KR20070108693A - 김치로부터 분리된 유산균 및 이로부터 얻어지는 엑소폴리사카라이드 - Google Patents
김치로부터 분리된 유산균 및 이로부터 얻어지는 엑소폴리사카라이드 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하며 pH 3.0 내지 pH 5.0의 산성 환경에서 생존할 수 있고 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지며 생균활성을 갖는 루코노스톡속 균주(Leuconostoc sp.), 상기 균주가 생산하는 엑소폴리사카라이드와 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법, 및 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어진 군에서 선택되는 적어도 하나를 활성성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)에 관한 것이다.
본 발명에 따른 균주는 엑소폴리사카라이드를 생성하고, 장내생존율도 뛰어나므로 생균활성제(probiotics)로서 우수하며, 상기 엑소폴리사카라이드는 물성기능소재뿐만 아니라 생리기능소재로 다양한 산업분야에 이용될 수 있다.
Description
도 1은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 그람염색사진이고,
도 2는 본 발명의 일실시예에 따른 16S rDNA 증폭용 프라이머쌍이며,
도 3은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2의 16S rDNA의 염기서열이고,
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 시트리움 C3의 16S rDNA의 염기서열이며,
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 16S rDNA의 염기서열이고,
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 16S rDNA의 염기서열을 기초로 한 다른 세균(bacteria)과의 계통발생론적 관계를 나타내는 표이며,
도 7은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 배양시간에 따른 생육도를 흡광도 를 이용하여 측정한 생육곡선이고,
도 8은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 배양배지의 NaCl 농도에 따른 생육도를 흡광도를 이용하여 측정한 생육곡선이며,
도 9는 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 배양배지의 초기 pH에 따른 생육도를 흡광도를 이용하여 측정한 생육곡선이고,
도 10은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 pH 3.0의 배양배지에서의 단순 산성pH에 대한 내성을 측정한 그래프이며,
도 11은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 pH 3.0의 인공위액에 대한 내성을 측정한 그래프이고,
도 12는 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 0.3% 황소의 담즙이 함유된 인공담즙에 대한 저항성을 측정한 그래프이며,
도 13은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 0.5% 황소의 담즙이 함유된 인공담즙에 대한 저항성을 측정한 그래프이고,
도 14는 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이아이 GJ2, 루코노스 톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 pH 3.0의 인공위액을 이용한 전처리 후의 0.3% 황소의 담즙이 함유된 인공담즙에 대한 저항성을 측정한 그래프이며,
도 15는 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 엑소폴리사카라이드의 산 가수분해물의 TLC 분석 결과이고,
도 16은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 엑소폴리사카라이드의 산 가수분해물의 HPLC 분석 결과이며,
도 17은 본 발명의 일실시예에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2의 엑소폴리사카라이드의 GPC(Gel Permeation Chromatography) 분석결과이고,
도 18은 본 발명의 일실시예에 따른, 5% 수크로스가 함유된 수크로스 고체배지에서 48시간 배양한 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11가 생성하는 각각의 엑소폴리사카라이드의 형태를 나타내는 사진이며,
도 19는 본 발명의 일실시예에 따른, 5% 수크로스가 함유된 수크로스 고체배지에서 48시간 배양한 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11가 생성하는 각각의 엑소폴리사카라이드의 형태를 도식화하여 나타낸 것이다.
[발명이 속하는 기술분야]
본 발명은 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharides, EPS)를 생성하며, pH 3.0 내지 pH 5.0의 산성 환경에서도 생존할 수 있고 장내환경에서 생존 가능한 생균활성을 갖는 루코노스톡속 균주(Leuconostoc sp.), 상기 균주가 생산하는 엑소폴리사카라이드와 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법, 및 상기 균주, 이의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 적어도 하나를 활성성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics)에 관한 것이다.
[종래기술]
유산균(lactic acid bacteria, LAB)은 자연계에 널리 분포하고 탄수화물을 혐기적으로 이용하여 젖산을 생성하는 미생물로서 유제품, 육류, 야채 등의 다양한 발효 가공에 종균으로 사용 되고 있으며, 식품의 보존성 향상뿐만 아니라 관능적 특성 및 영양적 가치에도 기여하고 있다. 또한 일부의 유산균속에서는 엑소폴리사카라이드를 생합성하여 제품의 조직과 점성향상에도 기여하고 있다[An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria. International Dairy Journal. 12:163-171(2002)]. 유산균이 생산하는 엑소폴리사카라이드는 특히, 유산균 발효유제품에서 큰 문제점이었던 유청분리 현상을 완화시키고 점성을 증가시키며 조직을 부드럽게 하여 섭취시 구강 내 포만감과 조직감을 부여해준다[Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: perspectives and challenges. Trends in Biotechnology. 21(6):269-274(2003)].
엑소폴리사카라이드는 세포벽의 일부로서 세포벽 주위에 협막을 형성하거나 발효 중에 세포벽 외부에 점액형태(slime type)로 축적되는 미생물 다당류로, 1차 또는 2차 대사산물이다[Isolation of Exopolysaccharide Producing Enterobacter sp. and Physicochemical Properties of the Polysaccharide Produced by This Strain. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 16(4):370-375 (2001)]. 엑소폴리사카라이드는 에너지원으로 이용되는 물질은 아니며 건조, 식균작용, 원생동물의 습식, 항생제, 독성화합물, 삼투압 스트레스 등과 같은 외부환경으로부터 자신을 보호하는 등 미생물의 생존과 관련된 여러 가지 기능을 수행하고 있는 물질로 알려져 있다[Studies on the Properties of the Stirred Yogurt Manufactured by Exopolysaccharide Producing Lactic Acid Bacteria. Korean J. Food Sci. Ani. Resour. 25(1):84-91(2005)]. 엑소폴리사카라이드는 물에 녹거나 분산되는 긴 사슬의 고분자 중합체이며 식가공품에서 농후제 또는 겔링화와 관련하여 중요한 역할을 한다. 엑소폴리사카라이드는 실제적 측면에서 미생물이 가장 다량으로 생성하는 다당류고, 배양액으로부터 회수가 쉬우며, 정제비용이 적게 들어 상업적인 잠재력이 가장 높은 다당류이다[Novel and established applications of microbial polysaccharides. Trends in Biotechnology. 16:41-46(1998)].
유산균에 의해 생성된 엑소폴리사카라이드는 그 균종에 따라 구성당의 종류와 비율이 서로 다르다는 것이 이미 보고되어있다.
유산균생성 엑소폴리사카라이드의 분류는 호모폴리사카라이드(homopolysaccharides)와 헤테로폴리사카라이드(heteropolysaccharides)의 두 그룹으로 구분된다. 호모폴리사카라이드는 주로 프룩토오스(fructose)와 글루코오스와 같은 한 가지 형태의 단당으로만 구성되어 있는 것을 지칭하며, 그 종류로는 Streptococcus salivarius와 Streptococcus mutans에 의한 프룩탄 형(fructans type)의 레반(levan)과 이눌린(inulin)이 있으며, 글루칸 형(glucans type)으로 Leuconostoc mesenteroides subsp. mesenteroides와 Leu . mesenteroides subsp. dextranicum에 의해 생산된 덱스트란(dextran)과 Leu . mesenteroides에 의한 알터난(alternan) 및 Streptococcus mutans와 Streptococcus sobrinus에 의해 생산된 뮤탄(mutan)이 여기에 속한다[Novel and established applications of microbial polysaccharides. Trends in Biotechnology. 16:41-46(1998)]. 헤테로폴리사카라이드는 두 가지 또는 그 이상의 다른 종류의 단당들로 구성되어 있으며, 주요 구성당으로 글루코오스, 갈락토오소(galactose), 프룩토오스(fructose) 및 람노스(rhamnose)가 서로 다른 비율로 결합을 이루고 있다. 소수의 경우 N-아세틸글루코사민(N-acetylglucosamine), N-아세틸갈락토사민(N-acetylgalactosamine), 글루쿠론산(glucuronic acid)과 인산아세틸글리세롤(phosphate acetyl glycerol)과 같은 당이 아닌 물질들이 결합을 형성하는 경우도 있다. 주로 Lactococcus lactis subsp. lactis , Lactobacillus casei , Lactobacillus sake 등의 중온성 유산균들과 Lactobacillus acidophilus , Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgalicus , Streptococcus thermophilus 등의 고온성 유산균들에 의해 생산된다.
최근에 와서는 엑소폴리사카라이드가 과거의 단순물성기능소재로서가 아니고 생체 중요 정보물질로서의 생리기능소재로서 주목받고 있다. 유산균 중 Bifidobacteria의 엑소폴리사카라이드와 Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgalicus , Lactobacillus helverticus var. jugurti로부터 유래한 엑소폴리사카라이드들이 항암효과가 있다고 보고 되었다[Optimization of exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR grown in a semidefined medium. Appl. Environ. Microbiol. 64:659-664(1998)]. 또한, Streptococci로부터 생산된 엑소폴리사카라이드의 경우 면역학적 효과가 있다고 하였고, 항궤양 효과와 콜레스테롤 저하 활성에 대한 보고도 있다[Exocellular polysaccharide production by Streptococcus thermophilus. Biotechnol. Lett. 10:255-260(1998)].
더구나, 이러한 미생물성 엑소폴리사카라이드는 산업적 이용의 높은 잠재력과 함께, 배양조건 및 생산조건을 개선하여 생산성을 높일 수 있으며, 단기간에 발효조를 이용한 연속배양에 의해 대량생산이 가능하고 생산된 엑소폴리사카라이드의 분리, 회수가 용이하기 때문에 현재 주목받고 있다.
지금까지 유산균으로부터 생성된 엑소폴리사카라이드에 관한 많은 연구가 이루어졌으나 대부분의 연구가 요구르트와 치즈 등과 같은 발효유제품의 물성기능소재로서의 종균이용에 관한 것이거나 엑소폴리사카라이드 생산균주의 탐색이나 특성에 관한 연구도 거의 발효유제품에서 분리한 유산균에 국한되어왔다. 채소발효식품, 특히 김치에서 분리한 경우는 동치미에서의 고활성 덱스트란 수크레이 스(dextran sucrase)를 생성하는 Leuconostoc mesenteroides[(Strain Selection of Psychrotrophic Leuconostoc mesenteroides Producing a Highly Active dextran sucrase from Kimchi. Korean J. Food Sci. Technol. 34(6):1085-1090(2002)]와 김치로부터 덱스트란을 생성하는 Leuconostoc lactis의 분리에 관한보고[Isolation of dextran-producing Leuconostoc lactis from Kimchi. Journal of Microbiology. 39(1):11-16(2001)]정도이다.
김치발효과정에 관여하는 유산균은 항균작용[Physicochemical Characteristics of Yogurt Prepared with Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi. Korean J. Food Culture. 20(3):337-340(2005)], 면역기능 강화, 혈중 콜레스테롤 저하, 간 기능 항진작용, 항암작용, 항산화작용 등의 다양한 건강 증진 기능이 보고되고 있다.
최근에는 유산균 특징 중에 생균활성제라는 기능적인 측면에 관심이 모아지고 있다. 생균활성제는 살아있는 균주를 섭취한다는 점에서 항생제의 사용으로 야기될 수 있는 잔류 및 내성문제를 해결하는 항박테리아제로 장내 미생물군의 균총 유지와 대장균의 감소를 통한 성장촉진을 유도할 수 있다[Isolation and Characterization of Acid- and Bile-Tolerant Isolates from Strains of Lactobacillus acdophilus. Journal of Dairy Science. 82:23-31(1999)., Physicochemical Characteristics of Yogurt Prepared with Lactic Acid Bacteria Isolated from Kimchi. Korean J. Food Culture. 20(3):337-340(2005)]. 따라서 생균활성제의 기능성을 지니는 유산균들을 김치 담금 시 종균으로 이용하면 정장작 용을 높일 수 있을 것이다.
본 발명은 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하며 pH 3.0 내지 pH 5.0의 산성 환경에서 생존할 수 있고 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지며, 생균활성을 갖는 루코노스톡속 균주를 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 김치로부터 분리된 유산균으로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드 및 상기 유산균을 이용하여 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하며, 위 및 장에서 생존 가능하고, 특히, pH 3.0 내지 pH 5.0의 산성 환경에서도 생존할 수 있고, 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지며 생균활성을 갖는 루코노스톡속 균주에 관한 것이다. 상기 루코노스톡속 균주의 예로 본 발명은 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하는 루코노스톡 김치아이 GJ2를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 유산균으로부터 생산되는 엑소폴리사카라이드 및 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 김치로부터 분리된 유산균 중에서 극한 생존환경에서 자기 방어 물질로 작용하는 엑소폴리사카라이드를 생성하는 유산균은 낮은 pH의 위산에서와 소장에 분비된 담즙에서 생존하여 생균활성제로 기능할 수 있다는 것에 착안하 고, 김치로부터 분리된 유산균 중 엑소폴리사카라이드를 생성하는 유산균주를 선별하고, 내산성, 인공위액 및 인공담즙 저항성 시험을 통하여 정장의 효과 유무를 조사하여 본 발명을 완성하였다.
또한 본 발명자들은 기능성 물질로서 상기 균주로부터 생산되는 엑소폴리사카라이드를 분리, 정제하고 그 특성을 규명하여 본 발명을 완성하였다.
또한 본 발명자들은 상기 균주를 통한 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법을 개발하여 본 발명을 완성하였다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
우선, 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하며, 위 및 장에서 생존 가능하고, 특히, pH 3.0 내지 pH 5.0의 산성 환경에서도 생존할 수 있으며, 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지며 생균활성을 갖는 루코노스톡속 균주를 제공한다. 상기 균주는 바람직하게는 루코노스톡 김치아이 GJ2(Leuconostoc kimchii GJ2), 루코노스톡 시트리움 C3(Leuconostoc citreum C3) 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11(Leuconostoc mesenteroides C11)이며, 더욱 바람직하게는 루코노스톡 김치아이 GJ2이다.
상기 루코노스톡 김치아이 GJ2(Leuconostoc kimchii GJ2)는 대전광역시 유성구 어은동 52번지 305-333에 위치한 한국생명공학연구원에 2006년 3월 14일자로 기탁 되어, 수탁번호 KCTC 10921BP를 부여받았다.
루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11는 김치로부터 분리한 유산균으로, 그람 양성이며 점성집락(mucoid colony)을 나타내는 점질균이다. 상기 루코노스톡 김치아이 GJ2 및 루코노스톡 시트리움 C3의 콜로니는 둥근형으로 표면은 매끈하고 우유빛을 나타내며, 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 콜로니는 둥근형으로 표면은 매끈하고 흰빛을 나타낸다.
16S rDNA 염기서열 분석결과, 본 발명의 분리된 루코노스톡 김치아이 GJ2는 루코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii) AF179386과 99%의 높은 상동성을 나타낸다. 한편, 루코노스톡 시트리움 C3는 Leuconostoc citreum AF111949와 99%의 높은 상동성을 나타내며, 루코노스톡 메센테로이데스 C11는 Leuconostoc mesenteroides AB023246과 99%의 상동성을 나타낸다.
본 발명인 루코노스톡 김치아이 GJ2는 엑소폴리사카라이드를 생성하며, NaCl 농도 0%에서 3%범위에서 잘 생육하고, pH 6.0에서 pH 10.0의 배지에서도 잘 생육하며 특히 생육 최적 pH가 pH 10.0으로 알카리 영역에서 가장 잘 생육한다. 한편, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11도 NaCl 농도 0%에서 3%범위에서 잘 생육한다. 또한, 루코노스톡 시트리움 C3는 pH 6.0에서 pH 7.0의 배지에서 잘 생육하며, 생육 최적 pH는 pH 7.0이고, 루코노스톡 메센테로이데스 C11는 pH 6.0에서 pH 10.0의 배지에서 잘 생육하며, 특히 생육 최적 pH는 pH 7.0이다.
또한, 본 발명은 김치로부터 분리된 루코노스톡속 균주로 엑소폴리사카라이드를 생성하는 균주, 이의 배양액, 배양액의 농축액 또는 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 1종 이상 선택된 것을 활성성분으로 포함하는 생균활성제를 제공한다. 본 발명에서 생균활성제란 사람과 가축의 장내 미생물 균총의 개선으로 건강에 유익한 효능을 갖는 생균제재를 의미한다. 미생물이 생균활성제로 기능하기 위 해서는, 장내 생존력이 좋아 섭취 후 일정기간 그 활성이 유지되어야 하며, 많은 종류의 유해균의 증식 속도가 빠르기 때문에 섭취된 생균의 활성화 속도가 빨라야 한다. 본 발명에서 배양배지란 동물세포나 식물세포 또는 세균 따위를 기르는 데 필요한 영양소가 들어 있는 고체 또는 액체를 의미하며, 배양액이란 액체배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미한다. 배양액의 농축액이란 상기 배양액을 농축한 것을 말하고, 배양액의 건조물이란 상기 배양액의 물기를 없앤 것을 의미한다.
또한, 본 발명은 이러한 생균활성제가 포함된 식품, 퍼스널 케어 제품 또는 의약품을 제공한다.
본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스이거나 칩류, 면류, 축산가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 생균활성제는 식품류, 음료, 건강음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류의 제조시 원료 물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제와 함께 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 생균활성제의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량 %로 가할 수 있으며, 음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 20 g, 바람직하게는 0.5 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명에서 발효식품이란 유산균이나 효모 등 미생물을 한 가지 또는 둘 이상 첨가하고 상기 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미하며, 상세하게는 식품 기재에 발효식품용 종균을 첨가하고 숙성시켜 제조하는 식품을 의미한다. 상기 발효식품으로는 주류, 빵류, 김치, 젖갈, 된장, 간장, 치즈, 버터, 요구르트 등 비살균 개방형 발효식품 모두가 포함된다. 또한, 상기 생균활성제는 발효식품용 종균으로 사용될 수 있으며, 바람직하게는 김치의 종균으로 사용될 수 있다. 이때 종균의 사용량은 발효식품의 종류 및 종균의 종류에 따라 적절히 조절하는 것이 좋다. 바람직하게는 식품 주재료 100 중량을 기준으로 0.0001 내지 0.01 중량부(습윤 중량부)로 접종하는 것이다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지 시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
본 발명에서 의약품이란 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 의약품의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 생균활성제의 약학적 투여 형태와 관련하여 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태가 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 생균활성제의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 생균활성제는 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식이 예상될 수 있다. 상기 의약품에도 역시 필요에 따라 다양한 보조 생약제, 비타민, 미네랄, 식이섬유 및 기타 의약용, 식품용 보조제(예컨대, 부형제, 증강제, 코팅제 등)등이 함유될 수 있을 것이다.
본 발명에 따른 퍼스널 케어 제품이란 피부, 머리카락 및 손발톱과 같은 신체에 적용하기 위한 제품을 의미하는 것으로서 샴푸, 컨디셔너, 크림, 로션, 화장품 및 비누를 포함하지만 이들만으로 제한되는 것은 아니다. 상기 화장품이란 인체를 정결 또는 미화하기 위하여 도찰, 살포 기타 이와 유사한 방법으로 사용되는 물품으로서 인체에 대한 작용이 적은 것을 의미하며, 유연화장수, 영양화장수, 영양크림, 맛사지크림, 엣센스, 팩, 유화용 파운데이션 등을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 외에 본 발명의 생균활성제는 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 생균활성제는 천연과일쥬스 및 과일쥬스음료 및 야채쥬스음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 복합생약제 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
김치로부터 분리된 유산균이 생균활성제로 이용되기 위해서는 장내 점착성 세균 균총의 균형을 유지하기 위해 산성환경인 위액 및 담즙액에 대한 저항성을 가지고 있어야 한다. 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 수크로스 액체배지에 접종하여 배양한 경우 엑소폴리사 카라이드를 생성한다. 이러한 엑소폴리사카라이드를 생성하는 경우, 세 종류의 유산균 모두 산성환경인 pH 3.0으로 조정한 0.05 M 인산 나트륨(sodium phosphate)용액과 pH 3.0으로 조정한 인공위액에서 2시간이 지난 후에도 사멸하지 않고 초기 균수를 유지하며 높은 저항성을 나타냈다. 또한 인공담즙에서도 24시간 동안 초기 균수를 유지하며 높은 담즙액 저항성을 나타냈다. 이러한 결과에 의해 알 수 있는 바와 같이, 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하는 유산균은 장내 담즙(0.6 g/L)의 경우보다 훨씬 많은(3.0 g/L) 황소의 담즙(oxgall)이 함유된 배지에서 성장할 수 있는 내성을 가진 것으로 확인되어, 실제로 생균활성제로서의 기능을 정상적으로 수행할 수 있는 것으로 나타났다.
루코노스톡 김치아이 GJ2는 항균활성에 대한 실험 결과, 분변오염의 지표가 되는 E. coli, 패혈증을 일으키는 Pseudomonas , 식중독의 원인균인 Listeria , Micrococcus, Salmonella , Stahylococcus , Streptococcus속 등에서 항균활성을 지니는 것으로 나타났다.
또한, 본 발명은 김치로부터 분리되고 pH 3.0 내지 pH 5.0의 산성 환경에서 생존할 수 있으며 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지고 생균활성을 갖는 균주로부터 얻어지는 엑소폴리사카라이드 및 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법을 제공한다.
본 발명인 루코노스톡 김치아이 GJ2로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드의 총 당 함량은 95.4 내지 97.2% w/w이며, 단백질 함량은 0.7 내지 0.8% w/w 로 아주 소량에 해당하며, 이를 구성하는 구성 당은 TLC와 HPLC를 사용하여 분석한 결과, 모 두 표준당으로 사용한 글루코오스와 같은 결과를 나타내어, 글루코오스로만 구성되어 중합체를 형성하는 호모폴리사카라이드 형태의 엑소폴리사카라이드임이 확인되었다. GPC(Gel Permeation Chromatography)를 통하여 얻은 루코노스톡 김치아이 GJ2로부터 얻어진 엑소폴리사카라이드의 평균 분자량(MW)은 240,000 내지 560,000이었다. 한편, 루코노스톡 시트리움 C3로부터 분리 정제된 엑소폴리사카라이드의 경우는 총 당 함량은 88.0 내지 90.00% w/w, 총 단백질 함량은 0.8 내지 1.0% w/w로 나타났고, 루코노스톡 메센테로이데스 C11로부터 분리 정제된 엑소폴리사카라이드의 경우는 총 당 함량은 90.0 내지 92.0% w/w, 총 단백질 함량은 0.85% 내지 1.05% w/w로 나타났으며, 루코노스톡 시트리움 C3과 루코노스톡 메센테로이데스 C11에 의해 생성되는 엑소폴리사카리드도 루코노스톡 김치아이 GJ2에서 생성되는 엑소폴리사카라이드와 같이 다른 구성 당은 전혀 없고, 글루코오스로만 구성되어 중합체를 형성하는 호모폴리사카라이드 형태의 엑소폴리사카라이드임이 확인되었다.
기존에 보고된 유산균이 생산한 엑소폴리사카라이드는 1 내지 2 g/L정도에 그쳤다[Biodiversity of Exopolysaccharides Produced by Streptococcus thermophilus Strains Is Reflected in Their Production and Their Molecular and Functional Characteristics. Appl. Environ. Microbiol. 70(2):900-912(2004)., Structure determination of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus rhamnosus strains RW-9595M and R. Biochem. J. 263:7-17(2002)]. 반면에, 루코노스톡 김치아이 GJ2는 수크로스를 유일한 탄소원으로 하여 조 엑소폴리사카라이 드(crude exopolysaccharide)를 생산하였으며, 그 생산량은 21.49 g/L로 기존의 유산균의 생산량에 비하여 10배 이상의 높은 생산량을 보여 산업적 이용가치가 훨씬 크다고 할 수 있다.
또한, 루코노스톡 시트리움 C3로부터 생산된 엑소폴리사카라이드는 16.46 g/L이고, 루코노스톡 메센테로이데스 C11로부터 생산된 엑소폴리사카라이드는 22.98 g/L가 회수되어 기존에 보고된 유산균보다 10배 이상의 높은 생산량을 보여 이들 또한 산업적 이용가치가 훨씬 크다고 할 수 있다.
본 발명의 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하며 pH 3.0 내지 pH 5.0의 산성 환경에서도 생존할 수 있고 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지며 생균활성을 갖는 루코노스톡속 균주를 이용하여 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법은 ⅰ) 김치로부터 분리된 상기 유산균을 수크로스 액체배지에 접종하여 30℃에서 48시간 정치배양하고, ⅱ) 배양액으로부터 폴리사카라이드를 분리하고, ⅲ)분리된 폴리사카로이드에서 엑소폴리사카라이드를 정제하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 폴리사카라이드를 분리하는 단계는 균체배양액을 원심분리(9,950g, 25min)를 수행하여 균체를 제거하고, 회수한 상징액에 2배의 냉각된 95% 에탄올을 서서히 가하여 4℃에서 15시간 침전 시킨 후, 침전물은 원심분리(9,950g, 25min, 4℃)를 수행하여 회수하고, 동결건조(Samwon freezing engineering Co., Korea)하는 방법으로 수행할 수 있다. 상기 엑소폴리사카라이드를 정제하는 단계는 균체배양액에 트리클로로아세트산(trichloloacetic acid, Sigma chemical Co., USA)을 최종농도가 4%(w/v)가 되도록 첨가하고 4℃에서 2시간 처리한 후 원심분리(9,950g, 25min, 4℃)를 수행하여 균체와 침전된 단백질을 제거하고 상징액을 회수하며, 상기 회수한 상징액을 0.2 ㎛ filter(Milipore Co., USA)로 여과하여 남은 단백질을 제거하고, 2배의 냉각된 95% 에탄올을 서서히 가하여 4℃에서 15시간 침전 시키며, 상기 침전물을 원심분리(9,950g, 25min, 4℃)를 수행하여 회수하고 회수된 침전물에 남은 에탄올을 건조 시킨 후, 상기 침전물을 3차 증류수에 용해하여 dialysis-sack(M.W. cut off 10,000, Spectra/Por 6 membrane, Spectrum Laboratories, USA)에 넣어 4℃에서 24시간 동안 투석시킨 다음 동결건조하는 방법으로 수행할 수 있다.
이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
<
실시예
1>
엑소폴리사카라이드
생성 균주의 분리 및 동정
1-1.
엑소폴리사카라이드
생성 균주의 분리
김치를 수집하여 내용물 전체를 마쇄한 다음, 무균적으로 여과하고 멸균수를 추가하여 적정배율로 희석하여, 탄산칼슘(CaCO3, Amersco Inc., USA)이 2% 첨가된 MRS(Difco Co., France)배지에 30℃에서 평판배양하여, 투명환을 형성하고, 그람양성(Gram stain kit BD Co., USA), 카탈라아제(Catalase Negative, Biomrieux Co., France) 음성인 집락을 유산균으로 잠정적으로 확인하였다.
상기 김치로부터 분리되고 유산균으로 확인된 김치유산균주를 수크로스 고체 배지(트립톤(tryptone) 10 g, 효모추출액(yeast extract) 5 g, 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 5 g, 디암모니움 시트레이트(diammonium citrate) 5 g, 수크로스 50 g/1 L, pH 7.0)에 도말하여 30℃에서 48시간 배양한 후, 점성집락을 나타내는 점질균을 선정하고, 다시 수크로스 액체배지(트립톤(tryptone) 10 g, 효모추출액(yeast extract) 5 g, 디포타슘 포스페이트(dipotassium phosphate) 5 g, 디암모니움 시트레이트(diammonium citrate) 5 g, 수크로스 50 g/1 L, pH 7.0)에서 점성물질을 분비하는 것을 확인하여 엑소폴리사카라이드 생성균주로 선정하였다. 분리 균주는 MRS 액체배지(Difco, France)에 배양한 후 대수기에 있는 배양액에 글리세롤(glycerol)이 25% (v/v)가 되게 첨가하여 -70℃에서 보관하였으며, 실험에 사용할 경우 5 mL MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후 MRS 액체배지에 1차 계대하고, 다시 수크로스 액체배지에 2차 계대하여 30℃에서 48시간 배양하여 사용하였다.
1-2.
엑소폴리사카라이드
생성 균주의 동정
분리된 엑소폴리사카라이드 생성균주는 그람염색(Gram stain kit, BD Co., USA)을 비롯한 형태학적 특성, API kit(50CHL, Biomrieux Co., France)을 이용한 생화학적 특성 및 16S rDNA 염기서열 분석(Lee, H.J., Park, S.Y., and Kim, J.H. 2000. Multiples PCR-based detection and identification of Leuconostoc species. FEMS Microbiol. Lett. 193:243-247)을 통하여 동정하였다. 16S rDNA 염기서열 분석을 위해 사용한 프라이머쌍에 대하여 서열번호 2 및 서열번호 3과 표 1에서 각각 포워드 프라이머(Forward primer)와 리버스 프라이머(Reverse primer)를 나타내었다. PCR은 Palmcycler(Corbett Reaserch, Australia)을 사용하여 수행하였다.
| Primers | 서열 (5′→3′) | 서열번호 |
| Forward | 5'- GCGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCG-3' | 1 |
| Reverse | 5'- GACCCGGGAACGTATTCACCGCGGC-3' | 2 |
결정된 16S rDNA 염기서열의 상동성 검사는 GeneBank database에 등록된 정보를 대상으로 Blast program(http://www. ncbi.nlm. nih.gov/BLAST/Blast.cgi)에 의해 실행하였다.
엑소폴리사카라이드 생성 분리균주의 형태학적 분석을 통한 결과를 표 2에 나타내었다. 분리균주의 형태학적 분석과 관련하여, 분리균주들을 MRS 배지(Difco, France)에 접종하여 24시간 혐기 배양하고, Gram 염색하여 광학현미경으로 관찰하였다. 그 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 알 수 있는 바와 같이 GJ2, C3 및 C11은 모두 그람양성 구균이었다. 도 1 및 표 2에서 알 수 있는 바와 같이, GJ2, C3 및 C11의 균주는 그람양성 구균이었으며, 콜로니는 둥근형으로 표면은 매끈하며 GJ2 및 C3는 우유빛을 나타내었고, C11은 흰색을 나타냈다.
| 특징 | GJ2 | C3 | C11 |
| Gram 염색 (Gram-stain) | + | + | + |
| 콜로니 형태 (colony morphology) | coccus &circular | coccus &circular | coccus&circular |
| 콜로니 표면 (colony surface) | smooth | smooth | smooth |
| 콜로니색깔 (colony color) | milk | milk | white |
| 콜로니 불투명도 (colony opacity) | opaque | opaque | Opaque |
생화학적 특성에 대한 분석은 API 50CHL kit(Biomrieux Co., France)을 사용하여 당 대사능을 검토하였으며, 그 결과는 표 3에 나타냈다.
| Reaction | GJ2 | C3 | C11 | Reaction | GJ2 | C3 | C11 |
| control | - | - | - | Esculine | + | + | + |
| Glycerol | - | - | - | Salicine | + | + | + |
| Erythritol | - | - | - | Cellobiose | + | + | - |
| D-Arabinose | - | - | - | Maltose | - | + | + |
| L-Arabinose | + | + | + | Lactose | - | - | + |
| Ribose | + | - | + | Melibiose | - | - | + |
| D-Xylose | - | - | + | Saccharose | + | + | + |
| L-Xylose | - | - | - | Trehalose | + | - | + |
| Adonitol | - | - | - | Inuline | - | - | - |
| β-Methyl-xyloside | - | - | - | Melezitose | - | - | - |
| Galactose | - | - | + | D-Raffinose | - | - | + |
| D-Glucose | + | + | + | Amidon | - | - | - |
| D-Fructose | + | + | + | Glycogene | - | - | - |
| D-Mannose | + | + | + | Xylitol | - | - | - |
| D-Fructose | - | - | - | β -Gentiobiose | + | + | - |
| Rhamnose | - | - | - | D-Turanose | + | - | + |
| L-Sorbose | - | - | - | D-Lyxose | - | - | - |
| Inositol | - | - | - | D-Tagatose | - | - | - |
| Mannitol | - | + | + | D-Fucose | - | - | - |
| Sorbitol | - | - | - | L-Fucose | - | - | - |
| α-Methyl-D-mannoside | - | - | - | D-Arabitol | - | - | - |
| α-Methyl-D-Glucoside | + | + | + | L-Arabitol | - | - | - |
| glucosamine | + | + | + | Gluconate | + | + | + |
| Amygdaline | + | + | + | 2 keto-gluconate | + | - | + |
| Arbutine | + | + | + | 5 keto-gluconate | + | - | - |
30℃에서 48 시간동안 배양 + : 양성 반응, - : 음성 반응
분리균주의 16S rDNA 염기서열 분석과 관련하여, 분리균주 GJ2의 경우 총 1,306 bp를 결정하였고, 그 결과로 얻은 염기서열을 서열번호 1 및 도 3에 나타내었다. 결정된 GJ2의 16S rDNA의 서열분석은 Blast program으로 상동성 검색을 실시하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이, 분리균주 GJ2는 루코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii) AF179386과 99%의 높은 상동성을 나타내었다. 분리균주 C3 및 C11의 경우는 총 1,359 bp를 결정하였으며, 그 결과를 서열번호 4 및 도 4(분리균주 C3)와 서열번호 5 및 도 5(분리균주 C11)에 나타내었다. 결정된 분리균주 C3 및 C11의 16S rDNA를 이용하여 실시한 상동성 검색의 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6에 나타낸 바와 같이 분리균주 C3 및 C11은 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum ) AF111949 및 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides ) AB023246과 각각 99%의 높은 상동성을 나타내었다. 도 6은 상기의 결과들을 기초로 하여 다른 세균과의 계통발생론적 관계를 나타낸 것이다. 상기한 바와 같이 도 6은 GJ2의 경우 루코노스톡 김치아이(Leuconostoc kimchii)로 최종 동정되었고, C3의 경우는 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum), C11의 경우는 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로 동정되었다는 것을 나타낸다.
즉, 김치로부터 분리된 엑소폴리사카라이드를 생성하는 유산균인 분리균주 GJ2는 당 대사능을 포함한 일반적인 특성과 16S rDNA 염기서열을 분석한 결과 루코노스톡 김치아이 (Leuconostoc kimchii)로 동정되었으며, 그 결과 GJ2를 루코노스톡 김치아이 GJ2(Leuconostoc kimchii GJ2)(KCTC 10921BP)로 명명하였고, 대전광역시 유성구 어은동 52번지 305-333에 위치한 한국생명공학연구원에 2006년 3월 14일자로 기탁하여, 수탁번호 KCTC 10921BP를 부여 받았다.
한편, C3의 경우 루코노스톡 시트리움(Leuconostoc citreum)으로 동정되어 루코노스톡 시트리움 C3으로 명명하였으며, C11의 경우 루코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides)로 동정되어 루코노스톡 메센테로이데스 C11로 명명하였다.
1-3.
엑소폴리사카라이드생성
균주의 특성 확인
1) 배양시간에 따른 생육도
상기 실시예 1-2의 분리균주의 배양시간에 따른 생육도를 조사하기 위하여 MRS 액체배지(Difco, France)에 상기 실시예 1-2의 분리균주를 1% (v/v) 접종하여 30℃에서 36시간 정치배양 하면서 매 3시간마다 A600에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해 분리균주를 3번씩 배양하여 측정하였다. 측정결과를 도 7에 기재하였다. 도 7에서 나타난 바와 같이, 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 모두 3시간부터 12시간까지 대수적으로 증가하였으며 12 내지 15시간에서 최대가 되었고, 그 이후에는 정지기로 들어가는 것을 관찰할 수 있었다.
2) 배지의
NaCl
농도에 따른 생육도
배지의 초기 NaCl 농도가 분리균주의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, NaCl을 0, 1, 3, 5 및 7% (w/v)로 첨가한 MRS 액체배지(Difco, France)에 상기 실시예 1-2의 분리균주를 1% (v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 정치배양한 후 A600에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다. 흡광도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해 분리균주를 3번씩 배양하여 측정하였고 측정결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서 알 수 있는 바와 같이, 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11는 모두 NaCl 농도 0%에서 3%범위에서 잘 생육하였다. 루코노스톡 김치아이 GJ2의 경우 생육 최적 NaCl 농도는 0%이나, 1%에서도 0%와 비슷한 생육도를 보였으며 그 이후로는 점차 감소하는 경향을 보였고, 루코노스톡 시트리움 C3의 생육 최적 NaCl 농도는 1%로 NaCl 이 적정농도로 첨가되었을 때 더 잘 생육하는 것으로 나타났으며, 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 생육 최적 NaCl 농도는 0%이었다.
3) 배지의 초기
pH
에 따른 생육도
배지의 초기 pH가 분리균주의 성장에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 1 N NaOH 또는 1 N HCl로 pH 4.0, 5.0, 6.0, 6.5, 7.0 및 10.0으로 보정한 MRS 액체배지(Difco, France)에 상기 실시예 1-2의 분리균주를 1% (v/v) 접종하여 30℃에서 24시간 정치배양한 후 A600에서 흡광도를 측정하여 생육도를 확인하였다. 흡광도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해 분리균주를 3번씩 배양하여 측정하였고 그 결과를 도 9에 나타내었다. 도 9에서 알 수 있는 바와 같이 루코노스톡 김치 아이 GJ2는 pH 6.0에서부터 pH 10.0까지의 범위에서도 잘 생육하였으며 생육 최적 pH는 pH 10.0으로 알칼리 영역에서 가장 잘 생육하는 것으로 나타났고, 루코노스톡 시트리움 C3는 pH 6.0에서부터 pH 7.0까지의 범위에서 잘 생육하였고, 생육 최적 pH는 pH 7.0으로 나타났으며, 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 pH 6.0에서부터 pH 10.0까지의 범위에서도 잘 생육하였고, 생육 최적 pH는 pH 7.0인 것으로 나타났다.
<
실시예
2>
분리균주의
장내
생존성
2-1.
내산성
및 인공위액 저항성
구강을 통하여 섭취된 균이 최종 목적 부위인 장에 도달하기 위해서는 강산성의 위액을 통과하여 생존해야 한다. 따라서 김치로부터 분리한 루코노스톡속 균주(Leuconostoc sp.)인 상기 실시예 1-2의 분리균주에 대하여 산 저항성 시험 및 인공위액 하에서의 시험을 실시하였다.
상기 실시예 1-2의 분리균주의 산 저항성 시험은 1 N HCl을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 0.05 M 인산나트륨용액 하에서 수행하였다. 산 저항성 여부는 생균수를 측정하여 비교한 것으로, 생균수는 적정비율로 희석하여 3번씩 측정한 것을 평균치로 나타내었다.
인공위액 하에서의 저항성은 체내 소화관 조건과 유사한 환경에서 측정하기 위하여 인공위액을 조제하여 실시하였다. 인공위액의 조제는 Kobayashi등의[Kobayashi, Y., Tohyama, K. and Terashima, T. Studies on biological characteristics of Lactobacillus: Ⅱ. Tolerance of the multiple antibiotic resistance strain, L. casei PSR3002, to artificial digestive fluids. Jpn. J. Microbiol. 29:691-698(1974)] 방법을 변형하여 1 N HCl을 사용하여 pH 3.0으로 조정한 MRS 액체배지(Difco, France)에 엑소폴리사카라이드(Sigma Co., USA)를 1,000 unit/mL가 되도록 첨가하였다. 엑소폴리사카라이드 생성을 위해 분리균주를 상기 실시예 1-1의 수크로스 액체배지에 1%(v/v)접종하여 30℃에서 48시간 배양한 후 원심분리(9,950×g, 5min)하여 상징액을 제거하고 균체를 회수한 다음pH 3.0의 0.05 M sodium phosphate 용액과 인공위액을 상기에서 제거된 상징액과 동량으로 첨가하여 30℃에서 2시간 배양하였다. 2시간 배양 후 생균수를 측정하여 내산성과 인공위액에 대한 저항성을 비교하였다. 생균수는 적정비율로 희석하여 3번씩 측정하였다. 대조군으로는 분리균주가 엑소폴리사카라이드를 생성하지 않은 상태의 것을 사용하였다. 이러한 대조군은 MRS 액체배지(Difco, France)에서 전 배양되어(30℃, 24시간) 엑소폴리사카라이드를 생성하지 않은 상태로 상기의 과정을 동일하게 처리하였고 그 결과를 도 10 및 도 11에 나타내었다.
그 결과 도 10 및 11에서 알 수 있는 바와 같이, 상기 실시예 1-1의 수크로스 배지에서 전 배양되어 엑소폴리사카라이드를 생성한 루코노스톡 김치 아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 0.05 M 인산 나트륨용액과 인공위액에서 2시간이 지난 후에도 사멸하지 않고 초기균수(108CFU/mL)를 유지하며 높은 저항성을 나타내었다. 이는 위에서 생존하여 장으로 이동할 수 있다는 가능성을 제시한 결과라 할 수 있겠다. 순수한 위액의 pH는 1.4-2.0 정도로 거의 대부분 미생물은 여기에서 사멸하게 되지만 섭취한 음식물의 완충작용으로 인해 위의 pH가 높아진다는 것을 고려한다면, 생존율은 더욱 높아질 것으로 판단된다. 반면 MRS 액체배지(Difco, France)에서 전 배양되어 엑소폴리사카라이드를 생성하지 않은 대조군의 경우는 1 내지 2 log cycle 감소현상을 보였다.
이러한 결과로부터, 본 발명인 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11이 구강으로 섭취될 경우, 위내에서의 생존 가능성은 분리균주의 내산성 및 내담즙 특성과 아울러 엑소폴리사카라이드 생성으로 인한 균체 보호막의 작용여부에 의존할 것이라고 예상할 수 있을 것이다.
2-2. 인공담즙 저항성
엑소폴리사카라이드 생성 균주의 인공위액에서의 높은 생존율로 인해 위를 통과하여 장으로 이동할 수 있을 것으로 예측하였다. 위를 거쳐 장에 도달하기 위해서는 그 전에 췌장과 십이지장을 통과하게 되는데, 이 부위에서는 담즙액이 분비된다. 따라서 최종적으로 장내로 들어오기 위해서는 담즙액에 대한 내성 또한 갖추어야 할 중요한 특성이다. Gilliland 등은 생균활성제로 사용되는 생균이 가져야 할 담즙액에 대한 내성은 황소의 담즙이 0.3% 함유된 배지에서 성장할 수 있다고 보고한바 있으나, 실제로 생균활성제로서의 기능을 정상적으로 수행하려면 장내 담즙의 농도(0.6 g/L)보다 훨씬 많은 황소의 담즙(3.0 g/L)이 함유된 배지에서 성장할 수 있는 내성을 가져야 한다.
인공담즙의 조제는 MRS 액제배지(Difco, France)에 0.45 ㎛ filter(Milipore Co.,USA)로 여과 제균된 황소의 담즙(oxgall, Sigma chemical Co., USA) 용액을 0.3%, 0.5%가 되도록 첨가하였다. 상기 실시예 1-2의 분리균주의 인공담즙에 대한 내성은 상기 실시예 1-1의 수크로스 액체배지에서의 전 배양액 및 위액에서 생존시 위를 통과하여 장으로 이동할 것임을 고려하여, 인공위액에서 2시간 동안 처리한 후의 배양액을 대상으로 이를 각각 원심분리(9,950×g, 5min)하여 상징액을 제거하고 균체를 회수한 후 인공담즙액을 상기에서 제거된 상징액과 동량으로 첨가하여 30℃에서 24시간 배양하였다. 24시간 배양 후, 생균수를 측정하여 인공담즙에 대한 저항성을 비교하였다. 생균수는 적정비율로 희석하여 3번씩 측정하였으며, 그 결과를 도 12 내지 도 14에서 나타내었다. 도 12 및 도 13에서 알 수 있는 바와 같이, 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 모두 0.3%와 0.5% 황소의 담즙이 함유된 인공담즙에서 24시간 동안 초기 균수를 유지하며 높은 담즙액 저항성을 나타내었으며, 도 14에서 알 수 있는 바와 같이 인공위액에서 2시간 처리 후 0.3% 황소담즙을 처리하였을 때에도 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 모두 24시간 동안 초기 균수를 유지하며 높은 담즙액 저항성을 나타내었다. 대조군으로는 분리균주가 엑소폴리사카라이드를 생성하지 않은 상태의 것을 사용하였다. 이러한 대조군은 MRS 액체배지(Difco, France)에서 전 배양되어(30℃, 24시간) 엑소폴리사카라이드를 생성하지 않은 상태로 상기의 과정을 동일하게 처리하였고 그 결과를 도 12 내지 도 14에 나타내었다. 도 12 내지 도 14에서 알 수 있는 바와 같이, 대조군인 MRS 액체배지에서 전 배양되어 엑소폴리사카라이드를 생성하지 않았을 때의 경우는 1 내지 2 log cycle 감소현상을 보였다.
이러한 결과로부터, 본 발명인 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 인공위액에 대한 저항성뿐만 아니라, 높은 농도의 담즙액에 대한 생존가능성은 분리균주의 엑소폴리사카라이드 생성으로 인한 균체 보호막의 작용여부에 의존할 것이라고 예상할 수 있을 것이다.
또한, 본 실시예에서 분리한 엑소폴리사카라이드 생성균주 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 강산성의 인공위액과 인공담즙 모두를 처리한 환경에서 생존함으로서 생균활성제로서의 기능을 갖추어 목적부위인 장에 도달하여 인체에 정장작용을 할 수 있을 것으로 기대된다.
2-3. 항균 활성 검증
1) 항균 활성의 측정
루코노스톡 김치아이 GJ2의 항균활성의 확인은 하기 표 4에 기재한 지시 균주 각각에 대한 생육억제 저해환 확인 실험을 통하여 실시하였다. 실험방법은 균체를 직접 가하는 직접방법[Kim, S.I., Kim, I.C. and Chang, H.C. Isolation and identification of antimicrobial agent producing microorganisms and sensitive strain from soil. J. Korean Soc. Food Sci. Nutr. 28(3): 526-53 (1999)]을 사용하였다.
항균활성은 저해환의 형성 유무에 따라 하기와 같이 구분하였고, 실험결과는 표 4에 나타내었다. 표 4의 항균활성 표기와 관련하여 '+'는 저해환이 검출된 것을 의미하여, '-'는 저해환이 검출되지 아니한 것을 의미한다.
| 지시 균주 | GJ2 의 항균활성 |
| Escherichia coliATCC 25922 | ＋ |
| Streptococcus faecalis ATCC 29212 | ＋ |
| Streptococcus mutans ATCC 25175 | ＋ |
| Micrococcus luters ATCC 9341 | ＋ |
| Staphylococcus aureus ATCC 29213 | ＋ |
| Salmonella typhimurium ATCC 19430 | ＋ |
| Pseudomonas aeroginosa ATCC 27853 | ＋ |
| Listeria monocytogenes ATCC 19111 | ＋ |
루코노스톡 김치아이 GJ2(Leuconostoc kimchii GJ2)는 분변오염의 지표가 되는 E. coli, 패혈증을 일으키는 Pseudomonas , 식중독의 원인균인 Listeria , Micrococcus , Salmonella , Staphylococcus, Streptococcus속 등에서 항균활성을 지니는 것으로 나타낸다.
2) 항균활성 물질의 각종 효소의 영향
트립신(EC 3.4.21.4 type I, Sigma, Missouri, USA), 리파제(EC 3.1.1.3 type VII, Sigma) 및 프로테이즈(type I, Sigma)를 각각 50mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)에 용해시킨 용액을 준비하고, 알파-아밀라아제(α-Amylase)(EC 3.1.1.1 typeⅧ-A,, Sigma)는 0.1 M 인산 나트륨완충액(pH 7.0)에 용해시킨 용액을 준비하며, 프로테나제 K(EC 3.4.21.64, Sigma)는 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl 및 5 mM EDTA(pH 7.5)를 포함하는 완충액에 용해시켰다. 상기 효소의 농도는 20 ㎎/mL로 준비하였다. 동결건조시킨 루코노스톡 김치아이 GJ2 배양액에 준비된 각종 효소용액을 최종 4 ㎎/mL 농도로 가하고, 37℃에서 12시간 동안 반응시켜 항균활성의 변화를 관찰하였다. 상기와 모든 동일한 조건에서 효소를 처리하지 않은 실험군을 대조군으로 사용하였다.
효소 처리에 따른 항균활성 측정결과는 하기 표 5에 나타내었다. 표 5의 항균활성 표기와 관련하여 '+'는 저해환이 검출된 것을 의미하여, '-'는 저해환이 검출되지 아니한 것을 의미한다. 트립신, 프로테이즈 및 프로테나제 K로 실험한 경우, 역가가 소실되었고, 리파제, 알파-아밀라제 및 알파-키모트립신(α-Chymotrypsin)으로 실험한 경우에서는 항균활성이 영향을 받지 않아, 루코노스톡 김치아이 GJ2의 항균활성과 관련된 물질은 단백질로 이루어져 있음을 알 수 있었다.
즉, 루코노스톡 김치아이 GJ2로부터의 항균물질은 단백질성 물질로서 체내의 단백분해효소에 의하여 분해되므로 항균물질의 체내 잔류에 의한 항균물질 내성의 우려가 없어 루코노스톡 김치아이 GJ2를 생균활성제로 사용하는 경우에도 그 안정성이 보장된다고 할 수 있을 것이다.
| Enzyme(4mg/mL: at 37℃, for 12hr) | GJ2 의 항균활성 |
| Control (non-enzyme treated sample) | + |
| Trypsin | - |
| Protease | - |
| Lipase | + |
| α-Amylase | + |
| Proteinase K | - |
| α-Chymotrypsin | + |
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실시예3
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엑소폴리사카라이드의
특성 규명
3-1. 분리
분리균주로부터 생성된 엑소폴리사카라이드의 분리는 균체 배양액을 4℃에서 원심분리(9,950×g, 25min)하여 균체를 제거하고, 엑소폴리사카라이드를 침전시키기 위해 회수한 상징액에 2배량의 냉각된 95% 에탄올을 서서히 가하여 4℃에서 15시간 침전시켰다. 침전물은 원심분리(9,950×g, 25min, 4℃)하여 회수하고, 남은 에탄올을 건조시킨 후 동결건조하여(Samwon freezing engineering Co., Korea) 이를 조 엑소폴리사카라이드(crude exopolysaccaride)로 명명하였다[Exopolysaccharide-producing lactic acid bacteria strains from traditional thai fermented foods: isolation, identification and exopolysaccharide characterization. International Journal of Food Microbiology. 51:105-111(1999)].
엑소폴리사카라이드의 생성량은 분리균주를 각각 3번씩 배양하여 회수한 엑소폴리사카라이드를 정량하여 평균치로 나타냈다. 상기의 방법에 따른 결과를 검토하면, 기존에 보고된 유산균으로부터 생성된 엑소폴리사카라이드가 1 내지 2 g/L정도에 그치는 반면 본 발명인 루코노스톡 김치아이 GJ2의 경우 회수된 엑소폴리사카라이드가 21.49 g/L으로 기존에 보고된 유산균보다 10배 이상의 높은 생산량을 보였고, 루코노스톡 시트리움 C3의 경우 엑소폴리사카라이드가 16.46 g/L 회수되었고, 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 경우 22.98 g/L의 엑소폴리사카라이드가 회수되어 각각 기존에 보고된 유산균보다 10배 이상의 높은 생산량을 보였다.
또한, 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 경우 탄소원으로 유일하게 수크로스만을 이용하였다. 이러한 결과를 검토하여 보건데, 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11를 이용하여 엑소폴리사카라이드를 생성할 경우 그 산업적 이용가치가 훨씬 크다고 할 수 있을 것이다.
3-2. 정제
엑소폴리사카라이드의 정제과정은 다음과 같다. 균체배양액에 트리클로로아세트산(trichloloacetic acid) (Sigma chemical Co., USA)를 최종농도가 4%(w/v)가 되도록 첨가하고 4℃에서 2시간 처리한 후 원심분리(9,950×g, 25min, 4℃)하여 균체와 침전된 단백질을 제거하였다. 상기 균체와 침전된 단백질을 제거한 후, 남은 상징액을 회수한 후 0.2 ㎛ filter(Milipore Co., USA)로 여과하여 남은 단백질을 제거하고, 상기 상징액의 2배량의 냉각된 95% 에탄올을 서서히 가하여 4℃에서 15시간 침전시켰다. 상기 처리에 의해 발생한 침전물을 원심분리(9,950×g, 25min, 4℃)하여 회수하고, 침전물에 남은 에탄올을 건조시킨 후, 건조된 침전물을 3차 증류수에 용해하여 dialysis-sack(M.W. cut off 10,000, Spectra/Por 6 membrane, Spectrum Laboratories, USA)에 넣어 4℃, 24시간 동안 투석시킨 다음 동결건조 하였다[Separation, purification and characterisation of extracellular polysaccharides produced by slime-froming Lactococcus lactis ssp. cremoris strains. International Dairy Journal. 9:631-638(1999)].
루코노스톡 김치아이 GJ2로부터 분리된 정제 엑소폴리사카라이드는 14.61 g/L로 단순 에탄올 침전으로 회수한 엑소폴리사카라이드보다 약 65% 정도로 감소량을 보였고, 루코노스톡 시트리움 C3로부터 분리된 정제 엑소폴리사카라이드는 7.73 g/L으로 단순 에탄올 침전으로 회수한 엑소폴리사카라이드보다 약 40% 정도로 감소량을 보였으며, 루코노스톡 메센테로이데스 C11로부터 분리된 정제 엑소폴리사카라이드는 4.77 g/L으로 단순 에탄올 침전으로 회수한 엑소폴리사카라이드보다 약 20% 정도로 감소량을 보였다.
그러나, 이러한 결과는 S. thermophilus의 경우 50 내지 350 ㎎/L의 생성능을 나타냈다는 Cerning 등[Lactic acid bacteria and human health. Korean J. Food Nutr. 6:53-65(1993)]의 결과와 Lactococcus lactis ssp. cremoris가 164-263 ㎎/L정도의 엑소폴리사카라이드 생성능을 나타냈다는 Zhennai Yang의 결과[Separation, purification and characterisation of extracellular polysaccharides produced by slime-froming Lactococcus lactis ssp. cremoris strains. International Dairy Journal. 9:631-638(1999)] 및 Lactobacillus ssp. SCU-M의 엑소폴리사카라이드 생성능이 1,680 ㎎/L였다고 보고된 결과[Isolation of Lactobacillus ssp. Producing Exopolysaccharide and Optimization of its Production. Korean J. Biotechnol. Bioeng. 17(2):169-175(2002)]보다 높은 엑소폴리사카라이드 생성량에 해당한다.
또한, 루코노스톡 김치아이 GJ2와 루코노스톡 시트리움 C3의 경우는, T. Smitinont 등[Exopolysaccharide-producing lactic acid bacteria strains from traditional thai fermented foods: isolation, identification and exopolysaccharide characterization. International Journal of Food Microbiology. 51:105-111(1999)]이 보고한 Pediococcus pentosaceus에서 2.5 g/L와 6.0 g/L의 엑소폴리사카라이드를 생성한 것에 비해서도 높은 생산량이라 할 수 있겠다.
따라서, 상기의 결과를 보면, 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11를 이용하여 엑소폴리사카라이드를 생성할 경우 그 산업적 이용가치가 크다고 할 수 있으며, 루코노스톡 김치아이 GJ2를 이용하는 경우에는 그 산업적 이용가치가 매우 크다고 할 수 있을 것이다.
3-3.
총 당
및 단백질
정제된 엑소폴리사카라이드의 총당 확인은 Dubois 등의[Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chemistry. 28:350-356(1956)] 페놀-황산(phenol-sulfuric acid)법으로 측정하였다. 물에 용해시킨 엑소폴리사카라이드 용액 1 mL에 동량의 5%(w/v) 페놀(phenol, Fluka Co., USA)을 가한 후 즉시 진한 황산 5 mL를 넣고 10분간 정치한 후 25℃ 중탕냄비(water bath)에서 10분간 처리하여 A490에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해 3번씩 반응시켜 측정하였다. 표준물질로는 글루코오스를 사용하였다.
엑소폴리사카라이드의 총 단백질은 Schacterle 및 Pollack의 방법[Method for the Quantitative Assay of Small Amounts of Protein in Biologic Material. Anal. Biochem. 51:654-655(1973)]을 이용하여 측정하였다. 물에 용해시킨 엑소폴리사카라이드 용액 1 mL에 동량의 알칼라인 구리(alkaline copper)용액을 넣고 10분간 정치한 후 페놀처리용액(phenol working solution)을 4 mL를 즉시 가하여 55℃ 중탕 냄비에서 5분 처리한 후 즉시 식혀서 A650에서 흡광도를 측정하였다. 흡광도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해 3번씩 반응시켜 측정하였다. 표준물질로는 bovine albumin(Fraction V, Sigma)을 사용하였다.
정제된 엑소폴리사카라이드의 총 당과 총 단백질 함량은 3번씩 반응시켜 측정한 결과를 평균하여 백분율로 표 6에 나타내었다.
표 6에서 알 수 있는 바와 같이, 김치아이 GJ2(Leuconostoc kimchii GJ2)로부터 분리되어 정제된 엑소폴리사카라이드의 총 당 함량은 95.4 내지 97.2% w/w, 총 단백질 함량은 0.7 내지 0.8% w/w로 나타났고, 루코노스톡 시트리움 C3로부터 분리되어 정제된 엑소폴리사카라이드의 총 당 함량은 88.0 내지 90.00% w/w, 총 단백질 함량은 0.8 내지 1.0% w/w로 나타났으며, 루코노스톡 메센테로이드 C11(Leuconostoc mesenteroides C11)로부터 분리 정제된 엑소폴리사카라이드의 경우는 총 당 함량은 90.0 내지 92.0% w/w, 총 단백질 함량은 0.85 내지 1.05% w/w로 나타났다.
| Culture | EPS (g/L) | Total sugar (g%) | Total protein (g%) | |
| 1 | 2 | |||
| Leu . kimchii GJ2 | 21.49(±0.46) | 14.61(±0.09) | 96.48(±0.49) | 0.8(±0.26) |
| Leu . citreum C3 | 16.46(±0.79) | 7.73(±0.09) | 89.38(±0.33) | 0.9(±1.04) |
| Leu . mesenteroides C11 | 22.98(±0.72) | 4.77(±0.08) | 91.05(±0.28) | 0.95(±0.45) |
1. 에탄올침전으로 분리된 조 엑소폴리사카라이드
2. 정제된 엑소폴리사카라이드
3-4. 구성 당 확인
엑소폴리사카라이드의 구성 당을 확인하기 위하여 엑소폴리사카라이드 가수분해물을 제조후 TLC 및 HPLC를 이용하여 분석하였다[Effect of Reaction Time on the Rheological Properties of dextran Formed Solution Produced by Crude dextran sucrase from Leuconostoc mesenteroides Sikhae. Kor. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. 20(3):316-323(1992)]. 엑소폴리사카라이드의 가수분해는 2 N 황산으로 100℃에서 3 내지 6시간 동안 실시하였으며, 1 N NaOH로 중화하고 0.45 ㎛ filter(Milipore Co., USA)로 여과하여 시료로 사용하였다.
TLC는 준비된 시료를 TLC 플레이트(TLC plate)(Whatman K5F, 150Å)에 1 μL 점적한 후 아세톤(acetone) : 부탄올(butanol) : 증류수(water)의 비가 4 : 5 : 2인 전개용매로 2번 전개시킨 다음, 0.5%(w/v) α-naphthol과 5%(v/v)황산을 포함한 에탄올 용액에 담그고 건조시킨 후 120℃ 오븐에서 10분간 발색시켜 점(spot)의 위치를 확인하였다[Strain Selection of Psychrotrophic Leuconostoc mesenteroides Producing a Highly Active dextran sucrasefrom Kimchi. Korean J. Food Sci. Technol. 34(6):1085-1090(2002)]. 상기 방법에 의한 결과를 도 15에 나타내었다.
도 15에서 알 수 있는 바와 같이, 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11에서 생성된 엑소폴리사카라이드는 표준당으로 사용한 글루코오스와 같은 전개율로 1개의 점(spot)을 나타내어 1차적으로 글루코오스로만 이루어진 호모폴리사카라이드로 추정할 수 있다.
보다 정확한 분석을 위해정제된 엑소폴리사카라이드의 산 가수분해물을 HPLC로 분석하였다. HPLC는 분석 컬럼(column)으로 탄수화물 분석용 컬럼(carbohydrate analysis column)(3.9 mm × 300 mm. Waters)을 사용하였으며 이동상으로는 80% (v/v) 아세토니트릴(acetonitrile)을 사용하였다. 이동상의 유속은 1.5 mL/min으로 하였으며, 시료는 auto-sampler(MIDAS 830)를 이용하여 20 μL 주입하여 RI(Regractive Index)검출기로 검출하여 그 결과를 도 16에 나타내었다.
도 16에서 알 수 있는 바와 같이, 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11에서 생성되는 엑소폴리사카라이드는 표준 당으로 사용한 글루코오스와 같은 체류시간(retention time)의 단일 피크(peak)만을 나타내어 글루코오스로만 이루어진 호포폴리사카라이드형의 엑소폴리사카라이드만을 생성함을 알 수 있었다. 따라서 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11에서 생성되는 엑소폴리사카라이드는 다른 구성당은 전혀 없고, 글루코오스로만 구성되어 중합체를 형성하는 호모폴리사카라이드인 것으로 결정되었다.
3-5. 점도 및 분자량
1) 점도의 측정
점도의 경우, Brookfield viscometer(LVDVⅡ+Pro, USA)에 스몰 샘플 어댑터(small sample adapter)를 부착하여 spindle No.18을 사용하여 측정하였다. 점도의 측정은 상기 실시예 1-1의 수크로스 배양배지에서 실시예 1-2의 분리균주를 배양한 수크로스 배양액의 상징액과 상징액을 실시예 3-1과 같이 에탄올 침전을 통하여 회수한 조 엑소폴리사카라이드와 상징액을 실시예 3-2와 같은 방법으로 정제한 정제 엑소폴리사카라이드에 대하여 실시하였다. 에탄올 침전을 통하여 회수한 조 엑소폴리사카라이드와 정제 엑소폴리사카라이드는 3차 증류수 20 mL와 10 mL에 각각 용해하여 측정하였다. 점도는 실험에서의 오차를 줄이기 위해 각각의 엑소폴리사카라이드를 3번씩 준비하여 측정하였다. 또한, 엑소폴리사카라이드의 생산량에 따른 점도의 차이에 대비하여 동일농도에 대해서도 측정을 수행하여 도 18 및 도 19와 표 7에 나타내었다. 즉, 상기 실시예 1-1의 수크로스 배양배지에서 실시예 1-2의 분리균주를 배양한 수크로스 배양액 50 mL로부터 생산된 각각의 엑소폴리사카라이드의 점도를 측정한 결과 및 이와 같은 결과에 엑소폴리사카라이드의 생성량이 미치는 영향을 배제하기 위하여, 분리균주로부터 조 엑소폴리사카라이드와 정제 엑소폴리사카라이드를 동일농도(4% w/v)로 조정하여 점도를 측정한 결과를 표 7에 나타내었다.
도 18 및 도 19에서 알 수 있는 바와 같이, 루코노스톡 김치아이 GJ2를 수크로스 고체배지에서 배양하는 경우, 물엿 정도의 흐름을 가지는 투명한 형태의 엑소폴리사카라이드를 생성하였다.
루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11의 엑소폴리사카라이드는 글루코스를 구성당으로 하는 글루칸 형의 호모폴리사카라이드라는 점에서 루코노스톡 김치아이 GJ2의 엑소폴리사카라이드와 공통점이 있으나, 서로 다른 형태의 엑소폴리사카라이드를 생성하였다. 즉, 도 18에서 알 수 있는 바와 같이 루코노스톡 시트리움 C3는 불투명하면서 끈끈한 형태의 엑소폴리사카라이드를 생성하였고, 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 불투명 하면서 묽게 퍼지는 형태의 엑소폴리사카라이드를 생성하였다.
실시예 1-1의 수크로스 배양배지에서 실시예 1-2의 분리균주를 배양한 수크로스 배양액 50 mL로부터 생산된 조 엑소폴리사카라이드와 정제 엑소폴리사카라이드를 각각 20 mL와 10 mL의 3차 증류수에 녹여, 그 점도를 측정하여 그 결과를 표 7에 나타내었다. 이와 같은 결과는 각 분리균주로부터의 엑소폴리사카라이드 생성량에 따른 차이가 점도에 영향을 미쳤을 수 있으므로 각각의 분리균주로부터의 조 엑소폴리사카라이드와 정제 엑소폴리사카라이드를 동일농도(4% w/v)로 조정한 것에 대해서도 점도를 측정하여 그 결과를 표 7에 나타내었다.
표 7에서 알 수 있는 바와 같이, 루코노스톡 김치아이 GJ2의 경우 배양 상징액은 13.03 cp를 나타냈었고 조 엑소폴리사카라이드는 482.15 cp를 나타내었으며 정제 엑소폴리사카라이드는 4,662 cp의 점도를 나타내었다. 상기의 동일농도(4% w/v)로 조정하여 조 엑소폴리사카라이드와 정제 엑소폴리사카라이드를 측정한 결과, 루코노스톡 김치아이 GJ2의 경우 각각 110 내지 130 cp, 240 내지 280 cp, 바람직하게는 119.4 cp, 266.3 cp이었고, 루코노스톡 시트리움 C3에서의 조 엑소폴리사카라이드와 정제 엑소폴리사카라이드는 각각 126 내지 146 cp, 3,620 내지 3,820 cp, 바람직하게는 136.3 cp, 3,719 cp로 가장 높은 점도를 나타내었으며, 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 각각 3 내지 4 cp, 5.5 내지 6.5 cp, 바람직하게는 3.57 cp, 6.07cp로 비교적 큰 차이를 보이며 가장 낮은 점도를 나타내었다.
| Culture | 상징액 (centipoise) | 엑소폴리사카라이드(centipoise) | |||
| 1 | 2 | 3 | 4 | ||
| Leu . kimchii GJ2 | 13.03 (±0.22) | 482.15 (±7.25) | 119.4 (±10.06) | 4,662 (±9.07) | 266.3 (±20.5) |
| Leu . citreum C3 | 7.31 (±0.04) | 139.25 (±0.25) | 136.3 (±10.03) | 3,633 (±10.97) | 3,719 (±100.3) |
| Leu . mesenteroides C11 | 2.21 (±0.15) | 5.39 (±0.05) | 3.57 (±0.5) | 3.67 (±0.06) | 6.07 (±0.5) |
1. 배양액 50 mL로부터 생산된 조 엑소폴리사카라이드를 3차 증류수 20 mL에 녹인 것
2. 생산된 엑소폴리사카라이드를 4% (w/v)로 농도를 맞춘 조 엑소폴리사카라이드
3. 배양액 50 mL로부터 생산된 정제 엑소폴리사카라이드를 3차 증류수 10 mL에 녹인 것
4. 생산된 엑소폴리사카라이드를 4% (w/v)로 농도를 맞춘 정제 엑소폴리사카라이드
2) 분자량의 측정
루코노스톡 김치아이 GJ2가 생산하는 엑소폴리사카라이드의 평균 분자량은 GPC(Gel Permeation Chromatography)에 의하여 측정하였다. GPC system(Agilent 1100series, Agilent, U.S.A.)을 이용하였으며, 실험 조건으로 컬럼(colunmn)은 Zorbax bioseries GFC 250(MW range : 500 내지 400,000)을 사용하였고 이동상은 물을 사용하였다. 상기 GPC는 1mL/min의 유속으로 35℃에서 수행하였으며, 투입량은 100 μL이었다. 시료(sample)의 농도는 10 ㎎/mL이었다. 상기 GPC의 분자량 측정 결과는 도 17에 나타내었다.
도 17에서 알 수 있는 바와 같이, 분자량 측정 결과는 전체 피크는 4.48분에서 7.93분 사이에 분포하고 5.37분이 가장 높은 피크를 나타냈으며, 분포지수(D)는 1.14이고 중량평균(MW)은 240,000 내지 560,000, 바람직하게는 248,000 내지 551,500이고, 더욱 바람직하게는 248,856 내지 551,122이며 가장 바람직하게는 360,606이었다. 중량평균을 계산하기 위하여 스라이스는 70개로 나누어 계산하였다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 루코노스톡속 균주(Leuconostoc sp.)는 엑소폴리사카라이드를 생성하는 경우, 다른 유산균들에 비하여 산성 조건에서 생존율이 더 높으며 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성이 높을 뿐만 아니라 항균활성을 가짐으로써 정장작용을 하는 생균활성제로 활용할 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 루코노스톡 김치아이 GJ2, 루코노스톡 시트리움 C3 및 루코노스톡 메센테로이데스 C11은 수크로스를 유일한 탄소원으로 하는 배지에서 지금까지 보고된 다른 엑소폴리사카라이드를 생성하는 유산균과 비교하여 10배 이상의 높은 엑소폴리사카라이드의 생산량을 보여 상기 루코노스톡속 균주들을 이용한 엑소폴리사카라이드를 생산하는 방법은 산업적 이용가치가 매우 크다.
<110> CHANG, HAE CHOON
<120> LACTIC ACID BACTERIA SEPARATED FROM KIMCHII AND
EXOPOLY-SACCHARIDES PRODUCED THEREBY
<160> 5
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 1306
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of the amplified 16S rDNA from Leuconostoc
kimchii GJ2
<400> 1
ctgtcccact tagacggctc cctccttacg gttaggccac cggctttggg cattacaaac 60
tcccatggtg tgacgggcgg tgtgtacaag acccgggaac gtattcaccg cggcgtgctg 120
atccgcgatt actagcgatt ccgacttcgt gcagtcgagt tgcagactgc agtccgaact 180
gagacgtact ttaagagatt agctcacctt cgcaggttgg caactcgttg tatacgccat 240
tgtagcacgt gtgtagccca ggtcataagg ggcatgatga tctgacgtcg tccccgcctt 300
cctccggttt gtcaccggca gtctcgctag agtgcccatc tgaatgctgg caactaacaa 360
taagggttgc gctcgttgcg ggacttaacc caacatctca cgacacgagc tgacgacgac 420
catgcaccac ctgtcacttt gtctccgaag agaacacttc tatctctaaa agcttcaaag 480
gatgtcaaga cctggtaagg ttcttcgcgt tgcttcgaat taaaccacat gctccaccgc 540
ttgtgcgggt ccccgtcaat tcctttgagt ttcaaccttg cggtcgtact ccccaggcgg 600
aacacttaat gcgttagctt cggcactaag aggcggaaac ctcctaacac ctagtgttca 660
tcgtttacgg tgtggactgc cagggtatct aatcctgttt gctacccaca ctttcgagcc 720
tcaacgtcag ttacagtcca gtaagccgcc ttcgccgctg gtgttcttcc atatatctac 780
gcattccacc gctacacatg gagttccact tacctctact gcactcaagt tgtccagttt 840
ccaatgcctt tccggagttg agctccgggc tttcacatca gacttaaaca accgtctgcg 900
ctcgctttac gcccaataaa tccggataac gctcgggaca tacgtattac cgcggctgct 960
ggcgcgtatt tacgcgtccc tttctggtat ggtaccgtca cactaaaatc attccctatt 1020
ctagctgttc ttcccataca acagtgcttt acgacccgaa agccttcatc acacacgcgg 1080
cgttgctcca tcaggcttcg cgcccattgt ggaagattcc ctactgcagc ctcccgtagg 1140
agtttgggcc gtgtctcagt cccaatgtgg ccgatcagtc tctcaactcg gctatgcatc 1200
attgtcttgg tgagccttta cctcaccaac taactaatgc accgcggatc catctctagg 1260
tgacgccgat agcgcctttt aactttatgt catgcgacac taagcc 1306
<210> 2
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LeuP forward primer
<400> 2
gcggcgtgcc taatacatgc aagtcg 26
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> LeuP Reverse rDNA
<400> 3
gacccgggaa cgtattcacc gcggc 25
<210> 4
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of the amplified 16S rDNA from Leuconostoc
citreum C3
<400> 4
gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgaacg cgcagcgaga ggtgcttgca cctttcaagc 60
gagtggcgaa cgggtgagta acacgtggat aacctgcctc aaggctgggg ataacatttg 120
gaaacagatg ctaataccga ataaaactta gtatcgcatg atatcaagtt aaaaggcgct 180
acggcgtcac ctagagatgg atccgcggtg cattagttag ttggtggggt aaaggcttac 240
caagacgatg atgcatagcc gagttgagag actgatcggc cacattggga ctgagacacg 300
gcccaaactc ctacgggagg ctgcagtagg gaatcttcca caatgggcgc aagcctgatg 360
gagcaacgcc gcgtgtgtga tgaaggcttt cgggtcgtaa agcactgttg tatgggaaga 420
aatgctaaaa tagggaatga ttttagtttg acggtaccat accagaaagg gacggctaaa 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg tcccgagcgt tatccggatt tattgggcgt 540
aaagcgagcg cagacggttg attaagtctg atgtgaaagc ccggagctca actccggaat 600
ggcattggaa actggttaac ttgagtgttg tagaggtaag tggaactcca tgtgtagcgg 660
tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggcttactg gacaacaact 720
gacgttgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacacc 780
gtaaacgatg aatactaggt gttaggaggt ttccgcctct tagtgccgaa gctaacgcat 840
taagtattcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggac 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggcttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
ttgacatcct ttgaagcttt tagagataga agtgttctct tcggagacaa agtgacaggt 1020
ggtgcatggt cgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgtaggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttatt gttagttgcc agcattcagt tgggcactct agcgagactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggcggggacg acgtcagatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggcgtataca acgagttgcc aacctgcgaa ggtgagctaa tctcttaaag 1260
tacgtctcag ttcggactgc agtctgcaac tcgactgcac gaagtcggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggtc 1359
<210> 5
<211> 1359
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Nucleotide sequence of the amplified 16S rDNA from Leuconostoc
mesenteroides C11
<400> 5
gcggcgtgcc taatacatgc aagtcgaacg cacagcgaaa ggtgcttgca cctttcaagt 60
gagtggcgaa cgggtgagta acacgtggac aacctgcctc aaggctgggg ataacatttg 120
gaaacagatg ctaataccga ataaaactta gtgtcgcatg acaaaaagtt aaaaggcgct 180
tcggcgtcac ctagagatgg atccgcggtg cattagttag ttggtggggt aaaggcctac 240
caagacaatg atgcatagcc gagttgagag actgatcggc cacattggga ctgagacacg 300
gcccaaactc ctacgggagg ctgcagtagg gaatcttcca caatgggcga aagcctgatg 360
gagcaacgcc gcgtgtgtga tgaaggcttt cgggtcgtaa agcactgttg tatgggaaga 420
acagctagaa taggaaatga ttttagtttg acggtaccat accagaaagg gacggctaaa 480
tacgtgccag cagccgcggt aatacgtatg tcccgagcgt tatccggatt tattgggcgt 540
aaagcgagcg cagacggttt attaagtctg atgtgaaagc ccggagctca actccggaat 600
ggcattggaa actggttaac ttgagtgcag tagaggtaag tggaactcca tgtgtagcgg 660
tggaatgcgt agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggcttactg gactgcaact 720
gacgttgagg ctcgaaagtg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacacc 780
gtaaacgatg aacactaggt gttaggaggt ttccgcctct tagtgccgaa gctaacgcat 840
taagtgttcc gcctggggag tacgaccgca aggttgaaac tcaaaggaat tgacggggac 900
ccgcacaagc ggtggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttaccaggtc 960
ttgacatcct ttgaagcttt tagagataga agtgttctct tcggagacaa agtgacaggt 1020
ggtgcatggt cgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080
aacccttatt gttagttgcc agcattcaga tgggcactct agcgagactg ccggtgacaa 1140
accggaggaa ggcggggacg acgtcagatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200
gtgctacaat ggcgtataca acgagttgcc aacccgcgag ggtgagctaa tctcttaaag 1260
tacgtctcag ttcggattgt agtctgcaac tcgactacat gaagtcggaa tcgctagtaa 1320
tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggtc 1359
Claims (10)
- 김치로부터 분리되고 엑소폴리사카라이드를 생성하며 인공위액과 인공담즙에 대한 저항성을 가지고, 위 및 장에서 생존 가능하며 생균활성을 갖는 루코노스톡속 균주(Leuconostoc sp.).
- 제 1 항에 있어서, 상기 루코노스톡속 균주는 루코노스톡 김치아이 GJ2 (Leuconostoc kimchii GJ2)(KCTC 10921BP)인 균주.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 균주, 상기 균주의 배양액, 상기 배양액의 농축액 및 상기 배양액의 건조물로 이루어지는 군에서 선택되는 한 가지 이상을 활성성분으로 포함하는 생균활성제(probiotics).
- 제 3 항의 생균활성제를 포함하는 식품 또는 퍼스널 케어 제품.
- 제 4 항에 있어서, 상기 식품은 발효식품, 기능성 식품 또는 음료인 식품.
- 제 5항에 있어서, 상기 발효식품은 제 3 항의 생균활성제를 종균으로 하는 식품.
- 제 1 항 또는 제 2 항의 균주로부터 생산되고 글루코오스만으로 구성된 호모폴리사카라이드 형태의 엑소폴리사카라이드.
- 제 7 항에 있어서, 상기 엑소폴리사카라이드는 분자량이 248,000 내지 551,500인 것을 특징으로 하는 엑소폴리사카라이드.
- 제 7 항에 있어서, 상기 엑소폴리사카라이드는 정제된 엑소폴리사카라이드의 점도가 200 내지 280 cp 인 것을 특징으로 하는 엑소폴리사카라이드.
- 제 7 항 또는 제 8 항의 엑소폴리사카라이드를 포함하는 식품 또는 퍼스널 케어 제품.
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|---|---|---|---|---|
| KR101109746B1 (ko) * | 2009-11-13 | 2012-03-13 | 충북대학교 산학협력단 | 균체외 다당을 생성하고 건강기능성 효과를 갖는 신규한 페디오코커스 펜토사세우스 |
| KR101109744B1 (ko) * | 2009-11-13 | 2012-03-13 | 충청북도 (관리부서:충청북도 농업기술원) | 균체외 다당을 생성하고 건강기능성 효과를 갖는 신규한 락토바실러스 파라카제이 |
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| KR100260849B1 (ko) * | 1997-12-22 | 2000-07-01 | 김광석 | 신균주 류코노스톡 메센테로이드스 씨비아이-110 및 이를 이용한 알터난의 생산방법 |
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-
2006
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