KR20070111846A

KR20070111846A - 토복령의 메탄올 추출물을 함유하는 뇌신경 보호 또는퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제

Info

Publication number: KR20070111846A
Application number: KR1020060045166A
Authority: KR
Inventors: 성연희; 송경식; 반주연; 정현희; 성낙술
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2006-05-19
Filing date: 2006-05-19
Publication date: 2007-11-22
Also published as: KR100779179B1

Abstract

본 발명은 유효성분으로서 토복령(Smilacis chinae rhizome)의 메탄올 추출물을 함유하는 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제에 관한 것으로서, 본 발명의 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제는 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증 (OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 픽병 등을 포함하는 퇴행성뇌질환, 뇌허혈, 뇌경색 등, 특히 알츠하이머병, 뇌허혈 및/또는 뇌경색을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.

Description

토복령의 메탄올 추출물을 함유하는 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제{Agent for neuroprotection or for prophylaxis or treatment of neurodegenerative disorders containing methanol extract of Smilacis chinae rhizome}

도 1은 토복령 추출물 (SCR)의 베타아밀로이드에 의한 세포사멸 억제효과를 보여주는 그래프이고;

도 2는 토복령 추출물 (SCR)의 베타아밀로이드에 의한 신경세포의 고사성 세포사멸 억제효과를 보여주는 그래프이며;

도 3은 토복령 추출물 (SCR)의 베타아밀로이드에 의한 세포 내 칼슘농도 증가 억제효과를 보여주는 그래프이고;

도 4는 토복령 추출물 (SCR)의 베타아밀로이드에 의한 글루타메이트 유리 억제효과를 보여주는 그래프이며;

도 5는 토복령 추출물 (SCR)의 베타아밀로이드에 의한 활성산소 생성 억제효과를 보여주는 그래프이고;

도 6a 및 6b는 토복령 추출물 (SCR)의 베타아밀로이드에 의한 캐스파제-3 발현 억제효과를 보여주는 사진 및 그래프이며;

도 7a 및 7b는 토복령 추출물 (SCR)의 뇌경색 억제효과를 보여주는 사진 및 그래프이다.

본 발명은 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는, 유효성분으로서 토복령(Smilacis chinae rhizome)의 메탄올 추출물을 함유하는 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제에 관한 것이다.

퇴행성뇌질환(Neurodegenerative disorders)은 중추신경계의 신경세포에 퇴행성 변화가 나타나면서 여러 가지 증상을 유발하는 질환으로, 대표적인 퇴행성뇌질환으로는 알츠하이머병(Alzheimer's disease), 파킨슨병(Parkinson's disease), 진행성 핵상마비(Progressive supranuclear palsy), 다계통 위축증(Multiple system strophy), 감람핵-뇌교-소뇌 위축증(Olivopontocerebellar atrophy; OPCA), 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager syndrome), 선조체-흑질 퇴행증 (Striatonigral degeneration), 헌팅톤병(Huntington's disease), 근위축성 측색 경화증(Amyotrophic lateral sclerosis; ALS), 본태성 진전증(Essential tremor), 피질-기저핵 퇴행증(Cortico-basal ganlionic degeneration), 미만성 루이 소체 질환(Diffuse Lewy body disease), 파킨스-ALS-치매 복합증(Parkinson-ALS-dementia complex of Guam), 픽병(Pick's disease) 등을 들 수 있다.

상기 질환 중에서, 알츠하이머병 (AD)은 신경세포(neuron) 상실과, 아밀로이드 전구체 단백질로부터 유래된 39∼43 아미노산 펩티드인 아밀로이드 β 단백질 (Aβ)을 주요 구성성분으로 하는 세포외 노인성 반(senile plaque)을 특징으로 한다. 시험관 내 및 생체 내 연구 결과 Aβ 또는 Aβ 펩티드 단편은 독성 효과를 갖는 것으로 보고되어 Aβ가 AD의 발병에 중요한 역할을 함을 시사한다. 배양 시, Aβ는 신경세포 사멸을 직접적으로 유도하며 신경세포를 흥분독성 및 산화성 손상에 취약하게 만든다. Aβ-신경독성의 기작은 복잡하지만, 글루타메이트 수용체 서브타입중 하나인 N-메틸-d-아스파테이트 (NMDA) 수용체의 흥분, 글루타메이트 방출에 의해 유도되는 변조, 세포 내 Ca²⁺ 농도 ([Ca²⁺]_i)의 지속적 상승, 및 산화성 스트레스를 포함하는 것으로 여겨진다. NMDA 수용체는 Aβ 결합의 선택적 기질이나 Aβ-유발되는 글루타메이트 흥분독성의 매개자로 작용한다. NMDA 수용체는 특히 Ca²⁺에 고도로 투과성인, 리간드-게이트/볼티지-감수성 양이온 채널이다. [Ca²⁺]_i의 광범위한 상승은 직접적으로 세포 기능부전, 과잉흥분 또는 사멸에 이르게 한다. 따라서 Aβ의 신경독성 효과가 비-경쟁적 NMDA 수용체 길항제인 (5R,10S)-(+)-5-메틸-10,11-디하이드로-5H-디벤조[a,d]사이클로헵텐-5,10-이민 (MK-801)에 의해 감소된다는 보고에 의해 증명되는 바와 같이, Aβ 노출에 의한 NMDA 수용체를 통한 Ca²⁺ 유입은 Aβ-유도된 신경독성에서 결정적인 역할을 한다. 활성산소(Reactive Oxygen Species; ROS)의 형성 또한 퇴행성뇌질환의 발병에 관여하는 것으로 믿어진다. 몇 몇 증거가 신경세포 항상성을 방해하는 광범위한 분자적 현상을 통해 신경퇴화를 촉발하거나 용이하게 함으로써, Aβ-매개된 신경병에서 활성 인자로서 산화성 스트레스의 관여를 뒷받침한다. 그러나 NMDA 수용체 길항제와 신경세포 채널의 직접적 차단제의 임상적 유익성은, 그들이 확신할만한 효능을 결여하고 있거나 심각한 부작용을 가지므로, 논란의 여지가 있다.

한편, 뇌경색(cerebral infarction)은 뇌의 혈관이 막히고 그 앞의 뇌조직이 괴사한 상태를 일컫는다. 뇌경색은 뇌연화증이라고도 하며, 뇌혈전증과 뇌색전증이 있다. 뇌의 영양혈관이 완전히 폐색되거나 강한 협착을 일으켜 혈류가 현저하게 감소되면 그 부분의 뇌조직이 괴사하여 마침내 융해된다.

한편, 백합과(Liliaceae)에 속하는 청미래덩굴(Smilax china)은 한국을 비롯하여 일본, 중국 등에 분포하며 그 근경을 한국에서는 '토복령'(Smilacis chinae rhizome; SCR)이라 한다. 토복령은 항미생물 효과, 항암 활성, 항산화 활성 등 여러 약리활성을 갖는 것으로 알려져 있다. 또한 예를 들어, 일본특허공개 제2004-161718호는 토복령을 비롯한 백합과 식물의 추출물을 유효성분으로 하는 타키키닌 길항제로서, 이들이 정신분열증, 불안증, 울병, 구토 등 과잉의 타키키닌이 관여하는 질환의 예방 또는 치료제로 사용가능함을 개시한 바 있다. 또한, 일본특허공개 제2000-154151호는 토복령 추출물을 비롯한 플라보노이드류 또는 쿠로몬류를 유효성분으로 하는 면역억제제를 개시하고 있다. 나아가, 한국특허공개 제2003-70283호 및 제2004-77595호는 토복령 등의 식물 추출물 중에 함유된 디오신을 유효성분으로 하는 성장호르몬 분비촉진제를 개시하였으며, 한국특허공개 제2005-7515호는 토복령 등의 추출물을 함유하는 식작용(phagocytosis) 억제제를 개시한 바 있다.

그러나 지금까지 토복령의 메탄올 추출물이 알츠하이머병의 원인물질로 알려진 Aβ에 의한 세포손상에 대한 보호효과를 가짐으로써 뇌신경 보호제나 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있음을 교시하거나 암시한 문헌은 없었다.

본 발명자들은 토복령의 메탄올 추출물이 강력한 항산화 활성을 갖는다는 사실로부터 알츠하이머병이나 뇌허혈증에 의한 뇌손상을 억제할 가능성이 있음에 착안하고, 시험관 수준에서 배양된 신경세포를 이용하여 알츠하이머병의 원인물질로 알려진 Aβ에 의한 세포손상을 야기하고 토복령의 메탄올 추출물의 보호효과를 시험하였다. 또한, 동물모델에서 뇌허혈로 인한 뇌경색을 유발하고, 토복령의 메탄올 추출물의 뇌경색 억제효과를 시험하였다. 그 결과, 토복령의 메탄올 추출물이 Aβ에 의한 세포손상에 대한 탁월한 보호효과와 뇌경색 억제효과를 가짐으로써 뇌신경 보호제 및 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제로 사용될 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

따라서 본 발명의 목적은 유효성분으로서 토복령의 메탄올 추출물을 함유하는 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제를 제공하기 위한 것이다.

본 발명은 유효성분으로서 토복령의 메탄올 추출물을 함유하는 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제는 알츠 하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증 (OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환, 파킨스-ALS-치매 복합증, 픽병 등과 같은 퇴행성뇌질환, 뇌허혈, 뇌경색 등, 특히 알츠하이머병, 뇌허혈 및/또는 뇌경색의 예방 또는 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제는 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 함유할 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 랫트의 태자로부터 대뇌피질 신경세포를 분리하여 배양하고 신경세포에 β-아밀로이드 단백질 (Aβ(25-35); 베타아밀로이드)을 가하여 독성을 유도한 후 토복령 (SCR)의 메탄올 추출물이 어떤 기전을 통하여 독성을 억제하는지를 실험하였다. 그 결과, Aβ (10 μM)는 고사성 세포사멸(apoptotic cell death)을 일으켰으며, 이를 토복령 추출물 (10-50 ㎍/㎖)이 농도의존적으로 억제하였다. 토복령은 Aβ에 의한 세포 내 Ca²⁺농도 증가, 글루타메이트의 세포 외로의 유리, 세포 내 활성산소 (ROS)의 생성을 억제하였다. 또한 고사가 일어날 때 생성되는 단백질인 캐스파제(caspase)-3의 발현을 억제하였다. 따라서 본 발명에 의해 토복령 추출물이 치매의 원인물질이라고 알려져 있는 Aβ에 의한 신경세포의 사멸을 억제하며 그 기전이 Aβ에 의한 고사성 세포사멸, 세포 내 Ca²⁺농도 증가, 글루타메 이트의 세포 외로의 유리, 세포 내 활성산소 (ROS)의 생성, 및 캐스파제-3의 발현 억제임이 최초로 규명되었다. 따라서 본 발명에 따른 토복령 추출물은 Aβ에 대한 뇌신경 보호 또는 각종 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제로서 효과적으로 활용될 수 있다.

본 발명의 뇌신경 보호제 또는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제를 약제학적 제제의 형태로 제조하는 경우, 유효성분을 약제학적으로 허용되는 통상적인 담체와 함께 배합하여 투여 목적에 따라, 정제, 경질 또는 연질 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제나 현탁제와 같은 경구 투여용 제제 또는 주사가능한 액제나 현탁제, 비강세척제 등과 같은 비경구 투여용 제제의 형태로 제형화할 수 있다.

경구 투여의 목적으로 본 발명의 유효성분을 정제, 캅셀제, 츄잉정, 분말제, 액제, 현탁제 등의 제제로 제형화하는 경우에는, 아라비아 고무, 옥수수 전분, 미세결정질 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제, 인산이칼슘 또는 락토스와 같은 부형제, 알긴산, 옥수수 전분 또는 감자 전분과 같은 붕해제, 스테아르산마그네슘과 같은 활택제, 슈크로스 또는 사카린과 같은 감미제 및 페퍼민트, 메틸 살리실산염 또는 과일향과 같은 향미제가 포함될 수 있다. 단위 투여형이 캅셀제인 경우에는 상기 성분 외에도 폴리에틸렌글리콜 또는 지방유와 같은 액상 담체가 포함될 수도 있다.

또한, 비경구 투여를 위한 용액 또는 현탁액 형태의 주사제는 비경구적으로, 예를 들면 피하, 정맥 내, 근육 내 또는 복강 내로 투여될 수 있다. 일반적으로, 주사가능한 용액 또는 현탁액은 물, 염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 설탕 용액 제, 비휘발성 오일, 에탄올, 글리세린, 폴리에틸렌글리콜, 프로필렌글리콜과 같은 글리콜류 등의 약제학적으로 허용되는 액상 담체 중에 유효량의 유효성분을 균질하게 혼합시켜 제조할 수 있다. 이외에도 필요에 따라 가용화제, 항세균제, 킬레이트제, 완충제, 보존제와 같은 보조제를 포함시킬 수도 있다.

상기 약제학적으로 허용되는 담체로는 약제학적으로 순수하고, 실질적으로 무독성이며, 유효성분의 작용을 저해하지 않는 임의의 모든 보조제를 사용할 수 있다.

본 발명의 뇌신경 보호제 또는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제는 상기한 약학적 제제 외에도, 기존의 청량 음료, 미네랄 워터, 알콜 음료 등의 음료 제품 또는 츄잉껌이나 캐러멜 제품, 캔디류, 빙과류, 과자류 등에 적당량 배합하거나, 비타민이나 미네랄 등을 포함한 건강 보조 식품, 또는 식품 첨가제 등에 포함시켜 식품 또는 식품 보조제의 형태로 제조할 수도 있다.

본 발명에 따른 뇌신경 보호제 또는 퇴행성뇌질환 예방 또는 치료제의 1일 투여용량은 투여하고자 하는 대상의 질환의 중증도, 합병증, 체중, 연령, 성 등의 다양한 요인에 따라 변화될 수 있으나, 일반적으로는 토복령 추출물 1 내지 1000 ㎎/㎏, 바람직하게는 10 내지 500 ㎎/㎏, 보다 바람직하게는 10 내지 100 ㎎/㎏을 1일 1 내지 3회 경구투여할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 보다 구체적으로 설명하나, 이들은 본 발명의 범위를 어떤 식으로든 제한하고자 하는 것은 아니다.

실시예 1: 토복령의 메탄올 추출물의 제조

토복령을 한국 대구에 있는 한약재상으로부터 구입하고 동정하였다. 토복령 (300 g)을 각각 2 ℓ의 메탄올로 24 시간 동안 환류 응축기에서 3회 추출하였다. 이 용액을 합치고, 왓트만 No. 1 종이를 통해 여과하여, 회전 진공 증발기를 이용하여 농축하였다. 이때 수율은 약 10% (w/w)였다.

실시예 2: 경질 캅셀제의 제조

실시예 1의 토복령 추출물의 10배 농축물 10 ㎎

D-소르비톨 10 ㎎

락토스 5 ㎎

콜로이달실리콘디옥사이드 5 ㎎

스테아르산마그네슘 3 ㎎

총량 33 ㎎

통상적인 캅셀제의 제조방법에 따라 상기 성분들을 지정된 양으로 배합한 후, 1 캅셀 당 33 ㎎의 배합물이 되도록 적절한 크기의 경질 젤라틴 캅셀에 충진하여 목적하는 캅셀제를 제조하였다.

실시예 3: 정제의 제조

실시예 1의 토복령 추출물의 10배 농축물 10 ㎎

D-소르비톨 10 ㎎

락토스 5 ㎎

콜로이달실리콘디옥사이드 5 ㎎

스테아르산마그네슘 3 ㎎

총량 33 ㎎

상기 성분들을 지정된 양으로 혼합한 후, 통상적인 정제의 제조방법에 따라 정제를 제조하였다.

실시예 3: 연질 캅셀제의 제조

실시예 1의 토복령 추출물의 10배 농축물 10 ㎎

콩기름 100 ㎎

팜유 76 ㎎

총량 186 ㎎

상기 성분들을 지정된 양으로 배합한 후, 통상의 연질 캅셀제 제조방법에 따라 연질 캅셀제를 제조하였다.

실험예 1: 대뇌피질 신경세포의 배양

임신한 스프래그-도울리(Sprague-Dawley) (SD) 랫트 (폴라스 인터내셔널(Polas International), 한국, 서울)를 한 마리씩 수용하고, 광주기를 12 시간 명/암 주기로 조절하고 먹이와 물에 자유롭게 접근하도록 하면서 공기조절 쿼터 (온도 22±2 ℃)에서 유지시켰다.

임신 15일의 랫트를 에테르 마취 하에서 태자를 꺼내고, 현미경 하에서 대뇌피질만을 분리하였다. 이를 트립신 (0.25 ㎎/㎖)을 함유하는 조클릭-변형 이글즈 배지(Joklik-modified Eagle's medium) (시그마 케미컬 Co.(Sigma Chemical Co.), 미국, MO, St. 루이스)에 가하고, 5 ㎖ 피펫에 의해 기계적으로 분산하였다. 이를 37 ℃에서 10 분간 배양하여 효소적 분리를 수행하였다. 세포 현탁액을 1,500 rpm으로 5 분간 원심분리하여 얻은 세포를 함유하는 침전층에 중탄산나트륨 (44 mM), 페니실린 (40 U/㎖), 겐타마이신 (50 g/㎖), KCl (5 mM) 및 10% 우태아혈청 (FBS) (집코(Gibco), 미국, UT, 로간)을 함유하는 DMEM (시그마 케미컬 Co.)을 가하여 세포 농도를 2×10⁶ 세포/㎖로 조정하여, 나일론 메쉬 (35 μm)를 통과하였다. 신경세포를 세포사멸 및 글루타메이트 방출 측정을 위해, 미리 폴리-L-리신으로 코팅한 배양용 용기 (코닝(Corning) 3512, 미국, NY)에, [Ca²⁺]_c, 활성산소 및 고사 측정을 위해 커버슬립 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific) 12CIR, 미국, PA, 피츠버그)에, 캐스파제-3 활성화 측정을 위해 30 ㎜ 배양접시에 위치시켰다. 2 일간 배양한 후, 배지를 우태아혈청 및 KCl의 농도가 각각 5%와 15 mM로 변화된 새로운 성장배지로 교체하였다. 배지를 매주 2회 교환하면서 배양물을 37 ℃, 5% CO₂/95% 공기를 유지하는 조건의 CO₂ 배양기에서 유지하였다.

실험예 2: 토복령 추출물의 신경세포 사멸 억제효과 측정 - MTT 측색 어세이

본 실험예의 MTT 측색(colorimetric) 어세이는 세포의 생존, 증식을 양적으로 측정하는 매우 민감하고 안정된 방법으로서, 살아있는 세포 내에서 노란색의 수용성 기질 MTT (3-[4,5-디메틸티아졸-2-일]-2,5-디페닐-테트라졸륨 브로마이드)를 진한 파란색의 포마잔(formazan)으로 전환시키는 미토콘드리아의 활성을 근거로 하는 것이다. 따라서 생성되는 포마잔의 양은 살아있는 세포의 수와 비례하며, 흡광도가 높을수록 살아있는 세포수가 많은 것이다.

실험예 1에서 배양된 대뇌피질 신경세포로부터 배양 배지를 제거하고 무-혈청 성장배지로 교체하였다. 신경세포를 상기 배지에서 20 분간 배양하고, 10 μM Aβ(25-35) (바켐(Bachem), 스위스, 부벤도르프) 존재 하에 추가로 24 시간 동안 배양하였다 (Aβ 단독처리군). 이때, 실시예 1에서 제조된 토복령의 메탄올 추출물을 Aβ 처리 15 분 전에 가하여, Aβ로의 배양 기간 중 배지 중에 존재하게 하고, 이를 토복령 추출물 처리군으로 하였다. 배지를 제거한 후, 무-혈청 성장배지 중 MTT (0.5 ㎎/㎖, 시그마 케미컬 Co.) 용액을 가하고 4 시간 동안 37 ℃에서 배양하였다. 이후 MTT 용액을 제거하고 200 ㎕의 산-이소프로판올 (이소프로판올 중 0.04 N HCl)을 모든 웰에 가하여 형성된 진한 푸른색의 포마잔 결정을 용해시킨 후, 마이크로엘라이자 리더(microelisa reader) (바이오-텍(Bio-Tek), EL_x808, 미국, VT, 위노오스키)에 의하여 파장 570 ㎚ (참조파장 630 ㎚)에 의하여 흡광도를 측정하였다. 이때 Aβ 처리를 하지 않은 세포를 대조군(control)으로 하여 이를 100%로 하였을 때 Aβ 단독처리군 및 토복령 추출물 처리군의 흡광도를 %로 나타내었다.

그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, Aβ (10 μM) 단독처리군의 경우, 대조군 (100%)에 비해 흡광도가 66.9ㅁ 1.5%로 감소하였다. 이는 Aβ에 의하여 약 33%의 세포가 사멸하였음을 의미한다. 이에 비해, 토복령 추출물 처리군의 경우 흡광도가 각각 10 ㎍/㎖ 처리 시 76.7%, 30 ㎍/㎖ 처리 시 100.6%를 나타내어 Aβ에 의한 세포사멸이 억제되며, 50 ㎍/㎖ 처리 시에는 107.8±4.0%로 Aβ에 의한 세포사멸이 완벽하게 억제되었다.

실험예 3: 토복령 추출물의 신경세포의 고사성 세포사멸 억제효과 측정 - 훽스트 염색

본 실험예에서는 Aβ에 의한 세포사멸이 고사성 세포사멸이라는 것을 입증하기 위하여 훽스트(Hoechst) 33342 염색을 수행하였다.

비스벤즈이미다졸 염료, 훽스트(Hoechst) 33342는 원형질막을 통과하여 DNA를 염색한다. 정상세포는 이 시약에 의하여 둥그런 핵 모양을 나타내나 고사를 일으킨 세포는 핵 모양의 형태적 변화를 일으킨다. 이를 이용하여 실험예 2에 기재된 바와 같이 커버슬립 상의 신경세포를 무-혈청 성장배지 중 10 μM Aβ(25-35) 또는 Aβ(25-35) 및 토복령 추출물에 노출시킨 후, 4% 파라포름알데히드로 실온에서 20 분간 고정한 후, 훽스트 33342 (1 ㎍/㎖; 몰레큘라 프로브즈(Molecular Probes) Inc., 미국, OR, 유진)로 15 분간 처리하고 형광현미경 (올림푸스(Olympus) IX70-EL, 일본, 토쿄) 하에서 세포의 모양변화를 관찰하였다. 총 세포수와 고사를 일으킨 세포를 계수하여 고사성 세포사멸을 측정하였다.

그 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타낸 바와 같이, 대조군이 7.9%의 고사를 일으킨데 비하여 Aβ 단독처리군은 28.6%의 고사를 일으켰으며, 토복령 추출물 처리군의 경우, Aβ에 의한 고사를 10 ㎍/㎖ 처리 시 20.7%, 50 ㎍/㎖ 처리 시 7.8%로 억제하여, 토복령 추출물이 50 ㎍/㎖의 농도에서 Aβ로 인한 고사를 완벽하게 억제함을 알 수 있었다.

실험예 4: 토복령 추출물의 세포 내 칼슘 농도 증가 억제효과 측정

본 실험예에서는 배양된 신경세포에 형광염색약인 플루오-4 AM(fluo-4 AM) (3 μM; 몰레큘라 프로브즈, Inc.)을 가하고 여기에 Aβ를 가하면 세포 내 Ca²⁺ 농도가 증가할수록 이 시약이 Ca²⁺과 결합하여 흡광도가 증가하는 성질을 이용하는 측정법을 이용하였다.

즉, 커버슬립 상에서 성장시킨 신경세포에 CO₂ 배양기에서 37 ℃에서 45 분간 무-혈청 성장배지 중 3 μM 플루오-4 AM (디메틸설폭사이드(DMSO)에 용해)을 로딩하였다. 플루오-4 AM-표지된 신경세포를 함유하는 커버슬립을 배양완충액을 함유하는 관류 챔버 상에 탑재하고, 레이저 주사 공촛점 현미경 (칼 자이스(Carl Zeiss) LSM 510, 독일, 오베르코헨)에 가하여 488 ㎚ 여기 아르곤 레이저와 515 ㎚ 롱패스 방사 필터를 사용하여 3초 마다 주사하였다. [Ca²⁺]_c의 기저선이 50 초간 관찰된 후, [Ca²⁺]_c 변화를 측정하기 위하여10 μM Aβ(25-35)를 관류 챔버에 가하였다. Aβ(25-35)-유도된 [Ca²⁺]_c 변화에 대한 토복령 추출물의 효과를 시험하기 위하여, Aβ(25-35) 처리 15 분 전에 신경세포를 토복령 추출물 (50 ㎍/㎖)로 전처리하였다.

그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에 나타낸 바와 같이, Aβ를 플루오-4 AM으로 처리한 신경세포에 가하면 세포 내 칼슘농도 ([Ca²⁺]_c)가 증가하면서 형광강도가 비교적 천천히 점진적으로 증가하였다. 기본값이 100인 것과 비교해, Aβ를 5 분간 적용했을 때 최대 형광강도는 180까지 증가하였다. 최고에 이른 후, 이 값은 점차적으로 감소하였다. 반면에, 토복령 추출물 (50 ㎍/㎖)을 전처리한 경우, Aβ에 의해 유도되는 [Ca²⁺]_c의 증가는 측정기간 내내 완벽하게 억제되었다.

실험예 5: 토복령 추출물의 글루타메이트 유리 억제효과 측정

글루타메이트는 퇴행성뇌질환에서 신경세포 외로 다량 유리되어 신경세포 사멸을 일으키는 원인물질이다. 세척 및 배양 완충액으로 20 분간 평형화한 후, 신경세포를 10 μM Aβ(25-35) 또는 토복령 추출물 및 Aβ(25-35)를 37 ℃에서 6 시 간 동안 처리하고, 배지를 포집하여 배지 중으로 유리되어 나온 글루타메이트의 양을 전기화학적 검출기 (ECD)가 장착된 HPLC (바스프(BASF) 시리즈, 미국, IN, 라파예트)에 의하여 측정하였다. 즉, 배양 웰로부터 배양액을 수집한 후, 글루타메이트를 OPA/2-머캅토에탄올로 예비-유도체화한 후 분석 칼럼 (ODS2; 입자크기, 5 ㎛; 4.6 ㎜×100 ㎜) 상에서 분리하였다. 유도체를 0.1 ㎂/V에서 전기화학에 의해 검출하고 참조 전극을 0.7 V로 설정하였다. 칼럼을 37% (v/v) HPLC-등급 메탄올과 0.1 M 인산나트륨 완충액을 함유하는 이동상 (pH 5.20)으로 0.5 ㎖/분으로 용출시켰다.

그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, Aβ를 신경세포에 처리하면 대조군 (0.43±0.12 μM)에 비하여 글루타메이트 유리가 증가하여 10 μM Aβ를 처리한 세포에서는 1.16±0.14 μM로 현저히 증가하였다. 이에 비해, 토복령 추출물 처리군 (10, 50 ㎍/㎖)에서는 Aβ에 의해 유도되는 글루타메이트 유리 증가가 강하게 억제되어, 각각 0.56±0.14와 0.47±0.09 μM을 나타내었다.

실험예 6: 토복령 추출물의 활성산소 (ROS) 생성 억제효과의 측정

퇴행성뇌질환에서 신경세포 사멸의 또 하나의 원인으로 다량의 활성산소가 생성됨이 알려져 있다. 따라서, 본 실험예에서는 토복령 추출물의 Aβ에 의한 활성산소 (ROS) 생성 억제효과를 H₂DCF-DA (몰레큘라 프로브즈, Inc.)의 형광 생성물인 2'7'-디클로로플루오레신(dichlorofluorescin) (DCF)의 미세 형광분석법을 이용 하여 측정하였다. 즉, 커버슬립 상에서 성장시킨 신경세포를 무-페놀레드 DMEM으로 3회 세척하고 37 ℃에서 24 시간 동안 10 μM Aβ(25-35) 존재 하에 배양하였다. 이때, 토복령 추출물을 Aβ 처리 15 분 전에 가하여, Aβ로의 배양 기간 중 배지 중에 존재하게 하였다. DMSO에 용해된 H₂DCF-DA (최종 농도, 5 μM)의 획득을 Aβ(25-35)로의 배양 마지막 10 분간 수행하였다. 세척 후, H₂DCF-DA가 로딩된 피질 신경세포를 함유하는 커버슬립을 공촛점 현미경 스테이지에 탑재하고, 신경세포를 488 ㎚의 여기, 510 ㎚의 방사 필터를 사용하는 공촛점 주사 레이저 현미경 (바이오-래드(Bio-rad), MRC1021ES, 영국, 메이랜즈)에 의해 관찰하였다. 한 커버슬립 당 5-6 개소의 이미지를 잡고 각 필드의 각 세포 내에서 측정되는 평균 형광강도를 DCF 형광의 상대적 단위로 표시하였다. 이때 형광강도가 높을수록 활성산소 생성이 증가하였음을 의미한다.

그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, Aβ에 의한 활성산소 생성으로 인하여 형광강도(fluorescence intensity)는 대조세포의 24.5±4.0에서 121.7±7.1까지 약 5배 증가하였다. 이에 비해, 토복령 추출물 (10, 50 ㎍/㎖) 처리 시에는, 형광강도가 각각 58.8과 46.4로 감소되었다.

실험예 7: 토복령 추출물의 캐스파제-3 생성 억제효과의 측정 - 웨스턴 블랏팅

캐스파제-3는 많은 세포나 조직에서 발현되는 32 kDa 프로테아제로서, 여러 다른 자극에 의해 일어나는 고사와 관련되어 있다. 본 실험예에서는 웨스턴 블랏 팅(western blotting) 전기영동법에 의해 고사성 유전자인 캐스파제-3를 측정하였다. 이때, 밴드가 진할수록 캐스파제-3의 생성이 많음을 의미하여 고사가 일어났음을 의미한다.

실험예 2에 기재된 바와 같이 배양된, 배양접시 상의 신경세포를 PBS로 세척하고 PRO-PREP 완충액 (iNtRON 바이오테크놀로지(iNtRON Biotechnology) Inc., 한국, 서울)으로 용해시켰다. 단백질의 양을 라우리(Lowry)법에 의해 측정하였다. 즉, 신경세포 용해물을 증류수로 희석하고, 수적 (200 ㎕)을 1 ㎖의 알칼리성 구리 시약과 함께 10 분간 배양한 후 100 ㎕의 페놀 시약을 가하였다. 30 분 후, 흡광도를 분광광도계 (벡크만(Beckman) DU 650, 미국, CA, 풀러톤) 상에서 750 ㎚의 파장에서 측정하였다. 단백질을 도데실황산나트륨-폴리아크릴아미드 젤 전기영동 (12% 아크릴아미드)에 의해 분리하고 니트로셀룰로스 막으로 옮겨, 캐스파제-3를 토끼 항-캐스파제-3 항혈청 (업스테이트 바이오테크놀로지(Upstate Biotechnology), 미국, NY, 레이크 플래시드)으로 검출하였다. 항원 항체 반응을 호스래디쉬 퍼옥시다제와 포접된 이차 항체 (업스테이트 바이오테크놀로지)와 화학발광 증진 검출시약 (퍼킨 엘머 라이프 사이언시즈(Perkin Elmer Life Sciences) Inc., 미국, MA, 보스톤)을 이용하여 가시화하였다.

그 결과를, 각 밴드의 밀도를 그래프로 도시하면서, 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, Aβ에 의하여 대조세포 (1) 보다 밴드 (2)가 진해졌고, 이는 캐스파제-3의 발현이 많아졌음을 의미하며, 이에 비해 토복령 추출물 (50 ㎍/㎖) 처리 시 이를 억제하고 그 밴드 (3)가 약해졌다.

실험예 8: 토복령 추출물의 뇌경색에 대한 보호효과 측정

300±5 g의 SD 랫트를 1-2% 이소플루란 (N₂O:O₂=4:1)으로 흡입마취한 후, 외과적 수술로 오른쪽 경동맥을 조심스럽게 노출시켰다. 외경동맥에서 중앙부로 분지되는 서혜동맥과 외경동맥에서 내경동맥 쪽으로 분지되는 갑상선 동맥을 전기소작하여 결찰하였다. 내경동맥의 위쪽으로 Y자 모양의 분지가 확인될 때까지 주변을 잘 정리한 후, 외경동맥의 머리쪽 부분을 실로 묶어 혈류 흐름을 차단하고 총경동맥과 내경동맥 사이의 혈류 흐름을 방지하기 위해 위 아래를 클립으로 막았다. 이후 총경동맥에 작은 구멍을 내어 탐침을 삽입한 후 프로브와 외경동맥의 아래 부분을 출혈이 되지 않을 정도로만 실로 살짝 묶은 후 혈류를 막았던 클립을 제거하였다. 탐침을 삽입한 구멍과 외경동맥을 묶은 부분 사이를 자른 후 외경동맥에 삽입된 탐침을 내경동맥 쪽으로 조심스럽게 삽입하였다. 내경동맥 위쪽에서 Y자 모양으로 분지되는 혈관 중 안쪽 혈관으로 탐침을 삽입하였다. 탐침은 총경동맥 분지로부터 20 ㎜만 삽입하였다. 수술 직후 직장체온을 재어 37.5 ℃로 맞추고 이후 6 시간 동안 38±0.5℃로 유지하였다. 결찰(occlusion) 3 시간 후에 탐침을 제거하여 재관류시켰다. 24 시간 후 랫트를 탈골치사시킨 후 뇌를 분리하여 뇌 기질을 이용하여 2 ㎜ 두께로 자른 후 2% TTC 용액으로 37 ℃에서 30 분간 염색한 후 디지털카메라로 촬영하여 이미지 분석 시스템을 이용하여 경색 부피를 측정하였다.

경색 부피 = [(우측 정상조직 부피 - 좌측 정상조직 부피) / 우측 정상조직 부피] ×100

그 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다. 도 7a에 의하면, 좌측 뇌조직은 아무것도 처리하지 않은 상태에서 뇌허혈을 유도하였을 때 뇌경색이 좌측 반구에 하얗게 생겼음을 알 수 있고, 이에 비해 우측 사진의 뇌는 토복령을 동맥 결찰 전 30 분 및 결찰 후 1 시간, 및 결찰 제거 후 1 시간에 경구로 투여하였을 때, 경동맥 결찰에 의하여 유발되는 뇌허혈로 인한 뇌경색을 30 및 50 ㎎/kg의 용량에서 현저히 억제하였다 (도 7b: 대조군; 50.6%, 30 ㎎/kg 투여; 29.5%, 50 ㎎/kg 투여; 31.0%).

본 발명에 따르면, 토복령의 메탄올 추출물은 Aβ에 의해 유도되는 고사성 세포사멸, 세포 내 칼슘농도 증가, 활성산소 생성, 및 캐스파제-3 발현을 현저히 억제하며, 뇌허혈로 인한 뇌경색을 현저히 억제하는 것으로 확인되었다. 따라서, 본 발명의 토복령 메탄올 추출물은 뇌신경 보호제 또는 각종 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제로 유용하게 활용될 수 있다.

Claims

유효성분으로서 토복령(Smilacis chinae rhizome)의 메탄올 추출물을 함유하는 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제.
제1항에 있어서, 알츠하이머병, 파킨슨병, 진행성 핵상마비, 다계통 위축증, 감람핵-뇌교-소뇌 위축증 (OPCA), 샤이-드래거 증후군, 선조체-흑질 퇴행증, 헌팅톤병, 근위축성 측색 경화증 (ALS), 본태성 진전증, 피질-기저핵 퇴행증, 미만성 루이 소체 질환), 파킨스-ALS-치매 복합증, 픽병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 예방 또는 치료하기 위한 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제.
제2항에 있어서, 알츠하이머병, 뇌허혈 및 뇌경색으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 질환을 예방 또는 치료하기 위한 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함하는 뇌신경 보호 또는 퇴행성뇌질환의 예방 또는 치료제.