KR20070110150A - 신경보호 활성을 갖는 오미자로부터 분리한 고미신 ａ를유효성분으로 함유하는 약학 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 오미자나무의 열매로부터 분리한 고미신 A (gomisin-A)를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서 상세하게는 본 발명의 고미신 A를 함유하는 조성물은 뇌허혈에 의해 유도되는 뇌신경세포 손상을 보호하는 효과를 나타내고, 신경행동학적 회복효과실험에서 뛰어난 회복 효과가 있으므로 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 의약품 및 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선을 위한 건강기능식품으로 이용할 수 있다.

고미신 A, 신경세포 보호, 뇌허혈, 퇴행성 뇌질환

Description

신경보호 활성을 갖는 오미자로부터 분리한 고미신 Ａ를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물 {Pharmaceutical composition comprising gomisin-Ａ as an effective ingredient showing neuro-protective activity}

도 1a 및 도 1b는 전뇌허혈을 유발시키지 않은 정상군(sham) 쥐의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌 관상(coronal) 절편을 크레질 바이올렛(Cresyl violet)으로 염색한 다음 현미경으로 촬영한 사진이고,

도 1c 및 도 1d는 전뇌허혈을 유발시킨 7일 후에 20% DMSO를 경구투여한 대조군(control) 쥐의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌 관상(coronal) 절편을 크레질 바이올렛(Cresyl violet)으로 염색한 다음 현미경으로 촬영한 사진이며,

도 1e 및 도 1f는 전뇌허혈을 유발시킨 후 고미신 A(gomisin-A)의 경구투여(30, 10mg/kg) 7일 후에 실험군 쥐의 등쪽 해마(dorsal hippocampus)의 뇌 관상(coronal) 절편을 크레질 바이올렛(Cresyl violet)으로 염색한 다음 현미경으로 촬영한 사진이고,

도 2 는 정상군과 전뇌허혈을 유발시킨 7일 후에 20% DMSO를 경구투여한 대조군(control), 고미신 A의 농도별로 투여한 실험군 쥐의 뇌 해마 CA1영역 세포수를 측정한 결과를 나타낸 그래프이며,

도 3 은 정상군과 전뇌허혈을 유발시킨 대조군(control), 고미신 A를 투여한 실험군 쥐의 신경행동학적 회복효과를 나타낸 도로서, 재관류 후 4일째의 감각 운동 기능 테스트 결과를 정상군, 대조군과 비교한 도이고,

도 4 는 전뇌허혈을 유발시킨 대조군(control), 고미신 A를 농도별로 투여한 실험군 쥐의 체온의 변화를 나타낸 그래프이다.

본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 오미자로부터 분리된 고미신 A (gomisin-A)를 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로서, 본 발명의 조성물은 신경세포의 사멸에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환 등을 예방 및 치료하기 위한 의약품 및 건강기능식품에 관한 것이다.

통계청에서 2003년 10월 발표한 우리나라 노령 인구의 비율을 살펴보면, 우리나라는 지난 2000년 65세 이상 인구가 총인구에서 차지하는 비중이 7.2 %에 이르러 고령화 사회에 들어섰으며, 오는 2019년에는 이 비율이 14 %를 넘어 고령사회에 진입할 것으로 전망되고 있다. 이와 같이 최근 고령화 문제가 사회적인 이슈로 대두됨에 따라 고령인구의 특성이나 주거, 보건, 문화, 여가 등 노인복지 등에 대한 국민의 관심이 높아지고, 이에 대한 통계 수요도 늘어나고 있다. 이러한 변화의 핵심 은 노령화 인구의 증가로 인해서 지난 50여년 간 사망의 주된 원인이 되었던 급성전염성질병보다는 만성퇴행성 질병이 더욱더 큰 문제로 대두되고 있다는 점이다. 특히 만성퇴행성 질병 중에서 뇌혈관질환에 의한 사망은 단일질환에 의한 사망률 중에서 2위를 기록하고 있는 매우 중요한 질환이다.

뇌혈관질환은 크게 2가지 형태로 분류될 수 있다. 하나는 뇌출혈 등에서 볼 수 있는 출혈성 뇌질환이고, 다른 하나는 뇌혈관의 폐쇄 등에 의해 나타나는 허혈성 뇌질환이다. 출혈성 뇌질환은 교통사고 등에 의해서 주로 나타나며, 허혈성 뇌질환은 주로 노령의 사람들에서 자주 나타나는 질환이다.

대뇌에 일시적인 뇌허혈이 유발되는 경우, 산소와 포도당의 공급이 차단되어 신경세포에서는 ATP 감소, 부종(edema)이 발생되며, 결국 뇌의 광범위한 손상이 유발된다. 신경세포의 사멸은 뇌허혈이 있은 후 상당한 시간 경과 후에 나타나는데, 이를 지연성 신경세포사(delayed neuronal death)라고 한다. 지연성 신경세포사는 몽골리안 저빌(Mongolian gerbil)을 이용한 일과성 전뇌 허혈모델(transient forebrain ischemic model)을 통한 실험에서 살펴보면, 5분간 뇌허혈 유도 4일 후 해마(hippcampus)의 CA1 영역에서 신경세포사가 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Kirino T, Sano K. Acta Neuropathol ., 62, pp201-208, 1984; Kirino T. Brain Res., 239, pp57-69, 1982).

지금까지 가장 많은 사람들이 받아들이는 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전으로는 2가지가 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과 도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전(Kang TC, et al., J. Neurocytol., 30, pp945-955, 2001)과 허혈-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인해 생체내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사, 2가지 기전에 있다(Won MH, et al., Brain Res., 836, pp70-78, 1999; Sun AY, Chen YM. J. Biomed . Sci., 5 , pp401-414, 1998; Flowers F, Zimmerman JJ. New Horiz . 6, pp169-180, 1998).

이러한 기전적인 연구를 바탕으로 해서 뇌허혈시에 나타나는 신경세포사를 효과적으로 억제하는 물질을 탐색하거나, 물질에 대한 기전을 밝히는 연구가 많이 수행되고 있다. 그러나 아직까지 효과적으로 뇌허혈에 의한 신경세포사를 억제하는 물질은 거의 없는 실정이다.

지금까지 유일하게 뇌허혈 치료제로 FDA 공인 시판 중인 조직플라즈미겐활성자(tissue plasminogen activator)는 혈전용해제로 뇌허혈을 유발시키는 혈전을 녹여 빠른 산소 및 포도당의 공급을 유도하는 물질이다. 따라서 직접적으로 신경세포를 보호하는 것이 아니기 때문에 빠른 사용이 필요하며, 혈전용해제라는 특징 때문에 과량의 사용이나, 자주 사용시에는 혈관벽이 얇아져 결국 출혈성 뇌혈관질환을 유발하게 된다.

또한 초기의 칼슘 유입을 효과적으로 억제하기 위한 칼슘채널 억제제(Calcium channel blocker)인 MK-801의 경우 임상적 테스트가 실행이 되었으나 그 부작용으로 인해 약물을 폐기한 바 있다.

한편 국내의 경우, 다수의 천연물질이 뇌졸중 예방에 효과가 있는 건강식품으 로 시판되고 있으나 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다. 따라서, 오랫동안 사용되어 그 안전성이 입증된 천연자원들을 객관적으로 검증하여 뇌질환 치료 및 예방효과를 갖는 천연물질을 개발하고자 하는 노력이 시급히 요구된다.

고미신 A는 오미자로부터 분리된 단일물질이며, 오미자는 오미자나무(Schisandra chinensis Baillon)의 열매로서 오미자나무는 낙엽성 목본인 덩굴식물과 붉은색의 과실을 생약재 및 식품원료로 이용하는 주요 약용식물이다. 옛날부터 여러 종류의 식품으로 가공 이용되어 왔으며 식품분야 외에도 한방이나 의학 분야에도 널리 통용되고 있다.

동의보감에는 폐를 보호하고 콩팥을 돕는 목적과 기침멎이약, 수렴약, 자양강장약, 입안갈증해소, 가래멎이 등을 목적으로 달여먹거나 민간요법으로 간기능장애, 기침가래, 소변불통시 오미자가루(종실포함)를 온수에 복용한다고 기록되어 있다. 또한 열매즙은 위운동 장애에 복용하면 항진효과를 나타내 정상 회복시키고, 나무껍질과 잎을 찐 후 그늘에 말려 차로 음용하면 밥맛과 소화를 촉진시킨다고 명시되어 있다(한약[생약]규격집, 2000).

오미자의 일반성분은 수분이 80%, 지방 1%, 단백질 1.2%, 총당함량 14%로 구성되어있으며, 과즙내 당은 과당, 설탕, 포도당, 맥아당이, 유기산은 구연산, 주석산, 사과산, 수산(蓚酸), 호박산, 초산, 젖산이 함유되어있다. 종실에서는 20∼30%의 기름, 수지, 1.6∼2%정유와 리그난 화합물이 분리되며, 기름은 리놀레산 56∼60%, 올레산 28∼34%가 분리된다.

리그난은 시잔드린 A, B, C, 시잔드롤 A와 B, 고미신 B, C, D, F, G, 시잔드렐 A와 B등이 밝혀져 있다. 또한 6.8%의 수지, 약 5%의 사포닌(거품지수1: 200), 아스코르빈산(환원형 215∼581mg%)이 함유되어 있다(NICS online 작물정보센터, 2003).

오미자 과실에 함유된 성분은 주로 리그난(Lignan) 화합물이며, 기름 정유, 색소 등 다양한 성분이 함유되어 있는 것으로 보고되어 있다. 오미자의 리그난 성분은 1961년 코체코브(Kochetkove) 등이 최초로 리그난의 일종인 시잔드린을 분리하였으며 그 이후로 여러 연구자들에 의해 30여종의 리그난이 분리 동정되었다(농촌진흥청 작물과학원, 1999).

오미자에 함유된 여러 가지 리그난 화합물들 중 고미신 A에 대한 분석은 많이 이루어져 있으며 그 정량분석법들도 많이 연구되어져 있다. 특히 고미신 A는 간장보호작용이 있다. 고미신 A는 일본 및 중국 인삼학자들이 오미자의 간장보호효과의 유효성분으로 분리 보고한 성분과 동일성분이라는 것을 밝혀냈다.

그러나 상기 문헌 어디에도 고미신 A가 허혈로 유발된 신경세포를 보호하는 활성을 가지고 있음이 교시되거나 개시된 바 없다.

이에 본 발명자들은 오미자로부터 분리된 고미신 A가 뇌허혈성 신경세포사를 현저히 억제시킬 수 있는 활성을 가짐을 확인하여, 이를 근간으로 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 인체에 무해하며 뇌허혈에 의한 신경세포 손상을 방지할 수 있는 고미신 A(gomisin-A)를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 신경세포보호활성을 갖는 하기 구조식 (1)로 표기되는 고미신 A를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.

(1)

또한 상기 고미신 A는 오미자(Schisandra chinensis Baillon)로부터 분리됨 을 특징으로 한다.

상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의하여 유발되는 것을 특징으로 하며, 신경세포사에 의하여 유발되는 퇴행성 뇌질환으로는 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 및 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병, 바람직하게는 뇌졸중, 중풍, 치매 등의 질환이 포함될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

예를 들어 오미자를 분쇄하고 물, 메탄올 또는 에탄올과 같은 극성용매로 초음파추출한 후에 여과하고, 감압농축 및 동결 건조하여 극성용매에 가용한 조추출물을 수득하는 제 1단계; 상기 조추출물을 물에 현탁하여 순차적으로 헥산, 염화메틸렌의 비극성용매로 녹여 현탁 시킨 후, 분획 및 여과하여 헥산 가용추출물, 염화메틸렌 등의 비극성 용매 가용추출물을 수득하는 제 2단계; 상기 헥산 가용추출물 등의 비극성 용매 가용추출물을 전개용매로서 헥산:아세톤 혼합용매를 전개용매로 하여 고정상으로는 실리카겔(Silica gel 580g, 70-230 mesh)을 사용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 몇 개의 분획물을 얻고 이를 다시 HPLC (Nova-Pak C-18, Φ 2.1 x 150 mm, 온도 30℃, 유속 0.2ml/min, USA)를 이동상(메탄올 : 물 = 70:30 - 85:15)의 조건에서 HPLC를 수행하여 본 발명의 고미신 A를 분리 수득 가능하다.

본 발명은 상기 제법으로 얻어진 고미신 A를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 약학조성물은 고미신 A를 0.01 내지 99 % 함유하는 것이 바람직하 고, 0.1 내지 90 % 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 상기 함유량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 고미신 A를 유효성분으로 포함하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료용 약학조성물을 제공한다.

본 발명의 신경세포사에 의한 퇴행성 뇌질환의 치료 및 예방을 위한 약학조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 화합물을 0.1 내지 50 중량%로 포함한다.

본 발명의 화합물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 화합물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 화합물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 화합물은 1일 0.0001 내지 100mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 10mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 화합물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관 내 (intra-cerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 신경세포 보호활성을 갖는 고미신 A 및 식품학적으로 허용가능한 식품첨가제를 포함하는 퇴행성 질환의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다. 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

본원에서 정의되는 "건강기능식품"은 건강기능식품에 관한 법률 제6727호에 따른 인체에 유용한 기능성을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조 및 가공한 식품을 의미하며, "기능성"이라 함은 인체의 구조 및 기능에 대하여 영양소를 조절하거나 생리학적 작용 등과 같은 보건 용도에 유용한 효과를 얻을 목적으로 섭취하는 것을 의미한다.

또한, 신경세포 보호 및 퇴행성 뇌질환의 예방 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 화합물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제, 액제 등의 형태를 포함한다. 예를 들어, 상기 정제 형태의 건강기능식품은 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 적당한 방법으로 과립상으로 한 다음 활택제 등을 넣어 압축성형하여 조제하거나 정제 형태의 건강기능식품을 그대로 또는 부형제, 결합제, 붕해제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 것을 직접 압축성형하여 만들거나 또는 미리 만든 과립에 건강기능식품을 그대로 혹은 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 다음 압축성형하여 조제하거나 건강기능식품에 부형제, 결합제 또는 다른 적당한 첨가제를 넣어 고르게 섞은 분말을 용매로 습윤시키고, 습윤된 분말을 저압으로 틀에 넣어서 성형한 후, 적당한 방법으로 건조하여 조제한다. 또한, 상기 정제 형태의 건강기능식품에 필요에 따라 교미제 등을 넣을 수 있으며, 적당한 제피제로 제피 가능하다.

상기 캅셀 형태의 건강기능식품 중 경질캅셀제는 보통 캅셀에 건강기능식품 또는 건강기능식품에 적당한 부형제 등을 고르게 섞은 것 또는 적당한 방법으로 입상으로 한 것 또는 입상으로 한 것에 적당한 제피제로 제피한 것을 그대로 또는 가볍게 성형하여 충전하여 조제하며, 연질캅셀제는 보통 캅셀에 건강기능식품 또는 건강기능식품에 적당한 부형제 등을 넣은 것을 젤라틴 등 적당한 캅셀기제에 글리세린 또는 소르비톨 등을 넣어 소성을 높인 캅셀기제로 피포하여 일정한 형상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 상기 캅셀기제에 착색료 보존료 등을 첨가할 수 있다.

환형태의 건강기능식품은 보통 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 구상으로 성형하여 조제하며, 필요에 따라 백당이나 다른 적당한 제피제로 제피를, 또는 전분, 탈크 또는 적당한 물질로 환의를 입힐 수도 있다.

과립형태의 건강기능식품은 보통 건강기능식품을 그대로 또는 건강기능식품에 부형제, 결합제, 붕해제 등을 넣어 고르게 섞은 다음 적당한 방법으로 입상으로 만들고 될 수 있는 대로 입자를 고르게 한 것이며, 필요에 따라 착향료, 교미제 등을 넣을 수 있다. 과립형태의 건강기능식품은 12호 (1680 ㎛), 14호 (1410 ㎛) 및 45호 (350 ㎛) 체를 써서 다음 입도시험을 할 때에 12호체를 전량 통과하고 14호체에 남는 것은 전체량의 5.0 %이하이고 또 45호체를 통과하는 것은 전체량의 15.0 %이하이어야 한다.

본원 발명의 상기 부형제, 결합제, 붕해제, 활택제, 교미제, 착향료 등에 대한 용어 정의는 당업계에 공지된 문헌에 기재된 것으로 그 기능 등이 동일 내지 유사한 것들을 포함한다 (대한약전 해설편, 문성사, 한국약학대학협의회, 제 5 개정판, p33-48, 1989).

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 화합물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아 스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다.

상기 외에 본 발명의 화합물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 화합물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 화합물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

본 발명의 고미신 A는 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 하기의 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 오미자로부터 고미신 A의 성분분리

본 발명은 조성물의 표준화와 안정성을 확보하기 위해 HPLC를 이용하여 정성, 정량분석을 실시하였다. 오미자 20kg (2005년 6월 15일, 유성 회춘당한약방)에 메탄올을 가하여 80℃에서 2번 환류 추출한 후 여과하였다. 여과액을 40~45℃에서 감압 농축하여 메탄올 엑스 4.5kg을 얻었다. 메탄올 엑스를 증류수 2L에 현탁시킨 후 헥산(hexane), 에틸아세테이트(EtOAc) 및 부탄올(BuOH)로 순차적으로 분획하였다. 각 분획물들을 농축하여 그 중 헥산(hexane) 분획물 512g 을 실리카겔 컬럼(silica gel column)에 걸어 헥산-아세톤(hexane-acetone)을 전개용매로 하여 극성을 높이면서 크로마토그래피(chromatography)를 실시하여 6개의 소분획 (H1~6)으로 나누었다. 6개의 소분획 (H1~6)중 H5를 실리카겔 컬럼(silica gel column)에 걸어 헥산-에틸 아세톤(hexane-ethyl acetone) 6:1 로 용출시켜 H5.1과 H5.2를 얻었고 H5.1로부터 고미신 A를 분리하였다.

분리된 고미신 A는 HPLC (Nova-Pak C-18, Φ 2.1 x 150 mm, 온도 30℃, 유속 0.2ml/min, USA)를 UV 254nm에서 실시하여 메탄올 : 물 (70:30 - 85:15)의 조건에서 시료 0.5mg을 메탄올 1mL에 녹여 스톡 용액(stock solution)을 조제하였다. 이것에서 10L를 정확히 취하여 HPLC에 주입하여 얻은 크로마토그램 피크범위(chromatogram peak area)로부터 순도를 얻었다. 순도는 3번 실험하여 얻은 평균값으로 나타내었다. 분리한 고미신 A의 순도는 95.9~99.0%였다.

이렇게 분리된 고미신 A를 LC/MS/MS를 사용하여 분석하였는데 13.27분에 고미신 A(gomisin A)가 용리되었다. 또한 제반 파라미터(parameter)의 측정으로 분석조간의 발리데이션(validation)을 입증하였다. 그리고 오미자의 조추출물에 대한 분석결과 주요 성분인 고미신 A(gomosin A)의 존재를 MRM모드로 확인하였다. 고미신 A의 물성치는 하기 표 1에 나타내었다.

고미신 A에 대한 물성치

기원	오미자 [Schizandra chinensis (Schizandraceae)]
분자량	C23H28O6 (416)
용해도	DMSO, 에탄올, 메탄올, 클로로포름에 가용성 (Soluble in DMSO, EtOH, MeOH, CHCl3)

실험예 1. 흰쥐의 뇌허혈 유발

고미신 A의 신경세포 보호효과를 확인하기 위해 1979년 펄시넬리(Pusinelli)가 개발한 4-혈관폐색(4-vessel occlusion)모델을 사용하여 하기와 같이 실험하였다(Pulsinelli WA, Brierley JB. stroke, May-Jun;10(3):267-72, 1979 ).

상기 모델은 뇌허혈로 인한 신경세포 고사의 대표적인 동물모델로서 흰쥐의 뇌에 혈액을 공급하는 혈관들을 일시적으로 차단한 후 재관류하게 되면 주로 뇌 등쪽 해마(dorsal hippocampal) CA1 부분의 신경세포가 손상을 입게 되는 원리를 사용한 것으로서, 상기 모델에서 신경세포 괴사 방지효과를 나타내는 약물들은 사람의 중풍 모델과 유사한 국소허혈 동물모델에 효과가 있는 것으로 알려져 있고, 임상 효과도 상당히 확보할 수 있기 때문에 중풍실험을 위한 모델로 각광받고 있다. 또한 전뇌허혈(forebrain ischemia) 모델로 후뇌의 혈류가 영향을 받지 않아 호흡과 체순환에 영향을 미치지 않는 장점이 있다.

실험동물 180g 내외의 위스터계(Wister) 5주령 수컷 흰쥐를 일본(SLC, Japan)에서 수입하여 사료와 물을 충분히 공급하면서 1주일간 실험환경에 적응시킨 다음 실험에 착수하였다. 흰쥐를 마취시킨 다음 정위고정장치(stereotaxic apparatus)에 수평면에서 머리를 기준으로 하여 꼬리를 30。 경사지게 밑으로 고정시키고 코와 입 주위는 마취기(Ohameda V.M.C./Boc Health Care, Cyprane, UK)에 플라스틱 원추흡입기(cone)로 연결시켰다. 마취는 처음에 질소와 산소의 혼합가스(질소 70 %, 산소 30 %)에 포함된 5 % 이소플루레인(isoflurane)으로 하고 그 후에는 1.5 % 이소플루레인으로 계속 유지시켰다.

꼬리를 수술대에 고정하고 경추를 신전시킨 상태로 실험하였다. 먼저 후두골부위를 수술하였다. 후두골하단의 1번 경추부를 수술확대경을 이용하여 수술하고 우상공(羽狀孔, alar foramina) 쪽으로 근육이 다치지 않게 접근하였다. 1 ㎜ 이하의 미세한 전기소작침을 1번 경추의 우상공(alar foramina)을 통하여 밑으로 척추동맥이 통과하고 있는 터널로 집어넣어, 간헐적인 전류를 통전시켜 척추동맥을 소작하였다. 수술현미경을 이용하여 뼈 속으로 지나가는 터널에 존재하는 척추동맥이 완전히 소작되어서 폐쇄되었다는 것을 확인한 다음 수술용 클립으로 봉합하였다. 그 다음 흰쥐를 돌려 인후(咽喉)부위를 수술하기 위하여 총경동맥에 수술용 실로 고리를 만들어 허혈을 유발하고 재관류할 수 있도록 장치하였다. 그리고 허혈유발시 미세혈관의 순환을 봉쇄하기 위하여 실로 뒤쪽으로는 기관(氣管, trachea), 식도(esophagus), 외부 경정맥(external jugular vein), 총경동맥(common carotid arteries) 들이 위치하고 앞쪽으로는 경부(cervical), 척추주위(paravertebral) 근육들이 지나가도록 꿰뚫은 다음 수술용 클립으로 상처를 봉합하였다.

24시간 뒤, 수술용 클립을 제거한 다음 총경동맥을 동맥류(動脈瘤, aneurysm) 클립으로 10분 동안 조여서 허혈을 유발하였다. 만약 1분 이내에 대광반사가 소실되지 않으면 경부봉합을 단단하게 하였고 이 때 대광반사가 소실되지 않은 흰쥐들은 완전한 양측 평행적인 CA1 신경손상이 유발되지 않았기 때문에 이 실험에서 제외시켰다. 또 경련을 일으키는 흰쥐들도 제외시켰다. 10분 후 총경동맥에서 동맥류(aneurysm) 클립을 떼어 내어 재관류 시켰다. 또 재관류시킨 다음 의식 소실 기간이 20± 5분인 흰쥐들만 실험에 사용하였다.

상기 과정에서 정상군에서는 해마의 신경세포들이 정상적으로 관찰되었으며(도1a, 1b 참조), 대조군의 경우 조직이 이완되면서 세포들이 주변 세포로부터 유리되는 현상과 세포체가 본래의 추체상을 형태를 잃고 응축되어 단일 세포의 형태로 되어있음을 확인할 수 있었다. 또한 핵 염색질이 농축되고 핵막이 붕괴되는 현상이 관찰됨으로서 세포고사(apoptosis)가 이루어졌음을 확인할 수 있었다(도 1c, 1d 참조).

실험예 2. 고미신 A의 경구투여

시료의 투여와 실험군의 설정-흰쥐의 전뇌허혈(forebrain ischemia)에 대한 고미신의 효능을 측정하기 위하여 문헌에 기재된 실험방법을 응용하여 하기와 같이 용량별로 실험을 수행하였다(Pulsinelli WA, Brierley JB. stroke, May-Jun;10(3):267-72, 1979 ).

투여시간은 허혈유발 후 20분에 경구투여 하였다. 고미신 A를 20%의 DMSO에 녹여서 각 10mg/kg, 30㎎/㎏의 용량으로 동일부피를 경구 투여하였다. 제1군은 정상군(僞裝群, sham group)으로 수술과정은 같게 하였지만 전뇌허혈(forebrain ischemia)은 일으키지 않았다. 제2군은 대조군(control)으로 전뇌허혈을 유발시킨 후 시료투여와 같은 시간간격으로 DMSO 20%를 경구 투여하였다. 제3, 4군은 각각 고미신 A를 10mg/kg, 30㎎/㎏의 농도로 허혈유발 후 20분에 경구 투여하였다. 그 결과 대조군은 정상세포수 대비 23%의 세포생존율을 나타낸 것에 반해 농도별 고미신 A 투여군 (10, 30mg/kg)은 각각 50%, 64.7%의 세포생존율을 나타내었다(도 1e, 1f, 도2 참조).

실험예 3. 고미신 A 투여에 따른 뇌허혈 흰쥐의 체온 변화

뇌허혈시 체온 저하는 뇌 해마내의 신경세포 손상을 방지함으로써 신경방어 효과를 나타내기 때문에 (Busto et al, J. Cereb . Blood Flow Metab . 7, pp720~738, 1987) 흰쥐에 뇌허혈을 유발한 후 대조군(control)과 실험군의 체온을 허혈유발 후 2시간까지는 30분 간격으로, 3시간째부터 6시간까지는 1시간 간격으로 모니터링 하였다. 체온하강이 나타나는 경우에는 부분적으로 체온저하를 방지하면서 저체온으로 인한 신경세포의 방어효과를 차단하면서 실험하였다. 흰쥐들에 허혈을 유발시키는 동안과 재관류 및 회복기 동안 37± 0.5 ℃으로 유지시키기 위하여 직장 온도를 이용한 자동 온도 조절 전열기로 37 ℃로 고정시켜서 실험하였다. 체온측정은 직장속으로 최소한 6 ㎝ 들어가게 소식자(消息子, probe)를 삽입함으로써 뇌온도를 반영하는 직장체온을 측정하였다(Miyazawa T et al. J. Cereb . Blood Flow Metab , 12, pp817-822, 1992).

그 결과 고미신 A를 투여한 군에서는 체온이 강하하지 않았음을 관찰하였다(도 4 참조).

실험예 4. 조직 관찰

허혈유발 1주일 후에 흰쥐를 클로랄 하이드레이트(35.0 ㎎/㎏, i.p.)로 마취시켜 개흉한 다음, 우심이를 절개하여 바늘을 좌심실에 주입한 후 헤파린 처리된 5% 소디움니트라이트 생리식염수를 심장에 관류시키고, 4.0 % 파라포름알데하이드 고정액으로 관류시켰다. 그 후 흰쥐의 뇌부분을 떼어내어 2시간 동안 0.1 M 포스페이트 완충된 파라포름알데하이드 고정액에 후고정 시킨 다음, 30 % 수크로스에 담가 4℃에서 하룻밤 동안 고정시켰다. 고정된 뇌에서 정수리점(Bregma) -2.5 ㎜와 -4.0 ㎜사이의 등쪽 해마(dorsal hippocampus) 부위에 있는 관상봉합부 조각(coronal block)을 준비하였다. 이 조각을 동결한 후 슬라이딩 마이크로톰을 사용하여 해마를 포함하는 조직절편을 만들었다. 표본제작을 위한 조직절편은 매 20 ㎛씩 수집하였다.

손상된 신경세포수 관찰-등쪽 해마(Dorsal hippocampus)를 포함하는 절편을 크레실 바이올렛에 염색하여 고정한 다음 등쪽 해마(dorsal hippocampal) CA1 중 가장 지연성 신경원세포 사망(delayed neuronal death)에 손상받기 쉬운 부분인 (Crain BJ et al., Neuroscience, 27, pp387-402, 1988) 중간대(middle zone)의 1,000 ㎛ 길이에서 신경세포 수를 관찰하였다. 세포수의 관찰은 고배율(× 250)에서 정상적인 형태를 보이는 추체세포(pyramidal cell)의 수를 3인의 관찰자가 한 개의 뇌조직에서 3개의 다른 조직절편의 좌우양측 2개, 총 6부위에서 관찰하여 평균하였다(도 2 참조).

그 결과, 정상군에서는 평균 374개의 세포수가 관찰된 데 반해 대조군에서는 85.9개로 정상군에 비해 22.9%의 세포생존율을 보였다. 고미신 A (10mg/kg, 30㎎/㎏) 투여군에서는 각각 187.3개와 242개의 세포수가 관찰되어 대조군에 비해 10mg/kg 경구투여에서 50%, 30㎎/㎏투여에서는 64.7%의 유의성있는 세포포호 효과가 관찰되었다 (p < 0.05).

실험예 5. 고미신 A의 신경행동학적 회복 효과 검증

상기 실험예 1과 동일한 방법으로 처리된 백서의 신경행동학적 회복효과를 헬렌 호지(Helen Hodges) 등의 Y-Maze 방법으로 측정하였다.(Helen Hodges et al., Brain Research, 111, pp213-221, 2000)

검은 아크릴판으로 규격에 맞추어 제작한 Y자 모양의 사방이 꽉 막힌 미로에서 세 개의 암을 각각 A, B, C로 정한 후에 8분 동안 흰쥐가 A, B, C의 암을 왕래하는 것을 세어 측정하였다. A, B, C를 연속으로 각각 한번씩 왕래하면 1점이고 A, B, C를 연속으로 왕래하지 않으면 점수를 부여하지 않았다. 이렇게 측정된 점수를 총 왕래한 횟수에서 2를 뺀 수로 나누어 확률로 환산한 것을 실제 점수로 산정하여 하기 수학식 1의 계산식을 통해 구하였다.

상기의 평가 점수 방법에 따라 정상군, 대조군과 고미신 A 투여군의 최종적인 신경행동학적 점수를 도 3에 나타내었다. 정상군에서는 68.9%의 정확성을 보인 반면 대조군에서는 7.6%의 정확성 보여 정상군과 확연한 차이를 확인하였고, 고미신 A 30mg/kg를 경구투여한 실험군에서는 41.8%의 정확성을 보여(p < 0.005) 유의성있는 신경보호효과를 보였다(도 3 참조).

본 발명의 화합물을 포함하는 약학 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

고미신 A 300 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

고미신 A 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

고미신 A 50 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

통상의 캡슐제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

고미신 A 50 mg

주사용 멸균 증류수 적량

pH 조절제 적량

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당(2 ㎖) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

고미신 A 1000 ㎎

설탕 20 g

이성화당 20 g

레몬향 적량

정제수를 가하여 전체 1000 ㎖로 맞추었다. 통상의 액제의 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 갈색병에 충전하고 멸균시켜 액제를 제조하였다.

제제예 6. 건강 식품의 제조

고미신 A 1000 ㎎

비타민 혼합물 적량

비타민 A 아세테이트 70 ㎍

비타민 E 1.0 ㎎

비타민 B₁ 0.13 ㎎

비타민 B₂ 0.15 ㎎

비타민 B₆ 0.5 ㎎

비타민 B₁₂ 0.2 ㎍

비타민 C 10 ㎎

비오틴 10 ㎍

니코틴산아미드 1.7 ㎎

엽산 50 ㎍

판토텐산 칼슘 0.5 ㎎

무기질 혼합물 적량

황산 제1철 1.75 ㎎

산화아연 0.82 ㎎

탄산마그네슘 25.3 ㎎

제1인산칼륨 15 ㎎

제2인산칼슘 55 ㎎

구연산칼륨 90 ㎎

탄산칼슘 100 ㎎

염화마그네슘 24.8 ㎎

상기의 비타민 및 미네랄 혼합물의 조성비는 비교적 건강식품에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 건강식품 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 과립을 제조하고, 통상의 방법에 따라 건강식품 조성물 제조에 사용할 수 있다.

제제예 7. 건강 음료의 제조

고미신 A 1000 ㎎

구연산 1000 ㎎

올리고당 100 g

매실농축액 2 g

타우린 1 g

정제수를 가하여 전체 900 ㎖

통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2 ℓ용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.

상술한 바와 같이, 본 발명의 신경세포 보호활성을 갖는 고미신 A(gomisin-A)를 유효성분으로 함유하는 조성물은 뇌허혈시 발생되는 신경세포사를 저해하는 효과가 탁월할 뿐만 아니라 신경손상으로 인한 감각운동 기능의 실조에 대한 보호 효과를 확인함으로써, 신경세포의 괴사에 의해 발생되는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 약학조성물 또는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품으로서 이용될 수 있다.

Claims (5)

1. 신경세포 보호활성을 갖는 고미신 A(gomisin-A)를 유효성분으로 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의하여 유발되는 뇌졸중, 중풍, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 피크(Pick)병 또는 크로이츠펠트-야콥(Creutzfeld-Jakob)병인 약학 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 고미신 A(gomisin-A)는 오미자(Schisandra chinensis Baillon)로부터 분리됨을 특징으로 하는 약학 조성물.
4. 신경세포 보호활성을 갖는 제 1항의 고미신 A를 함유하는 퇴행성 뇌질환의 예방 및 개선용 건강기능식품.
5. 제 4항에 있어서, 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제인 건강기능식품.

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