KR20070098078A - 피토스핑고신을 유효성분으로 함유한 피부 외용제 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 피토스핑고신(phytosphingosine)의 접촉성 피부염과 이에 수반되는 표피 과증식 질환 치료제로서의 새로운 용도에 관한 것이다. 또한, 민감성 피부를 위한 용도 및 염증 매개 인자에 의해 유도되는 피부 노화를 방지하는 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 생체 내 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptors, "PPARs")를 활성화시키고 그 발현을 증가시킴으로써, 프로스타글란딘(PGE₂)생성에 의한 염증 반응을 억제하고 각질 세포 과다 증식 질환을 치료할 수 있는 하기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신 화합물의 새로운 용도에 관한 것이다. 또한 본 발명은 PPARs 활성 조절을 통하여 연령 증가에 따른 염증 매개 인자의 생성을 억제하는 기전으로 노화를 억제하는 피토스핑고신 화합물의 새로운 용도에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 화합물은 접촉성 피부염과 표피 과증식 질환의 동물 모델에서 TPA 처리에 의해 유도된 면역 세포의 피부 침습과 각질세포 과다 증식을 억제시키고, TPA 처리에 의한 면역세포에서의 프로스타글란딘 생성을 억제하는 효과가 있으며, 정상 각질 세포의 분화를 촉진하고 표피 증식을 정상화시키므로, 염증, 각질 분화 이상, 표피 과다 증식을 특징으로 하는 접촉성 피부염과 표피 과증식 질환의 치료제 및 피부노화 방지제로 활용될 수 있고, 염증 매개 인자에 의해 유도되는 피부 노화를 방지하는 성분으로 활용될 수 있다.

피토스핑고신, PPARs 활성화, 프로스타글란딘, 염증, 각질 분화 이상, 표피 과다 증식, 접촉성 피부염, NF-κB, MMP-1

Description

피토스핑고신을 유효성분으로 함유한 피부 외용제 조성물{Composition for external application to the skin comprising phytosphingosine}

도 1a는 실험에 사용되는 HaCaT 세포주에서 주된 반응을 보이는 퍼옥시좀 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptors, "PPARs") 이소타입을 나타내는 그림이다.

도 1b는 피토스핑고신(phytosphingosine)의 PPARs 활성 증진 효과를 나타내는 그림이다.

도 2a 및 2b는 피토스핑고신의 PPARγ 유전자 발현 증진 효과를 나타내는 그림이다.

도 3은 피토스핑고신의 각질세포 분열 억제 효과를 나타내는 그림이다.

도 4는 피토스핑고신의 코니파이드 엔벨롭(cornified envelope, "CE") 양 증가 효과를 나타내는 그림이다.

도 5는 피토스핑고신의 인볼루크린(involucrin) 양 증가 효과를 나타내는 그림이다.

도 6은 피토스핑고신의 로리크린(loricrin), 케라틴 1(keratin 1) 양 증가 효과를 나타내는 그림이다.

도 7 및 8은 접촉성 피부염 동물 모델에서 피토스핑고신의 표피 과다 증식 억제 효과를 나타내는 그림이다.

도 9는 접촉성 피부염 동물 모델에서 피토스핑고신의 항염 효과를 나타내는 그림이다.

도 10은 단핵 백혈구에서 피토스핑고신의 프로스타글란딘 생성 억제 효과를 나타내는 그림이다.

도 11은 증식하는 노화 세포 모델(replicative senescence cell model)에서 노화에 따른 프로스타글란딘 생성 증가를 억제하는 피토스핑고신의 효과를 나타내는 그림이다.

도 12는 자외선에 의한 NF-κB 활성 증가를 억제하는 피토스핑고신의 효과를 나타내는 그림이다.

도 13은 자외선에 의한 매트릭스 메탈로프로테이나제-1(matrix metalloproteinase-1, "MMP-1") 생성 증가를 억제하는 피토스핑고신의 효과를 나타내는 그림이다.

도 14는 증식하는 노화 세포 모델에서 노화에 따른 MMP-1 생성 증가를 억제하는 피토스핑고신의 효과를 나타내는 그림이다.

본 발명은 피토스핑고신의 PPARs 활성 조절을 통한 접촉성 피부염과 표피 과 증식 질환 치료용 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, PPARs의 활성 조절 기전을 통해, 염증을 억제하고 각질 세포 분화를 촉진하며 표피 과다 증식을 억제함으로써 접촉성 피부염과 표피 과증식 질환을 개선시킬 수 있는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다. 또한 본 발명은 피토스핑고신의 PPARs 활성 조절을 통한 피부노화 방지용 피부 외용제 조성물에 관한 것으로, PPARs의 활성 조절 기전을 통해, NF-κB 활성을 억제하고 프로스타글란딘 생성을 저해하며 MMP-1의 합성을 억제함으로써 피부노화를 방지할 수 있는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

PPARs는 세포 증식/분화의 조절, 염증 매개체들의 조절 등에 있어 중요한 역할을 담당하며, 포도당, 지질, 호르몬의 대사 조절에도 중요한 역할을 한다고 보고된 대표적인 핵호르몬 수용체이다<쿠엔즐리, 에스.(Kuenzli, S.), 사우랏, 제이. 에이치.(Saurat, J. H.), Peroxisome proliferator-activated receptors in cutaneous biology, Br. J. Dermatol., 149 (2003) 229-236; 데스베르그네, 비.(Desvergne, B.), 와흘리, 더블유.(Wahli, W.), Peroxisome proliferator-activated receptors: nuclear control of metabolism, Endocrine Reviews, 20 (1999) 649-688>. 특히, 피부의 표피에서 각질형성세포 분화를 촉진하고 증식을 억제하며 지질대사를 통한 피부장벽 형성을 촉진하고 염증 반응을 억제하여 피부 기능의 항상성 유지에 중요한 역할을 수행함이 밝혀졌다<쿠엔즐리, 에스.(Kuenzli, S.), 사우랏, 제이. 에이치.(Saurat, J. H.), Peroxisome proliferator-activated receptors in cutaneous biology, Br. J. Dermatol., 149 (2003) 229-236>.

본 발명자들은 이들 PPARs 생물학에 대한 개략적인 정보와 PPARs의 피부에서 의 효능 및 작용 기작, 특히 피부 표피 기능과의 관련성 등에 대해 살펴보고, 활성을 유도할 수 있는 리간드를 찾던 중 피토스핑고신이 PPARs를 활성화시키고 그 유전자 발현을 조절함으로써 접촉성 피부염을 억제시키고, 접촉성 피부염에 동반된 각질형성세포의 비정상적인 증식을 억제하는 효능을 가짐을 확인하였다. 동시에 피토스핑고신이 염증성 사이토카인 합성을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 저하시키고 염증 매개 인자인 프로스타글란딘 합성을 저해시킴으로써 노화 유도에 중요한 MMP-1의 생성을 억제하는 효능을 가짐을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

접촉성 피부염이란 주로 외부 물질과의 접촉에 의해서 발생하며 흔히 심한 소양증과 홍반을 동반하는 습진성 피부질환이다. 이 접촉성 피부염은 그 기전에 따라 크게 원발성 접촉 피부염(Primary irritant contact dermatitis)과 알레르기성 접촉 피부염(Allergic contact dermatitis)으로 분류된다. 원발성 접촉 피부염이란, 원인물질이 피부에 직접 독성을 일으켜 발생하는 것으로서, 일정한 농도의 원인물질로 자극을 주면 거의 모든 사람에게 피부염을 일으키게 된다. 그에 반해, 알레르기성 접촉 피부염은 세포 매개 면역반응인 제4형 과민반응의 한 형태이다. 기존에는 부신피질호르몬제연고의 국소 도포를 통해 접촉성 피부염을 치료해왔으나, 호르몬 제제 사용의 부작용은 극복되어야 할 과제로 남아 있고, 화장품 영역에서 호르몬 제제의 사용은 금지되어 있다.

이에, 피토스핑고신은 PPARs 활성을 통해 염증 매개 인자인 프로스타글란딘 합성을 저해하고 염증 매개 인자와 염증성 사이토카인 합성을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 저하시킴으로써, 접촉성 피부염을 억제하고 접촉성 피부염에 동반 된 각질형성세포의 비정상적인 증식을 억제하는 효능이 있어, 접촉성 피부염 치료를 위한 유용한 성분이 될 것으로 기대된다.

한편, 최근 피부의 내재적인 염증 매개 인자와 노화 사이의 상관관계에 대하여 보고가 되어 있다<지아코모니, 피.유.(Giacomoni, P.U.), (2005) Ageing, science and the cosmetics industry. The micro-inflammatory model serves as a basis for developing effective anti-ageing products for the skin., EMBO, Rep. 6 Spec No, S45-8>.

특히 염증 매개 인자인 PGE₂는 콜라게나제(collagenase)와 스트로멜리신(stromelysin)을 포함한 여러 MMPs의 생성을 증가시키고, 콜라겐과 피브로넥틴(fibronectin) 합성을 저하시키는 것으로 보고되었다<펜트랜드, 에이. 피.(Pentland, A. P.), 샤피로, 에스. 디.(Shapiro, S. D.), 웰구스, 에이치. 쥐.(Welgus, H. G.), Agonist-induced expression of tissue inhibitor of metalloproteinases and metalloproteinases by human macrophages is regulated by endogenous prostaglandin E₂ synthesis., J. Invest. Dermatol., 104 (1995) 52-57; 마우비엘, 에이.(Mauviel, A.), 할신, 씨.(Halcin, C.), 바실로우데스, 피.(Vasiloudes, P.), 박, 더블유, 씨.(Parks, W. C.), 쿠르키넨, 엠(Kurkinen, M.), 우이토, 제이.(Uitto, J.), Uncoordinated regulation of collagenase, stromelysin, and tissue inhibitor of metalloproteinases genes by prostaglandin E₂: selective enhancement of collagenase gene expression in human dermal fibroblasts in culture., J. Cell. Biochem., 54 (1994) 465-472; 바르가, 제이.(Varga, J.), 디아즈페레즈, 에이.(Diaz-Perez, A.), 로젠블룸, 제이.(Rosenbloom, J.), 지메네즈, 에스. 에이.(Jimenez, S. A.), PGE₂ causes a coordinate decrease in the steady-state levels of fibronectin and types I and III procollagen mRNAs in normal human dermal fibroblasts., Biochem. Biophys. Res. Commun., 147 (1987) 1282-1288>.

또한 PGE₂을 포함한 염증 매개 인자와 염증성 사이토카인 합성을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성은 세포 내의 MMPs 생성을 유도하여 세포간기질의 분해를 촉진한다고 보고되었다<타나카, 케이.(Tanaka, K.), 하세가와, 제이.(Hasegawa, J.), 아사미추, 케이.(Asamitsu, K.), 오카모토, 티.(Okamoto, T.), 2005. Prevention of the ultraviolet B-mediated skin photoaging by a nuclear factor kappa B inhibitor, parthenolide., J. Pharmacol. Exp. Ther., 315(2) (2005) 624-30; 루, 와이.(Lu, Y.), 왈, 엘. 엠(Wahl, L. M.), Oxidative stress augments the production of matrix metalloproteinase-1, cyclooxygenase-2, and prostaglandin E2 through enhancement of NF-kappa B activity in lipopolysaccharide-activated human primary monocytes., J. Immunol., 175(8) (2005) 5423-9>.

따라서 PGE₂ 생성과 NF-κB 활성에 의한 MMPs 생성과 매트릭스 단백질의 생성 저해는 노화된 피부의 콜라겐 부족 현상과 연관되어 있음을 제안할 수 있고, 이 에 피토스핑고신은 PPARs 활성을 통해 염증 매개 인자인 프로스타글란딘 합성을 저해하고, 염증 매개 인자와 염증성 사이토카인 합성을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성을 저하시킴으로써 MMP-1의 생성을 억제하는 효능이 있어, 피부 노화 방지제로서 활용이 가능하다.

PPARs에 대한 특허들을 살펴보면 주로 γ형에 대한 활성화제 즉 신물질에 대한 특허와 검색방법에 대한 특허, 당뇨 비만 등에 대한 용도 특허들로 구성되어 있다.

신물질에 대한 특허는 PPARγ에 대한 효능제 활성을 갖는 치환된 4- 히드록시-페닐알카논산 유도체(대한민국 등록특허 제474202호), ＰＰＡＲs 매개 질환의 치료에 유용한 신규 화합물(대한민국 공개특허 제2005-0055790호), 키랄 옥사졸-아릴프로파이온산 유도체 및 ＰＰＡＲs 작동제로서의 그의 용도(대한민국 공개특허 제2005-0055750호), 체액 잔류, 부종 또는 울혈심부전증을 유발하지 않는 신규 ＰＰＡＲs 리간드(대한민국 공개특허 제2005-0055701호), 당뇨병 치료에 유용한 ＰＰＡＲs 작용제로서 Ｎ-치환된-1Ｈ-인돌-5-프로파이온산 화합물(대한민국 공개특허 제2005-0042809호), ＰＰＡＲγ와 ＰＰAＲα의 활성을 항진시키는 신규화합물, 그것의 제조 방법, 및 그것을 함유한 약제 조성물 (대한민국 공개특허 제2005-0040746호), ＰＰＡＲα 및 γ의 조절물질로서 벤조산 유도체(대한민국 공개특허 제2005-0014014호), 경구용 항당뇨병제(대한민국 공개특허 제2004-0044515호) 등이 있고, 검색방법에 대한 특허는 비만 및 당뇨 조절물질의 검색 방법(대한민국 등록특허 제468046호), βＧＫ 유전자의 퍼옥시좀 증식 반응 요소(대한민국 등록특허 제4434948호), ＰＰＡＲγ에 대한 단일클론 항체, 특이항체분비 융합세포주 및 항체를 이용한 염증, 암, 대사성 질환과 같은 질병 관련 조절인자를 검색하는 방법(대한민국 공개특허 제2005-0027808호) 등이 있고, 용도특허로는 항지방화 및 항비만 활성을 갖는 박과 식물 추출물 또는 이로부터 분리한 정제물을 포함하는 조성물(대한민국 공개특허 제2005-0054009호, 제2005-0054006호), 지질대사 개선용 조성물 및 식품(대한민국 공개특허 제2004-0084908호), 심장 인슐린 내성 관련 증상의 치료 및 예방 (대한민국 공개특허 제2003-0019434호), 뼈 형성의 조절(대한민국 공개특허 제0093808호), 진성 당뇨병 치료를 위한 벤조산 유도체(대한민국 공개특허 제2002-0087382호), 피부 관리 조성물(대한민국 공개특허 제2002-0047101호), 심혈관 질환 치료용 ＰＰＡＲδ 억제제(대한민국 공개특허 제2002-0012323호), 알쯔하이머병, 중추신경계 손상 및 염증성 질환의 치료용 조성물 및 치료 방법(대한민국 공개특허 제2001-0101085호), 증후군 X의 치료를 위한 PPARα 및 PPARγ 길항제의 용도(대한민국 공개특허 제1999-0077099호) 등이 있다.

피토스핑고신을 이용하여 피부에 이로운 작용을 제공하는 조성물은 매우 다양하게 공지되어 있다. 대표적으로 국내특허 제10-0532579호에서는 피토스핑고신 성분을 단독 혹은 혼합 적용하여, 아폽토시스(세포 사멸)를 유도함으로써 각질화성 질병과 피부암을 억제하는 효과를 제공할 수 있음을 명시하고 있다. 또한 국내특허 제10-0370455호에서와 같이 피토스핑고신 유도체인 N-스테아로일 피토스핑고신을 이용한 보습 효과와 피부 건조증 예방 효과에 대한 특허가 있다.

그러나 피토스핑고신 성분이 PPARs 활성 및 그 유전자 발현 증가 기전을 통 하여 정상적인 각질 세포의 분열과 분화의 균형을 유지시키고 염증 매개 인자의 생성을 억제함으로써, 접촉성 피부염과 이에 동반되는 표피 과증식 질환의 치료제로 사용될 수 있음에 대한 특허는 전혀 명시되어 있지 않다.

또한 염증 매개 인자 합성을 조절하는 전사인자인 NF-κB의 활성 저하와 염증 매개 인자인 프로스타글란딘 합성 저해를 통해 노화 유도에 중요한 MMP-1의 생성을 억제시킴으로써, 피부 노화 예방, 억제제로 사용될 수 있음에 대한 특허도 명시되어 있지 않다.

이러한 상황에서 본 발명자들은 접촉성 피부염과 이에 수반되는 피부 장벽의 항상성 소실에 영향을 끼치는 여러 요인들을 효과적으로 통제하는 방법을 탐색하던 중 피토스핑고신을 사용할 경우, 접촉성 피부염을 방지, 치료하고, 피부 표피의 항상성을 유지할 수 있음을 발견하였다. 즉, PPARs의 활성화와 그 유전자 발현의 증가를 통한 염증 억제 및 각질 세포 분열/분화 정상화 기전으로 접촉성 피부염과 이에 수반되는 피부의 항상성 소실을 방지, 예방할 수 있으므로, 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 접촉성 피부염과 이에 동반되는 표피 과증식 질환 예방, 치료용 피부 외용제 조성물을 제공하고자 한다.

또한 피토스핑고신을 이용하여 자연노화와 광노화에 의해 발생하는 염증을 억제함으로써 피부의 노화증상을 막거나 회복시켜줄 수 있음을 발견하였다. 즉, PPARs 활성화를 통하여 NF-κB 활성을 억제하고 프로스타글란딘 생성을 억제하며 진피를 분해하는 효소인 MMP-1의 생합성을 저해할 수 있으므로, 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 피부 외용제 조성물을 제공하고자 한다.

또한 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 민감성 피부에 적합한 피부 외용제 조성물을 제공하고자 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 접촉성 피부염 치료용 피부 외용제 조성물은 하기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 표피 과증식 질환 치료용 피부 외용제 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 피부 노화 방지용 피부 외용제 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 민감성 피부용 피부 외용제 조성물은 상기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물의 피토스핑고신은 PPARs를 활성화시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물의 피토스핑고신은 PPARs의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 한다.

본 발명에 의한 피부 외용제 조성물에 있어서, 상기 조성물은 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스, 팩 또는 연고의 제형을 갖는 것을 특징으로 한다.

이하 하기 실험예, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과에 대하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 하기 실험예, 실시예들은 본 발명에 대한 이해를 돕기 위하여 예시된 것으로, 본 발명이 이들 예로만 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 사용된 피토스핑고신은 두산바이오텍에서 구입하여 사용하였다.

<실험예 1: PPARs 활성화 확인>

인체 각질형성 세포주(human keratinocyte)인 HaCaT를 10% 우태아 혈청을 포함하는 DMEM 배지에 계대 배양하였고 페놀 레드의 에스트로겐에 의한 효과를 제거하기 위해 페놀 레드-프리(phenol red-free) 배지를 사용하였다. 플라스미드는 일반적인 배양 조건에서도 발현되는 유니버설(universal) 프로모터 뒤에 PPARα, PPARβ/δ, PPARγ 유전자를 지닌 플라스미드와 리간드 결합형의 PPARs가 결합하여 활성화되는 PPARs 반응 요소(PPARs Response Element, "PPRE")를 프로모터로 가지고 뒤에 리포터로써 역할을 하는 반디불(firefly) 루시퍼라제(luciferase) 유전자를 지닌 것, 그리고 참조(reference)로 유니버설 프로모터에 β-갈락토시다제(β-galactosidase) 유전자가 결합된 플라스미드를 사용하였다<클리워, 에스. 에이.(Kliewer, S. A.), 포만, 비. 엠.(Forman, B.M.), 블럼버그, 비.(Blumberg, B.), 옹, 이. 에스.(Ong, E. S.), 보르그메이어, 유.(Borgmeyer, U.), 만겔스도프, 디. 제이.(Mangelsdorf, D. J.), 우메소노, 케이.(Umesono, K.), 에반스, 알. 엠.(Evans, R. M.), Differential expression and activation of a family of murine peroxisome proliferator-activated receptors, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91 (1994) 7355-7359>.

우선, 실험에 사용되는 HaCaT 세포주에서 주된 반응을 보이는 PPAR 이소타입을 확인하기 위하여 HaCaT 세포를 5x10⁴의 농도로 24 웰(well)형 플레이트에 분주하고 24시간 배양한 후, 상기 PPRE 프로모터-리포터 플라스미드를 일시적 트랜스펙션(transient transfection)하였다. 24시간 배양 후 인산완충용약(PBS)으로 세척한 후 피토스핑고신(PS, 도 1a의 다섯 번째, 여섯 번째 칼럼)과 양성 대조군으로 기존에 알려진 PPARs 리간드<PPARα 리간드인 Wy-14,643(도 1a의 두 번째 칼럼), PPARβ/δ 리간드인 프로스타사이클린(도 1a의 세 번째 칼럼, prostacyclin, "PGI2"), PPARγ 리간드인 트로글리타존(도 1a의 네 번째 칼럼, troglitazone, "TGZ")>를 명 시된 농도로 처리하였다. 음성 대조군으로는 시료들을 녹일 때 사용한 에탄올을 처리한 군(도 1a의 첫 번째 칼럼)을 이용하였다. 24시간 배양 후 PBS로 세척하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하여 그 결과를 도 1a에 나타내었다. 도 1a에서 PPARγ 리간드인 TGZ에 대한 강한 반응성으로부터 PPARγ가 주된 이소타입임을 확인하였다.

다음으로, 피토스핑고신의 PPARs 활성 증진 효과를 확인하기 위하여, HaCaT 세포를 5x10⁴의 농도로 24 웰(well)형 플레이트에 분주하고 24시간 배양한 후, 상기 PPARα, PPARβ/δ, PPARγ 발현 플라스미드 각각과 PPRE 프로모터-리포터 플라스미드를 동시에 트랜스펙션시켰다. 24시간 배양 후 인산완충용약(PBS)으로 세척한 후 피토스핑고신(도 1b 각 그래프의 세 번째 칼럼)을 명시된 농도로 처리하였다. 음성 대조군으로는 시료들을 녹일 때 사용한 에탄올을 처리한 군(도 1b 각 그래프의 두 번째 칼럼)을 이용하였다. 24시간 배양 후 PBS로 세척하고 세포를 수확하여 루시퍼라제 활성을 측정하여 도 1b에 나타내었다. 각 그래프의 첫 번째 칼럼은 대조군으로서 트랜스펙션이 되지 않은 상태에서의 루시퍼라제 활성을 나타낸 것이다. 도 1b에 의하면, 피토스핑고신은 유의한 정도의 PPARα, PPARβ/δ, PPARγ의 활성을 유도하여 높은 루시퍼라제 활성을 나타내었다.

<실험예 2: PPARs 유전자 발현의 조절 효과>

HaCaT를 10% 우태아혈청(fetal bovine serum)을 포함한 DMEM 배지<둘베코의 수정된 이글스 배지(Dulbecco's modified Eagle's Medium), 집코(Gibco) 1210-0038>에서 배양하였다. 75플라스크에 1x10⁶개씩 분주하여, 24시간 배양한다. 그 후, 우태아혈청이 포함되지 않은 DMEM 배지를 처리하여 24시간 동안 배양한 다음 역시 우태아혈청이 포함되지 않은 배지에 0.1, 1, 5μM 농도의 피토스핑고신을 각각 24시간 처리하거나, 5μM 농도의 피토스핑고신을 6, 24, 48시간 동안 처리하였다. 그 후 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용약(PBS)로 세척하고 트리졸 시약<TRIzol™reagent, 라이프 테크놀로지스, 인크.(Life Technologies, Inc.)> 1ml를 첨가하여 총 RNA를 추출하여 정량적인 역전사 PCR을 수행하였다. PCR을 수행을 위한 PPARγ 의 프라이머 서열은 다음과 같다. 정방향으로, 5'-GCT GTC ATT ATT CTC AGT GGA GAC C -3', 역방향으로, 5'-CAA CTG GAA GAA GGG AAA TGT TGG -3'.

총 RNA 4μg을 50mM 트리스-HCl(Tris-HCl, pH 8.3), 75mM KCl, 3mM MgCl₂, 0.1M DTT, 10mM dNTP, 40유닛/μl RNase 저해제가 함유된 역전사 반응 완충액 25μl에 넣고, 0.5μg/μl 올리고(dT)₁₆의 프라이머와 200유닛 수퍼스크립트 II<SuperScript II, 집코비알엘(GiboBRL)>의 역전사 중합효소를 첨가하여 42℃에서 1시간 반응시킨다. 이후 역전사 반응 용액 2.5μl를 엠플리택(AmpliTaq)DNA 중합효소<0.04U, 퍼킨 엘멀, 쉘튼, 씨티(Perkin Elmer, Shelton, CT)>, 50mM 트리스(pH 8.3), 0.25mg/ml 우혈청알부민, 3mM MgCl₂, 0.25mM dNTPs, SYBR 그린 I의 1/50,000 희석액<몰레큘라 프로브, 유진, 오알(Molecular Probes, Eugene, OR)>이 함유된 PCR 반응 완충액 50리터에 섞고, 10μM의 프라이머를 첨가하여 94℃에서 30초, 53 ℃에서 30초, 72℃에서 1분인 사이클을 30사이클을 수행하였다.

상대적인 mRNA 레벨은 아이사이클러(ICycler) 소프트웨어를 이용하여 SYBR 그린 I 형광 변화를 측정함으로써 분석하여 도 2a 및 도 2b에 나타내었다. 양성 대조군으로는 PPARγ의 리간드인 TGZ를 사용하였으며(도 2a의 다섯 번째 칼럼), 피토스핑고신의 농도가 0일때(도 2a의 첫 번째 칼럼)를 기준으로 상대적인 mRNA 레벨을 나타내었다. 도 2a는 피토스핑고신의 농도가 0.1(두 번째 칼럼)에서 5μM(네 번째 칼럼) 사이일 때 PPARγ의 mRNA 양이 기준보다 1.5배 내지 4배 증가함을 나타내고, 도 2b는 5μM 피토스핑고신 처리 후 6, 24, 48시간 경과시(두 번째 내지 네 번째 칼럼) PPARγ의 mRNA 양이 기준(첫 번째 칼럼)보다 2.2 내지 3.8배 증가함을 나타낸다.

<실험예 3: 피토스핑고신에 의한 각질 세포 분열 억제능 측정>

신생아포피에서 분리한 인체 각질 형성 세포를 24공 평판배양기에 70% 밀도로 배양하고, 24시간 동안 피토스핑고신을 각각 0.1, 1, 5μM 처리하였다. 수확하기 4시간 전 1mCi/mL의 [³H]티미딘<뉴 잉글랜드 뉴클리어, 보스톤, 엠에이. (New England Nuclear, Boston, MA.), 2Ci/mmol>을 처리한 후 배양액을 제거하고 냉각된 인산완충용액으로 세척하였다. 그 후 냉각된 10%(w/v) 트리클로로아세트산(trichloroacetic acid)을 처리하여 세포를 고정하고 DNA를 침전시켰다. 세포를 파쇄한 후 5mL 신틸레이션 리퀴드(scintillation liquid)와 혼합하여 [³H]티미딘 방 사능을 측정하고 그 결과를 음성 대조군(첫 번째 칼럼)에 대한 백분율로 도 3에 나타내었다. 도 3에서와 같이 피토스핑고신은 0.1μM 농도(두 번째 칼럼)에서는 음성 대조군(첫 번째 칼럼)과 통계적으로 유의미한 차이를 보이지 않으나, 1, 5μM 농도(세 번째, 네 번째 칼럼)에서 각질세포의 분열을 억제하는 효과를 보였다.

<실험예 4: 피토스핑고신에 의한 각질 세포 분화 마커 코니파이드 엔벨롭(CE) 생성 증가 확인>

신생아포피에서 분리한 인체 각질 형성 세포 10⁵개를 12공 평판배양기에 배양하고, 7일 동안 CaCl₂, TGZ(양성 대조군, 두 번째 , 네 번째 칼럼) 또는 피토스핑고신으로 처리한 후 2% 소디움 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, "SDS") 용액을 처리하여 파쇄하였다. 5초 동안의 가벼운 소니케이션 후 12,000 rpm에서 15분 동안 원심분리하였다. 2% SDS/20 mM 디티오트레이톨(dithiothreitol)에 침전물을 현탁한 후 1시간 동안 가열하고, 310nm에서 CE의 양을 측정하여 대조군(첫 번째 칼럼)에 대한 백분율로 도 4에 나타내었다. 도 4에서와 같이, 피토스핑고신에 의해 각질 세포 분화 마커인 CE 양이 증가함을 알 수 있다(세 번째 칼럼).

<실험예 5: 피토스핑고신에 의한 각질 세포 분화 마커 인볼루크린의 증가 확인>

인체 각질형성세포 10⁵개를 12공 평판배양기에 배양하고, 3일 동안 CaCl₂, TGZ(양성 대조군, 두 번째, 네 번째 칼럼) 또는 피토스핑고신으로 처리한 후 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용액 (PBS)로 세척하였다. 세포를 회수한 후 파쇄하고, 12,000 rpm에서 15분간 원심 분리한 후 상등액을 얻어 ELISA 키트<바이오메디칼 테크놀로지스 인크., 스토우튼, 엠에이., 미국(Biomedical Technologies Inc., Stoughton, MA., USA)>를 이용하여 인볼루크린 양을 측정하여 도 5에 나타내었다. 도 5에서와 같이 피토스핑고신 처리(세 번째 칼럼)에 의해 인볼루크린 양이 대조군(첫 번째 칼럼)보다 40% 정도 증가하였다.

<실험예 6: 피토스핑고신에 의한 각질 세포 분화 마커 로리크린, 케라틴 1의 증가 확인>

신생아포피에서 분리한 인체 각질 형성 세포를 3일 동안 CaCl₂, TGZ(양성 대조군, 두 번째, 네 번째 칼럼) 또는 피토스핑고신으로 처리한 후 세포를 회수하여 냉각된 인산완충용액 (PBS)로 세척하고, 8M 우레아, 2% CHAPS, 50mm DTT, 2M 티오우레아(thiourea), 2mM PMSF, 100mg/ml 류펩타인(leupeptine)이 함유된 단백질 추출 완충용액 500μl을 처리한 후 10분간 상온에서 방치한다. 그 후 4℃에서 10분간 15,000g의 중력가속도로 원심분리하고, 상층액을 수거한 후 바이오라드 프로테인 염색 시약(BIO-Rad Protein Dye Reagent ™)을 이용하여 단백질을 정량한다.

20μg의 단백질을 8% SDS-PAGE를 이용하여 크기별로 분리하고, 50V로 12 시 간 동안 PDF(바이오라드)막에 블랏팅(blotting)한다. 이 블랏을5% 무지방 우유 용액으로 1시간 동안 블로킹한 후 일차 항체로는 안티-로리크린<밥코, 버클리, 씨에이,. 미국(BabCo, Berkeley, CA, USA)>이나 안티-K1 항체(밥코, 버클리, 씨에이., 미국)를 사용하였고, 홀스래디쉬 퍼록시다제(horse radish peroxidase)가 결합된 이차 항체<아메르샴(amersham)>와 아메르샴 사의 향상된 화학발광(enhanced chemiluminescence, "ECL") 키트를 이용하여 웨스트 블랏을 수행하였다. 반응시킨 블랏은 X선 후지 필름에 감광시킨 후 현상하여 단백질 발현 정도를 확인하였다. 필름 상의 밴드는 파워룩(PowerLook) 2100 XL(umax)를 이용하여 스캐닝한 후 이미지마스터 2D 엘리트(ImageMaster 2D Elite, 아메르샴 바이오사이언스) 이미지 분석 프로그램을 이용하여 분석하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에서와 같이, 피토스핑고신을 5μM 처리하였을 때(세 번째 칼럼) 미처리군(첫 번째 칼럼)과 대비하여 로리크린 양은 3.8배, 케라틴 1양은 6.2배 증가하였다. 결과를 정확하게 하기 위하여 언제나 일정한 양으로 발현되는 액틴 밴드를 나타내었다.

<실험예 7: 접촉성 피부염 동물 모델에서 TPA 도포에 의한 피부 염증과 피부 과다증식의 억제 효과>

본 실험을 위하여 체중이 25-39g 정도 되는 7주령의 암컷 무모 생쥐(hairless mice, Skh:HR-1)와 ICR 생쥐를 바이오제노믹스(Biogenomics, 서울, 한국)로부터 구입하여 사용하였다. 실험쥐들을 일주일 동안 동물 사육실에서 적응시 킨 후 그룹 당 7마리씩 비처리 대조군(도 8의 첫 번째 칼럼), TPA+매개물(vehicle) 처치군(음성 대조군, 도 8의 두 번째 칼럼), TPA+피토스핑고신 처치군(도 8의 세 번째 칼럼), TPA+TGZ 처치군(양성 대조군, 도 8의 네 번째 칼럼)으로 나누어 사육하였다. 23.2℃의 온도와 55.10%의 습도에서 생활하도록 하였으며 명암은 12시간 주기로 조명하였다. 그 외 실험기간 동안 먹이와 물은 자유롭게 섭취할 수 있도록 하였다. 매개물로 에탄올과 프로필렌 글리콜이 7:3으로 혼합된 용매를 사용하였고, 피토스핑고신 20μmol이나 TGZ 20μmol을 TPA 처리후 30분 경과한 시점에 도포하였다.

동물을 희생시킨 후 귀 혹은 등쪽 피부를 10% 중성 포르말린에 고정시키고 파라핀에 임베드하여 얇은 절편으로 자른 후 H&E 염색을 하였다. 염색된 조직 절편은 이미지프로-플러스(ImagePro-Plus)<미디아 사이버네틱스, 실버스프링, 엠디(Media Cybernetics, Silver Spring, MD)>를 이용하여 분석되었다. 도 7의 A는 TPA+매개물(vehicle) 처치군(음성 대조군), B는 TPA+피토스핑고신 처치군, C는 TPA+TGZ 처치군(양성 대조군), D는 비처리 대조군에 해당한다.

또한, 표피의 면적과 기저막의 길이를 측정한 후 (표피의 면적÷기저막의 길이)식을 통해 표피의 두께를 구하고 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8에서와 같이 TPA 처리에 의해 유도된 접촉성 피부염 동물 모델에서 피토스핑고신(세 번째 칼럼)은 TPA에 의해 유도된 표피 과다 증식을 억제하였다.

한편, ICR 생쥐의 귀 조직을 이용하여 부종 반응과 미엘로퍼록시다제(myeloperoxidase, "MPO") 활성을 측정하여 도 9에 나타내었다. 조직은 1.5ml의 0.5% 헥사데실트리메틸암모니움 브로마이드(hexadecyltrimethylammonium bromide, "HTAB")를 포함한 50mM 소디움 포스페이트 버퍼(sodium phosphate buffer, pH 6.0)에 담근 후 균질화하여 원심분리로 상층액을 얻는다. 50μl의 상층액에 0.5% HTAB를 포함한 포스페이트 버퍼(pH 6.0) 50μl과 o-디아니시딘(dianisidine) 용액(증류수 내 0.68mg/mL) 50μl를 첨가하고 50μl의 0.003% 하이드로젠 퍼록사이드(hydrogen peroxide)를 첨가하여 반응을 시작한다. 5분 간격으로 450nm 에서 흡광도를 측정하여 MPO 활성을 측정한다.

도 9에서는 피토스핑고신의 항염 효과를 보기 위해 대조군(첫 번째 칼럼) 대비 백분율로 TPA 도포에 따른 피부 부종 정도와 면역 세포의 피부 침윤 지표인 MPO 활성을 측정하여 나타내었다. 양성 대조군으로는 아스피린과 TGZ를 사용하였다(두 번째, 네 번째 칼럼). 접촉성 피부염 동물 모델에서 피토스핑고신(세 번째 칼럼)은 TPA 도포에 따른 피부 부종을 억제하고, 면역 세포의 피부 침윤 지표인 MPO 활성을 감소시켰다.

<실험예 8: 단핵 백혈구에서 TPA 처리에 의한 프로스타글란딘 생성억제 효과>

생쥐의 말초 단핵백혈구를 96공 평판배양기에 배양하고 2시간 동안 TPA(16nM)를 처리한 후 사이클로옥시제나제(cyclooxygenase) 저해제(inhibitor)인 인도메타신(indometacin, 1nM, 10nM, 양성 대조군, 세 번째, 네 번째 칼럼), 피토스핑고신 또는 TGZ(5μM, 양성 대조군, 여섯 번째 칼럼)을 16시간 동안 처리한다. 염증 매개인자인 프로스타글란딘(PGE₂)농도를 효소 면역분석(enzyme immunoassay, "EIA") 키트<케이만 케미컬, 앤 아버, 엠아이., 미국(Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA)>를 이용하여 측정하고 그 결과를 도 10에 나타내었다. 도 10에서와 같이 TPA 처리에 의해 생쥐의 말초 단핵백혈구에서의 프로스타글란딘 생성은 크게 증가하나(두 번째 칼럼), 5μM 피토스핑고신 처리(다섯 번째 칼럼)에 의해 프로스타글란딘 생성이 38%까지 감소된다.

<실험예 9: 노화에 따른 프라스타글란딘 생성 증가를 억제하는 피토스핑고신의 효과>

인간 진피 섬유아세포를 10% 우태아 혈청을 포함한 DMEM 배지에서 피토스핑고신 5μM 첨가하거나 첨가하지 않은 상태로 배양하였다. 80-90%의 밀도에 도달했을 때 1/2로 계대 배양하여 패시지(passage)5, 패시지10, 패시지20, 패시지30일 때 세포를 얻어 프라스타글란딘 양을 측정하고 그 결과를 도 11에 나타내었다. 도 11에서와 같이 피토스핑고신은 증식하는 노화 세포 모델에서 노화에 따른 프라스타글란딘 생성 증가를 억제하는 것이 확인되었다.

<실험예 10: UV에 의한 NF-κB 활성 증가를 억제하는 피토스핑고신의 효과>

인체 각질형성세포주인 HaCaT 10⁶개를 100mm 세포 배양 접시에서 배양하고, FS40 램프<웨스팅하우스, 피츠버그, 피에이., 미국(Westinghouse, Pittsburgh, PA, USA)>를 이용하여 자외선 B를 10mJ/cm²로 조사한 후, 피토스핑고신을 1, 5μM 포함한 배지로 교체하였다. 배양 6-24시간 후 트랜스팩터 추출 키트(TransFactor extraction kit)<비디 바이오사이언스 클론테크, 산 호세, 씨에이., 미국(BD Bioscience CLONTECH, San Jose, CA, USA)>를 이용하여 핵 추출물을 얻고 그 후 트랜스팩터 키트(비디 바이오사이언스 클론테크, 산 호세, 씨에이. 미국)를 이용하여 NF-κB 활성을 측정하였다. 그 결과는 도 12에 나타내었다. 양성 대조군으로는 TGZ(여섯 번째 칼럼)와 트랜스팩터 키트에서 제공하는 경쟁자 올리고(competitor oligo, 일곱 번째 칼럼)를 사용하였다. 자외선을 조사하지 않고 피토스핑고신을 처리한 경우(두 번째 칼럼)에도 처리하지 않은 경우(첫 번째 칼럼)에 비해 NF-κB 활성이 다소 감소되었다. 도 12에서와 같이 자외선 조사에 의해 NF-κB 활성이 크게 증가하나(세번째 칼럼) 피토스핑고신의 처리(네 번째, 다섯 번째 칼럼)로 자외선에 의한 NF-κB 활성 증가가 억제되는 것이 확인되었다.

<실험예 11: UV에 의한 MMP-1 생성 증가를 억제하는 피토스핑고신의 효과>

인체 각질형성세포주인 HaCaT 10⁶개를 100mm 세포 배양 접시에서 배양하고, 피토스핑고신을 1, 5uM 전처리한 후 FS40 램프(웨스팅하우스, 피츠버그, 피에이., 미국)를 이용하여 자외선 B를 10mJ/cm²로 조사하였다. 피토스핑고신 1, 5μM을 포함한 배지로 교체한 후 48시간 동안 배양하고 MMP-1 양을 ELISA 키트<아메르샴 파마시아 (amersharm pharmacia), cat.#; RPN2610>를 이용하여 측정하였다. 각각 측정 된 MMP-1의 양은 전체 단백질 대비 상대적 양으로 보정하여 도 13에 나타내었다. 양성 대조군으로는 TGZ(다섯 번째 칼럼)를 사용하였다. 도 13에서와 같이 자외선 조사에 의해 MMP-1 생성이 증가하나(두 번째 칼럼) 1, 5μM의 피토스핑고신의 처리(세 번째, 네 번째 칼럼)로 자외선에 의한 MMP-1 생성 증가가 유의미하게 억제되는 것이 확인되었다.

<실험예 12: 노화에 따른 MMP-1 생성 증가를 억제하는 피토스핑고신의 효과>

인간 진피 섬유아세포를 10% 우태아혈청을 포함한 DMEM 배지에서 피토스핑고신을 첨가하거나 첨가하지 않은 상태로 배양하였다. 80-90%의 밀도에 도달했을 때 1/2로 계대 배양하여 패시지5, 패시지10, 패시지20, 패시지30일 때 세포를 얻어 MMP-1 양을 측정하고 그 결과를 도 14에 나타내었다. 도 14에서처럼 피토스핑고신은 증식하는 노화 세포 모델에서 노화에 따른 MMP-1 생성 증가를 억제하는 것이 확인되었다.

본 발명의 피부 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스, 팩 또는 연고 등의 제형을 가질 수 있다.

<실시예 1: 영양 화장수>

본 발명에 따른 피부 외용제 중 영양 화장수를 하기 표 1의 조성으로 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
정제수	To 100
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
히아루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
피토스핑고신	0.05
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	8.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
트리에탄올아민	0.1

<실시예 2: 영양 크림>

본 발명에 따른 피부 외용제 중 영양 크림을 하기 표 2의 조성으로 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
정제수	To 100
글리세린	3.0
부틸렌글리콜	3.0
유동파라핀	7.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
피토스핑고신	3.0
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	5.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
방부제	적량
향	적량
색소	적량
트리에탄올아민	0.1

<실시예 3: 마사지 크림>

본 발명에 따른 피부 외용제 중 마사지 크림을 하기 표 3의 조성으로 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
정제수	To 100
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	45.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
피토스핑고신	1.0
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.0
밀납	4.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
세스퀴 올레인산 소르비탄	0.9
바세린	3.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
파라핀	1.5

<실시예 4: 팩>

본 발명에 따른 피부 외용제 중 팩을 하기 표 4의 조성으로 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
정제수	To 100
글리세린	4.0
폴리비닐알콜	15.0
히아루론산 추출물	5.0
베타글루칸	7.0
알란토인	0.1
피토스핑고신	0.5
노닐 페닐에테르	0.4
폴리솔베이트 60	1.2
방부제	적량
향	적량
색소	적량
에탄올	6.0

<실시예 5: 연고>

본 발명에 따른 피부 외용제 중 연고를 하기 표 5의 조성으로 제조하였다.

성분	함량 (중량 %)
정제수	To 100
글리세린	8.0
부틸렌글리콜	4.0
유동파라핀	15.0
베타글루칸	7.0
카보머	0.1
피토스핑고신	1.0
카프릴릭 카프릭 트리글리세라이드	3.0
스쿠알란	1.0
세테아릴 글루코사이드	1.5
소르비탄 스테아레이트	0.4
세테아릴 알코올	1.0
방부제	적량
향	적량
색소	적량
밀납	4.0

상기에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 의한 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물은 생체 내 PPARs를 활성화시키고 그 발현을 증가시킴으로써, 면역 세포의 피부 침습과 프로스타글란딘 생성에 의한 염증 반응을 억제하고, 각질세포의 과다 증식을 억제시키며, 정상 각질 세포의 분화를 촉진, 증식을 정상화시키므로 염증, 각질 분화 이상, 표피 과다 증식을 특징으로 하는 접촉성 피부염과 이에 동반되는 표피 과증식 질환의 치료제로 활용될 수 있다. 또한 PPARs 활성 조절을 통하여 염증을 억제하는 기전으로 NF-κB 활성과 프로스타글란딘 생성, MMP-1 생성을 억제시키므로 피부노화 방지제로 활용될 수 있다. 그리고, 접촉성 피부염의 위험이 있는 민감성 피부에 적합한 피부 외용제로 활용될 수 있다.

Claims (7)

1. 하기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 접촉성 피부염 치료용 피부 외용제 조성물.

   [화학식 1]

   
2. 하기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 표피 과증식 질환 치료용 피부 외용제 조성물.

   [화학식 1]

   
3. 하기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 피부노화 방지용 피부 외용제 조성물.

   [화학식 1]

   
4. 하기 화학식 1로 표시되는 피토스핑고신을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 민감성 피부용 피부 외용제 조성물.

   [화학식 1]

   
5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 피토스핑고신은 퍼옥시즘 증식체 활성화 수용체(peroxisome proliferator-activated receptors, "PPARs")를 활성화시키는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 피토스핑고신은 PPARs의 발현을 증가시키는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
7. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스, 팩 또는 연고의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.

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