KR20080043342A - 소수성 친화 크로마토그래피에 따른 염소화 당 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 염소화 당, 그의 전구물질 및 유도체, 특히 염소화 반응 혼합물에서 직접 유도된 트리클로로갈락토수크로스(TGS)를 함유하는 염소화 당 화합물을, 흡착제 상에서 및 하나 이상의 상기 염소화 당 화합물에 대한 특이적 및 선별적 친화성을 제공할 소정의 조건하에서, 컬럼 크로마토그래피를 통해 선별적 포획, 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 또한 상기 에스테르를 탈착제로 처리하는 한편 흡착제에 흡착된 염소화 당 에스테르의 탈에스테르화 반응을 포함한다. 이 방법은 또한 TGS의 농축 및 결정화에 대한 새로운 접근도 포함한다. TGS를 포함한 염소화 당 유도체는 분리 처리에 따라 실질적으로 대부분의 불순물, 염류 및 유기 용매를 포함하지 않는다. 본 발명의 방법은 TGS를 포함한 원하는 염소화 당 유도체에 관련하여 95% 이상의 높은 회수율을 갖는다.

Description

소수성 친화 크로마토그래피에 따른 염소화 당 제조방법 {PROCESS FOR PRODUCTION OF CHLORINATED SUCROSE BASED ON HYDROPHOBIC AFFINITY CHROMATOGRAPHY}

본 발명은 1-6-디클로로-1-6-디데옥시-β-프룩토푸라나실-4-클로로-4-데옥시-갈락토피라노사이드(TGS)를 포함한 염소화 당 화합물, 그의 중간체나 유도체를 함유하는 용액이나 반응 혼합물로부터 친화성 및/또는 소수성 흡착 크로마토그래피를 통해 상기 TGS 산물 또는 그의 중간체나 유도체를 정제하는 새로운 방법 또는 방식에 관한 것이다.

4,1',6' 트리클로로갈락토수크로스(TGS) 제조에 관한 종래 기술은 우선적으로, 인 옥시염화물, 염화옥살릴, 5염화인 등의 각종 염소화제 및 디메틸 포름아미드(DMF)나 디메틸 아세타미드 등의 3차 아미드로부터 유래된 빌스마이어 하크 (Vilsmeier-Haack) 시약을 이용하여 수크로스-6-에스테르를 염소화 처리하여 6-아세틸-4,1',6'-트리클로로갈락토수크로스를 형성하는 염소화 반응을 수반한다. 상기 염소화 반응 뒤에, 반응물은 적절한 칼슘, 나트륨 등의 적절한 알칼리 수산화물을 사용하여 pH 7.0 내지 7.5로 중화 처리함으로써 상기 6-아세틸-4,1',6'-트리클로로갈락토수크로스를 탈에스테르화 및/또는 탈아세틸화 하여 4,1',6'-트리클로로갈락 토수크로스(TGS)를 제조하였다.

염소화 반응법에 따른 상술한 TGS 제조방법 이외에도 다양한 TGS 제조방법이 공지되어 있으며, 이들 각각은 사용 방식에 따라 조성이 변화하는 것으로서 하나 이상의 TGS, 그의 중간물 및 유도체, 미반응 원료, 염류, 촉매 및 반응에 수반되는 기타의 반응물을 함유하는 공정 흐름을 제조한다. 이러한 공지 방법들은 공통적으로, 디메틸포름아미드(DMF) 같이 제거하기 곤란한 구성분을 제거하고, 또한 밀접한 관련이 있는 유기 및 무기 불순물로부터 TGS, TGS 전구물질, TGS 유도체 등으로 구성된 군에서 개별 선택되는 반응 혼합물 중의 하나 이상의 구성분을 분리할 수 있는 산업적 규모의 편리한 방법이 요구된다는 문제를 안고 있다.

수증기 증류법, 컬럼 크로마토그래피, 역상 삼투압 처리, 기계교반식 박막 건조법 등을 포함한 다양한 3차 아미드 제거 방법이 공지되어 있다. 또한, 추출 정제법, 실리카겔 컬럼 크로마토그래피, 결정화법 등의 처리조작에 따라 염소화 당 유도체 분리를 달성할 수 있다.

본 발명은 조작이 용이하며 규모를 확대할 수 있고 또한 불순물 제거 및 원하는 염소화 당 산물의 분리를 달성함에 있어서 효율적인 소수성 친화 크로마토그래피법을 포함한 컬럼 크로마토그래피에 기초한 신규의 방법을 제공한다.

TGS 제조 공정의 여러 단계에서 반응 혼합물로부터 물을 제거할 필요가 있으나 상술한 바와 같은 종래의 방법들은 수분 제거가 번거롭다. 그러므로 수분 제거 및 염소화 당 유도체의 농축을 위한 새로운 방법의 개발이 요구되며 본 발명은 이점에 착안한 것이다.

3차 아미드 용매의 제거, TGS, 방호 또는 부분 방호 TGS 전구물질의 정제에 관하여 또한 수증기 증류, 컬럼 크로마토그래피, 역상 삼투법, 기계교반식 박막 건조법 등과 같은 사용 방식에 관하여 다수의 방법이 이미 공지되어 있다. 이에 의해 수득된 부분 정제 혼합물은 추출 정제법, 실리카겔 크로마토그래피, 결정화법 등과 같은 조작법을 통해 추가로 정제된다,

종래의 방법은 TGS 산물 및, 탈아세틸화 반응 혼합물로부터 얻은 기타의 염소화 당은, 흡착제로 실리카겔을 이용하고 또한 탈착제로서 고극성 용리액을 이용하는 컬럼 크로마토그래피에 따라 정제하는데 응용되고 있다. 실리카겔 상의 박막 크로마토그래피는 TGS나 그의 유도체를 검출하는 널리 알려진 대중적인 방법이다. 반응 혼합물로부터 성분을 분리하기 위한 컬럼 그로마토그래피와 특히, 탈아세탈화된 반응 혼합물로부터 TGS를 정제하기 위한 극성 향상 용매 및 흡착제로 실리카겔를 사용하는 것도 오래전부터 공지되어 있으며 이에 관한 특허가 다수 보고되었다.

예를 들어, Mufti, et al. (1983)의 미국 특허 제4,380,476호는 "또한, 본 발명에 따른 방법의 성취는, TGS 자체를 탈아세틸화된 염소화 당 유도체 혼합물로부터 큰 어려움 없이 분리할 수 있다는 사실에 일부 근거한다. 실리카겔 상의 크로마토그래피로 TGS를 비교적 간단히 분리한다. 예를 들어, 극성 증대된 용리제로 탈아세틸화된 혼합물을 용리하면 우선적으로 극성이 작은 부산물과 그 뒤로 TGS가 제거되며 극성이 큰 화합물만 바닥에 남게 된다. 클로로포름과 아세톤의 혼합물은 특히, 1:1 용리제 내에서 TGS를 분리함에 있어서 2:1 혼합물이 가장 효과적이며 1:1 혼합물은 그 차선책이다. 탈아세틸화 반응후 크로마토그래피 처리가 바람직하나 TGS 6-아실레이트의 크로마토그래피 분리도 또한 가능하다." 라고 개시하고 있다. 이러한 개시 내용의 구체예는 상기 특허의 실시예 1 내지 3에서 상세히 기술되어 있다.

Khan, et al. (1992)의 미국 특허 제5,136,031호에서 실시예 3은 피리딘에 용해된 수크로스 6,4'-디아세테이트 용액을 1차로 0℃에서 0.5시간 및 2차로 95℃에서 4시간 동안 1,1,2-트리클로로에탄에 용해된 염화티오닐로 처리하는 것을 설명하였다. 이 반응 혼합물은 염화메틸렌으로 희석한 후 차가운 수성 탄산나트륨으로 세척한 뒤 다시 물로 세척했다. 유기층을 건조한 뒤 (Na₂SO₄) 톨루엔으로 공증류(co-distillation)하여 농축하고 실온에서 4시간 동안 메탄올에 용해된 1M 메톡시화 나트륨(pH10.0)으로 처리했다. T.I.C (아세트산에틸: 아세톤: 물, 8:6:1)는 주 생성물로 수크랄로스를 노출시키며 이 생성물을 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 ¹H-NMR 분광법으로 특성화했다.

Dordick, et al. (1992)의 미국 특허 제5,128,248호에서는 "6-모노- 및 6,4'-디아실레이트의 혼합물이 결과로서 형성된다. 두가지 아실레이트은 필요시 실리카겔 컬럼 상의 크로마토그래피를 통해 분리할 수 있다." 라고 개시되어 있다. 실시예 6에서는 수크로스 6,4'-디아세테이트를 수크랄로스로 전환하는 방법을 구체적으로 설명하고 있으며 상기 수크랄로스는 탈아세틸화 반응 혼합물로부터 얻은 주 생성물로서, 실리카겔 크로마토그래피로 정제하고 ¹H-NMR 분광법으로 특성화했다.

Walkup et al. (1990)의 미국 특허 제4,980,463호에서는 당이나 그 유도체의 염소화 반응에서 얻은 염소화 산물을 통상적으로 크로마토그래피법 또는 유도처리로 정제 및 분리하여 과아세틸화 반응(peracetylation)을 통해 고결정성 고체 산물을 형성하는 것에 대해 개시하고 있다. 그러나 이 특허는 상기 방법에 이용되는 크로마토그래피법 및 흡착제 매질의 구체적인 종류에 대해서는 언급하지 않았다.

미국 특허 제4,343,934호는 고체 TGS의 실리카겔 크로마토그래피 처리와 이온교환 수지 앰버라이트 IRA 35 및 IRC 72의 조합물을 이용한 반응 혼합물의 탈이온화 처리를 거친 뒤 수용액으로부터 TGS를 결정화하는 방법에 관한 것이다. 상기 처리 과정의 후속으로 남아있는 모액을 가열, 농축, 종자 결정 첨가 및 냉각하는 과정을 2회 반복한다. 추가로 결정화를 3회 반복함으로써, 수크로스 펜타아세테이트 탈아세틸화 처리로 얻은 시럽에서 수득한 TGS의 회수율은 76.6%에 달한다. 상기 특허에 이용된 이온교환 흡착제 수지는 특히 TGS에 국한되지 않고 가용성 이온들을 흡수함으로써 반응 혼합물의 탈이온화에 이용되었다는 점에 주목한다.

Jenner et al. (1982)의 미국 특허 제4,362,869호에서는 트리클로리네이트 에스테르의 분리를 위한 컬럼 크로마토그래피에 대해 개시하였다. 특히 반응 혼합물은 이것을 물에 붓고 디클로로메탄 같은 유기 용매로 추출함으로써 편리하게 처리할 수 있다고 소개하였다. 산 및 염기로 세척한 추출물을 건조 및 증발시켜 산물을 수득하고 이것을 실리카겔 등을 이용한 크로마토그래피로 후속 정제함으로써, 2,3,6,3',4'-펜타-O-아세틸수크로스의 초기 함량에 대해 약 80%에 해당하는 트리-클로리네이트 에스테르의 수율을 달성할 수 있다. 크로마토그래피는 또한 상기 특허의 실시예 8에서 TGS 펜타아세테이트의 분리에 이용되었으며, 구체적으로 "이 시 럽을 디에틸에테르/40°- 60° 석유에테르(4:1)로 용출시키는 실리카겔 컬럼에서 크로마토그래피 처리함으로써 TGS 펜타아세테이트 (1.2g 78%)를 수득하였고, 이것을 에탄올로 결정화 처리하면 참시료와 동일한 것으로 확인되었다" 라고 개시하고 있다.

미국 특허 제4,405,654호는 각종 할로수크로스(halosucrose) 유도체를 합성하는 경로를 개시한다. 화합물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 분리한다. 이 특허는 또한 중화 반응 및 탈이온화를 위한 이온성 수지의 용도에 대해서도 설명한다.

Rathbone et al ., (1989)의 미국 특허 제4,826,962호 " 테트라클로로라피노스 및 수크랄로스 제조에서의 이들의 용도" 에서는 크로마토그래피법의 용도에 대해 개시하며 구체적으로, "수크랄로스 산물의 분리는 적절한 단계 예를 들어, 증발 및 유기 용매 추출, 크로마토그래피법, 또는 수성 혹은 비수성계로부터의 선별적 결정화 등을 거쳐 달성할 수 있다" 고 기술하였다. 상기 특허의 실시예 4는 "산물을 그로마토그래피로 분리했으며 수크랄로스와 함께 6-클로로갈락토스와 TCR의 존재를 검출하였다" 라고 기술하였다. 그러나 상기 특허는 크로마토그래피법 및 사용되는 흡착제 매질의 종류에 대해 구체적으로 언급하지 않았다.

미국 특허 제4,980,463호는 추출, 결정화 및 재결정화를 포함하는 TGS-6-벤조에이트 정제방법을 개시한다. 이 에스테르는 다시 H⁺ 형 이온교환수지 앰버라이트 IRC-50를 이용하여 알칼리 가수분해 및 중화처리한다. 또한 추출 및 1차 결정화를 단일 단계로 통합한 추출 결정화법을 개시한다.

종래의 방법은 또한 반응 혼합물로부터 TGS-6-아세테이트의 분리 및 정제에 응용되고 있다. 이들은 이온교환수지 또는 크로마토그래피용 실리카겔을 이용했다. 따라서, Mufti et al. (1983)의 미국특허 제4,380,476호의 특허청구항 1, 8, 9, 10 및 14는 상기 특허의 상세한 설명에 언급된 내용, 구체적으로 "탈아세틸화후 크로마토그래피 처리가 바람직하나 TGS 6-아세틸레이트의 크로마토그래피 분리도 또한 가능하다" 라는 내용에 근거하여, 반응 혼합물/염소화 당류를 생성하는 염소화 처리 공정의 공정 흐름으로부터 TGS-아세테이트을 직접적으로 분리 및 정제하는 방법은 컬럼 크로마토그래피를 이용하는 것이 선행 기술로부터 예견되며, 이러한 목적의 흡착제는 실리카겔 또는 이온교환수지 크로마토그래피 혹은 양측 모두에 이용되었고, 또한 실행 원리는 크로마토그래피 처리 대상 용액에 존재하는 분자들의 친수성 및 소수성 차이에 근거한 비-특이적 흡착/탈착 공정이라는 점을 명확히 하고 있다.

미국 특허 제5,128,248호는 중간물 분리 및 TGS 정제를 위한 실리카겔의 용도에 대해 개시하고 있다.

미국 특허 제5,298,611호는 TGS 함유 반응 혼합물로부터 DMF 제거를 위한 수증기 탈거(stripping) 공정을 개시하고 있다.

미국 특허 제5,498,709호는 TGS-아세테이트가 DMF 제거 전 또는 후에 탈아세틸화 처리되고 TGS는 추출 회수 및 결정화 처리에 따라 정제하는 방법을 개시하고 있다.

미국 특허 제5,530,106호는 TGS-아세테이트 함유 액상 혼합물로부터 수증기 증류 또는 수증기 탈거에 의한 디메틸 포름아미드(DMF)의 제거 및, 후속으로 TGS-아세테이트 추출 및 반복적 결정화를 통해 순수한 TGS-아세테이트를 수득하는 것에 대해 개시한다. 상기 수득된 산물은 다시 재결정화, 가수분해, 앰버라이트 IRC-50 이온교환수지 통과후 농축, 추출 및 마지막으로 결정화 단계를 거쳐 순수한 TGS를 생성한다.

Catani, et al. (1999)의 미국 특허 제5,977,349호는 "염소화 당의 크로마토그래피 정제방법"을 발명의 명칭으로 하며, 흡착제인 4% 디비닐벤젠 과 가교결합되고 탈착제로서 물을 사용한 폴리스티렌계 술폰산나트륨 수지를 개시한다. 용리 순서는: 염 > Di > 6,6' > 수크랄로스 > 6,1',6 > 4,6,6' > Tet 로 나타났다. 상기 특허의 분리 방법은 다공성 겔형 술폰산 나트륨계의 양이온 교환수지 및 실리카겔을 각각의 탈착제로서 물 및 유기 용매와 함께 사용하는 것이다. 또한 이 특허는 방사형 유동 또는 환형 크로마토그래피, 예를 들어, 연속식 환형 크로마토그래피 (CAC) 또는 모사이동층(simulated moving bed: SMB) 크로마토그래피에서 고정층을 사용하는 것을 기술한다. 또한 수크랄로스-6-아세테이트를 위한 가수분해 및 역상 크로마토그래피에 앞서서 방사형 처리과정으로 에스테르화 반응 혼합물을 정제하는 것도 가능하다고 기술하였다. 다공성 겔형 양이온 교환수지의 경우, 이 특허는 2 내지 6%의 디비닐벤젠 (DVB)을 흡착제로 사용하는 방법을 개시한다.

Catani et al. (2006)의 미국 특허 제7,049,435호는 공정 흐름으로부터 TGS를 추출 정제하는 방법을 개시한다. 염소화 당 유도체를 액상 추출법으로 정제하는 방법은 물 및 유기 용매를 이용하는 추출 및 역추출의 반복 과정을 필요로 한다. 다수회의 추출 및 역추출 조작은 TGS 같은 염소화 당 유도체의 미미한 수용해도 탓에 전체 공정 수율을 감소시킨다. 또한 추출 공정에 이용되는 용매는 다량의 수분을 함유하므로 이 또한 결정화 단계에서 수율을 낮춘다.

크로마토그래피 공정 또는 기타의 정제 방법을 통해 수득한 염소화 당 유도체의 수용액은 결정화 단계에서 물을 제거해야 한다. 이 과정은 대체로, TGS를 포함한 염소화 당 유도체를 유기 용액 속에서 액-액 추출하거나 또는 증류처리함으로써 이루어진다. 산물로부터 물을 제거하기 위한 증류처리는 시간과 에너지 소모가 큰 조작이며 고온에서 장시간 노출하므로 산물의 품질에도 악영향을 미친다.

이 밖에도, TGS 같은 히드록실기 보호된 염소화 당은 히드록실기 보호된 TGS가 낮은 수용해도를 갖기 때문에 추출에 의해 양호한 수율로 정제될 수 있다. 히드록실기 보호된 TGS는 화학적 또는 효소적 가수분해를 통해 TGS를 생성한다. 전형적인 화학 공정에 따라 염과 부산물이 생성되며, 이들로부터 추출 또는 크로마토그래피를 통해 TGS를 포함한 염소화 당 유도체를 정제하는 것이 요구된다. 다른 한편, 효소법은 가수분해에 물을 필요로 한다. 이들 두가지 가수분해법은 모두 물을 제거해야 하며 따라서 상술한 바와 같은 문제점은 여전히 남아있다.

분리 방법으로서 크로마토그래피를 이용하는 선행 특허 발명들은 어느 것도 비이온성 고분자 수지를 사용하지 않았다는 사실에 주목한다.

공지 기술에 따른 컬럼 크로마토그래피법에서는, 폴리스티렌이나 디비닐벤젠과 가교된 폴리스티렌 등에 기초한 이온교환수지 및 통상의 실리카겔을 흡착제로 사용하며 이들 방법은 모두 용리제와 이온성 및/또는 극성 흡착제를 이용한 친수성 또는 소수성 상호반응에 관련한 분자간 차이를 기본 원리로 한다. 구조적으로 아주 유사한 분자 종류끼리는 상기와 같은 차이가 미미한 것이 보통이며 그 결과 이들의 용리 곡선이 거의 중복된다. 두가지의 서로 밀접하게 관련된 분자들은 고수율로 깨끗이 분리하기가 어려운 경우가 종종 있으며 대부분은 혼합물 형태로 용리제에 혼입되는 것이 보통이다. 두종류의 용매가 부분적으로 혼화되어 있으므로 분자들을 분리하기 적절치 않다는 문제 이외에도 서로 밀접한 관계의 분자들은 용매추출법으로 분리하기 적합하지 않다는 문제 때문에 반복 추출 및 이로 인한 다량의 용매가 요구되고 또한 이를 회수하기 위해 큰 에너지가 소모된다.

DMF는 비교적 높은 비등점의 용매이므로 다량 사용시, 수증기 증류 또는 수증기 탈거에 의한 DMF 제거시 에너지 소모가 크다. 또한, 수증기 증류는 산물을 열화시킬 우려가 있어 TGS 정제가 더욱 곤란하고 수율 및 순도가 저하되는 결과를 가져온다.

또한 TGS를 형성하기 위해 DMF의 존재하에 알칼리를 이용하여 TGS-아세테이트 함유의 반응물을 가수분해하는 종래의 방법, 특히 염소화 처리 공정을 수반하는 방법에 있어서 상기 알칼리는 고가의 용매 DMF를 급속 분해하기 때문에, TGS 산물 단위 중량당 막대한 비용이 추가된다.

공지 방법은 산물의 회수율은 물론 공정 효율 및 품질의 개선에 있어서도 개발의 여지가 크다.

본 발명은 TGS 제조공정에서 수득된 공정 흐름으로부터, 동일하거나 상이한 컬럼에서 연속적으로 및 동일하거나 상이한 흡착제를 이용하여 DMF 및 무기 불순물의 제거, TGS-아세테이트 등의 TGS-에스테르 및 TGS-아릴레이트의 분리, 컬럼 자체에 축적된 상기 TGS-에스테르의 탈에스테르 처리, 또한 TGS의 분리 및 탈수처리를 달성하는 것을 특징으로 하는, 소수성 친화 컬럼 크로마토그래피에 기초한 매우 간단한 신규의 컬럼 크로마토그래피법을 구현한다.

본 발명에 따른 컬럼 크로마토그래피법의 또다른 구현은, 희석액으로부터 목적하는 분자 산물을 5% 이하의 수분 함량을 갖는 조성물로 농축하는 방법을 포함한다.

본 발명의 또다른 구현은 흡착제를 다수회 재생함으로써 비용 효율과 함께 공정 효율의 향상을 가져오는 방법을 포함한다.

친화성 크로마토그래피는 혼합물의 기타 구성분 중 일부에서 목적 분자에 대한 친화성 등과 같이 상호반응력의 정도를 표현할 수 있는 흡착제를 사용하는 것을 포함한다. 본 발명에서 사용되는 흡착제는 일반적으로 천연, 합성 및 반합성 공급원으로부터 얻은 유기 고분자로 제작된 경질의 혹은 겔형 다공성 흡착제이다. 흡착제 수지는 또한 2 내지 18개의 직쇄나 분지쇄 탄소 원자(C2 - C18)를 함유하는 분자들, 또는 흡착제 표면에 침착 혹은 그래프트된 방향족 소수성 분자들을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법은 적절한 변형이나 수정이 가해진 할로겐화 당류에 모두 적용되나 본 발명의 상세한 설명에 포함된 예시적인 구현예는 TGS 제조방법에서 생성되는 공정 흐름에 적용되는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법에 관한 한가지 구현예는, 염소화 당 유도체와 선택된 흡착제 간의 적절한 상호반응을 위한 조건 하에서, 원하는 염소화 당 유도체에 대한 선택도를 나타내는 다공성 고분자 흡착 매트릭스 상에서의 흡착 크로마토그래피에 따라 TGS를 포함한 염소화 당 유도체를 포획, 분리 및 정제하는 방법에 관한 것이다.

상기 구현예는 중화된 염소화 반응물로부터 TGS 및/또는 보호되거나 부분적으로 탈보호된 TGS를 포획 및 정제하는 방법을 제공하며, 상기의 방법은:

(a) pH 조정된 염소화 반응물을 평형화된 경질의 다공성 흡착제 매트릭스와 접촉시켜 상기 염소화 유도체가 상기 매트릭스에 흡착되도록 하고;

(b) 상기 흡착된 매트릭스를 세척하여 DMF 및 염류를 포함한 흡착되지 않은 반응물 성분들을 제거하고;

(c) 적절한 용리 이동상을 이용하여 상기 매트릭스에서 염소화된 유도체를 점진적으로 및/또는 선별적으로 용리하고; 및

(d) 상기 흡착 매트릭스를 재생하여 재사용하는 단계들을 포함한다.

상기 방법은 DMF 및 염류의 동시제거와 함께 염소화 당 (TGS 함유)이나 그 유도체 (TGS-아세테이트, TGS-벤조에이트 등을 포함하는)의 포획과 정제를 실행하고 DMF 및 염류가 제거된 산물을 제조한다. 용리된 염소화 당이나 그 유도체는 제2 컬럼에서 유사하거나 다른 흡착제로 연마 정제(polishing)하여 미량으로 함유된 대부분의 다른 불순물을 제거함으로써, 실질적으로 불순물이 없는 TGS, TGS-아세테이트 또는 TGS-벤조에이트 등의 산물을 결과로써 수득한다. 상기 방법은 결정화 단계에서 고수율 및 순도의 산물을 제공한다. 또한, 선행 기술에서 언급한 통상의 결정화 방법에서 실해하는 모액 재활용처리가 불필요하다. 따라서, 본 발명의 방법은 전체적으로 간단하고 경제적이며 대규모로 수행 가능하고, 또한 염소화 당이나 그 유도체의 정제를 위한 별도의 단계를 요구하지 않는다.

크로마토그래피 컬럼 상에서 TGS-아세테이트의 현장 탈아실화 또는 TGS-벤조에이트의 탈벤조일화를 수반하는 본 발명의 구현예는 히드록실기 보호된 염소화 당 유도체의 포획과 가수분해를 포함하는 것으로서, 3차 아미드 용매 및 유기와 무기염류를 제거하고 또한 당이나 그 유도체의 염소화 반응으로부터 얻은 pH 조정된 반응 혼합물(이후 "염소화 반응 혼합물" 이라 한다)로부터 상기 염소화 당 유도체를, 추후 공지 방법에 따라 정제될 수 있는 부분 정제된 형태로서 회수하는 개선된 일체형 흡착 크로마토그래피법을 제공한다. 본 발명은:

(e) pH 조정된 염소화 반응물을 사전평형화된 흡착제 매트릭스와 접촉시켜 6-O 위치 히드록실기 보호된 염소화 당 유도체 및 기타의 염소화 당 유도체가 흡착제에 흡착되도록 하고;

(f) 상기 흡착제 매트릭스를 세척하여 DMF 및 염류를 포함하는 미흡착 화합물을 제거하고;

(g) 적절히 제형화된 재생/용리 이동상을 이용하여, 염소화 당 유도체의 가수분해와 점진적 및/또는 선별적 탈착을 동시 수행함으로써 TGS를 포함한 탈보호된 염소화 당 유도체를 회수하고; 및

(h) 재사용을 위해 흡착제 매트릭스를 세척 및 평형화하는 단계들을 포함하는, 단일 흡착 크로마토그래피 단계의 이용방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 회분식 접촉기 (교반 탱크 등), 충전층 크로마토그래피 컬럼, 팽창층 컬럼, 유동층 컬럼, 액-고 순환형 유동층 (LSCFB), 이동층 또는 막투과 크로마토그래피계 (중공 섬유, 나선체 또는 시트상), 원심분리형 크로마토그래피계 또는 이들의 조합체 중에서 선택될 수 있는 장비에서 다단계로 수행되는 신규의 방법이다. 상기 장비의 조합은 예를 들어, 팽창층과 충전층, 유동층과 충전층 등이 있으며 상기의 방법의 능력을 향상시킬 수 있다.

본 발명의 방법은 또한 염소화 또는 비염소화 당 유도체에 함유된 6-O-보호된 기를 제외한 히드록실기의 탈보호에 바람직하다. 히드록실기 보호는 예를 들어, 디에스테르, 트리에스테르, 테트라에스테르 또는 펜타에스테르 같이 하나 이상의 히드록실 부분을 대상으로 할 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 한 구현예에서, 정제되거나 부분 정제된 염소화 당 유도체의 수용액 또는 수성-유기 용액의 수분 함량이 5부피% (v/v) 이하가 되도록 수분을 제거한다. 또한 상기 방법은 TGS 같은 염소화 당 유도체의 희석액으로부터 얻은 산물의 농도가 5중량% (w/v) 이상이 될 때까지 행하고, 유기용매 내에서 상기 용액을 수득한다. 본 발명에서 이용되는 용매나 용매의 조합물은 필수불가결은 아니지만 대부분 물과 함께 공비물을 형성하고 따라서 증류나 증발 과정에서 잔류하는 물을 완전히 제거하는데 도움을 준다. 사용되는 용매는 물을 함유하는 이들 공비물이 저온에서 비등하여 신속히 증류할 수 있도록 하기 위한 것이다.

농축된 염소화 당 유도체의 결정화는 99% 이상의 HPLC 순도를 가진 산물의 90% 이상을 분리하기 위하여 수행된다. 상기 결정화는 단일 용매 또는 용매의 조합물을 이용하여 수행하며 이 용매 내에서 염소화 당 유도체가 낮은 용해도 또는 부분 용해도를 갖는다.

상기 구현예에서, 본 발명의 방법은 다공성 흡착제 매트릭스를 이용하는 크로마토그래피법에 따라 염소화 당 유도체의 포획, 수분 제거, 및 정제되거나 부분 정제된 염소화 당 유도체 함유 수용액 또는 수성-유기 용액의 농축 과정을 포함하며, 상기 방법은:

(i) 정제되거나 부분 정제된 염소화 당 유도체 함유 용액은 사전평형화된 비이온형, 이온형 또는 혼합형 흡착제 매트릭스와 접촉하여 상기 염소화 유도체가 상기 매트릭스에 접착되게 하고;

(j) 정치된 흡착층 내에서 공기 또는 무반응 기체를 이용하여 상기 흡착된 매트릭스를 배출 및/또는 일소하여 유리수나 수분 함유 용매를 제거하고;

(k) 탈수된 용매 또는 상기 용매의 조합물을 이용하여 매트릭스로부터 상기 염소화 당 유도체를 용리하고; 또한

(l) 후속 사이클에 재사용할 수 있도록 상기 흡착제 매트릭스를 재생 및 재평형화하는 단계들을 포함한다.

TGS를 포함한 염소화 당 유도체를 흡착처리한 후, 바람직하게는 충전층에 이용된 상기 흡착제 매트릭스를 정치, 배출 및 공기나 질소 등의 무반응 기체로 일소함으로써 상기 정치된 흡착층 공극에 갇힌 유리수나 수분 함유 용매를 제거할 수 있다. 흡착물은 칼 피셔(Karl fisher)법으로 분석시 수분 함량이 5부피% (v/v) 이하인 농축물 형태로서 적절한 단일 용매 혹은 용매 혼합물 내에서 흡착 매트릭스로부터 용리된다. 상기 농축 용리액 또는 탈착 용액은 다시 30 내지 60℃에서 감압하에 증류 또는 증발처리 후 용매로부터 결정화된다. 본 발명의 방법은 농축 및 수분의 완전 제거를 통해 결정화 후의 수율을 개선했다.

종래의 기술에서는 임의의 흡착 크로마토그래피 기술을 이용하여 염소화 당 유도체를 포획, 수분 제거 및 생성물을 농축하는 방법을 개시한 적이 없다. 또한, 종래의 기술은 본 발명에 따라 수득된 염소화 당 유도체의 결정화 수율보다 높은 수율을 달성하지 못한다.

도 1은 실시예 6에서와 같이 본 발명의 방법에 있어서, 매트릭스 용량(gm/리터), TGS 회수율(%) 및 DMF 회수율(%)에 관하여, 세파비드(SEPABEADS) SP700 (미츠비시 화학, 일본)을 이용한 정제 실험에 따른 성능 비교의 결과를 도시한다.

보호 및/또는 탈보호된 TGS 또는 관련 성분 이외에, TGS 제조를 위한 통상의 반응 혼합물은 당의 모노, 디, 트리 및 테트라-클로로 유도체, 이량체 또는 다량체 불순물, 고비등점 용매, 또한 염소화 단계후 중화 및 가수분해 과정에서 생성된 염화물, 인산염, 아세트산염, 벤조산염 등의 염류를 함유한다. 특히, 이러한 불순물은 함께 뒤섞인 복합 흐름 처리문제를 안고 있으며 TGS 제작 공정의 비용에 심각한 영향을 미칠 수 있다. 본 발명의 컬럼 크로마토그래피법의 처리 대상인 반응 혼합물은 추후에 효소적 탈아실화 반응의 대상이 되는 이 반응의 결과물이거나 또는 효 소적 탈아실화 반응 대상인 중화처리된 염소화 반응 혼합물이 될 수도 있다. 두 경우 모두, TGS-6-아세테이트의 분리 및 농축을 수반하는 처리 단계는 중복되는 결과를 낳기 때문에, 본 발명의 방법은 TGS-6-아세테이트 또는 TGS-6-벤조에이트의 분리 단계 및 이의 정제나 탈아실화 반응을 생략하는 것도 고려한다. 현재, 다양한 모노, 디-, 트리- 및 테트라클로로 수크로스 유도체가 존재하면 순수 TGS의 형성을 방해하며 그 결과로 TGS의 수율 및 순도가 저하된다. 이들은 종래의 정제 공정에서 일부 제거되며, 감미도 조절에 불리한 방식으로 작용하고, 맛과 최종 제품의 품질에 악영향을 미치는 등 식품 및 음료 제품의 착향 시스템에 지장을 초래한다. 반대로, 불순물을 모두 제거하면 맛, 감미도, 입맛 적합성 등에 유리한 방향으로 작용할 수 있다. 또한 합성 경로에 이용되는 용매, 예를 들어, 3차 아미드는 제품의 결정화에 영향을 미치므로 제거해야 한다. 용매 제거는 증류나 수증기 탈거 등의 공지 방법으로는 실현하기 어려운 것으로 알려져 있다. 따라서 TGS 함유 반응 혼합물의 하행 흐름 처리 과정에 여러가지 문제가 발생한다

이러한 복합적인 문제는, 컬럼 크로마토그래피에 이용되고 또한, 특별히 한정되는 것은 아니지만, 처리조작 조건에서 제거될 DMF, 염소화 당 유도체 또는 염소화 당을 포함하는 하나 이상의 바람직한 화학 분자에 대해 특이적인 친화도를 갖는 흡착제를 사용하는 본 발명의 구현예를 통해 해결할 수 있다. 상대적 친화도는, 이온교환 혹은 실리카겔 흡착제를 이용하는 것과 더불어 소수성:친수성 상호반응을 포함하는 공지의 컬럼 크로마토그래피법에서 생성된 분자들의 흡착-탈착보다 선택성이 더 크며 그 결과, 흡착제, 분리 대상인 분자물질 및 용리제 사이에 선택적 크 로마토그래피 체류 거동(retention behavior)이 형성된다.

본 발명의 목적에 관련하여, 친화 크로마토그래피는 혼합물의 다른 성분들의 전부 또는 일부에 있어서 목적 분자에 대한 상대적 친화도를 나타낼 수 있는 흡착제 표면의 이용을 포함한다.

TGS, TGS 전구물질 및 TGS 유도체의 크로마토그래피 분리에 있어서, 일차적으로 본 발명의 방법은 염소화 당 제조 과정에서 나타나는 유사성이 큰 분자들에 관하여 광범위한 친화도를 갖는 흡착제를 사용했으며 이에 따라 컬럼 크로마토그래피에서 중복없이 상기 분자들을 분리할 수 있다.

본 발명의 상기 특징은 본 발명의 구현예 중 하나로서, 컬럼 크로마토그래피법의 효율을 크게 향상시키며 또한, 탈착 과정에서 흡착된 TGS-아세테이트의 현장 탈아실화 또는 TGS-아릴레이트의 탈아릴화 (TGS-6-아세테이트나 TGS-6-벤조에이트의 탈아실화, 단, 흡착제와 접촉상태거나 흡착제로부터 탈착 상태로서 컬럼 속에 존재함)를 알칼리 수성 용리제로 수득할 수 있게 한다. 현장 탈아실화의 중요한 장점은 DMF가 없는 상태에서 상기 방법이 진행된다는 것으로서 즉 알칼리 조건하에 DMF가 노출되는 것을 피하고, 또한 파괴없이 토토(toto)에서 회수 가능하므로 액상 반응 혼합물에 용해된 DMF의 존재하에 TGS-아세테이트의 탈아실화 또는 TGS-6-아릴레이트의 탈아릴화를 동반하는 종래의 방법보다 경제적인 잇점이 크다는 것도 장점이다. 또한, 혼합물 내의 불순물로부터 TGS-아세테이트 또는 TGS-벤조에이트를 분리하는 것과 동시에 친화적 컬럼 크로마토그래피의 동일한 처리 단계에서 축적된 모든 물질을 우수한 순도로 용리한다. 따라서 상기 방법은 다수의 기능을 단일의 단계에서 실행할 수 있다. 회수한 탈보호된 염소화 당 유도체는 추후 크로마토그래피 및/또는 추출후 결정화 등과 같은 일반적인 공지 방법에 따라 정제할 수 있다. 상기 탈아실화 방법은 종래 기술에서는 언급된 바가 없으며 이점에 근거하여, 훨씬 단순화되고 경제적 효과가 큰 TGS 제조방법, 특히 일반적인 할로겐화 당류의 제조방법을 개발하게 되었다.

본 발명의 방법은 탈보호된 염소화 당 유도체를 공급물인 반응 혼합물 내의 화합물 농도보다 더 큰 농도로 회수할 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예는 농축 효과가 큰 방법으로서, 다량의 희석액을 DMF를 포함한 각종 불순물이 제거되고 고순도 염소화 당 산물의 농도가 5중량% (w/v) 이상인 용액으로 전환 처리할 수 있다. 희석된 복합 반응 혼합물에서 출발하는 단일 처리 단계에서 5중량% (w/v) 이하의 최종 함량까지 농축했다. 실질적으로 불순물이 모두 제거된 산물을 1회 처리로 95% 이상 회수하는 경우, 상기 분리된 산물은 동일하거나 다른 흡착제를 함유한 또다른 컬럼을 1회 이상 통과함으로써 미량의 불순물까지 제거할 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 흡착제는 수회 반복 재생할 수 있다. 회수된 산물은 추가 정제를 위한 방법을 필요로 하지 않으며 따라서 전체 공정이 간단하고 경제적이며 처리 규모도 확대할 수 있다. 본 발명의 상세한 설명은 특별한 이의가 없을 경우 "친화성 크로마토그래피법" 등과 같이 단수로 표현하나 이는 친화성 크로마토그래피에 기초한 하나 이상의 처리 방법을 포함한다. 마찬가지로, "용매"는 하나 이상의 용매를, TGS, TGS 전구물질 및 TGS 유도체의 제조를 위한 "공 정 흐름"은 TGS, TGS 전구물질 및 TGS 유도체의 제조, 정제 및 분리를 위한 모든 공지 방법에 있어서 처리 단계에서 형성되는 하나 이상의 "공정 흐름"을 모두 포함한다.

본 발명에서 사용할 수 있는 반응 혼합물/공정 흐름/처리액은 구체적으로, 추후 용질을 다시 회수할 물에 용해된 TGS 또는 TGS-아세테이트 용액부터, 특별히 한정되지 않지만 TGS, TGS 전구물질 및 TGS 유도체를 포함하는 TGS 또는 TGS-아세테이트의 제조를 위한 효소적 및 비효소적 공정에서 유도된 공정 흐름까지 포함한다.

본 발명은 사실상 새로운 접근을 시도한다. 6-O-보호된 혹은 탈보호된 상태의 염소화 당 유도체 또는 그의 혼합물을 포함하는 중화된 반응물은 상기 혼합물에 함유된 분리 대상 산물에 대한 특이적 친화도를 가진 적절한 리간드 (흡착제)와 접촉하게 된다. 이 리간드는 가교 폴리스티렌-디비닐벤젠 또는 폴리메타크릴레이트계 매트릭스로부터 유래된 흡착제 혹은, 적절한 표면 개질을 통해 이로부터 유래된 유도체를 포함할 수 있으며 염소화 당 유도체를 선택적으로 흡착하게 된다. 무기 염류, 용매 및 물은 액상의 상기 리간드로부터 분리된다. 흡착 반응은 특정의 당 유도체에 대해 선별적으로 이루어질 수 있으며 또는 하나 이상의 당 유도체가 컬럼 매트릭스에 흡착된 뒤 다시 적절한 용리제에 의해 선택적으로 탈착될 수도 있다.

흡착제와 당 유도체 간의 임시적 결합 형성에 기초하여 상기 흡착제와 염소화 당 유도체 간 상호반응이 일어나기도 한다.

본 발명은 특별히 이에 국한되는 것은 아니지만, 리간드와 당 유도체 간의 임시적 결합을 형성하기 위해 당 유도체 분리를 위한 하나 이상의 적절한 리간드를 확인하는 단계도 포함하며, 따라서 종래 기술에 따른 방법을 한층 더 개선하였다. 이 경우의 분리 공정은 극성 상호반응이 아니라 순수 소수성 친화도를 바탕으로 한다.

상술한 리간드는 염소화 당 유도체를 흡착하고 또한 상기 반응물의 기타 다른 구성분들을 분리하여 씻겨져 나가게 할 수 있다. 염소화 당 유도체는 1차 염소화 당 및 그 뒤의 2차 염소화 위치 등, 적절한 점진적 방식으로 흡착제로부터 추출한다.

선택적 탈착에서 얻은 분획(fractions)들은 각각 개별 수거한다. 이들 분획물을 종래 방법에 따라 농축, 탈보호 및 결정화 처리한다.

상술한 반응 혼합물/공정 흐름/본 발명의 방법으로 정제될 수 있는 용액의 바람직한 구현예를 구체적으로 예시하면, 특별히 한정되지는 않지만, 다음 중 하나 이상을 포함한 하나 이상의 TGS 제조공정의 공정 흐름에서 유래된 염소화 당을 함유하는 용액을 들 수 있다:

(a) DMF 및/또는 무기물이 제거되거나 및/또는 염소화 반응 혼합물을 포함하여 효소적 및 비효소적 반응 혼합물과 또한 TGS 및/또는 TGS-아세테이트 혹은 TGS-벤조에이트 같은 TGS-아릴레이트가 수성 혹은 비수성 용매에 용해된 원액으로부터 나온 분해 산물을 포함하는 기타의 유기 불순물이 제거된 유기 당 유도체를 분리 및 농축하는 단계;

(b) 수성 또는 비수성 매질에 용해시킨 후, ATFD (Ratnam et.al.의 WO/2005/09374 및 WO/2005/090376에 개시된 기계식 교반 박막 건조기)를 이용한 건조 등 다양한 방법에 따라 상기 반응 혼합물을 건조시켜 얻은 고형물로부터 무기 및 유기 불순물을 제거하는 단계;

(c) 컬럼 크로마토그래피나 기타의 정제방법을 통해 정제한 후 산물 분획들을 농축하는 단계; 및

(d) 효소적 전환 과정에서 수크로스-6-아세테이트로부터 글루코스-6-아세테이트를 분리하는 단계.

본 발명의 방법에 적용되는 정제용 공정 흐름의 다수 구현예는 종래 기술에 따른 방법 즉, TGS, TGS 전구물질 및 TGS 유도체 제조를 위한 효소적 및 비효소적 방법에 따라 적용될 수 있다. 이러한 방법은 특별히 한정되는 것은 아니지만, 예를 들면: Fairclough, Hough 및 Richardson, Carbohydrate Research 40(1975) 285-298; Mufti et al (1983), 미국 특허 제4,380,476호; Rathbone et al (1986), 미국 특허 제4,380,476호; O'Brien et al (1988), 미국 특허 제4,783,526호; Tully et al (1989), 미국 특허 제4,801,700호; Rathbone et al (1989), 미국 특허 제4,826,962호; Simpson (1989), 미국 특허 제4,889,928호; Navia (1990), 미국 특허 제4,950,746호; Homer et al (1990), 미국 특허 제4,977,254호; Walkup et al (1990), 미국 특허 제4,980,463호; Neiditch et al (1991), 미국 특허 제5,023,329호; Vernon et al (1991), 미국 특허 제5,034,551호; Walkup et al (1992), 미국 특허 제5,089,608호; Dordick et al (1992), 미국 특허 제5,128,248호; Khan et al (1992), 미국 특허 제5,136,031호; Bornemann et al (1992), 미국 특허 제 5,141,860호; Dordick et al (1993), 미국 특허 제5,270,460호; Navia et al (1994), 미국 특허 제5,298,611호; Khan et al (1995), 미국 특허 제5,440,026호; Palmer et al (1995), 미국 특허 제5,445,951호; Sankey et al (1995), 미국 특허 제5,449,772호; Sankey et al (1995), 미국 특허 제5,470,969호; Navia et al (1996), 미국 특허 제5,498,709호; Navia et al (1996), 미국 특허 제5,530,106호; Catani et al (2003), 미국 특허 출원 200030171574; Ratnam et al (2005), 국제 출원 WO/2005/090374; Ratnam et al (2005), 국제 출원 WO/2005/090376 등에 개시된 것을 들 수 있다. 이들은 단지 예시를 위한 것에 불과하며 이에 한정되지 않는다.

한 구현예에서, 본 발명은 TGS를 포함하는 염소화 당 유도체가 함유된 반응 혼합물/공정 흐름/용액의 분리 및 정제를 위한 흡착 크로마토그래피법과 또한, 소수성 및 친수성 불순물, 무기 및 유기염류, 용매 및 유색 잔류물의 대부분을 실질적으로 제거한 TGS 를 제조하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 반응 혼합물로부터 TGS를 분리할 수 있는 고수율 및 고순도의 제조방법을 제공한다. 특히, 반응 혼합물에 존재하는 구조적 관련성이 있거나 없는 불순물이 제거된 순수한 형태의 TGS가, 예를 들어, 95% 이상 및 때로는 100%에 가까운 고회수율로 분리 회수될 수 있는 방법에 관한 것이다. 이 방법은, 별도의 사전정제 처리가 필요없이 흡착, 세정 및 용리나 탈착 조작을 수반하고 다른 한편으로 흡착제에 관련하여 만족할 만한 회수율 및 우수한 내구성을 유지함으로써, 99% 순수 TGS를 95% 이상의 회수율로 제공할 수 있는 방법과 이를 위한 장비를 사용하여 달성한다.

선행 특허들은 폴리스티렌 디비닐벤젠 (PS-DVB), 폴리메타크릴레이트, 셀룰로오스 등에 기초한 경질의 다공성 매트릭스, 한천, 키토산, 덱스트린, 폴리아크릴아미드 등에 기초한 다공성 겔형 매트릭스, 히드록시아파타이트, 적절한 공극의 유리, 스테인레스강, 석영 및 마그네틱 비드 등에 기초한 기타의 매트릭스 등을 사용하는 방법은 포함하지 않고 있다. 또한 이들 특허는 상술한 매트릭스 종류에 팽창층, 유동층, 고-액 순환형 유동층, 막형 크로마토그래피, 충전층, 직렬형 컬럼 크로마토그래피 및 모사 이동층 크로마토그래피 등을 이용하는 것도 개시하지 않았다. 또한 공지의 특허는 입자 크기, 공극 크기, 원하는 정제 처리에 필요한 매트릭스 표면적, 술폰산기를 제외하고 카르복실기, 아미노기, 디올, 시아노, 지방족, 방향족, 할로겐 및 부동화된 금속 킬레이트 친화성 크로마토그래피를 위한 메탈 킬레이트기 유사 이미노디아세트산 (IDA) 등과 같은 작용기에 대해서도 언급한 바가 없다. 마지막으로, 공지의 특허는 지방족 및/또는 방향족 부분 (C1 내지 C8 탄소 원자), 시아노기나 아미노기를 가진 실리카 등과 같이 개질된 실리카를 사용하는 것도 개시하지 않았다. 상기에서 제안된 펄스 조작(pulse operation)을 포함하는 크로마토그래피법은 다량의 공급물을 처리하는데 적합하지 않다.

공지의 특허는 상술한 바와 같은 다양한 방식의 컬럼 크로마토그래피에서 자연 또는 합성 고분자 매트릭스를 사용하는 방법을 개시하지 않았다.

또한, TGS에서 할로겐화된 당 불순물울 제거하기 위한 다른 접근법들에 대해서는 거의 다룬 적이 없었다.

위에서 검토한 바와 같이, 기존의 특허 또는 연구에 따른 방법들은 본 발명 의 배경에서 확인된 다수의 문제점을 안고 있다. 따라서 규모가 확장되고, 경제적이며 또한 상용성이 있는 방법, 즉, 탈보호된 TGS, 보호된 TGS 및 부분 보호된 TGS를 포함하는 염소화 당 유도체를 정제하고 큰 손실이나 열화 없이 용매 DMF를 제거할 수 있는 새로운 방법의 개발이 요구되었다. 상기 방법은 액상 용액으로부터 TGS나 TGS-아세테이트를 단독 분리하는데도 이용할 수 있다. 또한, 고순도의 TGS를 제조하고 최종 결정화 과정에서 TGS의 고수율을 확보할 수 있는 방법도 필요하게 되었다. 결정화시 TGS의 손실은 TGS에서 다른 염소화 당 유도체 및 DMF가 제거되면 최소화 할 수 있다. 종래의 특허에 따른 방법은, 간단하고 경제적인 방식으로 염소화 당 유도체 및 DMF가 모두 제거된 TGS를 생성하지 못하였으며 중간물이나 TGS의추출 및 결정화를 위한 다단계 처리가 필요했다.

본 발명의 방법은, 흡착 크로마토그래피법에서 경질의 고분자 흡착제 매트릭스를 이용하여, TGS 및/또는 보호 또는 부분적 보호된 TGS를 포획하고 또한 중화된 염소화 반응물로부터 얻어진 다른 염소화 당 유도체들을 제거하여 상기 TGS를 정제함으로써 상술한 공지 방법들의 단점을 극복하였다. 본 발명의 방법은 또한 상기 성분들을 포획하는 동안 DMF 같은 3차 아미드 용매를 제거하고 동시에 유색 잔류물의 대부분과 염류도 제거한다. 따라서, 본 발명의 방법은 보호 및/또는 탈보호된 TGS를 포획 정제하고 또한 반응물로부터 직접 염류와 DMF를 제거하는 통합된 방법이라 하겠다. 이에 상술한 문제의 해결 방법을 다음과 같이 상세하게 기술한다.

TGS 는 당의 6번 위치에 있는 가장 반응성이 우수한 히드록실기를 보호하고 또한 상기 6-O-보호된 당을 "빌스마이어-하크 시약"으로 염소화 처리함으로써 당으 로부터 조제한다. 염소화 반응물은 적절한 염기로 중화한다. 중화물의 구성분은 다음과 같다:

(a) 염소화 당 유도체 (6-O-보호 또는 탈보호된 유도체 및/또는 보호 및 탈보호된 유도체의 혼합물);

(b) 무기 염류 (인산염, 염화물 등);

(c) 유기 염류 (아세트산염, 벤조산염 등);

(d) 3차 아미드, 알코올, 피리딘 등의 용매;

(e) 카라멜 당 등의 유색 당 유도체; 및/또는

(f) 물.

염소화 처리 뒤의 상기 중화물은 TGS 및/또는 보호되거나 부분 탈보호된 TGS를 다른 염소화 유도체로부터 분리 정제처리 한다.

본 발명에서, 중화 반응물은 (화학적 혹은 효소적으로) 6-O-보호 또는 탈보호된 염소화 당 유도체나 이들의 혼합물을 포함하며 이들은 경질의 다공성 고분자 매트릭스와 접촉한다. 매트릭스 표면, 매트릭스 상의 리간드 또는 화학 작용기는 염소화 당 유도체에 대한 친화력 및/또는 강한 상호반응력이 있고 따라서 적절한 조건하에 염소화 당 유도체를 선택적으로 흡착하도록 제조할 수 있다. 염류, 용매 및 대부분의 유색 잔류물은 미흡착 부분으로 남아 상기 매트릭스로부터 분리된다. 각종 염소화 당류의 흡착도는 각각 상이하다. 대부분 흡착되는 염소화 당부터 거의 흡착되지 않는 염소화 당까지의 흡착도나 결합 강도 혹은 친화도는, 처리 조건에 따라, 테트라클로로 > 트리클로로 > 디클로로 > 모노클로로 유도체 혹은 테트라클 로로 < 트리클로로 < 디클로로 < 모노클로로 유도체 순서가 되기도 한다. 다공성 흡착 매트릭스와 염소화 및/또는 염소화되지 않은 당 유도체 간의 상호반응은, 가역성 다중 혹은 다점형 상호반응 또는 2종류 이상의 상호반응, 예컨대, 상호 배위반응, 수소결합, 상호 이온반응, 쌍극자간(dipole-dipole) 유래된 쌍극자 및 소수성 상호반응 등과 같은 복합형 상호반응을 기초로 하며 이에 따라, 염소화 당 유도체 및 상호작용기를 이용한 선택적인 상호반응을 달성한다.

상술한 염소화 당 유도체를 순수한 형태로 분리 정제하는 본 발명의 방법에서 사용된 비이온형 또는 음이온 교환용 다공성 매트릭스는: 비이드형 매트릭스를 제조하기 위한 것으로서, (A) 스티렌 및 디비닐벤젠(PSDVB) 공중합체, (B) 스티렌, 디비닐벤젠, C1 내지 C8 탄소 분자를 가진 불포화 혹은 포화 지방족 및/또는 방향족 성분 혹은 불소, 브롬, 염소 등의 할로겐 원자를 함유하는 고분자, (C) 한천, 덱스트란, 키토산 또는 셀룰로오스 등에 기초하는 자연 고분자, (D) 가교 반응으로 생성된 폴리메타크릴레이트나 폴리아크릴아미드 고분자 또는 (E) 이들의 조합물; (F) 상술한 고분자 물질 중 하나 이상을 이용하여 제조한 마그네틱 비이드; 또는 (G) 지방족 및/또는 방향족 아미노 혹은 시아노 성분을 함유하는 개질 실리카 등을 포함한다.

본 발명에서 "다공성 매트릭스"는 미다공성, 거대다공성, 메조다공성, 초거대다공성 및 기가다공성 매트릭스를 포함한다.

본 명세서에서 언급하는 "친화력"이란 분자물과 흡착제 또는 흡착제 표면에 존재하는 하나 이상의 상호작용기 간의 상대적인 특이적 상호반응 강도를 말하며, 이 결과로서 흡착 선택성이 생기고 또한 흡착제나 사용된 이동상의 종류에 따라 상이한 상호반응력을 수반한다.

흡착제 매트릭스 상의 상호작용기 및/또는 리간드는 염기 매트릭스의 일부가 되거나 혹은 종래의 활성화 반응 화학에 따라 매트릭스에 그래프트 되기도 하며 이에 따라 매트릭스 소수성이나 친수성, 그룹 밀도, 공간 방향성, 당 유도체에 대한 선택적인 특이 친화력 등, 원하는 특성을 제공한다. 매트릭스의 또다른 중요한 특성으로는 표면적, 공극률, 입자크기, 공극 반경 및 공극 구조 등이 있다.

본 발명에서, 흡착제로서 막(membrane)을 사용할 수 있으며 상호작용기 및/또는 리간드가 상기 막의 표면에 분포된다. 이러한 시스템을 막 크로마토그래피로 이용한다. 사용되는 막은 다공성 혹은 다공성이 아닐 수도 있으며 특별히 한정되지는 않지만, 폴리에테르 술폰, 셀룰로오스 아세테이트, 재생 셀룰로오스, 나일론, 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 및 셀룰로오스 아세테이트 프탈레이트 등에 기초한 중공 섬유, 편평 시트, 나선형 막 등의 모듈 형태이다. 바람직한 구현예로서, 농도의 편중 현상을 피하기 위해 횡류형(cross flow type) 막을 사용한다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 매트릭스 상의 리간드는 본 발명에서 사용하기 적절한 할로겐 원소이며 특히 브롬, 염소, 불소 및 요오드를 포함한다. 당업자라면, 흡착제 변경시 당해 분야에서 공지된 방법에 따라 동일한 할로겐 원소 또는 상이한 할로겐 원소들의 조합물이나 치환물을 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법은 특별히 한정된 것은 아니지만, 시판 이용되고 있는 크로마토그래피 흡착제 매질을 이용하여 바람직하게 수행한다. 시판물 또는 그외의 흡착 제 매트릭스를 다음과 같은 그룹에서 선택할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다:

(a) C2 내지 C18 탄소 원자를 가진 포화 또는 불포화 방향족이나 지방족 성분 혹은 시아노기 등의 치환기를 갖거나 갖지않은 스티렌 디비닐벤젠의 공중합체, 예를 들면, DIAION HP-20, HP-21, HP20SS, DCA11 또는 SEPABEADS SP825, SP700, SP850, SP20SS, SP70, FP-OD (미츠비시 화학, 일본), 바이오비즈 SM (BioRad Laboratories, USA), 앰버크롬 CG71, CG161, CG300, CG1000 SMC 흡착제 (TOSHO 바이오사이언스), 앰버라이트 XAD 시리즈 (Rohm and Haas, USA), ADS 600 (Thermax, 인도) 등;

(b) 불소, 브롬, 염소 및 요오드 같은 할로겐 원자 등의 치환기를 갖거나 갖지않은 스티렌 디비닐벤젠의 공중합체, 예를 들면, SEPABEADS SP207, SP207SS (미츠비시 화학, 일본) 등;

(c) 치환기를 갖거나 갖지 않은 비이드 매트릭스를 형성하기 위한 것으로서, 가교 반응에 의해 조제된 폴리메타크릴레이트 공중합체 및/또는 폴리아크릴아미드 공중합체, 예를 들면, DIAION HP-2MG (미츠비시 화학, 일본), Macro-Prep 메틸, 부틸, 페닐 (BioRad Laboratiroes, USA) 등;

(d) 한천, 덱스트란 또는 셀룰로오스 등의 자연 고분자계 매트릭스, 예를 들면, SOURCE 5 RPC 15 RPC, 페닐 세파로스 6 FF, HP, 고치환형 부틸 및 옥틸 세파로스 4FF (GE 헬스케어), CELBEADS (자국 발명된 인도 특허 출원 제356/Mum/2003) 등;

(e) C2 내지 C18 탄소 원자를 가진 포화 또는 불포화 방향족이나 지방족 성 분 혹은 시아노기 등의 치환기를 갖는 개질 실리카;

(f) 하나 이상의 상술한 고분자를 기초로 하고 아미노기(1차, 2차 또는 3차) 혹은 이미노 성분을 함유한 복합형 혹은 음이온교환 매트릭스, 예를 들면, SEPABEADS FP-NH₂, EB-QA, EB-DA, FP-HA, EB-HA (레진디온 에스알엘, 미츠비시 화학, 이탈리아), 세파로스-DEAE, 스트림라인-DEAE (GE 헬스케어), CELBEADS-DEAE (자국 발명된 인도 특허 출원 제356/Mum/2003) 등;

(g) PSDVB, 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드, 히드록실기나 디올기를 가진 자연 고분자 및 그의 조합물에 기초한 매트릭스, 예를 들면, SEPABEADS FP-HG (레진디온 에스알엘, 미츠비시 화학, 이탈리아) 등.

본 발명의 방법에 사용되는 매트릭스의 또다른 특성은 표면적 (100m²/g 이상), 공극 직경 (50Å 이상), 입자 크기 (5㎛ 이상) 및 용해도 지수나 소수성도 (0.5 이상) 등이 있다.

2단계 흡착에 이용되는 수지는 같거나 상이할 수 있다. 수지 선택은 매우 중요하며 수많은 실험이 요망된다. 또한 수지 선택은 수지의 다양한 특성(공극 크기, 입자 크기, 표면적, 기저 매트릭스 및 표면 소수성도, 및 용해도 지수), 정제될 물질의 종류, 불순물이나 관련 불순물의 성질과 함량, 반응 매질의 종류 및 사용되는 이동상 등에 따라 달라진다. 수지 선택에 관여하는 다른 변수로는 크로마토그래피 조건 즉, 온도, 유속, 구배법 혹은 균일법, 구배 형태나 크기 등을 들 수 있다.

본 발명에서 "관련 불순물"이란 합성 과정 혹은 크로마토그래피 단계에 앞선 처리 과정에서 생성되는 불순물을 말하며 상기 염소화 당 유도체와 구조적으로 관련이 있다.

본 발명에서 "구배(기울기) 용리"란, TGS 및 기타 염소화 당 유도체의 선택적 탈착/용리에 이용되는 이동상의 조성/물성에 따라 달라지는 단계적, 선형, 볼록 혹은 오목 형태의 기울기를 포함한다. 또한 "구배 부피"란 이동상의 최종적인 용리 강도를 달성하는 이동상의 크기(부피)를 뜻한다.

중화된 반응물과 접촉시 흡착제 매트릭스의 흡착량은 탈보호된 TGS, 보호된 TGS 및 부분적으로 탈보호된 TGS (즉, 보호된 TGS 및 탈보호된 TGS의 혼합물) 각각 혹은 이들의 조합에 대하여 5 내지 100gm/리터이다. 본 발명의 방법은 회분식 혹은 연속식으로 행해질 수 있다. 한 구현예에 따르면, 적절한 흡착제를 수지 컬럼에 충전하고 이 수지 컬럼에 반응물을 통과시키는 것을 포함하는 충전층 크로마토그래피 컬럼의 이용 방법에 따라 흡착이 실행된다.

연속식 조작의 경우, 충전층이나 팽창층 흡착(EBA), 유동층 흡착(FBA), 액-고 순환식 유동층(LSCFB), 막 흡착(MBA) 또는 개선된 모사 이동층(ISMB)이나 이동층이나 이들의 조합을 이용할 수 있다. 회분식 시스템의 경우 교반 탱크를 이용할 수 있다.

팽창층이나 유동층을 이용하는 본 발명의 정제 방법에서, 적하 및 세척 단계 뒤의 용리 단계는 팽창층, 유동층 혹은 충전층 방식으로 행할 수 있다. 바람직하게, 용리는 충전층 방식으로 행한다.

바람직한 구현예에 따르면, 상술한 염소화 당 유도체는 매트릭스나 막에 흡 착되고 다시 이것을 세척하여 염류 및 DMF를 제거한 뒤 선택적 용리를 통해 순수한 보호, 탈보호 혹은 부분 탈보호된 TGS를 얻을 수 있다. 상기의 TGS는 단계형 혹은 선형 구배의 이동상 뿐만 아니라 적절한 이동상을 이용하는 등용매(isocratic) 용리를 통해서도 정제될 수 있다.

매트릭스나 막에 존재하는 리간드 혹은 상호작용기가 벤질기 혹은 페닐기인 본 발명의 바람직한 구현예에서, 트리클로로 및 테트라클로로 당 유도체는 유지되는 반면 디클로로 및 모노클로로 유도체는 세척 이동상에 녹아 분리된다. 트리클로로 및 테트라클로로 유도체는 그 후 선택적 용리에 의해 순수 분획 속에 녹아 분리된다.

매트릭스나 막에 존재하는 리간드 혹은 상호작용기가 브롬 같은 방향족 할로겐인 본 발명의 바람직한 구현예에서, 테트라클로로, 트리클로로, 디클로로 및 모노클로로 유도체는 모두 흡착된다. 이들의 결합 강도 순서는, 알칼리 및 산성 조건하에 각각 테트라클로로 > 트리클로로 > 디클로로 > 모노클로로 유도체 혹은, 테트라클로로 < 트리클로로 < 디클로로 < 모노클로로 유도체이다. 원하는 염소화 당 유도체 즉, TGS는 디클로로나 모노클로로 유도체를 우선적으로 세척하고 후속으로 테트라클로로 유도체를 세척한 뒤에 선택적으로 용리한다. 마찬가지로, 트리클로로, 디클로로 및 모노클로로 당 유도체의 혼합물이 아미노 또는 이미노 같은 리간드에 해당할 경우, 트리클로로 당 유도체가 강력히 흡착되는 것과 달리, 디클로로 및 모노클로로 유도체는 선택적으로 용리 배출될 수 있다. 그 후 상기 트리클로로 유도체를 순수 분획으로 용리할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따르면 모노클로로, 디클 로로, 트리클로로 및 테트라클로로 유도체나 이들의 혼합물을 함유하는 반응 혼합물은 다양한 경로 및 이들 경로의 조합에 따라 순수 분획으로 분리될 수 있다. DMF 및 염류는 상기 흡착 경로에서 흡착되지 않고 그대로 남아 있으며 흡착된 염소화 당 유도체의 손실 없이 흡착제로부터 간단히 세척 분리할 수 있다.

탈보호된 TGS를 함유하는 반응물을 공급물로 이용하는 본 발명의 방법에서, 용리 후 95% 순도의 탈보호 TGS가 수득된다.

보호 및/또는 부분 탈보호된 TGS를 함유하는 반응물을 공급물로 이용하는 본 발명의 방법에서, 선택적 용리 결과 95% 이상의 순수물 형태로서 보호 및/또는 부분 탈보호 TGS를 수득할 수 있다. 상기 보호 및/또는 부분 탈보호된 TGS는 공지의 화학적 또는 효소적 방법에 따라 정제후 완전히 탈보호 처리한다.

본 발명의 방법에 관한 한 구현에에서, 정제된 탈보호 TGS는 유사하거나 다른 흡착제 상의 제2 크로마토그래피 컬럼에서 최종적으로 연마 정제되며, 용리 이동상에 이용된 유기 용매는 단순 증발 혹은 증류에 따라 완전히 혹은 부분적으로 제거한다. 연마 정제 단계에 이용된 흡착제는 상술한 연마제 종류 전체로부터 선택될 수 있다. 연마 정제 단계에서 매트릭스의 양은 흡착제에 대해 5gm 산물/리터 이상이다. 상기 연마 정제 단계는 충전층, 모사 이동층 혹은 개선된 모사 이동층에서 실행할 수 있다. 소수성 상호반응 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 이온 배제형 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 막 크로마토그래피, 원심 분리 크로마토그래피 및 복합형 상호반응 크로마토그래피나 이들의 조합을 이용할 수 있다. 한개의 컬럼에서 용리되는 선택 분획을 직접 제2 컬럼에 공급할 수 있는 탠덤형 컬럼 크로마토그래피도 상기의 방법에 이용할 수 있다. 등용매 혹은 구배 용리는 미량의 불순물을 제거하는데 이용하며 이 결과, 99% 이상의 순도를 갖는 TGS를 수득할 수 있다. 본 발명의 또다른 예에서, 보호 및/또는 부분적 탈보호 TGS는 상기 방법에 따라 연마 정제될 수 있으며 이 결과, 98% 이상의 순수한 형태의 보호 및/또는 부분적 탈보호 TGS를 수득하고 이 수득물을 공지의 효소적 방법에 따라 가수분해하여 최종의 순물질 TGS를 얻는다. 상술한 정제 및 연마 정제후의 크로마토그래피법을 통해, 공급 반응물에 대비하여 90% 이상, 때로는 100%에 달하는 순도의 TGS-6-아세테이트, TGS-6-벤조에이트 혹은 기타의 TGS를 얻을 수 있다. 연마 정제 컬럼에서 얻은 분획은 미량의 불순물을 함유하는 것으로 나타나며 이것을 후속 주기에 재순환시켜 95% 이상의 총 회수율을 달성한다.

본 발명의 방법에 관한 그 밖의 또다른 구현예에서, 탈보호된 TGS 혹은 보호 및/또는 부분적 탈보호된 염소화 당 유도체를 함유하는 중화된 염소화 반응물은 기계교반식 박막 건조기 등의 공지 방법에 따라 건조하여 용매부분을 제거할 수 있다. 건조된 반응물을 다시 수성 혹은 수성-유기 매질에 용해하여 순수한 TGS를 본 발명의 방법에 따라 회수할 수 있다.

본 발명의 방법에 관한 또다른 구현예에서, 탈보호된 TGS 혹은 보호 및/또는 부분적 탈보호된 염소화 당 유도체를 함유하는 용매 무함유 혹은 수성 염소화 반응물, 또한 크로마토그래피 단계에서 수득된 공정물을 공급물로 이용할 수 있다. 또한, 순수한 TGS나 염소화 당을 본 발명의 방법에 따라 회수할 수 있다.

정제 및 연마 정제 단계에서 사용되는 평형화, 세척, 용리 및 재생 이동상은 특별히 한정되지는 않지만, 알코올 (메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올), 아세토니트릴, 염소화 유기 용매류 (클로로포름, 디클로로메탄, 디클로로에탄), 톨루엔, 에스테르류 (부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트), 케톤류 (아세톤, 메틸이소부틸케톤), 및 이들의 2종 이상의 조합물을 유기 개질제로서 함유한다. 필요한 경우, 상기 용매와 물을 조합하여 흡착제에 대한 모노, 디, 트리 및 테트라 염소화 화합물의 친화도 및/또는 상호반응력을 조절 혹은 조정할 수 있다. 흡착제에 충전될 반응물의 종류, 요구에 따른 세척, 용리, 재생 및 평형화 조건에 따라 0% 내지 100% 비율로 물을 첨가할 수 있다. 예를 들어, 평형을 이루기 위해서는 100%의 물을 사용하는 반면, 재생 목적으로는 수분 함량이 0%까지 감소한다.

이동상은 또한 적절한 이온쌍 작용제 및/또는 친화력 및/또는 결합강도 조절제를 함유할 수 있으며 구체적인 예를 들면, 특별한 한정되는 것은 아니지만, 인산, 아세트탄, 펜탄술폰산, 트리플루오로아세트산, 트리에틸아민 및 이들의 2종 이상의 조합물 등이 있다. 이동상 내의 이온쌍 작용제 농도는 선택된 이온쌍 작용제의 종류에 따라 0.001부피%(v/v) 내지 2.5부피%(v/v)의 범위이다. 특별히 한정되는 것은 아니지만, 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제, 인산염-시트르산염 완충제 (Macllav 완충제), 시트르산염-아세트산염 완충제, 붕산염 완충제, 탄산염 완충제 등과 같은 완충제를 사용함으로써 염소화 당 유도체와 매트릭스 간의 상호반응 혹은 결합강도의 차이를 유도할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서 식용 염류, 완충제, 산류 및 알칼리를 사용한다.

평형화, 세척, 용리 및 재생 용도의 이동상은 "등용매 용리"와 같은 무변화 방식, 단계 방식, 소정의 기간 동안 액체의 용적이 변화하는 방식, 예컨대, "단계식 구배"나 "연속식 구배" 용리 방식, 또는 이들의 조합 방식에 따라 흡착제에 첨가된다.

본 발명에 따른 크로마토그래피 정제 방법의 진행 과정에 있어서, 흡착제로부터 선택적 탈착으로 얻은 탈착 분획들은 각각 별도로 수거하여 HPLC로 TGS 함량을 분석하며 마찬가지로 GC로 용매 함량을, 기타의 염소화 유도체들의 함량은 공지 방법에 따라 TLC로 각각 분석한다. 순수 분획들을 혼합하여 농축한다. 본 발명의 방법으로 수득한 TGS는 다시 공지의 방법에 따라 결정화하여 중량% 기준으로 99% 이상의 순도를 갖는 고형 TGS 산물을 수득한다.

본 발명에 따른 방법의 장점을 다음과 같이 요약할 수 있다:

(1) 중화된 자연 반응 혼합물 또는 건조된 반응 혼합물로 실행한 흡착 단계에서, 상기 TGS 및/또는 보호되거나 부분적으로 탈보호된 TGS의 정제를 염류 및 용매 제거와 동시에 행할 수 있다.

(2) 재생 후 흡착제를 재사용할 수 있으므로 경제적이다.

(3) 상기 염소화 당 유도체의 최종 결정화 수율 및 순도를 향상한다.

(4) 99% 이상의 순도 및 95% 이상의 수율로서 염소화 당 유도체를 제공한다.

(5) 실험실 규모부터 산업적 규모까지 실행할 수 있다. 더욱 유리하게는, 충전층, 팽창층, 유동층, 액-고 순환형 유동층, 개선된 모사 이동층 혹은 막 크로마토그래피 방식 중 어느 것으로도 실행할 수 있으며 연속 조작이 가능하다.

흡착 및 크로마토그래피의 원리는 염소화 당 유도체 분리 공정의 어느 단계에나 적용할 수 있다. 상기 단계 중 일부에서는 다음과 같이 치환 혹은 변형이 가능하다. 즉, 친화적 흡착 크로마토그래피는

(a) 중화된 염소화 당 유도체의 탈보호 전 또는 후에 적용할 수 있다.

(b) 3차 아미드 제거 전 또는 후에 적용할 수 있다.

(c) 상기 염소화 당 유도체로부터 3차 아미드 및 염류를 제거하기 위해 적용할 수 있다.

(d) 염류 (유기 및/또는 무기염류)를 부분 혹은 전체적으로 제거하기 전 또는 후에 적용할 수 있다.

(e) 추출, 크로마토그래피, 결정화, 증류 등의 기타 조작을 통해 염소화 당 유도체를 부분 정제한 후 임의의 단계에서 적용할 수 있다.

(f) 통상의 컬럼 크로마토그래피의 대체 방법으로 이용할 수 있다.

(g) 상기 염소화 당 유도체의 제조에 이용되는 당 중간 화합물의 정제나 분리에 적용할 수 있다.

(h) 분리된 TGS나 이의 전구물질 혹은 유도체를, 본 발명의 컬럼 크로마토그래피 용액을 이용하여, 정제하는 목적을 달성하기 위해 응용할 수 있다.

(i) pH 조건을 달리하여 공급액에 함유된 염소화 당 유도체의 결합 강도나 흡착력을 증가 혹은 감소시킨다.

보호된 염소화 당의 현장 탈아실화에 관련한 상세한 내용은 상술한 바와 같이 하나 이상의 구현예를 포함한다.

현장 탈아실화 구현에 관한 본 발명의 한 구체예에서, 본 발명의 방법은 당의 모노클로로, 디클로로, 트리클로로 및 테트라-염소화 유도체를 모두 함유할 수 있는 공급 혼합물을 사용하기도 한다.

현장 탈아실화 구현에 관한 본 발명의 또다른 구체예에서, TGS 화합물은 염소화 당의 6-O-아실 또는 6-O-벤조일 유도체를 포함한다. 공급 혼합물에 존재하는 할로겐화 화합물의 종류는 합성 경로 및 합성을 위한 특정의 조건에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에서 사용하기 적합한 할로겐 원소는 브롬, 염소, 불소 및 요오드를 포함한다. 당업자라면 동일한 할로겐 원소 혹은 상이한 할로겐 원소의 조합물이나 치환물을 당해 분야의 공지 방법에 따라 용이하게 해당 위치에 충전할 수 있을 것이다.

또한, 현장 탈아실화 구현에 관한 본 발명의 또다른 구체예에서, 히드록실기의 보호는 하나 이상의 위치에서 실현되어 디에스테르, 트리에스테르, 테트라에스테르 또는 펜타에스테르 등을 제공하며 또한 아세틸이나 벤조일 혹은 다른 적절한 기를 포함하기도 한다. 공급 혼합물에 존재하는 에스테르 화합물의 종류는 이용된 합성 경로 및 합성을 위한 특정 조건에 따라 다를 수 있다. 당업자라면, 다수의 위치를 당해 분야에서 공지된 방법에 따라 동일한 기 또는 상이한 기의 치환물 및 조합물로 용이하게 채울 수 있을 것이다.

현장 탈아실화 구현에 관한 본 발명의 또다른 구체예에서, TGS 이외의 다른 화합물을 함유하며 또한 다수의 TGS 합성 공정에서 얻은 TGS 이외의 산물 역시 가수분해된다. 이러한 화합물은 구체적으로, 당의 모노클로로-, 디클로로-, 테트라클 로로- 및 펜타클로로-유도체, 당에서 유래된 다른 2당체, 또한 TGS를 제외한 트리클로로 유도체를 유리된 형태 또는 에스테르 형태로서 포함한다.

본 발명은, 혼합물 내의 화합물을 흡착제 매질과 접촉시키기 위해 반응 혼합물을 본 발명의 요약에서 열거한 것으로부터 적절한 장비에 충전하며, 또한 화합물 즉 보호된 염소화 당 유도체는 흡착 상태에서 완전히 혹은 부분적으로 탈보호되어 탈보호 염소화 당 유도체를 생성하고 또한 탈착에 의해 이것을 회수하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다. TGS를 포함하는 탈보호 유도체는 크로마토그래피 절차에 따라 회수된다. 이 방법에서, 공급 반응 혼합물에 존재하는 염류 이외에도 DMF 같은 반응 혼합물 용매 역시 흡착 및 세척 주기에서 제거한다.

본 방법은 회분식 혹은 연속식으로 행할 수 있다. 한 구체예에 따르면, 흡착은 대부분 충전층 크로마토그래피 컬럼이나 팽창층 크로마토그래피 컬럼에서 실행되며, 이는 적절한 흡착제를 컬럼에 충전하고 여기에 반응물을 통과하는 단계를 포함한다. 중화된 염소화 반응물을 충전하는 과정에서 단계식 혹은 경사식 충전을 택하여 충전층이 불안정하게 되지 않도록 한다.

흡착제 결합 용량은 6-O-보호된 염소화 당의 경우 어떤 구현예에서는 10gm/리터 이상인 반면 또다른 구현예에서는 50gm/리터 이상이다. 본 발명의 바람직한 구현예에서는 50gm/리터 이상의 결합량을 갖는 매트릭스가 적절하다. 원하는 염소화 당 유도체에 있어서 총 결합 용량은 표면적과 또한 공급물의 특성, 조건 및 조성에 근거한다.

본 발명의 방법에서 "공급물의 특성"이란 보호 및/또는 부분적 탈보호된 염 소화 당의 총 함량, 또한 중화된 반응물에 함유된 모노클로로, 디클로로, 트리클로로 및 테트라클로로 유도체 등과 같은 염소화 당의 종류와 조성을 뜻한다.

본 발명의 방법에서 "공급물의 조건 및 조성"이란 무기 및 유기 염류의 종류 및 그 존재에 있어서 pH, 전도도, 온도 및 조성을 뜻한다.

본 발명의 방법에서, 흡착제 매트릭스는 6-O-보호된 염소화 당 유도체의 가수분해를 위한 "촉매 수지" 역할을 할 수 있다. 6-O-보호된 염소화 당 유도체를 탈착하면서 가수분해를 통해 6-O-탈보호된 염소화 당을 형성한다. 용리 이동상은 수성 혹은 수성-유기계 물질이며 흡착제 매트릭스의 존재하에 가수분해율을 증가시키는 촉매이온을 함유한다. 촉매이온은 반드시 그런 것은 아니지만, 대체로 나트륨, 칼륨, 칼슘 및/또는 마그네슘 이온 등의 상대 이온을 동반하는 히드록실 이온(OH^-)이다. 이동상의 pH값은 히드록실 이온 및 이것의 상대 이온 종류에 따라 pH7.5 내지 pH12의 범위를 갖는다.

본 발명의 방법에서, 흡착제 매트릭스 자체가 상기 이온들을 수용하며 혹은 이동상의 일부로서 외부로부터 부가되어 6-O-보호된 염소화 당 유도체 혹은 염소화되지 않은 당 유도체의 가수분해에 작용한다. 완전 혹은 부분적 가수분해된 혼합물은 TGS 같은 6-O-보호형 매트릭스 및 기타의 탈보호된 염소화 당으로부터 탈착되거나 용리한다.

본 발명의 방법에서, 흡착 매트릭스를 알칼리액으로 세척하여 6-O-보호형 염소화 당 유도체를 6-O-탈보호형으로 전환할 수 있으며 이에 TGS를 포함한 6-O-탈보 호된 염소화 당 유도체는 수성 및 수성-유기 탈착제 용액 중 하나 혹은 이들의 혼합물을 이용하여 회수한다. 부분 혹은 전체 탈보호된 유도체를 함유하는 용리 또는 탈착된 용액물의 pH값은 적절한 산이나 염류를 이용하여 조정한다.

본 발명의 또다른 접근에 있어서, 흡착한 6-O-보호된 염소화 당은 수성 용리상 혹은 수성-유기 용리상의 혼합물을 이용하여 탈착하며, 필요시 pH값 조정후, 이 유도체를 함유하는 회수된 용리제를 공지의 화학적 혹은 효소적 방법에 따라 가수분해한다.

일반적으로, pH 조정 화합물은 수산화물, 탄산염, 중탄산염, 아세트산염, 인산염, 소르베이트, 타르타르산염 및 이들의 혼합물의 나트륨, 칼륨, 암모늄 또는 기타의 적절한 염류를 사용할 수 있다. 바람직한 pH 조정 화합물은 수산화물, 암모니아 및 인산염의 나트륨 혹은 칼륨염이다.

본 발명의 구현예에서, pH 조정된 염소화 반응물, 세척액 및 가수분해 용리액을 컬럼의 한 말단에 통과시키고 DMF 등의 반응 혼합물 용매, 염류 및 염소화 당 유도체를 함유하는 분획을 다른쪽 말단에서 수거한다. 본 발명의 또다른 구현예에서, 공급물을 상향 통과하고 DMF와 염류는 컬럼 상단에서 수거한다. 가수분해 용리상은 하향 통과하며 농축 가수분해물은 컬럼 하단에서 수거한다. 본 발명의 방법에서, 원하는 6-O-보호된 염소화 당 유도체의 가수분해율은 공급물 기준으로 가수분해 이동상의 조성 및 컬럼 통과 유속에 따라 0 내지 100% 이다.

본 발명의 방법 중 가수분해 및/또는 탈착 단계에서 또한 세척 단계에서, 이동상은 염소화 당 유도체의 가수분해 또는 탈착을 돕는 촉매제를 함유할 수 있으 며, 이것은 특별히 한정되지는 않지만, 수산화나트륨, 수산화암모늄, 수산화칼륨, 수산화 칼슘 등의 형태로 존재하는 히드록실 이온이 될 수도 있다. 다른 가수분해제를 본 발명의 상기 구현예에 이용할 수도 있다.

본 발명의 방법에서, 가수분해 용리 이동상은 6-0-탈보호형 염소화 당 즉, TGS를 흡착한다. 용리 과정에서, 흡착제 메트릭스로부터 나온 염소화 당 유도체는 2 층부피 미만의 가수분해 용리 이동상의 농축 분획에 용리되며, 이때의 층부피란 상기 방법에 이용된 흡착제의 부피량을 나타내는 것이다. 수거된 용리물은 2% 이상의 TGS를 나타낸다. 상기 용리물을 저온에서 감압 증류하여 용리 이동상 함유 용매를 제거할 수 있으며 그 결과로서, 염소화 반응 혼합물에서보다 높은 농도의 TGS 용액을 얻는다. 상기 방법으로 회수한 TGS 용액은 추후 크로마토그래피로 정제하여 99% 이상의 순도를 갖는 TGS를 분리한다.

본 발명의 방법에서, 가수분해 용리 이동상 자체는 추가의 재생 단계 없이 흡착제 매트릭스의 재생 혹은 정치 세정(cleaning-in-place: CIP)를 행할 수 있다. 이 공정은 상기 방법의 총 처리기간을 단축하고 또한 시간당 흡착제의 단위부피당 생산성을 증가시키는데 도움을 준다.

본 발명에 따른 방법의 장점을 다음과 같이 요약할 수 있다:

(1) 염소화 반응기로부터 직접 수득하거나 또는 건조된 염소화 반응 혼합물을 용해하여 얻은 용액으로부터 제조된 pH 조정된 염소화 반응 혼합물을 이용하여 실행하는 흡착 단계에서, 보호된 TGS 및/또는 보호되거나 부분적으로 탈보호된 TGS를 포획, 가수분해, 또한 탈보호된 TGS 형태로 회수하는 동시에 3차 아미드 용매 같은 용매 및 염류의 제거를 단일 컬럼에서 수행할 수 있다.

(2) 다공성 흡착제 매트릭스를 재사용하므로 경제적인 통합 방법이다.

(3) 완전 가수분해된 염소형 당 유도체 TGS를 95% 이상의 수율로 제조한다.

(4) 규모 확장이 가능하므로 산업적 규모로 실행할 수 있다.

더욱 유리하게는, 충전층, 팽창층, 유동층, 액-고 순환형 유동층, 개선된 모사 이동층 혹은 막 크로마토그래피 방식 중 어느 것으로도 실행할 수 있으며 연속 조작이 가능하다.

흡착 및 친화성 크로마토그래피에 따른 본 발명의 분리 방법의 원리는 탈보호 및 탈보호된 염소화 당 유도체의 분리 공정의 어느 단계에나 적용할 수 있다. 상기 단계 중 일부에서는 다음과 같이 치환 혹은 변형이 가능하다. 즉, 친화적 흡착 크로마토그래피는:

(a) 중화된 염소화 당 유도체의 탈보호 전 또는 후에 적용할 수 있다.

(b) 3차 아미드 제거 전 또는 후에 적용할 수 있다.

(c) 상기 보호된 염소화 당 유도체로부터 3차 아미드 및 염류를 제거하기 위해 적용할 수 있다.

(d) 염류 (유기 및/또는 무기염류)를 부분 혹은 전체적으로 제거하기 전 또는 후에 적용할 수 있다.

(e) 추출, 크로마토그래피, 결정화, 증류 등의 기타 조작을 통해, 보호된 염소화 당 유도체를 부분 정제한 후 임의의 단계에서 적용할 수 있다.

(f) 통상의 컬럼 크로마토그래피의 대체 방법으로 이용할 수 있다.

(g) 하나 이상의 히드록실기 위치에서 보호되는 염소화 혹은 염소화되지 않은 당 유도체의 가수분해에 사용할 수 있다.

희석 수성 또는 수성-유기 용액으로부터 할로겐화된 당을 포획, 농축 및 결정하는 단계를 수반하는 본 발명의 또다른 구현예에 관한 상세한 내용은 다음과 같다.

정제된 혹은 부분 정제된 염소화 당 유도체의 수성 혹은 수성-유기 용액은 추출 또는 크로마토그래피 등의 공지 방법에 따라 수득되며, 상기 용액은:

(a) 보호 및/또는 탈보호되거나 부분적으로 탈보호된 히드록실기 함유의 할로겐화된 염소화 당 유도체;

(b) 물; 및/또는

(c) 알코올 (예, 메탄올, 이소프로필 알코올, 에탄올) 등의 유기 용매를 포함한다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 상기 공급 혼합물에 존재하는 할로겐화 화합물은 이용된 합성 경로 및 특정의 합성 조건에 따라 달라질 수 있다. 본 발명에서 사용하기 적합한 할로겐 원소는 브롬, 염소, 불소 및 요오드를 포함한다. 당업자라면 당해 분야의 공지 방법에 따라 다양한 위치에 동일한 할로겐 혹은 상이한 할로겐의 조합이나 치환물을 쉽게 충전할 수 있다. 이러한 종류의 공급물은 본 발명의 방법으로 취급할 수 있다.

본 발명의 또다른 구현예에서, 히드록실기 탈보호 혹은 보호된 할로겐화 당 유도체는 당의 모노클로로, 디클로로, 트리클로로 또는 테트라클로로 유도체나 이 들의 혼합물이며 공급 비히클에 함유된다.

본 발명의 방법을 이용하는 통상의 방법에서, 흡착제 매트릭스는 충전층이라고 부르는 흡착제 충전된 원통형 컬럼 등 단일 컬럼 크로마토그래프 장치를 이용하여 흡착제 1리터당 30gm 염소화 당 이상 충전된다. 회분식 교반 반응기에서도 상기 방법을 수행할 수는 있으나, 충전층 조작시 통상의 평형 제한 회분식 방법과 비교하여 염소화 당 유도체의 농도가 더 큰 용리액을 생성하는 결과를 가져왔다. 본 발명의 방법은 또한 팽창층, 유동층, 액-고 순환형 유동층 (LSCFB), 이동층, 모사 이동층 (SMB), 개선된 모사 이동층 (ISMB), 원심분리형 크로마토그래피 및 환형 크로마토그래피 등 기타의 흡착층 방식으로 조작 처리할 수도 있다.

따라서, 전형의 방법에서 염소화 당 유도체 함유의 수성 또는 수성-유기 용액은 컬럼의 흡착제 매트릭스에 충전 및 흡착되었다. 충전 단계에 이어서 중력에 의해 혹은 펌프나 가압 기체 등 적절한 추진 수단에 의해 상기 컬럼을 빠져나고, 다시 기체를 이용하여 정화시켜 매트릭스층에 함유된 유리수 혹은 수-용매 혼합물을 거의 대부분 제거한다. 정화용 기체는 질소나 공기 혹은 그의 혼합물이었다. TGS를 포함한 흡착된 당 유도체의 탈착은 용매나 용매의 혼합물을 이용하여 실시했다. 사용된 용매는 특별한 한정되지는 않지만 알코올 (메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올), 아세토니트릴, 염소화 유기 용매 (클로로포름, 디클로로메탄, 디클로로에탄), 톨루엔, 에스테르 (부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트), 케톤류 (아세톤, 메틸이소부틸케톤), 및 이들 중 하나 이상의 적절한 조합물로 구성된 용매군으로부터 선택되었다.

본 발명의 방법에 있어서, 특별히 한정되지는 않지만, 산 (예를 들어, 인산, 아세트산, 염산, 황산, 펜탄 술폰산, 트리플루오로 아세트산, 부티르산) 및/또는 염기 (예를 들어, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 수산화암모늄), 및 이들 중 하나 이상의 적절한 조합물을 포함하는 이동상 개질제를 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 식용 염류, 산 및 알칼리가 바람직하게 이용된다.

본 발명의 방법은 0 내지 80℃, 바람직하게는 비용 측면을 고려하여 보편적인 상온에서 수행된다.

흡착된 염소화 당 유도체는 용매 함유의 용리 이동상에 대하여 2.0 층부피 이하, 바람직하게는 1.5 층부피 이하의 양으로 용리된다. "층부피"란 컬럼 혹은 용기 내에 정착된 흡착제 매트릭스의 용적을 말한다. HPLC 및 칼 피셔법으로 분석한 결과, 용리 분획에는 TGS 같은 염소화 당 유도체의 함량이 5중량% (w/v) 이상이고 수분 함량 5부피% (v/v) 이하인 것으로 각각 확인되었다. 상기 염소화 유도체의 공급 함량을 기준으로 할 때 회수율은 90% 이상이고, 경우에 따라 100%에 이르는 높은 값을 갖는다.

또한, 농축물의 결정화는 용리 이동상 용매의 증류/증발 후에 실행되거나, 또는 염소화 당 유도체의 90% 이상을 회수하기 위하여 증류/증발과 함께 실행할 수도 있다. 본 발명의 구현예에서, 상기 염소화 당 유도체가 가용성이거나 혹은 부분 가용성인 용매를 또다른 구현예의 증류/증발 산물에 부가할 수 있으며, 용매 조합물 혹은 혼합물은 순수한 염소화 당 유도체를 회수하기 에 적합한 비율로 이용된 다. 본 발명의 방법에서 용매의 혼합물 또는 조합물을 결정화에 이용할 수 있으며, 용매 중 하나는 TGS 같은 염소화 당 유도체가 완전히 혹은 부분적으로 가용성이며 또다른 용매는 상기 TGS에 대하여 저용해도 혹은 극저의 용해도를 갖는다. 이러한 용매는 특별히 한정되지 않지만, 염소화 용매 (예를 들면, 염화메틸렌, 클로로포름, 에틸렌 디클로라이드 등), 에스테르 (예를 들어, 에틸 아세테이트 및 부틸 아세테이트), 알코올 (예를 들어, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 이소프로판올 등), 케톤류 (예를 들어, 메틸이소부틸케톤, 메틸에틸케톤 등) 등으로부터 선택될 수 있다.

또한, 흡착성 크로마토그래프법으로 수득한 농축물은 증류/증발할 수 있으며 궁극적으로 염소화 당 유도체는 공지의 방법에 따라 용매로부터 결정화될 수 있다.

본 발명에 따른 방법의 장점을 다음과 같이 요약할 수 있다:

(a) 본 발명의 방법은 수분 제거 및 온도 민감성 산물의 농축에 특히 적합하다.

(b) 다량의 물을 증류시킬 필요가 없으며 따라서 에너지 절약이 가능하다.

(c) 재생 후 흡착제를 재사용할 수 있으므로 경제적이다.

(d) 상기 물질의 결정화 후 수득한 염소화 당 유도체의 수율 및 순도를 향상시킨다.

(e) 99% 이상의 순도 및 95% 이상의 수율로서 염소화 당 유도체 TGS를 제공한다.

(f) 본 발명의 방법은 화학 변화에 적합한 용리제의 사용에 의존하여 염소화 당이나 이의 화합물을 수반하는 하나 이상의 화학 개질 단계로서, 특별히 한정되지 는 않지만, 컬럼 내에서의 탈아실화 등을 포함할 수 있으며 이와 동시에 크로마토그래피에 의한 분리 공정이 진행된다.

(g) 규모 확대가 가능하므로 간단한 충전층 크로마토그래피 컬럼 혹은 기타의 컬럼형 접촉 반응기와 함께 산업적 규모에 쉽게 순응할 수 있다.

상기와 같은 수분 제거 및 농축 방식을 염소화 당 유도체 또는 그 중간물의 분리 및 정제 공정에서 중간체 단계에도 적용할 수 있다. 상기 단계 중에는 변형물 치환 혹은 도입이 가능한 경우도 있으며 이는 다음과 같다:

(a) 염소화 당 유도체의 탈보호 전 또는 후에 적용할 수 있다.

(b) 정제 혹은 부분 정제된 염소화 당 유도체의 효소적 혹은 화학적 탈보호 후에 적용할 수 있다.

(c) 3차 아미드 제거 전 또는 후에 적용할 수 있다.

(d) 추출, 크로마토그래피 등 기타의 조작을 통해 염소화 당 유도체의 부분 정제후 임의의 단계에서 적용할 수 있다.

(d) 수분 제거를 위해 통상의 추출 및 증류의 대체 방법으로서 이용될 수 있다.

(f) 상기 염소화 당 유도체의 제조에 이용되는 염소화 당 중간 화합물의 정제나 분리 후에 적용할 수 있다.

본 발명은 이의 주요 구현예를 다음의 비제한적인 실시예를 통해 예시한다. 이들 실시예는 예시를 목적으로 하며 실시예에 개시된 반응물, 반응 조건, 흡착제, 화학물질 등으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다. 당업자라면 본 발명의 범위 내에서 본 발명을 수정 또는 변경할 수 있음을 이해할 것이다. 또한 작업 과정에서 시판중인 흡착제를 사용하였으나 본 발명은 이들 제품에 특별한 한정되는 것은 아니며 이들과 동등하거나 유사한 특성을 갖는 그외의 적합한 흡착제 이형물도 마찬가지로 포함한다.

본 상세한 설명에서 허용하지 않는 경우를 제외하고, 단수로 명시한 부분은 복수형도 포함하는 것으로 한다. 따라서, 단수형의 "방법"은 "방법들"을 포함한다 즉, 상기 용어가 가리키는 대상물에 관한 모든 방법을 포함한다. 단수형 명시는 또한 동일한 종류에 해당하는 모든 등가물도 포함한다. 따라서 "용매"는 본 발명의 상세한 설명 또는 특허 청구항에 상세히 기술된 기능을 달성하기 위해 이용될 수 있는 모든 용매를 포함한다.

실시예 1: 포획, 정제 및 3차 아미드 제거

20g의 TGS 및 기타의 염소화 당 유도체를 함유하는 2.0리터의 중화된 반응물과 함께 무기 및 유기염류와 0.480kg의 3차 아미드를 정제 및 3차 아미드 제거 실험에 이용했다. 공급물을 스테인레스강 어댑터가 장착되고 사전평형화된 0.40리터의 SEPABEADS SP825 (미츠비시 화학, 일본)을 충전한 보로실리케이트 유리 흡착 컬럼에 통과시켰다. 펌프를 이용하여 1.50리터/시간의 유속으로 상기 공급물을 충전한 후 탈염수로 세척했다. 흡착된 TGS는 1.0리터의 5.0% 이소프로필 알코올 수용액을 이용하여 흡착제 매트릭스로부터 선택적으로 용리했다. 무정치, 세척 및 용리 분획들을 TGS 및 3차 아미드에 대해 HPLC 및 GC를 이용하여 각각 분석했다. 무정치 및 세척 분획은 HPLC 상에서 TGC를 나타내지 않으며 이는 반응물로부터 TGS를 흡착 하는 흡착제의 효율이 100%에 달한다는 것을 가리킨다. GC 결과는 미흡착 분획에 함유된 3차 아미드의 양이 0.478kg인 것을 보여준다. 0.63리터의 용리 분획은 HPLC 상에서 순도 95.30%의 TGS의 함량이 총 19.72gm인 것을 보여준다. GC 결과는 용리 분획에 3차 아미드가 함유되어 있지 않음을 보여준다. 출발 반응물의 TGS와 3차 아미드의 함량에 관련된 수율은 각각 용리 분획 중에서 98.60% 및 미흡착 분획 중에서 99.58%에 달하였다.

실시예 2: 포획, 정제 및 DMF 제거

5.40kg의 TGS 및 기타의 염소화 당 유도체를 함유하는 910리터의 중화된 반응물과 함께 무기 및 유기염류와 110kg의 DMF를 스테인레스강 컬럼에 충전된 180리터의 SEPABEADS SP700 (미츠비시 화학, 일본)에 공급하여 2.4미터의 층높이를 형성했다. 공급 펌프를 이용하여 8.3리터/시간의 유속으로 상기 공급물을 충전한 후 탈염수로 세척했다. 흡착된 TGS는 900리터의 25.0% 메탄올 수용액을 이용하여 흡착제 매트릭스로부터 선택적으로 용리했다. TLC 상에서 TGS를 나타내는 총 650리터의 용리 분획을 수거했다. HPLC로 분석한 무정치 및 세척 분획은 0.080kg의 TGC를 나타냈으며 이는 반응물로부터 TGS를 흡착하는 흡착제의 효율이 98.5%인 것을 가리킨다. 무정치 분획의 TLC 분석 결과, 당의 모노클로로, 디클로로, 트리클로로 및 테트라클로로 유도체는 존재하지 않는 반면 세척 분획의 TLC 분석에서는 모노클로로 및 디클로로 유도체가 존재하는 것으로 나타났다. 이는, 매트릭스가 트리클로로 및 테트라클로로 유도체보다 모노클로로 및 디클로로 유도체에 대한 친화도가 낮다는 것을 가리킨다. GS 결과는 미흡착 분획 중에 총 108.2kg의 DMF가 포함된 것을 보여 준다. 650리터의 용리 분획은 HPLC 상에서 순도 96.80%의 TGS의 함량이 총 5.30kg인 것을 보여준다. GC 결과는 용리 분획에 DMF가 함유되어 있지 않음을 보여준다. 출발 반응물의 TGS와 DMF의 함량에 관련된 수율은 각각 용리 분획 중에서 98.15% 및 미흡착 분획 중에서 99.27%이었다.

실시예 3: TGS 흐름의 연마 정제

실시예 2에서와 같은 실험에서 수득한 용리 분획에는 당의 디클로로 및 모노클로로 유도체가 미량 존재하며, 이것을 연마 정제 단계에서 제거한다. 이 경우, 상기 실시예 2에서 설명한 바와 같은 실험을 거치고 메탄올을 증류 제거한 후 수득한, 분리된 TGS 13.32kg을 3.98미터의 층높이를 갖는 500리터의 SEPABEADS SP207 (미츠비시 화학, 일본) 수지 컬럼에 6.6리터/분의 유속으로 충전했다. TGS 및 잔류의 모노클로로 및 디클로로 유도체가 모두 매트릭스에 흡착되었다. 흡착된 염소화 당 유도체는 35% 메탄올 수용액을 이용하여 등용매 용리했다. 210리터의 용리 분획은 TLC 분석시 농축된 모노클로로 및 디클로로 유도체를 나타내는 반면 TGS는 존재하지 않는 것으로 나타났다. 또한 TLC 분석 결과, 1600리터의 용리 분획은 12.97kg의 TGS을 함유하는 반면 염소화 유도체는 존재하지 않았다. 총 97.52%의 TGS를 회수하였으며 이것은 HPCL 분석에서 99.39%의 순도를 갖는 것으로 나타났다.

실시예 4: 반응물로부터 포획, 정제 및 DMF 제거를 위한 팽창층 및 유동층 크로마토그래피

이 방법은 5.0cm 직경의 유리 컬럼에 충전한 1.0리터의 SEPABEADS SP700 또는 SEPABEADS SP207 (미츠비시 화학, 일본), XAD 16 (Rohm and Haaas, U.S.A.) 또 는 ADS 600 (Thermax, 인도)를 각각 이용하여 팽창층 및 유동층 방식으로 실시했다. 흡착제에 60gm의 TSC-6-아세테이트 및 기타의 염소화 당 유도체를 함유한 5.0리터의 중화된 반응물을 무기 및 유기염류와 1.2kg의 3차 아미드 용매와 함께, 각 흡착제에 충전했다. 팽창층에 이용된 팽창도는 1.4인 반면 유동층의 경우 충전층 높이의 2배였다. 이 실험은 상향류 방식으로 실행했다. 흡착된 염소화 당 유도체는 하향류 방식으로 등용매 용리되었다. 이 걸과를 다음의 표 1에 요약하였다 (TGS-6-아세테이트를 가수분해한 후 TGS에 대해 분석했다).

표 1

번호	내용	팽창층법				유동층법
		SP700	SP207	XAD16	ADS600	SP700	SP207	XAD16	ADS600
1	TGS 흡착 (gm)	59.6	59.8	56.0	56.3	58.2	59.5	56.2	56.4
2	비정치 및 세척 분획내 3차 아미드 (kg)	1.2	1.2	1.18	1.68	1.2	1.2	1.17	1.64
3	TGS 흡착효율 (%)	99.3	99.7	93.3	93.8	97.0	99.2	93.6	94.0
4	총 TGS회수량 (gm)	59.4	58.2	54.0	52.5	58.0	56.3	45.2	49.4
5	총 TGS 회수율 (%)	99.0	97.0	90	87.5	96.6	93.8	74.3	82.3
6	연마 정제전 회수된 TGS의 순도 (%)	95.3	96.8	92.2	90.1	98.2	97.5	91.4	89.2
7	TGS 용리 분획내 3차 아미드 함량 (%)	무시	무시	0.0031	무시	무시	무시	0.0022	0.0025

실시예 5: 반응물로부터 포획, 정제 및 DMF 제거를 위한 이동층 크로마토그래피

1.0리터의 SEPABEADS SP70 또는 SEPABEADS SP700 (미츠비시 화학, 일본)을 이용하여 액-고 이동층에서 상술한 TGS 등의 염소화 당 유도체 (탈보호, 보호 혹은 부분 탈보호된)를 정제했다. 이동층 크로마토그래피 시스템은 공급 흐름이 향류(counter-current:역흐름)로서, 상향이동시 컬럼 아래로 이동하는 수지로 조작한다. 흡착 용질을 함유한 수지를 또다른 평행 컬럼에 담고 산물을 병류(co-current:정흐름) 혹은 향류 방식으로 연속 용리했다. 이 실시예에서, 상기 염소화 당 유도체 및 DMF인 3차 아미드 용매를 함유하는 반응 혼합물은 5.0cm 직경의 주흡착 컬럼에 연속으로 공급되었다. 산물은 주컬럼 하단 영역에서 세척한 후 1.5cm 직경의 제2 병류 컬럼에서 연속 용리했다. 용리된 흡착제는 고-액 분리기를 거쳐 주컬럼 상단으로 재순환시켰다. DMF와 염류는 주컬럼 상단 유출구로부터 연속으로 수거하였다. 상기 시스템은 제1 컬럼에서의 향류 흡착 때문에 고흡착 효율 및 낮은 높이의 흡착 영역을 갖는다.

실시예 6: 트리클로로 당 유도체의 정제 및 연마 정제

60g의 TGS 및 기타 염소화 당 유도체를 함유한 6.0리터의 중화된 반응물을 무기염류 및 2.0kg의 3차 아미드와 함께 1.5리터/시간의 유속으로 1.5리터의 DIAION HP2MG (미츠비시 화학, 일본)에 통과시켰다. 염소화 당 유도체가 매트릭스의 리간드에 흡착된 반면 미흡착 분획은 DMF 및 무기염류를 함유했다. 이들 분획에 서 총 1.98kg의 DMF를 수거했다. 흡착된 매트릭스를 2.0 층부피의 탈염수로 세척하여 흡착 DMF 및 무기물을 씻어냈다. 당의 디클로로 및 트리클로로 유도체를 5.6 층부피의 30% 메탄올 수용액으로 용리했다. 테트라클로로 당 유도체는 리간드 바닥에 남아있다. 용리 분획은 40 내지 60℃에서 감압하에 메탄올을 제거하기 위해 증류처리했다. 디클로로 및 트리클로로 유도체 함유 분획은 추후 정제를 위해 2.0리터의 SEPABEADS SP207SS (미츠비시 화학, 일본)가 함유된 연마 정제 컬럼을 통과시켰다. 이 때, 40% 메탄올 수용액로 용리하는 경우 디클로로 유도체를 제1 분획에서 분리했다. 1.0 층부피의 디클로로 불순물을 우선적으로 수거했다. 후속의 3.0 층부피는 순수한 트리클로로 유도체로 구성되어 있다. HPLC 결과에서, 98%의 트리클로로 유도체가 99.6%의 순도로 회수되는 것을 확인하였다. 상기 분획을 증류 및 결정화 처리하여 메탄올을 제거했다.

실시예 7: TGS 의 연마 정제

실시예 2에서와 같은 방식으로 수득한 용리 분획은, 연마 정제 단계에서 DIAION HP20SS, SEPABEADS SP207SS 또는 SEPABEADS SP20SS 컬럼을 이용하여 제거한 TGS에 함유된 디클로 및 모노클로로 당 유도체을 미량 함유하는 것으로 나타났다. 200ml의 각 매트릭스를 컬럼에 충전하여 2미터의 층높이를 형성하였다. 4.5g의 TGS를 각 컬럼에 채우고 1.0 층부피의 알칼리수(pH9.8)로 세척한 뒤 다시 1.0 층부피의 중성수(pH7.0)로 세척했다. 여기서 얻어진 산물을, 한가지 방법으로 0 내지 50% 구배의 메탄올 수용액을 이용하는 구배법과 또다른 방법으로 35% 등용매 메탄올 용액을 이용하는 등용매법을 통해 용리했다. 두가지 분획 즉, 불순물을 함유하는 분 획과 TGS를 함유하는 순수 분획을 수득했다. 상기 매트릭스를 이용하여 얻은 회수율 및 순도를 다음의 표 2에서 요약했다.

표 2

번호	내용	HP20SS		SP207SS		SP20SS
		등용매법	구배법	등용매법	구배법	등용매법	구배법
1	순수 TGS 회수율(%)	96.2	97.5	98.8	98.2	95.8	94.7
2	회수된 순수 TGS의 순도 (%)	98.5	98.8	99.3	99.2	94.2	96.8
3	불순물 분획 내의 TGS 함량 (%)	3.8	2.5	1.2	1.8	4.2	5.3

실시예 8: TGS 수용액으로부터의 TGS 분리 및 결정화

추출후 수득한 10gm의 순수 TGS를 함유하는 1000ml의 수용액을 스텐레스강 어댑터가 장착되고 또한 사전평형화된 120ml의 SEPABEADS 700 (미츠비시 화학, 일본)을 충전한 보로실리케이트 유리 흡착 컬럼에 통과시켰다. 펌프를 이용하여 25mL/분의 유속으로 상기 공급물을 충전한 후 중력하에 배출했다. 컬럼을 공기로 15분간 정화 세정하여 매트릭스층의 공극으로부터 물을 제거했다. 흡착된 TGS는 200ml의 1:1 조성의 메탄올:부탄올 혼합물을 이용하여 흡착제 매트릭스로부터 탈착했다. 용리 과정에서 초기에 0.3 층부피의 물을 별도의 분획으로 수거한 뒤 99.2%의 TGS를 함유하는 70ml의 분획을 추가로 얻었다. 이것을 HPLC로 분석한 결과 TGS의 농도가 14.2%인 것으로 나타났다. 칼 피셔법 분석에서 수분 함량은 2.8%으로 나타났다. 용리 분획은 다시 증류하여 잔류 수분 및 부탄올을 제거하고 또한 염화메 틸렌과 에틸 아세테이트 혼합물을 이용하여 결정화 처리했다. 결정화된 산물의 순도는 HPLC에서 99.5%로 나타났다.

실시예 9: TGS 수용액으로부터의 TGS 분리 및 결정화 (킬로그램 규모)

310mm의 직경을 가진 스텐레스강 컬럼에 225리터의 SEPABEADS SP700 (미츠비시 화학, 일본)를 충전했다. 매트릭스를 세척하고 pH7.5의 물로 평형화했다. 2%의 메탄올 및 98%의 물을 함유하는 수용액에 컬럼 크로마토그래피에서 수득한 정제된 TGS 13kg를 용해시켜 얻은 용액을 6리터/분의 유속으로 컬럼에 충전했다. 충전후 이 용액을 컬럼으로부터 6.0리터/분의 유속으로 중력 배출하고 공기로 컬럼을 정화 세정하여 크로마토그래피층에 함유된 물을 제거했다. 350리터의 55:45 조성의 메탄올:부탄올 혼합물로 탈착 처리했다. 탈착 과정에서, 80리터의 물을 수거한 뒤 산물의 분획을 별도로 수거했다. 총 12.9kg의 TGS를 180리터의 용리액에서 7.2중량% (w/v) 용액 형태로 회수했다. 칼피셔법으로 분석한 결과 회수율은 99.2%이고 수분함량은 1.8%이었다. 이 용액을 50℃에서 감압 증류하여 부탄올과 메탄올을 제거했고 이 중의 수분함량은 1.8%로서 부탄올-물의 공비 혼합물 형태로 제거되었다. 최종물은 메탄올 디클로라이드로부터 결정화하여 공급물 기준으로 96%의 TGS를 수득했다. 결정화된 산물의 순도는 HPLC 분석에서 99.3%로 나타났다. TGS를 전량 회수하기 위해 잔류 모액은 용매 제거후 다음 처리 주기로 재순환했다.

실시예 10: TGS -아세테이트 수용액으로부터의 TGS -아세테이트의 분리 및 결정화

310mm 직경을 가진 스텐레스강 컬럼에 225리터의 SEPABEADS SP207 (미츠비시 화학, 일본)를 충전했다. 매트릭스를 세척하고 pH6.5의 물로 평형화했다. 추출후 95%의 물을 함유하는 수성-유기 용액에 용해된 15kg의 부분 정제된 TGS-AC 용액을 매트릭스에 충전했다. 질소 기체로 컬럼을 정화 세정하고 물을 배출 제거한 뒤 350리터의 55:45 조성의 메탄올:부탄올 혼합물로 탈착 처리했다. 탈착 과정에서, 90리터의 물을 수거한 뒤 200리터의 산물 분획을 별도로 수거했다. 총 14.2kg의 TGS-AC를 200리터의 용리상에서 7.5중량% (w/v) 용액 형태로 회수했으며 칼피셔법으로 분석한 결과, 회수율은 94.7%이고 수분함량은 3.2%이었다. 상기 용액을 실시예 2에서와 같이 처리하여 13.7kg의 TGS-AC를 수득했다.

실시예 11: 포획, 3차 아미드 제거, 6-O-보호된 TGS 의 가수분해 및 TGS 의 회수

21gm의 6-O-보호된 TGS 및 기타의 염소화 당 유도체를 함유하는 2.0리터의 중화된 반응물과 함께 무기 및 유기염류와 0.5kg의 3차 아미드를, 양 말단에 스테인레스강 유동 어댑터가 장착되고 사전평형화된 0.40리터의 SEPABEADS SP700 (미츠비시 화학, 일본)을 충전한 보로실리케이트 유리 흡착 컬럼에 통과시켰다. 펌프를 이용하여 1.2리터/시간의 유속으로 상기 공급물을 충전한 후 탈염수로 세척하여 미흡착물을 제거했다. 흡착된 6-O-보호된 TGS 및 기타의 염소화 당 유도체를 70% 메틸 알코올, 2.5%의 암모니아 및 나머지로 물을 함유하는 1.0리터의 가수분해 용리 이동상을 이용하여 흡착제 매트릭스로부터 용리했다. 무정치, 세척 및 가수분해 용리 분획은 각각 HPLC 및 GC에 따라, TGS 물질인 6-O-보호된 TGS와 3차 아미드를 분석했다. 6-O-보호된 염소화 당은 또한 TLC로 분석했다. 무정치 및 세척 분획은 HPLC 상에서 TGC를 나타내지 않으며 TLC에서는 반응물로부터 나온 6-O-보호된 TGS에 대한 흡착 효율이 100%인 것으로 나타났다. GC 분석 결과, 미흡착 분획에 함유된 3차 아미드의 총량은 0.496kg이었다. 0.5리터의 용리 분획은 TLC 상에서 TGS의 총량이 20.8gm인 반면 6-O-보호된 TGS는 존재하지 않는 것으로 나타났다. GC 결과는 용리 분획에 3차 아미드가 함유되어 있지 않음을 보여준다. 출발 반응물의 TGS와 3차 아미드의 함량에 관련된 수율은 각각 용리 분획 중에서 99.04% 및 미흡착 분획 중에서 99.2%에 달하였다.

실시예 12: 포획, 3차 아미드 제거, 6-O-보호된 TGS 및 TGS 회수의 규모 확대

12kg의 6-O-보호된 TGS 및 350kg의 DMF를 함유하는 1400리터의 중화된 반응물을 300mm 직경의 스테인레스강 컬럼에 충전된 230리터의 SEPABEADS SP700 (미츠비시 화학, 일본)에 공급했다. 공급 펌프를 이용하여 6.0리터/분의 유속으로 상기 공급물을 충전한 후 탈염수로 세척했다. 무정치 및 세척 분획은 HPLC 및 TLC 분석에서 6-O-보호된 TGS가 존재하지 않는 것으로 나타났다. 따라서, 상기 TGS 전구물질에 대한 흡착 효율은 100%이었다. 6-O-탈보호된 TGS를 수득하기 위해 상기 흡착된 6-O-보호된 TGS를 다시 850리터의 가수분해 용리 이동상으로 용리했다. 가수분해 용리 이동상의 조성은 80:2.5:17.5의 메탄올;암모니아:물로 구성되어 있다. 가수분해된 6-O-보호된 TGS를 450리터의 용리 분획에서 농축물 형태로 회수했다. 용리시 TGS의 농도는 2.64%로서 TGS의 총량 11.89kg에 해당한다. 용리 분획의 GC 분석 결과, 미흡착 및 세척 분획은 347.8kg의 DMF를 함유한 것으로 나타났다. TGS 및 DMF의 회수율은 각각 99.1% 및 99.37% 이었다.

실시예 13: 포획, 3차 아미드 제거, 6-O-보호된 TGS 의 가수분해 및 TGS 의 회수를 위한 본 발명의 방법에서 팽창층 크로마토그래피의 이용 방법

이 방법은 양 말단에 스텐레스강 어댑터를 장착한 5.0cm 직경의 유리 컬럼에 충전된 1.0리터의 SEPABEADS SP207 (미츠비시 화학, 일본)의 팽창층에서 실행했다. 흡착제에 상향류 방향으로 5.0리터의 중화 반응 혼합물을 충전했다. 충전된 반응 혼합물은 60gm의 6-O-보호된 TGS 및 기타의 염소화 당 유도체와 함께 무기 및 유기염류와 1.2kg의 3차 아미드 용매를 함유한다. 팽창도는 충전 동안 1.5로 유지했다. 흡착된 매트릭스를 2.0 층부피의 0.1M 수산화나트륨 용액으로 세척 (1.0 층부피는 팽창층 방식으로, 나머지 1.0 층부피는 충전층 방식으로 세척)하였다. 이어서 가수분해 용리 이동상을 이용하여 용리했다. 80%의 이소프로필 알코올과 3.75%의 암모니아를 함유하는 3.6 층부피의 가수분해 용리 이동상을 컬럼에 통과시켜 6-O-탈보호된 TGS가 함유된 1.2 층부피의 농축 분획을 수거했다. 이동상의 잔류물은 재생 이동상 역할을 하며 별도로 수거했다. 용리는 충전층 방식에 따라 하향류 방향으로 실행되었다. 1.2 층부피의 용리액에서 4.83%의 용액 형태로 총 58gm의 TGS가 수거되었으며, 잔류 6-O-보호된 TGS 및 DMF는 존재하지 않았다. 컬럼 상단에서 수거된 미흡착 및 세척 분획은 DMF로서 1.18kg의 3차 아미드를 함유하는 것으로 나타났다. TGS의 수율은 96.67%인 반면 DMF 수율은 98.3%이었다.

실시예 14: 매트릭스의 효능 및 재활용도

산물의 순도 및 회수율 측면에서 본 발명에 따른 방법의 효능 및 재활용도를 50회의 실험에 관하여 도 1에 도시한다. 이 실험은, 실시예 6에서 보는 바와 같이, 본 발명에 있어서 SEPABEADS SP700 (미츠비시 화학, 일본)를 이용한 정화 효능을 비교하기 위한 것으로서, 매트릭스 용량(gm/리터), TGS 회수율 (%) 및 DMF 회수율 (%) 등을 비교하였다. 비교 결과, 재생 이동상을 이용하는 흡착제 매트릭스가 우수한 정치 세정(CIP) 효과를 나타내었다. 95:1:5 조성의 메탄올:암모니아:물의 용액을 이동상으로 이용하여 상기 매트릭스를 재생 사용하였다. 매트릭스는 50회의 실험후에도 일관된 효능을 나타내므로 재활용할 수 있어 처리 공정의 경제성이 향상된다.

본 발명은 TGS(즉, 1-6-디클로로-1-6-디데옥시-β-프룩토푸라나실-4-클로로-4-데옥시-갈락토피라노사이드)를 함유하는 염소화 당 화합물, 그의 중간체나 유도체를 함유하는 용액이나 반응 혼합물로부터 친화성 및/또는 소수성 흡착 크로마토그래피를 통해 상기 TGS 산물 또는 그의 중간체나 유도체를 정제하는 새로운 방법에 관한 것으로서, 상기 방법에 따라 얻은 염소화 당 유도체는 불순물, 염류 및 유기 용매를 함유하지 않으며 95% 이상의 고회수율로 수득할 수 있다.

Claims (11)

1. 하나 이상의 염소화 당 화합물의 분리, 정제, 농축, 탈수, 또한 탈에스테르화 등을 포함한 하나 이상의 화학적 개질 단계를 포함하는 분리 방법으로서, 상기 염소화 당 화합물은 공정 흐름으로부터 얻은 상기 염소화 당 화합물의 전구물질 및 유도체를 포함하고, 또한 상기 방법은:

   (a) 상기 공정 흐름을 흡착제와 접촉시켜 흡착제 상에 상술한 하나 이상의 염소화 당 화합물을 선택적 포획하고 상기 공정 흐름의 기타 성분들을 배제하는 것으로서, 이때의 흡착제는 실리카겔이나 다공성 혹은 겔형 양이온 교환 수지가 아닌 것을 특징으로 하는 단계;

   (b) 화학적 무변화형 혹은 탈에스테르형을 포함한 화학적 변화형으로 상기 흡착제로부터 하나 이상의 흡착된 염소화 당 화합물을 개별적으로 선택 용리하거나 또는 관련된 염소화 화합물군을 용리하는 것으로서, 이때의 흡착제는 실리카겔이나 다공성 혹은 결형 양이온 교환 수지가 아닌 것을 특징으로 하는 용리 단계; 및

   (c) 염소화 당 화합물의 분리 및 정제 공정을 포함한 후속의 산물 제조 단계에서 상기 (b) 단계의 용리제를 이용하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
2. 제 1항에 있어서,

   (a) 상기 공정 흐름이나 반응 혼합물은, 염소화 당이나 그의 전구물질 또는 유도체의 합성 또는 정제 단계 중에서 생성된 조성물을 포함하고, 물을 함유하거나 함유하지 않는 반응물 또는 산물의 용액을 포함하며 이들 각각은, (i) 글루코스-6-아세테이트와 글루코스-6-벤조에이트 등을 포함한 글루코스-6-에스테르, (ii) 수크로스-6-아세테이트 및 수크로스-6-벤조에이트 등을 포함한 수크로스-6-에스테르, (iii) 1-6-디클로로-1-6-디데옥시-β-프루고푸라노실-4-클로로-4-데옥시-갈락토피라노사이드, 약칭하여 TGS, (iv) TGS-6-아세테이트 및 TGS-6-벤조에이트 등을 포함한 TGS-6-에스테르, (v) 테트라클로로-6-아세테이트 및 테트라클로로-6-벤조에이트 등을 포함한 테트라클로로 수크로스 에스테르, (vi) 테트라클로로 수크로스, (vii) 디클로로-6-아세테이트 및 디클로로-6-벤조에이트를 포함한 디클로로 수크로스 에스테르, (viii) 디클로로 수크로스, (ix) 무기 염류, (x) 유기 염류, (xi) 부유 고형물, (xii) 3차 아미드, (xiii) 가용성 효소, (xiv) 부동형 효소, (xv) 펜타 아세틸 수크로스, (xvi) 수크로스 알킬 4,6-오르토아실레이트, (xvii) 수크로스 2,3,6,3',4'-펜타 에스테르, (xviii) 수크로스 6,4'-디에스테르, (xix) 4',6-디-O-아세틸수크로스, (xx) 6-O-아세틸수크로스, (xxi) 2,3,6,3'-수크로스 테트라아세테이트, (xxii) 수크로스 알킬 4, (xxiii) 6-오르토에스테르, (xxiv) 수크로스 옥타아실레이트, (xxv) 수크로스 헵타아실레이트 및 수크로스 헥사아실레이트, (xxvi) 수크로스 알킬 4,6-오르토에스테르, (xxvii) 수크로스 4-에스테르, (xviii) TGS 펜타 아세테이트, 펜타 프로피오네이트, 펜타 부티레이트, 펜타 글루타레이트, 펜타 라우레이트를 포함한 TGS 펜타 아실레이트, 및 (xix) 카라멜화 산물 등에서 선택된 하나 이상의 물질을 포함하고;

   (b) 상기 염소화 당의 전구물질은 (i) 글루코스, (ii) 수크로스, (iii) 수크로스-6-아세테이트 및 수크로스-6-벤조에이트를 포함한 수크로스-6-에스테르, (iv) TGS-6-아세테이트 및 TGS-6-벤조에이트를 포함한 TGS-6-에스테르, (v) 테트라클로로아피노스, (vi) 펜타 아실 수크로스, (vii) 수크로스 알킬 4,6-오르토아실레이트, (viii) 수크로스 2,3,6,3',4'-펜타 에스테르, (ix) 수크로스 6,4'-디에스테르, (x) 4',6-디-O-아세틸수크로스, (xi) 6-O-아세틸수크로스, 2,3,6,3'-수크로스 테트라아세테이트, (xii) 수크로스 알킬 4,6-오르토에스테르, (xiii) 수크로스 옥타아실레이트, (xiv) 수크로스 헵타아실레이트 및 수크로스 헥사아실레이트, (xv) 수크로스 알킬 4,6-오르토에스테르, (xvi) 수크로스 4-에스테르 등에서 선택된 하나 이상을 포함하고;

   (c) 상기 염소화 당의 유도체는 TGS 펜타 아세테이트, TGS 펜타 프로피오네이트, TGS 펜타 부티레이트, TGS 펜타 글루타레이트, TGS 펜타 라우레이트 등과 같은 TGS 펜타 아실레이트를 추가로 더 포함한 펜타아실레이트를 포함하고;

   (d) 상기 흡착제 매트릭스는 염소화 당 화합물과 상호반응할 수 있으며 또한, (i) 비술폰산 수지, (ii) 비이온성 수지, (iii) 음이온 교환 수지, (iv) 표면기를 가진 것으로서 염소화 당과의 상호반응력이 있는 수지, (v) 경질 다공성 수지, (vi) 막 형태의 수지, (vii) 합성 또는 자연 고분자계 매트릭스를 가진 수지, (viii) 폴리스티렌, 디비닐벤젠 (PSDVB), 폴리메타크릴레이트, 폴리아크릴아미드 등의 합성계 매트릭스를 가진 수지, (ix) 한천, 셀룰로오스, 키토산, 덱스트란 등의 자연 고분자계 매트릭스를 가진 수지, (x) 가교결합 수지, (xi) C2-C18 탄소 원 자를 가진 치환기로서 방향족 및/또는 지방족 성분을 함유한 개질 실리카, (xii),(xiii) 공지의 활성화 화학반응에 의해 기저 매트릭스에 그라프트되거나 기저 매트릭스의 일부인 상호반응기를 가진 개질 실리카, (xiv) 상기 상호반응기가 C1-C18 탄소 분자의 불포화 혹은 포화 지방족 및/또는 방향족 성분인 개질 실리카, (xv) 상기 상호반응기가 할로겐 원자인 개질 실리카, (xvi) 상기 상호반응기가 시아노, 디올 또는 아미노인 개질 실리카, (xvii) 상이한 염소화 당에 대한 상이한 상호반응력이나 친화력 또는 결합강도를 갖는 상호반응기를 가진 개질 실리카, (xviii) 미다공성, 거대다공성, 메조다공성, 기가다공성, 초거대다공성 혹은 중공성 실리카, (xix) 하나 이상의 합성 또는 자연 고분자 매트릭스에 기초하며 아미노(1차, 2차 또는 3차) 또는 이미노 성분을 함유하는 복합형 혹은 음이온 교환 매트릭스, (xx) PSDVB, 폴리메타크릴레이트 및 폴리아크릴아미드를 포함하는 하나 이상의 고분자, 히드록실기나 디올기를 가진 자연 고분자 및 이들의 조합물에 기초한 매트릭스, (xxi) 소수성기를 가진 고분자에 기초한 매트릭스를 포함하고;

   (e) 정제 및 연마 정제시 평형화, 세척, 용리 및 재생에 이용되는 이동상은: (i) 중성 pH7의 물, (ii) pH7 이하의 산성수, (iii) pH7 이상의 알칼리수, (iv) 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올을 포함하는 하나 이상의 알코올, (v) 아세토니트릴, (vi) 클로로포름, 디클로메탄, 디클로에탄 등을 포함하는 염소화 유기 용매, (vii) 톨루엔, (viii) 부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 등을 포함하는 하나 이상의 에스테르, (ix) 아세톤, 메틸 이소부틸케톤 등을 포함하는 하나 이상의 케톤, (x) 인산, 아세트산, 펜탄 술폰산, 트리플루오로 아세트산, 트리페닐라민 및 그의 조합물을 포함하는 하나 이상의 이온쌍 작용제나 하나 이상의 친화도 및/또는 결합 강도 개질제, (xi) 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제, 인산염 시트르산염 완충제, 시트르산염-아세트산염 완충제, 붕산염 완충제, 탄산염 완충제 등을 포함하는 하나 이상의 완충제, (xii) 특별히 한정되지 않으나 염화나트륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 인산칼륨, 시트르산칼륨, 탄산칼륨, 아세트산칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄 등을 포함하는 하나 이상의 유기 또는 무기 염류, (xiii) 특별히 한정되지 않으나 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 염산, 인산, 황산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민, 폴리에틸렌이민 등의 하나 이상의 유기 또는 무기산이나 염기, 및 (xiv) 상기 (i) 내지 (xiii)의 화합물들의 적절한 조합물로서, 필요시 일염소화, 이염소화, 삼염소화 및 사염소화 화합물과 흡착제 매트릭스간의 이상적인 친화력 및/또는 상호반응력을 달성할 수 있는 물질 중에서 선택된 것을 포함하고;

   (f) 또한, 평형화, 세척, 용리 및 재생에 이용되는 상기 이동상은, 등용매 용리 등과 같이 무변화 방식으로 용리제의 변화없이, 혹은 단계식, 소정 기간 동안 임의의 액체량에 대해 변화 방식, "단계적 구배" 혹은 기타 적절한 "연속 구배" 용리 방식 또는 이들의 조합 방식으로 용리를 지속하는 하나 이상의 방법에서 흡착제에 부가되는 것으로서 상기 (e) 단계에서 언급한 물질 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
3. 제 1항 또는 2항에 있어서,

   (a) 화학적 상호반응기 또는 당의 트리클로로 및 테트라클로로 유도체에 대한 선택성이 있는 리간드 중 하나 이상을 매트릭스에 포함하고, 또한 흡착제에 트리클로로 및 테트라클로로 유도체를 흡착시키기 위해 벤질이나 펜틸기를 더 포함하는 흡착제를 사용하는 단계;

   (b) 필요시, DMF, 무기 염류, 유기 염류, 유기 용매, 카라멜화 생성물 등에서 선택된 하나 이상을 포함하는 공급물의 미흡착 성분을 다음에서 선택된 하나 이상을 포함하는 이동상으로 세척하는 것으로서, 상기 이동상은: (i) 중성 pH7의 물, (ii) pH7 이하의 산성수, (iii) pH7 이상의 알칼리수, (iv) 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올을 포함하는 하나 이상의 알코올, (v) 아세토니트릴, (vi) 클로로포름, 디클로메탄, 디클로에탄 등을 포함하는 염소화 유기 용매, (vii) 톨루엔, (viii) 부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 등을 포함하는 하나 이상의 에스테르, (ix) 아세톤, 메틸 이소부틸케톤 등을 포함하는 하나 이상의 케톤, (x) 인산, 아세트산, 펜탄 술폰산, 트리플루오로 아세트산, 트리페닐라민 및 그의 조합물을 포함하는 하나 이상의 이온쌍 작용제나 하나 이상의 친화도 및/또는 결합 강도 개질제, (xi) 시트르산염 완충제, 인산염 완충제, 아세트산염 완충제, 인산염 시트르산염 완충제, 시트르산염-아세트산염 완충제, 붕산염 완충제, 탄산염 완충제 등을 포함하는 하나 이상의 완충제, (xii) 특별히 한정되지 않으나 염화나트륨, 아세트산나트륨, 탄산나트륨, 인산칼륨, 시트르산칼륨, 탄산칼륨, 아세트산칼륨, 황산암모늄, 염화암모늄 등을 포함하는 하나 이상의 유기 또는 무기 염류, (xiii) 특별히 한정되지 않으나 아세트산, 시트르산, 타르타르산, 염산, 인산, 황산, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 트리에틸아민, 폴리에틸렌이민 등의 하나 이상의 유기 또는 무기산이나 염기, (xiv) 및 상기 (i) 내지 (xii)의 화합물들의 적절한 조합물로서, 필요시 일염소화, 이염소화, 삼염소화 및 사염소화 화합물과 흡착제 매트릭스간의 이상적인 친화력 및/또는 상호반응력을 달성할 수 있는 물질 중에서 선택되고, 상기 이동상은 DMF, 무기 염류, 유기 염류, 유기 용매 등을 포함하는, 공급물의 미흡착 성분들을 세척하기에 적합한 방식으로 구성되며 정제에 이용되는 흡착제 매트릭스에 따라 달라지는 단계;

   (c) 제2항의 (e) 단계에서 언급한 군으로부터 선택된 적절한 이동상을 세척 용리하고 경우에 따라 제2항의 (f) 단계의 방식에 적용되는 이동상의 디클로로 및 모노클로로 유도체를 분리하는 단계;

   (d) 제2항의 (e) 단계에서 언급한 군으로부터 선택되고 제2항의 (f) 단계의 방식에 적용되는 하나 이상의 적절한 이동상을 이용하여 선택적 용리에 따라 순수 분획에서 트리클로로 및 테트라클로로 유도체를 분리하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
4. 제 1항 또는 2항에 있어서,

   (a) 화학적 상호반응기 또는 염소화 당 유도체에 대한 선택성이 있는 리간드 중 하나 이상을 매트릭스에 포함하고, 또한 상기 당 유도체는 당의 테트라클로로, 트리클로로, 디클로로 및 모노클로로 유도체 중 하나 이상을 포함하고, 상기 리간드는 무이온성 또는 양이온성 지방족 및/또는 방향족 화합물을 포함하고 할로 겐류와 브롬류를 추가로 포함하는 흡착제를 사용하여 당의 테트라클로로, 트리클로로, 디클로로 또는 모노클로로 유도체를 흡착하는 단계;

   (b) 필요시, 용리를 지속하여 DMF, 무기 염류, 유기 염류, 유기 용매, 카라멜화 생성물 등에서 선택된 하나 이상을 포함하는 공급물의 미흡착 성분을 세척 제거하는 것으로서, 상기 용리제는 제2항의 (e) 단계에서 언급한 군으로부터 선택되고 제2항의 (f) 단계의 방식에 적용되는 적절한 이동상인 것으로 된 단계; 및

   (c) 순수 분획에서 하나 이상의 염소화 당을 선택적으로 용리하는 것으로서, 이때의 용리제는 제2항의 (e) 단계에서 언급한 군으로부터 선택되고 제2항의 (f) 단계의 방식에 적용되는 이동상인 것으로 된 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
5. 제 1항 또는 2항에 있어서,

   (a) 화학적 상호반응기, 또는 하나 이상의 아미노나 이미노기 등을 가진 당의 트리클로로 유도체에 대한 선택성이 있는 리간드 중 하나 이상을 매트릭스에 포함하는 흡착제를 사용하는 단계;

   (b) 필요시 용리를 지속하여 DMF, 무기 염류, 유기 염류, 유기 용매, 카라멜화 생성물 등에서 선택된 하나 이상을 포함하는 공급물의 미흡착 성분을 세척 제거하는 것으로서, 상기 용리제는 제2항의 (e) 단계에서 언급한 군으로부터 선택되고 제2항의 (f) 단계의 방식에 적용되는 적절한 이동상인 것으로 된 단계;

   (c) 컬럼에서 당의 디클로로 및 모노클로로 유도체를 세척 제거하고 선별적 으로 이들을 수거하는 것으로서, 상기 세척액은 제2항의 (e) 단계에서 언급한 군으로부터 선택되고 제2항의 (f) 단계의 방식에 적용되는 적절한 이동상인 것으로 된 단계; 및

   (d) 순수 분획으로 당의 트리클로로 유도체를 용리하고, 이때의 용리제는 제2항의 (e) 단계에서 언급한 군으로부터 선택되고 제2항의 (f) 단계의 방식에 적용되는 적절한 이동상인 것으로 된 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
6. 제 1항 또는 2항에 있어서,

   하나 이상의 염소화 당 화합물을 5% 이상의 농도로 함유하는 공정 흐름은 농축 및 다음 중 선택된 하나 이상의 단계를 포함하는 방법에 의해 탈수되며, 이 방법은:

   (a) 컬럼을 충전한 후 중력하에 이 컬럼에서 배출하거나 또는, 펌프나 가압 기체 같은 적절한 추진 수단을 이용하여 과량의 액상을 배출 제거함으로써 흡착제 상에 염소화 당 화합물을 흡착시키는 단계;

   (b) 기체로 정화 세정하여 매트릭스층에 함유된 유리수 전체 혹은 물-용매의 혼합물을 대부분 제거하는 단계; 및

   (c) 물이 함유되지 않은 무기 용매나 용매의 혼합물을 이용하여 흡착 분자를 용리하고 이때의 용매는 특별히 한정되지 않지만, (i) 메탄올, 에탄올, 이소프로판올, 부탄올 등에서 선택된 하나 이상의 알코올, (ii) 아세토니트릴, (iii) 클로로 포름, 디클로로메탄, 디클로로에탄 등을 포함하는 염소화 무기 용매, (iv) 톨루엔, (v) 부틸 아세테이트, 에틸 아세테이트 등을 포함하는 하나 이상의 에스테르, (vi) 아세톤, 메틸 이소부틸케톤 등을 포함하는 하나 이상의 케톤으로 구성된 군에서 선택하는 것으로 된 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
7. 제 1항 또는 2항에 있어서,

   탈에스테르화 반응은 염소화 당 에스테르를 함유하는 공정 흐름이나 용액의 크로마토그래피 공정에 통합되며, 이 크로마토그래피 공정은:

   (a) 염소화 당 에스테르를 용리 및 각각의 염소화 당으로 탈아세틸화 할 수 있는 용리제를 이용하여 상기 에스테르를 흡착시키는 흡착제가 함유된 컬럼을 용리 처리하는 것으로서, 상기의 용리제는 제2항의 (e) 단계에서 언급한 군으로부터 선택되고 제2항의 (f) 단계의 방식에 적용되는 적절한 이동상인 것으로 된 단계; 및

   (b) 상기 용리된 용액으로부터 염소화 당을 분리 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
8. 제 1항 내지 8항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 공정 흐름은:

   (a) 중화된 염소화 당 유도체의 탈보호 전 또는 후에 적용되는 염소화 반응 혼합물;

   (b) 3차 아미드 제거 전 또는 후에 적용되는 염소화 반응 혼합물;

   (c) 상기 염소화 당 유도체로부터 3차 아미드 및 염류를 제거하기 위해 적용되는 반응 혼합물;

   (d) 염류 (유기 및/또는 무기염류)를 부분 혹은 전체적으로 제거하기 전 또는 후에 상기 염소화 당 유도체로부터 3차 아미드 및 염류를 제거하기 위해 적용되는 반응 혼합물;

   (e) 추출, 크로마토그래피, 결정화, 증류 등의 기타 조작을 통해 염소화 당 유도체를 부분 정제한 후 임의의 단계에서 적용되는 반응 혼합물;

   (f) 통상의 컬럼 크로마토그래피의 대체물;

   (g) 상기 염소화 당 유도체의 제조에 이용되는 당 중간 화합물의 정제나 분리에 적용되는 반응 혼합물;

   (h) 분리된 TGS나 이의 전구물질 혹은 유도체를, 본 발명의 컬럼 크로마토그래피용 용액을 이용하여, 정제하기 위한 반응 혼합물 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 분리방법.
9. 제 1항 내지 9항 중 어느 한 항에 있어서,

   이 방법은 단일 방식, 다수 방식, 혹은 회분식, 연속식, 팽창층, 유동층, 액-고 순환형 유동층(LSCFB), 모사 이동층(SMB), 이동층, 개선된 모사 이동층, 원심분리형 크로마토그래피, 환형 크로마토그래피 등을 포함하는 군에서 선택된 하나 이상의 방식에 따라 실행되며, 흡착 공정은 적절한 흡착제를 컬럼에 충전하고 반응물 및 이동상을 이 컬럼에 통과시키는 것으로 된 충전층 크로마토그래피 컬럼이나 팽창층 크로마토그래피 컬럼을 이용하여 실행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
10. 제 7항에 있어서,

    하나 이상의 공정 흐름은:

    (a) 염소화 당 유도체의 탈보호 전 또는 후에 적용되거나;

    (b) 정제 혹은 부분 정제된 염소화 당 유도체의 효소적 혹은 화학적 탈보호 후에 적용되거나;

    (c) 3차 아미드 용매의 제거 전 또는 후에 적용되거나;

    (d) 추출이나 크로마토그래피 등의 다른 조작을 통해 염소화 당 유도체를 부분 정제한 후 임의의 단계에서 적용되거나;

    (e) 수분 제거를 위한 통상의 추출 및 증류에 대체물로 적용되거나; 또는

    (f) 원하는 염소화 당 유도체의 제조에 이용되는 당 중간 화합물의 정제나 분리에 적용되는 것을 특징으로 하는 분리방법.
11. 제 1항 내지 10항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 방법은 0 내지 80℃, 바람직하게는 보편적인 상온에서 실행되는 것을 특징으로 하는 분리방법.

Images