KR20070116442A - 항균, 항암, 면역자극 활성을 가지는, 사람의 짧은 나선형펩티드-1 및 이의 용도 - Google Patents

항균, 항암, 면역자극 활성을 가지는, 사람의 짧은 나선형펩티드-1 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람에서 발현되는 항균, 항암, 면역활성 단백질인 사람의 짧은 나선형 펩티드-1 (human short helical peptide-1, hSHP-1), hSHP-1을 포함하는 항균, 항암, 면역자극 활성용 약학적 조성물, hSHP-1 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 항균, 항암, 면역자극 활성을 위한 치료방법에 관한 것이다.
hSHP, 짧은 나선형 펩티드, 항균 항암 단백질

Description

항균, 항암, 면역자극 활성을 가지는, 사람의 짧은 나선형 펩티드-1 및 이의 용도{Human Short Helical Peptide-1 which has antimicrobial, antitumor, and immune stimulating activity and uses thereof}
도1은, hSHP-1 아미노산 서열과 항균 단백질 데이터베이스 (APD; University of Nebraska Medical Center, USA, http://aps.unmc.edu/AP/main.html)에 기록된 다른 항균단백질과의 서열유사성을 검색한 결과를 나타낸 것이다.
도2는, 사람 장기들에서 보이는 hSHP-1의 면역조직화학적 발현 양상을 보여주는 것이다.
도3은, 여러 종류의 박테리아들에서 검사한 hSHP-1의 최소 억제 농도 (MIC; minimum inhibitory concentration) 결과를 보여주는 것이다.
도4는, hSHP-1의 펩티드 길이에 따르는 최소 살균 농도 (MBC; minimum bactericidal concentration) 결과를 보여주는 것이다.
도5는, hSHP-1 유전자 염기서열 및 아미노산 서열을 보여주는 도이다.
도6은, hSHP와 모노단실카다버린 (monodansyl cadaverine)이 트랜스글루타민나제(TGase)에 의한 교차결합을 형성함을 확인하기 위한 실험에서, hSHP-1이 TGase에 의하여 신속하게 교차 결합하는 것이 관찰된 것을 보여주는 도이다.
도7은, Staphylococcus aureus 와 E. coli에 대한 hSHP-1의 콜로니 살상 에세이(colony killing assay) 결과를 보여주는 것으로서, Staphylococcus aureus 는 hSHP-1이 2 μM 에서부터 거의 완전한 살균력이 보이고, E. coli에서는 현저하게 낮은 살균력을 보여서 hSHP-1이 30 μM에서 50%의 E. coli를 죽일 수 있다.
도8은, 구강 탈락상피를 6M urea, 1 mM EDTA 용액으로 1주일 동안 중탕하여 비특이적으로 부착된 성분들을 모두 제거한 다음 hSHP-1 항체를 사용하여 면역화학염색을 시행한 결과 탈락상피의 바깥면에 국한적으로 양성반응을 보여주는 도이다 (이는 침 속에 들어 있는 hSHP-1이 탈락 상피에 교차 결합되었음을 의미한다).
도9는, 인체 각 장기의 조직에서 보이는 hSHP의 면역조직화학적 염색 결과 점막 및 외분비 샘 등에서 풍부한 량의 hSHP-1이 발현되었으며 분비선에서는 분비세포의 세포질 내에 작은 과립모양의 hSHP-1 양성 물질이 다수 발견되었고 hSHP-1이 주로 구강점막의 표층, 위장관 점막의 유두 꼭대기 표층 등에 집중되어 관찰되었다.
도10은, 사람의 이하선에서 바로 받은 침과 눈물 및 정액 등에서 얻은 단백질을 이용하여 웨스턴 블롯을 수행한 결과 hSHP-1이 동일한 양상으로 발견되었음을 보여주는 도이다.
도11은, hSHP-1에 특이하게 반응하는 항체를 이용하여 만든 크로마토그라피 칼럼을 이용하여 혼합 침에서 면역 침강 (immunoprecipitation) 실험을 한 결과를 보여주는 도면으로, 다양한 크기의 hSHP-1 양성 밴드가 관찰되었으며 이는 hSHP-1이 매우 신속하게 단백질 변형 (modification)을 일으키는 것을 의미한다.
도12는, 인체의 각 장기에서 발현되는 hSHP-1 mRNA를 확인하기 위하여 mRNA 하이브리다이제이션을 수행한 결과를 보여주는 도면으로, 대부분의 분비샘에서 hSHP-1의 발현이 관찰되었고, 특히 위장관 조직과 전립선 등에서 매우 강한 발현을 보였다.
도13은, hSHP-1이 Staphyococcus aureus와 Candida albican에 대한 항균작용을 주사전자현미경으로 관찰한 결과를 도시한 것이다 (hSHP-1에 의하여 이들의 세포막이 30분 이내에 완전히 파괴되는 현상이 관찰되었다).
도14는, 구강 전암병소에서 구강암이 발생되어 악성도가 진행되는 동안 hSHP-1이 발현되는 양상을 관찰한 도이다 (정상 구강점막 상피에서는 hSHP-1의 발현이 미약하지만 전암 병소인 백반증 (leukoplakia)에서는 발현이 증가되고 상피내 암 (carcinoma in situ)에서 많이 증가하고 분화가 잘된 초기 암세포에서 강한 발현을 보이다가 악성도가 커져서 분화가 불량한 암세포에서는 hSHP-1의 발현이 나타나지 않았다).
도15는, hSHP-1이 간암 세포와 악성 연골종양 세포에서 발현되는 양상을 보여주는 도면으로, hSHP-1의 일부가 핵 내로 이동하여 핵질에 부착된다.
도16은, 간암세포에서 hSHP-1이 세포질과 핵질에 침윤되어 발현되는 양상을 보여주는 전자현미경 사진이다 (세포질에서는 골지체와 소포체 등에 밀집되어 보이고 핵질에는 무분별하게 부착되어 있음이 관찰된다).
도17은, hSHP-1이 사람의 치은과 치주인대의 섬유모세포의 세포증식에 미치는 영향을 관찰한 결과를 보여주는 도면으로, hSHP-1이 이들 세포의 증식을 현저하 게 억제하는 현상이 관찰되었다.
도18은, 사람의 위암세포주 (SNU-1 cells)를 사용하여 hSHP-1이 유전자 발현에 미치는 영향을 알기 위하여 여러 종류의 암유전자 (oncogene), 세포 자멸사 (apoptosis) 관련 유전자, 조직 변성에 관련되는 유전자 들에 대한 검색을 수행한 결과를 보여주는 도면으로, hSHP-1이 SNU-1 세포의 활성도를 전반적으로 억제하는 현상이 관찰되었다.
본 발명은 사람에서 발현되는 항균, 항암, 면역활성 단백질인 사람의 짧은 나선형 펩티드-1 (human short helical peptide-1, 이하 'hSHP-1'이라 함)에 관한 것이다.
항균 및 항암 단백질의 연구는 생명과학 및 의학 분야에서 매우 중요한 영역이다. 모든 생명체는 생존을 위하여 항균 물질을 생산하는 것으로 알려져 있는데 푸른곰팡이에서 추출한 페니실린도 곰팡이가 생존하기 위해 만들어 낸 항균 물질에 속하며, 오래 전부터 질경이나 민들레 등의 들풀에서 얻은 진액을 항균 물질로 사용하는 민간요법이 전해지고 있는데 이들 질경이나 민들레의 진액에는 각각 고유의 항균 물질이 들어 있다. 현재까지 다양한 동식물로부터 800 여 가지의 항균 물질 들이 보고 되고 있으나 사람의 항균 및 항암 단백질에 대한 보고는 매우 적은 실정이다. 사람의 항균 단백질로는 디펜신(defensin), 카텔리시딘(cathelicidin) (LL-37), 더미시딘(dermicidin), 히스타틴(histatin), 라이소자임(lysozyme) 등이 발표되었으나 이들의 항균 작용은 두꺼비에서 발견된 마가이닌(magainin)에 비하면 항균력이 크게 저조하다. 현재까지 개구리, 돼지, 뱀, 악어, 전갈, 파리 등 다양한 동물들에서 항균 단백질들이 발견되고 있으나 이것들을 사람에 사용하면 바로 면역 반응을 보이기 때문에 바로 사용하지 못하고 유전자 재조합 공법을 통하여 면역성이 적으면서 강한 항균력이 있는 항균 단백질을 제조하는 기술이 발달되고 있다.
본 발명자들은 사람에서 특이하게 발현되는 새로운 항균단백질을 발견하고자 예의 연구 노력한 결과, hSHP-1을 분리하여 이것이 항균, 항암, 면역자극 활성이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 항균, 항암, 면역자극 활성이 있는 신규한hSHP-1 펩티드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 hSHP-1 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균, 항암, 면역자극 활성용 약학적 조성물 또는 상기 펩티드를 포함하는 항균용 생활용품을 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 hSHP-1 펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 항균, 항암, 면역자극 활성을 위한 치료방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명은 다음의 군으로부터 선택되는 항균 활성, 항암 활성 또는 면역 촉진 활성을 가지는 펩티드를 제공한다:
(a) 상기 펩티드의 N-말단은 서열번호 제2서열의 제12번째 아미노산 잔기 내지 제31번째 아미노산 잔기 중 어느 하나로부터 선택되고, 상기 펩티드의 C-말단은 서열번호 제2서열의 45번째 혹은 제46번째 아미노산 잔기로부터 선택되며, 16-머 (mer) 이상인 펩티드,
(b) 상기 펩티드 (a)의 탠덤 리피트 (tandem repeat).
바람직하게는, 상기 펩티드는 서열번호 제3서열 내지 제8서열 중 어느 하나의 펩티드 또는 이의 탠덤 리피트인 것을 특징으로 하며, 상기 펩티드는 당화 (glycosylation)된 것을 특징으로 한다.
본 발명은 상기 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 구강, 안구, 모발, 피부, 비강, 위장관, 복막, 흉막, 질, 전립선, 방광(오줌보), 요로(오줌길), 관절낭, 뇌하수체막, 외이, 내이, 골수, 또는 내부의 주요 장기에서 발생된 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 감염성 질환의 병원체는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아, 진균류, 피낭성 바이러스이고, 더욱 바람직하게는 상기 감염성 질환의 병원체는 메티실린 내성균이다.
본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 전암병소 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 상기 암은 피부암, 골육종, 구강암, 위암, 장암, 뇌종양, 또는 간암으로부터 선택된다.
본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 면역기능 강화용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기 펩티드를 유효성분으로 포함하는 항균용 생활용품을 제공한다. 바람직하게는, 상기 생활용품은 화장품, 치약, 피부 세정제, 여성 청결제, 안구 건조시 사용되는 인공 눈물, 구강 건조시 사용되는 인공 침, 비강 건조시 사용되는 인공 콧물, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제로부터 선택된다.
생물체가 생존하기 위하여 우선적으로 병원균을 죽이기 위한 항균기능이 필요한데 체외에서 일차적으로 살균 작용을 하고 세균의 침입을 막기 위하여 항균 단백질이 사용된다. 모든 생물체는 각각 독특한 자체 항균 단백질들을 생산하는데 사람에서도 소수의 항균 단백질이 알려지고 있다. 사람의 항균 단백질에는 히스타틴(histatin), 라이소자임(lysozyme), LL-37, 디펜신(defensin), 더미시딘(dermicidin) 등이 있으나 실제로 인체에서 작용되는 효과적인 살균작용을 설명하기에는 아직도 부족함이 많다. LL-37은 카텔리시딘(cathelicidin)이라는 단백질에서 절단된 37 개 아미노산으로서 매우 강한 항균 작용을 보인다. hSHP-1은 독특한 당화 (glycosylation)를 통하여 세균의 균막 (biofilm)이나 바이러스의 피막 (capsule) 등에도 쉽게 부착되므로 심각한 감염성 질환이나 바이러스 질환 치료에도 사용 가능하다. 본 발명에서는 사람에서 생산되는 새로운 분비성 항균 단백질인 hSHP-1을 발견하여 그 특성, 기능, 구조, 성분 및 사용 방법들에 연구를 수행하였으며 감염성 질환을 치료하거나 hSHP-1의 부족이나 결핍으로 발생되는 질환을 예방하기 위하여 hSHP-1의 사용 방법을 제공하고자 한다.
한편, 일부 항균단백질에서 나타나는 것과 같이 사람의 항균 단백질인 hSHP-1은 염증성 또는 물리-화학적 자극에 의한 점막-피부상피의 대상성 과다증식을 억제하는 기능이 있으므로 hSHP-1이 상흔 (keloid) 형성, 폴립 (polyp) 및 전암 병소의 발생을 억제시킬 수 있다. 따라서 hSHP-1을 다양한 과다 증식성 질환이나 전암병소의 치료 및 예방에 사용하는 방법을 제공하고자 한다.
1. hSHP-1 유전자 및 명명
hSHP-1 유전자는 GenBank에 Salvic이라는 유전자의 명칭으로 AY177672 번호로 기록되어 있다. hSHP-1의 ORF (open reading frame)는 141 bp로서 이 중에서 138 bp가 46개 아미노산 서열 (서열번호 제2서열)을 지정한다 (도 5).
46 개의 아미노산 서열 중에 아미노 말단의 11개 아미노산은 소수성의 배열로서 신호 펩티드 (signal peptide) 역할을 할 것으로 추정된다. 따라서 카르복실 말단의 35개 아미노산이 hSHP-1 고유의 항균성 및 항암성 기능을 할 것으로 여겨진다.
hSHP-1은 발견 당시 침(saliva) 속에 세균을 이길 수 있는 (victory) 물질로 여겨져서 살빅(Salvic)이라 칭하였고 이 물질이 주로 점막 조직 (mucosa)에서 세균에 대한 항균 작용 (bactericidal)을 하므로 뮤코시딘(Mucocidin)이라 바꾸었으나 나중에 이 유전물질이 항균 작용뿐 아니라 증식하는 세포에 대한 항암 작용과 면역 촉진작용들이 있음이 관찰되었으며 최근에 양이온성의 짧은 나선형 펩티드 (cationic short helical peptide, SHP)들이 이러한 항균 작용과 항암 작용을 동시에 보이는 다기능 (multifuctional) 펩티드임이 알려지고 있어서 SHP가 중요시되고 있다. 그러므로 본 유전물질은 사람에서 나타나는 단일 유전자의 양이온성의 짧은 나선형 펩티드 (cationic short helical peptide)로서 처음으로 기록되어 지므로 총괄해서 hSHP-1으로 다시 명명하였다.
사람에서 발견된 SHP로는 LL-37이 있는데 LL-37은 카텔리시딘 (cathelicidin) 이라는 큰 단백질에서 잘라져서 생긴 SHP로서 단일 유전물인 hSHP- 1과는 차이가 있다. 그러나 실제로 생물체에서는 다양한 형태의 각각 고유의 내재성 면역 (innate immunity)이 존재하는데 아마도 SHP 형태의 유전물질이 다량 존재할 것으로 추측된다. 따라서 앞으로 사람에서도 여러개의 hSHP가 밝혀질 것으로 기대된다.
2. hSHP-1 단백질의 변형(modification)
hSHP-1은 알파형 나선구조를 갖는 짧은 단백질로서 8개의 세린 (serine) 아미노산을 갖고 있는데 이중 두개의 세린-세린 구조를 갖고 있으므로 이부분이 빠르게 구연산화 (sialidization) 되면서 심하게 당화될 것으로 추측된다. 한편, 단백질 코드의 중앙부위에 시스테인 (cystein) 아미노산을 갖고 있어서 두개의 당화된 hSHP-1이 이황화 결합 (disulfide bond)을 이루어 비교적 큰 거대분자 (macromolecule)로 존재한다. 이러한 당화 hSHP-1의 거대 분자는 침이나 눈물 등의 점액 내에 다량 존재하는 강한 단백질 분해 효소에 의한 변성을 감소시키고 박테리아의 세균 벽에 쉽게 접착할 수 있으며 산성과 알카리성 용액 내에서 활성도를 유지하면서 지속적인 hSHP-1 기능을 가능케 한다. 실제로 hSHP-1의 아미노산 서열에 의한 pI 값은 9.45 이고 초기 hSHP-1 단백질의 분자량은 5.25 kDa으로 추정되지만 실제 침이나 눈물, 및 전립선에서 얻은 hSHP-1의 등전압 전기이동 (isoeletrophoresis, pI) 값은 약 6-6.3 이고 면역 침전법 (immuno-precipitation)을 통한 웨스턴 블롯에서 분자량이 약 6, 35, 45, 52, 77 kDa 등으로 분산되어 나타나는데 45 kDa 크기의 hSHP-1이 가장 강하게 존재한다 (도 11).
결과적으로 hSHP-1은 점액 분비세포 내에서 만들어 진 후에 바로 당화 과정에 의하여 나선형 구조의 친수성 아미노산인 세린-세린 부분 등을 중심으로 구연산화 및 당화가 지속되어 분자량이 커지고, 시스테인을 중심으로 이황화 결합을 이루면서 나선형 복합 구조를 만들어서 세포 밖으로 배출되면 신속하게 점액 내에 존재하는 트랜스구루타민나제-3에 의하여 침 속의 다른 단백질들이나 점막 상피 표면에 존재하는 단백질들과 구루타민-라이신 (Q-K) 교차결합을 이루어서 복합체를 형성하게 된다.
3. hSHP-1 단백질의 교차결합 (cross linking) 능력
hSHP-1은 카복시 말단 부위에 1개의 글루타민 (Q)과 2개의 라이신 (K)를 갖고 있는데 이 아미노산들이 트랜스구루타미나제에 의하여 hSHP-1을 점막상피에 교차 결합시킬 수 있다. 실험적으로 hSHP-1, 트랜스글루타민나제-2, 그리고 모노단실카다버린 (monodansylcadaverine)을 섞어서 배양시킨 후에 SDS-젤을 사용하여 전기 영동한 결과 hSHP-1과 모노단실카다버린이 결합되어 한 밴드로 관찰되었으며 배양시간이 길어짐에 따라 교차 결합된 산물이 비례하여 증가하였다 (도 6 ). 한편, 면역조직화학 염색에서 hSHP-1이 점막 표면에 부착된 채로 얇은 막을 형성하며 관찰된다 (도 8). 이러한 양상은 구강 점막뿐 아니라 위장, 소장, 대장 등의 장관막, 안구 점막 등에서도 동일하게 관찰되었다.
4. hSHP-1 항체의 생산 방법
hSHP-1은 46개의 아미노산으로 이루어진 짧은 단백질로서 아미노 말단의 11개 아미노산은 신호 펩티드로 절단될 것으로 추측되므로 실제 35개 아미노산을 이용하여 항체를 생산할 수 있다. 카복실 말단 23개 아미노산이 실제적인 항균 작용을 하지만 이 23개 아미노산은 항원성이 매우 낮으므로 항체 생산이 어렵다. 따라서 hSHP-1의 항원성이 높은 아미노 말단 13-23에 해당하는 아미노산을 포함하는 펩티드를 이용하여 항체를 생산할 수 있다. hSHP-1 항체에는 다크론 항체 (polyclonal antibody)와 단크론 항체 (monoclonal antibody) 생산이 모두 가능하다. 다클론 항체인 경우 가토(New Zealand white rabbit), 염소, 소, 생쥐, 백서 등 대부분의 동물을 사용할 수 있으며, 카복시 말단 35개 아미노산을 사용하는 경우 단일 특이성 항체 (monospecific antibody)가 만들어 진다. 단클론 항체인 경우에는 매우 특이성이 높은 항체의 생산이 가능하다. 예를 들면, 생쥐의 골수종 하이브리드 (myeloma hybrid)를 사용하여 지속적인 단크론 항체가 생산된다.
5. 인체 내 hSHP-1의 발현 정도 및 발현 양상
hSHP-1의 발현 양상은 면역조직화학적 관찰과 RNA 인시츄(in situ) 혼성화법(hybridization)으로 쉽게 관찰할 수 있다. 사람의 각각의 점막조직 및 장기에서 보이는 발현 정도와 발현 양상은 다음과 같다 (도 2, 9, 12).
1) 구강 점막 및 침샘
hSHP-1은 침샘의 도관세포에서 주로 만들어지며 일부의 장액샘 세포에서도 발현이 관찰된다. 큰 침샘 중에는 이하선에서 발현이 가장 크고, 악하선에서도 발현이 상당량 관찰된다. 점액을 주로 만들어 내는 설하선이나 작은 침샘들에서 소량의 발현이 관찰된다. hSHP-1은 도관세포에서 작은 알갱이 형태로 관찰되는데 주로 핵 근처에서 모여 있다가 점차로 세포 밖으로 배출되어 진다. 결과적으로 침이 분비될 때에 다량의 hSHP-1이 침에 포함된다. 정상적인 구강 점막세포에서는 hSHP-1의 발현이 거의 발견되어지지 않으나 침이 닿는 점막표면에 얇은 막 상태의 hSHP-1 양성 반응이 관찰되므로, 이는 침 속의 hSHP-1이 점막 표면에 단단히 부착되어 있음을 의미한다.
탈락된 구강 점막각화세포를 모아서 6M urea, 1 mM EDTA 용액에 넣고 1 주일 동안 계속하여 중탕으로 끓인 후에 탈락된 구강 점막세포를 hSHP-1으로 면역조직화학 염색을 수행한 결과 탈락 상피의 안쪽 면보다 바깥쪽 면에 더 집중적으로 hSHP-1의 양성이 관찰됨이 확인되었다. 결국, hSHP-1은 이 탈락된 구강각화 상피에 교차결합에 의하여 단단히 부착되어 있으므로 6M urea, 1 mM EDTA 용액 중에 1주일간 끓여도 hSHP-1이 분리되지 않았다. 그리고 탈락 구강 점막각화 세포의 바깥 쪽 면에 더 집중하여 양성 반응을 보이므로 이것은 침에 있는 hSHP-1이 탈락된 구강 점막 각화상피에 부착된 것으로 추정하였다.
구강점막 상피가 이형성 변형을 하면 점차로 백반증을 일으키게 되는데 이때 각화 상피가 구강점막에서 쉽게 탈락되지 못하고 점막상피가 두꺼워 지면서 각화 상피가 계속적으로 비대 증식하게 된다. 이때 hSHP-1의 생산이 증가되면서 세포 내에 축적되는 현상이 관찰된다. 구강점막 각화 상피가 암으로 전이되는 초기의 잘 분화된 암세포에서 hSHP-1의 생산이 매우 증가되어서 세포질 내에 풍부하게 발현되는데 일부의 hSHP-1이 핵 근처로 이동하여 핵질에 축적되는 현상이 관찰된다. 이렇게 핵 내에 hSHP-1이 축적된 암세포는 점차로 위축되어 지거나 핵 내에 공포화가 진행되어 사멸되어 지는 양상이 관찰된다. 그러나 암의 진행이 증가되어 세포분화가 안되는 악성의 암세포가 되면 hSHP-1의 발현은 거의 사라지게 되며 핵질의 양은 매우 증가되어 비정상적인 모양이 된다 (도 14).
2) 눈 점막 및 눈물샘
눈에서 hSHP-1이 가장 많이 발현되는 부위는 뫼보미안선(Mㆆbomian gland)으로서 윗 눈꺼풀 뒷면에 있는 눈물샘이다. 이 눈물샘은 매우 중요한 기능성 눈물을 만들어 내는데 이 분비물은 눈을 깜빡일 때 마다 안구의 표면을 닦아주면서 부착된 세균들을 죽이고 안구의 표면을 보호한다. hSHP-1은 눈의 주분비샘인 눈물샘에서도 다량 분비되는데 주로 도관세포에서 hSHP-1의 발현량이 증가되어 있으며 일부의 선상세포에서도 발현이 관찰된다. 특히 안구에 염증성 질환이 있는 경우에 눈물샘에서 hSHP-1의 발현이 크게 증가되는 것이 관찰되므로 hSHP-1의 발현이 안구의 염증성 질환과 밀접한 관련이 있을 것으로 추측된다.
3) 코 점막 및 점액 분비샘
hSHP-1은 코 점막의 점액 분비세포에서 미만성(diffuse)으로 발현되며, 특히 상악동의 점막에 분포되어 있는 점액 분비세포에서 발현이 증가되어 있다. 코 점 막은 주로 기다란 기둥모양 세포로 이루어져 있는데 이들의 바깥쪽 면에서 막 모양으로 hSHP-1에 양성 반응을 보이는 것이 관찰된다. 이는 hSHP-1이 코 점막에서 활발하게 분비되며 코 점막의 표면에 강하게 부착되어 지속적으로 코 점막을 보호하는 역할을 하고 있는 것으로 판단된다.
4) 위장 점막
hSHP-1은 위장 점막에서 강한 발현을 보이는데 주로 위 점막의 벽세포 (parietal cell)에서 매우 강한 발현양이 관찰된다. 그리고 일부의 점액 분비세포에서도 hSHP-1의 발현이 관찰되는데 위장 점막의 표면에 강하게 부착되어 막상의 양성 반응을 보이는 것이 특징적이다. 특히 점막의 유두상 구조에서 바닥 (crypt)에 있는 미성숙 세포의 표면에서는 발현양이 적으나 유두의 꼭대기에 있는 마지막 성숙세포 (terminal mature enterocyte)의 표면에서 집중되어 발현된다. 특히 위액의 pH가 2.5-3 정도로 강한 산성인 상태에서 hSHP-1이 위산을 분비하는 벽세포에서 지속적으로 발현되는 것은 특이한 현상으로 hSHP-1이 산성 조건에서도 활성도가 감소되지 않고 동일한 항균 및 항암 작용을 할 것으로 추측된다.
위장벽에 염증성 변화로 만성 위염을 보이는 점막상피에서는 점액분비 상피들에서 미만성으로 hSHP-1의 양성 반응이 보이고 점막상피에서는 막 모양으로 점막 표면에 부착된 hSHP-1은 감소되어 보이지만 대부분의 hSHP-1은 점막상피 아래의 결체조직 내에 침윤된 포식세포의 세포질 내에서 발견된다. 이는 hSHP-1이 염증을 일으키는 항원체에 단단히 부착되어 항균 작용을 하거나 항원체를 둘러 싸면서 옵 소닌화(opsonization)를 하면서 포식세포에 쉽게 잡아 먹히게 하는 작용을 하는 것으로 여겨진다. 결과적으로 hSHP-1은 염증과정에서 불특정 항원체에 대한 면역 직용을 촉진시키는 촉매 역할을 하는 것으로 추측된다.
위장 점막세포가 암으로 전이되는 경우에 초기의 이형성 증식 (dysplastic hyperplasia)을 일으키는 경우에 hSHP-1의 발현이 증가되며 초기 암세포에서 세포 내 축적된 일부의 hSHP-1이 핵질 내로 침투되는 현상이 관찰된다. 이렇게 핵질 내에 hSHP-1이 침투되어 무분별하게 부착된 암세포는 세포질 내의 부속기관들이 점차로 파괴되고 핵질도 공포화를 보이면서 암세포가 소멸되어지는 현상이 관찰된다.
5) 소장 및 대장 점막
소장과 대장의 유두 모양 점막상피에서 기저부위의 장세포에서는 발현이 저조하지만 유두의 꼭대기 부위의 장세포 표면에 hSHP-1이 강하게 농염되는 현상이 관찰된다. 이러한 발현 양상은 대장에서 매우 두드러지게 관찰되는데 바로 대변이 모여서 닿는 점막 유두의 꼭대기 부위에 국한적으로 장세포 표면에 강한 발현을 보인다.
소장과 대장에 염증성 질환이 생긴 경우에는 유두상피 꼭대기 부위의 집중된 hSHP-1 양성 반응이 감소되고 점막 상피에 전반적으로 미만성의 hSHP-1 양성 반응이 관찰된다. 결과적으로 장관막의 유두상피 꼭대기 부위에서 대변에 대한 보호막의 역할을 하던 hSHP-1 막이 소멸되고 hSHP-1이 장관막의 만성 염증 반응의 촉진제의 역할로 분산되는 양상으로 관찰된다.
6) 질 및 자궁 점막
hSHP-1은 질 점막의 바톨린선(Bartholin's gland)에서 풍부한 발현이 관찰되며 질 점막의 각화 상피의 표면에 막 모양의 양성 반응이 발견된다. 질액은 pH 4-5 정도의 약산이므로 hSHP-1이 잘 활성화되면서 항균, 항암 및 면역 촉진 기능을 할 것으로 추측된다.
자궁 점막의 잘 발달된 엔도메트리움(endometrium) 점막 상피에서 미만성으로 hSHP-1 양성 반응이 관찰된다. 월경시 점막 상피의 hSHP-1 발현은 급격하게 감소되지만 자궁 점막의 재생기에는 다시 hSHP-1의 발현이 증가된다.
7) 피부 및 땀샘과 피지선
hSHP-1은 피부 기관인 땀샘과 피지선에서 풍부하게 발현하는데 땀샘의 도관세포에서 hSHP-1의 발현이 주로 발견되고 분비된 땀을 본 연구의 분석 방법으로 분석한 결과 땀에서도 당화된 hSHP-1의 성분이 다량 분리되었다.
hSHP-1은 모발이 있는 피지선 (sebaceous gland)에서 집중적으로 농축되어 관찰되는데 기름세포 (fatty cell)의 세포질에 농축된 hSHP-1이 그대로 배출되는 양상이 피지선에서 관찰된다. 배출된 hSHP-1은 기름 성분과 섞여서 피부 표면에 퍼지게 되는데 이때 hSHP-1은 피부 표면의 각화상피 바깥면에 단단히 결합하여 막상의 hSHP-1 양성 반응이 관찰된다. 아마도 이 hSHP-1 막이 피부의 보호막 기능을 하면서 지속적으로 항균 작용을 할 것으로 추측된다.
8) 전립샘
전립샘의 도관세포는 사람 분비샘 중에서 가장 강한 hSHP-1 발현을 보이는데 도관세포 내에서 hSHP-1 양성 반응을 보이는 다수의 알갱이 형태의 과립들이 존재하면서 천천히 배출되는 양상이 관찰된다. 전립선 비대증 환자들에서는 hSHP-1의 발현이 증가되어 있으며 배출된 정액을 분자 생물학적으로 분석한 결과 당화된 hSHP-1이 풍부하게 분리되었다. 이는 전립샘에서 분비된 hSHP-1이 정액 내에서 고유의 항균 작용을 하는 것으로 추정된다.
9) 편도선 및 점막 면역기관
hSHP-1은 정상적인 피부나 점막상피에서는 주로 표면에 막 모양으로 양성 반응을 보이는데 비하여 면역 감지 기관인 편도선이나 장관의 점막에 있는 면역 점막 상피세포에서는 세포질에 농축되어 강한 양성 반응을 보인다. 특히 편도선의 갈라져서 함몰된 얇은 상피세포 (cryptic epithelium)에는 세포질 전체에서 강한 양성 반응을 보이면서 상피층 바로 하방에 림파구 등의 면역세포들이 침윤 증식하는 양상이 관찰된다. 이는 hSHP-1이 점막의 외부에서 침투한 항원에 대해 빠르게 작용하여 점막 상피에 우선적으로 부착시키고 이를 결체조직으로 전달해서 면역세포들로 하여금 면역 작용을 일으키게 하는 항원 전달 기능을 하는 것으로 해석된다. 결과적으로 hSHP-1이 갖는 양이온성의 짧은 나선형 펩티드 (cationic short helical peptide)가 외부에서 침투한 항원들에 무분별하게 반응하여 점막 상피세포 가 직접 면역 세포들에게 항원을 전달하는 표재성 항원 전달 기능을 한다. 이는 hSHP-1이 갖는 또 다른 기능으로서 면역 촉진 기능의 한 예로 설명된다.
10) 간
간세포는 외분비세포는 아니지만 hSHP-1을 풍부하게 생산하는 세포이다. 정상적인 간세포에서는 세포질 내에 미만성으로 소량의 hSHP-1이 발현되지만 콜레스타시스(cholestasis, 쓸게즙정체)나 만성 염증 반응, 또는 간경변 (liver cirrhosis) 등에 의하여 간세포가 자극을 받게 되면 hSHP-1의 생산이 증가된다. 생산된 hSHP-1은 대부분 간의 혈관벽을 통과하여 동양모세혈관(sinusoid) 형태의 간 혈관계로 배출되어서 전신으로 분산된다. 따라서 정상적인 사람의 혈액 내에서도 hSHP-1이 풍부하게 검출된다.
간에서 콜레스타시스(cholestasis)나 만성 염증 반응, 또는 간경변 등에 의하여 간세포가 심하게 자극 받게 되면 hSHP-1이 간세포의 세포질에 과다하게 축적되는 양상이 관찰된다. 그리고 콜레스타시스나 만성 염증 반응, 또는 간경변이 지속적으로 진행되는 경우 일부의 hSHP-1이 핵 주위로 모이는 현상이 발견된다. 그러나 아직 핵 내로 침윤되는 hSHP는 발견되지 않지만, 간세포가 종양성 변화를 일으켜서 증식성이 갑자기 커지면 다량의 hSHP-1이 핵 내로 침윤되어 핵질에 무분별하게 결합하는 양상이 관찰된다. 이렇게 간암세포의 hSHP-1이 무분별하게 결합된 세포는 핵이 점차로 공포성 변성 (vacuolar degeneration)을 일으키고 세포질의 과립성분이 감소하면서 소멸되어지는 현상이 관찰된다 (도 15, 도 16).
11) 관절낭
류마치스 환자의 무릎 관절액에서 hSHP-1의 양성 반응이 발견된다. 퇴행성 관절염 환자의 무릎 관절액에 비하여 류마치스 환자의 무릎 관절액에서 훨씬 더 많은 량의 hSHP-1이 검출되므로 hSHP-1이 관절의 염증 반응, 특히 자가면역 발생에 관여하는 것으로 설명된다. 관절액 내의 hSHP-1의 기원을 알기 위하여 관절낭 조직을 면역조직화학적으로 검사한 결과 관절낭 상피세포에서 hSHP-1을 발현하고 있었으며 hSHP-1이 관절낭 상피세포와 관절판 또는 연골 표면에 막 모양으로 덮혀 있는 양상이 관찰되었다. 이는 hSHP-1이 관절낭에서 보호막 역할을 하면서 항균, 항증식 및 면역 촉진 기능을 할 것으로 추측된다.
12) 뇌척수 및 뇌척수막
hSHP-1은 뇌척수액에서 풍부하게 검색되므로 hSHP-1을 만드는 세포를 추적한 결과 척수액을 만드는 에펜디말(ependymal) 세포에서 풍부한 발현량이 관찰되고 뇌를 덮고 있는 뇌막 (meningeal membrane)에서도 hSHP-1의 발현이 관찰되었다. 따라서 hSHP-1은 뇌척수액에 광범위하게 존재하면서 다양한 항균, 항증식 및 면역 촉진 기능을 할 것으로 추측된다.
13) 혈관
혈액 내에 존재하는 hSHP-1은 결국 전신에 분산되어 있는 혈관내피세포의 안 쪽 면에 부착됨이 관찰된다. 오래된 혈관에서는 hSHP-1의 부착이 희미하게 보이지만 신생 혈관에서는 비교적 뚜렷한 양성 반응이 막 모양으로 관찰된다. 따라서 hSHP-1이 혈관의 내면에 있는 혈관내피세포 안쪽 면에 부착되어 고유의 항균, 항증식 및 면역 촉진 작용을 할 것으로 추측된다. 특히 신생 혈관의 혈관내피 세포 안쪽 면에 강하게 발현되므로 hSHP-1이 신생혈관 형성기전에 관여할 것으로 추정된다.
hSHP-1이 신생혈관 형성기전에 관여하는 것을 알기 위하여 C-23(서열번호 6)의 hSHP-1 펩티드를 HUVECs (human umblical vascular endothelial cells) 세포 배양에 첨가하여 체외 세포 실험을 한 결과 VEGF (vascular endothelial growth factor, 5 ng/mL)를 첨가하여 HUVECs의 이동을 촉진시킨 경우에도 C-23의 hSHP-1 펩티드가 HUVECs의 세포 이동을 C-23 펩티드의 농도 증가에 비례하여 C-23 펩티드 농도가 1 μM인 경우에는 35%, C-23 펩티드 농도가 2.5 μM 인 경우에는 55%의 세포이동 억제가 관찰되었다. 이는 C-23 펩티드가 HUVECs의 세포 이동을 매우 효과적으로 억제하는 것을 의미하므로 신생 혈관의 생성을 억제할 수 있음을 간접적으로 나타낸다.
6. hSHP-1의 항균 작용
1) 박테리아 및 진균에 대한 항균 작용
hSHP-1은 전체적으로 16개의 나선구조를 갖는 것으로 추정되는데 이중에서 11 개의 나선구조가 독특한 항균작용을 한다. 아미노 말단의 소수성 나선은 주로 박테리아에 부착하는 성질이 강하고 카르복실 말단에는 트랜스 글루타민에 의한 글루타민-라이신 교차결합 시키는 모티프가 있어서 점막이나 주요한 세포의 표면에 단단히 부착되어 지속적인 항균작용을 할 것으로 추정된다. hSHP-1의 주요 항균 작용은 대략 12-45 번째 아미노산의 나선구조가 박테리아의 세포막에 부착력이 강하고 세포막에 삽입되어 세포벽에 구멍을 만들어서 세포를 파괴시키는 것으로 추정된다. hSHP-1과 동일한 항균력을 보이는 최소 크기의 펩티드 (16개 펩티드; SRVLNRSLQVKVVKIT)는 +4의 양성 전하 값을 갖고 있다. hSHP-1의 카복시 말단 23개 펩티드(서열번호 제6서열)를 사용하여 항균작용을 관찰한 결과, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa 등의 병원균에 대하여 강한 살균력 (hSHP-1, C-23 mer, MIC: 약 10 μM/107 cells)을 보였으며 인체의 상주균인 Escherichia coli에 대하여는 중등도의 살균력 (MIC: 약 100 μM/107 cells)을 보였다 (도 3, 도 4).
한편, hSHP-1은 메티실린(methicillin)에 내성이 있는 Staphylococcus aureus에 대해서도 내성이 없는 Staphylococcus aureus과 동일한 항균 작용을 보였다 (도 7). 그리고 사람의 위염의 원인균으로 알려져 있는 Helicobacter pylori에 대하여 중등도의 살균력 (MIC: 약 150 μM/107 cells) 을 보였다.
2) 바이러스에 대한 항균 작용
hSHP-1은 구연산 (sialic acid)이 부착되는 세린-세린 (SS) 모티프를 두개 갖고 있으며 두개의 hSHP-1이 이황화결합에 의하여 연결되어 다이머 (dimer)를 형성하는 경우 다수의 구연산화 (sialidation)에 의한 당화단백질 (glycoprotein)을 만든다. 이렇게 당화된 hSHP-1은 당화된 염기성 프로린 풍부 단백질 (glycosylated basic proline rich protein)과 같이 항바이러스 (antivirus)의 기능을 갖는다. 따라서 피막성 바이러스에 강한 부착성을 갖으며 양이온성의 (cationic) SHP가 피막을 손상시킴으로써 효과적인 항바이러스의 기능을 갖는다.
3) 균막 생성 억제 및 제거 기능
당화된 hSHP-1은 박테리아나 진균류가 형성시킨 균막 (biofilm)에도 부착력이 있으므로 균막 내의 세균에 대하여 항균 작용을 할뿐 아니라 균막의 형성을 방해하고 균막의 구조를 이완시킴으로써 새로운 균막의 생성을 억제하고 기존의 균막을 제거하는 기능을 갖고 있다.
4) hSHP-1 결핍증에 대한 보충
따라서 사람의 점막이나 피부에 지속적으로 당화된 hSHP-1의 기능이 유지되면 매우 효과적으로 박테리아, 진균 및 바이러스에 대한 항균 작용을 기대할 수 있다.
특히, 노인성 또는 퇴행성 질환이나 자가면역 질환인 경우에는 각종 점막이나 피부에서 분비물의 감소가 두드러지게 나타나는데 이 경우 hSHP-1의 분비 감소 현상으로 각종 병원균에 의한 다발성 감염증이 발생될 수 있다. 이 경우 점액 중 에 결핍된 성분 중에 하나인 hSHP-1의 공급이 필요하다. 상기의 환자들에서 hSHP-1이 결핍되어 있음을 알기 위하여 점액 분비물 중에 hSHP-1의 농도를 측정할 수 있는 분석법으로 ELISA, 도트 블롯, 웨스턴 블롯 등의 방법을 사용할 수 있으며, 분비된 점액을 바로 이용하여 세균에 대한 항균력을 검사할 수 있는 검사법으로는 배지를 이용한 세균 살상 에세이(killing assay)를 사용하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration; MIC) 값으로 판정할 수 있다.
7. hSHP-1의 항암 작용
정상적인 세포에서는 리보좀에서 hSHP-1 단백질이 생산된 후에 골지체에 모여서 당화 작용에 의하여 당화된 hSHP-1 단백질이 된다. 이때 구연산이 hSHP-1에 부착되면 원래 pI가 9.45인 단백질이 구연산화에 의하여 산성화됨에 따라 pI가 약 6.2 정도의 약산성 단백질로 된다. 이렇게 됨으로써 hSHP-1은 세포 밖으로 쉽게 배출되어 특유의 항균 작용을 하게 된다. 그런데 세포 과다 증식이나 암화가 진행되면 무산소증에 의하여 세포내 당 (glucose)의 신진대사의 변화가 생기고 시알린(sialin; sialic acid transporter)에 의하여 N-glucosyl sialic acid (NeuGc)-G(M2)이라는 강글리오사이드(ganglioside)가 과다 생산됨에 따라 hSHP-1이 구연산에 의한 당화가 완전히 이루어지지 않아서 hSHP-1이 세포 내에 축적되며 축적된 hSHP-1의 pH 값이 8-9 정도로 높으므로 일부의 hSHP-1이 산성인 핵 내로 이동하게 된다. 이때 hSHP-1의 나선형 구조와 반복된 소수성과 친수성 기질이 DNA 나선 구조에 비특이적으로 결합하는 성질을 갖게 된다. 결과적으로 증식성이 증가된 전암 병소의 세포나 초기 암세포에서 세포 내에 hSHP-1의 축적이 관찰되며 일부의 hSHP-1이 핵 내로 이동하여 핵 주변부의 핵질에 무분별하게 부착되어지는 양상이 면역조직화학적 관찰에서 발견된다. 결과적으로, hSHP-1이 세포의 핵 내로 침투하여 핵질에 부착되면 세포의 증식은 억제되고 나중에는 세포가 자멸사 (apoptosis)하게 되는 현상이 관찰된다. 따라서 hSHP-1이 전암 병소 세포나 암세포에서 보이는 이러한 현상은 세포에 대한 항암 작용으로 설명된다. 예를 들면, 구강의 전암 병소인 백반증 (leukoplakia)에서 마지막 세포분화가 이루어지지 못하는 세포층에서 hSHP-1의 세포질 내 축적이 관찰되며 구강암의 초기 진행 상태인 잘 분화된 암세포에서 세포질 내 hSHP-1의 축적이 보일뿐 아니라 일부의 hSHP-1이 핵 내로 이동하여 핵질에 부착되어지는 현상이 관찰된다. 이러한 현상은 구강암뿐 아니라 위암, 간암 등의 악성 세포 등에서도 동일하게 관찰되는데 모두 세포의 증식을 억제하는 항암 작용이 관찰된다. 이러한 항암작용은 항암작용의 초기 현상으로 설명되어 질 수 있으나 실제로 분화가 안되어 악성화가 진행된 세포에서는 hSHP-1의 생산이 급격하게 감소되어 말기 암세포에서는 hSHP-1의 생산이 거의 정지되므로 암세포에서 hSHP-1의 지속적인 항암 또는 항암 작용을 기대하기 어렵다.
hSHP-1의 항암효과는 증식이 증가되는 초기의 세포 이형성을 억제하는 hSHP-1의 항증식 작용에 의한 결과이다. 한편으로, 비정상적으로 증식하는 전암 병소나 초기의 암세포에서는 무산소증 (hypoxia)에 의한 젖산의 생산 증가와 ATP의 지나친 소모로 hSHP-1의 구연산화 (sialidization)와 당화 (glycosylation)가 쉽게 이루어지지 않으므로 hSHP-1이 세포 밖으로 배출되지 못하고 세포질 내에 축적된다. 그 리고 축적된 hSHP-1은 점차로 핵 내로 이동하여 핵질인 DNA에 무분별하게 부착됨에 따라 세포의 활성도가 신속하게 감소되어 세포가 소멸되어 진다. 이 때 hSHP-1에 의하여 핵질이 심하게 손상된 세포는 세포사멸 과정을 거치기 전에 점막 상피에서 조기 탈락되는 현상을 통하여 비정상적인 증식성을 보이는 전암 병소 세포나 초기 암세포들이 점막에서 조기 탈락되어 제거될 수 있다.
체외 세포 배양에서 hSHP-1이 배양 세포에 미치는 영향을 조사한 결과 항균 작용을 보이는 최소 크기의 펩티드가 있는 카복시 말단 23 개 아미노산은 항암 작용이 미약하고 hSHP-1 단백질 서열의 12-46 번째에 해당하는 35 개 아미노산의 펩티드가 항암 작용을 보였다.
hSHP-1의 35개 아미노산 (C-35: 서열번호 제8서열) 펩티드를 사용하여 세포배양 실험을 한 결과 치은의 섬유모세포 (gingival fibroblast), 치주인대 섬유모세포 (periodontal ligament fibroblast), 사람의 피부상피의 각화세포에서 얻은 불멸화 세포주들 (immortalized cell lines) 에서 1일 이내에 30% 이상의 세포 증식이 억제되었으며, 구강암세포주, 사람의 골육종 세포주 (human osteogenic sarcoma, HOS), 위암세포주 (SNU-1) 등의 암세포에서도 hSHP-1의 C-35 펩티드가 세포 증식을 억제시키는 현상을 관찰하였다. hSHP-1의 C-23 펩티드를 사용하여 동일한 세포 실험을 한 결과 hSHP-1의 C-23 펩티드가 신속하게 세포의 핵내로 이동하는 것이 관찰되었으나 세포 증식 억제 현상은 다소 저조하였다 (도 17).
한편, SNU-1, HOS, 및 RHEK을 이용하여 hSHP-1의 C-35 펩티드가 보이는 항암 작용 시에 이들 세포들이 발현하는 유전물질 동정을 실시한 결과, C-35 펩티드에 의하여 PCNA, CDK4, c-erbB2, EGFR 등의 세포증식 인자의 발현이 급격히 감소하고, 카스파제-9 (caspase-9), 카스파제-8, 카스파제-3, FAS, p53, Bax, BAD, FADD 등의 세포 자멸사에 관련되는 유전단백질의 발현이 매우 증가되었으며, MMP-3, MMP-9, MMP-10 등의 세포 변성에 관련되는 유전단백질도 급격하게 증가되었다. 결과적으로 hSHP-1의 C-35 펩티드가 증식성을 갖는 불멸화 세포나 암세포의 증식을 효과적으로 억제하고 일부의 암세포를 사멸시킬 수 있음이 관찰된다.
따라서 hSHP-1은 위의 실험 결과를 토대로 증식성이 증가된 세포나 암세포에서 세포질 내 축적이 증가되며, hSHP-1이 이들 세포들의 핵질에 무분별하게 강하게 결합함으로써 세포 증식을 억제하고 세포사멸을 일으키게 된다 (도 18).
8. hSHP-1의 면역 촉진 작용
양이온성의 짧은 나선형 펩티드인 hSHP-1은 항원성 물질에 단단히 부착하는 성질이 있는데 hSHP-1이 점막상피 표면에 교차 결합하는 특성을 갖고 있으므로 점막세포 주위로 흘러 지나가는 항원체를 잡아서 점막세포에 부착시켜 주는 역할을 할 수 있다. 일부 점막 상피는 부착된 항원성 물질을 엔도사이토시스(endocytosis)에 의하여 포식한 후에 근처의 면역세포들에 전달시키는 역할을 하는데 편도선 균열된 점막조직의 세포들이나 장관막의 균열된 점막조직의 세포 등에서 흔하게 관찰된다.
9. hSHP-1 펩티드의 구분
hSHP-1의 유용한 부분의 펩티드는 항균성 또는 항암성에 관여하는 단위 아미노산의 포함 여부에 좌우된다. 우선 아미노 말단인 N-11 펩티드는 소수성이 매우 강해서 소수성 환경에서 소수성 지질 성분에 강하게 부착하는 성질이 있으며 N-11의 아미노산 서열은 신호 펩티드 (signal peptide)의 구조를 갖고 있으므로 hSHP-1이 세포 밖으로 배출되어 사용 장소로 인도하기까지 hSHP-1의 안전성을 유지하는데 사용될 것으로 여겨진다. 항균성을 갖는 주요 아미노산 서열로서 최소 크기는 30SRVL1NRSLQVKVVKIT45 로서 2개의 알지닌 (arginine, R)과 2개의 라이신 (lysine, K)를 포함한다. 대체로 C-23 펩티드(서열번호 제6서열) 는 SSVSS 아미노산 서열을 갖고 있으므로 구연산에 의하여 당화가 가능하며 지속적인 α-나선구조를 만들기 때문에 항균 펩티드로서 적합한 구조이다. 그리고 C-23 펩티드는 면역성 검사를 수행한 결과 토끼와 쥐의 면역세포에 의하여 항체의 생산이 이루어지지 않으므로 C-23 펩티드의 항원성이 매우 낮은 것으로 판단된다. 따라서 사람의 펩티드인 C-23을 인체에 지속적으로 다량 사용하더라도 C-23 펩티드에 대한 면역학적 부작용이 발생될 가능성이 매우 적다.
한편, C-35 펩티드(서열번호 제8서열)는 19번째 아미노산인 시스테인 (cystein, C)를 포함하는 지속적인 α-나선구조를 갖고 있으며 두개의 hSHP-1 펩티드를 이황화 교차결합을 이루기 때문에 매우 중요한 기능성 펩티드로 사용될 수 있다. 특히 C-35 펩티드에서 증식성 세포나 암세포에 대하여 항암성 기능을 나타내므로 C-35 펩티드가 다기능 펩티드로 사용될 수 있다.
hSHP-1의 나선 구조가 2회전 펩티드를 구성하는데 최소한 8개의 아미노산의 배열이 필요하므로 이론적으로 최소의 항균 작용의 기능을 보이는 최소 크기의 펩티드는 hSHP-1 아미노산 서열의 8개가 사용될 수 있으며 유전자 변이 방법을 사용하여 더욱 강한 항균 단백질의 고안이 가능하다.
10. hSHP-1 재조합 단백질의 생산 방법
1) 플라스미드 벡터를 이용하여 박테리아에서 재조합 단백질 생산
hSHP-1은 짧은 펩티드로서 염기서열이 작으므로 탠덤 리피트(tandem repeat)된 코드를 사용하여 벡터를 제작할 수 있다. 이때 사람의 단백질 코드가 박테리아에서 잘 만들어 지게 하기 위하여 DNA 코드의 최적화 (optimization)가 필요하다. hSHP-1 자체가 호스트 세포인 박테리아의 증식을 억제할 수 있으므로 hSHP-1 코드에 KSI, His-tag, GFP, GST 등의 융합(fusion) 단백질을 부착하여 hSHP-1의 기능을 억제하고 hSHP-1의 순수 분리시 크로마토그라피 부착에 도움이 되는 방법으로 사용하여야 한다. 이 방법에 사용되는 벡터는 상업용으로 구입이 가능한 pET32b, pET 시리즈 등 대부분의 벡터가 사용될 수 있다. 박테리아에서 재조합 단백질을 생산하는 경우에는 단백질의 당화나 이황화 변형 등이 이루어지지 않는 펩티드가 만들어 진다. 따라서 순수 분리된 hSHP-1 펩티드는 경우에 따라 당화 및 황화 처리가 불가피하다.
2) Pichia pastoris 에서 재조합 단백질 생산
이스트에 속하는 Pichia pastoris는 박테리아에 비하여 세포내 당화가 잘되고 엔도톡신(endotoxin)의 양이 비교적 적어서 순수 기능성 hSHP-1 펩티드 생산이 유리하다. 이 방법에 사용되는 벡터는 상업용으로 구입이 가능한 대부분의 이스트용 벡터가 사용될 수 있으며 이 경우 비교적 이스트의 증식이 빠르게 진행되므로 비교적 다량의 재조합 단백질의 생산이 가능하다.
3) Baculovirus를 이용하여 곤충 세포에서 재조합 단백질 생산
바이러스 벡터인 배큘로바이러스(baculovirus)를 곤충세포에 감염시켜서 재조합 단백질을 생산하는 방법을 통하여 hSHP-1 펩티드를 생산할 수 있다. 이 경우에는 만들어진 펩티드의 당화 및 황화가 비교적 잘 이루어져 있으므로 상당히 기능성이 좋은 hSHP-1 재조합 단백질의 생산이 가능하다. 곤충 세포는 증식성이 비교적 높고 엔도톡신의 생산도 낮을 뿐 아니라 배양시 다루기 편리한 이점이 있는 반면에 호스트 세포가 hSHP를 다른 기능성 단백질로 인식하여 변형된 당화나 황화 과정으로 hSHP의 항균, 항암 및 면역 촉진 기능이 감소되는 경향이 발견되었다. 따라서 세포 배양의 조건, 수확 (harvesting) 시기, 및 순수 정제 방법 등에 주의가 필요하다.
4) CMV 벡터를 이용하여 동물 세포에서 재조합 단백질 생산
세포 배양에 흔하게 사용되는 사람, 쥐, 소 등의 불멸화 세포 (immortalized cell) 또는 암세포 등에 직접 CMV 프로모터를 사용하는 벡터를 삽입하여 hSHP-1 재 조합 단백질을 생산하는 방법이다. 이 경우에도 hSHP-1의 당화 및 황화가 순조롭게 잘 이루어지지만 증식성이 높은 호스트 세포에서 hSHP-1이 당화되지 못하고 세포 내에 축적되어 오히려 호스트 세포의 증식을 억제하고 사멸시키는 항암 작용을 하는 경우가 있어서 충분한 양의 hSHP-1 의 생산이 어려울 수가 있다. 그리고 동물세포는 박테리아나 이스트 등에 비하여 세포 분열 속도와 단백질 생산 속도가 낮아서 대량의 hSHP-1 생산에 어려움이 있다.
11. 사람의 분비액 중의 hSHP-1 분리방법
사람이 분비하는 hSHP-1은 분비 세포 내에서 당화 및 이황화결합 등을 통하여 다 기능성 단백질로 만들어 진 후에 세포 밖으로 배출되는 것으로 관찰된다. 따라서 일반적인 재조합 단백질의 제작 과정에서 원핵세포 (prokaryote) 인 박테리아에서 만들어진 재조합 단백질은 당화와 이황화결합이 결핍되고, 진핵세포 (eukaryote)인 이스트나 동물세포에서 만들어진 재조합 단백질은 당화와 이황화 결합이 불완전하게 이루어기 때문에 사람의 분비선에서 만들어진 hSHP-1은 제대로 완전하게 형성된 분자 구조를 갖고 있으므로 사람의 몸 안에서 필요한 항균 및 항암 기능이 매우 특이하게 작용할 수 있다. 따라서 사람에서 직접 분비된 체액에서 직접 hSHP-1를 순수 분리하여 필요한 시기에 적절한 용도로 사용할 수 있다.
사람의 분비액 중에서 hSHP-1을 현저하게 많이 생산하는 장기는 침샘, 눈물샘, 질액, 전립선, 유선, 피지선, 위장관액 등이 있는데 이 중에서 침샘, 눈물, 등에서 비교적 쉽게 분비액을 얻을 수 있다. 침샘의 경우를 예로 들면, 성인이 하루 에 분비하는 침의 양이 약 1.5 L 정도로 비교적 많은 양의 침이 분비되는데 침샘 중에서 장액을 주로 분비하는 이하선에서 다량의 hSHP-1을 생산하고 악하선, 설하선, 및 부타액선 등의 순서로 hSHP-1을 생산이 감소된다. 침 안에 포함되어 있는 hSHP-1의 성분을 웨스턴 블롯으로 조사한 결과 이하선의 도관에서 직접 수집한 이하선 침 (parotid saliva)이 입안에 분비된 침을 한꺼번에 모아서 수집한 초기의 혼합 침에 비하여 hSHP-1 량은 증가되어 있으나 성분의 차이는 별로 없었다. 그러나 침이 입 안에 분비되어 1분 이상 지체된 혼합 침은 이하선 침이나 초기의 혼합 침에 비하여 단백질 분해 및 변성 등에 의한 SDS-젤 전기영동 이상이 관찰되었다. 결과적으로 여러 사람에게서 초기의 혼합 침을 다량 얻음으로써 충분한 량의 hSHP-1을 분리 정제할 수 있다.
hSHP-1의 정제 방법은 다양한 방법이 있는데, 우선적으로 수집된 침이 분해되거나 변성되는 것을 방지하기 위하여 침 10 mL에 0.5 M 구연산 (citric acid, pH 4.0) 1 mL, 0.5 M EDTA 20 μL를 섞어서 단백질 분해 효소를 비활성화 시킨다. hSHP-1은 산성에 내성이 크므로 pH 4 이하의 산도에서도 충분히 견딜 수 있다.
그리고 지나치게 당화된 뮤신이나 PRP 단백질을 제거하기 위하여 2배 량의 100% 에탄올을 첨가한 후에 잘 섞어서 -20℃ 냉동고에서 1 시간 방치한 후에 원심 분리하여 침전물을 얻는다. 침전물을 증류수로 잘 흔들어 녹인다. 이 때 용해되지 않는 고형 성분은 버리고 상청액을 사용하여 hSHP-1의 순수 분리를 진행한다. 이 고형 성분 내에도 상당량의 hSHP-1이 존재하므로 경우에 따라 2차 및 3차로 수행한 증류수 용해액을 사용하여 hSHP-1 순수 분리를 진행할 수 있다.
위에서 얻은 수용성의 hSHP-1을 얻기 위하여 이온교환 (ion exchange) 크로마토그라피, 젤 여과 (gel filtration) 크로마토그라피, HPLC 등의 방법을 사용할 수 있다. 이온교환 크로마토 그라피인 경우에는 주로 SP 칼럼 (파마시아, 미국)을 사용하여 pH 6.0 인 Tris-acetate 완충액을 사용하여 당화된 hSHP-1을 분리할 수 있다. 그리고 젤 여과 방법이나 HPLC 방법으로 hSHP-1을 분리하는 경우에는 ELISA, 도트 블롯(dot blot), 웨스턴 블롯 등의 실험을 통하여 hSHP-1의 피크 (peak)를 확인한 후에 바로 분리 및 정제를 반복하여 순수한 당화된 hSHP-1을 얻을 수 있다.
이렇게 얻어지는 사람 분비액의 당화 hSHP-1에는 당화된 초기 단백질 (6 kDa), 심하게 당화된 hSHP-1 (30-50 kDa), 다른 단백질과 교차 결합된 hSHP-1 (53-70 kDa) 등의 여러 종류가 분리되는데 이들은 모두 hSHP-1 항체에 양성 반응을 보인다.
한편, hSHP-1의 항체를 이용하여 분비액 내의 hSHP-1을 분리 정제하는 방법이 가능한데 이 경우 분리되는 hSHP-1의 양이 제한적이다. 이 방법을 위하여 hSHP-1 항체를 비드에 교차결합 시키기 위하여 항체의 중쇄(heavy chain)에 있는 당화 성분을 비드의 아마이드와 치환반응 시킨다. 제작된 hSHP-1 항체 칼럼을 이용하여 분비물 내에 들어 있는 hSHP-1을 항체에 부착시킨 후에 pH 2.5인 구연산(citric acid)으로 분리시켜서 hSHP-1을 정제한다.
hSHP-1이 pH 2.5의 산성 용액에서도 변성되지 않으므로 그대로 보관이 가능하지만 사용 목적에 따라 산성과 염기를 제거하기 위하여 투석 (dialysis)과 냉동 건조 (lyophilization) 후에 보관한다.
12. hSHP-1 단백질의 적용
1) 항균 작용
hSHP-1의 최소 항균성 펩티드인 C-16 펩티드를 생화학적으로 합성하거나 재조합 단백질로 생산하여 감염 부위에 직접 투여할 수 있다. 항균력을 높이고 항균 지속 시간을 증가시키기 위하여 더 긴 hSHP-1 펩티드를 사용할 수 있는데 대략 C-19 (서열번호 제4서열), C-21 (서열번호 제5서열), C-23 (서열번호 제6서열), C-30 (서열번호 제7서열), C-35 (서열번호 제8서열) 펩티드를 사용하면 효과적이다.
hSHP-1은 그람 양성 및 그람 음성의 병원성 박테리아에 모두 강한 항균 작용이 있는데 인체 상주균인 E. coli 에는 다른 병원성균에 비하여 낮은 항균력을 보여서 상주균에 대해 안전한 약제로 사용이 가능하다.
hSHP-1은 메티실린(methicillin) 내성의 세균에 대해서 동일한 항균 작용을 보이고 입 안의 침이나 눈 안의 눈물처럼 중성 용액에서 항균 작용을 보일뿐 아니라 위장과 같이 산성 용액에서도 hSHP-1의 활성도가 감소되지 않고 강한 항균 작용을 보인다. 그리고 피지샘과 같이 소수성 환경에서도 동일한 항균력을 가지므로 인체 내에서 광범위하게 사용할 수 있는 사람의 항균 단백질이다.
hSHP-1의 분해를 억제하고 항균 작용을 강화하기 위하여 구연산에 의한 당화 처리된 hSHP-1의 사용이 필요하다. 그리고 두개의 hSHP-1이 다이머를 형성하여 복 합적인 SHP 구조를 갖는 것이 항균 작용에 유리할 것으로 추측된다. 따라서 hSHP-1이 용액 내에서 지속적으로 항균 작용을 유지하기 위하여 hSHP-1의 다이머 형성과 구연산 당화가 필요하다. 이러한 hSHP-1은 사람의 분비액 중의 고유의 형태 (native form)로 관찰되는데 이러한 고유 형태의 hSHP-1은 세균뿐 아니라 바이러스에 대해서도 항균력을 보이고, 세균의 균막의 형성을 억제하고 균막을 제거하는 매우 고도의 기능성 물질로 사용이 가능하다.
일반적으로 hSHP-1의 합성 펩티드나 재조합 단백질은 눈물, 침, 콧물, 위장관액, 질액, 전립선액, 땀 등의 광범위한 대체용액이나 치료제로 사용이 가능하다. hSHP-1은 위에서 언급한 펩티드 특성에 따라 안정성과 기능성을 유지하기 위해 복합적인 처방이 필요하다.
2) 항암 작용
hSHP-1의 항암효과는 증식이 증가되는 초기의 세포 이형성(dysplasia)을 억제하는 hSHP-1의 항증식 작용에 의한 결과이다. 비정상적으로 증식하는 전암 병소나 초기의 암세포에서는 무산소증 (hypoxia)에 의한 젖산의 생산 증가와 ATP의 지나친 소모로 hSHP-1의 구연산화 (sialidization)와 당화 (glycosylation)가 쉽게 이루어지지 않으므로 hSHP-1이 세포 밖으로 배출되지 못하고 세포질 내에 축적된다. 그리고 축적된 hSHP-1은 점차로 핵 내로 이동하여 핵질인 DNA에 무분별하게 부착됨에 따라 세포의 활성도가 신속하게 감소되어 세포가 소멸되어 진다. 이 때 hSHP-1에 의하여 핵질이 심하게 손상된 세포는 세포사멸 과정을 거치기 전에 점막 상피에서 조기 탈락되는 현상을 통하여 비정상적인 증식성을 보이는 전암 병소 세포나 초기 암세포들이 점막에서 제거될 수 있다.
hSHP-1의 화학 합성 펩티드나 재조합 펩티드인 경우에 인위적으로 당화가 없는 hSHP-1을 사용하여 세포 배양하면 hSHP-1이 쉽게 세포 내로 들어가서 핵 내로 모이는 성질을 이용해서 hSHP-1을 전암 병소나 항암 치료제로 사용할 수 있다.
피부나 쉽게 접근이 가능한 눈이나 입 안의 점막에는 hSHP-1이 포함되어 있는 연고제를 사용하여 상기의 항암 효과를 기대할 수 있으며, 위장관과 같이 접근이 어려운 경우에는 경구 투여용 약물을 주기적으로 복용함으로써 hSHP-1의 항암 효과를 기대할 수 있다.
상기의 hSHP-1 항암치료는 hSHP-1이 쉽게 세포 내로 침투되어 질 수 있는 전암병소나 초기의 암세포에서 효과적인데 악성 암세포처럼 세포벽이 불분명한 당단백질에 의하여 두꺼워지고 세포질에 무산소증이 증가된 경우에는 hSHP-1이 세포 내로 쉽게 침투되어지지 않으므로 효과를 기대하기 어렵다. 이런 경우에는 바이러스 벡터를 이용하여 증식성 암세포에 선택적으로 일차 감염은 되지만 이차 감염이 안되는 변이 바이러스를 사용하여 hSHP-1를 악성 암세포에 전달함으로써 hSHP-1의 항암작용을 일으킬 수 있다.
3) 면역 촉진 작용
양이온성의 짧은 나선형 펩티드 (cationic short helical peptide)인 hSHP-1은 항원성 물질에 단단히 부착하는 성질이 있는데 hSHP-1이 점막상피 표면에 교차 결합하는 특성을 갖고 있으므로 점막세포 주위로 흘러 지나가는 항원체를 잡아서 점막세포에 부착시켜 주는 역할을 할 수 있다. 일부 점막 상피는 부착된 항원성 물질을 엔도사이토시스(endocytosis)에 의하여 포식한 후에 근처의 면역세포들에 전달시키는 역할을 하는데 편도선 균열된 점막조직의 세포들이나 장관막의 균열된 점막조직의 세포 등에서 흔하게 관찰된다.
특정의 항원체를 hSHP-1에 부착시켜서 약물로 복용하거나 연고제로 얇은 피부나 점막에 장기간 부착시키면 면역기능을 회복시키는 왁찐과 같은 효과를 얻을 수 있다.
특정 항원체의 성질에 따라 hSHP-1의 펩티드 크기, 당화 및 이황화 다이머 형성 등의 조건을 바꾸어서 사용할 수 있다. 예를 들면 인후루엔자 바이러스 피낭과 같이 작은 항원체인 경우 부분적으로 당화된 짧은 hSHP-1을 사용하여 점막세포를 통한 면역 전달을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 탄수화물류 화합물 (예: 락토스, 아밀로스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 셀룰로스, 등), 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 염 용액, 알코올, 아라비아 고무, 식물성 기름 (예: 옥수수 기름, 목화 종자유, 두유, 올리브유, 코코넛유), 폴리에틸렌 글리콜, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경피, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 적합한 투여량은 성인 기준으로 1일 1회 50 ㎎ - 10 g 이다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실 시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: hSHP-1의 교차결합 능력 및 발현 특징
hSHP-1은 카복시 말단에 트랜스구루타민에 의한 교차결합 능력을 갖고 있으므로 침 속의 다른 단백질 성분이나 점막 내에서 점막세포의 세포막에 단단히 결합할 수 있는 구조를 갖고 있다. 이를 실험하기 위하여 침 속에서 구강 탈락 상피를 얻었으며 이들을 8 M urea, 1% SDS, 2 mM EDTA 그리고 20 mM 머캅토에탄올 용액에서 100ㅀC에서 2 시간 동안 끓여서 단백질의 용해량 관찰하였으며 단백질이 용해되지 않을 때까지 반복하여 끓인 후에 통법에 의하여 파라핀 조직 표본을 제작한 후에 hSHP-1 항체를 사용하여 면역조직화학염색을 수행한 결과 hSHP-1이 구강탈락 상피의 바깥쪽 상피 표면에 강하게 발현되는 것을 확인하였다. 한편, hSHP-1이 트랜스구루타민나제의 기질 (substrate)로 사용되는 것을 확인하기 위하여 hSHP-1을 트랜스구루타민나제의 기질로 잘 알려진 모노단실 카다버린 (monodansylcadaverine)과 혼합한 용액에 트랜스구루타민나제를 반응시키는 실험을 수행하였다. 그 결과, hSHP-1은 트랜스구루타민나제에 의하여 칼슘이온에 의존적으로 모노단실 카다버린과 교차결합하는 현상이 관찰되었다 (도 6).
한편, hSHP-1은 사람의 각종 점막조직 상피의 바깥쪽 상피세포 표면에 선상으로 발현되는데 특히 대장의 점막에서는 음식물 분해 성분이 접촉되는 부위의 점 막 상피에 강하게 선상으로 발현되는 특징을 보였다 (도 9).
실시예 2: hSHP-1에 대한 항체 생산
hSHP-1은 46개의 아미노산으로 이루어진 짧은 단백질로서 아미노 말단의 11개 아미노산은 신호 펩티드로서 절단될 것으로 추측되므로 실제 35개 아미노산을 이용하여 항체를 생산할 수 있다. 카복실 말단 23개 아미노산이 실제적인 항균 작용을 하지만 이 23개 아미노산은 항원성이 매우 낮으므로 항체 생산이 어렵다. 따라서 hSHP-1의 항원성이 높은 아미노 말단 13-23에 해당하는 아미노산을 포함하는 펩티드를 이용하여 항체를 생산할 수 있다. hSHP-1에 대한 항체로는 다크론 항체와 단크론 항체 모두 생산 가능하다. 다클론 항체인 경우 가토, 염소, 소, 생쥐, 백서 등 대부분의 동물을 사용할 수 있으며, 카복시 말단 35개 아미노산을 사용하는 경우 단일 특이성 항체 (monospecific antibody)가 만들어 진다. 단클론 항체인 경우에는 매우 특이성이 높은 항체의 생산이 가능하다. 예를 들면, 생쥐의 골수종 하이브리드 (myeloma hybrid)를 사용하여 지속적인 단크론 항체가 생산될 수 있다.
실시예 3: 재조합 hSHP-1 제조
1) 플라스미드 벡터를 이용한 박테리아에서 재조합 단백질 생산
hSHP-1은 짧은 펩티드로서 염기서열이 작으므로 탠덤 리피트(tandem repeat)된 코드를 사용하여 벡터를 제작할 수 있었다. 이때 사람의 단백질 코드가 박테리아에서 잘 만들어 지게 하기 위하여 DNA 코드의 최적화가 필요하다. hSHP-1 자체 가 호스트 세포인 박테리아의 증식을 억제할 수 있으므로 hSHP-1 코드에 KSI, His-tag, GFP, GST 등의 융합 단백질을 부착하여 hSHP-1의 기능을 억제하고 hSHP-1의 순수 분리시 크로마토그라피 부착에 도움이 되는 방법으로 사용하였다. 이 방법에 사용되는 벡터는 상업용으로 구입이 가능한 pET32b, pET 시리즈 등 대부분의 벡터가 사용될 수 있다. 박테리아에서 재조합 단백질을 생산하는 경우에는 단백질의 당화나 이황화 변형 등이 이루어지지 않는 펩티드가 만들어 진다. 따라서 순수 분리된 hSHP-1 펩티드는 경우에 따라 당화 및 황화 처리가 불가피하다.
2) Pichia pastoris에서 재조합 단백질 생산
이스트에 속하는 Pichia pastoris는 박테리아에 비하여 세포내 당화가 잘되고 엔도톡신의 양이 비교적 적어서 순수 기능성 hSHP-1 펩티드 생산이 유리하다. 이 방법에 사용되는 벡터는 상업용으로 구입이 가능한 대부분의 이스트용 벡터가 사용될 수 있으며 이 경우 비교적 이스트의 증식이 빠르게 진행되므로 비교적 다량의 재조합 단백질의 생산이 가능하다.
3) Baculovirus를 이용하여 곤충 세포에서 재조합 단백질 생산
바이러스 벡터인 배큘로바이러스를 곤충세포에 감염시켜서 재조합 단백질을 생산하는 방법을 통하여 hSHP-1 펩티드를 생산할 수 있다. 이 경우에는 만들어진 펩티드의 당화 및 황화가 비교적 잘 이루어지므로 상당히 기능성이 좋은 hSHP-1 재조합 단백질의 생산이 가능하다. 곤충 세포는 증식성이 비교적 높고 엔도톡신의 생산도 낮을 뿐 아니라 배양시 다루기 편리한 이점이 있는 반면에 호스트 세포가 hSHP를 다른 기능성 단백질로 인식하여 변형된 당화나 황화 과정으로 hSHP의 항균, 항암 및 면역 촉진 기능이 감소되는 경향이 발견되었다. 따라서 세포 배양의 조건, 수확 (harvesting) 시기 및 순수 정제 방법 등에 주의가 필요하였다.
4) CMV 벡터를 이용하여 동물 세포에서 재조합 단백질 생산
세포 배양에 흔하게 사용되는 사람, 쥐, 소 등의 불멸화 세포 (immortalized cell) 또는 암세포 등에 직접 CMV 프로모터를 사용하는 벡터를 삽입하여 hSHP-1 재조합 단백질을 생산하는 방법이다. 이 경우에도 hSHP-1의 당화 및 황화가 순조롭게 잘 이루어지지만 증식성이 높은 호스트 세포에서 hSHP-1이 당화되지 못하고 세포 내에 축적되어 오히려 호스트 세포의 증식을 억제하고 사멸시키는 항암 작용을 하는 경우가 있어서 충분한 양의 hSHP-1 의 생산이 어려울 수가 있다. 그리고 동물세포는 박테리아나 이스트 등에 비하여 세포 분열 속도와 단백질 생산 속도가 낮아서 대량의 hSHP-1 생산에 어려움이 있었다.
실시예 4: 사람의 점액에서 hSHP-1 복합체(complex)의 분리
hSHP-1은 사람의 점액에서 다른 단백질들과 결합하여 복합체의 형태로 주요 기능을 하는 것으로 나타났는데 사람의 침에서 hSHP-1 단백질만 분리해서 정제하는 것은 어려우므로 hSHP-1이 결합된 침 단백질 복합체를 추출하였다. 추출하는 방법은 hSHP-1 항체 칼럼을 이용하여 침에서 직접 분리 추출하는 방법이 있으나 다량 생산에는 한계가 있었다. 따라서 점액 내에서 다량을 만들기 위하여 hSHP-1 단백질의 특성을 이용하였다.
우선, hSHP-1이 나선 구조이면서 소수성과 친수성이 반복되어 있으므로 부착력이 매우 큰 성질을 이용하였다. 예를 들면 이하선 침이나 혼합 침에서 hSHP-1을 분리하는 방법으로 우선 에탄올 침전법을 사용하여 침 속에 다량 함유되어 있는 아밀라제, 뮤신, 그리고 프로린 리치 단백들 (proline rich proteins) 등을 70% 에탄올로 침전시켜서 제거하고 상청액을 각각 80, 90% 순으로 에탄올을 증가시키면서 침전시켜서 소수성 단백질을 모으고 나머지 상청액을 건조시켜서 강한 소수성 단백질을 모았다. 이렇게 모은 단백질 중에는 90% 이상에 용해되어 있는 단백질에 hSHP-1의 함량이 가장 많고, 90, 80% 순으로 hSHP-1의 함량이 감소되어 있었다. 이렇게 얻은 침 단백질을 양이온성 이온 교환 칼럼 (cationic ion exchange column, SP-column)을 사용하여 양이온성을 보이는 단백질을 분리하였다. 이중에는 아직도 히스타틴이나 염기성 프로린 리치 단백들이 포함되어 있으므로 hSHP-1이 나선구조 특유의 비특이성 결합하는 성질을 이용하여 C-8 칼럼을 사용하여 HPLC 정제를 수행하였다. 친수성 유동액은 증류수를 사용하고 소수성 유동액은 메탄올을 사용하였으며 각각의 용액에 트리플로로아세테이트 0.01%를 첨가하였다. 이 경우 대부분의 hSHP-1 결합 침 복합체는 C-8 칼럼에 부착되어서 메탄올 유동 시에 그 일부가 용해되어 복잡한 피크를 나타내며 분리된다. 이는 hSHP-1 결합 침 복합체가 매우 여러 종류의 이종 단백질과 다양한 형태의 구조를 이루는 것을 의미한다. 다량의 hSHP-1 결함 침 복합체를 C-8 칼럼에 충분히 부착시킨 후에 pH 2.5인 초산 용 액으로 용해 시켜서 한꺼번에 모아서 동결건조 시킨 후에 0.1 M DTT 용액을 첨가한 후에 70ㅀC에서 20분 동안 배양시켜서 이황화 결합을 단절시켰다. 그리고 소수성 흡착성이 적은 실리케이티드 젤 휠터 (silicated gel filtration) 칼럼을 사용하여 분리시켜서 hSHP-1 결합 침 복합물을 분리 정제하였다. 이렇게 환원시킨 hSHP-1 결합 침 복합체는 활성도가 높은 다기능성 단백질 기능을 갖게 되므로 동결 건조하거나 4ㅀC에 보관하였다가 바로 항균 및 항암 활성을 시험할 수 있다.
실시예 5: hSHP-1의 항균 활성
1) 박테리아 및 진균에 대한 항균 작용
hSHP-1은 전체적으로 16개의 나선구조를 갖는 것으로 추정되는데 이중에서 11 개의 나선구조가 독특한 항균작용을 한다. 아미노 말단의 소수성 나선은 주로 박테리아에 부착하는 성질이 강하고 카르복실 말단에는 트랜스 글루타민에 의한 글루타민-라이신 교차결합 시키는 모티프가 있어서 점막이나 주요한 세포의 표면에 단단히 부착되어 지속적인 항균작용을 할 것으로 추정되었다. hSHP-1의 주요 항균 작용은 대략 12-45 번째 아미노산의 나선구조가 박테리아의 세포막에 부착력이 강하고 세포막에 삽입되어 세포벽에 구멍을 만들어서 세포를 파괴시키는 것으로 추정된다. hSHP-1과 동일한 항균력을 보이는 최소 크기의 펩티드 (16개 펩티드; SRVLNRSLQVKVVKIT)는 +4의 양성 전하 값을 갖고 있었다. hSHP-1의 카복시 말단 23 개 펩티드를 사용하여 항균작용을 관찰한 결과, Staphylococcus aureus, Candida albicans, Aspergillus niger, Pseudomonas aeruginosa 등의 병원균에 대하여 강한 살균력 (hSHP-1, C-23 mer, MIC: 약 10 μM/107 cells)을 보였으며 인체의 상주균인 Escherichia coli에 대하여는 중등도의 살균력 (MIC: 약 100 μM/107 cells)을 보였다 (도 7).
한편, hSHP-1은 메티실린에 내성이 있는 Staphylococcus aureus에 대해서도 내성이 없는 Staphylococcus aureus과 동일한 항균 작용을 보였다. 그리고 사람의 위염의 원인균으로 알려져 있는 Helicobacter pylori에 대하여 중등도의 살균력 (MIC: 약 150 μM/107 cells) 을 보였다.
2) 바이러스에 대한 항균 작용
hSHP-1은 구연산 (sialic acid)이 부착되는 세린-세린 (SS) 모티프를 두개 갖고 있으며 두개의 hSHP-1이 이황화결합에 의하여 연결되어 다이머를 형성하는 경우 다수의 구연산화 (sialidation)에 의한 당화단백질 (glycoprotein)을 만들었다. 이렇게 당화된 hSHP-1은 당화된 염기성 프로린 풍부 단백질 (glycosylated basic proline rich protein)과 같이 항바이러스 (antivirus)의 기능을 갖는다. 따라서 피막성 바이러스에 강한 부착성을 갖으며 양이온성의 (cationic) SHP가 피막을 손상시킴으로써 효과적인 항바이러스의 기능을 보여준다.
3) 균막 생성 억제 및 제거 기능
당화된 hSHP-1은 박테리아나 진균류가 형성시킨 균막 (biofilm)에도 부착력 이 있으므로 균막 내의 세균에 대하여 항균 작용을 할뿐 아니라 균막의 형성을 방해하고 균막의 구조를 이완시킴으로써 새로운 균막의 생성을 억제하고 기존의 균막을 제거하는 기능을 갖고 있다.
4) hSHP-1 결핍증에 대한 치료
따라서 사람의 점막이나 피부에 지속적으로 당화된 hSHP-1의 기능이 유지되면 매우 효과적으로 박테리아, 진균 및 바이러스에 대한 항균 작용을 기대할 수 있었다.
특히, 노인성 또는 퇴행성 질환이나 자가면역 질환인 경우에는 각종 점막이나 피부에서 분비물의 감소가 두드러지게 나타나는데 이 경우 hSHP-1의 분비 감소 현상으로 각종 병원균에 의한 다발성 감염증이 발생될 수 있다. 이 경우 점액 중에 결핍된 성분 중의 하나인 hSHP-1의 공급이 필요하다. 상기의 환자들에서 hSHP-1이 결핍되어 있음을 알기 위하여 점액 분비물 중에 hSHP-1의 농도를 측정할 수 있는 분석법으로 ELISA, 도트 블롯, 웨스턴 블롯 등의 방법을 사용할 수 있으며, 분비된 점액을 바로 이용하여 세균에 대한 항균력을 검사할 수 있는 검사법으로는 배지를 이용한 세균 살상 에세이(killing assay)를 사용하여 최소 억제 농도(Minimum Inhibitory Concentration; MIC) 값으로 판정할 수 있다.
hSHP-1의 최소 항균성 펩티드인 C-16 펩티드를 생화학적으로 합성하거나 재조합 단백질로 생산하여 감염 부위에 직접 투여할 수 있다. 항균력을 높이고 항균 지속 시간을 증가시키기 위하여 더 긴 hSHP-1 펩티드를 사용할 수 있는데 대략 C-19 (서열번호 제4서열), C-21 (서열번호 제5서열), C-23 (서열번호 제6서열), C-30 (서열번호 제7서열), C-35 (서열번호 제8서열) 펩티드를 사용하면 효과적이다.
hSHP-1은 그람 양성 및 그람 음성의 병원성 박테리아에 모두 강한 항균 작용이 있는데 인체 상주균인 E. coli 에는 다른 병원성균에 비하여 낮은 항균력을 보여서 상주균에 대해 안전한 약제로 사용이 가능하다.
hSHP-1은 메티실린 내성의 세균에 대해서 동일한 항균 작용을 보였고 입 안의 침이나 눈 안의 눈물처럼 중성 용액에서 항균 작용을 보일뿐 아니라 위장과 같이 산성 용액에서도 hSHP-1의 활성도가 감소되지 않고 강한 항균 작용을 보였다. 그리고 피지샘과 같이 소수성 환경에서도 동일한 항균력을 가지므로 인체 내에서 광범위하게 사용할 수 있는 사람의 항균 단백질이다.
hSHP-1의 분해를 억제하고 항균 작용을 강화하기 위하여 구연산에 의한 당화 처리된 hSHP-1의 사용이 필요하다. 그리고 두개의 hSHP-1이 다이머를 형성하여 복합적인 SHP 구조를 갖는 것이 항균 작용에 유리할 것으로 추측된다. 따라서 hSHP-1이 용액 내에서 지속적으로 항균 작용을 유지하기 위하여 hSHP-1의 다이머 형성과 구연산 당화가 필요하다. 이러한 hSHP-1은 사람의 분비액 중의 고유의 형태 (native form)로 관찰되는데 이러한 고유 형태의 hSHP-1은 세균뿐 아니라 바이러스에 대해서도 항균력을 보이고, 세균의 균막의 형성을 억제하고 균막을 제거하는 매우 고도의 기능성 물질로 사용이 가능하다.
일반적으로 hSHP-1의 합성 펩티드나 재조합 단백질은 눈물, 침, 콧물, 위장관액, 질액, 전립선액, 땀 등의 광범위한 대체용액이나 치료제로 사용이 가능하다. hSHP-1은 위에서 언급한 펩티드 특성에 따라 안정성과 기능성을 유지하기 위한 복합적인 처방이 필요하다.
실시예 6: hSHP-1의 항암 활성
hSHP-1의 항암효과는 증식이 증가되는 초기의 세포 이형성 (dysplasia)을 억제하는 hSHP-1의 항증식 작용에 의한 결과이다. 비정상적으로 증식하는 전암 병소나 초기의 암세포에서는 무산소증 (hypoxia)에 의한 젖산의 생산 증가와 ATP의 지나친 소모로 hSHP-1의 구연산화 (sialidization)와 당화가 쉽게 이루어지지 않으므로 hSHP-1이 세포 밖으로 배출되지 못하고 세포질 내에 축적되었다. 그리고 축적된 hSHP-1은 점차로 핵 내로 이동하여 핵질인 DNA에 무분별하게 부착됨에 따라 세포의 활성도가 빠르게 감소되어 세포가 사멸되었다(도 15). 이 때 hSHP-1에 의하여 핵질이 심하게 손상된 세포는 세포사멸 과정을 거치기 전에 점막 상피에서 조기 탈락되는 현상을 통하여 비정상적인 증식성을 보이는 전암 병소 세포나 초기 암세포들이 점막에서 제거될 수 있다(도 14).
hSHP-1의 화학 합성 펩티드나 재조합 펩티드인 경우에 인위적으로 당화가 없는 hSHP-1을 사용하여 세포 배양하면 hSHP-1이 쉽게 세포 내로 들어가서 핵 내로 모이는 성질을 이용해서 hSHP-1을 전암 병소나 항암 치료제로 사용할 수 있다(도 14, 15, 16).
피부나 쉽게 접근이 가능한 눈이나 입 안의 점막에는 hSHP-1이 포함되어 있는 연고제를 사용하여 상기의 항암 효과를 기대할 수 있으며, 위장관과 같이 접근이 어려운 경우에는 경구 투여용 약물을 주기적으로 복용함으로써 hSHP-1의 항암 효과를 기대할 수 있다.
상기의 hSHP-1 항암치료는 hSHP-1이 쉽게 세포 내로 침투되어 질 수 있는 전암병소나 초기의 암세포에서 효과적인데 악성 암세포처럼 세포벽이 불분명한 당단백질에 의하여 두꺼워지고 세포질에 무산소증이 증가된 경우에는 hSHP-1이 세포 내로 쉽게 침투되어지지 않으므로 효과를 기대하기 어렵다. 이런 경우에는 바이러스 벡터를 이용하여 증식성 암세포에 선택적으로 일차 감염은 되지만 이차 감염이 안되는 변이 바이러스를 사용하여 hSHP-1를 악성 암세포에 전달함으로써 hSHP-1의 항암작용을 일으킬 수 있다.
실시예 7: hSHP-1의 면역촉진 활성
양이온성의 짧은 나선형 펩티드인 hSHP-1은 항원성 물질에 단단히 부착하는 성질이 있는데 hSHP-1이 점막상피 표면에 교차결합하는 특성을 갖고 있으므로 점막세포 주위로 흘러 지나가는 항원체를 잡아서 점막세포에 부착시켜 주는 역할을 할 수 있다. 일부 점막 상피는 부착된 항원성 물질을 엔도사이토시스에 의하여 포식한 후에 근처의 면역세포들에 전달시키는 역할을 하는데 편도선 균열된 점막조직의 세포들이나 장관막의 균열된 점막조직의 세포 등에서 흔하게 관찰된다.
특정의 항원체를 hSHP-1에 부착시켜서 약물로 복용하거나 연고제로 얇은 피 부나 점막에 장기간 부착시키면 면역기능을 회복시키는 왁찐과 같은 효과를 얻을 수 있다. 특정 항원체의 성질에 따라 hSHP-1의 펩티드 크기, 당화 및 이황화 다이머 형성 등의 조건을 바꾸어서 사용할 수 있다. 예를 들면 인플루엔자 바이러스 피낭과 같이 작은 항원체인 경우 부분적으로 당화된 짧은 hSHP-1을 사용하여 점막세포를 통한 면역 전달을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 hSHP-1은 사람에서 분비하는 항균 및 항암 단백질이므로 면역학적으로 알러지 반응의 가능성이 없으며 사람의 다른 항균 단백질에 비하여 매우 강한 항균력을 보였다. 현재까지 발견된 사람의 항균 단백질 중에서 가장 강한 항균력을 보이며 침뿐 아니라 사람의 대부분의 분비선 및 점막 조직에서 발현이 관찰되는 광범위한 항균 단백질이며 결핍 시에 감염성 점막 질환을 일으킬 수 있다. 따라서 hSHP-1은 감염성 점막 질환의 예방 및 치료에 긴요하게 사용될 수 있었다.
또, 본 발명의 hSHP-1은 구조적 특이성에 의하여 증식성이 높은 전암 병소 세포나 암세포에 작용하여 증식을 방해하고 암세포의 조기 탈락 또는 조기 세포 자멸사를 유도함으로써 초기의 암 발생을 억제하고 암세포의 침윤 증식은 감소시키는 효과에 의하여 항암 작용을 하는 것이 관찰되므로 hSHP-1의 항암제 효용성이 매우 높다.
또, 본 발명의 hSHP-1은 구조적으로 나선형 펩티드이면서 소수성이 강하며 양성의 (cationic) 전하적 특성을 보이고, 이황화 결합과 글루타민-라이신 (glutamine-lysine) 교차 결합을 이루면서 다른 단백질에 단단히 부착되는데 hSHP-1이 점막 상피에 부착될 뿐 아니라 이종 단백질 사이에 끼어드는 상태로 교차 결합을 이루어서 침 성분 복합체 (salivary complex)를 이루는 주요 구성 성분 역할을 하는 것으로 관찰되었다. 특히 항원성 인지가 어려운 외부 단백질에 대하여 hSHP-1이 신속하게 반응하여 복합체를 형성시킨 후에 점막 상피에 부착됨으로써 초기 면역 반응을 일으키는 기전이 관찰되므로 hSHP-1을 사용하여 면역세포들이 인지하기 어려운 작은 항원체를 커다란 복합체를 만들어서 점막 상피에 부착시켜 줌으로써 점막 유래 면역 (mucosa associated immunity) 기전을 촉진시킬 수 있다.
<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Human Short Helical Peptide-1 which has antimicrobial, antitumor, and immune stimulating activity and uses thereof <130> dp-2006-0170 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 141 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 atgcacgact tctgggtact gtgggttctt ttggaatata tatataattc cgcgtgtagt 60 gtactgtcag ctacgtcaag tgtgagcagc cgggtgttaa acagaagtct ccaggtgaag 120 gtggttaaaa tcaccaactg a 141 <210> 2 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met His Asp Phe Trp Val Leu Trp Val Leu Leu Glu Tyr Ile Tyr Asn 1 5 10 15 Ser Ala Cys Ser Val Leu Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Arg Val 20 25 30 Leu Asn Arg Ser Leu Gln Val Lys Val Val Lys Ile Thr Asn 35 40 45 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shortened hSHP-1 peptide <400> 3 Arg Val Leu Asn Arg Ser Leu Gln Val Lys Val Val Lys Ile Thr Asn 1 5 10 15 <210> 4 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shortened hSHP-1 peptide <400> 4 Val Ser Ser Arg Val Leu Asn Arg Ser Leu Gln Val Lys Val Val Lys 1 5 10 15 Ile Thr Asn <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shortened hSHP-1 peptide <400> 5 Ser Ser Val Ser Ser Arg Val Leu Asn Arg Ser Leu Gln Val Lys Val 1 5 10 15 Val Lys Ile Thr Asn 20 <210> 6 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shortened hSHP-1 peptide <400> 6 Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Arg Val Leu Asn Arg Ser Leu Gln Val 1 5 10 15 Lys Val Val Lys Ile Thr Asn 20 <210> 7 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shortened hSHP-1 peptide <400> 7 Ser Ala Cys Ser Val Leu Ser Ala Thr Ser Ser Val Ser Ser Arg Val 1 5 10 15 Leu Asn Arg Ser Leu Gln Val Lys Val Val Lys Ile Thr Asn 20 25 30 <210> 8 <211> 35 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Shortened hSHP-1 peptide <400> 8 Glu Tyr Ile Tyr Asn Ser Ala Cys Ser Val Leu Ser Ala Thr Ser Ser 1 5 10 15 Val Ser Ser Arg Val Leu Asn Arg Ser Leu Gln Val Lys Val Val Lys 20 25 30 Ile Thr Asn 35

Claims (12)

  1. 다음의 군으로부터 선택되는 항균 활성, 항암 활성 또는 면역 촉진 활성을 가지는 펩티드:
    (a) 상기 펩티드의 N-말단은 서열번호 제2서열의 제12번째 아미노산 잔기 내지 제31번째 아미노산 잔기 중 어느 하나로부터 선택되고, 상기 펩티드의 C-말단은 서열번호 제2서열의 45번째 또는 제46번째 아미노산 잔기로부터 선택되며, 16-머(mer) 이상인 펩티드,
    (b) 상기 펩티드 (a)의 탠덤 리피트(tandem repeat).
  2. 제1항에 있어서, 상기 펩티드는 서열번호 제3서열 내지 제8서열 중 어느 하나의 펩티드 또는 이의 탠덤 리피트인 것을 특징으로 하는 항균 활성, 항암 활성 또는 면역 촉진활성을 가지는 펩티드.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 펩티드는 당화(glycosylation)된 것을 특징으로 하는 항균 활성, 항암 활성 또는 면역 촉진활성을 가지는 펩티드.
  4. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드.
  5. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 구강, 안구, 모발, 피부, 비강, 위장관, 복막, 흉막, 질, 전립선, 방광(오줌보), 요로(오줌길), 관절낭, 뇌하수체막, 외이, 내이, 골수, 또는 내부의 주요 장기에서 발생된 감염성 질환의 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 감염성 질환의 병원체는 그람 음성 또는 그람 양성 박테리아, 진균류, 피낭성 바이러스인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 감염성 질환의 병원체는 메티실린 내성균인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 전암병소 또는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 암은 피부암, 골육종, 구강암, 위암, 장암, 뇌종양 또는 간암으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 면역기능 강화용 조성물.
  11. 제1항 또는 제2항의 펩티드를 유효성분으로 포함하는, 항균용 생활용품.
  12. 제11항에 있어서, 상기 생활용품은 화장품, 치약, 피부 세정제, 여성 청결제, 안구 건조시 사용되는 인공 눈물, 구강 건조시 사용되는 인공 침, 비강 건조시 사용되는 인공 콧물, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항균용 생활용품.
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