KR20070090232A - 싸이클로덱스트린의 검출 및 정량화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 단백질 함유 용액 중 싸이클로덱스트린 및 싸이클로덱스트린 유도체의 검출 및 정량화에 관련된다. 본 발명은 나아가 잔류 싸이클로덱스트린 존재에 관하여 약학 제제를 평가하는 방법에 관련된다.

Description

싸이클로덱스트린의 검출 및 정량화{DETECTION AND QUANTITATION OF CYCLODEXTRINS}
본 발명은 단백질 함유 용액 중 싸이클로덱스트린 및 싸이클로덱스트린 유도체의 검출 및 정량화에 관련된다. 본 발명은 나아가 잔류 싸이클로덱스트 존재에 관하여 약학 제제를 평가하는 방법에 관련된다.
싸이클로덱스트린은, 도넛 모양 고리 내의 알파-1,4-글루코사이드 결합에 의해 연결된 6개 (α-싸이클로덱스트린), 7개 (β-싸이클로덱스트린), 또는 8개 (γ-싸이클로덱스트린)의 글루코스 유닛으로 가장 흔히 이루어진 고리형 다당류이다. 당 유닛의 의자 배열 결과, 모든 2차 히드록시 유닛은 고리의 한 측면에 존재하고 모든 1차 히드록시 기는 다른 측면에 존재한다. 그 결과, 외부 면은 친수성으로써, 싸이클로덱스트린은 수용성이다. 반면, 싸이클로덱스트린의 동공은 소수성인데 이는 C3 및 C5의 수소 원자 및 유사 에테르성 산소에 의해 나열되기 때문이다. 이러한 구조는 싸이클로덱스트린이 소수성 화합물과 내포 착물을 형성 가능하게 한다. 이러한 특성에 따라, 싸이클로덱스트린은, 수용성이 열악한 약품의 용해도를 제고하고, 약학적 안정성을 제고하며, 약품의 원치 않는 부작용을 감소시키기 위해 널리 사용된다.
싸이클로덱스트린의 히드록시 기는, 분자의 특성 (일례로, 수용성, 결합 특이성) 변형을 위해 유도체화 가능하다. 메틸-β-싸이클로덱스트린 (MBCD)은 싸이클로덱스트린 유도체로 가장 빈번하게 사용되는 것 중의 하나이다.
싸이클로덱스트린은 또한 세포 내로 콜레스테롤과 같은 소수성 영양소를 운반하기 위해 세포 배양 시스템 중에 사용된다. 싸이클로덱스트린은 콜레스테롤 영양의존성 (auxotrophic) 세포, 일례로 콜레스테롤 영양의존성 CHO 세포, COS 세포, 및 NSO 세포의 배양에 특히 유용하다. 천연 발생 또는 재조합 단백질, 특히 치료 단백질의 제조를 위해 세포 배양을 사용하는 경우, 정제된 단백질 생성물중 잔류 오염물로서의 싸이클로덱스트린의 존재는 약학 제품의 제조시 문제가 된다. 따라서, 단백질 포함 용액 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 낮은 수준을 검출 및 정량화하는 민감하면서도 신속한 기법이 필요하다.
Grosse 등 (J. Chromatography B 694:219 (1997))은, MBCD와 내포 착물을 형성하여 내포 착물의 형광 검출을 가능하게 하는 형광체 (1-나프톨)의 존재 하에 크기 배척 크로마토그래피를 이용하는 MBCD 검출 기법을 개시한다. 약리동력학 연구상의 혈장 샘플 중의 MBCD 검출을 위해 고안된 상기 기법은, 크로마토그래피 이전에, 유기 용매로의 샘플 추출, 증발 및 이동상 내의 잔류물의 용해를 필요로 한다. Gage 등은 (J. Pharm. Biomed. Analysis 22:773 (2000)) 혈장 샘플 중 설포부틸에테르-β-싸이클로덱스트린 존재 측정을 위해 1-나프톨을 사용하는 유사 기법을 개시한다. 상기 방법은, 크로마토그래피 이전에, 고체상 추출, 증발 및 잔류물의 용해를 포함하는 샘플의 가공을 필요로 한다. 이들 기법은, 단백질 성분들로부터의 싸이클로덱스트린 분리를 도모하지 못한다.
단백질 존재 하에서, 바람직하게 샘플 추출 단계의 필요 없이, 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 존재를 테스트하는 방법이 당업계에서 필요하다.
따라서 한 면에서, 본 발명은 단백질 함유 용액 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 존재의 테스트 방법을 제공하며, 이는, 상기의 단백질로부터 존재할 수 있는 임의의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 크기 배척 크로마토그래피 (SEC)로 분리하고 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고, 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 측정함을 포함한다.
본 발명의 다른 면은, 단백질 함유 용액 중 존재할 수 있는 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 함량의 측정 방법을 제공하며, 이는, 상기의 단백질로부터 임의의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 SEC로 분리하고 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고, 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 측정하고, 상기 신호의 크기를 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 신호의 크기는 용액 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 함량의 지표인 것이다.
본 발명 제 3의 면은, 하기를 포함하는 약학 제제 평가 방법이다:
(a) 치료 단백질 및 약학 허용 담체 포함 약학 제제를 제공하고;
(b) SEC로 상기 약학 제제를 분리하고;
(c) 약학 제제 내에 존재 가능한 임의의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고; 및
(d) 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 검출하고, 여기에서 상기 신호의 크기는 제제 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 함량의 지표임.
본 발명의 한 구현에서, 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체는 MBCD이다.
본 발명의 다른 구현에서 시약은 일례로 1-나프톨과 같은 형광체이다. 시약은 SEC에 의한 분리 이전, 동안 또는 이후 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 접촉시킬 수 있다.
한 구현에서, 약학 제제 또는 용액의 샘플은 어떤 제제도 없이 SEC 컬럼 상에 로딩되며, 일례로 샘플은 유기 용매로 추출, 건조, 재현탁, 농축 또는 기타 변형되지 않는다.
도 1은, MBCD 존재 및 부재 하에 정제된 나틸리주마브의 약학 제제에 대한 대표적 크로마토그램을 나타낸다; (a) 약학 제제 (19.6 mg/mL 나틸리주마브); (b) 제형화 완충액; (c) 1.3 μg/mL MBCD로 스파이킹한 약학 제제 (19.6 mg/mL 나틸리주마브).
도 2는 MBCD 표준에 대한 선형 커브를 나타낸다.
도 3은 MBCD 스파이킹한 나틸리주마브 약학 제제의 선형 커브를 나타낸다.
본 발명은 단백질 함유 용액 중 낮은 수준의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 검출 및 정량화에 관련된다. 한 구현에서, 본 발명 방법은, 싸이클로덱스트린 및 싸이클로덱스트린 유도체 존재 하에 성장시킨 세포에서 제조된 정제된 단백질의 잔류 싸이클로덱스트린 존재에 대한 평가에 유용하다. 따라서 한 면에서, 본 발명은, 단백질 함유 용액 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 존재의 테스트 방법이며, 이는, 상기의 단백질로부터 임의의 존재할 수 있는 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 크기 배척 크로마토그래피 (SEC)로 분리하고, 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고, 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 측정함을 포함한다.
본 발명의 다른 면은, 단백질 함유 용액 중 존재 가능한 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 함량의 측정 방법을 제공하며, 이는, 상기의 단백질로부터 임의의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 SEC로 분리하고, 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고, 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 측정하고, 상기 신호의 크기를 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 신호의 크기는 용액 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 함량의 지표인 것이다.
본 발명 제 3의 면은, 하기를 포함하는 약학 제제 평가 방법이다:
(a) 치료 단백질 및 약학 허용 담체 포함 약학 제제를 제공하고;
(b) SEC로 상기 약학 제제를 분리하고;
(c) 약학 제제 내에 존재 가능한 임의의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고; 및
(d) 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 검출하고, 여기에서 상기 신호의 크기는 제제 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 함량의 지표임.
여기에서 사용된 "싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체"라는 용어는, 임의의 공지 싸이클로덱스트린, 특히 α-싸이클로덱스트린, β-싸이클로덱스트린, 및 γ-싸이클로덱스트린, 및 임의의 공지 싸이클로덱스트린 유도체를 일컫는다. 싸이클로덱스트린 유도체는 미국 특허 3,426,011, 3,453,257, 3,453,258, 3,453,259, 3,453,260, 3,459,731, 3,553,191, 3,565,887, 4,383,992, 4,535,152, 4,616,008, 4,638,058, 4,659,696, 4,746,734, 4,678,598, 5,594,125, 5,710,268, 및 5,831,081 호에 기재되어 있으며, 이들 각각은 참조로 편입된다. 싸이클로덱스트린 유도체의 예는 MBCD, 히드록시에틸-β-싸이클로덱스트린, 및 히드록시프로필-β-싸이클로덱스트린을 포함한다. 싸이클로덱스트린 및 싸이클로덱스트린 유도체는 다음의 회사로부터 시판된다; American Maize Products Company, Wacker Chemicals (USA), Inc., 및 Sigma-Aldrich Chemical Company.
여기에 사용된 "싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약"이라는 용어는, 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 내포 착물을 형성할 수 있는 임의의 시약을 의미하여, 여기에서 내포 착물은 SEC 컬럼으로부터 용출시 검출될 수 있는 것이다. 상기 용어는, 그 자체로는 검출 가능하지 않으나, 일례로 방사성뉴클리드 또는 형광 태그와 같은 검출 가능한 표식을 포함하는 시약을 포함한다. 상기 용어는 또한, 그 자체로는 검출 가능하지 않으나, 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성하는 시약을 포함한다. 검출 방법의 예는, 형광 검출, 자외선 검출, 방사능계측 측정, 색도계측 측정, 형광 편광, 증발성 광산란, 모세관 전기영동, 적외선 분광학, 1H NMR 및 질량 스펙트로스코피를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 한 구현에서, 검출 가능한 시약은, 일례로 1-나프톨인 형광체이다. 다른 검출 가능한 시약으로 페놀프탈레인 및 8-아닐리노나프탈렌-1-설폰산을 또한 사용 가능하다.
여기에 사용된 "치료 단백질"이라는 용어는, 질환 또는 장애의 예방, 치료 또는 개선에 유용한 것으로 알려진 임의의 펩티드 또는 단백질을 일컬으며, 일례로, 항체, 성장 인자, 세포 표면 수용체, 싸이토카인, 호르몬, 독소 또는 상기 임의의 단편 및/또는 융합 단백질이다. 최대 광의로 사용된 "항체"라는 용어는, 모노클로날 항체, 키메라, 인간화 또는 완전 인간 항체 및, 단쇄 항체, 경쇄 및 중쇄 이량체, 및 Fv, Fab, 및 (Fab')2 단편과 같은 항원 결합 항체 단편 및/또는 그 유도체를 포함한다. 치료 단백질의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지는 않는다; 에리트로포이에틴, 성장 호르몬, 칼러니 자극 인자, 인슐린과 같은 단백질, 및 나틸리주마브, 인플릭시마브, 아달리무마브, 맵쎄라 (MabThera), 헤르셉틴 (Herceptin), 팔리비주마브, 압시지마브, 알렘투주마브, OKT3-뮤로모나브-CD3, 바실리지마브, 겜투주마브, 오조가미신, 오말리주마브, 이브리투모마브 티욱세탄, 에드레오콜로마브-Mab17-1A, 토시투모마브, 에팔리주마브, 베바시주마브, 및 세툭시마브와 같은 치료 항체. 단백질은, 단백질이 천연 발생하는 세포 일례로 또는 재조합 발현된 세포와 같이, 유전적으로 발현하도록 엔지니어링된 세포로부터 분리 가능하다.
여기에 사용된 "90% 이상 (또는 초과) 순수" 및 "90% 이상 (또는 초과) 균일도" 라는 용어는, 기타 단백질, 지질, 핵산 및 기타 세포 성분이 제거된 단백질을 의미하며 따라서 단백질이 정제 제제의 90 건조 중량% 이상 (또는 초과)를 나타내는 것이다. 일부 구현에서 단백질은 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 순수할 수 있다.
여기에 기재된 세포주를 일컫기 위해 사용된 "그 유도체"라는 용어는, 하나 이상의 새로운 특성을 가지는 세포주로부터 생성된 임의의 세포를 의미한다. 새로운 특성을 가진 세포 유도체의 예는, 상이한 성장 패턴 (일례로 콜레스테롤 영양의존성)을 가져서 선택적 압력 하에 생성될 수 있는 세포, 및 기타 다른 새로운 양태를 나타내거나 단백질을 발현하도록 유전적으로 엔지니어링된 세포를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 방법에서, SEC 컬럼은 임의의 적절한 크기일 수 있고, 단백질로부터 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 분리를 위해 적절한 임의의 SEC 매질을 포함할 수 있다. 한 구현에서, SEC 매질은 약 5-20 kDa 내지 약 75-300 kDa의 분리 범위를 가진다. SEC 매질은 약 2 - 약 6 마이크론, 바람직하게는 약 3-5 마이크론, 일례로 약 4 마이크론의 입자크기를 가질 수 있다. 적절한 SEC 매질의 한 예는, TSK 젤 G2000 SWXL (Tosoh Biosciences, Inc.)이다. 기타 적절한 SEC 매질은 중합체 기재 TSK 젤 컬럼이다. 바람직한 구현에서, 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC)를 이용하여 분리를 실시한다. HPLC에서, SEC 컬럼의 적절한 크기는 약 5 - 약 15mm 직경 및 약 3 - 약 60cm 길이 범위이다. 샘플 크기는 약 10 - 약 500 μL, 바람직하게는 약 50 - 약 100 μL 범위일 수 있다.
SEC 컬럼 상에 로딩하는 샘플은, 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 존재를 테스트하고자하며, 단백질을 포함하는 임의의 용액으로부터의 샘플일 수 있다. 본 발명의 한 구현에서, 샘플은, 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 존재 또는 함량을 측정하고자하는, 정제 과정 중 또는 정제된 단백질을 포함하는 용액에서 유래한 것이다. 한 구현에서, 단백질은 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 존재 하에 세포 배양액 중 성장된 세포에서 정제되었거나 정제될 것이다. 샘플은 일례로 세포 용해 이후, 하나 이상의 정제 단계 이후 (일례로 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등), 또는 최종 정제 단계 이후에 단백질의 정제 과정 임의의 단계에서의 용액에서 유래한 것일 수 있다. 용액중 단백질은, 90% 이상 순수, 바람직하게는 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상 순수한 것일 수 있다. 한 구현에서, 샘플은 20 μg/mL 미만, 바람직하게는 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2 μg/mL, 또는 1 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 가지는 용액으로부터 유래한 것이다.
샘플은 용액의 완충제가 SEC에 적합하도록 조절된 한, 단백질 함유 용액으로부터 취하여진 후 SEC 컬럼 상에 바로 로딩될 수 있다. 필요하다면, 샘플의 완충액을 SEC에 적합하도록 조절 가능하다. SEC에 적절한 완충액은 약 2.0 - 약 8.0, 바람직하게는 약 5.0 - 약 7.5의 pH를 가진 수성 완충액이다. 적절한 완충제의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 소듐 포스페이트, 포타슘 포스페이트, 소듐 아세테이트, 소듐 시트레이트, 포타슘 니트레이트 및 Tris-HCl. 완충제는 또한 충분한 염을 포함함으로써 샘플 중 단백질이 컬럼 및 SEC 매질에 달라붙는 것을 방지하도록 한다. 염의 적절한 수준은 약 50 mM 내지 약 300 mM 범위, 바람직하게 약 100 mM 내지 약 200 mM, 더 바람직하게 약 140 mM이다. 염의 예는 다음을 포함하나 이에 제한되지 않는다: 소듐 클로라이드, 포타슘 클로라이드, 소듐 설페이트, 포타슘 설페이트, 마그네슘 설페이트, 암모늄 설페이트, 암모늄 포스페이트, 및 마그네슘 클로라이드. 바람직하게 염은 소듐 클로라이드이다.
본 발명 한 구현에서, 샘플은 필요한 완충액 조절 이외에는 임의의 제조 단계를 거치지 않는다. 일례로, 샘플은 추출 (일례로 유기 용매 또는 고체 상 카트리지로), 건조, 재현탁, 농축 또는 기타 변형되지 않는다. 일례로 복잡한 추출 또는 기타 조작 (일례로, 샘플 회수에 영향을 미칠 수 있는 용매 또는 고체 상 추출) 없이 충전 시점에서 약학 제제를 테스트하기 위해, SEC 컬럼 상에 샘플을 직접 로딩할 수 있는 성질은, 본 발명의 한 장점이다.
이동상은 약 2.0 내지 약 8.0, 바람직하게 약 5.0 내지 약 7.5 사이의 pH를 가지고, 샘플 중 단백질이 컬럼 또는 SEC 매질에 달라붙는 것을 방지하도록 하는 충분한 염을 포함한 수성 완충액일 수 있다 (일례로 약 50 mM 내지 약 300 mM, 바람직하게 약 100 mM 내지 약 200 mM). 적합한 완충제 및 염은 상기 샘플 제제에 대해 기재한 것들이다. 적절한 이동상의 한 예는 140 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, pH 6.45이다.
싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성하는 시약을, 샘플을 SEC에 의해 분리하기 이전, 동안 또는 이후에 샘플 중 존재하는 임의의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 접촉시킬 수 있다. 일례로, 시약은 컬럼 상에 로딩 이전에 샘플에 첨가될 수 있고, 시약은 이동상 내에 존재 가능하며, 시약은 컬럼으로부터 수합된 용출 분획에 첨가할 수 있고, 또는 상기의 임의의 조합일 수 있다. 바람직한 구현에서, 시약은 이동상 내에 존재한다.
상이한 싸이클로덱스트린은 상이한 결합 특이성을 가지므로, 검출하고자 하는 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체에 따라 시약을 선택한다. 적절한 시약은 당업계 공지이고, 각 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체에 따라 실험적으로 검증 가능하다. 시약은 고유의 검출성 신호를 가지거나 (일례로 형광) 또는 검출성 표지가 부착된 것일 수 있다 (일례로 형광체 또는 방사성뉴클리드). 다른 구현에서, 시약은 고유의 검출성 신호는 없으나 시약이 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체에 결합 시에 형성되는 내포 착물이 검출성 신호를 생성하는 것이다. MBCD 검출에 적절한 형광 화합물의 한 예는, 1-나프톨이다. 적절한 다른 형광 화합물의 예는, 페놀프탈레인 및 8-아닐리노나프탈렌-1-설폰산을 포함한다. 시약이 수용성이면 이동상에 직접 첨가 가능하다. 시약이 수용성이 아니면 유기 용매 (메탄올, 에탄올, 클로로포름 또는 아세톤을 포함하나 이에 제한되지는 않음)에 용해시켜 이동상에 첨가함으로써 유기 용매의 백분율이 낮아지도록 할 수 있다 (일례로 10% 미만, 바람직하게 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2%, 또는 1% 미만). 이동상 중 시약의 농도는 검출할 신호에 대해 충분한 것이다. 일례로 1-나프톨 또는 기타 형광 화합물은 이동상 내에 약 1 x 10-8 내지 약 1 x 10-2 M, 바람직하게 약 1 x 10-5 내지 약 1 x 10-3 M, 바람직하게 약 1 x lO-4 M의 농도로 존재 가능하다.
SEC 분리는 당업계 공지의 방법에 의해, 적절한 컬럼 제제, 샘플 로딩, 유속, 분획 수합 및 신호 검출 기법을 이용하여 수행 가능하다. 일례로 다음 문헌을 참조하며 이들 각각은 참조로 편입된다; Deutscher, Meth. Enzymol: Guide to Protein Purification, Vol. 182, Academic Press, Inc., San Diego (1990), Chapter 38; Balch 등, Meth. Enzymol, Vol. 257, Academic Press, Inc., San Diego (1995), Chapter 8); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag (1994); Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology. 바람직한 구현에서, HPLC로 분리를 수행한다. 신호 검출기는 시약의 측정에 유용한 임의의 검출기, 일례로 형광 검출기, UV 검출기 또는 방사능 검출기일 수 있고, 컬럼과 함께 또는 별도로 사용될 수 있다. 형광체를 시약으로 사용 시에, 형광 검출기는 당업계에 공지된 바에 따른 적절한 여기 및 방출 파장, 일례로 1-나프톨에 대해 290 nm 및 360 nm 각각으로 고정할 수 있다. 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 정량화하는 경우, 검출된 신호 크기를 측정하고, 샘플내 존재하는 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 양을 측정하기 위해 시약량을 증가시키는 스파이킹된 샘플로부터 성립한 표준 커브와 비교할 수 있다.
본 발명의 방법을 사용시, 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 검출 한계는 100 μg/mL 미만, 바람직하게 50 μg/mL, 20 μg/mL, 10 μg/mL, 5 μg/mL, 2 μg/mL, 또는 1 μg/mL 미만이다.
단백질, 특히 치료 단백질은, 세포 배양액으로부터 정제되어 약학 제제로 제조 가능하다. 세포는 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 존재 하에 배양 가능하며, 특히 세포가 콜레스테롤 영양의존성 세포와 같이 성장에 대해 소수성 화합물 의존적인 경우이다 (일례로 CHO, COS, 또는 NSO 세포의 콜레스테롤 영양의존성 유도체). 본 발명의 한 면에서, 약학 제제는 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 존재에 대해 평가될 수 있다.
본 발명 방법에서, 단백질 발현용으로 당업계 공지된 임의의 세포를 사용 가능하다. 그 예는, NSO 세포, 원숭이 COS 세포, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, 인간 신장 293 세포, 인간 상피 A431 세포, 인간 Colo205 세포, 3T3 세포, CV-I 세포, HeLa 세포, 및 마우스 L 세포, BHK, HL-60, U937, HaK 또는 Jurkat 세포를 포함한다. 세포는, 당업계 공지의 임의의 방법으로 배양 가능하다. 한 구현에서, 세포는 콜레스테롤 영양의존성 세포 (일례로 NSO 세포 또는 그로부터 유래된 세포)이다. 다른 구현에서, 세포는 MBCD 존재 하에 배양된다. 배양된 세포는 정제될 단백질을 천연 발현하거나 단백질을 발현하도록 유전자 엔지니어링된다. 관심 단백질 발현을 위해 세포를 유전자 엔지니어링하는 방법은 당업계 공지이다. 일례로 다음 문헌을 참조하며 이들 각각은 참조로 편입된다; Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; Ausubel 등, Current Protocols in Molecular Biology. 세포는 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 존재 하에 배양된다. 단백질을 이후 배양된 세포 또는 배양 매질로부터 당업계 공지의 기법을 사용하여 정제한다 (일례로 이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기 배척 크로마토그래피, 상이한 용해도, 한외여과 등). 단백질은 90% 이상의 균일도, 바람직하게 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 이상의 균일도로 정제될 수 있다. 정제된 단백질은 이후 약학 허용 담체와 조합되어 약학 제제를 생산한다.
약학 허용 담체는 부형제 및 첨가제를 포함하며, 이는 약학적으로 사용될 수 있는 제제 내로의 단백질 가공을 촉진한다. 제한이 아닌 부형제의 에는 다음과 같다; 물, 식염수, 인산 완충된 식염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등. 제한이 아닌 당업계 공지의 첨가제는 다음을 포함한다; 일례로 계면활성제 (일례로 TWEEN-80과 같은 TWEEN), 점착소거제, 소포제, 완충화제, 항산화제 (일례로 아스코르빌 팔미테이트, 부틸 히드록시 아니솔 (BHA), 부틸 히드록시 톨루엔 (BHT) 및 토코페롤, 일례로 α-토코페롤 (비타민 E)), 보존제, 킬레이트제, 점증제, 충전제, 결합제, 윤활제, 점도조절제, 토닉제, 방향제, 착색제, 탈취제, 불투명화제, 현탁제 및 가소화제. 바람직하게, 제제는 약 0.01 내지 약 99 %, 바람직하게 약 0.25 내지 약 75 %의 단백질을 부형제와 함께 포함하고 주사 또는 경구 투여되는 적절한 용액이다.
싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 존재는, 정제중 임의의 단계에서 측정 가능하다. 한 구현에서, 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 존재는, 최종 약학 제제 내에서 측정된다. 본 방법은 추가로 샘플 중, 일례로 최종 정제된 약학 제제 내의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 수준을 기록하는 것 (일례로 프린트 또는 컴퓨터 판독가능 기록, 일례로 라벨)을 포함할 수 있다.
하기의 실시예는 제한이 아니며, 본 발명의 방법 및 조성물을 예시한다. 당업자에게 명백하여, 크로마토그래피 및 약학제제 및 평가에서 보통 부딪치는 기타 각종 조건 및 인자의 기타 적절한 변형 및 적용은 본 발명 범위 및 정신 이내이다.
실시예 1
약 720 mg/L MBCD 존재 하에 배양된 콜레스테롤 영양의존성 세포 내에서 나틸리주마브를 재조합 발현시켰다. 항체를 3개의 단순 크로마토그래피 단계로 정제하였다. 각 정제 단계 이후 및 최종 항체 제제 (약학 사용에 적절함) 중 존재하는 MBCD의 양을 측정하는 방법을 개발하였다.
샘플을 SEC 컬럼 상의 HPLC로 분리하였다 (TSK 젤 G2000SWXL, 7.8 mm x 30 cm). 이동상은 140 mM NaCl, 10 mM 포스페이트, pH 6.45/2% (v/v) 메탄올 및 10-4 M 1-나프톨을 포함하였다. 샘플 크기는 50 μL (Waters 형광 검출기) 또는 100 μL (Rainin 형광 검출기)이었다. 이소크라틱 (isocratic) 조건 하에서 유속은 1 mL/분이었다. MBCD/1-나프톨 내포 착물을 여기 및 방출 파장 각각 290 및 360 nm에서 형광 검출기로 측정하였다.
검출 어세이의 한계는 pH 6.1의 수성 완충액 중 MBCD 표준 (물 중 1.0 mg/mL MBCD)의 연속 희석을 사용하여 실시하였다. 상기 기법을 사용한 검출 한계는 1.3 μg/mL로 측정되었다. 3개의 크로마토그래피 컬럼 각각 및 최종 정제 항체 제제로부터의 용출물 샘플 중의 검출 한계를 측정하기 위해 유사한 어세이를 실시하였다. 샘플 중 검출 한계는 매우 낮아, 1.3 μg/mL 내지 5.2 μg/mL 범위이고, 평균 3.0 μg/mL이었다. 대표적 크로마토그램을 도 1에 나타낸다.
어세이의 직선도를 평가하기 위해 MBCD 1.3, 2.6, 10, 26, 및 65 μg/mL을 포함하는 5개의 표준을 50 μL 부피로 HPLC 컬럼 상에 주입하였다. 직선 최소 자승 회귀를 도 2에 나타낸다. 결과는, 본 어세이가 높은 직선도를 가지며 상관계수는 0.998임을 나타낸다.
직선도를 또한 MBCD 1.3, 2.6, 5.0, 10.0, 20.0, 및 50.0 μg/mL로 스파이킹된 최종 항체 제제의 샘플을 이용하여 조사하였다. 결과 (도 3)는, 본 어세이가 높은 직선도를 가지며 상관계수는 0.999임을 나타낸다.
최종 항체 제제 중 MBCD의 회수율을, 해당 MBCD 표준의 피크 면적에 대한 피크 면적을 비교하여 계산하였다. 표 1에 요약된 바와 같이, 테스트한 MBCD 농도에 대한 회수율은 97% 내지 117% 이었다
Figure 112007049017912-PCT00001
재현성에 대한 상대적 표준 편차 (어세이내 정확도)를 MBCD 1.3, 2.6, 10, 26, 및 65 μg/mL 함유 5개의 표준을 이용하여 검증하였다. 결과는 표2에 기재되며, 본 어세이가 5.0% 미만의 상대 표준 편차를 가짐을 나타낸다.
Figure 112007049017912-PCT00002
본 발명을 이제 충분히 설명한바, 당업자에게는 폭 넓고도 균등한 범위의 조건, 제형 및 기타 인자를 가지고, 본 발명의 범위 또는 그 구현에 영향을 끼치지 않으면서 본 발명이 실시 가능함을 인식할 것이다. 본원에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 출판물은 그 전부가 여기에 참조로 편입된다.

Claims (66)

  1. 단백질 함유 용액 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 존재의 테스트 방법으로, 상기의 단백질로부터 임의의 존재할 수 있는 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 크기 배척 크로마토그래피 (SEC)로 분리하고, 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고, 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 측정함을 포함하는 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체가 메틸-β-싸이클로덱스트린인 방법.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 치료 단백질인 방법.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 재조합 단백질인 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 용액이, 20 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 포함하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 시약이 형광 화합물인 방법.
  8. 제 7 항에 있어서, 상기 시약이 1-나프톨인 방법.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 방법이 10 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 검출 한계를 가지는 방법.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 방법이 2 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 검출 한계를 가지는 방법.
  11. 제 1 항에 있어서, SEC 컬럼 상에 용액의 샘플을 로딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 컬럼 상에 로딩 되기 이전에 추출 단계를 거치지 않는 방법.
  13. 제 11 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 5-20 kDa 내지 약 75-300 kDa 의 분리 범위를 가지는 방법.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 2 내지 약 6 마이크론의 입자 크기를 가지는 방법.
  15. 제 14 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 4 마이크론의 입자 크기를 가지는 방법.
  16. 제 1 항에 있어서, 상기 시약이 분리 단계 중 이동상 내에 존재하는 방법.
  17. 제 1 항에 있어서, 상기 분리가, 약 50 mM 내지 약 300 mM 농도의 염을 포함하는 이동상을 이용하는 방법.
  18. 제 1 항에 있어서, 상기 샘플 및 상기 이동상이, 약 2.0 내지 약 8.0의 pH를 가지는 방법.
  19. 제 18 항에 있어서, 상기 샘플 및 상기 이동상이, 약 5.0 내지 약 7.5의 pH를 가지는 방법.
  20. 제 1 항에 있어서, 상기 단백질이 90% 이상 순수한 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 상기 단백질이 95% 이상 순수한 방법.
  22. 제 21 항에 있어서, 상기 단백질이 98% 이상 순수한 방법.
  23. 단백질 함유 용액 중 존재 가능한 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 함량의 측정 방법으로, 상기 단백질로부터 임의의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 SEC로 분리하고, 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고, 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 측정하고, 상기 신호의 크기를 측정함을 포함하며, 여기에서 상기 신호의 크기는 용액 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 함량의 지표인 측정 방법.
  24. 제 23 항에 있어서, 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체가 메틸-β-싸이클로덱스트린인 방법.
  25. 제 23 항에 있어서, 상기 단백질이 치료 단백질인 방법.
  26. 제 23 항에 있어서, 상기 단백질이 재조합 단백질인 방법.
  27. 제 23 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인 방법.
  28. 제 23 항에 있어서, 상기 용액이, 20 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 포함하는 방법.
  29. 제 23 항에 있어서, 상기 시약이 형광 화합물인 방법.
  30. 제 29 항에 있어서, 상기 시약이 1-나프톨인 방법.
  31. 제 23 항에 있어서, 상기 방법이 10 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 검출 한계를 가지는 방법.
  32. 제 31 항에 있어서, 상기 방법이 2 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 검출 한계를 가지는 방법.
  33. 제 23 항에 있어서, SEC 컬럼 상에 용액의 샘플을 로딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  34. 제 33 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 컬럼 상에 로딩 되기 이전에 추출 단계를 거치지 않는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 5-20 kDa 내지 약 75-300 kDa 의 분리 범위를 가지는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 2 내지 약 6 마이크론의 입자 크기를 가지는 방법.
  37. 제 36 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 4 마이크론의 입자 크기를 가지는 방법.
  38. 제 23 항에 있어서, 상기 시약이 분리 단계 중 이동상 내에 존재하는 방법.
  39. 제 23 항에 있어서, 상기 분리가, 약 50 mM 내지 약 300 mM 농도의 염을 포함하는 이동상을 이용하는 방법.
  40. 제 23 항에 있어서, 상기 샘플 및 상기 이동상이, 약 2.0 내지 약 8.0의 pH를 가지는 방법.
  41. 제 40 항에 있어서, 상기 샘플 및 상기 이동상이, 약 5.0 내지 약 7.5의 pH를 가지는 방법.
  42. 제 23 항에 있어서, 상기 단백질이 90% 이상 순수한 방법.
  43. 제 42 항에 있어서, 상기 단백질이 95% 이상 순수한 방법.
  44. 제 43 항에 있어서, 상기 단백질이 98% 이상 순수한 방법.
  45. 하기를 포함하는 약학 제제 평가 방법:
    (a) 치료 단백질 및 약학 허용 담체 포함 약학 제제를 제공하고;
    (b) SEC로 상기 약학 제제를 분리하고;
    (c) 약학 제제 내에 존재 가능한 임의의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를, 분리된 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체와 검출 가능한 내포 착물을 형성할 수 있는 시약과 접촉시키고; 및
    (d) 상기 내포 착물로부터의 신호 존재를 검출하고, 여기에서 상기 신호의 크기는 제제 중 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체의 함량의 지표임.
  46. 제 45 항에 있어서, 상기 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체가 메틸-β-싸이클로덱스트린인 방법.
  47. 제 45 항에 있어서, 상기 단백질이 재조합 단백질인 방법.
  48. 제 45 항에 있어서, 상기 단백질이 항체인 방법.
  49. 제 45 항에 있어서, 상기 단백질이 모노클로날 항체인 방법.
  50. 제 45 항에 있어서, 상기 용액이, 20 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체를 포함하는 방법.
  51. 제 45 항에 있어서, 상기 시약이 형광 화합물인 방법.
  52. 제 51 항에 있어서, 상기 시약이 1-나프톨인 방법.
  53. 제 45 항에 있어서, 상기 방법이 10 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 검출 한계를 가지는 방법.
  54. 제 53 항에 있어서, 상기 방법이 2 μg/mL 미만의 싸이클로덱스트린 또는 싸이클로덱스트린 유도체 검출 한계를 가지는 방법.
  55. 제 45 항에 있어서, SEC 컬럼 상에 용액의 샘플을 로딩하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  56. 제 55 항에 있어서, 상기 샘플이 상기 컬럼 상에 로딩 되기 이전에 추출 단계를 거치지 않는 방법.
  57. 제 55 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 5-20 kDa 내지 약 75-300 kDa 의 분리 범위를 가지는 방법.
  58. 제 55 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 2 내지 약 6 마이크론의 입자 크기를 가지는 방법.
  59. 제 55 항에 있어서, 상기 컬럼이 약 4 마이크론의 입자 크기를 가지는 방법.
  60. 제 45 항에 있어서, 상기 시약이 분리 단계 중 이동상 내에 존재하는 방법.
  61. 제 45 항에 있어서, 상기 분리가, 약 50 mM 내지 약 300 mM 농도의 염을 포함하는 이동상을 이용하는 방법.
  62. 제 45 항에 있어서, 상기 샘플 및 상기 이동상이, 약 2.0 내지 약 8.0의 pH를 가지는 방법.
  63. 제 62 항에 있어서, 상기 샘플 및 상기 이동상이, 약 5.0 내지 약 7.5의 pH를 가지는 방법.
  64. 제 45 항에 있어서, 상기 단백질이 90% 이상 순수한 방법.
  65. 제 64 항에 있어서, 상기 단백질이 95% 이상 순수한 방법.
  66. 제 65 항에 있어서, 상기 단백질이 98% 이상 순수한 방법.
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