용도에 관한 것이다.

본 발명에 따른 폴리펩티드는 재조합 미생물의 배양에 의해 대량생산이 가능하고, 기존의 TRPs에 비하여 세포 투과율이 높아 보다 안정적이고 효율적으로 조직의 형성 또는 재생을 촉진하거나 장기의 섬유화 및 경화를 해소시킬 수 있다.

조직형성, 조직재생, PTD, FAD, TRD, HA2, 비활성 TRP

Description

향상된 세포 투과능 및 조직재생 기능을 가지는 비활성 폴리펩티드, 및 그 용도{Non-activated Polypeptides Having a Function of Tissue Regeneration and Improved Cell Permeability, and Use Thereof}

발명의 분야

배경기술

골 형성 단백질(bone morphogenetic proteins: BMP)은 탈무기질화 조건에서 콜라겐 또는 생분해성 고분자 등과 함께 사용할 경우, 포유류나 영장류에서 골 결손의 치유를 촉진하고, 특히, 골 세포에서 분비되어 인접 세포막의 수용체를 통해 골 형성을 유도하는 것으로 알려져 있다. hBMP는 서로 유사성을 갖는 단백질군으로, 현재까지 hBMP2 내지 hBMP15 등 14가지 이상이 알려져 있으며, hBMP2, 3, 4, 6, 7 및 14는 골 재생을 유도하는 효과를 가지는 것으로 보고되어 있다.

이중, hBMP2는 현재까지 가장 확실한 골 형성 인자 단백질이며, 최근 의학적 효과와 적용에 대해 많은 연구가 진행되고 있다. BMP7은 TGF-β1의 길항작용(antagoist)을 통해 장기의 섬유화를 억제할 뿐만 아니라, 장기 재생을 유도한다고 알려져 있다 (Nature Med ., 9:964, 2003; J. Biol . Chem ., 280:8094, 2005). BMP14(GDF-5, growth/differentiation factor-5: MP-25)는 인체나 포유류 동물에 투입할 경우, 피부의 상처를 효과적으로 치유하게 하는 기능과 위나 십이지장 궤양의 치유를 도와주는 효과가 있는 것으로 알려져 있다 (US 6,764,994; Nature, 368:639, 1994; Exp . Cell Res ., 235:218, 1997; Neurosurg Focus, 13:1, 2002; US 6,531,450). 즉, BMP는 그 용어적 정의와는 달리 뼈나 연골 형성 촉진 기능뿐 아니라, 피부의 재생, 위장 조직의 재생 재활 기능도 가질 수 있으며, 간이나 신장 경화의 경우에는 TGF-β를 길항하여 섬유 조직 형성을 억제하고 정상 조직의 회복을 유도하는 기능도 알려져 있다.

BMP 류를 제조하는 방법으로, 초기에는 비탈회(demineralized)된 동물 골 조직으로부터 자연염(natural salt)을 이용하여 추출하는 방법(US 4,294,753)이 시도되어 왔으나, 효율이 너무 낮고 대량 생산이 불가능한 문제점이 있었다. 1990년대 초반 BMP 유전자로 형질전환된 CHO 세포를 배양하여 활성화된 재조합 hBMP2를 분리·정제하는 방법(Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:2220, 1990)이 개발된 이후, 대량생 산이 가능하게 되었다 (US 4,968,590; 5,106,626; 5,106,748; 5,166,058; 5,187,076; 5,187,623; 5,208,219; 5,258,494; 5,266,683; 5,284,756; 5,399,346; 및 6,593,109).

그러나, 형질전환된 CHO 세포를 이용한 재조합 hBMP2 및 hBMP7의 제조방법은 활성을 가지는 rhBMP2 및 rhBMP7을 수득하기 위하여 대량의 CHO 세포 배양을 필요로 하고, 분리·정제 단계가 복잡하며, 생산단가가 매우 높다는 문제점이 있으며, 분리·정제 과정과 보관, 약제화 처리, 투약 과정 중에서 활성의 감소가 수반되는 공통적인 문제점을 가지고 있다. 이러한 동물세포 배양에 의한 재조합 BMP 류의 제조방법에 대한 단점을 일부 개선하기 위하여, 최근 Biopharm사는 rhBMP14(MP-52)를 재조합 대장균에서 제조하는 방법을 개발하여 그 제조비용을 낮춘 예가 있다 (US 2003/0181378; WO 96/33215). 그러나, 상기 rhBMP14 역시 활성을 가지는 단백질 형태로 분리·정제하는 공정이 복잡하고 불편할 뿐만 아니라, 보관, 취급 및 투약 단계에서 제조된 활성 단백질의 활성 저하 문제는 여전히 해결되지 못하였다.

또한, Biopharm 사와 같이 재조합 대장균 방식을 사용하여 종래와 같이 활성화된 단백질을 생산할 경우, BMP 류의 생화학적 구조에 따라 선택에 제약이 있다. 즉, Biopharm 사의 방식으로 rhBMP14와 같은 구조의 단백질은 제조가 가능하지만, 활성화된 rhBMP2나 rhBMP4, rhBMP7 등과 같은 구조의 BMP 류를 실용적으로 제조하는 것은 곤란할 것으로 예측된다.

상업적으로 유통되며 의학적으로 Spine Fusion 용 등으로 투약되고 있는 rhBMP-2의 경우, 2005년 현재 밀리그램(mg)당 수천 US달러의 높은 가격에 판매되고 있으므로, 세계적으로 수많은 Spine Fusion 시술 필요 환자에게는 물론이며, rhBMP 류가 피부 상처 재생용, 위궤양 재생용, 간경화 해소용 등 다양한 의학적 잠재 효용 가치가 있음에도 불구하고, 높은 비용과 활성 소실에 따른 보관 취급 투약의 불편성 때문에 BMP류의 임상적인 사용이 제한을 받아왔다.

따라서, 당업계에서는 상기 rhBMP 류나 TGF-β 류와 동등 이상의 생의학적 효용성을 가지면서도 종래에 알려진 단백질에 비해 제조비용이 획기적으로 저렴하면서, 분리·정제 단계에서의 비효율적 불편성과 보관, 취급 및 투약 단계에서의 불편성과 활성 저하문제를 근원적으로 해결할 수 있고, 새로운 약리 기전을 가지는 새로운 종류의 생화학 신약 물질의 개발이 절실한 상황이다.

그러나, 기존의 단백질을 효과적으로 세포 및 조직에 전달하는 방법은 여러 가지 기술적 문제를 야기한다. 최근 단백질을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 단백질 형질도입 도메인(protein transduction domain, PTD, Zhou, B.P. et . al., Nature Cell Biol., 6:931, 2004; 미국특허 2006/0222657A1)이 발견됨에 따라 생물학적 활성을 기대할 수 있는 다양한 펩티드의 세포 내 전달이 가능하게 되었다.

PTD로는 TAT(transactivator of transcription), AntHD(초파리 homeoprotein atennapedia transcription protein), VP22(virus protein22) 펩티드 및 mph-1-btm(마우스 전사 억제 인자-1-biomolecule transduction mortif) 등이 있다.

상기 PTD는 자연 상태에서 양이온을 띠는데, 세포막 수용체의 도움 없이 엔도좀(endosome)에 있는 지질 레프트(lipid raft)로 들어가서, 세포 내에서 엔도좀 의 형태인 운반체가 분열됨으로써 세포질로 목적 운반체를 분비한다.

TAT의 경우, TAT 단백질에 존재하는 9개의 염기성 아미노산(RKKRRQRRR)으로 이루어진 부분이 세포막을 통과하는데 있어서 중요한 역할을 하는 것으로 밝혀졌다 (Vives et al., 1997; Futaki et al., 2001; Suzuki et al., 2002; Hakansson et al., 2001; Tyagi et al., 2001; Rusnati et al., 1997).

그러나, TAT(RKKRRQRRR)는 양전하를 갖는 아미노산이 높은 빈도로 존재하기 때문에 투과율이 낮고, TAT-융합 단백질은 자연 상태에서는 세포 내로 운반되지 않고 변성 상태에서 세포 내로 운반된 후, 세포 내에서 단백질의 재폴딩(refolding)이 일어나 활성을 갖게 되므로, TAT-융합 단백질의 안정성 및 세포 내에서의 지속성이 자연 상태에서보다 효율적이지 않다는 문제점이 있을 뿐만 아니라(Schwartze, S.R., et al ., Trends in Cell Biology, 10:290, 2000), 일단 TAT-융합 단백질이 엔도사이토시스(endocytosis)를 통해 세포 내로 들어가면, 세포 내 운반체와 결합된 형태로 남아 있기 때문에 후속 과정으로 일어나는 사이토플라즘(cytoplasm), 핵(necleus) 또는 세포 기관(organelle)으로의 이동이 효율적으로 일어나지 않는다는 문제점이 있다.

AntHD(초파리 homeoprotein atennapedia transcription protein)의 경우, 아미노산 100개 미만 길이의 단백질만 융합할 수 있다는 단점이 있다.

단백질을 세포 내로 효과적으로 전달할 수 있는 또 다른 물질로 세포 투과율을 높일 수 있는 인플루엔자 막 융합 단백질(influenza membrane fusion protein)인 헤마글루티닌2(haemagglutinin2, HA2 domain; Skehel, J.J., et. al., Biochem . Society , Med., 10:310, 2004; Jehangir, S. Wadia, et . al ., Nature Medicine, 10:310, 2004; Loredana Vaccaro, et . al ., Biophysical . J., 88:25, 2005)가 알려져 있다.

인플루엔자의 헤마글루티닌(HA)는 바이러스 외피(viral envelope)의 성분인 글리코프로테인(glycoprotein)의 일종으로, 표적 세포에 바이러스가 부착하도록 하거나, 표적 세포막과 바이러스 외피 막(viral envelope membrane)이 융합하도록 매개하는 역할을 한다. 일반적인 바이러스 감염의 경우, 세포 표면에 부착된 바이러스는 엔도좀으로 들어가서 상대적으로 낮은 pH에 노출된다. 상기와 같은 pH의 변화는 HA의 아미노 말단이 많이 노출되는 형태적인 변화뿐 아니라, 바이러스 외피와 엔도좀 막 사이의 융합을 일으킨다.

HA는 HA1과 HA2의 2개의 폴리펩티드 단편으로 구성되어 있는데, HA1 단편은 시알릭산-결합 부위를 형성하여 숙주 세표 표면에 부착하도록 매개하는 역할을 한다. HA2 단편은 막-스패닝 고정체(membrane-spanning anchor)를 형성하고, 상기 아미노-말단 부위가 융합 반응 메카니즘에서 작용하게 된다.

헤마글루티닌2(haemagglutinin2, HA2 domain)는 하나 이상의 T-헬퍼 세포 인지 부위를 가지지만 B-세포 인지 부위는 가지지 않기 때문에, HA2 도메인에 결합된 항원에 대하여 T-의존성 면역학적 반응을 유발시키지만 그 자체에 대해서는 항체 반응을 유도하지 않는다. HA2 소단위는 바이러스의 지질 외막을 통해 일반적으로 연장된 카르복시 말단 근처의 소수성 아미노산 서열을 포함하기 때문에, 리포좀의 지질 이중층과의 결합을 촉진시켜 세포 내로 단백질을 효과적으로 전달할 수 있는 헬퍼 펩티드로 적당하다.

또한, HA2 도메인과 PTD를 동시에 이용할 경우, 엔도좀(endosome)으로부터 사이토플라즘(cytoplasm), 핵(nucleus) 또는 다른 세포 내 기관으로 폴리펩티드, 단백질 등의 이종 분자(heterologous molecules)를 분비하는 기능이 향상되어 세포 내로의 투과를 촉진하는 것으로 보고되고 있다 (미국특허 2006/0222657A1).

한편, 본 발명자들은 기존의 활성 단백질이 세포 투과 효율이 낮은 문제점을 해결하고, 골 또는 연골 형성 촉진 및 피부 상처 재생, 궤양 치료, 간경화 등 생체 조직재생을 촉진하게 해주며, 새로운 생화학적 구조와 약리 기전을 가지는 폴리펩티드 군을 개발하기 위하여, 세포막 수용체의 도움없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD; 프로프로테인 컨버타제 절단부위를 가지고 상기 프로프로테인 컨버타제에 의해 절단되어 비활성 TRD(tissue regeneration domain)를 세포 내에서 활성화시키는 FAD(furin activation domain); 및 상기 FAD의 프로프로테인 컨버타제 절단에 의해 활성화되어 세포 내에서 조직 성장 또는 형성을 촉진하거나 조직재생을 유도하는 TRD를 함유하는 비활성 폴리펩티드(TRPs)를 개발한 바 있다 (WO 2006/104306 A1).

이에, 본 발명자들은 기존 TRPs의 세포 내 전달 효율을 보다 높이기 위하여 예의 노력한 결과, 상기 TRPs에 HA2 도메인을 결합시킨 경우 기존 TRPs에 비해 세포 내로의 투과율이 다소 개선되는 것을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 주된 목적은 기존의 PTD, FAD 및 TRD를 함유하는 폴리펩티드(TRPs)의 세포 내 투과성을 높이기 위하여, 상기 TRPs에 HA2 도메인을 결합시킨 비활성 폴리펩티드를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 폴리펩티드를 함유하는 골, 연골 등과 같은 조직 형성 또는 재생 촉진용 조성물 및 장기 섬유화 또는 경화 해소용 약학 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 PTD(protein transduction domain), FAD(furin activation domain) 및 TRD(tissue regeneration domain)를 함유하는 폴리펩티드(TRPs: tissue regenerative polypeptides)에 세포 투과율을 높이는 HA2 도메인(HD)이 결합되어 있는 비활성 폴리펩티드를 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 프로프로테인 컨버타제는 퓨린인 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대 PC7, PC5/6A, PC5/6B, PACE4, PC1/3, PC2, PC4 등일 수도 있다.

본 발명에 있어서, 상기 TRD는 골 형성 단백질(bone morphogenetic proteins: BMPs), 변형성 성장인자-β(transforming growth factor-β: TGF-β), β-신경 성장인자(β-nerve growth factor: β-NGF), β-아밀로이드(β-amyloid), ADAMs(a disintergrin and metalloproteinase-likes), 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α: TNF-α), MMPs(matrix metalloproteinases) 및 인슐린-유사 성장인자-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 세포 내에서 조직 성장 또는 형성을 촉진하거나 조직 재생을 유도하는 활성을 나타내는 단백질인 한 그 제한이 없다.

본 발명에 있어서, 상기 PTD는 TAT(transactivator of transcription), AntHD(초파리 homeoprotein atennapedia transcription protein), VP22(virus protein22) 펩티드 및 mph-1-btm(마우스 전사 억제 인자-1-biomolecule transduction mortif)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 국한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, TRD를 코딩하는 DNA의 5' 앞에 FAD를 코딩하는 염기서열, PTD의 염기서열, HA2 도메인(HD)의 염기서열, 태깅(tagging)을 위한 염기서열 및 분리·정제를 위한 4개 이상의 히스티딘(histidine)을 코딩하는 염기서열이 삽입되어 있는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 박테리아를 제공한다.

본 발명은 또한, (a) 상기 형질전환된 박테리아를 배양하여 [HD-PTD-FAD-TRD] 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및 (b) 상기 배양액을 원심분리한 후, 세포 펠렛(cell pellet)에 요소 용액을 가하여 상기 폴리펩티드의 2차원 및 3차원 구조를 제거하거나 1차원 선형 구조로 변형시킨 다음, [HD-PTD-FAD-TRD] 폴리펩티드를 정제하는 단계를 포함하는 비활성 폴리펩티드의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 또한, 상기 비활성 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 형성 또는 재생 촉진용 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 골 또는 연골 형성 촉진용인 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 비활성 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 장기의 섬유화 또는 경화 해소용 조성물을 제공한다.

본 발명에 있어서, 상기 조성물은 변형성 성장인자-β(transforming growth factor-β: TGF-β), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판 방출 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF) 및 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)로 구성된 군에서 선택된 성장인자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 양태는 PTD, FAD 및 TRD를 함유하는 폴리펩티드(TRPs)에 HA2 도메인(HD)이 결합되어 있는 비활성 폴리펩티드에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 기존의 폴리펩티드 TRPs의 세포 내 전달 효율을 높이기 위하여, (a) 세포막 수용체의 도움 없이 세포막을 투과할 수 있게 하는 PTD(protein transduction domain); (b) 프로프로테인 컨버타제 절단부위를 가지고 상기 프로프로테인 컨버타제에 의해 절단되어 비활성 TRD(tissue regeneration domain)를 세포 내에서 활성화시키는 FAD(furin activation domain); 및 (c) 상기 FAD의 프로프로테인 컨버타제 절단에 의해 활성화되어 세포 내에서 조직 성장 또는 형성을 촉진하거나 조직재생을 유도하는 TRD를 함유하는 폴리펩티드(TRPs)에 마이크로피노좀(macropinosome) 또는 엔도좀(endosome)에 의한 생물학적 활성감소를 회피하고, 세포 투과율을 높이는 HA2 도메인(HD)을 결합시킨 경우, 기존 TRPs에 비하 여 세포 내 투과 효율을 높일 수 있다. 세포 내로 투과된 본 발명에 따른 비활성 폴리펩티드는 세포 내에서 활성화된 다음 분비되므로, 조직 성장 촉진 또는 재생 효과를 발휘할 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 FAD로는 다른 BMP류 및 TGF-β류의 프로도메인 등 퓨린과 같은 프로프로테인 컨버타제 절단부위를 가지고 세포 내에서 프로프로테인 컨버타제에 의해 절단되어 TRD를 활성화시킬 수 있는 한, 그 사용에 제한이 없다.

또한, 본 발명에서는 상기 PTD로 TAT(YGRKKRRQRRR)를 사용하였으나, 이에 국한되는 것은 아니다. 예컨대, AntHD(초파리 homeoprotein atennapedia transcription protein)(Joliot et al ., New Biol., 3:1121, 1991; Joliot et al ., Proc . Natl . Acad . Sci . USA , 88:1864, 1991; Le Roux et al., Proc . Natl . Acad. Sci. USA , 90:9120, 1993), VP22 펩티드(Gene Therapy, 8:1, Blackbirch Press, 2001), mph-1-btm(미국특허 2005/0147971) 등과 같은 PTD를 사용할 수도 있다.

본 발명의 다른 양태는 TRD를 코딩하는 DNA의 5' 앞에 FAD를 코딩하는 염기서열, PTD의 염기서열, HA2 도메인의 염기서열, 태깅(tagging)을 위한 염기서열 및 분리·정제를 위한 4개 이상의 히스티딘(histidine)을 코딩하는 염기서열이 삽입되어 있는 재조합벡터 및 상기 재조합벡터로 형질전환된 박테리아에 관한 것이다.

본 발명에서는 우선, HA2 도메인(서열번호 1 또는 서열번호 2)을 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭한 다음, 상기 증폭된 PCR 산물을 기존 TRPs를 제조하기 위하여 제작된 재조합벡터[TRD (hBMP2 또는 hBMP7)를 코딩하는 DNA의 5' 앞에 FAD를 코딩하는 염기서열, PTD의 염기서열, 태깅(tagging)을 위한 염기서열 및 분리·정제 를 위한 4개 이상의 히스티딘(histidine)을 코딩하는 염기서열이 삽입되어 있는 재조합벡터; WO 2006/104306 A1]의 PTD 염기서열 앞에 삽입하여 [HD-PTD-FAD-TRD] 발현용 재조합벡터를 제작하였다.

상기 제작된 재조합벡터를 열 충격(heat shock) 방법으로 대장균 BL21(E. coli BL21; Invitrogen Inc.)에 도입한 후, 배양하여 본 발명에 따른 폴리펩티드를 발현시킨 다음, 상기 발현된 폴리펩티드를 분리·정제하였다. 본 발명에서 형질전환된 대장균은 통상적으로 사용되는 배지에서 배양할 수 있고, 융합 폴리펩티드의 과발현을 유도하기 위하여 IPTG를 첨가하는 것이 바람직하다.

본 발명에서는 형질전환 미생물로 대장균(E. coli)을 사용하였으나, 다른 종류의 박테리아, 효모, 또는 곰팡이를 사용하는 것도 가능하며, 또한 미생물을 이용하지 않고 화학적 방법으로 유효 부위만을 합성하여 사용할 수도 있다.

상기 형질전환 미생물의 배양에 의해 발현된 융합 폴리펩티드는 GST-융합 단백질(GST-fusion protein)이나, 그 외 통상의 단백질 분리·정제 방법을 사용하여 분리할 수 있다. 예컨대, 요소(urea)나 암모늄 설페이트의 농도 구배를 이용하여 단백질의 침전을 유도하고, 이를 투석하여 염(salt)을 제거함으로써 본 발명에 따른 비활성 폴리펩티드를 정제할 수 있다.

본 발명의 또 다른 양태는 상기 비활성 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 형성 또는 재생 촉진용 조성물 및 장기의 섬유화 또는 경화 해소용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 따른 비활성 폴리펩티드는 기존의 TRPs에 비해 세포 투과율이 높 아 의학적인 효율성이 높은 장점을 가지고 있다.

따라서, 본 발명에 따른 비활성 폴리펩티드는 뼈가 정상적으로 형성되지 않은 환경에서 뼈의 성장을 유도하거나, 외부 충격의 골절로 인한 골 손실 및 인공 관절의 고정을 촉진하는 등, 골 질환 치료용으로 유용하다. 구체적인 예로, 선천성, 외상, 또는 종양절제, 두개 안면 기형 등의 치료, 치근막 질병의 치료 등의 치과 치료에 사용되어 골 형성 세포의 분화를 유도하고, 골 형성 세포의 성장을 자극하거나, 골 형성 세포의 분화를 유인하는 환경을 제공한다. 이외에도 본 발명에 따른 폴리펩티드는 신장이나 간과 같은 조직의 섬유화 예방 및 조직 재생을 유도하기 위해 사용될 수 있으며, 신경이나 혈관 재생과 같은 다른 용도로 사용될 수도 있다.

본 발명에 따른 비활성 폴리펩티드는 그 자체를 사용하거나 약제학적으로 허용이 가능한 산부가염 또는 금속 복합체, 예를 들어, 아연, 철 등과 같은 염의 형태로 사용한다. 보다 구체적으로 산부가염은 염화수소, 브롬화수소, 황산염, 인산염, 말레산염, 아세트염, 시트로산염, 벤조산염, 숙신산염, 말린산염, 아스코로브산염, 타르탈산염을 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따른 비활성 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조성물은 통상적인 투여방법, 투여형태 및 치료목적에 따라 상기 유효성분을 약제학적으로 허용가능한 부형제 또는 매트릭스인 담체와 함께 혼합하여 희석하거나, 용기 형태의 담체 내에 봉입시키는 것이 바람직하다. 또한, 다른 골 결함 치료에 유익한 다른 약재와 배합하여 사용할 수 있다. 이때, 목적하는 pH, 등장성, 안정성 등을 갖는 생 리적으로 수용 가능한 단백질 조성물의 제법은 본 발명의 분야에서 따르는 통상적인 기술범위 내에 있는 것을 사용할 수 있다. 본 발명에서 상기 매트릭스는 생물접합성, 생물분해성, 기계적 특성, 미용적 외관 및 접촉 특성에 따라 황산칼슘, 트리칼슘포스페이브, 하드록시아파리트, 폴리락트산, 포릴무수물과 같은 생물 분해성 및 화학적 물질이나; 뼈 또는 피부 콜라겐, 기타 순수 단백질 또는 세포의 매트릭스 성분과 같은 생물 분해성 및 생물학적 물질; 소결된 히드록시아파티트, 바이오글래스, 알루미네이트 또는 기타 세라믹과 같은 비-생물 분해성 및 화학성 물질; 폴리락트산, 히드록시아파티트, 콜라겐 및 트리칼슘포스페이트와 같은 상술한 물질의 배합물을 사용하는 것이 바람직하다. 하지만, 상기 담체로 본 발명이 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서 부형제는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 소르비톨, 만니톨, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 마그네슘 스타아레이트, 폴리비닐피롤리돈 (polyvinylpyrrolidone), 물, 메틸하이드록시벤조에이트 (methylhydroxybenzoate), 프로필하이드록시벤조에이트 (propylhydroxybenzoate), 탈크(talc), 광물유 등을 사용할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 비활성 폴리펩티드를 함유하는 조성물은 뼈 손상 부위에 넣기 위해 점성형으로 주사되거나 캡술화하여 사용하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 조성물의 투여량은 사용되는 부형제나 매트릭스 등의 담체 종류와 환자의 형성된 뼈의 중량, 뼈 손상 부위, 손상된 뼈의 상태, 환자의 나이, 성별 및 다이어트, 감염의심도, 투여시간 및 기타 임상적 요인을 고려하여 조절될 수 있기 때 문에 한정되지 않으나, 통상적으로 공지된 유효량은 뼈 무게를 고려하여 적정량을 연속적 또는 나누어 투여하고 뼈의 성장을 관찰하며 추가 투여를 결정할 수 있다.

이상 상세히 기술한 바와 같이, 본 발명은 기존의 PTD, FAD 및 TRD를 함유하는 폴리펩티드(TRPs)에 비하여 세포 투과율이 개선된 [HD-PTD-FAD-TRD] 형태의 비활성 폴리펩티드를 제공하는 효과가 있다. 본 발명에 따른 폴리펩티드는 재조합 미생물의 배양에 의해 대량생산이 가능하고, 세포 투과율이 높아 생체 내에 투약하였을 경우 조직의 형성 또는 재생을 촉진하거나 장기의 섬유화 및 경화를 해소시키는 기능을 향상시킬 수 있다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

<110> KIM, JUNG MOON KIM, JUNG KOOK KIM, TAE HAN LEE, JONG SUK <120> NON-ACTIVATED POLYPEPTIDES HAVING A FUNCTION OF TISSUE REGENERATION AND IMPROVED CELL PERMEABILITY, AND USE THEREOF <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> HA2 <400> 1 Gly Leu Phe Gly Ala Ile Ala Gly Phe Ile Glu Gly Gly Trp Thr Gly 1 5 10 15 Met Ile Asp Gly 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> HA2 analog <400> 2 Gly Leu Phe Glu Ala Ile Ala Glu Phe Ile Glu Gly Gly Trp Glu Gly 1 5 10 15 Leu Ile Glu Gly 20

Claims

PTD(protein transduction domain), FAD(furin activation domain) 및 TRD(tissue regeneration domain)를 함유하는 폴리펩티드(TRPs: tissue regenerative polypeptides)에 세포 투과율을 높이는 HA2 도메인(HD)이 결합되어 있는 비활성 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 프로프로테인 컨버타제는 퓨린인 것을 특징으로 하는 비활성 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 TRD는 골 형성 단백질(bone morphogenetic proteins: BMPs), 변형성 성장인자-β(transforming growth factor-β: TGF-β), β-신경 성장인자(β-nerve growth factor: β-NGF), β-아밀로이드(β-amyloid), ADAMs(a disintergrin and metalloproteinase-likes), 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α: TNF-α), MMPs(matrix metalloproteinases) 및 인슐린-유사 성장인자-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비활성 폴리펩티드.
제1항에 있어서, 상기 PTD는 TAT(transactivator of transcription), AntHD(초파리 homeoprotein atennapedia transcription protein), VP22(virus protein22), VP22(virus protein22) 펩티드 및 mph-1-btm(마우스 전사 억제 인자-1-biomolecule transduction mortif)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 비활성 폴리펩티드.
TRD를 코딩하는 DNA의 5' 앞에 FAD를 코딩하는 염기서열, PTD의 염기서열, HA2 도메인의 염기서열, 태깅(tagging)을 위한 염기서열 및 분리·정제를 위한 4개 이상의 히스티딘(histidine)을 코딩하는 염기서열이 삽입되어 있는 재조합벡터.
제5항의 재조합벡터로 형질전환된 박테리아.
(a) 제6항의 형질전환된 박테리아를 배양하여 [HD-PTD-FAD-TRD] 폴리펩티드를 발현시키는 단계; 및 (b) 상기 배양액을 원심분리한 후, 세포 펠렛(cell pellet)에 요소용액을 가하여 상기 폴리펩티드의 2차원 및 3차원 구조를 제거하거나 1차원 선형 구조로 변형시킨 다음, [HD-PTD-FAD-TRD] 폴리펩티드를 정제하는 단 계를 포함하는 비활성 폴리펩티드의 제조방법.
제7항에 있어서, 상기 TRD는 골 형성 단백질(bone morphogenetic proteins: BMPs), 변형성 성장인자-β(transforming growth factor-β: TGF-β), β-신경 성장인자(β-nerve growth factor: β-NGF), β-아밀로이드(β-amyloid), ADAMs(a disintergrin and metalloproteinase-likes), 종양 괴사 인자-α(tumor necrosis factor-α: TNF-α), MMPs(matrix metalloproteinases) 및 인슐린-유사 성장인자-1(insulin-like growth factor-1, IGF-1)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서, 상기 PTD는 TAT(transactivator of transcription), AntHD(초파리 homeoprotein atennapedia transcription protein), VP22(virus protein22) 펩티드 및 mph-1-btm(마우스 전사 억제 인자-1-biomolecule transduction mortif)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 비활성 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 조직 형성 또는 재생 촉진용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 조성물은 골 또는 연골 형성 촉진용인 것을 특징으로 하는 조성물.
제10항에 있어서, 변형성 성장인자-β(transforming growth factor-β: TGF-β), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판 방출 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF) 및 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)로 구성된 군에서 선택된 성장인자를 추가로 함유하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 비활성 폴리펩티드를 유효성분으로 함유하는 장기의 섬유화 또는 경화 해소용 조성물.
제13항에 있어서, 변형성 성장인자-β(transforming growth factor-β: TGF-β), 인슐린-유사 성장인자(insulin-like growth factor, IGF), 혈소판 방출 성장인자(platelet-derived growth factor, PDGF) 및 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor, FGF)로 구성된 군에서 선택된 성장인자를 추가로 함유하는 것을 특 징으로 하는 조성물.