KR20080020930A

KR20080020930A - 혈전색전증 증후군들의 예방방법

Info

Publication number: KR20080020930A
Application number: KR1020067023504A
Authority: KR
Inventors: 헤이모 하이칼라; 조우코 레비로키; 피에로 폴레셀로; 카롤라 틸그만
Original assignee: 오리온 코포레이션
Priority date: 2004-05-12
Filing date: 2005-05-12
Publication date: 2008-03-06
Also published as: EA200602096A1; US8329693B2; AU2005239847A1; NZ550814A; JP5074923B2; WO2005107757A2; EP1744752A2; NZ579536A; US20110301166A1; NO20065669L; FI20040674A0; TWI366463B; WO2005107757A3; AR050903A1; CN1980673B; AU2005239847B2; US20080039467A1; ZA200609304B; CN1980673A; CA2564033A1

Abstract

레보시멘단 및 그 활성 대사물질(II)가 소금 감수성 래트 모델에서 뇌졸중과 관련된 뇌병변, 행동이상 증후군 및 사망의 빈도와 양을 현저하게 감소시키는 것을 발견하였다. 더욱이, 레보시멘단는 래트 조직에서 키니노겐 농도를 10배까지 증가시킨다. 시험결과는 레보시멘단 및 그 대사물질(II)이 포유동물에서 아마도 키니노겐이 개재된 효과에 의하여 뇌경색증(뇌졸증) 또는 심근경색과 같은 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 위험도를 감소시킬 수 있음을 보여주고 있다. 따라서, 레보시멘단 및 그 대사물질(II)은 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 예방에 유용하며, 특히 이러한 증후군의 높은 위험도를 가지는 사람을 포함하여 포유동물에서 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 위험도를 감소시킬 수 있다.

따라서, 본 발명은 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염을 유효성분으로 함유하는 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 예방과 치료용 조성물을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 필요한 포유동물에 투여하여 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군을 예방하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 필요한 포유동물에 투여하는 방법을 포함하여 이러한 증후군 발 생의 높은 위험도를 가지는 포유동물에 투여하여 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 위험도를 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 예방용 치료제의 제조에 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 높은 위험도를 가지는 포유동물에서 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 위험도를 감소시키는 약제의 제조에 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 출혈 또는 폐색성 증후군의 높은 위험도를 가지는 포유동물에서 혈관의 출혈 또는 혈전, 색전 또는 폐색성 위험도를 감소시키는 약제의 제조에 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 출혈, 또는 혈전 및 색전을 예방하는 약제의 제조에 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.

마지막으로, 본 발명은 또한 뇌출혈의 예방용 약제의 제조에 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염의 용도를 제공하는 것이다.

혈전, 색전, 출혈성 증후군

Description

혈전색전증 증후군들의 예방방법{A METHOD FOR THE PREVENTION OF THROMBOEMBOLIC DISORDERS}

본 발명은 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그 약학적으로 허용되는 염류를 이러한 예방을 필요로 하는 포유동물에 투여하여 뇌경색증(뇌졸증) 또는 심근경색과 같은 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군을 예방하는 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

혈전경색성 질환, 예를 들면 혈전에 의한 혈관의 차단은 많은 성인들을 공격하며, 죽음의 원인이 될 수 있다. 대부분의 자발적으로 발전하는 혈관성 폐색들은 혈전들로 알려진 혈관내 혈전의 형성에 기인하는 것이며, 이것은 결국 그 형성되는 곳에서 동맥을 차단한다. 이러한 폐색들은 혈전성 색전들로 알려져 있다. 또한 혈전(색전)의 작은 조각들은 그 신체의 형성되는 곳에서 떨어져 나와 순환기계를 통하여 이동하여 멀리 떨어져 있는 장기에 도달한다. 이들 색전들은 다음에 정지하여 정상적인 순환을 방해하는 치명적인 복합적 증후군을 야기할 수 있다. 이러한 폐색은 체내의 다른 곳에서 형성한 혈전에 의하여 야기되며, 혈류를 타고 이동하여 색전성 폐색으로 알려져 있다. 뇌경색증(뇌졸증), 심근경색(심장발작) 및 신장 및 폐 부전 증들은 혈전 색전성 현상의 결과로 잘 알려져 있다. 혈관의 폐색은 또한 동맥벽에 2차적인 균열이나 누출의 원인이 되어 출혈로 이어진다. 혈관벽의 일차적인 파열은 혈전성이니 폐색성 폐색없이 동맥류(동맥의 벽의 약한 부분)에서 발생한다. 일차적 뇌출혈의 예들은 뇌내출혈(intracranial haemorrhage) 및 지주막하 출혈(subarachnoidal haemorrahage)을 포함한다.

피브린은 비교적으로 불용성인 네트워크를 형성하는 혈병(clot)의 주요 단백질 성분이다. 혈병들은 혈중에 고농도로 존재하는 가용성 피브리노겐이 트롬빈의 작용에 의하여 불용성 피브린으로 전환될 때에 형성된다. 단백용해성, 특히 피브린용해 효소들이 피브린 매트릭스(fibrin matrix)의 분해는 혈전의 용해를 가져오기 때문에 혈관폐색의 용해에 사용되어 왔다.

또한 포유동물의 혈액은 혈전용해의 역할을 담당하는 프라즈마노겐 시스템이라 불리워지는 섬유 유용해 시스템을 함유하고 있다. 섬유용해시스템은 플라스마노겐을 함유하고 있으며, 이것은 플라스마노겐 활성인자(PA)의 작용에 의하여 활성 엔자임 플라스민으로 전환되고, 이것은 차례로 피브린을 소화시켜서 가용성 분해 생성물로 전환시킨다. 두 생리적 플라스미노겐 활성인자들, 즉 조직형 타이프(t-PA)와 유로키나제-타입(u-PA)가 확인되었다.

플라스미노겐 활성의 저해는 플라스미노겐 활성인자 저해제-1(PAI-1)에 의하여 이 루어지며, 이것은 t-PA와 함께 안정한 불활성 콤플렉스를 형성한다. 혈전-반응성 PAI-1의 대부분은 혈전내에 축적하여 그것을 섬유용해에 저항하게 한다. 높아진 PAI-1 레벨은 전체적으로 증가된 항혈전 용해 능력으로 인하여, 예를 들면 심부전증이나 또는 심한 혈관 혈전등과 같은 중요한 혈전 리스크 인자를 구성한다.

PAI-1은 풍부한 플라스마 글리코프로테인인 비트로넥틴(vitronectin : VN)과의 콤플렉스 상태에서만 기능적으로 안정하다. 더욱이, VN은 PAI-1에서 피브린에 결합하는 결정적인 역할을 담당한다. PAI-1과 유사하게, 고분자량의 키니노겐( high molecular weight kininogen : HK)도 또한 VN과 결합하여 PAI-1과 함께 VN의 인접하는 결합 사이트들를 완성한다. 이리하여, 키니노겐(HK)은 PAI-1 - VN 컴플렉스의 형성을 저해하거나 또는 분리되어, PAI-활성의 감소화에 기여하게 된다. 진실로, 연구들은 키니노겐(HK)이 프로트롬빈 성보다는 항트롬빈성임을 보여주고 있으며, 키니노겐(HK) 결핍환자들은 혈전증의 위험이 증가된다.(Chavakes, T. et al., "A Novel Antithrombotic Role for High Molecular Weight Kininogren as Inhibitor of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Function", Journal of Biological Chemistry, 277, 36, 32677-32682(2002).

혈전성, 색전증성 및/또는 출혈성 증후군들을 예방할 수 있는 약물은 혈전성, 색전증성 및/또는 출혈성 증후군들의 높은 위험성이 있는 환자들에게는 높은 이익이 있게 될 것이다.

화학명이 [[4-(1,4,5,6-테트라하이드로-4-메틸-6-옥소-3-피리다지닐)페닐]하이드라지노]프로판디니트릴인 레보시멘단 및 그 제조방법은 EP 566646 B1에 기재되어 있다. 레보시멘단은 허혈에 강력한 효능이 있다. 레보시멘단은 심장근육의 수축성 단백질의 칼슘 감수성를 증가시켜서 심장의 수축력을 증기시킨다. 레보시멘단은 다음의 구조식을 가진다.

인간에서의 레보시멘단의 혈류역학적 효과들은 Sundgerg, S. et al., Am. J. Cardiol., 1996; 75: 1061-1066 및 Lilleberg, J. et al., Cardiovasc. Pharmacol., 26(Suppl. 1), S63-S69, 1995에 기재되어 있다. 정맥내 또는 경구투여후의 인간에서의 레보시멘단의 약물동력학은 Sandell, E.-P. et al., J. Cardiovasc. Pharmacol., 26(Suppl. 1), S57-S62, 1995에 기재되어 있다. 임상연구는 허혈 환자들에서 레보시멘단의 유익한 효과들을 확인하고 있다.

최근에는 레보시멘단을 사람에게 투여후에 존재하는 활성 대사물질인 (R)-N-[4-(1,4,5,6-테트라하이드로-4-메틸-6-옥소-3-피리다지닐)페닐]아세트아마이드(II)를 가지고 있는 것이 알려졌다. (II)의 효과는 레보시멘단에 유사하다. 심장근육에서 수축 단백질의 칼슘 감수성을 증가시키는 (II)의 용도에 관하여는 WO99/66932에 기재되어 있다.

급성 심부전증의 치료에 혈전용해제와 함께 레보시멘단의 투여는WO03/063870에 기재되어 있다. 그러나, 레보시멘단이 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군들의 위험도를 감소시키는 항혈전성 효과에 대하여서는 기재된 바 없다.

레보시멘단 및 그 활성 대사물질(II)가 소금 감수성 래트 모델에서 뇌졸중과 관련된 뇌병변, 행동이상 증후군 및 사망의 빈도와 양을 현저하게 감소시키는 것을 발견하였다. 더욱이, 레보시멘단는 래트 조직에서 키니노겐 농도를 10배까지 증가시킨다. 시험결과는 레보시멘단 및 그 대사물질(II)이 포유동물에서 아마도 키니노겐이 개재된 효과에 의하여 뇌경색증(뇌졸증) 또는 심근경색과 같은 혈전, 색전 및또는 출혈성 증후군의 위험도를 감소시킬 수 있음을 보여주고 있다. 따라서, 레보시멘단 및 그 대사물질(II)은 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 예방에 유용하며, 특히 이러한 증후군의 높은 위험도를 가지는 사람을 포함하여 포유동물에서 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 위험도를 감소시킬 수 있다.

본 발명은 또한 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염의 유효량을 필요한 포유동물에 투여하는 방법을 포함하여 이러한 증후군 발생의 높은 위험도를 가지는 포유동물에 투여하여 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 위험도를 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.

본 명세서에서 사용된 “혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군들”이란 용어는 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군들의 발생 또는 재발을 감소시키는 의미이다. 유사하게, “뇌출혈의 예방”이란 용어는 뇌출혈의 발생 또는 재발을 감소시키는 의미이다.

본 명세서에서 사용된 “혈전 및/또는 색전 증후군들”이란 용어는 혈전 또는 색전으로 인하여 혈관의 폐색 또는 부분 폐색으로부터 초래되는 급성 또는 만성의 병리적 상태를 의미한다. 유사하게, “혈전 또는 색전성 폐색”은 혈전 또는 색전으로 인하여 혈관의 폐색 또는 부분 폐색을 의미한다. 혈전 및 색전성 증후군들의 예들은 여기에 한정되는 것은 아니나, 뇌경색증(뇌출혈), 일과성 허혈증(transient ischemic attack) 및 혈관성 치매; 심부전등, 급성 관상동맥 증후군, 불안전한 협심증 및 뇌혈전 및 색전 증후군들 빈혈성 돌연사 등과 같은 심장의 혈전 및 색전성 증후군과 같은 뇌 혈전 및 폐색 증후군들; 폐 또는 신장 부전증; 말초 순환기계 증후군; 및 중증 정맥 혈전증등을 포함한다.

본 명세서에서 사용된 “출혈성 증후군”이란 용어는 손상된 혈관으로부터의 출혈에서 기인하는 급성 또는 만성의 병리적 상태들 또는 증후군들을 의미한다. 출혈성 증후구들의 에는 여기에 한정되는 것은 아니나, 뇌내출혈(ICH), 일과성 허혈증(transient ischemic attack) 및 혈관성 치매; 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage : SAH) 및 출혈성 뇌졸중을 포함한다.

본 발명의 바람직한 태양의 하나는 뇌혈전, 뇌색전 및/또는 출혈성 증후군들, 특히 뇌 허혈(뇌졸증), 일과성 허혈증(transient ischemic attack : TIA), 뇌내출혈(ICH), 지주막하 출혈(subarachnoid hemorrhage : SAH) 또는 혈관성 치매의 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 태양에 의하여, 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염류를 심장의 혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군들, 특히 심주전증, 급성 관상동맥 증후군 및 불안정한 협심증의 예방용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 태양에 의하여, 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염류를 심방의 섬유화 또는 다른 심장 부정맥을 저해하는 것과는 다른, 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군들의 예방에 사용된다. 본 발명의 다른 태양에 의하여 치료될 환자들은 심방의 섬유화 또는 기타 심장 부정맥으로부터 고통받지 않는다.

본 발명의 또 다른 태양에 의하여, 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염류는 상승된 혈압을 낮추는 것과는 독립적으로 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군들의 예방에 사용된다. 본 발명의 다른 태양에 의하여 치료될 환자들은 고혈압으로부터 고통을 받지 않는다.

본 발명의 또 다른 태양에 의하여, 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염류는 심장 허혈을 저해하는 것과는 별도로, 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군들의 예방에 사용된다.

혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군의 높은 위험과 관련이 있는 증후군들은 여기에 한정되는 것은 아니나, 앞의 혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군들; 정형외과 골절 또는 기타 부상들; 연장된 침상 휴식; 다리의 만성 중증 정맥 부전증; 당뇨병; 고 지혈증 수치; 동맥괴사; 심내막염; 악성종양; 임신; 및 심장 상담(cardiac intervention), 경피 콜로나리 인터빈션(percutaneous coronary intervention), 혈관성형 및 보철 밸브(prosthetic valves)과 같은 외과 수술의 수술후기들을 포함한다.

본 발명의 방법은 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그들의 약학적으로 허용되는 염류의 유효량을 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군들을 방지하는데 효과적인 량을 숙주에 투여하여 혈전의 생성을 방지하거나 및/또는 혈전의 섬유용해를 유도하여 투여방법에 관한 것이다. 이론에 구애됨이 없이, 레보시멘단은 적어도 부분적으로는, 키니노겐의 발현 및/또는 분비를 증가시킴으로서 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군들을 방지하는 것으로 예측된다. 바람직하게는, 레보시멘단은 혈액의 항상성 균형에 영향을 주지 않고, 즉, 혈소판 응집이나 또는 혈약응고를 현저하기 저해함이 없이 혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군을 예방한다.

레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)의 투여는 경구 또는 직장내 투여와 같은 장관내 투여; 정맥주사와 같은 비경구투여; 또는 경피투여나 점막투여로 투여할 수 있다.

숙주에게 투여되는 레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)의 유효량은 투여되거나 또는 예방되는 환자의 조건, 투여경로, 나이, 체중 및 환자의 상태에 따라서 변화될 수 있다. 레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)의 경구 일일 용량은 약 0.05 내지 약 10mg이다. 사람에 있어서, 혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군의 장기 예방을 위하여서는 상대적으로 적은 경구용량이 일반적으로 바람직하다. 예를 들면, 경구 일일 투여량의 경우 약 0.05 내지 5mg, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 4mg, 더욱 바람직하게는 약 0.2 내지 약 3mg이다.

레보시멘단은 정맥네 인퓨젼으로 인퓨젼 비율로 약 0.01 내지 약 5μg/kg/min., 더욱 바람직하게는 약 0.02 내지 약 3μg/kg/min.이다. 활성 대사물질(II)은 인퓨젼 비율로 ir 0.01 내지 약 1μg.kg/min, 바람직하게는 약 0.005 내지 약 0.5μg/kg/min이다.

본 발명의 활성성분은 환자의 필요에 따라서, 1일 1회 또는 수회, 또는 주당 또는 2주당과 같은 정기적으로 투여할 수 있다.

혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군을 예방하기 위하여서는 경구투여가 특히 바람직하다. 특히 바람직한 활성성분은 레보시멘단 또는 그 약학적을 허용되는 염류이다.

레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)은 문헌에 잘 알려진 기준을 사용하여 혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군의 예방에 적합한 용량형태로 제형화할 수 있다. 즉, 제형내의 활성성분의 함량이 약 0.1 내지 100%(중량)의 형태의 정제,과립제, 캡슐제, 좌제, 유제, 현탁제, 또는 액제의 형태로 적당한 약학적 부형제와 함께 제형화 할 수 있다. 조성물용의 적합한 성분들의 선택은 이 분야에 통상의 지식을 가진 사람들에게는 극히 통상적인 일이다. 적당한 담체,용제, 겔형성제, 분산형성 성분, 산화방지제, 착색제, 감미제, 습윤제 화합물, 지속성 조절 성분 및 기타 성분들은 이 분야에 통상의 지식을 가진 사람들에게는 잘 알려진 일이다.

본 발명의 한 태양에 의하여, 혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군의 예방, 특히 폐색 출혈 또는 혈관의 폐색, 색전을 예방하는 제제형태는 레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)을 단독의 활성성분을 함유하던가 또는 약물사용의 설명서의 지시대로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 다른 태양에 의하여, 용량형태는 레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)을 혈전, 색전 및 또는 출혈성 증후군에 유용한 다른 활성서분과 함께 함유하는 것이다.

정제형태의 경구투여에는, 예를 들면 락토스, 옥수수전분, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 포스페이트 및 탈크와 같은 적당한 담체나 부형제를 포함한다. 캡슐형태의 경구투여에는, 락토스, 옥수수전분, 마그네슘 스테아레이트 및 탈크와 같은 유용한 담체 및 부형제를 포함할 수 있다. 제속성 경구투여 조성물로는 지속성 성분들을 사용할 수 있다. 전형적인 지속성 성분들은 하이드록시프로필메틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 알기닌산, 또는 이들의 혼합물들과 같은 친수성 겔형성 폴리머들; 수소화 대두유, 경화 피마자유 또는 피마자씨유(Cutina HR이라는 상품명으로 판매), 면실유(Sterotex or Lbritab라는 상품명으로 시판중) 또는 그 혼합물들과 같은 식물성 지방 또는 오일; 예를 들면 글리세릴트리스테아레이트, 글리세릴 트리팔미테이트, 글리세릴 트리미리스테이트, 글리세릴 트리베헤네이트(Compritol이라는 상품명으로 시판중) 및 글리세릴 팔미토스테아린산 에스테르와 같은 포화 지방산 또는 그 혼합물들과 같은 지방산 에스테르류를 포함한다.

정제는 활성성분과 담체 또는 부형제와 혼합하고 분말성 혼합물을 정제로 타정하여 제조한다. 캡슐제는 활성성분을 담체 및 부형제와 혼합한 다음 분말성 혼합물을 예를 들면 젤라틴 경캡슐에 충진하여 제조한다. 전형적으로 정제 또는 캡슐제는 레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)을 0.05 내지 10mg, 더욱 전형적으로는 약 0.2 내지 4mg을 함유한다.

주사제 또는 인퓨젼 조성물과 같은 비경구투여에 적합한 조성물은 레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II) 및 담체, 바람직하게는 수성 용제의 멸균 등장액을 포함한다. 전형적인 비경구 인퓨젼 액제는 레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)을 약 0.01 내지 0.mg/ml를 포함한다.

레보시멘단 또는 그 활성 대사물질(II)의 염류는 공지의 방법으로 제조된다. 약학적으로 허용되는 염류는 활성 dirw제로 유용하다. 그러나, 바람직한 염류는 알칼리 또는 알칼리토류금속의 염류이다.

도 1은 레보시멘단의 두 다른 용량으로 처리한 고염도 음식물을 섭취한 Dahl salt-감수성 래트들의 사망률(%)(Dahl HS + 레보 1 및 Dahl HS + 레보 10)을 약물로 처리하지 않은 고염도 음식물을 섭취한 Dahl salt-감수성 래트(Dahl HS)와 저염도 음식물을 섭취한 Dahl salt-감수성 래트들(Dahl LS)의 사망률을 보여주는 것이다.

1. 경구 캡슐제

젤라틴 경캡슐 3호

레보시멘단 2.0mg

유당 198mg

캡슐형태의 약학적 제제는 레보시멘단을 유당과 혼합하고 분말성 혼합물을 젤라틴 경캡슐에 충진한다.

2. 정맥용 인퓨젼의 농축액

(2) 레보시멘단 2.5mg/ml

(b) 콜리돈 PF12 10mg/ml

(c) 구연산 2mg/ml

(d) 무수 에탄올 적당량 첨가 1ml(785mg)

농축액은 구연산, 콜리돈 PF12 및 레보시멘단을 멸균된 제조용 용기중에서 무수 에탄올에 교반하여 용해시킨다. 결과로 얻어진 벌크 용액을 멸균 필터(0.22μm)를 통하여 여과한다. 멸균 및 여과된 벌크 용액을 다음에 무균적으로 8ml 및 10ml용 주사용 바이알들(5ml 및 10ml 용량)에 충진한 다음 고무전으로 밀전한다.

정맥주사용 인퓨젼의 용축용액은 사용전에 수용성 희석제로 희석한다. 전형적으로 농축용액은 5% 글루코스 용액 또는 0.9% NaCl 용액과 같은 수용성 등장용액으로 희석하여 수용성 정맥주사용 액제를 얻는다. 여기에서 레보시멘단의 양은 일반적으로 약 0.001 - 1.0mg/ml, 바람직하게는 약 0.01-0.1mg/ml의 범위내에 있다.

실험예들

실험예 1 염 감수성 래트 모델에서의 사망률에 대한 효과

Dahl salt-감수성 래트들의 초기 사망률에 대한 레보시멘단의 효과가 연구되었다. Dahl salt-감수성 래트들을 고염도 음식물을 섭취하여 고혈압을 유발시켜서 사망률을 증가시킨다. 고혈압의 초기 상태에서, 사망률은 거의 뇌출혈 및 돌연사에 기인한다.(Qu, P. et al., Hypertens. Res., 2000;23;613-623 참조).

6-주령의 숫컷 Dahl salt-감수성 래트들(SS/JrHsd)은 다음의 음식물 및 약물 섭생을 7주간 섭취시킨다:

1) Dahl SS를 고염도 식품으로 조절한다.

2) Dahl SS 래트들을 고염도 음식물 + 고용량 레보시멘단(음용수중 레보시멘단 10mg/l)을 섭취시킨다.

3) Dahl SS 래트들을 고염도 음식물 + 저용량 레보시멘단(음용수중 레보시멘단 1mg/l)을 섭취시킨다.

4) Dahl SS 래트들을 저염도 음식물을 섭취시킨다.

고염도 음식물은 시판중인 저염도 음식물에 NaCl을 첨가하여 제조한다.

초기 생존 결과들은 Kaplan-Meier Plot로서 도 1에 내타내었다. 고염도 음식물을 섭취한 래트들의 38%(9/24)만이 7-주까지에서 생존하였다. 저농도 레보시멘단 투여 그룹(n=12) 의 래트들은 모두 사망하였다. 고농도 레보시멘단 투여 그루의 래트들은 12필중 3필만이 사망하였다. 따라서, 레보시멘단은 염-감수성 래트들의 초기단계의 사망률이 현저하게 감소하였으며, 따라서 이 실험결과는 뇌졸중-관련된 사망률에 대한 레보시멘단의 유익한 효과가 확인되었다.

실험예 2. 염 감수성 래트 모델에서의 뇌졸중의 발생예에 대한 효과

Dahl salt-감수성 래트 뇌졸중 모델에서 뇌졸중들의 발생에 대한 레보시멘단의 효능을 핵자기공명영상촬영법(MRI)과 행동테스트(Neuroscore and Functional Observational Battery : FOB)을 사용하여 실험을 행하였다.

Dahl SS 래트들을 3 처리그룹으로 나눈다.

고염도음식물 + 비히클(n=20),

고염도 음식물 + 레보시멘단 1mg/kg/일(n=20), 및

정상 염 음식물 대조군(n=4).

고염도 음식물은 시판중인 저염도 음식물에 NaCl 7%를 함유한다. 고염도 음식물의 섭취는 6주령의 나이에서 시작하여 연구의 끝인 7주간 계속되었다. 레보시멘단은 음용수(음용수중의 레보시멘단 2mg/l)를 통하여 투여하였다. 투여는 동시에 고염도 음식물과 함께 시작하여 연구의 끝까지 계속하였다. 음용수 및 음식물의 소비 및 체중과 동물들의 일반적인 건강을 모니터하였다. MRI는 2-8주중 일주일에 한번씩 행하였다. FOB 및 7-점 뉴로스코어 테스트는 1-3주중 일주일에 한번, 그리고 4-8주중에는 일주일에 2회 행하였다.

사망률 :

모든 동물들은 실험이 끝날때까지 콘트롤 음식물을 섭취시켰다. 레보시멘단 그룹에서 단지 한 동물(5%)만이 연구기간중에 사망하였다. 한편, 비히클 그룹 사망률은 실험이 끝날 때까지 70%에 이르렀다.

생체내 MRI :

4.7T 수평 마그네트(Magnex Scientific Ltd.)에 접촉된 바리안 이노바 콘솔(Varian Inova Console)을 사용한 디퓨젼 및 T2-웨이티드 MRI(Diffusion and T2-weighted MRI)를 할로탄으로 마취시킨 래트들에서 일주일에 한번 행하였다. T-2-웨이티드 영상 및 정량 이퓨젼 영상(quantitative diffusion imaging)을 사용하여 Dahl SS 래트들에서 병변의 크기를 결정하고, 진짜같은 허혈성 병변을 특징지었다. 전형적인 병변들은 균질하지 않았으며, 상이한 MRI 특성들과 함께 여러 다른 부위로 구성되 어있었다. T2-웨이티드 영상에서의 하이퍼인텐시티(hyperintensity)가 실질적으로 감지가능한 비정상들이 모든 동물들에서 발견되었다. 이것은 부종성 조직(oedematous tissue)으로 설명될 수 있으며, 이것은 허혈성 조직의 특이적인 형태이다. 그리고 일반적으로, 섭취 용기의 폐색후에 ～12-24시간에서 시작되어 감지되는 것이다. 더욱이, 허혈 동물들의 대부분은 하이퍼인텐스 병변부위내의 국소적 시그날보이드 부위(local signal void areas)를 보여주고 있다. 이 연구에서 사용된 고자장(4.7T)에서, 자철성 물질(ferromagnetic substance은 자장 균질성에 국소적 분열을 일이키며, 이것은 T2-웨이티드 영상을 파괴한다. 이것은 철을 함유하고 있는 혈액중의 헤모글로빈으로 출ㄹ혈에 대한 특이적인 MRI의 모습이다. 따라서, 본 연구에서 검색된 거의 대부분의 병변들은 출혈과 관련된 특성화된 것으로 볼 수 있다.

비히클-처리 동물들은 레보시멘단 처리 그룹에 비하여 더 많은 뇌졸중의 빈도와 더 큰 뇌졸중 량을 가진다. 연구의 6주에서, 비히클 처리된 동물들의 50%이상이 T2-웨이티드 MRI 변화가 감지되었으며, 한편, 그 때에 레보시멘단 처리그룹에서는 아무런 변화가 관찰되지 않았다. 최종적 MRI 측정에서, 측정가능한 T2-웨이티드 MRI 변화들이 레보시멘단 처리 동물들의 10%와 비히클 처리된 동물들의 85%에서 관찰되었다.

(표 1). 약어 : LS, 레보시멘단.

생체외(Ex vivo) MRI:

생체외 영상을 위하여, 동물의 사후 뇌(post-mortem brain)를 두개골로부터 분리하고, 4% 포르말린에 48시간 침적시킨다. 그 후에 0.1M PBS에 저장한다. 뇌를 퍼풀루오로폴리에테르(perfluoropolyether)에 끼워넣고 MRI를 SMIS-console에 접촉시킨 9.4T 마그네트에서 촬영한다. 하이퍼인텐시티와 시그날 보이드 부위의 해석은 셍체실험에서 행해진 다로 따른다. 생체외 실험에서는 현저한 부종을 가진 성숙된 병변과 파괴된 조직구조만이 측정될 수 있었다. 생체내에서는 측정될 수 있었던 초기 T2 콘트라스트는 생체외실험에서는 측정될 수 없었다. 생체외 실험에서 확인된 것 은 대부분의 허혈성 병변들은 출혈과 관련이 있다는 생각을 지지하는 것이다. 생체외 MRI는 또한 비히클 처리된 동물들은 레보시멘단 처리 그룹과 비교할 때, 뇌졸중의 더 높은 빈도와 더 큰 뇌졸중의 양을 가지고 있음을 보여주고 있다.

표 2 참조. 약어 : LS, 레보시멘단.

행동 실험 :

기능적 관찰 계열(Functional observational battery : FOB) 및 뉴로스코어 실험(Neuroscore testing)을 1-3주중에는 일주일에 1회, 4-8주중에는 일주일에 2회 행하였다.

a) Neuroscore :

7-포인트 뉴로스코러 테스트가 모터(motor)와 행동결핍(behavioral deficits)를 평가하는데 사용되었다.(modified from Zausinger et al., Brain Res. 863:94-105, 2000 참조). 신경학적 테스트는 래트의 처리 상황을 모르는 조사자들에 의하여 수행되었다. 7-포인트 등급은 아래와 같다:

등급 6 : 꼬리로 암전히 들어올릴 때, 두 앞의 갈비뼈가 마루로 향한여 정상적으로 늘어지는 상태.

등급 5 : 꼬리로 얌전히 들어올릴 때, 온화한 발목의 굴곡과 어깨 어덕션(adduction)에서 어께의 내부적 회전과 함께 발목과 발꿈치의 완전한 굴곡과 어덕션의 심한 자세를 가지는, 앞의 갈비의 어느것의 일관된 굴곡.

등급 4 : 양편의 어느 한편을 향하여 측면을 누를 때 일치되게 감소된 저항.

등급 3 : 꼬리를 끌거나 꼬리로 들어올릴 때 어느 쪽 방향으로 회전함.

등급 2 : 꼬리를 끌면 어느 쪽을 향하여 외전함.

등급 1 : 어느 쪽을 향하여 자발적으로 회전함.

등급 0 : 자발적 행동이 없음.

결과들 :

대조 동물들 및 레보시멘단을 투여한 동물들은 모두 연구를 통하여 최고의 스코어를 기록하였다, 한편 비히클 그룹에서는 스코어는 연구의 5주째부터 감소하기 시작 하였다.

b) FOB :

모든 래트들은 표준화된 공정을 사용하여 관찰하였다. 공정들은 홈 케이지(home cage)에 있는 래트의 관할을 포함한다. 한편, 개방된 장소 및 조종적 실험들도 포함된다. 측정은 다음의 것들을 포함한다.

(1) Home-case 측정 :

신체의 위치, 호흡, 발성 및 눈꺼플의 잠김.

(2) 손으로의 관찰

들어올릴 때의 반응성, 취급, 눈물의 흐름, 타액분비, 모발의 섬 및 기타(털의 늘어뜨림, 물건의 물어뜯음, 꼬리의 미싱(miss), 몸의 여윔, 등)

(3) 새로운 환경/야외의 활동성

리어링(rearings) I의 수(래트는 앞다리를 사용하지 않는다.), 리어링 II의 수(래트는 그 자신 벽에 의지한다.), 경련성 무의식적 운동, 강력한 무의식적 운동, 걸음걸이, 활동성, 입체운동의 발생, 비정상적 행동, 배변의 회수 및 소변의 회수.

(4) 자극반응

접근 반응, 접촉반응, 눈꺼플 반사, 귓바퀴 반사, 소리반응 및 꼬리 꼬집음 반응.

(5) 신경 및 근육 측정

복부 긴장도, 사지의 긴장도 및 잡음의 강도

(6) 직장 체온

(7) 추가적 데이터

눈의 색깔, 공중 점액분비 및 말초 혈액순환((심이, 발가락, 꼬리, 코).

결과 :

레보시멘단은 FOB 테스트에서 관찰된 뇌졸중-관련된 행동결핍증을 현저하게 감소하고 지연시킨다.

요약하여, 실험은 레보시멘단이 Dahl SS 래트에서 치료를 예방적으로 시작하였을 때, 뇌졸중과 관련된 사망률, 발생율, 뇌의 병변의 양 및 행동장애를 현저하게 감소 및/또는 지연시킨다.

실험예 3. 키니노겐 발현에 대한 효과

방법

래트들에 수돗물중에 20mg/l의 양의 레보시멘단을 경구로 투여하고, 수돗물만을 8일간 콘트롤한다. 심장들을 액체질소에 동결시키고 -80℃에서 저장한다. 심장조직을 얼음중에서 하룻밤 동결 건조시키고 라이스 완충액(9M urea, 20mM Tris-HCl pH 7.4, 50mM KCl, 3mM EDTA pH 7.5, 0.55 IPG buffer 3-10NL, 5mM PMSF, 1% DTT 및 Benzoase 100unit)에서 실온에서 10분간 배양한다. 단백용액을 다음에 2x15s 동안 초음파처리하고 14000rpm에서 5분간 원심분리한다. 상등액을 수집하고, 단백질양을 BioRad로부터 단백질 분석키트로 분석한다. 40μg 단백질 용액을 재하이드레이션 완충액(rehydration buffer: 7M urea, 2M thiourea, 2mM TBP, 0.5% IPG buffer 3-10 NL, 4% CHAPS 및 0.2% BFB) 350μl에 희석시킨 다음, 실온에서 30분간 배양한 다음, 14000rpm에서 5분간 원심분리한다.

상등액 350μl를 IPG strip 18cm, pH 3-10NL(Amersham Pharmacia Biotech)에 적용한 다음, 스트립을 스트립 홀더에 넣는다. 파라핀오일 600μl를 각각의 스트립의 꼭대기에 적용한 다음, 각각의 스트립을 다음에 다음의 프로그램에 따라서 IPGphor 전기영동 장치에 건다.

0V 7h,

20V 7h,

100V 5h,

500V 1h,

1000V 1h,

3000V 1h,

8000V 5.5h.

모은 스트립들을 다음의 완충액(6M urea, 50mM Tris-HCl, pH 8.8, 2% SDS, 30% glyceril, 2% DTT, 2.5% iodoacetaide and 0.2% BFB)에서 실온에서 2x10분간 안정화시킨다. 다음에 스트립들을 11% SDS-PAGE위에 적용하고, 0.75% 아가로스레 덮은 다음 4℃, 100V에서 4시간 작동시킨다. SDS-PAGE 겔을 Amersham Pharmacia Biotech에서 시판중인 키트(PlusOne)에 의하여 은염색(silver staining)을 행한다. 겔을 염색한 후에, 영상 덴시토메타(imaging densitometer: Calibrated imaging densitometer GS-710, BIO-RAD)으로 스캐닝한다. 은염색한 헬들을 PD-QUEST(6.2) 2-DE 소프트웨어(BIO-RAD)에 의하여 분석한다. 단백질 스포트 디텍션 및 겔 에디팅한 후에, 매치 세트(match set)를 6겔로부터 구축한다; 레보시멘단 심장들 3 복제물 및 콘트롤 3. 겔 분석은 콘트롤에 대한 레보시멘단 시료를 비교하여 수행한다. O.D.에서 2배수 차이(twofold difference는 편차 단백질 발현에 대한 기준으로 사용된다.

PD-QUEST 분석법에 기준하여 염색된 단백질 스포트들은 겔로부터 잘라내고, 은으로 염색된 겔 슬라이스들은 -20℃에서 저장한다. 매스 핑거프린팅(mass fingerprinting)용 단백소화는 인겔 다이제스쳔 프로시져(in-gel digestion procedure: Rosefeld, J. et al., Anal. Biochem., 203:173-179, 1992)에 의하여 행한다. 소화전에, 단백질은 환원시키고 알킬화시킨다. 단백질들은 변형 트립신 용액 2μl를 0.04μg/μl(Sequencing Grade Modified Trypsin, porcine, Promega)의 농도에서 소화시킨다.

모든 시료들은 리버스 페이스 피페트 팁 C₁₈(reversed phase pipette tips C₁₈ :ZipTip, Millipore)에 의하여 제조된다. 시료 3μl를 50% 아세토니트릴 과 0.1% 트리플루오로아세트산에 희석시킨 시아노-4-하이드록시신나민산중에 용출시킨 다음, MALDI-TOF 시료위에 적용시킨다. 시료들을 샐 질량분석기(Voyager-DE PRO)에서 분석한다. 질량분석은 양이온화 모드(positive ionization mode)에 의하여 완료되며, 타임 오브 플라이트 페어런트 매스 컴퓨테이션(time-of-flight parent mass computation)에 대한 질량범위는 500-3500의 MHz로 커버된다. 얻어진 펩타이드류의 질량들은 Expasy Molecular Biology server PeptIdent상의 MS-fit 프로그램에 의하여 분석된다.

결과들

래트 심장들 레보시멘단/콘트롤의 추출물들은 2-DE gels로 분석되었으며, 은 염색 분석법에 의하여, 우리는 총 약 1500 스포트들을 얻었다. 10배 높여서 조절된 단백질 발현은 SWISS PORT 확인번호 PO8934 체인 1 :키니노겐-rattus novergicus pI 6.22와 매치된 분자량 68.9kDa의 단백질로 보여진다.

레보시멘단 및 그 대사물질(II)은 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 예방에 유용하며, 특히 이러한 증후군의 높은 위험도를 가지는 사람을 포함하여 포유동물에서 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 위험도를 감소시킬 수 있다.

Claims

혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 예방의 효능을 가지는 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그 약학적으로 허용되는 염을 활성성분으로 함유하는 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 예방될 증후군이 뇌혈전, 뇌색전 및/또는 뇌출혈성 증후군인 약학적 조성물.
제 2항에 있어서, 뇌혈전, 뇌색전 및/또는 뇌출혈 증후군이 뇌경색(뇌줄증), 일과성 허혈증(TIA), 대뇌내 출혈(ICH), 지주막하 출혈(SAH) 또는 혈관성 치매인 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 예방될 질병이 심장의 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군인 약학적 조성물.
제 4항에 있어서, 심장의 혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군이 심부전증, 급성 관상동맥 증후군 또는 안정하지 않은 협심증인 약학적 조성물.
제 1항에 있어서, 예방된 증후군이 폐 또는 신장 부전증, 말초 순환기계 증후군 또는 심한 정맥 혈전증인 약학적 조성물.
혈관의 출혈, 혈전 또는 색전의 위험도가 높은 포유동물에서 혈관의 출혈, 혈전 또는 색전의 위험도를 감소시키는 약제의 제조에 있어서, 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그 약학적으로 허용되는 염류를 사용하는 방법.
혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 예방이 필요한 포유동물에게 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그 약학적으로 허용되는 염류의 유효량을 투여하여 혈전, 색전 및/또는 훌혈성 증후군을 예방하는 방법.
혈전, 색전 및/또는 출혈성 증후군의 높은 위험도를 가지는 포유동물에게 레보시멘단 또는 그 대사물질(II) 또는 그 약학적으로 허용되는 염류의 유효량을 투여하여 혈전, 색전 및/또는 훌혈성 증후군ml 위험도를 감소시키는 방법.