KR20070113086A - 에리트로포이에틴을 포함하는 운동신경원질환 치료용조성물 및 치료방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에리트로포이에틴(EPO), 에리트로포이에틴의 활성단편 또는 이의 유사체를 포함하는 운동신경원질환, 특히 근위축성측삭경화증(ALS)를 치료하기 위한 조성물 및 상기 조성물을 이용하여 운동신경원질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 치료 방법에 의하여 운동신경원질환, 특히 근위축성측삭경화증(ALS)을 효과적으로 치료할 수 있다.

에리트로포이에틴(EPO), 운동신경원질환, 근위축성측삭경화증(ALS)

Description

에리트로포이에틴을 포함하는 운동신경원질환 치료용 조성물 및 치료방법 {Methods and compositions for treating motor neuron diseases comprising erythropoietin}

도 1은 동물모델인 근위축성측삭경화증모델 쥐(SOD1 mutant transgenic mice model)에 EPO를 투여한 후의 임상 변화를 나타낸 그림이다(-▲- : EPO 처리군, -■- : 대조군(Con)).

도 2는 동물모델인 근위축성측삭경화증모델 쥐(SOD1 mutant transgenic mice model)에 EPO를 투여한 후의 EPO 농도에 따른 쥐의 생존기간의 변화를 나타낸 그림이다.

도 3은 동물모델인 근위축성측삭경화증모델 쥐(SOD1 mutant transgenic mice model)에 EPO를 투여하였을 때의 COX-2의 발현 정도의 변화를 나타낸 그림이다.

도 4는 rhEPO를 투여할 환자 그룹과 대조군 그룹을 분류하는 과정을 나타낸 그림이다.

도 5는 ALS 환자의 rhEPO 투여에 의한 치료 과정 및 결과 분석의 과정을 나타낸 그림이다.

도 6은 ALS 환자(A 그룹)에 EPO를 주입하기 3개월 전부터 EPO를 주입한 후 3 개월 후의 ALSFRS-r 스코어 변화를 나타낸 그림이다(-■- : A-I 그룹, -▲- : A-II 그룹, -◇- : A 그룹).

도 7은 ALS 환자(A 그룹)에 EPO를 주입하기 전 및 후의 ALSFRS-r 점수 차이를 나타낸 그림이다.

도 8은 ALS 환자의 EPO 투여 후 환자들이 즉각적으로 느끼는 효과들을 나타낸 그림이다(+: positive).

도 9는 ALS 환자의 첫번째 EPO 투여 후 3개월 간의 신경생리학적 인덱스의 변화를 나타낸 그림이다.

본 발명은 에리트로포이에틴(erythropoietin, 이하 'EPO'라 한다), EPO의 활성단편 또는 이의 유사체를 포함하는 운동신경원질환(Motor Neuron Disease; MND), 특히 근위축성 측삭경화증(루게릭 병, amyotrophic lateral sclerosis, ALS)의 치료를 위한 조성물 및 그 방법에 관한 것이다.

운동신경원질환(MND)은 중추신경계의 운동신경원 세포의 소실 및 운동신경경로의 퇴행성변화로 인해 운동신경의 기능에 장애를 초래하는 질환으로서, 다른 신경세포가 손상되는 파킨슨 병, 알쯔하이머병 및 소뇌위축증 등의 신경계 퇴행성 질 환(neurodegenerative diseases)과는 근본적으로 상이한 질환이다. 이러한 MND에는 근위축성측삭경화증(루게릭병 Lou Gehrig's disease) 이외에도 상부운동신경원만을 침범하는 원발성 측삭경화증(Primary Lateral Sclerosis, PLS), 하부 운동신경원을 침범하는 진행성근위축증(progressive muscular atrophy, PMA), 뇌간의 하부운동신경원을 침범하는 진행성연수마비 (progressive bulbar palsy, PBP) 등으로 구분된다.

근위축성측삭경화증(루게릭병, amyotrophic lateral sclerosis, ALS)은 운동신경원질환(motor neuron disease, motoneuron disease, MND) 중의 하나로 병리기전은 명확하게 밝혀져 있지 않지만, 운동신경계만을 선택적으로 침범하는 신경계 질환이다. ALS는 병리적으로는 대뇌운동피질의 추체세포 (giant Betz cell), 척수전각세포(anterior spinal motor neuron), 뇌간 운동신경원 세포(brainstem motor neuron)의 소실과 추체로의 변성을 초래하며, 임상적으로는 상위운동원(upper motor neuron, UMN) 및 하위운동원(lower moter neuron, LMN) 징후를 동시에 보이며, 발병 후에는 급속한 임상경과를 보여 수 년 내에 사망하는 질환이다. 현재까지의 자료에 의하면 국내 발병율과 유병율은 명확히 밝혀져 있지 않지만 1300명 정도 연구가 진행 중에 있고, 외국의 경우에 인구 10만 명당 1 내지 2명의 발병율과 4 내지 6명의 유병율을 보이며 여성보다는 남성에서 발병률이 높고, 50세 이상의 비교적 고령의 성인들에게서 나타난다. 또 루게릭 병의 약 10%는 가족 내 일정한 유전성을 보이지만, 대부분에서는 산발성으로 발병된다. ALS의 발병원인은 다른 여러 퇴행성 신경계 병변에서와 마찬가지로 아직 명확히 밝혀져 있지 않지만 직업과 관련된 통계적인 수치에서, 육체적인 외상, 중금속에 대한 노출, 과도한 산화성 손상 등에 의해 발병할 확률이 더 높은 것으로 추정되고 있다.

상기의 ALS를 치료하기 위한 방법으로 미국식약청에서 승인받아 상품화되어 안전성이 입증된 것은 글루탐산염(glutamate)에 대해 길항작용을 하는 리루졸(riluzole) 한가지 밖에 없으나, 그 약효도 미미한 상태로 현재 급격히 진행되는 임상증상을 호전시킬 수 있는 뚜렷한 치료법이 없는 상태이다.

한편, EPO는 적혈구세포의 생산과 관련된 당단백질로서, 뇌신경세포 및 신경조직에서 다량으로 발현된다는 연구가 발표되었다(마르티(Marti) 등의 문헌[Kidney Int.,51:416-418, 1997] 및 모리시타(Morishita) 등의 문헌[Neuroscience,76:105-116, 1997] 참조). 또한 EPO는 다른 사이토카인 및 호르몬과 함께 또는 단독으로 허혈성 병변 및 알쯔하이머, 파킨슨씨 병, 헌팅턴 질병과 같은 신경질환 관련의 동물 모델 및 신경세포에서 세포의 생존을 증가시키거나 신경을 보호하는 효과가 있으며(미국특허 공개번호 US20060063705, 미국특허 공개번호 US20050197284, 미국특허 공개번호 US2004025907, 미국특허 공개번호 US20040018978), 저산소증 및 기타 대사성 스트레스 인자들에 의해 발현 및 방출이 증가된다는 여러 보고가 있었다(마르티 등의 문헌[Eur. J. eurosci.,8:666-676, 1996], 마스다 등의 문헌[J. Biol.Chem.,268:11208-11216, 1993] 및 마스다 등의 문헌[J. Biol. Chem.,269:19488-19493, 1994] 참조). 또한 국제공개특허 WO 00/61164는 포유동물에 EPO의 수용체 활성 조절자의 주입으로 흥분성 조직, 즉 중추신경계, 심장, 망막의 기능을 보호 또는 증가시키는 방법에 관하여 개시하고 있다.

상기한 바와 같이, EPO를 이용한 신경세포 관련 질환을 치료하는 방법 등에 관하여 다양한 문헌 및 기술이 공지되어 있다. 그러나, 이는 동물 실험에 국한되어 있고, 그 결과가 실제 인간에게 적용하는 경우 등의 구체적인 임상 결과가 미흡하고 그 안정성 또한 검증되지 않은 문제가 있다.

이에 본 발명자들은 운동신경원질환, 특히 ALS의 새로운 치료법에 관하여 연구하던 중 ALS 질환 동물모델 및 환자에게 EPO를 투여하였을 때, 질환동물모델 및 근위축성측삭경화증 환자의 임상경과를 완화시켜 유의한 치료효과가 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 하나의 목적은 EPO, EPO의 활성단편 또는 이의 유사체를 포함하는 운동신경원질환, 특히 ALS를 치료하기 위한 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 조성물을 이용하여 운동신경원질환, 특히 ALS를 치료하기 위한 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 EPO, EPO 활성단편 또는 이의 유사체를 포함하는 운동신경원질환, 특히 ALS를 치료하기 위한 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 사용된 용어, "EPO"는 개체 내에서 EPO 수용체에 결합하여 EPO 수용체를 발현 및 활성화시키고, 이로부터 매개되어 운동신경원질환을 치료 및/또는 예방하는 물질을 말한다. 일반적으로, EPO는 주로 성인의 신장 또는 태아의 간에서 생산되며, 산소를 운반하여 적혈구의 형성을 조절할 뿐만 아니라 적혈구 세포의 생산을 제어하는 에리트로포이어시스(erythropoiesis)와 관련된 기능이 있으며, 저산소증과 관련하여 뇌에서 생산되는 유도성 사이토카인(cytokine)으로 알려져 있다. 본 발명의 바람직한 양태에서는, EPO는 에리트로포이어시스와 관련된 기능뿐만 아니라 운동신경원질환의 치료 및 예방을 위하여 주로 활동하는 비적혈구 생성성을 가진다. 본 발명에 있어 유용한 EPO 형태는 천연적으로 생성되거나 합성되거나 재조합 형태인 에리트로포이에틴(EPO), 에리트로포이에틴 유사체, 에리트로포이에틴 유사물, 에리트로포이에틴 단편, 혼성 에리트로포이에틴 분자, 에리트로포이에틴 수용체-결합 분자, 혈액 세포 생산을 조절하기 위하여 신체 내에서 생산되는 당단백질 호르몬 등이며, 본 명세서에서는 편의상 "EPO"는 상기 유용한 EPO 형태를 모두 포함하여 지칭하는 용어로 사용될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "EPO 활성단편(fragment)"은 EPO에 의한 생리학적 인 기능을 수행하는 최소한의 단편을 포함하는 폴리펩타이드를 말한다. 본 발명의 EPO 활성단편은 EPO 수용체에 결합하여 EPO 수용체(receptor)를 발현 및 활성화시키고, 이로부터 매개되어 운동신경원질환을 예방 및/또는 치료할 수 있다. 이들 EPO 활성단편은 인간의 천연형(native) EPO 보다 더 높은 EPO 수용체에 대한 결합력을 가질 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "EPO 유사체(analogue)"는 EPO 또는 EPO 활성단편을 코딩하는 아미노산 서열에서 1개 이상의 변화를 가지면서 EPO수용체를 통해 매개되는 다양한 생리적 기능을 수행할 수 있는 폴리펩타이드를 말한다. 또한 본 발명의 EPO 유사체는 생물학적 활성에 필요한 이차구조 또는 삼차구조를 방해하지 않는 글리코실화 부위를 증가시키거나 변화시키는 아미노산 잔기의 부가, 결실 또는 치환을 갖는 부위 지정 돌연변이체를 포함할 수 있다. 상기 EPO 유사체(analogue)는 인간의 천연형(native) EPO보다 더 높은 EPO수용체에 대한 결합력을 가질 수 있다.

본 발명의 EPO, EPO 활성단편(fragment) 또는 이의 유사체(analogue)에는 EPO 이중합체(dimer), EPO 다중합체(polymer), EPO 아이소형(isoforms) 등 다양한 형태가 포함되며, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 EPO, EPO 활성단편 또는 이의 유사체는 세포배양, 인간을 포함한 동물에서 추출 및 분리, 화학적으로 합성 또는 유전적으로 재조합된 벡터 등에 의하여 생산될 수 있다. 또한 본 발명의 EPO는 바람직하게는 사람 EPO, 보다 바람직하게는 생리활성이 높은 재조합 사람 EPO이다.

본 발명의 조성물은 EPO, EPO 활성단편 또는 이의 유사체 이외에 하나 이상의 다른 인자를 추가로 포함할 수 있다. 상기 다른 인자는 내피세포 장벽을 통해 EPO를 전달하기 위한 역할 및/또는 세포 보호 등의 역할을 수행할 수 있는 인자를 말한다. 예를 들면, FGF, EGF, IGFs, TGFs, NGF등의 성장인자; BNF, CTF 등의 신경향성 인자(neurotrophic factor); 펩티드 방사선 약물; 안티센스 약물; 생물학적 활성제에 대한 항체; 사이클로스포린 등의 면역억제제; 인터루킨, 인터페론, LIF 등의 사이토카인; GSK(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 억제제 등이 있다.

본 발명의 조성물은 또한 통상적인 방법에 따라 약제학적으로 허용되는 담체 또는 부형제와 혼합하거나 희석제로 희석하여 사용할 수 있다. 적합한 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 필요에 따라 상기 조성물에 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제, 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 조성물은 경구, 국소(협측(buccal), 설하, 피부 및 안내(眼內)의 투여를 포함), 비경구(피하, 피내, 뇌척수강 내, 복강 내, 근육 내, 혈관 내 및 관절 내의 투여를 포함) 또는 경피성 투여를 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 비경구 투여이며, 보다 바람직하게는 뇌척수강 내, 복강 내, 근육 내, 혈관 내의 투여일 수 있다. 비경구 투여의 경우, 예를 들면, 정맥 내 투여는 바늘 또는 이와 양립 가능한 수단에 의할 수 있으며, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 함유할 수 있다. 본 발명의 조성물은 바람직하게는 정맥 내 경로를 통해, 적당한 투여량으로, 그리고 액체 형태로 투여된다. 경구 투여의 경우, 예를 들면, 본 발명의 조성물은 액체 또는 고체 형태로 적당한 담체와 함께 투여될 수 있다.

또한 본 발명의 조성물은 당해 분야에서 공지된 다른 운동신경원질환 치료용 물질과 동시에 또는 순차적으로 개체에 투여될 수 있다.

본 발명의 EPO, EPO 활성단편 또는 이의 유사체를 포함하는 조성물은 운동신경원질환의 발병 초기에 투여할 수 있으며, 또는 운동신경원질환이 상당히 진행된 후에도 투여할 수 있다. 예를 들면, ALS 증상이 시작된 시점(예로, 상위운동원 징후, 하위운동원 징후 또는 뇌간 징후)부터 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 시간 후 등에 투여할 수 있으나, 이로 제한하지 않으며, ALS가 상당히 진행되어 상 위운동원 및 하위운동원 징후가 전반적으로 나타나는 경우에도 투여할 수 있다. 또한 본 발명의 조성물은 운동신경원질환의 예방을 위하여 투여할 수 있다. 이러한 투여는 필요에 따라 반복될 수도 있다. 예를 들어, 임상적으로 필요한 경우 매일 반복하여 투여할 수 있거나, 적당한 시간 간격이 지난 후, 예를 들어 매 1 내지 12주, 바람직하게는 매 3 내지 8 주마다 투여할 수도 있으나, 이로 제한하지 않는다.

본 발명의 조성물은 개체에 투여된 후 활성 성분의 신속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 잘 알려진 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 정제, 분말, 환제, 새세이(sachet), 엘릭서(elixir), 현탁액, 에멀젼, 용액, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 상기 제형은 1회용 투약 형태가 편리할 것이다. 본 발명의 제형으로 가장 바람직한 것은 주사제이다.

본 발명의 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에서 "약제학적으로 유효한 양"은 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도; 환자의 연령, 체중, 건강, 성별; 환자의 약물에 대한 민감도; 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율; 치료 기간; 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 조성물 1회 투여량은 인간을 제외 한 동물의 경우에 1회 투여당 200 내지 10000 유니트(IU)/체중(kg), 바람직하게는 약 200 내지 5000 유니트 /체중(kg), 보다 바람직하게는 200 내지 2000 유니트/체중(kg), 가장 바람직하게는 500 내지 1000 유니트/체중(kg)으로 투여될 수 있다. 또한 인간의 경우 안전성을 고려하여 체중과 관계없이 1회 투여당 20,000 내지 45,000 유니트, 바람직하게는 25,000 내지 40,000 유니트, 보다 바람직하게는 30,000 내지 40,000 유니트로 투여될 수 있다.

본 발명에서 사용된 용어, "운동신경원질환"은 운동신경의 기능에 장애를 초래하는 질환을 말한다. 예를 들면, 근위축성측삭경화증(ALS), 진행성연수마비(progressive bulbar palsy, PBP), 일차성측삭경화증(primary lateral sclerosis, PLS), 진행성근위축증(progressive muscular atrophy, PMA)를 포함한다. 운동신경원질환은 아니지만 신경계 퇴행성 변화를 보이는 타 질환에는 파킨슨씨병, 헌팅톤씨병, 다기관 위축증(multisystem atrophy), 알츠하이머병, 피크씨병, 올리브교소뇌피질위축증 등이 있다. 본 발명의 조성물에 특히 효과가 있는 질환은, 바람직하게는 근위축성측삭경화증(ALS), 진행성연수마비(PBP), 일차성측삭경화증(PLS), 진행성근위축증(PMA)이며, 보다 바람직하게는 근위축성측삭경화증(ALS)이다. 본 발명의 조성물은 가장 바람직하게는 근위축성측삭경화증(ALS)을 치료하기 위한 조성물이다.

본 발명의 조성물은 운동신경원질환의 치료에 우수한 효과가 있다. 즉, 본 발명의 조성물을 투여한 근위축성측삭경화증(ALS) 쥐의 운동능력 평가에서 본 발명의 조성물을 투여하지 않은 쥐에 비하여 30% 정도의 운동능력이 향상되었으며, 또한 쥐의 생존 능력(생존 기간)에서도 향상되었다. 근위축성측삭경화증(ALS) 환자를 대상으로 한 임상실험에서도 본 발명의 조성물을 투여한 환자에서 호흡, 발음 및 연하기능이 현저하게 호전되었으며, 기립자세 유지 가능 시간이 연장되었고, 불면증이 감소되는 등의 임상적인 변화가 있었으며, 상기와 같은 변화가 상당 기간 지속되었다. 따라서, 본 발명의 조성물은 운동신경원질환의 치료를 위하여 효과적으로 사용할 수 있다.

다른 하나의 양태로서, 본 발명은 EPO, EPO활성단편 또는 이의 유사체를 포함하는 운동신경원질환 치료용 조성물을 개체에 투여하여 운동신경원질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 치료학적 처치 및 예방 또는 방지 수단을 말한다. 따라서, 치료가 필요한 자들은 이미 운동신경 장애 또는 운동신경원질환을 가진 자뿐만 아니라 운동신경 장애 또는 운동신경원질환을 예방하고자 하는 자들을 포함한다. 본 발명에서 사용된 용어, "개체"는 사람, 영장류 및 가축, 사육, 애완용 또는 스포츠 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 양, 돼지, 소 등을 비롯한 치료가 필요한 임의의 포유동물을 말한다.

구체적인 양태로서, 본 발명은 EPO를 포함하는 조성물을 개체에 비경구 투여하는 단계를 포함하는 운동신경원질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 구체적 양태로서, 본 발명은 EPO 및 FGF, EGF, IGFs, TGFs, NGF등의 성장인자; BNF, CTF 등의 신경향성 인자(neurotrophic factor); 펩티드 방사선 약물; 안티센스 약물; 생물학적 활성제에 대한 항체; 사이클로스포린 등의 면역억제제; 인터루킨, 인터페론, LIF 등의 사이토카인; GSK(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 억제제 등의 추가인자 중 어느 하나 이상을 동시에 포함하는 조성물을 개체에 투여하여 운동신경원질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 다른 양태로서 본 발명은 EPO를 포함하는 조성물 및 상기 인자들 중 하나 이상을 포함하는 조성물을 순차적으로 개체에 투여하여 운동신경원질환을 치료하는 방법에 관한 것이다.

이하, 본 발명을 하기 실시예를 참조하여 더욱 구체적으로 설명하기로 한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 근위축성측삭경화증모델 쥐 ( SOD1 mutant transgenic mice model ) 에서의 EPO 의 치료효과

실험에 사용한 사람 EPO는 동아제약에서 구입 혹은 기증받아 사용하였고 (rhEPO; 에포론 주; 4,000 IU), 근위축성측삭경화증모델 쥐(B6SJL-Tg(SOD1- G93A)1Gur/J mouse)는 잭슨 실험실(Jackson laboratory; Bar Harbor, ME, USA)로부터 4주령을 구입하여 12주령까지 사육한 후 실험에 사용하였다. 실험은 쥐 몸무게 1그램당 1 IU의 EPO를 2주 간격으로 복강 투여하고, 같은 방법으로 대조구는 생리식염수만을 복강투여하였다. 각각의 군당 5마리를 실험하였으며, 사지떨림, 근육경련, 과다반사, 사지근력약화, 사지근력마비 등의 근위축성측삭경화증에 의한 증상을 비교 관찰하고, 로타로드(Rotarod; Ugo Basile; Comerio-Varese, Italy)를 이용하여 운동능력시험을 수행하여 EPO의 효과를 비교하였다.

근위축성측삭경화증의 초기 증상인, 사지떨림, 근육경련, 과다반사 등의 증상이 처음 보이기 시작한 시기를 증상 발현 시점으로 하여 측정하였고, 쥐들이 30초 이내에 자발적으로 지면으로부터 일어설 수 없을 때를 종말점으로 하여 그때까지의 기간을 측정한 후 희생시켰다. 또한 몸무게의 변화를 주기적으로 측정하였다.

로타로드(rotarod)을 이용하는 운동능력의 변화는 보편적인 방법으로 측정하고, 투약 일주일전부터 로타로드 기계를 이용하여 트레이닝을 시켜 적응하도록 하였다. 측정할 지표로 로타로드 위에서 버틴 시간 및 떨어질 당시의 회전수 등을 이용하였다.

그 결과, 운동능력에 대한 평가에서, EPO를 투여한 쥐군이 그렇지 않은 쥐군에 비해 30% 가량 운동능력이 향상되었으며, 생존률도 10일 이상 증가하였다(도 1).

실시예 2 : EPO 의 효과적 투여량 조사

실시예 1에서와 동일하게 사람 EPO는 동아제약에서 구입 혹은 기증받아 사용하였고 (rhEPO; 에포론 주; 4,000 IU), 근위축성측삭경화증모델 쥐(B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J mouse)는 잭슨실험실(Jackson laboratory; Bar Harbor, ME, USA)로부터 4주령을 구입하여 12주령까지 사육한 후 실험에 사용하였다. 실험은 쥐 몸무게 1그램당 1, 2.5 및 5 IU의 EPO를 2주 간격으로 복강 투여하고, 같은 방법으로 대조군은 생리식염수만을 복강투여하여EPO의 투여량에 따른 근위축성측삭경화증모델 쥐의 생존 기간을 측정하였다. 생존 기간에 대한 평가는 쥐가 30초 이내에 스스로 일어나지 못하는 시점까지를 평가하였으며, 각각의 군당 9마리를 실험에 이용하여 이의 결과를 도 2에 나타내었다. 그 결과 EPO 투여량에 따라 농도의존적으로 생존기간이 연장되었음을 확인할 수 있었으며, 특히 5,000 IU/Kg의 EPO 투여 시 생존기간이 가장 연장되었다.

상기 생존기간의 연장에 대한 EPO의 기전을 확인하기 위하여 대표적인 염증반응 물질인 COX-2 발현의 변화를 웨스턴 블롯팅(western blotting)을 통하여 확인하였다. 실험은 생존기간의 평가를 위한 방법과 같은 방법으로 진행하였으며, 각각의 군당 2마리를 실험에 이용하였으며 이에 대한 결과를 도 3에 나타내었다. 그 결과 대표적인 염증반응 물질인 COX-2의 발현이 EPO 투여량에 따라 농도의존적으로 감소하여 EPO에 의한 염증반응의 감소가 생존기간의 연장과 밀접하게 관련되어 있을 것이라는 사실을 확인하였다.

실시예 3 : ALS 환자에서 EPO 치료 효과

3-1. ALS 환자 선택

ALS 환자에서 EPO 치료 효과는 엘에스코리얼 진단기준 개정판(Revised El Escorial Criteria: 세계 신경과학회에서 제시된 ALS의 진단 기준) (표 1 참조)에서 '임상적으로 ALS 진단 고려'(Probable ALS 이상)로 확진된 환자를 대상으로 하여 총 2차례의 입원과 외래 추적 관찰을 실시하고, 첫 번째 입원 시에 기능평가등급(Functional rating scale), 아펠 점수(Appel score), 노리스점수(Norris scale), 신경생리학적 지표(Neurophysiologic index) 등을 이용하여 환자의 전반적인 치료 전, 초기 치료 및 치료 후 3개월 이후의 임상상태를 평가하였다. 이에 대한 결과를 표 2에 나타내었다.

세계신경과학회에서 제시된 ALS 진단 기준(Revised El Escorial Criteria of ALS)

임상적으로 확실시 ( Clinically Definite ALS ) 3 부위 이상에서 상위운동원 징후 및 하위운동원 징후가 모두 존재할 때

임상적으로 추정 ( Clinically Probable ALS ) 최소 2부위에서 상위운동원 징후 및 하위운동원 징후가 모두 존재하며 전자가 후자보다 상부에 위치할 때

임상적으로 추정 ( Clinically Probable - Laboratory - supported ALS ) 상위운동원 징후 및 하위운동원 징후가 1부위에 존재하거나 상위운동원징후가 1부위에 존재하면서 두 경우 모두 근전도 소견상 2지 이상에서 근전도 기준에 부합할 때

임상적으로 고려 ( Clinically Possible ALS ) 상위운동원 징후 및 하위운동원 징후가 1부위에 존재하는 경우, 상위운동원 징후가 2 부위이상에서 존재하는 경우, 혹은 하위운동신경원 징후가 상위운동원 징후보다 상부에 존재할 때

임상적으로 의심 ( Clinically Suspected ALS ) 확실한 하위운동원징후가 존재하는 경우, ALS 진단이 리서치 연구에서의 환자를 포함하여 충분히 확실하다고 간주될 수 없을 때

ALS 환자의 특징 및 임상 상태

	Group A-I, Rapid progression (n=10)	Group A-II, Slow progression (n=6)
연령, 평균±편차	46.8 ± 8.9	55.2 ± 11.5
남성 비율, n (%)	5 (50)	3 (50)
발병기간, ±s.d.	2.3 ± 1.3	4.7 ± 3.7
Limb onset, n (%)	8 (80)	5 (83.3)
체중 (kg), ±s.d.	59.9 ± 6.1	63.9 ± 11.8
신체비만지수, ±s.d.	22.0 ± 1.6	24.0 ± 3.4
N (%) on Riluzole	7 (70)	6 (100)
초기 치료 시의 위창냄술(Gastrostomy)	1 (10)	0
초기 치료 시의 기관절개술(Tracheostomy)	1 (10)	0
치료 3개월 전의 ALSFRS-R, ±s.d.	36.00 ± 7.99	35.17 ± 3.31
초기 치료 시의 ALSFRS-R, ±s.d.	28.70 ± 9.57	34.17 ± 3.06
초기 치료 3개월 후의 ALSFRS-R, ±s.d.	25.50 ± 8.64	32.67 ± 3.33

* EPO군과 대조군간에 인구학적 차이가 없었다.

3-2. EPO 에 의한 치료 효과

EPO군과 대조군의 분류 근거 및 과정을 도 4에 나타냈으며, 실시예 3-1에서 선별한 ALS 환자에, 환자당 rhEPO(동아제약, 에포론 주, 4,000 IU 짜리 사용) 35,000 IU를 50ml의 생리식염수에 희석하여 정맥 내로 30분간 투입하였다. rhEPO 치료 후 2일간 부작용 여부를 확인한 후 퇴원하였으며 2주 후 외래에 내원하여 혈액검사를 통해 부작용 여부를 재차 확인하였다. rhEPO 치료 계획은 도 5에 보는 바와 같으며, 치료에 대한 결과를 표 3에 나타내었다. 표 3에 나타난 바와 같이, rhEPO를 투여한 환자에서 Hb, Hct, PLT 카운트(count) 및 혈압, 간 기능, 신장 기능 등의 이상 반응은 관찰되지 않았다.

ALS 환자의 EPO 투여 후의 부작용 검사 결과

	At the time right before
	첫번째 EPO 투여	두번째 EPO 투여 (첫번째 EPO 투여 1개월 후)	첫번째 EPO 투여 2개월 후
Hemoglobin (g/dl)	13.29 ± 1.03	13.50 ± 1.19	13.56 ± 1.07
Hematocrit (%)	38.99 ± 3.26	39.81 ± 3.48	40.64 ± 3.04
Thrombocyte count (x103/ml)	274.38 ± 75.69	262.63 ± 85.55	259.81 ± 65.57
Mean blood pressure (mmHg)	91.00 ± 7.88	91.67 ± 8.48	88.58 ± 6.15
AST	31.44 ± 19.92	25.69 ± 10.28	28.81 ± 9.19
ALT	42.06 ± 31.27	29.94 ± 15.78	33.00 ± 16.41
Blood urea nitrogen	12.50 ± 2.73	12.38 ± 2.96	12.00 ± 2.50
Creatinine	0.65 ± 0.18	0.66 ± 0.17	0.64 ± 0.17

* EPO 후 특별한 부작용은 없었다.

실시예 2-1에서 선택된 ALS 환자의 기능평가 등급(Functional rating scale) (이하, ‘ALSFRS-r’이라 함)을 기준으로 ALSFRS-r 점수가 20점 이상인 A그룹 및 ALSFRS-r 점수가 20점 이하인 B그룹으로 구분하고, A그룹은 다시 3개월 간의 관찰 기간 동안의 ALSFRS-r 점수의 변화율에 따라 A-I 그룹(ALS가 빠르게 진행하는 그룹) 및 A-II 그룹(ALS가 천천히 진행하는 그룹)으로 구분하였다. A 그룹의 ALSFRS-r 점수의 변화를 도 6 및 도 7에 나타내었다.

도 6 및 도 7에 나타난 바와 같이, A 그룹에서 EPO 투여 전 3개월 간의 ALSFRS-r 점수의 변화에 비해 EPO 투여 후 3개월 간의 ALSFRS-r 점수의 변화량에 확실한 차이를 보여 ALS 질환이 완화되었음을 알 수 있었다. 특히, 도 6에 나타난 바와 같이, A-II 그룹보다 A-I 그룹에서 ALSFRS-r 점수가 크게 변화하여 본 발명의 EPO 투여가 비교적 빠르게 진행하는 ALS 환자에서 보다 좋은 효과를 얻을 수 있을 것이다.

또한, EPO 투여 후의 ALS 환자가 증상이 향상되었다고 호소한 증상들을 도 8에 나타내었다. 상기 증상들은 수치화하여 ALSFRS-r 점수로 나타낼 수는 없으나, 환자들이 EPO를 투여받은 후 달라진 점을 나타낸 것이다. 도 8에 나타난 바와 같이, 많은 환자에게서 사지의 근력이 향상되는 느낌과 호흡, 구기능, 침흘리기 등에 있어 향상된 느낌을 호소하였다.

도 9에는 신경생리학적 인덱스(unlar nerve, both)를 이용하여 신경생리학적 평가(neurophysiological assessment, N.I.) 결과가 나타나 있다. 도 9에서 보는 바와 같이, EPO 투여 후 2개월간에서 통계적으로 유의한 변화가 없었으나, 3개월 시점부터 변화량의 차이를 보이고 있어 EPO의 2차례 투여에 의한 효과가 약 1개월 간 유지될 가능성이 있음을 나타내고 있다.

본 발명의 EPO 또는 이의 유사체를 포함하는 운동신경원질환 치료용 조성물은 운동신경원질환, 특히 근위축성측삭경화증(ALS)의 치료에 효과적이다.

Claims (9)

1. 에리트로포이에틴, 에리트로포이에틴 활성단편 또는 이의 유사체를 포함하는 운동신경원질환 치료용 조성물.
2. 에리트로포이에틴, 에리트로포이에틴 활성단편 또는 이의 유사체 및 FGF, EGF, IGFs, TGFs, NGF등의 성장인자; BNF, CTF 등의 신경향성 인자(neurotrophic factor); 펩티드 방사선 약물; 안티센스 약물; 생물학적 활성제에 대한 항체; 사이클로스포린 등의 면역억제제; 인터루킨, 인터페론, LIF 등의 사이토카인; GSK(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 억제제 중에서 선택되는 하나 이상의 추가인자를 포함하는 운동신경원질환 치료용 조성물.
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 운동신경원질환이 근위축성측삭경화증(ALS)인 조성물.
4. 제1항 또는 제2항에 있어서, 운동신경원질환이 진행성연수마비 (progressive bulbar palsy, PBP), 일차성측삭경화증(primary lateral sclerosis, PLS), 진행성근육위축증(progressive muscular atrophy, PMA)인 조성물.
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 에리트로포이에틴, 에리트로포이에틴 활성단편 또는 이의 유사체가 전체 조성물에서 20,000 내지 45,000 유니티(IU)로 포함된 조성물.
6. 제5항에 있어서, 에리트로포이에틴, 에리트로포이에틴 활성단편 또는 이의 유사체가 전체 조성물에서 30,000 내지 40,000 유니트(IU)로 포함된 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 조성물이 정맥 투여용 주사제로 사용되는 것인 조성물.
8. 제1항 또는 제2항의 조성물을 개체에 투여하여 운동신경원질환을 치료하는 방법.
9. 에리트로포이에틴, 에리트로포이에틴 활성단편 또는 이의 유사체를 포함하는 조성물 및 FGF, EGF, IGFs, TGFs, NGF등의 성장인자; BNF, CTF 등의 신경향성 인자(neurotrophic factor); 펩티드 방사선 약물; 안티센스 약물; 생물학적 활성제에 대한 항체; 사이클로스포린 등의 면역억제제; 인터루킨, 인터페론, LIF 등의 사이토카인; GSK(Glycogen Synthase Kinase 3 beta) 억제제 중에서 선택되는 하나 이상의 추가인자를 포함하는 조성물을 개체에 순차적으로 투여하여 운동신경원질환을 치료하는 방법.

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