KR100260849B1

KR100260849B1 - 신균주 류코노스톡 메센테로이드스 씨비아이-110 및 이를 이용한 알터난의 생산방법

Info

Publication number: KR100260849B1
Application number: KR1019970071739A
Authority: KR
Inventors: 정호권
Original assignee: 김광석; 주식회사참존; 정호권
Priority date: 1997-12-22
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 2000-07-01
Also published as: KR19990052282A

Abstract

본 발명은 신균주 류코노스톡 메센테로이드스 CBI-110(Leuconostoc mesen- teroides CBI-110; 미생물수탁번호 KFCC-10999) 및 이를 이용한 알터난(Alternan)의 발효생산방법과 그 정제방법에 관한 것으로 본 발명의 알터난 생산 균주의 분리는 여러가지 배추김치, 깍두기 등의 침채류를 시료로하고 그 액즙을 단계별로 희석하여 분리용 액체배지에 접종하고 30℃에서 48시간동안 진탕 배양(140 rpm)하여 원심 분리법으로 균체를 제거한 후, 상등액을 45℃에서 30분간 열처리하고 이를 10% 슈크로스 용액에 반응시켜 환원당이 가장 많이 생성되는 균주인 류코노스톡 메센테로이드스 CBI-110(Leuconostoc mesenteroides CBI-100; KFCC-10999)을 분리하였다. 본 발명의 균주 KFCC-10999를 슈크로스 약20%, 펩톤 1%, 육엑스 1%, 효모엑스 1%, K₂HPO₄0.1%, 소디움 니트레이트 0.2%, 소디움 아세테이트 0.5%의 배지에서 pH 7.0∼8.0으로 호기적 발효하여 다량의 알터난을 생산한다.

본 발명은 종래 미생물에 의한 알터난 생산 및 정제에 있어서 시간과 비용이 큰 난점을 제거하여 매우 순도높은 알터난을 용이하게 생산할 수 있는 유용한 발명이다.

Description

신균주 류코노스톡 메센테로이드스 씨비아이-110 및 이를 이용한 알터난의 생산방법

본 발명은 신균주 류코노스톡 메센테로이드스 CBI-110(Leuconostoc mesen- teroides CBI-110; 미생물수탁번호 KFCC-10999) 및 이를 이용한 알터난(Alternan)의 발효생산방법과 그 정제방법에 관한 것이다.

알터난은 1954년 류코노스톡 메센테로이드스 NRRL B-1355에 의해 텍스트란(dextran)과는 다른 구조의 독특한 폴리사카라이드(polysaccharides)인 분획 S가 생산된다는 보고가 있은후, 많은 연구를 통하여 이 분획 S가

α

-1,6과

α

-1,3 결합으로 된 독특한 구조의

α

-D-글루칸이라 밝혀졌으며, 1980년대 후반에 이르러 알터난이라 불려지기 시작했다.

류코노스톡 메센테로이드스는 탄소원을 슈크로스(sucrose)로 하여 텍스트란슈크라제(dextransucrase)와 알터난슈크라제(alternansucrase)의 생산이 유도되고, 슈크로스의 프럭토스와 글루코스의 결합을 분해하여 플럭토스, 글루코스를 모두 에너지원으로 이용하거나 플럭토스만 에너지원으로 이용하고 글루코스는 결합을 절단할 때 발생하는 에너지를 이용하여 텍스트란 및 알터난을 생산한다. 이렇게 생산된 알터난과 그 유도체는 아라비아고무(gum arabic), 말토텍스트린(maltodextrin), 폴리덱스트로스(polydextrose)등과 유사한 기능적 성질을 갖고 있어 식품과 화장품등에서 저점도 부피 조정제(low viscosity bulking agent), 증량제, 안정화제등으로의 산업적 응용이 가능한 유용한 물질이다.

알터난은 이와같이 산업적으로 응용할 수 있는 잠재력이 많으나 자연계에 알터난만 생산하는 류코노스톡 메센테로이드스 종은 존재하지 않는다는 단점이 있다. 따라서 본 발명은 알터난을 다량 생산하는 균주를 스크리닝(screening)하고, 보다 효율적이고 경제적으로 알터난을 생산할 수 있는 발효방법과 그 분리방법을 제공하기 위한 것이다.

도 1은 세파로스 4B 컬럼으로 정제한 알터난의 분리크로마토그램이고,

도 2는 HA 알터난 및 덱스트란의 흡습성 비교 그래프이다.

도 3a 및 도 3b는 각각 본 발명의 류코노스톡 메센테로로이드스 씨비아이-110으로 생산된 알터난 슈크라제와, 종래의 류코노스톡 메센테로이드스 NRRL B-1355로 생산된 알터난 슈크라제의 역가를 나타낸 그래프이다.

본 발명의 알터난 생산 균주의 분리는 여러가지 배추김치, 깍두기 등의 침채류를 시료로하고 그 액즙을 단계별로 희석하고 표 1의 분리용 배재에 접종하고 30℃에서 배양후, 생성된 집락으로부터 점성을 가지거나 큰 집락의 균주를 폴리사카라이드 생산 균주로 일차 선별한다. 이를다시 분리용 액체배지에 접종하고 30℃에서 48시간동안 진탕 배양(140 rpm)하여 원심 분리법으로 균체를 제거한 후, 상등액을 45℃에서 30분간 열처리하고 이를 10% 슈크로스 용액에 반응시켜 환원당이 가장 많이 생성되는 균주인 류코노스톡 메센테로이드스 CBI-110(Leuconostoc mesenteroides CBI-100; KFCC-10999)을 분리하였다.

분리용 액체배지 조성

슈크로스(Sucrose) 2%펩톤(Peptone) 1%육엑스(Beef extr.) 1%효모엑스(Yeast extr.) 0.5%K₂HPO₄0.02%암모늄시트레이트(NH₄-citrate) 0.02%소디움 아세테이트(Na-acetate) 0.005%MgSO₄·7H₂O 0.02%MnSO₄·5H₂O 0.005%펜닐에틸 알콜(Phenylethyl alcohol) 0.25%트윈 80(Tween 80) 0.1%pH 6.8

본 발명의 균주는 PES(Phenylethanol & Sucrose)등 다른 배지에서보다 MRS 배지에서 가장 생육이 좋았으며, 글루코스 대신 슈크로스를 첨가하여준 표 1. 조성의 MRS 배지에서는 폴리사카라이드를 생산하여 큰 코로니가 형성되었다.

코로니는 유백색이었고, 균의 형태는 직경 0.5∼0.7

μ

의 구형(spherical)이었으며, 2연균 또는 긴 사슬(chain)을 형성하였으며, 그램 양성이었고, 포자를 형성하지 않았으며, 운동성이 없었고, 카탈라제(catalase), 옥시다제(oxidase)는 음성이었다. 기타 본 균주의 여러가지 특성은 표 2와 같다.

균주 KFCC-10999의 생리적 특성

구 분

특 성

그램염색(Gram stain)형태(Shape)포자형성(Spore formation)가스발생(Gas from glucose)운동성(Motility)카탈라제(Catalase)NaCl내생육(Growth in NaCl)3.0%6.5%생육 pH(Growth at pH)4.86.537℃에서 생육(Growth at 37℃)배양액최종pH(Final pH in glucose broth)덱스트란 형성(Dextran formation)탄수화물(Carbohydrate)아라비노스알부틴셀로비오스프럭토스길릭토스글루코스이노시톨락토스말토스만니톨만노스멜리비오스라피노스람노스살리신솔보스슈크로스트레할로스크실로스

+구형, 2연균 또는 사슬-+--+--+d4.4∼4.5++(d)++d+dd+++ddd+d++d

다음은 본 발명의 균주 KFCC-10999가 다량의 알터난을 생산할 수 있는 발효조건을 기술한다.

탄소원으로 각종 당류를 2%가 되도록 첨가하여 배양한 결과, 균의 생육은 슈크로스, 말토스, 글루코스, 프럭토스등에서 우수하였으나 슈크로스에서만 엑소폴리사카라이드(exopolysaccharides)가 생산되었다. 또한 슈크로스를 첨가한 배지에서는 균의 생육도 가장 좋았고, 엑소폴리사카라이드를 생산하는 것으로 볼때, 오직 슈크로스로 인해서 덱스트란 슈크라제와 알터난 슈크라제가 유도된다고 사료된다.

질소원은 무기질소원과 유기질소원에 대하여 조사하였으며, 그 결과 무기질소원으로 소디움 니트레이트, 포타지움 니트레이트, 암모늄 시트레이트, 암모늄설페이트가 사용될 수 있으며 이중 소디움 니트레이트를 첨가한 배지에서 가장 큰 효소활성을 나타냈으며, 유기질소원은 효모엑스, 육엑스, 펩톤, 트립톤, 소이톤이 사용될 수 있으며 펩톤, 육엑스는 각각 1%와 효모엑스 0.5%씩 첨가한 배지에서 가장 높은 효소활성을 나타냈다.

최적의 C/N비를 조사하기 위하여 펩톤, 육엑스, 효모엑스를 각각 동량 혼합하여 질소원 농도를 1.2, 2.4, 3.0, 4.2, 6.0, 9.0%되게하고 이들 용액에 각각 슈크로스의 농도를 5, 10, 20, 25, 30, 40%로 조정한 배지에서 배양 후의 알터난 슈크라제의 활성을 측정한 결과 표 3과 같았다.

C/N비에 따른 알터난슈크라제 활성

N(%)1.2 2.4 3.0 4.2 6.0 9.0C(%)

5 50 69 100 112 73 3610 71 91 120 127 79 6020 105 109 180 122 50 2025 70 94 130 109 23 1830 70 61 100 145 73 6840 21 54 54 50 71 47

상기표에서 나타나듯이 질소원 3% 탄소원인 슈크라제 20%가 첨가된 배지에서 알터난 슈크라제의 활성이 가장 높았다.

본 균주가 알터난을 생산하는 데에 금속이온의 영향은 Mn²⁺과 Cu²⁺의 영향이 매우 크며 Mn²⁺과 Cu²⁺의 최적 농도를 조사한 바, Mn²⁺은 0.005%이하의 저농도에서는 어느 정도 비슷한 영향을 주지만 일정 농도(0.015%)이상이 되며 오히려 심한 저해를 나타내고, Cu²⁺는 0.03%에서 최대 활성을 나타내었다.

또한 인산염의 농도가 균체와 효소 활성에 주는 영향을 검토하기 위하여 각종 인산염을 농도별로 첨가하여 배양한 후, 세포 농도와 효소 활성의 변화를 측정한 결과, KH₂PO₄, K₂HPO₄, NaH₂PO₄, Na₂HPO₄가 사용될 수 있으며, 특히 K₂HPO₄가 균의 생육에도 가장 좋으며, 효소 활성에도 가장 좋으며 첨가농도는 0.1%에서 효소활성이 가장 높았다.

알터난 생산 최적배양온도는 28±2℃이며, 최적 pH는 7.0∼8.0이고 호기적조건으로의 배양이 혐기적 조건의 배양에서보다 효소활성이 높다.

한편 알터난의 생산효소인 알터난슈크라제의 활성은 40℃, pH4∼6에서 가장 높은 활성을 나타낸다.

또한, 배양 종료된 배양액으로부터 용매를 사용하거나 이온 크로마토그래피등을 사용하여 알터난을 정제할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예로 보다 상세히 설명하지만 이에 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

다음표 4와 같은 조성으로된 최적배지에서 최초 2% 슈크로스가 첨가된 배지에서 스타터(starter)로 이용될 균주 KFCC-10999를 10%까지 단계적으로 농도를 상승시켜 배양한후, 20% 슈크로스 배지를 사용하여 페드배찌(fed-batch)방식으로 발효조에서 배양하였다.

그 결과 20% 슈크로스 MRS배지를 사용하여 페드배찌 방식으로 배양한 결과의 230%에 달하는 25.6g/L의 알터난을 얻었다.

최적배지조성

슈크로스(Sucrose) 2∼20%펩톤(Peptone) 1%육엑스(Beef extr.) 1%효모엑스(Yeast extr.) 1%K₂HPO₄0.1%소디움니트레이트(Sodium nitrate) 0.2%소디움아세테이트(Sodium acetate) 0.5%MnSO₄5H₂O 0.01%CuSO₄·5H₂O 0.03%트윈 80(Tween 80) 0.1%pH 8.0

[실시예 2]

알터난을 정제하기위해 배양완료된 배양액에 증류수를 가하여 5배 희석하여 9,000×g로 20분간 원심 분리하여 균체를 제거한 상등액에 전체 70% 에탄올 농도가 되도록 95% 에탄올을 가하여 얻은 침전물을 3회 세척한후, 불용 폴리사카라이드(insoluble polysaccharides)를 제거하기 위하여 12,000×g에서 20분간 원심분리하고, 증류수에 녹여서 0.44M TCA로 처리하고 12,000×g으로 10분간 재 원심분리하여 단백질을 침전시키는 과정을 5회 반복한다. 그리고 95% 에탄올로 다시 침전하여 알터난을 회수하였고 다시 0.5%가 되도록 증류수에 녹여서 세파로스 4B(Sepharose 4B; 시그마사제) 컬럼(2×80cm)에 3mL을 적하하고 20mL/hr의 유속으로 5mL씩 분취하였다. 이들 각 분획을 490nm에서 O.D.값을 측정한 결과 도 1과 같이 가장 앞에 있는 피크의 분자량 500,000 이상의 고분자량 알터난과 분획 35근처에서 저분자량 알터난으로 분리수득할 수 있다.

[실시예 3]

알터난의 물성을 검토하기위하여 RH 80%, 30℃에서 흡습력이 좋은 HA와 정제된 알터난(고분자량 알터난과 저분자량 알터난이 혼합된 것.), 그리고 알터난과 유사한 구조인 텍스트란의 흡습력을 비교한 결과는 도 2와 같았다. 도 2에 나타낸 것처럼 동량의 시료를 취하여 흡습력을 측정한 결과, 알터난은 비록 HA보다는 낮은 흡습력을 갖고 있으나 덱스트란보다 약 4배의 흡습력을 갖고있다. 따라서 덱스트란과는 다른 성질을 갖고 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 신균주 류코노스톡 메센테로이드스 CBI-110(KFCC-10999)의 배양액에서 균체를 제거한 상등액으로부터 알터난 슈크라제 활성을 조사한 결과, 공지의 다른 균주들의 것보다 30배 이상 높은 활성이 나타내어 알터난을 다량 생산할 수 있는 유용한 균주이며, 또한 본 균주는 최적화한 생산조건에서 2배 이상 높은 생산성을 나타낸다. 그리고 MW 17,700, 73,200, 170,000, 그리고 2,000,000 덱스트란중 그 흡습력이 가장 높은 MW 170,000 덱스트란과 본 발명에서 얻은 정제된 알터난과의 흡습력을 비교해본 바, 알터난의 흡습력이 휠씬 높아 식품과 화장품등에서 저점도 보습제, 부피조정제, 증량제, 안정화제등으로서 산업적으로 유용하게 사용될 수 있다. 이와같이 본 발명은 종래 미생물에 의한 알터난 생산 및 정제에 있어서 시간과 비용이 큰 난점을 제거하여 매우 순도높은 알터난을 용이하게 생산할 수 있는 유용한 발명이다.

Claims

직경 0.5∼0.7 μ 의 구형으로 2연균 또는 긴사슬을 형성하며, 그램양성으로 포자를 형성하지 않으며, 운동성이 없는 류코노스톡 메센테로이드스 CBI-110 (Leaconostoc mesenteroides CBI-110; KFCC-10999).
류코노스톡 메센테로이드스 CBI-110(Leaconostoc mesenteroides CBI-110; KFCC-10999)을 슈크로스 약20%, 펩톤 1%, 육엑스 1%, 효모엑스 1%, K₂HPO₄0.1%, 소디움 니트레이트 0.2%, 소디움 아세테이트 0.5%의 배지에서 pH 7.0∼8.0으로 호기적 발효함을 특징으로하는 알터난의 생산방법.