KR20080030144A

KR20080030144A - 젤다나마이신의 생합성 유전자 변이를 통해 제조된 유도체

Info

Publication number: KR20080030144A
Application number: KR1020060095833A
Authority: KR
Inventors: 홍영수; 이정준; 이경; 이동호; 김원철; 신진철
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2006-09-29
Filing date: 2006-09-29
Publication date: 2008-04-04
Also published as: WO2008038877A1; KR100860502B1

Abstract

본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 (Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주의 유전자 조작에 의해 생합성되는 벤조퀴논 안사마이신(Benzoquinone ansamycin)인 젤다나마이신 유도체에 관한 것으로, 구체적으로 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 균주의 젤다나마이신 생합성 유전자군에서 폴리키타이드 유전자 변이주(AC3 균주), gel7, gel16 또는 gel7&gel8 이중-비활성 변이주 및 상기 변이주들로부터 얻은 젤다나마이신 유도체인 1Ab, 1Ba, 1Bb, 1Bc, 1Ca, 1Cb, 1Cc 및 1Cd에 대한 것이다. 본 발명의 젤다나마이신 유도체들은 젤다나마이신과 유사하게 Hsp90 억제 작용을 나타내어 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 퇴행성 신경질환 치료제, 항염증제 또는 항암제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

젤다나마이신, 생합성, 스트렙토마이세스, 항암제

Description

젤다나마이신의 생합성 유전자 변이를 통해 제조된 유도체{Geldanamycin derivatives by modification of biosynthetic genes}

도 1은 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 게놈 코스미드 DNA를 염기서열 결정함에 의해 얻어진 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터 63.5-kb 분획의 생합성 유전자 배열 맵이다.

도 2는 젤다나마이신 PKS에서 각각 도메인과 그 활성에 의한 젤다나마이신 생합성과정을 도시한 것이고,

도 3은 젤다나마이신 PKS의 모듈 1의 디하이드라타아제 (Dehydratase) 도메인의 중요 활성 아미노산 서열과 변이주 개발에 이용한 아미노산과 그 염기서열을 표시한 것이다.

H: 히스티딘, G: 글라이신, P: 프로린

Q: 글루타민, x: 보존되지 않은 아미노산 서열

도 4는 이들 젤다나마이신 생합성 유전자의 단일 자리 변형을 위한 실험을 개략적으로 표현한 것이다.

도 5는 젤다나마이신 생합성 유전자의 기능을 확인하기 위해 비활성화 실험 을 수행하는 것을 상기한 도4에서 간략히 표현한 것을 gel7 유전자를 예로 하여 나타내는 것이다.

도 6은 pCR2.1-TOPO와 pKC1139의 백터 맵(vector map)이다.

도 7은 젤다나마이신과 본 발명에서 확인 유도체의 화학 구조식이다.

본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 (Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주의 유전자 조작에 의해 생합성되는 벤조퀴논 안사마이신(Benzoquinone ansamycin)인 젤다나마이신 유도체에 관한 것이다.

젤다나마이신은 허비마이신(herbimycin), 멕벡신(macbecin), 그리고 레브라스타틴(reblastatin)과 함께 3-아미노-5-하이드록시벤조산(3-amino-5-hydroxybenzoic acid; AHBA)을 최초 전구체로 이용하여 생합성되는 폴리케타이드(polyketide) 골격 구조를 가진 화합물이다. 상기한 화합물들은 1970년에서 2000년 사이에 항생제, 항진균제, 항바이러스제 및 항암제로서 그 기능이 확인되었다(DeBoer C. et al. J. Antibiotic., 23(9) 442-447, 1970; Omura, S. et al., J. Antibiotic. 32, 255-261, 1979; Muroi, M. et. al., J. Antibiotic. 33, 205- 212, 1980; Neckers L. et al.,Invest. New Drugs 17, 361-373, 1999; Piper P.W., Curr. Opin. Investing Drugs 2(11) 1606-1610, 2001).

이와 같은 젤다나마이신은 거대 환형 락탐 구조로 리파마이신 및 안사미토신과 같은 안사마이신계 항생물질에 속하는 것으로, 이런 부류의 화합물들의 생합성은 상기와 같이 AHBA를 출발 단위로 하여, 아세테이트, 프로피오네이트 및 글리콜레이트와 같은 골격연장 전구체의 연속적 부가에 의해 폴리케타이드 기본 골격을 형성한 후에, 기본골격을 수식하는 부가적인 반응을 거쳐서 생합성된다.

이러한 젤다나마이신은 1994년에 Neckers 등에 의해 샤페론단백질 protein chaperone) 활성을 가진 열충격 단백질 90(Heat shock protein 90; Hsp90)의 에티피(ATP) 결합자리에 결합하는 것이 확인되었다(Whitesell L. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91, 8324-8328, 1994; Prodromou C. et. al. Cell , 90, 65-75, 1997). 이러한 발견으로 인하여 기존의 젤다나마이신이 암 발생단백질(oncogenic protein) 기능을 갖는 타이로신 키나아제(tyrosin kinase)의 효소활성을 억제하여 항암활성을 나타내는 것이 아니라, 타이로신 키나아제를 포함한 다양한 종류의 Hsp90의 대상단백질(client protein)의 구조적 안전성에 중요한 Hsp90의 기능을 저해함으로서 상기 대상단백질들의 안정성이 저해되어 나타나는 약리효능인 것으로 확인되었다(Walter S. and Buchner J., Angew. Chem. Int. Ed. 41, 1098-1113, 2002; Piper P. W., Current opinion in Investigational Drugs 2, 1606~1610, 2001).

이러한 Hsp90의 생리적 중요성 때문에 젤다나마이신의 화학합성 유도체인 17-알릴 아미노 젤다나마이신 (17-AAG) 와 17-DMAG가 같은 HSP90 활성저해제가 항암제로서 개발되고 있다.

이미, 제 1형 폴리케타이드 합성효소(type-I polyketide synthases, PKS) 유전자를 포함하는 젤다나마이신 생합성에 관련되는 유전자 클러스터가 다른 종의 스트렙토마이세스로부터 클로닝되고, 염기서열이 분석되었다. 예를 들어, 미국특허출원 제20040077058호는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 젤다니우스 NRRL3602 (Streptomyces hygroscopicus var. geldanus NRRL3602) 균주에서 젤다나마이신 생합성 유전자 조작을 통하여 재조합 폴리케타이드 합성효소, 폴리케타이드 변형 단백질 등을 개시하고 있다. 또한, 미국특허출원 제20040077058호는 세포의 바람직하지 않은 과증식에 의한 암이나 기타 질병의 치료에 유용한 벤조퀴논 안사마이신 유사화합물과 그 제조방법에 관하여 개시하고 있다.

또한, 한국공개특허 제2004-0023581호는 "젤다나마이신 유도체 및 그를 사용하는 암치료 방법"이라는 명칭으로, 신규한 젤다나마이신유도체 및 그 제조방법을 개시하고 있고, 한국공개특허 제2004-0054692호는 "17-알릴 아미노 젤다나마이신 (17-AAG) 및 기타 안사마이신의 제조방법"이라는 명칭으로, 17-알릴 아미노 젤다나마이신 (17-AAG) 및 기타 안사마이신에 대한 화학합성적 제조방법을 개시하고 있다.

젤다나마이신의 생합성 경로는, 이를 생산하는 미생물로부터 클론닝한 생합성 관련 유전자의 염기서열의 유사성 분석에 의한 예측과 방사성동위원소 ¹⁴C나 ³H 로 표지된 전구체로 실험한 결과에 의하여, 젤다나마이신 생합성은 초기 폴리케타이드골격이 만들어진 후에 이에 O-카르바모일화, 하이드록실화, O-메틸화 및 산화반응을 거쳐 완성될 것이라고 제안되었다. 그러나, 염기서열을 결정하고, 염기서열의 유사성분석으로부터 유전자의 기능을 추정하는 것 외에, 초기 폴리케타이드를 생합성과정과 이 과정에 관련된 유전자나 효소의 기능을 실험적으로 증명한 예는 소수에 불과하다. 이중 초기 폴리케타이드를 젤다나마이신으로 변환시키는 O-카르바모일화 과정을 이용한 젤다나마이신 유도체 개발에 관하여 WO 2006/016773호가 개시하고 있다.

이에, 본 발명자들은 젤다나마이신 및 그의 유도체가 암을 포함한 여러 질병에 유용하게 사용될 수 있음에 착안하여 유전자 조작에 의해 생합성되는 젤다나마이신 유도체를 다량으로 생산할 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 젤다나마이신 생합성 유전자의 PKS 유전자중 모듈의 디하드라타아제와 PKS 합성 이후의 단계에 관여하는 생합성 유전자, 상기 유전자 변이주가 생합성하는 젤다나마이신 유도체 및 그 제조방법을 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스 (Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)의 젤다나마이신 탄소 15번의 수식에 관여하는 모듈 1의 디하드라타제의 기능성 아미노산 중 히스티딘이 글루타민으로 치환된 변이주인 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨3(Streptomyces hygroscopicus AC3)를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 7로 기재되는 gel7 유전자 및 서열번호 10으로 기재되는 gel16 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 gel7, gel16 또는 gel7 및 gel8 이중 유전자 비활성 컨스트럭트를 제공한다.

또한, 본 발명은 gel7, gel16 또는 gel7 및 gel8 이중 유전자 비활성 컨스트럭트를 각각 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 변이주 및 이로부터 생산된 젤다나마아신 유도체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 젤다나마이신 유도체, 재조합 벡터 또는 변이주를 유효성분으로 하는 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 항염증제, 퇴행성 신경질환치료제, 또는 항암제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 젤다나마이신 폴리키타이드 합성효소(polyketide synthases, PKS) 유전자 중 모듈 1의 디하드라타아제의 단일 아미노산 변이가 일어난 균주인 AC3를 제공한다.

본 발명자들은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)의 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터의 염기서열 분석으로 일련의 추정되는 젤다나마이신 폴리키타이드 신타제 유전자를 밝히고, 이들 중 젤다나마이신 탄소 15번의 수식에 관여하는 모듈 1의 디하드라타아제의 기능 아미노산중 히스티딘(His: H)를 글루타민 (Gln: Q)으로 치환된 변이주 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 AC3(Streptomyces hygriscopicus AC3; 기탁번호: KCTC 10682BP) AC3를 개발하였다. 상기 디하드라타아제 유전자는 서열번호 12로 기재되는 염기서열을 가지며, 디하드라타아제 유전자 비활성 컨스트럭트는 상기 유전자의 단일 자리 변형 DNA 서열을 가진다.

또한, 본 발명은 gel7, gel16, 그리고 gel7 및 gel8의 이중 변이를 통해 만들어진 유전자 비활성 컨스트럭트를 제공한다.

염기서열 분석으로 일련의 추정되는 포스트-PKS 변형 유전자를 밝히고, 이들 중 gel7 유전자가 안사미토신 및 리파마이신의 생합성에서 벤조키논의 변형 수산화 반응 단계를 수행하는 하이드록실라아제와 유사한 단백질을 코드하는 것을 확인하였다. 또한 gel16은 시토크롬 단백질 450과 유사한 단백질을 코드하여 탄소 4과 5번의 이중결합의 환원화 반응 단계를 수행하는 유전자임을 확인하였다. 또한 gel8 유전자는 카바모일화에 관여함은 이미 공지된 바 있다(Hong Y.S et. al., J. Am. Chem. Soc. 126, 11142-11143, 2004).

젤다나마이신 폴리키타이드 합성효소에 의해 생합성된 프로젤다나마이신을 젤다나마이신으로 전환시키는데 관여하는 상기 유전자들(gel7, 서열번호 9; gel16, 서열번호 10) 내에 카나마이신(kanamycin)과 같은 항생제 내성 유전자를 삽입함으로써 상기 유전자들을 불활성화시켰다. 상기 불활성화된 유전자 비활성 컨스트럭트는 pKC1139 벡터에 삽입하였으며, 삽입된 유전자 비활성 컨스트럭트에 따라 각각 pKC-gel7, pKC-gel16 또는 pKC-gel7&8로 명명하였다. 단, 유전자 비활성 컨스트럭트를 삽입하는 벡터의 종류는 pKC1139에 한정되지 않고 이 외에도 다양한 벡터가 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터 및 상기 벡터로 형질전환된 변이주를 제공한다.

상기 PKS의 모듈 1의 Dehydrtase 변이주(AC3 균주를) 이용하여 gel7, gel8, gel16 및 gel7&8 유전자 변이주도 각각의 야생형 유전자와의 염기서열유사성에 의한 재조합(homologous recombination)에 의하여 야생형을 비활성 변이형으로 대체하여 제조하였다.

또한, 본 발명은 하기 화학식 1 과 2 로 표시되는 젤다나마이신 유도체를 제공한다.

<화학식 1>

<화학식 2>

상기 본 발명에 따른 변이주들은 효모추출물-맥아추출물(YEME) 배지에서 정상적으로 성장하고 야생주와 특성이 유사하지만, 야생주의 두 주요 대사산물인 젤다나마이신(화합물 1Aa)을 생산하지 않는 특성을 가진다. 또한, 본 발명은 상기 변이주들을 배양하여 상기 화학식에 해당하는 1Ab, 1Ba, 1Bb, 1Bc, 1Ca, 1Cb, 1Cc, 1Cd의 젤다나마이신 유도체를 얻었고, 상기 화합물들의 1D 및 2D NMR 스펙트럼의 분석을 통해 젤다나마이신의 유도체임을 확인하였다.

상기와 같이, 본 발명은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 두아마이세티쿠스 균주만의 독특한 유전적 특징을 이용해 젤다나마이신 생합성 유전자를 조작한 균주에서의 여러가지 젤다나마이신 유도체를 제공한다.

아울러, 본 발명은 젤다나마이신 유도체, 재조합 벡터 또는 상기 변이주를 유효성분으로 하는 항생제, 항진균제, 면역억제제, 항염증제, 퇴행성 신경질환 치료제 또는 항암제를 제공한다.

젤다나마이신은 샤페론단백질(protein chaperone) 활성을 가진 열충격 단백질 90(Heat shock protein 90; Hsp90)의 에티피(ATP) 결합자리에 결합하는 것이 확인되었다(Whitesell L. et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 8324-8328, 1994; Prodromou C. et. al., Cell 90, 65-75, 1997). 이러한 발견으로 인하여 기존의 젤다나마이신이 암 발생단백질(oncogenic protein) 기능을 갖는 타이로신 키나아제(tyrosin kinase)의 효소활성을 억제하여 항암활성을 나타내는 것이 아니라, 타이로신 키나아제를 포함한 다양한 종류의 Hsp90의 대상단백질(client protein)의 구조적 안전성에 중요한 Hsp90의 기능을 저해함으로서 이러한 대상단백질들의 안정성이 저해되어 나타나는 약리효능인 것으로 확인되었다[Piper P.W., Curr. Opin. Investing Drugs 2(11) 1606-1610, 2001; Banerji U. et. al., Curr. Cancer Drug Targets 3(5) 385-90, 2003; Smith D. F. et. al., Pharmacological Reviews 50(4) 493-513, 1998; 항생(Takahashi A. et al., PNAS 100(20) 11777-11782, 2003; Agbessi S. et al., Appl. Microbiol. Biotechnol 62, 233-238, 2003), 항진균(Cardenas M. E. et al., Clinical Microbiology Review 12(4) 583-611, 1999), 항 바이러스(Li Y. et al., Antimicrobial Agents and Chemotherapy 48(3) 867-872, 2004), 면역억제(Owens-Grillo J. et al., J. Biological Chemistry 270(35) 20479-20484, 1995), 퇴행성 신경질환 관련(Sittler A. et al., Human Molecular Genetics 10(12) 1307-1315, 2001; Waza M. et al., Nature medicine 11(10) 1088-1095, 2005), 항염증(Pittet J. et al., The Journal of Immunology 174, 384-394, 2005; Hsu H. et al., Molecular Pharmacology, Web pub. Jul 25. 2006].

본 발명의 치료제는 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 약제학적으로 허용 가능한 담체는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한, 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 당해 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 치료제는 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용) 할 수 있으며, 투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일회 투여량은 0.1 내지 500 ㎎/㎏이며, 1일 1회 또는 수회 투여될 수 있는 것이 더욱 바람직하다.

이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 상세히 설명하는 것일 뿐, 본 발명을 한정하지는 않는다.

<실시예 1> AC3 변이주의 제조

본 발명의 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터는 3개의 PKS(polyketide synthase) 유전자(gelA-C), 아미드 신타제 유전자(gelD), 추정 하이드록실라제 유전자(gel1, 7 & 16), 및 카바모일 트랜스퍼라제(gel8)를 포함한다 (도 1와 표 1).

젤다나마이신 PKS의 아미노산 서열은 리파마이신(rifamycin) 및 안사미토신(ansamitosin) PKS에 유의성 있는 상동성을 나타내고, 각각의 모듈에 포함된 기능성 도메인들은 젤다나마이신 구조와 직접적 연관성을 지니고 있다(도 2) 디하이드라타아제(Dehydratase:DH) 도메인은 모듈 1, 2, 4, 6 및 7에서 발견되었고, 특히 모듈 1에 존재하는 디하이드라타아제는 젤다나마이신 탄소 15번의 변형에 관여할 것으로 추정되고 있는데, 잘 보전된 디하이드라타아제 아미노산 서열을 보면, 히스티딘 (His), 글라이신 (Gly) 과 프로린 (Pro)을 가진 부위가 디하이드라타아제의 기능에 결정적인 역할을 하는 것으로 예측할 수 있다(도 3). 그 중 히스티딘 아미노산은 활성에 가장 중요한 역할을 하는 것으로 글루타민과 같은 다른 아미노산으로 치환된 경우 그 기능이 없어지는 것으로 알려져 있다(Joshi A. K. & Smith S. , J. Biol. Chem. 268(30) 22508-22513, 1993).

따라서, 본 발명자들은 젤다나마이신 PKS의 모듈 1의 디하이드라타아제 도메인의 히스티딘 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하면 젤다나마이신 PKS의 전체 3차 구조 및 기능에는 적은 영향을 미치면서 젤다나마이신의 탄소 15번 위치에 수산기가 환원되는 반응이 진행되지 않아 최종 산물에는 탄소 15번에 수산기가 남아 있는 젤다나마이신이 생성될 것으로 예측하였다.

<1-1> AC-DH 변이주의 제조

상기 예측에 따른 변이체를 만들기 위해, 디하이드라타아제 부위에 가나마이신(kanamycin)과 같은 내성 유전자가 삽입된 변이체 AC-DH를 먼저 제작하였다(도 4).

서열번호 1과 2 및 서열번호 3과 4로 기재되는 프라이머를 이용하여 하기와 같은 조건으로 PCR을 실시하였다. 주형은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus) 균주의 염색체 DNA를 분리하여 사용하였다. PCR 증폭 조건은 DNA 중합효소(Ex Taq polymerase, Takara사)를 사용하여 상기에 기재된 프라미어 쌍 (25pmol), 주형, dNTP 혼합액, 반응 완충용액을 최종 50ul로 맞춘 후, 97℃에서 5분 동안 변성시키고, 95℃에서 1분, 55℃에서 1분 및 72℃에서 1분간 30회 반응시키고, 72℃에서 10분간 연장시켜 반응을 종결하였다. 상기 PCR 산물을 TA 클로닝 벡터(pCR2.1-TOPO, Invitrogen^TMlife technologies, USA)에 클로닝하여 재조합 벡터 pCR-DH12 및 pCR-DH34을 제조하였다(중간에 카나마아신 내성 유전자를 삽입하기 위해 유전자의 앞 부분과 뒷 부분을 나누어 클로닝하였고 이를 각각 12와 34로 표시하였다).

카나마이신 내성 유전자인 aphII 유전자를 포함하는 pFD-neoS (Denis, F.& Brzezinski, R., FEMS Microbiol. Lett. 81, 261-264, 1991)를 KpnI과 PstI으로 절단하여 수득한 1.1-kb DNA 분획을 선택 마커 및 유전자-파괴 컨스트럭트를 구성하기 위하여 사용하였다.

유전자 비활성화 실험을 위하여, pCR-DH12의 EcoRI/PstI분획(디하이드라타아제 유전자를 포함한 앞 부분), pCR-DH34의 KpnI/HindIII 분획(디하이드라타아제 유전자를 포함한 뒷 부분) 및 pFD-neoS의 1.1-kb PstI/KpnI 분획(aphII 유전자)을 미리 EcoRI/HindIII으로 잘려진 pKC1139(Bierman, M. et al., Gene 116, 43-49, 1992)에 접합시켜 재조합 벡터 pKC-DH1을 제조하였다. 이 방법은 하기 도 5에 gel7을 이용한 pKC-gel7 제작 방법과 같다.

상기 재조합 벡터 pKC-DH1를 ET12567(pUZ8002)(Allen, I. W. & D. A. Ritchie., Mol. Gen. Genet. 243:593-599, 1994)에 도입하고 얻어진 균주를 Flett, F. 등의 방법(Flett, F. et al., FEMS Microbiol. Lett., 155, 223-229, 1997)대로 S. hygroscopicus JCM4427에 형질전환하였다(도 4).

pKC-DH1의 유전자를 S. hygroscopicus JCM4427의 염색체에 도입시키기 위하여(chromosomal integration) 카나마이신이 첨가된 효모추출물-맥아추출물(YEME, yeast extract-malt extract) 액체 배지에서 37℃에서 4일간 형질전환체를 배양하였다. 이때 상기 pKC1139 벡터의 유전적 특징으로 인해 37℃에서 벡터의 복제는 정지하고 자연적으로 카나마이신 내성 유전자가 염색체에 도입된 균주만이 생존한다(Bierman, M. et al., Gene 116, 43-49, 1992). 이들 생존균주를 카나마이신과 아프라마이신이 각각 첨가된 고체 배지에 배양하여 카나마이신에 대해서는 내성을 갖지만 아프라마이신에 대해서는 감수성인 재조합변이주 AC-DH를 선별하였다. 상기한 재조합변이주는 이들의 총 게놈의 DNA의 PCR에 의해 확인되었다. 결국 AC-DH 균주는 젤다나마이신 생합성 효소중 디하이드라타아제 부위를 포함한 폴리키타이드 시세즈 효소가 발현이 되지 않아 젤다나마이신을 생산하지 못하지만 카나마이신 내성을 가진 표현형을 나타낸다.

<1-2> AC-DH 변이주를 이용한 AC3 변이주의 제조

상기 형질전환체 AC-DH를 이용하여 하기의 방법으로 가나마이신 유전자가 제거되면서 디하이드라타아제 도메인에 단일 유전자 변형 DNA 단편을 삽입함으로서 최종 단일 자리 변이체 AC3는 가나마이신 유전자를 제거하였고 그 위치에 단일 뉴 클로오타이드가 변형된 새로운 디하이드라타아제 도메인을 삽입시켰다. 즉 AC-DH는 DH 부위에 카나마이신 삽입으로 전체 유전자 기능이 없어진 균주이고, AC3는 DH의 단일 자리 변형 유전자로 치환한 변이주로 이때 카나마이신이 빠져 나옴으로써 카나마이신 감수성의 표현형을 쉽게 확인할 수 있다(도 4).

구체적으로, 이 디하이드라타아제 도메인을 위치지정돌연변이(stie-directed mutagenesis)시키기 위해 서열번호 5와 6으로 기재되는 프라이머(표 2)와 히스티딘 아미노산이 글루타민으로 치환될 수 있는 두 프라이머(서열번호 7: 5'-CCGTGGCTGGCCGACCAGGCCGTCTCCGGAACGG -3', 서열번호 8: 5'-GGCACCGACCGGCTGGTCCGGCAGAGGCCTTGCC-3') 및 QuikChange^R Site-Directed Mutagenesis kit(Stratagene사, USA)을 이용하여 단일자리 변이를 수행하였다. 그 PCR 조건은 주형을 디하이드라타아제 도메인을 가진 DNA 단편을 사용하여 상기한 PCR 방법과 동일하게 시행하였다.

상기 단일자리 변형 디하이드라타아제 단편을 벡터 pKC1139에 클로닝하여 pKC-DHQ을 제작하고 상기와 같은 방법으로 pKC-DHQ 벡터를 AC-DH 변이주에 형질전환하였다. 이어 가나마이신 감수성을 확인하여 벡터 DNA와 재조합변이주 AC-DH 염색체 DNA 간의 염기서열 유사성에 의한 재조합(homologous recombination)이 일어난 재조합 변이주를 선별하였다. 이 재조합변이주는 이들의 총 게놈의 DNA중 디하이드라타아제 도메인의 위치지정돌연변이를 PCR을 통해 크론한 DNA를 시컨싱하여 의도한 단일 자리 변형이 일어난 것을 확인하였다. 또한, 균주는 하기 실시예 3에 서와 같이 젤다나마이신 유도체 생산이 확인되었다. 상기 균주를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨 3이라 명명한 후 2004년 8월 9일자로 KCTC에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10682BP).

<실시예 2> 젤다나마이신 수식 효소 유전자 변이주 제작

상기 도 2와 표 1에 나타난 젤다나마이신 생합성 유전자 클러스터내 존재하는 여러가지 젤다나마이신 수식 효소 유전자, gel7, gel8, gel16 및 gel7과 gel8가 이중변이(gel7&gel8)된 변이주를 제작하였다. 각각의 유전자 변이주를 제작하기 위해 사용한 프라이머 쌍들을 표 2에 표기하였다.

상기 실시예 1에서와 같은 방법으로 켄주게이션용 벡터 pKC-gel7, -gel8, -gel16 및 -gel7&8을 각각 제작하였다(도 5는 pKC-gel7의 예). 이들 벡터를 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 균주와 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨 3 균주를 이용해 상기한 방법으로 형질전환체들을 만들었다. 이들 재조합 균주들에서 생산되는 젤다나마이신 유도체들은 표 3에 표기 하였다. 이중 1Ba, 1Bc, 1Cb, 1Cc, 1Cd 는 신규 화합물이다.

표 1: 폴리키타이드 신타아제와 젤다나마이신 생합성에 관여할 것으로 추정되는 유전자 및 그 기능

표 2: 유전자 비활성 실험에 사용한 DNA 단편의 PCR 프라이머 및 그 방법

표 3: 야생균과 각각의 재조합 균주들에서 생산되는 젤다나마이신 및 그 유도체들

<실시예 3> 변이주들에 축적된 화합물의 구조 규명

상기 실시예 1과 2에서 만들어진 형질전환주를 28℃에서 7일 동안 10L의 액체 효모추출물-맥아추출물 배지에서 배양하였다. 각 배양배지를 EtOAc로 두 번 추출하고 이들 추출물은 여과하여 불용물을 제거하고, 농축한 후에 EtOAc와 H₂O로 분획하여 유기상 추출물을 얻었다. 변이주 배양 추출물의 분획화는 이동상으로 CHCl₃-MeOH를 사용하여 실리카 겔 크로마토그라피로 얻었고, 얻어진 분획은 TLC 및 ESIMS 분석하였다.

하기와 같이 생산되어 축적된 화합물을 동정하기 위해, 용융점은 이렉트로더말(Electrothermal) 9100 장비(Electrothermal사, 영국)로 보정없이 측정하였고, 비회전(Specific rotation)([α]_D ²⁵)과 UV는 JASCO DIP-370 폴러리메터(JASCO, 일본)와 Shimadzu UV-1601 스펙트로포토메터(Shimadzu, 일본)로 각각 측정하였다. 또한, 모든 NMR 시험은 CDCl₃에서 Bruker DMX 600 NMR 스펙트로포토메터(Bruker사, 미국)로 시험하였다. ESIMS 및 HRFABMS는 Finnigan LCQ Advantage Max 매스 스펙트로포토메터(Thermo사, 미국)와 JEOL JMS-HX110A/HX110A Tandem 매스 스펙트로포토메(Jeol사, 일본)로 각각 수행하여 얻었다. HPLC는 Waters Delta Prep 3000 system(Waters사, 미국)을 사용하여 수행하였다. 동정된 화합물은 하기와 같다(도 7).

젤다나마이신(화합물 1Aa); ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 3&4 참고; ESIMS m/z 561 [M + H]⁺, 559 [M - H]^-

4,5-다이하드로 젤다나마이신(화합물 1Ab); ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 3&4 참고 (Schnur, R. C. et al. J. Med. Chem. 1995. 38: 3806-3812).

DL1492 (화합물 1Ba); ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 3&4 참고; ESIMS m/z 569 [M + Na]⁺, 545 [M - H]^- HRFABMS m/z 569.2473, C₂₈H₃₈N₂O₉Na 계산치, 569.2475.

DL1493 (화합물 1Bb); ESIMS m/z 567 [M + Na]⁺, 543 [M - H]^-. (Hu, Z. et al. J. Antibiotics 2004. 57(7) 421-428)

QCT (화합물 1Bc); ESIMS m/z 526 [M + Na]⁺, 502 [M - H]^-

DL3195 (화합물 1Ca); ¹H 및 ¹³C NMR 데이터 표 3&4 참고 (Rascher, A. et al. Appl. Environ. Microbiol. 2005. 71(8) 4862-4871).

DL3701 (화합물 1Cb); ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 3&4 참고; ESIMS m/z 498.6 [M +Na]⁺, 474.7 [M - H]^- HRFABMS m/z 498.2826, C₂₇H₄₁O₆NNa 계산치, 498.2814.

DL3421 (화합물 1Cc); ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 3&4 참고; ESIMS m/z 557 [M + Na]⁺, 533 [M - H]^- HRFABMS m/z 552.3279, C₂₈H₄₂O₈N₂NH₄ 계산치, 552.3304.

DL3802 (화합물 1Cd); ¹H 및 ¹³C NMR 데이타, 표 3&4 참고; ESIMS m/z 514.6 [M + Na]⁺, 490.6 [M - H]^- HRFABMS m/z 514.2781, C₂₇H₄₁NO₇Na 계산치, 514.6148.

표 4: 화합물 1Ab, 1Ba, 1Cb, 1Cc, 1Cd의 H NMR 스펙트럼 값을 젤다나마이신과 비교

표 5: 화합물 1Ab, 1Ba, 1Cb, 1Cc, 1Cd의 C¹³NMR 스펙트럼 값을 젤다나마이신과 비교

상기한 바와 같은 본 발명의 젤다나마이신 유도체 및 그의 생합성 방법은 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 두아마이세티쿠스 균주의 젤다나마이신 생합성 유전자를 조작한 변이주를 제공함에 의해 이로부터 생합성된 젤다나마이신 유도체 및 그 제조방법을 제공하며, 이들 젤다나마이신 유도체들은 젤다나마이신과 유사하게 Hsp90 억제 작용을 나타내어 항생제, 항진균제, 항바이러스제, 면역억제제, 항염증제, 퇴행성 신경질환치료제, 항암제 등으로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Geldanamycin derivatives by modification of biosynthetic genes <160> 12 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DH12 primer <400> 1 cggaattcac gccaacccgg tcgatgtggg 30 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DH12 primer <400> 2 aactgcagac cgtcttcggg cagtgtcatc 30 <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DH34 primer <400> 3 ggggtaccga ggggtgcgga tctactctc 29 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DH34 primer <400> 4 cccaagctta gacgaggcac ccacagcagc cca 33 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stie-directed mutagenesis primer <400> 5 ccgaattcgc cgtcgtcgtc tccctcgccg ca 32 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stie-directed mutagenesis primer <400> 6 cccaagcttc tccgagacgt cgaggtacca gtg 33 <210> 7 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> histidine > glutamine <400> 7 ccgtggctgg ccgaccaggc cgtctccgga acgg 34 <210> 8 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> histidine > glutamine <400> 8 ggcaccgacc ggctggtccg gcagaggcct tgcc 34 <210> 9 <211> 1638 <212> DNA <213> gel7 <400> 9 atgagcggga aggaggcggc ggtggacacc gtgcgggaaa cggacagcct cgaggccgag 60 gtgctgatcg tcggctacgg accggtgggc cagctactgt cggtgctact ggcccagcgc 120 gggcggcgcg tgacggtcgt ggagcgctgg ccggagccgt accggcaccc ccgggcggtc 180 gggttcgaca gtgaggccgc gcgccttctg gcctcggccg ggatcggcga ctcgctcgac 240 aagttcaccg aacccgcgcg ggaccacgcc tggcagaaca cgaagggcga gacgctgatc 300 gaccacgagg tggccgaccg ggggcactgc acctggccgg aggctttgtc ggcgtatcag 360 cccgccctgg agtccgcgct gatcgagcac ggggcgacgc tgccgccgct gcggatcctg 420 cgcggatacg aggcggtggg actcgcggac gacggcgacc atgtgacctt gaccgtggtc 480 ggcccggacg gggagaagac ggacctcacc gcgctgtggg tggtcggctg cgacggcgcg 540 aacagcctgg taaggacggg cgtcggcacc accatgacgg acctcgactt ctcgtacgac 600 tggctgatct gcgatgtgcg gttgcacgag caccgcgagt tccggccgaa caacctggag 660 atctgcgatc cggcgcgccc ccggacggcg gtgtccgcgg gtcctggcca ccggcggtac 720 gagttcatgc gggtgcccgc ggacgacccc gaacacttcg gcaccgtgga gagcgcctgg 780 gagctgctgc ggctgttcga tgtgacgccc gagaacggcg ttctggaccg gcacgcggtc 840 tacaccttcc aggcccgctg ggcggagcgc tggcggaccg gacggatggt gctggccggg 900 gactcggcac acctcatgcc gccgttcgcg gggcagggca tgtgctccgg attccgtgac 960 gcggccaatc tggcctggaa actggacctg gtcctgggcg gacacgcggc gccgacgctg 1020 ctggacacct acaccaccga gcggcgggca cacgtgcggc acgcggtgga gatgtcggtg 1080 ggcctgggcc gggtggtgtg catggcggac ccggccgcgg cggcggaccg tgacgcggcg 1140 atgctggccg cgcgcaaacg caacatcggc ccgagtgccg cccgccgttc cgtggtgagg 1200 ccgctcgtgg acgggctgct acggcaggac ggtcagggcc gcccggcacc gtacgccggc 1260 caggcgggcc cccagtggcg agtgtgccgc gcgggaacca ccggcctgtt cgacgacgtg 1320 gtgggcaccg gtttcgtcct cctctacgcc gaggacgtgt tccccgcgct ggacgcgcgg 1380 cggctgacat tcctcgacag catcggcacc cgactggtgc gcatggtccc cgcggacacg 1440 cccccggccg ccctggggcc acgggacgcg ctggacgtgg aggaccggta cctgtcctat 1500 ctgtcggaga tggacgcgct ggcggtactg gtacgcccgg acttctacct gttcggcatc 1560 gcggaggacg agggcgaact cctctctctc gtagacgact tggccaccca gctgagcccg 1620 tcacccactc cttcgtaa 1638 <210> 10 <211> 1194 <212> DNA <213> gel16 <400> 10 atggacgaga tacgcgacta ccccgaatcg cgggctgctg catgcccgtt ctcacccccg 60 ctgggatacg aggagttgcg cgagcggtcc gccgtcacgc gggtgcggat gtgggatggc 120 agcaccccgt ttctcgtcac cggctatcac gaggcgcggg ccgcgctcgg cgacagcagg 180 ttcagcgccg acggcacgca caaggcgatg ccgcgcttcg tgaagttcga ggtgccggcc 240 gaggtgttca acctcgggag gatggacgat ccggagcacg cccggatccg ccgcatgctc 300 accgcgaact tcaccatccg gcgcaccgag gcgatgcggc cgatgatcca gggcatcgtg 360 gacggcctcc tggaccggct gatcgcccag gggccgccgg ccgacctggt ggccgacttc 420 gccttccccc tgccgtccca ggtgatcggt gtgatgctgg gggtctcgga cgccgacttc 480 gcggagttcc agcaggcgtc gcagggcgtc atggacttca ccgcgtcggc cgaggagatg 540 ggcgccgcgc tcggcgtcat ggtggactac gtcgcccgga tgtgcgcggc caagcgcgcc 600 gacccgggag acgatctcct cagccggctc atcgtcgacc aggagctgac gggcgggctc 660 acccagcagc aggtggtcgc caccgccctg gtgctgctgc tggccgggca cgagaccacc 720 gccaacatga tcgccctgtc caccgtcctg ttgctgagcc accccgaaca gctcgcccgg 780 ctgcgggcgg acgccgggct gatgggcaac gcggtggacg aactgctccg gtacatcacg 840 atcgtccagg aaggcacggg acgggtggcc accgaggacg tcgaggtcgg cggggtgctc 900 atcccgggcg gtgaaggggt gatcatcaat ctgcccagcg ccaaccgcga cccccacttc 960 gcggacgccc acgaactgga cctgagccgg ccgaacgccc gcgaacatgt cgcgttcggc 1020 tttggagtgc accagtgcct ggggcagacc ctcgcccggg tcgagctcca gatcgccctg 1080 gagaccctgc tgcgccggct gccgacgctc cgcctggagg tcccgttcga cgacctggcg 1140 tttttgtacg agtcgatgaa cttcggcgtc gcccgtgtgc ccgtcgcctg gtga 1194 <210> 11 <211> 2043 <212> DNA <213> gel8 <400> 11 gtgctcgggc tcaacggcaa cttctccgcc gcggacaccg atgtggtgcc gcagctcgga 60 gaggtgttct ttcatgactc ggcggcttcc ttgatccgcg acggcgaact cgtggccgcc 120 gtggaggagg agcggctcaa ccggatcaag aagacaacca aatttcccct caacgcggtc 180 cgtgagtgcc tggccctggc cggtgcgcgg cccgaggacg tcgacgcggt gggctactac 240 tttcccgaga accacatcga caccgtcctc aaccacctct acaccgaata tccgmgggcr 300 cccctgcgct actcccggga gctgatccgg cagcggctga aggagggcct gggctgggac 360 ctgccggacg agaagctggt gtacgtgccg caccacgagg cgcacgcgta ctcctcgtat 420 ctgcactccg gyatggactc cgcactggtc ctggtgctgg acggccgtgg cgaactgcac 480 tccggcaccg tctaccgcgc cgagggcacg cggctggaga agctggccga ctacccggtg 540 cccaagtcgc tcggcgggct ctacctgaac gccacctatc tgctcggcta cggcttcggc 600 gacgagtaca aggtgatggg tctggccccc tggggcaacc cggagaccta ccgcgacacc 660 ttcgccaagc tctacaccct ccaggacaac ggcgagtacg agctgcacgg caacatcatg 720 gtgccgaacc tggtcagccc gctgttctac gccgagggct tccggccgcg ccgcaagggc 780 gagccgttca cccaagcgca ccgcgacttc gccgccgcgc tccaggagac ggtcgagaag 840 atcgtgctgc acatcctcga atactgggcg aagaccagcg gccactcccg cctgtgcttc 900 ggcggtggcg tcgcccacaa ctccagcctc aacgggctga tcctcaagtc cggactcttc 960 gacgaggtgt tcgtgcaccc cgcctcgcac gacgcgggcg cgggcgaggg cgccgcctac 1020 gccgcggcgg cgagccttgg cacgctggag cgcccgggga agcggctgct cagcgcgagc 1080 ctcggcccgg cactgggcgg ccgggagcag atcagggcac ggttggccga ctgggcgccg 1140 ctgatcgatg tggagttccc ggacgacgcc gtggagaccg cggccggact cctcgccgag 1200 ggacaggtgc tcggctgggc gtacggccgc tccgagttcg gcccccgcgc cctgggccac 1260 cgcagcatcg tcgcggacgc acgccccgag gagaaccgga cccgcatcaa cgcgatggtg 1320 aagaagcgcg agggcttccg gccgttcgcc ccggtggtca ccgccgaagc cgcccgcgac 1380 tacttcgacc tctccggcgc ggatggcaac cacgagttca tgtccttcgt ggtgccggtg 1440 ctgccggagc ggcgtacgga actcggcgcg gtcacccacg tggacggcac cgcccgggta 1500 caggtcgtct ccgccgagtc cggcgagcgg ttccaccgcc tggtgcggcg rttcggcgaa 1560 ctgaccggca cccccgtgct cctcaacacc tccttcaaca acaacgccga acccatcgtg 1620 cagagcctcg acgacgtggt caccagcttc ctgaccaccg acctggacgt tctggtggtg 1680 gaggactgcc tggtacgcgg caaagcctcg cccgacctgg gcgttctggt gccgcggttc 1740 cgcccggtga cccggctggt cgagcgccgg acggccggtc cggacgcctc ggcgggagcc 1800 aagacccacg agatccacct cgactacgac ggcggcccgt ccgcgaaggt gtcgcccgag 1860 ctgtacgaac tgctcggcgc ggtcgacggc accaccaccc tcggggatct ggccaagacc 1920 gtgggcgggc tgtcggacgc actggccacc gaggtgttcg ccctgtggga gcagcggttc 1980 ctcaccctgg ccccggccgg ggacgtaggg ccgttggccg acgacggtac gcgggggcac 2040 tga 2043 <210> 12 <211> 555 <212> DNA <213> DH 1 domain <400> 12 gcaggcgatg tgagtgccgt gggcctccag ggcacgggcc acccgctggc cggggccgtg 60 gtgagcgtgc ccgacaccgg gggtgtgctg ctcaccgggc agttgtcggt ggccacccac 120 ccctggctgg ccgaccacgc cgtctccgga acggtgctgc tgccgggtac cgcgatggcc 180 gaactcgcca tccgcgccgg agacgagacc gataccccca ccctggaaga gctggtcatc 240 ggccagccga tgacactgcc cgaagacggt gcactacatg tccaggtact ggtcggcggc 300 gaggaggacg ggcgccgagg ggtgcggatc tactctcgcc ccgacgcggc ccaggaacag 360 gaatggctgg agcacgcctc gggcacactc gccacgcagc cggacggttc ggccgagggc 420 ggcatggaga acggcatggc cgagtggccg ccgcccggtg tcgagccgat cgctctggat 480 gacttctacg acgacctcgc ccaggccggg tatgagtacg ggcccgcctt ccgcggactg 540 aaggcggtct ggaag 555

Claims

하기 화학식으로 표시되는 젤다나마이신 유도체

여기서, R₁는 -OH 또는 -OCONH₂임.
하기 화학식으로 표시되는 젤다나마이신 유도체:

여기서 R₁은 H 또는 OH, R₂는OH 또는 OCONH₂임.
서열번호 7로 기재되는 gel7 유전자.
서열번호 10으로 기재되는 gel16 유전자.
서열번호 7로 기재되는 gel7 유전자가 변이되어 불활성화된 gel7 유전자 비활성 컨스트럭트.
서열번호 10으로 기재되는 gel16 유전자가 변이되어 불활성화된 gel16 유전자 비활성 컨스트럭트.
서열번호 7로 기재되는 gel7 유전자 및 서열번호 11로 기재되는 gel8 유전자가 이중으로 변이되어 불활성화된 gel7&8 유전자 비활성 컨스트럭트.
제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 항생제 내성 유전자가 삽입된 것을 특징으로 하는 유전자 비활성 컨스트럭트.
제 5항 내지 제 7항 중 어느 한 항의 gel7, gel16 또는 gel7과 gel8 이중 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 재조합 벡터.
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)를 상기 제 9항의 벡터로 형질전환시킨후 재조합된 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이주.
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)의 젤다나마이신 탄소 15번의 수식에 관여하는 모듈 1의 디하드라타제를 코딩하는 유전자에 카나마이신 내성 유전자가 삽입된 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이주.
스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 아종 두아마이세티쿠스(Streptomyces hygroscopicus subsp. duamyceticus)의 젤다나마이신 탄소 15번의 수식에 관여하는 모듈 1의 디하드라타제의 기능 아미노산 중 히스티딘이 글루타민으로 치환된 변이 주.
제 12항에 있어서, 기탁번호가 KCTC 10682BP로 기재되는 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 에이씨3인 것을 특징으로 하는 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이주.
제 11항 또는 제 12항 중 어느 한 항의 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이주를 상기 제 9항의 벡터로 형질전환시킨 재조합 스트렙토마이세스 하이그로프코피쿠스 변이주.
a) 제 1항 또는 제 2항의 젤다나마이신 유도체,

b) 제 9항의 재조합 벡터,

c) 제 10항 내지 제 14항의 변이주,

d) 제 10항 및 제 14항의 재조합 스트렙토마이세스 하이그로코피쿠스 변이주가 생산하는 젤다나마이신 유도체를 유효성분으로 함유하는 항생제, 항진균제 또는 항바이러스제.
제 15항의 a, b, c 또는 d를 유효성분으로하는 면역억제제 또는 항염증제.
제 15항의 a, b, c 또는 d를 유효성분으로하는 항암제.
제 10항 및 제 14항의 재조합 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이주를 배양하여 제 1항 또는 제 2항의 젤다나마이신 유도체를 생합성하는 방법.
제 10항 및 제 14항의 재조합 스트렙토마이세스 하이그로스코피쿠스 변이주를 배양하여 1Bb 또는 1Ca를 생합성하는 방법.
제 10항의 형질전환주 중 gel16 유전자 비활성 컨스트럭트를 포함하는 벡터로 형질전환 재조합된 균주를 배양하여 젤다나마이신 유도체인 4, 5-다이하이드로 젤다나마이신을 생합성하는 방법.