JP5074923B2

JP5074923B2 - 血栓塞栓性疾患の予防方法

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Publication number: JP5074923B2
Application number: JP2007512237A
Authority: JP
Inventors: ハイカラ、ヘイモ; レビヨキ、ヨウコ; ポッレセッロ、ピエロ; チルグマン、カロラ
Original assignee: オリオンコーポレーション
Priority date: 2004-05-12
Filing date: 2005-05-12
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2025-05-12
Also published as: JP2007537209A; FI20040674A0; EA010890B1; CA2564033A1; EA200602096A1; NO20065669L; ZA200609304B; WO2005107757A3; AU2005239847B2; HK1107000A1; US8017609B2; CN1980673B; US20110301166A1; AU2005239847A1; TWI366463B; NZ550814A; CN1980673A; US20080039467A1; KR20080020930A; TW200536546A

Description

本発明は、脳梗塞（脳卒中）または心筋梗塞などの血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防方法であって、そのような予防を必要としている哺乳動物に、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩を投与することによる方法に関する。

血栓塞栓性疾患、すなわち凝血塊による血管の閉塞は、多くの成人に影響を与え、死の原因となり得る。瞬時に生じる血管の閉塞のほとんどは、血栓として知られている血管内凝血塊の形成によって発生し、最終的にはそれらが形成された箇所で動脈を閉塞させることになる。このような閉塞は、血栓性閉塞として知られている。あるいは、凝血塊の小さな断片（塞栓）が凝血塊の本体から遊離し、循環系を通って、凝血塊本体の箇所から離れた組織内に停留する場合がある。これらの塞栓は、その後補集され、正常な血液循環を妨げる重篤な合併症を引き起こす可能性がある。体内のどこかで形成され、血流を通じて運ばれる凝血塊によって生じるこのような閉塞は、塞栓性閉塞として知られている。脳梗塞（脳卒中）、心筋梗塞（心臓発作）および腎梗塞や肺梗塞は、血栓塞栓性の事象が発生した結果であるとして広く知られている。血管の閉塞は、動脈壁における二次破壊や漏出をも引き起こし、引き続き出血（動脈出血）も引き起こす可能性がある。血管の一次破壊は、血栓や塞栓性閉塞がなくても、たとえば、動脈瘤のある部位（動脈血管壁の弱い領域）で発生する。原発性脳出血の例としては、頭蓋内出血やくも膜下出血などが挙げられる。

フィブリンは、比較的不溶性の高いネットワークを構成する、凝血塊の主要なタンパク質成分である。血中に高濃度で存在する可溶性フィブリノーゲンがトロンビンの作用によって不溶性フィブリンに変換されたときに、凝血塊は形成される。フィブリンマトリクスが崩壊すると凝血塊が溶解するため、タンパク質分解酵素、特にフィブリン分解酵素が、血管閉塞を溶解させるために用いられてきた。

さらに、哺乳動物の血液には、血栓溶解に重要な役割を果たすプラスミノーゲン系と呼ばれる線溶系が含有されている。線溶系は、プラスミノーゲン活性化因子（ＰＡ）の作用によって、活性酵素プラスミンに変換されるプラスミノーゲンを含有しており、このプラスミンがフィブリンを可溶性分解産物に消化する。組織型（ｔ−ＰＡ）およびウロキナーゼ型（ｕ−ＰＡ）と呼ばれる２種類の生理学的プラスミノーゲン活性化因子が同定されている。

プラスミノーゲン活性化の阻害は、ｔ−ＰＡとの安定した不活性複合体を形成するプラスミノーゲン活性化因子阻害剤（ＰＡＩ−１）によって達成される。凝血塊反応性ＰＡＩ−１のほとんどが血栓内に蓄積し、当初はフィブリン溶解に抵抗を示す。ＰＡＩ−１レベルの上昇は、全体的に抗フィブリン溶解能を増強させるので、たとえば心筋梗塞や深部静脈血栓症などの重要な血栓発症危険因子となる。

ＰＡＩ−１が機能的に安定するのは、ビトロネクチン（ＶＮ）、すなわち過剰なプラズマグリコプロテインとの複合体に限定される。さらに、ＶＮは、フィブリンに結合するＰＡＩ−１で極めて重要な役割を果たす。ＰＡＩ−１と同様に、高分子量のキニノゲン（ＨＫ）もＶＮに結合し、ＶＮの近位結合部位への結合に際し、ＰＡＩ−１と競合する。したがって、キニノゲン（ＨＫ）は、ＰＡＩ−１−ＶＮ複合体の形成を阻害する、またはこの複合体を引き離し、それにより、ＰＡＩ活性を漸次低下させる。実際に研究により、キニノゲン（ＨＫ）が血液凝固作用よりむしろ抗血栓作用を有することが実証されており、キニノゲン（ＨＫ）欠損患者は、血栓症にかかるリスクが高い。Ｃｈａｖａｋｉｓ，Ｔ．ら、“ＡＮｏｖｅｌＡｎｔｉｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃＲｏｌｅｆｏｒＨｉｇｈＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔＫｉｎｉｎｏｇｅｎａｓＩｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆＰｌａｓｍｉｎｏｇｅｎＡｃｔｉｖａｔｏｒＩｎｈｉｂｉｔｏｒ−１Ｆｕｎｃｔｉｏｎ”、ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７７、３６、３２６７７−３２６８２（２００２）を参照されたい。

血栓性、塞栓性および／または出血性疾患を予防することのできる作用物質は、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患のリスクが高い患者にとってきわめて有益である。

［［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−４−メチル−６−オキソ−３−ピリダジニル）フェニル］ヒドラゾノ］プロパンジニトリルの（−）鏡像体であるレボシメンダンとその製造法が、ＥＰ５６５５４６Ｂ１に開示されている。レボシメンダンは、心臓不全の治療に効能がある。レボシメンダンは、心筋における収縮性タンパクのカルシウム感受性を高めることによって、心臓の収縮性を高める。レボシメンダンは、以下の式によって表される。

ヒトにおけるレボシメンダンの血行動態効果は、Ｓｕｎｄｂｅｒｇ，Ｓ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．、１９９５；７５：１０６１−１０６６およびＬｉｌｌｅｂｅｒｇ、Ｊ．ら、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２６（Ｓｕｐｐｌ．１）、Ｓ６３−Ｓ６９、１９９５に記載されている。静注および経口投与後のヒトにおけるレボシメンダンの薬物動態については、Ｓａｎｄｅｌｌ、Ｅ．−Ｐ．ら、Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｖａｓｃ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．、２６（Ｓｕｐｐｌ．１）、Ｓ５７−Ｓ６２、１９９５に記載がある。心不全患者におけるレボシメンダンの有益な効果は、臨床研究で確認されている。

最近になって、レボシメンダンは、投与後のヒトに存在する活性代謝産物（Ｒ）−Ｎ−［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−４−メチル−６−オキソ−３−ピリダジニル）フェニル］アセトアミド（ＩＩ）を有することが明らかとなった。（ＩＩ）の効果は、レボシメンダンと同様である。心筋内の収縮性タンパク質のカルシウム感受性を高めることを目的とした（ＩＩ）の使用が、国際公開第９９／６６９３２号パンフレットに記載されている。

急性心筋梗塞の治療における血栓溶解剤とレボシメンダンの併用については、国際公開第０３／０６３８７０号パンフレットに記載がある。ただし、レボシメンダンは抗血栓効果を有する、あるいはレボシメンダンは血栓性、塞栓性および／または出血性疾患のリスクを低減させるという記載はなされていない。

目下、レボシメンダンとその活性代謝産物（II）が、塩感受性ラットモデルにおける脳卒中に伴う脳障害、行動障害および致死の発生率やその障害部位の体積を著しく減少させるということが明らかとなっている。さらに、レボシメンダンは、ラット組織におけるキニノゲン濃度を１０倍も高めるということが突き止められた。

これらの結果は、レボシメンダンとその代謝産物（II）が、おそらくはキニノゲン介在効果によって、脳梗塞（脳卒中）などの哺乳動物における血栓性、塞栓性および／または出血性疾患のリスクを低減させることができるということを示唆している。したがって、レボシメンダンおよびその代謝産物（II）は、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防に効果があり、特に血栓性、塞栓性および／または出血性の事象を、そのような事象発生リスクの高いヒトなどの哺乳動物において低下させるという点で効果的である。

このように、本発明は、哺乳動物における血栓、塞栓および／または出血性疾患の予防方法であって、このような予防法を必要としている哺乳動物に、有効量のレボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩を投与することを含む方法を提供する。

本発明はまた、血栓性、塞栓性および／または出血性事象のリスクが高い哺乳動物におけるこれら事象発生リスクを低減する方法であって、それを必要としている哺乳動物に、有効量のレボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩を、投与することを含む方法を提供する。

本発明はさらに、血管の血栓性または塞栓性閉塞のリスクが高い哺乳動物においてこのような閉塞のリスクを低減させる方法であって、それを必要としている哺乳動物に、有効量のレボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩を投与することを含む方法を提供する。

本発明はさらに、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防のための医薬の製造における、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩の使用を提供する。

本発明はさらに、血栓性、塞栓性および／または出血性事象のリスクの高い哺乳動物におけるこれらの事象リスクを低減するための医薬の製造における、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩の使用も提供する。

本発明はさらに、血管の出血もしくは血栓性または塞栓性閉塞のリスクが高い哺乳動物におけるこのようなリスクを低減するための医薬の製造における、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩の使用も提供する。

本発明はさらに、出血または血栓や塞栓の形成を防止するための医薬の製造における、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩の使用も提供する。

最後に、本発明は、脳卒中を予防するための医薬の製造における、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩の使用も提供する。

本明細書に記載の「血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防」という用語は、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の罹患率または再発率を低減することを意味している。同様に、「脳卒中の予防」という用語も、脳卒中の罹患率または再発率を低減することを意味している。

本明細書に記載の「血栓性および／または塞栓性疾患」という用語は、血栓や塞栓により血管が閉塞もしくは部分的に閉塞した結果生じる、急性または慢性の病理学的状態または病態を意味する。同様に、「血栓性または塞栓性閉塞」という用語は、血栓または塞栓による血管の閉塞または部分的閉塞を意味する。血栓性および塞栓性疾患の例としては、脳梗塞（脳卒中）、一過性虚血性発作および血管性痴呆などの脳血栓性および脳塞栓性疾患、心筋梗塞、急性冠不全症候群、不安定性狭心症および虚血性突然死などの心臓血栓性および塞栓性疾患、さらに肺梗塞または腎梗塞、末梢血管障害および深部静脈血管血栓などが挙げられるが、特にこれらに限定されない。

本明細書に記載の「出血性疾患」という用語は、損傷を受けた血管からの出血に起因する急性または慢性の病理学的状態または病態を意味する。出血性疾患の例としては、脳内出血（ＩＣＨ）、くも膜下出血（ＳＡＨ）および脳出血性脳卒中などといった脳の出血が挙げられるが、特にこれらに限定されない。

本発明の好ましい１つの実施態様は、脳血栓性、脳塞栓性および／または出血性疾患、特に脳梗塞（脳卒中）、一過性虚血性発作（ＴＩＡ）、脳内出血（ＩＣＨ）、くも膜下出血（ＳＡＨ）または血管性痴呆を予防するための方法である。

本発明のもう１つの実施態様によれば、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくは薬学的に許容され得る任意の塩を、心臓の血栓性、塞栓性および／または出血性疾患、特に心筋梗塞、急性冠不全症候群および不安定性狭心症の予防に使用する。

本発明のもう１つの実施態様によれば、心房細動や他の心臓不整脈の抑制とは別に、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩を、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防に使用する。本発明のもう１つの実施態様によれば、治療の対象となる患者は、心房細動またはその他の心臓不整脈を発症している患者と発症していない患者とである。

本発明のもう１つの実施態様によれば、上昇した血圧の降下とは別に、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩を、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防に使用する。本発明のもう１つの実施態様によれば、治療の対象となる患者は、高血圧症を発症している患者と発症していない患者とである。

本発明のもう１つの実施態様によれば、心筋虚血の抑制とは別に、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩を、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防に使用する。本発明のもう１つの実施態様によれば、治療の対象となる患者は、心筋虚血を発症している患者または心筋虚血を発症していない患者である。

血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の高いリスクと結びつけられる条件としては、初期血栓性、塞栓性および／または出血性事象；骨折やその他のけが；長期間安静状態；足の慢性深部静脈機能不全；糖尿病；高血中脂質；アテローム性動脈硬化；心内膜炎；上皮性悪性腫瘍；妊娠；および心臓インタベンション、経皮冠動脈インタベンション、血管形成および人工弁などの外科手術の術後期が挙げられるが、特にこれらに限定されない。

本発明による方法は、好ましくは凝血塊形成の抑制および／または凝血塊のフィブリン溶解を誘発することによって、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患を予防するのに効果的である、一定量のレボシメンダンまたはその代謝産物（II）もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩を対象に投与することに関する。特定の理論に結び付けないまでも、少なくとも部分的にレボシメンダンがキニノゲンの発現および／または分泌能を亢進することによって、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患を予防すると考えられる。レボシメンダンが、止血バランスに影響を与えずに、すなわち血小板の凝集や血液凝固を有意に阻害することなく、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患を予防することが好ましい。

レボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）の投与は、たとえば経口または直腸などの経腸的、静脈注射などの非経口的、経皮的または経粘膜的なものが可能である。

被検者に投与されるレボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）の有効量は、治療または予防する病態、投与経路、患者の年齢、体重および病状によって異なる。ヒトにおけるレボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）の経口日用量は、一般に約０．０５〜約１０ｍｇの範囲である。ヒトにおける血栓性、塞栓性および／または出血性疾患を長期的に予防するためには、比較的少ない経口用量、たとえば経口日用量が約０．０５〜約５ｍｇ、好ましくは約０．１〜約４ｍｇ、より好ましくは約０．２〜約３ｍｇが一般的に好ましい。

レボシメンダンは、約０．０１〜約５μｇ／ｋｇ／分、より一般的には約０．０２〜約３μｇ／ｋｇ／分までの注入速度を用いて静脈内注入によって投与可能である。活性代謝産物（II）は、約０．００１〜約１μｇ／ｋｇ／分、好ましくは約０．００５〜約０．５μｇ／ｋｇ／分の注入速度を用いて静脈内に投与可能である。

本発明の活性成分は、患者の必要性に応じて、１日１回または１日数回、またはたとえば１週間に１回または２週間に１回など定期的に投与してもよい。

血栓性、塞栓性および／または出血性疾患を予防するためには、経口投与が特に好ましい。特に好ましい活性成分は、レボシメンダンまたはその薬学的に許容され得る塩である。

レボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）は、当該技術分野で知られている原理を用いた、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防に好適な剤形に処方される。それ自体または好ましくは好適な製剤賦形剤との組み合わせで、錠剤、顆粒剤、カプセル剤、座薬、乳剤、懸濁液または溶液の剤形で、製剤における活性化合物の含有量が、０．１〜１００％／重量として、患者に投与される。組成物に好適な成分を選択するのは、当技術分野の一般的知識を有する当業者の所定の作業である。好適な担体、溶剤、ゲル形成成分、分散液形成成分、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、湿潤性化合物、放出制御成分および本技術分野で一般に使用されているほかの成分を使用してもよいことは、明らかである。

本発明の１つの実施態様によれば、剤形は、好ましくは、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防、特には血管の出血または血栓性または塞栓性の閉塞の予防において医薬を使用するためのパッケージ記載取扱説明書と共に、単独の活性剤としてのレボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）を含有する。

本発明のもうひとつの実施態様によれば、剤形には、血栓性、塞栓性および／または出血性疾患の予防に有効な任意の他の活性成分と共に、レボシメンダンまたはその代謝産物（II）が含まれる。

錠剤としての剤形における経口投与では、好適な担体および賦形剤として、たとえば、ラクトース、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウム、リン酸カルシウムおよびタルクなどがあげられる。カプセルとしての剤形における経口投与では、有効な担体および賦形剤として、たとえば、ラクトース、コーンスターチ、ステアリン酸マグネシウムおよびタルクがあげられる。放出制御経口投与組成には、放出制御成分を使用できる。代表的放出制御成分には、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アルギン酸またはそれらの混合物などの親水性ゲル形成ポリマー、硬化大豆油または硬化ヒマシ油（ＣｕｔｉｎａＨＲという商標名で販売）、綿実油（ＳｔｅｒｏｔｅｘまたはＬｕｂｒｉｔａｂという商標名で販売）またはそれらの混合物などの植物性固形油などの植物性油脂、たとえば、トリステアリン酸グリセリル、トリパルミチン酸グリセリル、トリミリスチン酸グリセリル、トリベヘン酸グリセリル（Ｃｏｍｐｒｉｔｏｌという商標名で販売）およびグリセリルパルミトステアリン酸エステルなどの、飽和脂肪酸のトリグリセリド類またはそれらの混合物などの脂肪酸エステルがあげられる。

錠剤は、活性成分を担体および賦形剤と混合し、粉末混合物を圧縮して錠剤に成型することで製造できる。カプセルは、活性成分を担体および賦形剤と混合し、たとえば硬ゼラチンカプセルなどのカプセルにその粉末混合物を封入することで製造できる。通常、錠剤またはカプセルには、約０．０５〜１０ｍｇ、より一般的には約０．２〜４ｍｇのレボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）が含まれる。

注射用または注入用剤形などの静脈内投与に好適な製剤には、レボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）の滅菌等張液およびビヒクル、好ましくは水溶液が含まれる。通常、静脈内注入液には、約０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌのレボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）が含まれる。

レボシメンダンまたはその活性代謝産物（II）の塩は、既知の方法によって製造してもよい。薬学的に許容され得る塩は、活性薬剤として有効ではあるが、好ましい塩は、アルカリまたはアルカリ性土類金属による塩である。

製剤例
実施例１．経口カプセル
硬ゼラチンカプセルサイズ３
レボシメンダン２．０ｍｇ
ラクトース１９８ｍｇ
レボシメンダンをラクトースと混合し、硬ゼラチンカプセルにその粉末混合物を封入することで、カプセルとしての剤形の医薬製剤を製造した。

実施例２．静脈注入用原液
（ａ）レボシメンダン２．５ｍｇ／ｍｌ
（ｂ）ＫｏｌｌｉｄｏｎＰＦ１２１０ｍｇ／ｍｌ
（ｃ）クエン酸２ｍｇ／ｍｌ
（ｄ）無水エタノール添加（ad）１ｍｌ（７８５ｍｇ）
クエン酸、ＫｏｌｌｉｄｏｎＰＦ１２１およびレボシメンダンを、攪拌しながら滅菌調剤容器内で無水エタノールに溶解することで、原液を製造した。生成されたバルク溶液を滅菌フィルタ（０．２２μｍ）で濾過した。次に、８ｍｌと１０ｍｌの注射液瓶に、滅菌フィルタで濾過した溶液を無菌状態で充填し（５ｍｌと１０ｍｌの充填量）、ゴム製の栓で封をした。

使用前に、静脈内注入用原液を水性ビヒクルで希釈した。通常、原液は、レボシメンダンの量が一般に約０．００１〜１．０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは約０．０１〜０．１ｍｇ／ｍｌの範囲内であるような、水性静脈注入液が得られるように、５％のブドウ糖溶液または０．９％のＮａＣｌ溶液などの、水性等張性ビヒクルで希釈する。

実験
実験１．塩分感受性ラットモデルにおける死亡率に対する効果
Ｄａｈｌ塩分感受性ラットの初期段階死亡率に対するレボシメンダンの効果について調査研究した。塩分の多い食餌のＤａｈｌ塩分感受性ラットは高血圧症を発症し、死亡率が上昇した。高血圧症の初期段階では、死亡にいたった原因は、ほぼ完全に脳卒中と突然死にある。Ｑｕ，Ｐ．ら、Ｈｙｐｅｒｔｅｎｓ．Ｒｅｓ．，２０００；２３：６１３−６２３を参照されたい。

６週齢の雄Ｄａｈｌ塩分感受性ラット（ＳＳ／ＪｒＨｓｄ）に対し、次の食餌と投薬計画を７週間にわたって適用した。１）塩分の多い食餌のＤａｈｌＳＳ対照、２）塩分の多い食餌＋高用量のレボシメンダン（飲料水中に１０ｍｇ／ｌのレボシメンダン）のＤａｈｌＳＳラット、３）塩分の多い食餌＋低用量のレボシメンダン（飲料水中に１ｍｇ／ｌのレボシメンダン）のＤａｈｌＳＳラット、および４）塩分の少ない食餌のＤａｈｌＳＳ対照。塩分の多い食餌は、市販の塩分の少ない食餌にＮａＣｌを添加することによって調製した。

初期生存率試験結果を、カプラン−マイヤープロットとして図１に示す。塩分の多い食餌では３８％（９／２４）のラットだけが、７週間のフォローアップ調査期間生存していた。低用量レボシメンダン群（ｎ＝１２）におけるラットはいずれも死にいたることはなく、１２匹からなる高用量レボシメンダン群のラットのうち３匹だけが死亡した。したがって、レボシメンダンは、塩分感受性ラットの初期段階死亡率を大幅に低下させ、脳卒中関連の死亡率に対してレボシメンダンが有益な効果があることを示唆している。

実験２．塩分感受性ラットモデルにおける脳卒中発症率に対する効果
磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）および行動試験（ニューロスコアおよび機能観察総合評価法（ＦＯＢ））を用いて、Ｄａｈｌ塩分感受性ラット脳卒中モデルにおける脳卒中発症率に対するレボシメンダンの効果を調査研究した。

ＤａｈｌＳＳラットは、３種類の治療群に分類した。すなわち、塩分の多い食餌＋ビヒクル（ｎ＝２０）、塩分の多い食餌＋レボシメンダン１ｍｇ／ｋｇ／日（ｎ＝２０）および通常塩分の食餌の対照（ｎ＝４）である。塩分の多い食餌は、市販の塩分の少ない食餌に、約７％のＮａＣｌを含有させたものである。塩分の多い食餌を６週齢から与え始め、本調査研究が終了するまで７週間継続した。レボシメンダンは、飲料水により（飲料水中に２ｍｇ／ｌのレボシメンダン）投与した。レボシメンダンの投与は、塩分の多い食餌を与え始めた時期と同時に開始し、本調査研究が終了するまで継続した。飲料水および食餌の消費量、さらには実験動物の体重および全体的健康状態を観察した。第２〜８週のあいだ、１週間に１回の頻度でＭＲＩを実施した。ＦＯＢおよび７ポイントニューロスコア試験を、第１〜３週のあいだは週１回、第４〜８週のあいだは週２回それぞれ実施した。

死亡率
対照用食餌を与えた実験動物はすべて、本調査研究が終了するまで生存していた。レボシメンダン群のうち、死亡したのはわずか１匹（５％）で、ビヒクル投与群の死亡率は、本調査研究の終了時には、７０％に達した。

インビボＭＲＩ
４．７Ｔ水平磁石（ＭａｇｎｅｘＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＬｔｄ．）に接続したＶａｒｉａｎＩｎｏｖａコンソールを用いた拡散およびＴ２−ウエート付けＭＲＩを、ハロセン麻酔をかけたラットに対して、１週間に１回行った。Ｔ２ウエート付け映像法および定量的拡散映像法を用いて、病変部の大きさを測定し、ＤａｈｌＳＳラットにおける信憑性のある虚血性病変部の特徴づけを行った。典型的な病変部は不均一で、異なるＭＲＩ特徴を有するいくつかの異なる領域からなる。実際には、異常が検出されたすべてのラットにおいて、Ｔ２ウエート付け映像法で高血圧症が認められた。これは、虚血組織に通例認められる浮腫性組織として解釈され、一般には、血流血管の閉塞後〜１２〜２４時間内に検出される。さらに、虚血性疾患の実験動物の大部分で、高血圧病変領域内の局部的シグナルボイド領域が認められた。本調査研究で使用した高磁場（４．７Ｔ）では、任意の鉄磁石物質が磁場の均質性を局部的に崩壊させ、Ｔ２ウエート付け映像法における信号の破壊を生じさせる。血中のヘモグロビンには鉄（Ｆｅ）が含まれているので、これは、出血に関する特徴的なＭＲＩの特色である。このように、本調査研究で検出された病変部のほとんどすべてが、出血に関連するとして特徴付けることができる。

ビヒクル処置動物は、レボシメンダン治療群と比較して、脳卒中の発症率が高く、脳卒中の病変部の体積も大きかった。本調査研究６週目に、ビヒクル処置動物の５０％より多くに、Ｔ２ウエート付けＭＲＩに顕著な変化が認められ、一方、同時期におけるレボシメンダン治療群には、変化は認められなかった。最終ＭＲＩ測定では、検出可能なＴ２ウエート付けＭＲＩの変化は、レボシメンダン治療動物で１０％、ビヒクル処置動物で８５％であった（表１）。略語：ＬＳ、レボシメンダン

エクソビボＭＲＩ
エクソビボ映像法用に、死後の脳を頭蓋骨から剥離し、４％のホルマリンに４８時間浸漬し、その後０．１ＭＰＢＳ内に保管した。脳をペルフルオロポリエーテル内に組み込み、ＳＭＩＳコンソールに接続した９．４Ｔ磁石（オックスフォード）でＭＲＩを実施した。異常な強度とシグナルボイド領域との解釈は、インビボ試験に関して記載した解釈にしたがう。エクソビボ試験では、重大な浮腫や破壊された組織構造が認められる成熟病変部しか検出できない。インビボで検出可能であるような、初期Ｔ２コントラストは、エクソビボ試験では目で確認することができない。エクソビボ試験における知見は、虚血性病変部の大部分が出血にかかわりがあるという見解を裏付けている。エクソビボＭＲＩはさらに、ビヒクル処置動物が、レボシメンダン治療群と比較して、脳卒中の発症率が高く、脳卒中病変部の体積が大きいことも明らかにした（表２）。略語：ＬＳ、レボシメンダン。

行動試験
第１〜３週のあいだには１週間に１回、第４〜８週のあいだには１週間に２回、機能観察総合評価法（ＦＯＢ）およびニューロスコア試験をそれぞれ実施した。

ａ）ニューロスコア試験
７ポイントニューロスコア試験を、運動および行動における欠陥を評価するために使用した（Ｚａｕｓｉｎｇｅｒら、ＢｒａｉｎＲｅｓ．８６３：９４−１０５、２０００から改変）。ラットの治療状況を知らされていない治験担当医によって、神経系の試験が行われた。７ポイントスケールは、下記のとおりであった。

等級６：尾部を持って静かに持ち上げたときに、両前肢が床方向に正常に伸びる。
等級５：尾部を持って静かに持ち上げたときに、前肢のどちらかが一貫して屈曲しており、その程度は、軽度の手首屈曲および肩の内転から、手首および肘の完全屈曲ならびに内転している肩の完全屈曲まで変化する。
等級４：横方向のどちらか一方に押したときの抵抗が、一貫して弱い。
等級３：尾部を持って引っ張ったり、持ち上げたりすると、左右どちらかの方向に回転する。
等級２：尾部を持って引っ張ると、左右どちらかの方向に回転する。
等級１：左右どちらかの方向に自発的に回転する。
等級０：自発的動作が認められない。

結果：
対照群の動物および、レボシメンダン投与群の動物のスコアは、全試験を通じて最大であったが、ビヒクル処置群のスコアは試験の第５週目から低下し始めた。

ｂ）ＦＯＢ
標準化された手順にしたがって、全ラットを観察した。これらの手順では、ホームケージ内の解放された領域で動作しているラットの観察および、全操作試験でのラットの観察を行った。測定法は下記のとおりである。
（１）ホームケージ内測定
体位、呼吸、発声および眼瞼閉鎖状態。
（２）把持観察
持ち上げたときの反応、ハンドリング、流涙、流ぜん、立毛、そのほか（被毛、噛み跡、爪の欠損、痩せ、など）。
（３）新しい環境／広いフィールド行動
飼育（rearing）Ｉ（ラットが前足を使用しない）の数、飼育II（ラットが壁に寄りかかっている）の数、慢性的な無意識な動作、緊張性の無意識な動作、歩行、活動、常同動作の発生、異常行動、排便回数および排尿回数。
（４）刺激反応
接近反応、接触反応、眼瞼反射、耳介反射、音声反射および尾部つまみ反応。
（５）神経および筋肉測定
腹部の状態、四肢の状態および握力強度。
（６）直腸体温
（７）そのほかのデータ
目の色、気道粘液分泌および末梢血液循環（耳介、つま先、尾部および鼻）。

結果
レボシメンダンは、ＦＯＢ試験で観察された脳卒中に関連する行動上の欠陥を大幅に低減し、発症を遅らせることが明らかとなった。

要するに、本実験では、予防のために治療を開始した場合、ＤａｈｌＳＳラットにおいて脳卒中にかかわる死亡率、脳の病変の発症と病変部の体積および行動障害を、レボシメンダンが低減する、および／または発症を遅らせることが実証された。

実験３．キニノゲン発現に対する効果
方法
８日間、ラットに水道水中に混入させた２０ｍｇ／ｌのレボシメンダンを経口投与し、対照群のラットには、水道水だけを与えた。心臓を液体窒素で凍結し、−８０℃で保管した。心臓の組織を、一晩、氷上で凍結乾燥させ、９Ｍの尿素、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌｐＨ７．４、５０ｍＭのＫＣＬ、３ｍＭのＥＤＴＡｐＨ７．５、０．５％のＩＰＧ緩衝液３〜１０ＮＬ、５ｍＭＰＭＳＦ、１％ＤＴＴおよびベンゾアーゼ１００単位からなる溶解緩衝液内で、室温で１０分間、インキュベートした。次に、タンパク質溶液を１５秒間ずつ２回、超音波で分解し、１４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を回収し、バイオラッド（BioRad）社のタンパク質検定キットに基づいて、タンパク質の量を測定した。４０μｇのタンパク質溶液を、７Ｍの尿素、２Ｍのチオ尿素、２ｍＭのＴＢＰ、０．５％のＩＰＧ緩衝液３〜１０ＮＬ、４％のＣＨＡＰＳおよび０．２％のＢＦＢからなる、３５０μｌの再水和緩衝液内で、室温で３０分間、インキュベートした後、１４０００ｒｐｍで５分間、遠心分離した。

３５０μｌの上清を、１８ｃｍ、ｐＨ３〜１０ＮＬのＩＰＧストリップ（アマシャムファルマシアバイオテク（Amersham Pharmacia Biotech））上に載せ、これらストリップをストリップホルダー内に置いた。６００μｌのパラフィノイルを各ストリップの上に適用した後、これらのストリップを、下記の計画にしたがって、ＩＰＧｐｈｏｒ電気泳動ユニット上で泳動させた。

０Ｖ７時間
２０Ｖ７時間
１００Ｖ５時間
５００Ｖ１時間
１０００Ｖ１時間
３０００Ｖ１時間
８０００Ｖ５．５時間

対象としたストリップを、６Ｍの尿素、５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８、２％のＳＤＳ、３０％のグリセロール、２％のＤＴＴ、２．５％のヨードアセトアミドおよび０．２％のＢＦＢからなる緩衝液で、室温で２×１０分間平衡化した。次に、これらのストリップを１１％のＳＤＳ−ＰＡＧＥに付し、０．７５％のアガロースで被覆した後に、４℃、１００Ｖで、４時間電気泳動させた。アマシャムファルマシアバイオテク社から市販されているキット（ＰｌｕｓＯｎｅ）にしたがって、銀染色法によりＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを染色した。染色後、画像濃度計（校正済み濃度計ＧＳ−７１０、バイオラッド社）でゲルをスキャンした。銀染色ゲルをＰＤ−ＱＵＥＳＴ（６．２）２−ＤＥソフトウェア（ＢＩＯ−ＲＡＤ）により解析した。タンパク質のスポット検出およびゲルの修飾後、レボシメンダン投与治療ラット心臓の３個のレプリカ培養物および、対照の３個のレプリカ培養物からなる、６個のゲルから適合セットを構成した。レボシメンダン標本を対照標本と比較することによって、ゲル分析を行った。比較差タンパク質発現の閾値として、Ｏ．Ｄ．における２倍の差を用いた。

ＰＤ−ＱＵＥＳＴ分析に基づき、染色されたタンパク質スポットをゲルから切り取り、銀で染色されたゲルのスライスをー２０℃で保管した。ゲル内消化手順（Ｒｏｓｅｆｅｌｄ，Ｊ．ら、Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２０３：１７３−１７９、１９９２）にしたがって、質量フィンガープリント法のためのタンパク質消化を実施した。消化させる前に、タンパク質を還元およびアルキル化した。０．０４μｇ／μｌの濃度の２μｌの修飾済みトリプシン溶液（ＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＧｒａｄｅＭｏｄｉｆｉｅｄｔｒｙｐｓｉｎ、ポルシン、プロメガ）で、タンパク質を消化した。

標本はすべて、逆相ピペットチップＣ１８（ＺｉｐＴｉｐ、ミリポア）を用いて調製した。５０％のアセトニトリルおよび０．１％のトリフルオロ酢酸で希釈した、シアノー４−ヒドロキシ桂皮酸で、標本３μｌを溶出させ、同標本をＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ標本プレート上にアプライした。標本は、ＴＯＦ質量スペクトロメーター（Ｖｏｙａｇｅｒ−ＤＥＰＲＯ）内で分析した。質量分析は陽イオン化モードで完結させ、飛行時間形親質量演算の質量範囲は、５００〜３５００ＭＨｚで変化した。ＥｘｐｓｙＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙサーバーＰｅｐｔＩｄｅｎｔで、ＭＳ−適合プログラムによって、取得したペプチドの質量を分析した。

結果
２−ＤＥゲル上で、レボシメンダン／対照のラットの心臓抽出物を分析し、銀染色分析に基づいて、全体として、約１５００スポットを取得した。スイスプロット識別番号Ｐ０８９３４鎖１：分子量６８．９ｋＤａのキニノゲン−ＲａｔｔｕｓｎｏｖｅｒｓｉｃｕｓｐＩ６．２２に適合するタンパク質で、１０倍のプロテイン発現の亢進が認められた。

レボシメンダンにより治療していない、塩分の多い食餌のＤａｈｌ塩分感受性ラット（ＤａｈｌＨＳ）および塩分の少ない食餌群のＤａｈｌ塩分感受性ラット（ＤａｈｌＬＳ）の生存率（％）と比較した、２種類の用量のレボシメンダンで治療された、塩分の多い食餌群におけるＤａｈｌ塩分感受性ラット（ＤａｈｌＨＳ＋レボ１およびＤａｈｌＨＳ＋レボ１０）の生存率（％）を示す。

Claims

血小板の凝集または血液凝固を有意に阻害することなく、脳梗塞（脳卒中）を予防するための医薬の製造における、レボシメンダンまたはその代謝産物（Ｒ）−Ｎ−［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−４−メチル−６−オキソ−３−ピリダジニル）フェニル］アセトアミド（II）、もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩の使用。
血小板の凝集または血液凝固を有意に阻害することなく、脳梗塞（脳卒中）のリスクを低減するための医薬の製造における、レボシメンダンまたはその代謝産物（Ｒ）−Ｎ−［４−（１，４，５，６−テトラヒドロ−４−メチル−６−オキソ−３−ピリダジニル）フェニル］アセトアミド（II）、もしくはそれらの薬学的に許容され得る任意の塩の使用。