KR20070114380A

KR20070114380A - 후향 후대 맵핑

Info

Publication number: KR20070114380A
Application number: KR1020077022586A
Authority: KR
Inventors: 로베르트 헬레너 히슬라인 디르크스; 요하네스 빌헬무스 쉬트
Original assignee: 리즈크 즈완 자드틸트 엔 자드한델 비.브이.
Priority date: 2005-03-03
Filing date: 2006-03-02
Publication date: 2007-12-03
Also published as: EP1855518A2; NZ560821A; IL185522A0; US20110065119A1; WO2006094774A2; CA2598737C; JP2008531030A; MX2007010567A; ES2554471T3; CA2598737A1; JP5818398B2; US8165822B2; IL185522A; AU2006222151A1; US7860658B2; JP2013117535A; WO2006094774A3; EP1855518B1; KR101317729B1; AU2006222151B2

Abstract

본 발명은 a) 제2 분열 복원(second division restitution)으로 발생되는 비감수분열 세포(unreduced cell), 특히 비감수분열 포자 집단의 일원으로부터 발생되는, SDR-O 유기체, 특히 식물 집단을 제공하는 단계; b) 상기 SDR-0 유기체 각각으로부터 SDR-1 후대 집단을 제조하는 단계; c) 상기 SDR-1 후대 집단의 표현형을 확인하여, 각 SDR-1 후대 집단에서 분리 형질(segregating trait)을 동정하는 단계; 및 d) 분리 후대가 SDR-1 후대 집단에 존재하는 경우, 해당 SDR-0 유기체의 유전자형을 확인하고, 그 유전자형을 다른 SDR-0 유기체의 유전자형과 비교하여, 상기 SDR-1 후대 집단에서 동정되는 상기 분리 형질의 출현과 연관된 이형접합성 염색체 영역을 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 형질 맵핑 방법에 관한 것이다.

Description

후향 후대 맵핑{REVERSE PROGENY MAPPING}

본 발명은 유기체, 특히 식물에서 형질(trait)을 맵핑(mapping)하는 방법에 관한 것이다.

복잡한 농작물의 형질, 예컨대 수확량, 스트레스 관용성, 대사산물 조성 및 잡종 강세(heterosis)와 조합 능력(combining ability)과 같은 관련 현상은, 이들의 양적 유전 성질 및 환경과의 강력한 상호작용으로 인해 연구하기 어렵다. 또한, 이들에 의해 유발되는 이러한 형질/현상 유전학은 흔히 매우 복잡하고, 대개 양적이고, 다인자유전자적(polygenic)인데, 이는, 이로부터 발현되는 표현형은 여러가지 유전자 자리에 의해 코딩되는 여러가지 대립 유전자의 상호작용에 의해 초래됨을 의미한다.

개개 유전자 자리가, 양적 형질(quantitative trait)에 기여하는 다른 유전자 자리의 대립 유전자의 존재 또는 부재와는 상관없이, 전체적인 작용에 측정가능한 정도로 기여를 할 때, 양적 형질에 대해 기여하는 각 유전자 자리를 특정화하고자하는 시도가 성공적으로 이루어져 왔다. 이러한 경우, 개별 QTL는 부가적인 성질의 것으로, 단순한 멘델 양상으로 유전된다.

여러가지 QTL 맵핑 방법이 널리 개시되어 있지만, 표현형이 수많은 이형접합 성 유전자 자리의 상호작용에 의해 초래될때, 특히 상기 유전자 자리가 상호의존적인 경우에는, 이러한 방법 대부분은 실패한다. 이는, 특정 형질 발현을 위해선는 2 이상의 특이적인 유전자 자리가 동시에 존재하여야 함을 의미한다. 2 곳의 유전자 자리중 어느 하나에 필수 대립 유전자가 없는 경우에는, 표현형 형질은 발현되지 않을 것이다. 개개의 필수 대립 유전자는 동형접합체 또는 이형접합체 형태 중 어느 한가지를 형성할 수 있다. 특정 형질에 따라, 유전자 자리의 여러가지 유전자 구성이 필요할 수 있다. 예컨대, 측정가능한 결과는 2 곳 이상의 유전자 자리가 이형접합체 상태로 존재할때만 관찰되며, 유전자 자리중 어느 하나라도 동형접합체일때에는 관찰되지 않는다. 이러한 경우, 상기 유전자 자리는 상호 의존적인 상태일 수 있다.

전술한 바와 같이, 수확율 및 스트레스 관용성과 같은 복합 형질은 산업적으로 매우 중요하므로, 여러 농작물에서 그러한 형질에 대한 육종 효율을 증가시킬 수 있는, 이러한 복합 형질과 연계된 분자 마커 유사 기법이 매우 바람직하다.

당대의 식물 육종은 AFLP, RAPD's, SSR's, SNP's 등과 같은 유전자(분자) 마커 기술을 일반적으로 이용하고 있으며, 예로, Lakshmikumaran, T. et al., Molecular markers in improvement of wheat and Brassica. In: Plant Breeding - Mendelian to Molecular approaches. H. Jain and M. Kharkwal (eds.) Copyright 2004 Narosa Publishing House, New Delhi, India, page 229-255를 참조한다.

분자 마커는 형질이 발현되지 않는 동안에, 심지어 발생 단계에서도 특정 형질의 존재를 나타내는, 진단 도구로서 매우 적합하다. 게다가, 분자 마커는 환경 조건에 둔감하다.

예로, 페퍼 과실이 익었을때 색에 관여하는 유전자와 유전적으로 연계되어 있는, (예컨대 SDP = 단일 뉴클레오티드 다형성 형태의 또는 아가로스 또는 폴리아크릴아미드 겔에서의 DNA 밴드와 관련있는) 분자 마커를 발견할 수 있다. 묘목으로부터 취한 DNA 샘플을 사용하여 식물의 과실이 결국 어떤 색을 띄게 될 것인지를 결정할 수 있다. 그래서, 이러한 경우, "지명된(called)" 특정 DNA 서열의 존재와 특정 형질의 존재는 직접적으로 관련성이 있다.

본질적으로, 동일한 과정은 수많은 다인자유전적 형질도 해당된다(Tanksley S., Mapping polygenes, Annu. Rev. Genet. 1993, 27: 205-233). 후자의 경우, 예컨대 질환 내성, 스트레스에 대한 내성, 비타민 등의 생산일 수 있는 형질은, 하나의 유전자 자리 보다 많은 수의 유전자 자리에 의해 통제될 수 있다. 개개 모든 유전자 자리의 기여 및 이와 관련된 DNA 마커는 측정할 수 있으며, 여러가지 유전자 자리 및 이들의 해당 DNA 마커 전체가 특정 형질의 존재를 (어느 정도) 표현형으로 나타날 것으로 추측된다. 이러한 개념은 양적 유전 형질을 설명하기 위해, 멘델 유전학을 친족간에 상관 관계에 대한 초기 통계적인 방법과 연계시킨, R. A. Fisher의 고전적인 연구로 거슬러 올라간다(The correlations between relatives on the supposition of Mendelian inheritance, Trans. R. Soc. Edinb. (1918) 52, 399-433).

재조합에 의한 진핵색물의 염색체 맵핑은 당업계에 잘 알려져 있다(Griffiths AJF et al., (2005) Eukaryote chromosome mapping by recombination, In: Introduction to Genetic Analysis, 8th edition. W. H. Freeman and Company, New York p 115-137).

분리 형질(segregating trait)의 맵핑, 즉 QTL-맵핑(QTL = Quantitative Trait Locus)은 기술적인 문제 또는 재조합에만 전적으로 의존하지 않으며, 표현형의, 질적 또는 양적인 정확한 관찰 또는 스코링(scoring)도 동등하게 중요하다. 이러한 측면에서, 복합 형질 또는 결과를 맵핑할때, 당업자는 복배수체 계통(DH) 집단이나 재조합 근친 교배 계통(RIL) 집단을 선호적으로 이용하는데, 이들은 원하는 형질(들)이 분리되며 하나의 F1 식물로부터 유래된 것이다. DH 계통은 식물 재생과 염색체 배가에 의해, 단배체 F1 식물 생식체(gamete)로부터 직접적으로 파생된다. RIL은 즉 수대에 걸친 근교배를 통하여 단주계통법(single seed descent, SSD)에 의해 파생된 고수준의 근교배 계통이며, 각 개별 식물은 F2에서 시작하여 다음 세대를 위해 하나의 종자를 제공한다.

대안적으로, 이른바 근동질 유전자 계통(Near Isogenic Line)(NIL)을 사용한다. NIL은 소형 DNA 단편이 상이한 동형접합체 계통이다. 이는 보통 역교배로부터 파생되지만, 또한 분리성 RIL로부터 수득할 수도 있다(Tuinstra et al., (1997) Theor. Appl . Genet. 95: 1005-1011).

DH 계통, RIL 및 NIL은 당대 유전학 및 유전자 맵핑에 크게 기여하였다. 실제 이러한 순계의 장점은, 계통간의 표현형 변이(계통 상호간 변이)는 고전적인 F2 맵핑 집단에 있어 개개 식물 수준으로의 분리에 비하여 용이하게 기록된다는 점에 있다. 순계의 이용성은, 또한 환경적인 영향이 유전학적으로 동일한 순계 식물 복 제에 의해 밝혀짐에 따라, 점점 중요해지고 있다. 이는, 유전자와 환경간의 상호작용의 결과인, 단일한 비-복제성 개별 F2- 식물의 표현형과는 대조적이다.

계통들 간의 잡종 강세 또는 조합 능력과 같은 복잡한 작용에 대한 해명은 당대 유전학 및 식물 육종에 있어 가장 큰 과제중 하나이다. 잡종 강세의 경우, 여러가지 가설이 설정되어 있다(Birchler J et al. (2003) The plant Cell 15, 2236-2239). 이른바 잡종 강세에 대한 역사적인 해명은 "초우성(overdominance)" 및 우성이다. 초우성은, 이형접합체 클래스에서 2 종의 동형접합체 클래스 보다 적응성이 높도록, 대립유전자 상호작용이 잡종에서 이루어진다는 이론이다. 우성은 한쪽 모체의 차선의 열성 대립유전자가 다른 모체의 우성 대립 유전자에 의해 보완되는 상태를 의미한다. 우성으로 설명되는 잡종 강세 작용은 동형접합체 상태에서 원칙적으로 고정될 수 있지만, 초우성으로 설명되는 작용은 명백하게 불가능하다. 최근에는, 잡종 강세에 대한 2가지 경쟁적인 단일-유전자 자리 설명으로는 불충분하며, 또한 상위 효과, 즉 유전자 자리간의 상호 작용이 잡종 강세의 유전적 기반으로서 주된 역할을 한다는 것이 명확해졌다(Yu SB et al. (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 9226-9231).

전술한 바와 같이, 재조합 근교계 집단(RIL) 및 복배수체(DH) 집단과 같은 동형접합체 개체를 이용한 전통적인 집단 구조 맵핑은, 특정 유전자 자리에서 이형접합체 상태의 특이적인 효과를 맵핑하는데는 쉽게 적용할 수 없다. 이러한 단점은, 이들 집단을 테스터와 교배하여 후대 잡종의 표현형을 분석함으로써 극복한다. 그러나, 이러한 방법에는 3가지 문제점이 있다. 먼저, 추가적인 노동력, 공간 및 시간이 요구된다. 또한, 한가지 이상의 추가적인 테스터를 사용하지 않는 한, 유전자 자리의 이형접합체는 2가지의 가능한 동형접합체 상태 중 단지 하나와 비교된다. 마지막으로, 이형접합성 유전자 자리와 유전적 백그라운드 사이의 상호작용, 즉 이형접합성으로 인한 특이적인 결과와 유전자 상호작용을 완전하게 분석할 수 없다. Charcosset et al. (1994) and Rebal et al. (1994) (both in: Biometrics in plant breeding: applications of molecular markers; Eds: Ooijen J. and Jansen J. CPRO-DLO, Wageningen, The Netherlands)이 제안한, 이면 교배(diallel mating) 집단의 사용으로 상기 두번째 및 세번째 문제점은 해결되지만, 노동력 및 공간이 더 필요하다.

F2 집단 및 역교배 집단에 적용하여, 특정 유전자 자리에서의 이형접합체 상태의 특이적인 결과 맵핑을 조사할 수 있다. 그러나, 집단의 크기로 제한되는 통계 모델에서 이용가능한 파라미터 스페이스로 인해, F2를 이용한 QTL 분석에는 제한된 유전자 상호작용만 허용된다. 역교배 집단을 제조하는데 더 많은 시간과 노동력이 소요되며, 특정 유전자 자리에서의 이형접합체 상태로 인한 결과로 단지 반복친(recurrent parent)의 유전적 백그라운드를 추정할 뿐이며 다른 유전자 자리와의 상호작용 가능성은 고려하지 않는다.

집단 맵핑을 개발하기 위한 대규모의 시간, 공간 및 노동력 투입을 방지하기 위한 다른 방법은, 연관비평형 맵핑(linkage disequilibrium mapping)(LD-mapping; Kraakman ATW et al. (2004) Genetics 168, 435-446; Kraft T et al. (2000) Theor. Appl. Genet. 101, 323-326)이다. 이 방법은 기존의 이용가능한 유전적 재 료, 예컨대 변형(varieties) 및 유전자은행 등록(genebank accession)을 이용한다. 이러한 재료가 충분히 이형접합성의, 예컨대 잡종 품종(hybrid variety) 맵핑 세트인 경우, 이형접합성 유전자 자리의 특이적인 작용은 추정할 수 있다. 그러나, 대개 LD 맵핑 방법은 상위 효과를 고려하지 않으며, 상위 효과에 의해 초래되는 통계적 노이즈 범위내에서 부가적으로 작동하는(working) QTL을 검출하기 위해서는 많은 수의 등재물(accession)을 필요로하는데, 그 이유는 모든 등재물의 유전적 백그라운드가 다르기 때문이다(Flint-Garcia SA et al. (2003) Annu. Rev. Plant Biol. 54, 357-374).

2 곳 이상의 유전자 자리의 대립유전자 구성의 조합에 의존적인 형질은, 동정 또는 맵핑하기 매우 어렵다. 집단 유전학에서, 이러한 여러개의 유전자 자리간의 상호작용을 '상위(epistasis)'라고 한다. 이러한 경우, 다른, 또는 3번째 또는 4번째 등의 유전자 자리의 임의 대립유전자 기여에서, 하나의 유전자 자리의 기여만 측정가능하다.

간단한 이론적인 예로, 특정 유전자(유전자 자리 1)로 코딩되는 동형이량체 효소는, 이량체가 일부 상이한 경우(유전자 자리 1이지만, 이형접합체에서 대립 유전자 2개)에 촉매 작용에 보다 유효할 수 있어, 예컨대 보다 유효한 촉매부 형성을 생각해 볼 수 있다. 이 경우, AA'는 AA 또는 A'A'에 비하여 촉매 작용에 더욱 우수하다. 또한, (유전자 조성이 어떠하던간에) 생합성 경로에서, "A" 유전자에 의해 코딩되는 효소는 케스케이드에서 특정 효소의 상류 또는 하류에 있는 다른 효소의 촉매 작용에 의존적일 수 있다. 효소 "A"가 보다 유효하게 되는 경우에, "A" 코팅 효소에 "제공되는(feed)" 기질에 대한 제한이 없다면 이러한 유효성 증가는 사실상 달성될 수 있는 것으로 쉽게 이해할 수 있다. A 효소에 사용되는 기질이 동일한 규칙에 의해 다른 효소(B)(대립유전자 2개에 의해 향상된 동형이량체 효소)에 의해 제공되는 경우, 향상은 조합에 의해서만 수득된다. 상기 경우에서, AA'/BB'는 AA/BB' 또는 AA'/BB, 및 이형접합체 상태 2가지 모두가 없는 그외 모든 경우 보다 우수하다.

한편, 경로의 산물이 A가 조절되는 단계에 의해 더이상 제한되진 않지만 A의 하류 효소가 제한 단계를 구성한다면, 여러가지 A 대립 유전자의 작용은 측정되지 않아, A의 하류 효소에 관여하는 유전자 자리가 A에 상위이다.

이형접합체 개체가 동형접합체 개체에 비해 우수한 것으로 널리 공지된 예로는, 겸상적혈구 빈혈(sickle-cell anaemia)이 있다. 동형접합체 개체에 매우 유해한 대립 유전자의 지속성에 대한 연구로, 상기 대립유전자가 이형접합체 개체에서 치사형 말라리아에 대해 낮지만 유의한 내성을 부여한다는 사실을 수득하였다. 자연 선택으로, 동형접합체 조건의 유해 효과가 이형접합체 조건에 의해 제공되는 말라리아 내성으로 상쇄되는 대립유전자 집단이 형성되었다.

우수한 이형접합성(heterozygosity) 및 상위가 동시에 존재할 수 있으며, 동형이량체에 대해 언급된 효과 역시 이형다량체에 유효할 수 있다는 것은 자명하다.

결론적으로, 이는, 개개 유전자 자리의 적어도 일부 기여가 비-부가적이고 한 곳 이상의 다른 유전자 자리의 대립 유전자 상태와 상호작용하기 때문에, 그 자체에 대한 하나의 특정 유전자 자리의 기여는 쉽게 측정 또는 가시화할 수 없음을 의미한다. 그러므로, 상위 형질의 QTL 맵핑은 통상적으로 유전자 자리간의 상가성(additivity)을 추측하는 전통적인 방법에 의해서는 쉽게 수행할 수 없다. 이러한 방법에 유전자 자리간의 상호작용을 병합하는 경우, 이러한 목적으로 사용되는 유전자 모델의 현저한 매개변수화(high parametrisation)로 인해, 통계적인 파라미터 평가에 있어 문제가 되며, QTL 검정 능력(power)은 낮다.

이러한 문제점을 해결하기 위해 시도되는 다른 방법으로는, 이면 교배 집단에 적용되는 QTL x 유전자 백그라운드 맵핑(Charcosset A et al. (1994) pp 75-84 and Rebal A et al. (1994) pp 170-177, both in: Biometrics in plant breeding: applications of molecular markers; Eds: Ooijen J and Jansen J. CPRO-DLO, Wageningen, The Netherlands) 및 다중성 근친계 교배에 적용되는 QTL x 집단-맵핑(Jannink J-L & Jansen R (2001) Genetics 157: 445-454)이 있다. 이러한 방법은 또한 다른 집단 구조에 적용될 수 있다는 것을 의미한다.

'다중적인 여타조건 일정 불변(multiple ceteris paribus)'으로 인해, 즉 패밀리가 각각에서 오직 하나의 QTL이 다른 QTL에 대한 특이적인 동형접합체성 백그라운드로 분리되는, 가능한 많은 하위-집단을 포함하기 때문에, 상위 상호작용을 검출하기 위한 목적에 흥미로운 집단 구조는 이종 근친 교배 패밀리이다(Heterogeneous Inbred Family, HIF)이다(Haley S et al., (1994) Theor. Appl. Genet. 88, 337-342; Tuinstra M et al., (1997) Theor. Appl. Genet. 95: 1005-1011).

HIF 집단 구축은 매우 지루한 일이다. 하나의 종자 세습에는 여러 세대가 소요되는데, 이는 느리며 노동력이 요구됨을 의미하다. HIF 집단이 완료될때까지, 선택 집단 모체는 더이상 갱신되지 않을 수 있다. 세대 시간(generation time)을 단축시키기 위한 시설(facility) 또는 다른 장소(alternative location)에 대한 막대한 투자가 요구된다. 또한, 단지 2개의 모체의 QTL 대립 유전자가 분석되는 점을 고려하면, 상업적으로 육종할 목적으로 이러한 집단에 투자할 가치는 없다.

상위 존재하에서 QTL을 맵핑하는 보다 실용적인 방식은 미국 출원번호 제 2005/0015827호에 기재되어 있다. 진행중인 육종 프로그램에서 그러한 것처럼 주어진 백그라운드에서 QTL의 포지션 및 작용은 주기적으로 모니터링된다. 특이적인 집단 구조는 연관 비평형 맵핑(하기 참조)에서처럼 적용되지 않으며, QTL의 위치 변화 및 작용 변화는 어쩔수 없는 것으로 받아들여진다. 이러한 방법의 주된 문제점은, 분석되어야 하는 등록물의 수가 너무 많으며, 특이적인 상위 효과를 확립하기 위한 분석력이 부족하다는 것이다. 다시 말해, 유전적 백그라운드에서 특정 유전자 자리가 변이성 QTL과 상호작용한다는 것은 분석되지 않는다.

QTL 분석에서 상위 효과를 방지하는 보다 근본적인 방법은, 역교배 집단을 이용하는 것이다. 이러한 방식으로, QTL 작용으로 다소 일정한 유전적 백그라운드, 즉 반복친에서 분석할 수 있다. 대부분의 역교배 집단 타입(예, 역교배 근친계 또는 BIL's)은 보다 일정한 유전적 백그라운드를 창출하고, 일부 경우에는, 유전자 자리의 3가지 대립유전자 상태들 중 하나를 배제하기 위하여, 하나 이상의 역교대 세대가 포함된 일정한 맵핑 집단 타입의 유사체로서 관찰될 수 있다.

전술한 측면에서, 본 발명의 목적은 상술한 문제점이 없는 유기체 특히 식물에서 형질을 맵핑하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 특정 유형의 비정상적인 감수분열로부터 파생된 생식체를 이용하고 상기 생식체로부터 재생시킨 유기체 후대의 표현형을 확인함으로써, 복합 형질을 코딩하는 유전자 자리를 쉽게 맵핑할 수 있다는 사실을 기반으로 한다.

본 발명의 방법, 이하 "후향 후대 맵핑" 또는 "RPM"은 비정상적인 감수분열의 제2 분열, 이른바 이차 분열 복원(Second Division Restitution) 또는 SDR로 인해 형성된 세포 특히 특정 포자의 이용을 토대로하며, 제조되는 포자는 (모체 식물 역시 이배체인 경우에) 단배체인 정상 포자와는 반대로 이배체이다. 이러한 포자는 SDR-0 포자라고 하며, 이로부터 재생된 식물은 SDR-0 식물이다.

제2 분열 복원은 광범위한 유형의 비감수분열 포자/생식체 중 단지 하나의 사례에 불과하다. Veilleux R, ((1985) Plant Breeding Reviews 3, 253-288)는 비감수분열 생식체에 의해 형성되는 메카니즘을 설명하고, 농작물에서 비감수분열 생식체 출현 리스트를 제공한다. 당시에, 비감수분열 생식체의 주된 2개의 상이한 유형, 즉 제2 분열 복원(SDR) 및 제1 분열 복원(FDR)이 인지되었다. 최근에는, 비감수분열 생식체의 3번째 유형으로 무한 감수분열 복원(Indeterminate Meiotic Restitution, IMR)이 공개되었다(Lim K et al. (2001) Theor. Appl. Genet. 103:219-230). 본 발명은 단지 SDR과 관련있다. 다른 공개문헌에서는, SDR이 자연스럽고 일반적인 현상인 것으로 나타나 있다(Lim K et al. (2004) Breeding Science 54: 13-18).

감수분열 I 도중에 발생되는 교차로 인해, SDR-0 포자의 염색체는 이형접합성인 세그먼트를 가질 수 있다. 본 발명에서, 이형접합성은 잡종 출발 식물 유전자의 대립 유전자가 다형임을 의미하며, 동형접합성은 유전자의 대립 유전자가 동일하다는 것을 의미한다.

SDR을 통해 제조된 포자를 재생시키면, 이배체 식물은 정상적인 감수분열 및 자식(selfing)(F2 세대)을 통해 수득되는 식물에 비해, 평균적으로 이형접합성이 감소된 이배체 식물이 수득된다. 평균적으로 SDR 결과물은 60%의 상동성(100% 이형접합체 잡종 식물에서 출발)을 포함하지만, FDR 결과물은 20%인 것으로 추정된다. 실제 수준은 센트로미어의 수와 상대적인 위치, 그리고 특이적인 SDR이 이루어지는 동안에 발생되는 교차 수 및 상대적인 위치에 의존적이다.

SDR-0 식물에서 이형접합체 세그먼트에 위치된 유전자 자리만 분리할 수 있다. 다음 세대, 즉 SDR-1에서 분리가 이루어진다. SDR-1에서 특이적인 표현형을 형성하게될 유전자형은, SDR-0 세대의 유전자형과 다를 것이다. 그러나, SDR-1 세대에서 표현형 분리는 단지 SDR-0 식물이 어느 정도 이형접합성일때만 발생할 수 있다. 이는, SDR-1 세대에서 표현형 분리를 초래하는 유전자 자리의 위치를 파악하기 위해 유전자 자리가 이형접합체인 SDR-0 세대에서 충분히 결정할 수 있음을 의미한다. 개개 SDR-0 식물에서 교차 구분점(breakpoint)의 동정 및 위치 측정을 예측하고, 따라서 SDR-1 후대에서 특정 표현형 형질의 분리에 관여하는 유전자 자리의 위치를 맵핑한다.

따라서, 본 발명은 유기체, 특히 식물에서 형질을 맵핑하는 방법에 관한 것으로, 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:

a) 제2 분열 복원으로 발생되는 비감수분열 세포, 특히 비감수분열 포자 집단의 일원으로부터 발생되는, 특히 식물에서 SDR-O 유기체의 집단을 제공하는 단계;

b) 상기 SDR-0 유기체 각각으로부터 SDR-1 후대 개체를 제조하는 단계;

c) 상기 SDR-1 후대 집단의 표현형을 확인하여, 각 SDR-1 후대 집단에서 분리 형질(segregating trait)을 동정하는 단계;

d) 분리 후대가 SDR-1 후대 개체에 존재하는 경우, 해당 SDR-0 유기체의 유전자형을 확인하고, 그 유전자형을 다른 SDR-0 유기체의 유전자형과 비교하여, 상기 SDR-1 후대 개체에서 동정되는 상기 분리 형질의 출현과 연관된 이형접합성 염색체 영역을 동정하는 단계.

특정 예로, 각각이 SDR-0 집단 식물로부터 발생되는 비감수분열 세포의 집단은 세포, 특히 포자의 집단을 크기, 무게나 DNA 함량에 따라 분류하고, 크기, 무게 또는 DNA 함량이 증가된 세포, 특히 포자를 선택함으로써, 비감수분열 세포, 특히 비감수분열 포자 집단의 일원으로서, 수득된다. 세포, 특히 포자는 유세포기, 원심분리, 미세조작기 조작 또는 그외 임의 분류 수단에 의해 분류할 수 있다.

SDR-1 후대 집단의 표현형 확인은 당업계에 공지된 모든 방식으로 수행할 수 있으며, 육안 관찰 또는 이온, 전사체, 단백질, 대사산물 또는 이들의 조합의 함량 및/또는 조성 분석에 의해, 각 SDR-1 유기체에서 특히 행해질 수 있다. 이온, 전사체, 단백질, 대사산물의 함량 및/또는 조성 분석은, 예컨대 이오노믹스(ionomics), 전사체학(transcriptomics), 프로테오믹스, 대사체학(metabolomics) 또는 이들의 조합과 같은 기술로 수행된다.

SDR-1 후대 개체의 표현형을 확인한 후, 분리되는 SDR-1 후대 집단을 발생시키는 SDR-0 유기체의 유전자형을 확인한다. 유전자형 확인은 당업자에게 공지된 모든 방법에 의해 수행될 수 있다. 바람직한 예로, SDR-0 유기체의 유전자형 확인은 핵산 다형성을 확인하는 방법에 의해 수행된다. 이러한 다형성을 확인하는 다수의 기법들로, 예컨대 AFLP, RFLP, SNP, SFP, SSR, RAPD가 알려져 있다. 상기 분자 마커 기술 리스트는 예에 불과하며, 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하는 것은 아니다.

이롭게는, SDR-1 후대 집단의 제조는 다양한 조건, 특히 다양한 환경 조건하에서 수행된다. 상기 다양한 환경 조건은 실험실 조건 및 실외 조건으로부터 선택된다. 이들 2가지 조건은 날씨 조건에 따라 달라질 수 있다. 이러한 방식으로, 특정 조건하에서만 표현형으로 나타나는 형질을 탐색 및 맵핑하는 것이 가능하다.

다른 예로, 여러가지 유전적 백그라운드에서 동일한 형질을 맵핑한다. 이러한 방식으로, 다른 유전적 백그라운드에서 보이지 않는 상호작용성 유전자 자리를 한가지 유전적 백그라운드으로부터 탐색하는 것이 가능하다.

본 발명은, 실제 새로운 출발 집단과 공지된 QTL-맵핑 기술의 조합을 제공한다. 상기 집단에서 이형접합성 수준은 다른 집단에서보다 현저하게 낮기 때문에, 분석하여야 하는 유기체의 수는 기존의 기술에 비해 현저하게 적다. 또한, 본 발명의 가장 기본적인 예로, 맵핑할 형질이 분리되는 SDR-1 후대 집단의 근원인 SDR-0 유기체는, SDR-0 유기체와 비교하여, 그 형질을 분리하지 않는 SDR-1 후대 개체의 유전자형을 확인할 필요가 있다. 이형접합체 염색체 단편에 있는 형질에 관여하는 유전자 자리는, 분리 SDR-1 후대 집단의 SDR-0 유기체에 존재한다.

감수분열 메카니즘은 특히 제1 분열 복원 또는 FDR, 및 제2 분열 복원 또는 SDR이라고 하는 다수의 비정상적인 형태를 포함하여, 매우 자세하게 언급되어 있다. 2가지의 감수분열 형태는 각각 제1 또는 제2 감수분열성 세포 분열의 부재로 인해 이배체 생식체로 형성된다. SDR은 포자/생식체내 2가지 자매염색분체(sister chromatid) 모두의 존재를 유도하며, 따라서 이들은 감수분열 재조합의 결과로서 이형접합인 부위를 제외하고는 유전자 조성이 동일하다(따라서, 이들 역시 SDR-0 포자로 표시되는 식물인 공여체-식물에 이형접합성을 나타냄).

염색체 팔(chromosome arm) 당 하나의 교차에서, 예컨대 교차점에서 텔로미어 쪽의 염색체 말단부는 이형접합체일 것이나, 센트로미어를 포함한 교차점에 가까운 염색체 부위는 동형접합체일 것이다.

감수분열 I 중에 독립적인 염색체 재분류(chromosome reassortment)로 인해, SDR 염색체의 동형접합체 부위는 모계 또는 부계로부터 유전받은 염색체들중 어느 하나로부터 파생된 유전 정보를 포함하게 되며, 따라서 SDR 집단은 매우 이종적이다. 그럼에도 불구하고, SDR 집단은 이형접합체 RIL 또는 HIF와 부분적으로 유사하고, 양쪽 모체 백그라운드 모두에 이입된 이형접합체 역교배 근친계(BIL)와 부분적으로 유사한 계통을 포함하는 집단으로서 설명될 수 있다.

SDR 포자/생식체의 출현은 본래 잘 알려져 있으며, 여러가지 종들에서 언급되어 있다(Ki-Byung Lim et al. (2004) Breeding Science 54: 13-18; Veilleux R. (1985) Plant Breeding Reviews 3, 253-288; Bastiaanssen H. (1997) Marker assisted elucidation of the origin of 2N-gametes in diploid potato (PhD thesis) ISBN 90-5485-759-5 (This thesis also includes references for many crops)) .

지금까지, 복합 유전자 자리는 당업자에게 공지된 방법에 의해 유전적으로 위치시킬 수 없거나 또는 거의 위치시킬 수 없었다. 본 발명은 분리하는 유전자 자리에 대한 전체 게놈 스크리닝이 가능한 집단을 맵핑하는 전혀 새로운 방법에 관한 것이다. 단일 유전자 형질에 계통 발생적 분류를 적용할 수 있으므로, 유전자 자리(ci)의 타입은 다인자 형질로 한정되진 않는다.

본 발명은 상호의존적인 상호작용 및/또는 상위 상호작용을 가질 수 있는 유전자 자리를 분석하는, 신규하며 매우 단순한 방법을 제공한다. 더욱이, 상기 방법은 단지 2개의 유전자 자리로 한정되지 않으며, 계통간 분리(intra-line segregation)를 측정 또는 관찰할 수 있는 한 상호작용하는 다수 유전자 자리에 적용할 수 있다.

계통간 변이성은 완전히 동종인 계통(예, 복배수체) 사이에서 발생하는 것으로 널리 알려져 있으며, 계통간 변이성은 계통 모체에서 나머지 이형접합성의 분리로 인해, 한정된 수의 표현형 특징이 계통내 개개 식물마다 상이한 상태를 의미한다.

본 발명에 있어서, 제2 감수분열이 생략된 포자로부터 재생되는 식물, 이른바 SDR-0 식물은 다양한 대립 유전자 구성에서 다인자 유전자 자리의 존재 및 잡종 강세와 같은 효과에 의존적인 형질과 같이, 매우 복잡한 형질을 포함한, 형질 맵핑을 위한 고유 물질을 제공하다는 것을 놀랍게도 발견하였다.

SDR 타입의 비감수분열 포자의 동정, 농화(enrichment) 또는 유도, 상기 포자로부터 식물(SDR-0) 재생, 및 SDR-0 식물의 분자 특정화(이형접합성 염색체 세그먼트의 동정)의 조합, SDR-1 세대에서 이러한 어떤 형질이나 작용이 분리된 세그먼트의 상관 관계/조합, 및 여러가지 이형접합성 SDR-0 계통과 이의 분리 패턴간의 비교로, 다인자 유전성이거나 아닌, 상호작용하거나 하지 않는 모든 유전자 자리를 맵핑 및 동정할 수 있다.

개개 SDR-0 식물에서 교차 중지점(crossing-over breakpoint)의 동정 및 위치를 예측하고, 그 결과 SDR-1 후대에서 특정 표현형 형질의 분리에 관여하는 유전자 자리의 위치를 맵핑한다. 또한, 세세한 맵핑은 재생된 SDR-0 식물 수, 유전자 맵의 크기에 의존하여 자동적으로 이루어진다.

도 1은 완전한 이형접합성 잡종의 염색체 쌍의 정상적인 감수분열 발생과, 감수 분열 이후의 자발적인 염색체 배가를 나타낸 것이다("해당 복배수체"). 이 경우, 도식된 교차로 세트당 모체 염색체 2 및 재조합 염색체 2개가 형성된다. 여러가지 염색체 세트로부터 각각 여러가지 동종체의 조합으로, 여러가지 다수의 포자/생식체를 제조할 수 있다. 도 1에는 3가지의 가능성만 나타낸다.

복배수체(DH) 식물은 이러한 "포자"로부터 재생된다. 복배수체 제조는 잘 확립되어 있는 기술이다(Doubled haploid production in crop plants, Ed: M. Maluszynski, K. Kasha, B. Forster and I. Szarejko. Kluwer Academic publishers, Dordrecht/Boston/ London, (2003) ISBN 1-4020-1544-5) .

도 2는 도 1에서와 같이 제2 분열이 발생되지 못한 상황(예, 제2 분열 복원의 경우)에서의, 동일한 이형접합성 잡종의 감수분열을 도시한 것이다. 그러나, 도 1과는 대조적으로, 자발적인 또는 유도성 염색체 배가가 발생된 특정 경우에, 이배체 포자의 출현은 제2 감수분열의 부재에 의해 유발된다. 도 1 및 2에, 염색체 4 쌍이 도시되어 있으며, 동종체는 각각 밝은 및 어두운 막대형 구조로 나타내며, 막대에서 검은 점은 센트로미어이다.

복배수체 식물과 이배체 SDR 식물 사이의 주된 차이점은, SDR 식물에서는 염색체상의 이형접합성 세그먼트에 의해 명확하게 나타나지만, DH 식물은 완전히 동형접합체성이라는 것이다.

이러한 이론적인 사례로, DH를 제조하는 단배체 포자 또는 SDR-0 포자 각각을 제조하는 출발 식물(공여체-식물 잡종 AB)은 완전히 이형접합체인 동종 염색체를 포함한다. 이는, 상기 염색체에 있는 유전자에 대한 모든 대립 유전자가 상이하다는 것을 의미한다. 그러나, 실제, 이는 거의 가능성이 없어, 이러한 경우는 매우 극단적으로 이형접합체인 경우를 예시한 것이다.

도 2에서, SDR 경우에서 동형접합성 유전자 자리 대 이형접합성 유전자 자리의 비 결정은 교차로 인해 동종 염색체의 비-자매 염색분체가 교체되는 수준에서 명백해진다. 각 염색체 팔의 교차 수준 한계는 센트로미어의 위치에 의해 결정된다. 물론, 염색체의 다른 쪽 말단으로부터의 교차 역시 발생할 수 있으며, 이 경우에 센트로미어까지 발생할 수 있다. 염색체 상에 포함된 유전자의 모든 대립 유전자가 다형임을 의미하는, 100% 이형접합성인 식물부터 시작하는 것은, 극단적인 경우이다. 실제, 거의 발생할 가능성은 없으며, 따라서 출발 식물의 이형접합성%은 평균적으로 낮을 것이다.

도 2에서, RIL 및 BIL과 유사한 SDR-식물의 출현을 나타낸다. BIL-유사체에서, 센트로미어는 하나의 동일한 기원의 모체, 즉 A 또는 B(도 1 참조)의 후대이다.

염색체 수가 자발적으로 또는 화합물의 수단에 의해 배가되는 정상적인 감수분열로부터 발생되는 단배체 포자에서 재생되는 식물은, 또한 DH-0로 명명될 것이다. 식물이 제2 감수분열이 없는 감수분열로 생기는 포자로부터 제1 재생물이 시발되는 경우에는 SDR-0이라고 불릴 것이다.

자가-수분된 DH-0 식물은 유전적으로 100% 동일하며 모든 대립 유전자에 완전히 고정된 후대(DH-1)를 발생시킬 것이다. 그래서, DH-0 식물에서 형성되는 포자(생식체)가 다시 감수분열 및 재조합을 겪더라도, 유전자 재배열은 이루어질 수 없다. 이는, 분리가 이루어질 수 없기 때문에 이른바 "순계"가 영속됨을 의미한다.

그러나, 저온, 고온, 또는 예컨대 다른 기후대와 같은 여러가지 조건하에서 생장시켰을때 순계는 표현상 상이한 외양을 보일 수 있다. 관찰될 수 있는 차이점은 환경 변이 때문이며 계통의 모든 "일원"에 유효하다. 바꾸어 말하면, "계통내" 변이는 없을 것이다. 여러 DH-0 식물의 자손인 여러가지 DH-1 계통의 식물들간의 차이점은 유전적인 토대를 가지며, "계통간" 변이로서 지시된다.

SDR 경우에서, SDR-1 세대에서 상이한 이미지가 관찰된다. 도 3A 및 3B는 도 2의 SDR-0 3으로부터 재생되는 식물에서 발생하는 포자/생식체의 형성을 나타낸다. 재조합 및 조합에 의해 하나의 염색체 조합물 발생할 수 있으며, 염색체 수가 증가함에 따라 조합물의 수도 명백하게 증가한다는 것이 도 3B에서 분명해진다. 양쪽 근친 모계 중 하나와 유사한 (부분적으로 이형접합성) BIL을 얻을 확률은 (l/2)^x-1이며, x는 염색체의 수이다. 특이적인(부분적으로 이형접합성) BIL 유사체를 얻을 확률은 (½)^x이다. 표현형으로 관찰가능한 가장 큰 변이는, 출발 물질에서의 이형접합성 정도에 의존적이며, 또한 발생하는 재조합 정도에 의존적이다. 재조합이 전혀 발생되지 않거나 또는 오직 상동접합성 부위에서만 발생되는 가능성 없는 경우, SDR-0는 복배수체(DH-0)의 유전자형 및 표현형 등가체일 것이다.

도 4는 재조합이 발생되는 수준이 상이한 이론상 개별 SDR-0 식물(하나의 염색체에 대해)을 나타낸다. 형질 또는 작용 분리는 SDR-0에 대한 SDR-1 세대에서 보이지만, A 및 B 사례에서는 보이지 않는 경우에는, 결론적으로 분리에 관여하는 염색체 부위는 B 및 C의 교차 위치 사이에 존재한다. 분자 마커의 유효성 및 유효한 SDR-0 식물 수에 따라, 표현형 분리에 관여하는 유전자 자리를 따라서 훨씬 정확하게 맵핑할 수 있으며, 공지된 분자 마커와 조합할 수 있다.

본 발명의 이러한 방법은 본원에서 "후향 후대 맵핑"이라고 한다. 이러한 방법의 고유 특징은 모체 식물의 맵핑 집단으로부터 식물 후대의 후대간 분리 정보를 이용하여 QTL 맵핑을 수행하는 것이다. 전통적인 맵핑에서 흔히 사용되는 후대를 이용하는 방법과는 반대로, 이러한 방법은 후대 변이를 이용하다. 상기 방법은 모체의 대립 유전자와는 관계없이, 특정 염색체 위치에 대해 이형접합성인 개체와 상기 위치에 동형접합성인 개체간의 차이를 이용한다. 전통적인 방법은 2가지 동형접합체 상태 간의 차이를 강조하여 염색체 위치의 모든 3가지 대립 유전자(동형접합체 모체(AA), 이형접합체(AB);동형접합체 모체(BB))들 간의 차이를 이용한다.

다른 예로, 후향 후대 맵핑은 QTL의 검출력을 증가시키기 위해 일정한 계통간 맵핑 방법과 조합할 수 있다.

다른 예로, 개별 SDR-1 식물의 표현형은 3가지의 가능한 대립 유전자 상태가 각 SDR-0 개체에 대해 모델이된, 분석한 염색체 위치에서 이형접합성인, 일반적인 혼합 모델 접근법으로 사용될 수 있다(Jansen RC (1992) Theor. Appl . Genet. 85: 252-260).

대안적으로, SDR-1 계통 변이를 이용하여 예컨대 추가적인 가능비를 계산가능하며, 계통간 맵핑에서, 일정한 가능비(likelihood ratio)로 다층화하여, 개선된 테스트 통계를 수득할 수 있다.

다른 예로, SDR-1 계통에서 분리의 존재 또는 부재에 대한 스코어를 간단하게 이용 가능하다. 이러한 경우에서, 또한 추가적인 가능비를 계산할 수 있다.

또한, 상기 예들은 본 발명의 계통내 및 계통간 분리 이용과 다른 QTL 맵핑 기술을 조합할 다른 가능성을 배제하진 않는다.

후향 후대 맵핑이 최적으로 작용하는 특정 조건이 있다. 바람직한 예로, QTL로 맵핑하여야 하는 형질은 단지 SDR-1 계통의 일부. 바람직하기로는 50 내지 80%로 분리된다. 이는, 특정 다인자유전자 형질에서, 더 많은 수의 QTL이 집단에서 분리되는 경우에 있어, 보다 낮은 수준의 이형접합성이 요구된다는 것을 의미한다. 필요에 따라, 이는 HIF 또는 SDR의 경우에 SDR의 제2 라운드에 의한 추가적인 근친교배에 의해 달성할 수 있으며, 각 SDR-0 개체를 사용하여 새로운 SDR-0 식물을 제조함으로써, 이른바 SDR²-0 집단이 형성된다. 집단 크기는 이형접합체 상태로 여전히 표시되는 전체 게놈을 갖기에 충분히 크도록 주의를 기울여야 한다.

본 발명에 있어서, SDR-0계 후향 후대 맵핑(RPM)에는 표현형 기록 및 개별적으로 이형접합성 유전자 자리의 작용 및 다른 이형접합성 또는 동형접합성 자리와의 상호 작용을 평가하는 가능성에, 복배수체 계통의 이상적인 특징들이 겸비되어 있다.

앞에서 이미 언급한 바와 같이, SDR 계통은 출발 물질이, 이형접합체인 이류로 그리고 이들 이형접합체 세그먼트에서의 재조합으로 인해, 이들이 이형접합성인 염색체 부위가 DH 계통과 상이하다. 이는, 다른 모든 세그먼트에 대해서는 SDR 계통이 DH 계통과 유사함을 의미한다. 이는, 계통내 분리가 오직 한정된 수의 특징이 표현형 수준으로 관찰됨을 의미한다. 그럼에도 불구하고, 특정 유전자 자리의 이형접합성을 필요로하는 표현형 클래스가 기록될 수 있다. 예컨대, 만약 특정 형질을 결정하는 유전자 자리가 SDR-0 세대에서 이형접합체라면, 제2 라운드의 생식체 형성에 있어 재조합 위치에 따라, SDR-1 세대에서 1:2:1(AA:Aa:aa)의 전통적인 멘델 분리를 제공할 수 있다. 만일, Aa 표현형이 AA 및 aa와 다르다면, 이것이 나타날 수 있다.

특정 유전자 자리가 빨리 생장되도록 이형접합체 상태가 되어야 하는 이론적인 경우에, 상기 유전자 자리를 이형접합체 상태로 가지는 SDR-0 식물의 자손인 SDR-1 계통은, 제2 라운드의 재조합이 SDR-0 식물의 재조합 위치를 변화시키지 않는다면, 빠른 생장 대 정상적인 생장의 1:1 분리를 보일 것이다. 이것은 DH-1 계통에서 발생하는 "계통간 변이"와는 반대되는, SDR-0 계통에서 "계통내 변이"의 명확한 적용 예이다.

즉, 이론상 "빠른 생장" 특징의 분리는 SDR-0 세대에서 이형접합체 세그먼트드의 존재에 의해 설명될 수 있다. 그래서, SDR-1 세대에서 표현형으로 무엇이 발생되는지를 설명하고 맵핑하기 위해, SDR-0 세대를 유전적으로 분석하는 것으로도 충분하다.

또한, 본 발명에 따른 방법의 능력은 독립적인 유전자 자리 사이의 상호작용을 조사할 수 있다는 점에 의해 입증된다. 예컨대, 하나의 유전자 자리가 동형접합체 열성(aa)이어야 하고, 반면 다른 2곳의 유전자 자리는 이형접합성이어야 하는 식물은, 원하는 형질을 보일 것으로 생각된다. 이러한 경우, SDR-0 세대가 AA였다면 원하는 형질에 대한 분리는 발생되지 않을 것이다. 그러나, 만약 SDR-0 세대가 aa이라면, 여전히 다른 유전자 자리에 대한 형질이 분리될 수 있을 것이다. 이러한 이른바 상위 효과는 특히 형질이 또한 환경에 의존적이라면 연구하기 어렵다.

DH 집단의 표현형 표시로 인한 이로운 점은 계통내 분리 결핍 및 DH-식물의 이형접합성 부족에 의해 무효화된다. 그러나, F2 집단에서는 원하는 형질 분리가 보이지만, 전체 게놈이 분리되어 상이한 유전적 백그라운드을 갖는 각각의 F2 개체를 제공한다는 점에 의해 분석을 방해할 것이다. 이러한 점이, 상위 QTL 효과를 검출하는 능력을 감소시키는 통계학적으로 커다란 백그라운드 노이즈를 만든다. 이 뿐만 아니라, F2 식물의 표현형을 오직 한번만 확인할 수 있으며, 이에 대규모의 환경적인 에러가 도입된다. 여러가지 조건에서 DH 계통을 복제할 가능성 및 표현형 차이를 여러번 표시할 가능성은, 신뢰성이 있는 QTL 맵핑에 매우 유리하다.

본 발명의 방법에도 똑같이 적용된다. 다른 조건에서 동일한 SDR-1 세대를 테스트할 수 있도록 SDR-0 계통으로부터 충분한 양의 종자가 제조되는 경우, 동형접합체 상태에 기여하는 유전자 자리 뿐만 아니라 이형접합체 상태에서 차이점을 실행하는 유전자 자리가 나타날 수 있다. 부가적으로, 이형접합성이거나 동형접합성인 유전자 자리간의 상위 상호작용과, 또한 질적으로 또는 양적 형질을 코딩하는 단일 유전자의 유전자 자리도 표시 가능하다.

당업계에 널리 공지된 바와 같이, 염색체상의 맵 거리는 센티모르간(cM)으로 표시된다. 100 cM 간격에서, 평균적으로 염색 분체 당 교차 1개가 이루어진다(Van den Berg J et al., (1997) pp. 334-396 in: Plant molecular biology - a laboratory manual, Ed. M. Clark, Springer Verlag, Berlin). 이는, 센트로미어로부터 1 cM에 위치된 형질을 맵핑하고자 하는 경우, 센트로미어로부터 최대 1 cM에 염색 분체 교체를 갖는 50개의 재조합에서 한개이라는 것을 의미한다. 물론, 이는 센트로미어의 양측에 적용된다.

표 1에 QTK 맵핑에서 특정 집단 타입을 이용하는 경우의 장점 및 단점을 개괄하였다. 대부분은 앞서 설명되었으며, 그렇지 않은 것은 표에 언급되어 있다. SDR계 집단을 창출하는 다른 집단과의 비교시 한정된 시간 및 입력치(input)가 필요하며, 매우 우수한 결과가 예상된다는 것이, 표로부터 명확해진다. 이러한 방식에 있어, SDR 방식은 복배수체 집단(DH)의 장점, 즉 한정된 비용으로 집단의 신속한 발생을, 이종의 근친계 패밀리(HIF)의 QTL 맵핑 가능성, 즉 신뢰성있는 표현형 확인, 이형접합성 및 상위 효과를 포함한 강력한 QTL 검정력 및 세심한 맵핑 가능성과 조합한다.

표 1. QTL-맵핑에 있어 수종의 집단을 창출 및 이용하기 위해 필요한 노력(effort) 및 잠재적인 결과. 노력(비용/ 시간 프래임): *: 매우 낮음, **: 낮음정, ***: 평균, ****: 높음, *****: 매우 높음; 결과(이형접합체에 대한 QTL 결과 판단은 제외): --: 매우 나쁨, -: 나쁨, =: 중간(moderate), += 적당(reasonable), ++= 양호, +++= 매우 양호; 결과(이형접합체에 대한 QTL 결과만 판단): -: 불가능, =: 가능, +: 양호. BCx: 역교배를 X회 한 후 역교배 집단; RIL: 재조합 근친계 계통; HIF: 이종의 근친계 패밀리; BIL: 역교배 근친계 계통; DH: 복배수체 계통; SDR: 제2 분열 복원 유래 계통.

집단 타입	노력				결과
집단 타입	집단 제조를 위한 노동력	집단 제조 시간	필수 마커의 갯수(러프 맵핑)	필수 집단 크기(러프 맵핑)	유전자 자리당 QTL-대립유전자 수	표현형의 신뢰성	QTL-검출력	이형접합체에 대한 QTL 결과 평가	세밀한 맵핑(재조합 수 및/또는 나머지 이형접합성)	상위 분석
F2	**	**	*	*	2	--/-^6,8	-	=	-	+
BCx	*/**³	*/**³	/*³	**⁵	2	=	+	+	=	-
RIL	****	****	***	*	2	++⁷	++	-	+	++¹²
HIF	*****	*****	***	*	2	+⁸	++	+	++	+++
BIL1	*****	*****	**	*	2	++⁷	++	+⁹	++⁹	-
DH	***	**	*	*	2	++⁷	++	-	-	++¹²
SDR	***	**	*	*	2	+⁸	++	+	++	+++
랜덤²	*	*	****⁴	***	>=2	++⁷	=	+¹⁰	-/+¹¹	=

1 예로 Jeuken MJW, Lindhout P (2004) : The development of lettuce backcross inbred lines (BILs) for exploitation of the Lactuca saligna (wild lettuce) germplasm; Theor.Appl. Genet. 109(2): 394-401 참조.

2 예로 LD-맵핑에 사용된 육종 계통의 집단, 변이, 유전자은행 등록

3 노력은 역교배 세대수(x)에 따라 증가

4 복수의 대립 유전자의 일배체형 지도 작성에 필요한 마커의 갯수 많음

5 특히 고도의 역교배 새대에서 충분한 게놈 커버(genome coverage)를 위한 필수 갯수 많음

6 F3-계통의 표현형 확인은 F-2 식물의 표현형 확인보다 신뢰성이 높다.

7 무한정 복제 가능

8 계통마다 종자 양에 따라 제한된 복제 가능

9 반복친과의 교배를 통해 가능

10 잡종의 경우만

11 집단에서 연관 비평형 정도에 의존적

12 동형접합성 유전자 자리간의 QTL-상호작용만

Zhang X et al. ((2002) Journal of Horticultural Science & Biotechnology 78(1), 84-88)에서는, 식물을 11 ℃로 48시간 노출시킴으로써 페퍼에서 SDR 2n 생식체(꽃가루)의 빈도가 <1%에서 최대 10.5% (평균)으로 증가할 수 있음을 확인하였다. SDR 최대 출현율은 81.3%로 측정되었다. 이 방법을 본 발명에 따라 사용하여, SDR 발생 수를 증가시키고 따라서 SDR-0 생식체의 수를 증가시킬 수 있다.

자발적인 SDR 출현 또는 환경 스트레스로 인한 SDR 출현 수 증가 유도 뿐만 아니라, 다른 유전학적 방법이 제공되고 있으며, 이들은 감수분열의 제2 세포 분열에 참여하는 유전자 기능을 간섭할 수 있다. 이러한 간섭은 돌연변이 발생 또는 형질전환을 통한 것일 수 있다. 형질전환 방법은 SDR 타입의 이배체 포자를 발생시키는 감수분열 제2 분열을 변형시키는 DNA 단편의 안정적인 또는 일시적인 도입을 목표로 한다. 변형은 감수분열 과정에 참가하는 유전적 인자, 특히 제2 세포 분열에 참가하는 유전적 인자와의 간섭을 통해 발생할 수 있다. 간섭은 전사후 유전자 침묵(PTGS)를 기저로한 특이적인 유전자 발현 하향-조절을 통해 확립될 수 있다. PTGS는 RNA-간섭(RNAi) 또는 바이러스 유도성 유전자 침묵(VIGS)를 통해 이루어질 수 있다. 이러한 기술은 당업계에 잘 알려져 있다.

또다른 방법으로, 간섭은 SDR을 발생시키는 감수분열의 제2 분열에 우세적으로 부정적인 작용을 나타내는, 단백질의 과다 발현을 통해 확립될 수 있다.

그러므로, 본 발명의 제1 예에서, 비감수분열 SDR-0 세포의 집단은 평균 이상의 제2 분열 복원을 보이는 것으로 선택된 유기체에 의해 제조된다. 대안적으로, SDR-0 세포의 집단은 평균 이상의 제2 분열 복원을 보이도록 유전자 변형된 유기체에 의해 제조된다. 유전자 변형은 유전적 요소의 게놈내 안정적인 또는 일시적인 통합에 의한 것이며, 유기체에서 제2 분열 복원 발생 수를 증가시킨다.

또다른 예에서, 비감수분열 SDR-0 세포 집단은 평균 이상의 제2 분열 복원을 보이도록 환경 스트레스를 받은 유기체에 의해 제조된다. 환경 스트레스의 예로는, 온도 스트레스, NO₂, 아산화질소 N₂O, 또는 이들의 조합이 있다.

본 발명은 a) 제2 분열 복원으로 초래되는 비감수분열 세포 집단, 특히 비감수분열 포자 집단의 일원으로부터 발생하는 특히 식물에서 SDR-0 유기체 집단을 제공하는 단계; 및 b) 상기 SDR-0 유기체 각각의 SDR-1 후대 집단을 제조하는 단계를 포함하는 단계에 의해 수득가능한 맵핑 집단의, 종에서 한가지 이상의 형질을 맵핑하기 위한 용도에 관한 것이다.

사용 방법과 무관하게, 타겟 유전자는 분자 수준에서 공지된 것이 필요한다. 열성 돌연변이의 수는 감자(pcpc, osos, fcfc) 및 옥수수(elongate)에서 언급되었으며, 이들은 감수분열의 SDR 타입이다. 이러한 구체적인 예에서 돌연변이된 유전자는 아직 분자 수준에서 파악되진 않았지만, 이들은 아직 클로닝되지 않았음에도 불구하고 분자 억제 기법을 이용하여 타겟 종에서 SDR을 수득하기 위한 우수한 후보물질이다. 본 발명은 후향 후대 맵핑의 일반적인 원리에 관한 것이며, 공여 유기체에서 SDR을 유도하는 모든 가능한 구현예가 언급되지 않았다는 것은 본 발명과 무관하다.

대안적으로, DUET(Venkata Reddy et al. (2003) Development 130, 5975-5987) 및 CYCl; 2(Wang et al. (2004) Plant Physiology 136, 4127-4135)와 같은 유전자가 있으며, 이들은 아라비돕시스 탈리아나에서 언급된 것으로, 돌연변이시 이상한 감수분열을 유도한다. 이들 돌연변이에서 이배체 감수분열 산물은 SDR-유사형이며, 따라서 DUET와 CYCl; 2 뿐만 아니라 다른 식물 종에서의 기능적인 동종물도 SDR 감수분열을 수행하기 위한 타겟 유전자 후보이다.

다른 타겟 유전자 후보는 TETRASPORE/STUD(Yang et al. (2003) Plant J. 34, 229-240)이며, 이는 낫 아웃(knock out)되었을때 감수분열 이후의 세포 분열을 생략시킨다. 사분포자(tetraspore)/stud 돌연변이의 미세포자의 이배체 재생물은 SDR-유사형일 수 있다.

2n 포자 또는 생식체의 출현은 웅성생식체(male gametophyte)에 한정되지 않으며, 또한 자성생식체의 수준에서는 발생되지 않는 것으로 입증되었다. Zagorcheva L (1976)은 오이에서 마크로포자형성(macrosporogenesis) 및 마크로생식체형성(macrogametogenesis)의 변이 발생을 보고하였다((1976) Genetics and Plant Breeding 9(5) pp 386-399).

또한, 단배체 및 복배수체를 EP 0 374 755에 따라 오이에서 제조함으로써, AFLP 분석(EP 0 534 858에 따라 수행)에 의해, 예상된 복배수체들에서 임의 %는 단배체 대포자(megaspore)로부터 기원되지 않고 비감수분열 대포자(2n)로부터 기원된다는 것을 발명자들은 확인하였다. 이는 도 5, 6 및 7에 나타낸다.

도 5는 오이의 전형적인 F2 계통에서의 AFLP 패턴을 나타낸 것이다. 각 가로선은 하나의 개별 식물을 나타낸다. 각 수직 컬럼은 연관군(linkage group)을 나탄낸다. 연회색 구역은 이형접합체 부위이고, 검정 및 어두운 부분은 각 동형접합체 부위이다.

도 6은 오이에서 전형적인 DH 계통의 AFLP 분석을 나타낸 것이다. 각 가로선은 하나의 개별 식물을 나타낸다. 각 수직 컬럼은 연관군(linkage group)을 나탄낸다. 검정 및 어두운 부분은 DH로 추정되는 부분이며, 연회색 구획은 없다.

도 7은 오이에서 전형적인 SDR-0 식물의 AFLP 분석을 나타낸 것이다. 각 가로선은 하나의 개별 식물을 나타낸다. 각 수직 컬럼은 연관군(linkage group)을 나탄낸다. 연회색 구역은 이형접합체 부위이고, 검정 및 어두운 부분은 각 동형접합체 부위이다. 이들 도의 비교를 통해 이들 식물에서 이형접합성이 통상의 F2 보다 훨씬 낮음을 알 수 있다.

따라서, 도는 최초로 추정되는 복배수체(도 7)가 정의에 따르면 진-복배수체에서는 불가능한(도 6) 이형접합성 섹터를 여전히 포함하고 있는 것으로 나타낸다. 비교시, 도 5는 전형적인 F2 집단의 AFLP 분석을 보인다.

출발 물질의 다형성 정도에 따라, 비감수분열 포자/생식체 및 그의 식물은 이형접합성 섹터를 매우 한정된 수로 또는 단지 하나 포함하는 것을 알 수 있다. SDR-1 세대에서의 분리성 형질 및 이형접합성 구획의 위치간에 인과 관계가 있는 경우에, SDR-0 식물에서, 맵핑은 매우 용이하며, 당업자에게 공지된 방법에 의해 이형접합성 구획의 크기를 감소시키기 위하여 세밀한 맵핑을 취할 수 잇다.

SDR 생식체를 수득하기 위해, 여러가지 방법을 사용할 수 있다. 많은 종들의 경우, 웅성 및 자성 측면 모두에서 이배체 생식체를 자발적으로 제조하며, 이는 특정 스트레스 조건에 의해 증강될 수 있다. 재생은 동정생식(androgenesis), 자성생식(gynogenesis) 또는 자가수분에 의한 단위생식(parthenogenesis)을 통해 이루어질 수 있다. 최적화는 이배체 꽃가루를 이용한 수분화 및 후대의 배수성 결정에 의해 수행될 수 있다.

SDR 감수분열모세포가 웅성 감수분열을 통해 제조되는 경우, 유세포기 및 혈광 활성화된 세포 분류를 통해 이배체 세포를 농화시킬 수 있다. 이러한 기술은 그 자체가 당업자들에게 잘 알려져 있으며, 과거에 마이크로포자에 적용되었으나(Deslauriers C et al. (1991) Biochem. Biophys . Acta 1091, 165-172), 이러한 기술은 본 발명의 맵핑 방법에 사용되진 않는다.

비감수분열 포자 또는 꽃가루는 이것의 단배체 피어(haploid peer)보다 더 크다. 놀랍게도, 2n 포자가 n 포자와 물질적으로 다르다는 단순한 사실은, 유세포기를 통한 2n 포자 농화를 가능하게 한다. 도 8은 사배수체 식물(이배체(2n) 포자) 유래 브로콜리 마이크로포자를 이배체 식물(단배체(n) 포자) 유래의 마이크로포자와 혼합한 실험의 결과이다. 보다 큰 포자는 2n이다.

그러므로, 본 발명의 다른 측면은 크기, 무게 또는 DNA 함량에 따라 세포, 특히 포자 또는 생식체의 집단을 분류하여, 비감수분열 세포, 특히 비감수분열 포자 또는 생식체로서 증가된 크기, 무게 또는 DNA 함량을 가지는 세포, 특히 포자 또는 생식체를 선별하는 단계를 포함하는, 세포, 특히 SDR 세포에 있어 포자 또는 생식체, 특히 SDR 포자 또는 생식체의 농화 방법을 제공한다. 특정 예로, 본 발명은 분류기, 특히 FACS에 의해 포자 또는 생식체 집단의 일원을 분류하는 단계를 포함하는, 포자 또는 생식체 집단에 SDR 포자 또는 생식체를 농화하는 방법을 제공한다.

본 발명은 다인자유전자 형질 또는 작용 맵핑, 양적 형질 또는 작용 맵핑, 상호의존적인 유전자 자리 맵핑, 상위 상호작용을 보이는 유전자 자리 맵핑, 잡종 강세, 조합력과 같은 작용 맵핑, 및 단일 유전자 형질 또는 올리고유전자 형질 맵핑에 있어서의, SDR 또는 SDR-유사 비감수분열 생식체로부터 재생된 식물 또는 이들의 후대의, 용도에 관한 것이다.

본 발명은 본원에서 각 식물을 참조하여 설명되지만, 기술은 식물에 한정되지 않으며 진균 또는 동물과 같은 다른 유기체에서 형질을 맵핑하는데에도 사용할 수 있다.

용어 "비감수분열 세포"가 본원에 사용되는 경우, 포자 또는 생식체와 같은 "비감수분열 생식 세포"가 의도된다.

본 발명은 하기에 언급한 어떠한 방식으로도 본 발명을 한정하는 의도가 아닌 실시예를 들어 더욱 설명된다.

도 1은 완전한 이형접합성 잡종의 염색체 쌍의 정상적인 감수분열 발생과, 감수 분열 이후의 자발적인 염색체 배가를 나타낸 것이다.

도 2는 도 1에서와 같이 제2 분열이 발생되지 못한 상황(예, 제2 분열 복원의 경우)에서의, 동일한 이형접합성 잡종의 감수분열을 도시한 것이다.

도 3A 및 3B는 도 2의 SDR-0 3으로부터 재생되는 식물에서 발생하는 포자/생식체의 형성을 나타낸다.

도 4는 재조합이 발생되는 수준이 상이한 이론상 개별 SDR-0 식물(하나의 염색체에 대해)을 나타낸다.

도 5는 오이의 전형적인 F2 계통에서의 AFLP 패턴을 나타낸 것이다.

도 6은 오이에서 전형적인 DH 계통의 AFLP 분석을 나타낸 것이다.

도 7은 오이에서 전형적인 SDR-0 식물의 AFLP 분석을 나타낸 것이다.

도 8은 사배수체 식물(이배체(2n) 포자) 유래 브로콜리 마이크로포자를 이배체 식물(단배체(n) 포자) 유래의 마이크로포자와 혼합한 실험의 결과이다.

도 9는 냉처리한 식물(도 9A) 대 대조군 식물(도 9B)로부터 수득한 꽃가루의 형태를 예시한 것이다.

도 10은 SDR-0 및 DH-0 식물에 대한 AFLP 분석 결과이다.

실시예 1

Elongate1 도입에 의한 옥수수에서 SDR-0 유기체 생산

옥수수 게놈에 핵산 병합은 일반적인 공정이며, 이를 수행하는 방법은 예컨대 EP-801134, US-5,489,520. EP-97114654.3에 언급되어 있으며, 이는 DSM6009 콘 프로토플라스트의 아그로박테리움 형질전환을 개시하고 있다.

Elongate1(Barell, PJ and Grossniklaus, U. (2005) Plant J. 43, 309-320)은 감수분열을 파괴시키고 그로인해 제2 감수 분열 생략을 야기하는 핵산 서열로, 상기 특허 공개공보에 형질전환 방법으로 옥수수에 도입하였다. 따라서, 비정상적인 SDR 타입의 포자가 수득되었다. 형질전환 핵산 서열의 게놈 삽입 부위가 상이하여, SDR 포자의 형성 빈도는 각각의 형질전환체 마다 상이하였다.

SDR 발생으로 인해 제조된 마이크로포자 또는 대포자는 이배체의 염색체 세트를 포함한다. 이들 이배체 마이크로포자 또는 대포자는 SDR-0 재생물 제조를 위한 출발 물질이었다. 옥수수에서 단배체는 마이크로포자로부터 통상적으로 수득하였다: Pescitelli S and Petolino J (1988) Plant Cell Reports 7: 441-444. Coumans M et al., (1989) Plant Cell Reports 7: 618-621. Pescitelli S et al., (1989) Plant Cell Reports 7: 673-676. Buter B (1997) In vitro haploid production in maize. In: In Vitro Haploid Production in Higher plants, vol 4, 37-71. Kluwer Academic Publishers. Eds. S Jain, S Sopory & R Veilleux.

대안적으로, 단배체 유발체(haploid inducer)와 자연적 및 인공적으로 수분한 후, 단배체 옥수수 식물을 수득하였다. 이 경우, Rotarenco V (2002) Maize Genetics Cooperation News Letter 76: 16에 따라 단배체 배아를 포함하는 종자가 수득되었다.

DH 옥수수 식물을 제조하기 위한 상기 프로토콜을 적용하여 SDR-0 세포로부터 SDR-0 옥수수 배아를 제조하였으며, 이의 제조는 Elongate1의 게놈 병합에 의해 유도된다.

SDR-0 카르넬의 내배유 수준에서 부체 및 모체 게놈 사이에 적절한 균형을 구하기 위해, 사배체 화분매개자로서 유발체 계통(inducer line)을 사용하는 것이 바람직하다.

실시예 2

저온 및 아산화질소 가스 처리에 의한 옥수수에서 SDR-0 유기체 제조

SDR 포자의 발생 빈도는 옥수수 식물에 저온 처리 또는 Kato, A and Birchler, JA (2006) J. Hered. 1, 39-44에 언급된 바와 같이 아산화질소 가스 적용에 의해 증가되었다.

저온 또는 아산화질소 처리 결과, SDR-타입의 각각의 다수 마이크로포자, 대포자가 제조되었다. SDR 마이크로포자가 정상적인 단배체 마이크로포자보다 크기가 크다는 사실을 토대로, 유세포기 또는 형광 활성화된 세포 분류를 이용함으로써, 포자 집단내 SDR 마이크로포자의 존재를 농화시켰다. SDR-발생으로 제조된 마이크로포자 또는 대포자는 이배체의 염색체 세트를 포함한다. 이들 이배체 마이크로포자 또는 대포자는 SDR-0 재생물 제조의 출발 물질이다. 옥수수에서 단배체는 실시예 1에서와 같이 마이크로포자로부터 통상적으로 수득하였다.

단배체 옥수수 식물은 또한 이른바 단배체 유발체와의 자연 및 인공 수분한 후 수득하였다. 이 경우, Rotarenco V (2002) (supra)에 따라 단배체 배아가 포함된 종자가 수득되었다.

DH 옥수수 식물을 제조하기 위한 상기 프로토콜을 적용하여, SDR-0 세포로부 터 SDR-0 옥수수 식물을 제조하였고, 이의 형성은 본 실시예에 명시된 처리에 의해 유발된다.

실시예 1에 언급한 바와 같이, 내배유 수준에서 부계 및 모계 게놈을 균형있게 하기 위해 사배체 수분매개체로서 단배체 유발체를 이용하는 것이 바람직하다.

실시예 3

SDR-0 유기체의 동정 및 특정화

실시예 1 및 2의 SDR-0 식물은, 부분적으로 이형접합체이지만 센트로미어 부분은 동형접합체이므로, SDR을 겪지 않은 DH 식물(또는 FDR(제1 분열 복원) 식물)과 구별할 수 있다. 오이의 경우, 실시예 5의 AFLP 분석을 이용한 경우, SDR을 겪지 않은 DH-0 옥수수 식물은 이형접합성 부위가 없는 AFLP 패턴을 보이지만, SDR을 경험한 DH 옥수수 식물은 AFLP 마커 패턴에서 이형접합성 부위를 보일 것이다. 이후, 오이에 대한, 맵 구출 및 통계 분석을 실시예 5와 같이 수행하였다.

실시예 4

옥수수에서 SDR-1 집단 분석 및 형질의 세밀한 맵핑

게놈에 이형접합성 부위를 가지고 있는 SDR-0 식물 각각의 후대를, 일정한 조건하에서 관찰하였고, 분리되는 형질에 따라 분리 후대(segregating progeny)를 분류하였다. 특정 형질에 대한 SDR-1 후대 분리를 유도하는 SDR-0 식물을 서로 비교하고, 그 형질에 대한 분리를 유도하지 않는 계통과 비교하였다. SDR-1 세대에서 분리는, SDR-0 식물 게놈의 이형접합성 구획과 관련있을 수 있다. 이는, 대부분의 플랭킹 마커(flanking marker)와 형질 유전자 자리 사이의 가능한 최대 간격 을 결정하기 위한 고전적인 QTL 분석에 의해 검증하였다. SDR-1 세대의 분리에 관여하는 유전자 자리에 대한 세밀한 맵핑은 Peleman, J et al., (1995) Genetics 171:1341-1352에 따라 수행하였다.

실시예 5

오이 SDR-0 식물에서 맵핑을 위한 이형접합성 구획 제조 및 동정

1. 복배수체 및 SDR-0 식물

2종의 동형접합성(순종) 오이 계통간의 교배로부터 파생된 F1으로부터 복배수체 및 SDR-0 식물을 재생시켰다. 개별 DH 및 SDR-0 식물 모두 AFLP에 의해 유전자형을 분석하였다.

복배수체 및 SDR-0 식물 제조는 EP 0374 755에 따라 수행하였다.

2. AFLP 분석

DH-O 및 SDR-O 식물에 대한 AFLP 분석은 Vos P et al., (1995) Nucleic acids Research 23(21) : 4407-4414에 따라 수행하였다.

데이타를 처리하고 Quantar Pro(Keygene, Wageningen, The Netherlands)로 분석하여, AFLP 마커의 상호우성 스코링(codominant scoring)을 허용하였다.

3. 맵 구축 및 통계 분석

컴퓨터 패키지 JoinMap^® version 2.0 (Stam, P., (1993) Plant J. 3: 739-744)를 이용하여, 유전자 맵을 산출하였다.

4. 분리 특징

분리가 예상되는 하기 성질

Apex 스플리팅(Apex splitting)

잎 크기

생장율

마디당 열매 수

마디간 길이

꽃 크기

열매 크기

열매 색상

5. 결과

도 10은 SDR-0 및 DH-0 식물에 대한 AFLP 분석 결과이다. 개별 계통 모두 단일 DH-0 식물 및 SDR-0 식물 각각을 나타낸다. 각 컬럼은 연관군을 나타낸다. DH 계통과 이형접합성 구획(연회색 부분)을 가지는 계통이 매우 분명하게 분류할 수 있었다. 상기 언급한 형질의 SDR-1 세대에서의 분리는 이형접합성 구획과 관련있다.

6. 세밀한 맵핑

SDR-1 세대에서의 분리에 관여하는 유전자 자리의 세밀한 맵핑은 Peleman J et al., (2005) Genetics 171: 1341-1352에 따라 수행하였다.

실시예 6

피망(Capsicum annuum L.)에서 비감수분열 포자/생식체 형성 강화

비감수분열 포자/생식체의 발생 빈도를 증가시키기 위해, Zhang X et al. (2002, supra)에 언급된 바와 동일하게 냉 스트레스를 유발체로서 적용하였다.

이를 위해, 감수분열전인 화아(floral bud)를 포함하는 23 ℃에서 생장시킨 현화 식물 피망을, 11 ℃에 2일간 노출시켰다. 이런 냉 충격이후에, 꽃봉오리(bud)를 수확하고, 부검 포셉과 외과용 메스를 이용하여 꽃밥을 열어 꽃가루를 추출하였다. 꽃가루는 이후 현미경 유리 슬라이드상에 이동시킨 다음, 아세토-카르민 한 방울을 떨어뜨려 생존성 분석을 위해 염색하였다. 커버 슬라이드를 명-현미경을 이용하여 평가되는 현탁물의 위에 두었다.

대조군으로서, 23 ℃에서 생장시킨 피망으로부터 꽃가루를 채집하였다. 도 9는 냉처리한 식물(도 9A) 대 대조군 식물(도 9B)로부터 수득한 꽃가루의 형태를 예시한 것이다. 알 수 있는 바와 같이, 비감수분열 포자로부터 유래된 것임을 나타내는 크기가 큰 꽃가루의 수가 냉처리한 식물에서 현저하게 증가하였다. 이러한 특정 예에서, 냉 처리로 인한 포자 확대%는 최대 25%에 달하는 것으로 추정되었다. 온도 스트레스에 의한 비감수분열 포자 형성 증가는 실현가능성이 높은 것으로 보인다.

Claims

유기체, 특히 식물의 형질 맵핑(mapping) 방법으로서,

상기 방법은

a) 제2 분열 복원(second division restitution)으로 발생되는 비감수분열 세포(unreduced cell), 특히 비감수분열 포자 집단의 일원으로부터 발생되는, SDR-O 유기체, 특히 식물 집단을 제공하는 단계;

b) 상기 SDR-0 유기체 각각으로부터 SDR-1 후대 집단을 제조하는 단계;

c) 상기 SDR-1 후대 집단의 표현형을 확인하여, 각 SDR-1 후대 집단에서 분리 형질(segregating trait)을 동정하는 단계;

d) 분리 후대가 SDR-1 후대 집단에 존재하는 경우, 해당 SDR-0 유기체의 유전자형을 확인하고, 그 유전자형을 다른 SDR-0 유기체의 유전자형과 비교하여, 상기 SDR-1 후대 집단에서 동정되는 상기 분리 형질의 출현과 연관된 이형접합성 염색체 영역을 동정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 형질 맵핑 방법.
제 1항에 있어서, 상기 SDR-0 집단의 식물을 발생시키는 비감수분열 세포 집단은크기, 무게 또는 DNA 함량을 기준으로 세포, 특히 포자의 집단을 분류(sorting)하고, 비감수분열 세포 집단, 특히 비감수분열 포자 집단의 일원으로서 증가된 크기, 무게 또는 DNA 함량을 갖는 세포, 특히 포자를 선별함으로써 수득되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 2항에 있어서, 상기 세포, 특히 포자는 유세포기(flow cytometer), 원심분리 또는 수동 미세조작기를 이용하여 분류되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 내지 제 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 SDR-1 후대 집단의 표현형 확인은 육안 관찰 또는 각 SDR-1 유기체에서의 이온, 전사체, 단백질, 대사산물 또는 이들의 조합의 함량 및/또는 조성 분석에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 4항에 있어서, 표현형 확인은 페노믹스(phenomics), 이오노믹스(ionomics), 전사체학(transcriptomics), 프로테오믹스, 대사체학(metabolomics) 또는 이들의 조합에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 내지 제 5항중 어느 한항에 있어서, 상기 SDR-0 유기체의 유전자형 확인은 핵산 다형성(polymorphism)을 확인하는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 6항에 있어서, 상기 핵산 다형성을 확인하는 방법은 AFLP, RFLP, SNP, SFP, SSR 및 RAPD 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 내지 제 7항중 어느 한항에 있어서, 상기 SDR-1 후대 집단의 제조는 다양한 환경, 특히 다양한 환경 조건하에서 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 8항에 있어서, 상기 다양한 환경 조건은 실험실 조건 및 실외(field) 조건으로부터 선택되며, 상기 2가지 조건은 기후 조건에 따라 변화되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 있어서, 상기 비감수분열 SDR-0 세포 집단은 평균 이상의 제2 분열 복원을 보이도록 선별된 유기체에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 있어서, 상기 SDR-0 세포 집단은 평균 이상의 제2 분열 복원을 보이도록 유전자 변형된 유기체에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는, 방법.
제 11항에 있어서, 상기 유전자 변형은 일시적인 것을 특징으로 하는, 방법.
제 11항에 있어서, 상기 유전자 변형은 유기체에서 제2 분열 복원 횟수를 증가시키는 유전적 요소의 게놈로의 안정적인 병합(incorporation)에 의한 것을 특징으로 하는, 방법.
제 1항 내지 제 9항중 어느 한항에 있어서, 상기 비감수분열 SDR-0 세포 집단은 평균 이상의 제2 분열 복원을 보이도록 환경 스트레스를 겪은 유기체에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
제 14항에 있어서, 상기 환경 스트레스는 온도 스트레스, NO₂, 아산화질소(N₂O), 또는 이들의 조합으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 방법.
a) 제2 분열 복원으로 초래되는 비감수분열 세포 집단, 특히 비감수분열 포자의 집단의 일원으로부터 발생하는 SDR-0 유기체, 특히 식물 집단을 제공하는 단계; 및

b) 상기 SDR-0 유기체 각각의 SDR-1 후대 집단을 제조하는 단계;

를 포함하는 단계에 의해 수득가능한 맵핑 집단의 용도로서, 종(species)에서 한가지 이상의 형질을 맵핑하기 위한 용도.
크기, 무게 또는 DNA 함량에 따라 세포, 특히 포자 또는 생식체의 집단을 분류하여, 비감수분열 세포, 특히 비감수분열 포자 또는 생식체로서 증가된 크기, 무게 또는 DNA 함량을 가지는 세포, 특히 포자 또는 생식체를 선별하는 단계를 포함하는, 세포, 특히 SDR 세포에 있어 포자 또는 생식체, 특히 SDR 포자 또는 생식체 의 농화(enrichment) 방법.
제 17항에 있어서, 상기 집단의 분류는 형광 활성화된 세포 분류기(fluorescence- activated cell sorter)에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.