JP5065043B2

JP5065043B2 - シクロデキストリンの検出および定量

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Publication number: JP5065043B2
Application number: JP2007544580A
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Inventors: ゾランソシク，; ルリンチエン，; ジェームスアハーン，; ローインマトレ，
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Priority date: 2004-12-06
Filing date: 2005-12-05
Publication date: 2012-10-31
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Description

（発明の背景）
（発明の分野）
本発明は、タンパク質を含む溶液中のシクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体の検出および定量に関する。本発明はさらに、残ったシクロデキストリンの存在について製薬調製物を評価する方法に関する。

（背景）
シクロデキストリンは、最も一般的には、ドーナツ形環中のα−１，４−グルコシド結合により連結された、６個のグルコース単位（α−シクロデキストリン）、７個のグルコース単位（β−シクロデキストリン）または８個のグルコース単位（γ−シクロデキストリン）からなる環状多糖である。糖単位の椅子形成の結果として、すべての２級ヒドロキシル単位は、環の一方の側に位置し、その一方で、１級ヒドロキシル基の全ては他方の側に位置している。その結果、外表面は親水性であり、シクロデキストリンを水溶性にしている。対照的に、シクロデキストリンの腔は疎水性である。なぜなら、これらは、原子Ｃ_３および原子Ｃ_５の水素によって、ならびにエーテルのような酸素によって覆われるからである。この構造によって、シクロデキストリンが疎水性化合物との包接複合体を形成し得る。この特徴に基づいて、シクロデキストリンは、十分には水溶性でない医薬の溶解性を増加させるため、医薬の安定性を増強するため、および医薬の不必要な副作用を低下させるために広く使われている。

シクロデキストリンのヒドロキシル基は、この分子の特徴（例えば、水溶性、結合特異性）を変えるために誘導体化され得る。メチル−β−シクロデキストリン（ＭＢＣＤ）は、最も頻繁に使われるシクロデキストリン誘導体のうちの１つである。

シクロデキストリンは、疎水性の栄養素（例えば、コレステロール）を細胞に運び込むために、細胞培養系においても使われる。シクロデキストリンは、コレステロール栄養要求性細胞（例えば、コレステロール栄養要求性のＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞およびＮＳＯ細胞）を培養するために特に役立つ。細胞培養物が、天然に存在するかまたは組換え体のタンパク質（特に、治療用タンパク質）を生産するために用いられる場合、精製されたタンパク質製品中の残留夾雑物としてのシクロデキストリンの存在は製薬製品の生産の問題である。このように、タンパク質を含む溶液中の低レベルのシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出および定量のための高感度でかつ迅速な技術が必要である。

非特許文献１は、ＭＢＣＤと包接複合体を形成して包接複合体の蛍光検出を可能にする発蛍光団（１−ナフトール）の存在下でサイズ排除クロマトグラフィーを使用する、ＭＢＣＤを検出するための技術を開示する。この技術（薬物動態学の研究のための血漿サンプル中のＭＢＣＤの検出のために設計された）は、クロマトグラフィーの前に、有機溶媒によるサンプルの抽出、エバポレーションおよび移動相中の残留物の溶解を有するを必要とする。非特許文献２は、１−ナフトールを使用する、血漿サンプル中のスルホブチルエーテル−β−シクロデキストリンの存在を判断するための類似の技術を開示する。この方法は、クロマトグラフィーの前に、固相抽出、エバポレーションおよび残留物の溶解を含め、サンプルの処理を必要とする。これらの技術は、タンパク質成分からのシクロデキストリンの分離を達成しない。
Ｇｒｏｓｓｅら，Ｊ．ＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙＢ６９４：２１９（１９９７）Ｇａｇｅら，Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｂｉｏｍｅｄ．Ａｎａｌｙｓｉｓ２２：７７３（２０００）

好ましくはサンプル抽出工程の必要のない、タンパク質の存在下でのシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在の試験方法についての必要性が当該分野に存在する。

（発明の要旨）
したがって、一つの局面では、本発明は、タンパク質を含む溶液中のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在の試験のための方法を提供し、この方法は、存在し得る任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって該タンパク質から分離する工程、分離されたシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤と、該シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体とを接触させる工程、および該包接複合体からのシグナルの存在を評価する工程を包含する。

本発明の別の局面は、タンパク質を含む溶液中に存在し得る、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の量を決定するための方法であって、該方法は、任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を、ＳＥＣによって該タンパク質から分離する工程、分離されたシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤と、該シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体とを接触させる工程、該包接複合体からのシグナルの存在を評価する工程、および該シグナルのサイズを決定する工程を包含し、ここで、該シグナルのサイズが、該溶液中のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の量を示す。

本発明の第３の局面は、製薬調製物を評価する方法であって、該方法は、以下の工程：（ａ）治療用タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む製薬調製物を提供する工程；（ｂ）ＳＥＣによって該製薬調製物を分離する工程；（ｃ）分離されたシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤と、該製薬調製物中に存在し得る任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体とを接触させる工程；および（ｄ）該包接複合体からのシグナルを検出する工程を包含し、ここで、該シグナルのサイズは、該調製物中のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の量を示す。

本発明の一つの実施形態において、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体は、ＭＢＣＤである。

本発明の別の実施形態において、この薬剤は、発蛍光団（例えば、１−ナフトール）である。この薬剤は、ＳＥＣによる分離の前に、分離中または分離後に、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と接触され得る。

一つの実施形態において、溶液のサンプルまたは製薬調製物は、いかなる調製もなしで、（例えば、サンプルは、有機溶媒を用いて抽出されず、乾燥されず、再懸濁されず、濃縮されず、またはさもなければ変更されずに）ＳＥＣカラムにローディングされる。

（発明の詳細な説明）
本発明は、タンパク質を含む溶液中の低レベルのシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出および定量に関する。１つの実施形態において、本発明の方法は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下で増殖させた細胞から調製される精製されたタンパク質の、残留シクロデキストリンの存在についての評価に役立つ。したがって、一つの局面では、本発明は、タンパク質を含む溶液中のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在の試験のための方法を提供し、この方法は、存在し得る任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって該タンパク質から分離する工程、分離されたシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤と、該シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体とを接触させる工程、および該包接複合体からのシグナルの存在を評価する工程を包含する。

用語「シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体」は、本明細書で用いられる場合、任意の公知のシクロデキストリン（特にα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリンおよびγ−シクロデキストリン）および任意の公知のシクロデキストリン誘導体をいう。シクロデキストリン誘導体は、米国特許第３，４２６，０１１号、同第３，４５３，２５７号、同第３，４５３，２５８号、同第３，４５３，２５９号、同第３，４５３，２６０号、同第３，４５９，７３１号、同第３，５５３，１９１号、同第３，５６５，８８７号、同第４，３８３，９９２号、同第４，５３５，１５２号、同第４，６１６，００８号、同第４，６３８，０５８号、同第４，６５９，６９６号、同第４，７４６，７３４号、同第４，６７８，５９８号、同第５，５９４，１２５号、同第５，７１０，２６８号および同第５，８３１，０８１号において開示される。これらのそれぞれは、参考として援用される。シクロデキストリン誘導体の例としては、ＭＢＣＤ、ヒドロキシエチル−β−シクロデキストリンおよびヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリンが挙げられる。シクロデキストリンおよびシクロデキストリン誘導体は、ＡｍｅｒｉｃａｎＭａｉｚｅＰｒｏｄｕｃｔｓＣｏｍｐａｎｙ、ＷａｃｋｅｒＣｈｅｍｉｃａｌｓ（ＵＳＡ），Ｉｎｃ．およびＳｉｇｍａ−ＡｌｄｒｉｃｈＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙから入手可能である。

用語「シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成し得る薬剤」は、本明細書で用いられる場合、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と包接複合体を形成し得る任意の薬剤をいい、ここで、この包接複合体は、ＳＥＣカラムからの溶出により検出され得る。この用語は、元々は検出可能ではないが検出可能な標識（例えば、放射性核種または蛍光タグ）を含む薬剤を包含する。この用語はまた、元々は検出可能ではないが、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤を包含する。検出方法の例としては、蛍光検出、紫外線検出、放射測定検出、比色検出、蛍光偏光法、蒸発光散乱、キャピラリー電気泳動法、赤外分光法、^１ＨＮＭＲおよび質量分析法が挙げられるがこれらに限定されない。一つの実施形態では、この検出可能な薬剤は、発蛍光団（例えば、１−ナフトール）である。他の検出可能な薬剤（例えば、フェノールフタレインおよび８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸）も使用され得る。

用語「治療用タンパク質」は、本明細書で用いられる場合、疾患または障害の予防、処置または改善に役立つことが公知である任意のペプチドまたはタンパク質（例えば、抗体、増殖因子、細胞表面マーカー、サイトカイン、ホルモン、毒素または前述のいずれかのフラグメントおよび／もしくは融合タンパク質）をいう。用語「抗体」は、モノクローナル抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体、もしくは完全にヒトの抗体、ならびに抗原結合性抗体フラグメントおよび／またはその誘導体（例えば、単鎖抗体、軽鎖および重鎖ダイマー、ならびにＦｖ、Ｆａｂ）および（Ｆａｂ’）_２フラグメント）を含むために、その最も幅広い意味で用いられる。治療用タンパク質の例としては、タンパク質（例えば、エリスロポエチン、成長ホルモン、コロニー刺激因子、インスリンおよび治療用抗体（例えば、ナチリズマブ（ｎａｔｉｌｉｚｕｍａｂ）、インフリキシマブ（ｉｎｆｌｉｘｉｍａｂ）、アダリムマブ（ａｄａｌｉｍｕｍａｂ）、ＭａｂＴｈｅｒａ、Ｈｅｒｃｅｐｔｉｎ、Ｐａｌｉｖｉｚｕｍａｂ、Ａｂｃｉｘｉｍａｂ、Ａｌｅｍｔｕｚｕｍａｂ、ＯＫＴ３−ムロモナブ（ｍｕｒｏｍｏｎａｂ）−ＣＤ３、Ｂａｓｉｌｉｘｉｍａｂ、Ｇｅｍｔｕｚｕｍａｂｏｚｏｇａｍｉｃｉｎ、Ｏｍａｌｉｚｕｍａｂ、Ｉｂｒｉｔｕｍｏｍａｂｔｉｕｘｅｔａｎ、Ｅｄｒｅｃｏｌｏｍａｂ−Ｍａｂ１７−１Ａ、Ｔｏｓｉｔｕｍｏｍａｂ、エファリズマブ（ｅｆａｌｉｚｕｍａｂ）、ベバシズマブ（ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ）およびセツキシマブ（ｃｅｔｕｘｉｍａｂ）が挙げられるが、これらに限定されない。このタンパク質は、それが天然で存在する細胞または遺伝子操作されてそれを発現する（例えば、組換え発現される）細胞から単離され得る。

用語「少なくとも９０％（またはそれより高い）純粋な」および「少なくとも９０％（またはそれより高い）均質性」は、本明細書で用いられる場合、精製された調製物の乾燥重量の少なくとも９０％（またはそれより高い）をタンパク質が構成するように、他のタンパク質、脂質、核酸および他の細胞構成成分から分離されて精製されたタンパク質をいう。いくつかの実施形態では、タンパク質は、少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％純粋であり得る。

用語「その誘導体」は、本明細書において記載されている細胞株を言及するために用いられる場合、少なくとも一つの新しい特徴を有する、その細胞株から作られる任意の細胞をいう。新しい特徴を有する細胞誘導体の例としては、例えば、選択圧によって生成され得る、異なる増殖パターン（例えば、コレステロール栄養要求性）を有する細胞、および遺伝子操作されてタンパク質を発現するかまたは何らかの他の新規な挙動を呈する細胞が挙げられるが、これらに限定されない。

本発明の方法において、ＳＥＣカラムは、任意の適切なサイズであり得、そしてタンパク質からのシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の分離に適している任意のＳＥＣ媒体を含み得る。一つの実施形態では、ＳＥＣ媒体は、約５〜２０ｋＤａから約７５〜３００ｋＤａの分離範囲を有する。ＳＥＣ媒体は、約２ミクロン〜約６ミクロン（好ましくは、約３ミクロン〜約５ミクロン、例えば４ミクロン）の粒径を有し得る。適切なＳＥＣ媒体の１つの例は、ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷ_ＸＬ（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｉｎｃ．）である。別の適切なＳＥＣ媒体はポリマーベースのＴＳＫゲルカラムである。好ましい実施形態では、分離は、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）により実施される。ＨＰＬＣについては、ＳＥＣカラムの適切なサイズは、直径が約５ｍｍ〜約１５ｍｍであり、そして長さが約３ｃｍ〜約６０ｃｍの範囲である。サンプルの大きさは、約１０μＬ〜約５００μＬ（好ましくは約５０μＬ〜約１００μＬ）の範囲であり得る。

ＳＥＣカラムにローディングされるべきサンプルは、タンパク質を含み、かつ、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在について試験されることが所望される、任意の溶液からのサンプルであり得る。本発明の一つの実施形態において、サンプルは、精製プロセスの途中にあるかまたは精製されたタンパク質を含む溶液であって、かつシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在または量を決定することが所望される溶液からのものである。一つの実施形態において、このタンパク質は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下で細胞培養において増殖された細胞から精製されたかまたは精製されるべきである。このサンプルは、タンパク質の精製プロセスの任意の段階にある溶液（例えば、細胞溶解後、一つ以上の精製工程（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィーなど）後、または最終精製工程後）からであり得る。この溶液中のタンパク質は、少なくとも９０％純粋（好ましくは、少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％純粋）であり得る。一つの実施形態では、このサンプルは、２０μｇ／ｍＬ未満（好ましくは１０μｇ／ｍＬ未満、５μｇ／ｍＬ未満、２μｇ／ｍＬ未満または１μｇ／ｍＬ未満）のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を有する溶液からのものである。

このサンプルは、タンパク質を含む溶液から採取され得、そして溶液の緩衝液がＳＥＣに適している限り、ＳＥＣカラムに直接ローディングされ得る。必要に応じて、このサンプルの緩衝液は、ＳＥＣに適しているように調整され得る。ＳＥＣに適切な緩衝液は、約２．０と約８．０との間（好ましくは約５．０と約７．５との間）のｐＨを有する水性緩衝液である。適切な緩衝液の例としては、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸ナトリウム、クエン酸ナトリウム、硝酸カリウムおよびＴｒｉｓ−ＨＣｌが挙げられるが、これらに限定されない。この緩衝液はまた、サンプル中のタンパク質がカラムおよびＳＥＣ媒体に固着するのを防止するために充分な塩を含むべきである。塩の適切なレベルは、好ましくは、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ（好ましくは約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ）の範囲にあり、さらに好ましくは約１４０ｍＭである。使用され得る塩の例としては、塩化ナトリウム、塩化カリウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸マグネシウム、硫酸アンモニウム、リン酸アンモニウムおよび塩化マグネシウムが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、塩は、塩化ナトリウムである。

本発明の一つの実施形態において、このサンプルは、必要に応じて、緩衝液の調整以外のいかなる調製工程も受けない。例えば、このサンプルは、（例えば、有機溶媒を用いて、または、固相カートリッジを用いて）抽出されないか、乾燥されないか、再懸濁されないか、濃縮されないか、またはさもなければ変更されない。例えば、充填の時点で製薬調製物を試験するために、複雑な抽出も他の操作（例えば、サンプル回収率に影響を及ぼし得る溶媒抽出または固相抽出）もなしで、ＳＥＣカラムにサンプルを直接ローディングする能力は、本発明の利点のうちの１つである。

移動相は、約２．０と約８．０との間（好ましくは約５．０と約７．５との間）のｐＨを有し、かつサンプル中のタンパク質がカラムまたはＳＥＣ媒体に固着するのを防止するために充分な塩（例えば、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭ、好ましくは約１００ｍＭ〜約２００ｍＭ）を含む、水性緩衝液であり得る。適切な緩衝液および塩は、サンプル調製について上記に列挙したものである。適切な移動相の１つの例は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ６．４５である。

シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤は、サンプルがＳＥＣにより分離される前、分離中、または分離された後に、サンプル中に存在する任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と接触され得る。例えば、薬剤は、サンプルがカラムにローディングされる前にサンプルに添加されてもよく、薬剤は移動相に存在してもよく、薬剤はカラムから集められた溶出画分に添加されてもよく、または上記のいかなる組合せであってもよい。好ましい実施形態では、薬剤は移動相に存在する。

薬剤は、検出されるべきシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体に依存して選択される。なぜなら、異なるシクロデキストリンが異なる結合特異性を有するからである。適切な薬剤は、当該分野において公知であり、そしてまた、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体ごとに経験的に決定され得る。薬剤は、固有の検出可能なシグナル（例えば、蛍光）を有してもよく、または検出可能な標識（例えば、発蛍光団または放射性核種）が結合されていてもよい。他の実施形態では、薬剤は、固有の検出可能なシグナルを全く有さないかもしれないが、薬剤がシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と結合したときに検出可能なシグナルを出す包接複合体が形成される。ＭＢＣＤの検出のための適切な蛍光化合物の１例は、１−ナフトールである。適切な蛍光化合物の他の例としては、フェノールフタレインおよび８−アニリノナフタレン−１−スルホン酸が挙げられる。薬剤が水溶性である場合、薬剤は移動相に直接添加され得る。薬剤が水溶性でない場合、有機溶媒（例えば、メタノール、エタノール、クロロホルムまたはアセトンが挙げられるがこれらに限定されない）に溶解され得、そして有機溶媒のパーセントが低い（例えば、１０％未満、好ましくは９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満または１％未満）ように移動相に添加され得る。移動相中の薬剤の濃度は、シグナルが検出されるのに充分である。例えば、１−ナフトールまたは他の蛍光化合物は、約１×１０^−８〜約１×１０^−２、好ましくは約１×１０^−５〜約１×１０^−３Ｍ、好ましくは約１×１０^−４Ｍの濃度で移動相に存在し得る。

ＳＥＣ分離は、適切なカラム調製、サンプルローディング、流速、画分収集およびシグナル検出技術を用いて当該分野で周知の方法により実施され得る。例えば、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ：ＧｕｉｄｅｔｏＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，第１８２巻，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ（１９９０），第３８章；Ｂａｌｃｈら，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ，第２５７巻，ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，ＳａｎＤｉｅｇｏ（１９９５），第８章）；Ｓｃｏｐｅｓ，ＰｒｏｔｅｉｎＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：ＰｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄＰｒａｃｔｉｃｅ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ（１９９４）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙを参照のこと。これらの各々は、参考として援用される。好ましい実施形態では、分離はＨＰＬＣによって実施される。シグナル検出器は、薬剤の測定に役立つ任意の検出器（例えば、蛍光検出器、紫外線検出器または放射線検出器）であり得、そしてカラムとつなげて使用してもよく、または、別々に使用してもよい。発蛍光団が薬剤として使われる場合、蛍光検出器は、当該分野で公知のような適切な励起波長および発光波長（例えば、１−ナフトールについては、それぞれ、２９０ｎｍおよび３６０ｎｍ）に設定され得る。シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体が定量されるべき場合、検出されたシグナルのサイズが測定され得、そしてサンプル中に存在するシクロデキストリンの量またはシクロデキストリン誘導体を測定するために漸増量の薬剤が添加されたサンプルから作成された標準曲線と比較され得る。

本発明の方法を使用すると、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出限界は、１００μｇ／ｍＬ未満、好ましくは５０μｇ／ｍＬ未満、２０μｇ／ｍＬ未満、１０μｇ／ｍＬ未満、５μｇ／ｍＬ未満、２μｇ／ｍＬ未満または１μｇ／ｍＬ未満であり得る。

タンパク質（特に治療用タンパク質）は、細胞培養物から精製され得、そして製薬調製物として調製され得る。特に、細胞が増殖を疎水性化合物に依存している場合（例えば、コレステロール栄養要求性細胞（例えば、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞またはＮＳＯ細胞のコレステロール栄養要求性誘導体））、細胞はシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下で培養され得る。本発明の一局面において、製薬調製物は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在について評価され得る。

本発明の方法において、タンパク質発現について当該分野で公知の任意の細胞が用いられ得る。例としては、ＮＳＯ細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、ヒト腎臓２９３細胞、ヒト上皮Ａ４３１細胞、ヒトＣｏｌｏ２０５細胞、３Ｔ３細胞、ＣＶ−１細胞、ＨｅＬａ細胞およびマウスＬ細胞、ＢＨＫ細胞、ＨＬ−６０細胞、Ｕ９３７細胞、ＨａＫ細胞またはＪｕｒｋａｔ細胞が挙げられる。細胞は、当該分野で公知の任意の方法によって培養され得る。一つの実施形態では、細胞はコレステロール栄養要求性細胞（例えば、ＮＳＯ細胞またはそこから誘導された細胞）である。別の実施形態では、細胞は、ＭＢＣＤの存在下で培養される。培養細胞は、精製されるべきタンパク質をもともと発現してもよく、または、タンパク質を発現するように遺伝子操作されてもよい。目的のタンパク質を発現するように細胞を遺伝子操作するための方法は、当該分野で周知技術である。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら，ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ；Ａｕｓｕｂｅｌら，ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙを参照のこと。これらの各々は、参考として援用される。細胞は、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在下で培養される。次いで、タンパク質は、培養細胞からまたは培養培地から、当該分野で周知の技術（例えば、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、溶解性の差、限外濾過など）を使用して精製される。タンパク質は、少なくとも９０％の均質性（好ましくは少なくとも９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の均質性）まで精製され得る。次いで、精製されたタンパク質は、それから、薬学的に受容可能なキャリアと合わされて、製薬調製物が生成される。

薬学的に受容可能なキャリアは、薬学的に用いられ得る調製物へのタンパク質の加工を容易にする、賦形剤および添加物を含む。賦形剤の例としては、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノールなどが挙げられるが、これらに限定されない。当該分野で周知の添加物としては、例えば、界面活性剤（例えば、ＴＷＥＥＮ（例えば、ＴＷＥＥＮ−８０）、粘着減少剤（ｄｅｔａｃｋｉｆｉｅｒ）、消泡剤、緩衝剤、抗酸化剤（例えば、アスコルビルパルミテート、ブチルヒドロキシアニソール（ＢＨＡ）、ブチルヒドロキシトルエン（ＢＨＴ）およびトコフェロール、例えばα−トコフェロール（ビタミンＥ））、保存剤、キレート剤、増粘剤、フィラー、結合剤、滑沢剤、粘度調節剤（ｖｉｓｃｏｍｏｄｕｌａｔｏｒ）、張度調節剤（ｔｏｎｉｃｉｆｉｅｒ）、矯味矯臭剤（ｆｌａｖｏｒａｎｔ）、着色剤、臭気剤、乳白剤、懸濁剤および可塑剤が挙げられる。好ましくは、調製物は、注射または経口的な投与に適切な溶液であり、そして、約０．０１〜約９９パーセント（好ましくは約０．２５〜約７５パーセント）のタンパク質を賦形剤とともに含む。

シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在は、精製のいかなる段階でも決定され得る。一つの実施形態において、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在は、最終的な製薬調製物において決定される。この方法は、サンプル中の（例えば、最終的に精製された製薬調製物中の）シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体のレベルの記録（例えば、プリントまたはコンピュータ読み取り可能な記録（例えば、ラベル））を作成することをさらに含み得る。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物の例示であるが、限定ではない。クロマトグラフィーおよび製薬の調製および評価において通常遭遇し、そして当業者にとって明らかである、種々の条件およびパラメータの他の適切な改変および適用は、本発明の趣旨および範囲の範囲内である。

（実施例１）
ナチリズマブを、約７２０ｍｇ／ＬのＭＢＣＤの存在下で培養したコレステロール栄養要求性細胞において組換え発現させた。この抗体を、３つの慣用的なクロマトグラフィー工程で精製した。各々の精製工程および最終的な抗体調製（製薬での使用に適している）の後に存在するＭＢＣＤの量を決定するための方法を開発した。

サンプルを、ＳＥＣカラム（ＴＳＫゲルＧ２０００ＳＷ_ＸＬ、７．８ｍｍ×３０ｃｍ）でのＨＰＬＣによって分離した。移動相は、１４０ｍＭのＮａＣｌ、１０ｍＭのリン酸塩、ｐＨ６．４５／２％（ｖ／ｖ）メタノールおよび１０^−４Ｍ１−ナフトールを含んだ。サンプルの大きさは、５０μＬ（Ｗａｔｅｒｓ蛍光検出器）または１００μＬ（Ｒａｉｎｉｎ蛍光検出器）であった。流速は、アイソクラティックな条件下にて１ｍＬ／分であった。ＭＢＣＤ／１−ナフトール包接複合体は、励起および放出についてそれぞれ２９０ｎｍおよび３６０ｎｍにて蛍光検出器を使用して検出された。

検出限界のアッセイを、ｐＨ６．１の水性緩衝液中のＭＢＣＤ標準（水中１．０ｍｇ／ｍｌのＭＢＣＤ）の系列希釈を使用して実施した。この技術を用いて、検出限界は、１．３μｇ／ｍＬであると決定された。類似のアッセイを行って、３つのクロマトグラフィーカラムからの溶出物および最終的な精製された抗体調製物の各々のサンプルの検出限界を決定した。サンプルにおける検出限界は非常に低く、１．３μｇ／ｍＬ〜５．２μｇ／ｍＬの範囲にわたり、平均３．０μｇ／ｍＬであった。代表的なクロマトグラムを図１に示す。

アッセイの線形性を評価するために、１．３μｇ／ｍＬ、２．６μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２６μｇ／ｍＬおよび６５μｇ／ｍＬのＬＭＢＣＤを含む５つの標準を５０μＬの体積でＨＰＬＣカラムに注入した。線形最小自乗回帰が図２において示される。この結果は、このアッセイが、０．９９８の相関係数という、高い線形性を有することを示す。

線形性もまた、１．３μｇ／ｍＬ、２．６μｇ／ｍＬ、５．０μｇ／ｍＬ、１０．０μｇ／ｍＬ、２０．０μｇ／ｍＬおよび５０．０μｇ／ｍＬのＭＢＣＤを添加した最終的な抗体調製物のサンプルを使用して調査した。この結果（図３）は、このアッセイが、０．９９９の相関係数という、高い線形性を有することを示す。

最終的な抗体調製物中のＭＢＣＤの回収率を、ピーク面積を、対応するＭＢＣＤ標準のピーク面積と比較することにより算出した。表１にまとめたように、回収率は、試験したＭＢＣＤ濃度については９７％と１１７％との間にあった。

反復率（アッセイ内精度）について相対標準偏差を、１．３μｇ／ｍＬ、２．６μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、２６μｇ／ｍＬおよび６５μｇ／ｍＬのＭＢＣＤを含めた５つの標準を使用して決定した。これらの結果を表２に示す。これらの結果は、このアッセイが５．０％未満の相対標準偏差を有することを示す。

本発明をいまや完全に記載してきたが、本発明の範囲にもそのいかなる実施形態にも影響を及ぼすことのない条件、処方および他のパラメータの広くかつ等価な範囲において本発明が実施され得ることは、当業者によって理解される。本明細書において引用される全ての特許、特許出願および刊行物は、それらの全体が本明細書において完全に引用される。

図１は、ＭＢＣＤを有する精製されたナチリズマブ製薬調製物およびＭＢＣＤのない精製されたナチリズマブ製薬調製物についての代表的なクロマトグラムを示す。（ａ）製薬調製物（１９．６ｍｇ／ｍＬナチリズマブ）；（ｂ）処方緩衝液；（ｃ）１．３μｇ／ｍＬのＭＢＣＤを添加した製薬調製物（１９．６ｍｇ／ｍＬのナチリズマブ）。図２は、ＭＢＣＤ標準についての線形性曲線を示す。図３は、ＭＢＣＤが添加されたナチリズマブの製薬調製物についての線形性曲線を示す。

Claims

タンパク質を含む溶液中のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の存在の試験のための方法であって、該方法は、
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに該溶液のサンプルをローディングする工程であって、該サンプルが、該カラムにローディングされる前に抽出工程を受けない、工程、
存在し得る任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を、サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）によって該タンパク質から分離する工程、
分離されたシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤と、該シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体とを接触させる工程、および
該包接複合体からのシグナルの存在を評価する工程
を包含する、方法。
前記シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体が、メチル−β−シクロデキストリンである、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質が抗体である、請求項１に記載の方法。
前記溶液が、２０μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を含む、請求項１に記載の方法。
前記薬剤が蛍光化合物である、請求項１に記載の方法。
前記薬剤が１−ナフトールである、請求項７に記載の方法。
前記方法が、１０μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出限界を有する、請求項１に記載の方法。
前記方法が、２μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出限界を有する、請求項９に記載の方法。
前記カラムが、約５〜２０ｋＤａから約７５〜３００ｋＤａの分離範囲を有する、請求項１に記載の方法。
前記カラムが、約２ミクロン〜約６ミクロンの粒径を有するＳＥＣ媒体を含む、請求項１に記載の方法。
前記ＳＥＣ媒体が、約４ミクロンの粒径を有する、請求項１２に記載の方法。
前記薬剤が、前記分離工程中、移動相に存在する、請求項１に記載の方法。
前記分離が、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩を含む移動相を使用する、請求項１に記載の方法。
前記サンプルおよび移動相が、約２．０〜約８．０のｐＨを有する、請求項１に記載の方法。
前記サンプルおよび前記移動相が、約５．０〜約７．５のｐＨを有する、請求項１６に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９０％純粋である、請求項１に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９５％純粋である、請求項１８に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９８％純粋である、請求項１９に記載の方法。
タンパク質を含む溶液中に存在し得る、シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の量を決定するための方法であって、該方法は、
サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに該溶液のサンプルをローディングする工程であって、該サンプルが、該カラムにローディングされる前に抽出工程を受けない、工程、
任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を、ＳＥＣによって該タンパク質から分離する工程、
分離されたシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤と、該シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体とを接触させる工程、
該包接複合体からのシグナルの存在を評価する工程、および
該シグナルのサイズを決定する工程
を包含し、ここで、該シグナルのサイズが、該溶液中のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の量を示す、方法。
前記シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体が、メチル−β−シクロデキストリンである、請求項２１に記載の方法。
前記タンパク質が治療用タンパク質である、請求項２１に記載の方法。
前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項２１に記載の方法。
前記タンパク質が抗体である、請求項２１に記載の方法。
前記溶液が、２０μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を含む、請求項２１に記載の方法。
前記薬剤が蛍光化合物である、請求項２１に記載の方法。
前記薬剤が１−ナフトールである、請求項２７に記載の方法。
前記方法が、１０μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出限界を有する、請求項２１に記載の方法。
前記方法が、２μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出限界を有する、請求項２９に記載の方法。
前記カラムが、約５〜２０ｋＤａから約７５〜３００ｋＤａの分離範囲を有する、請求項２１に記載の方法。
前記カラムが、約２ミクロン〜約６ミクロンの粒径を有するＳＥＣ媒体を含む、請求項２１に記載の方法。
前記ＳＥＣ媒体が、約４ミクロンの粒径を有する、請求項３２に記載の方法。
前記薬剤が、前記分離工程中、移動相に存在する、請求項２１に記載の方法。
前記分離が、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩を含む移動相を使用する、請求項２１に記載の方法
前記サンプルおよび前記移動相が約２．０〜約８．０のｐＨを有する、請求項２１に記載の方法。
前記サンプルおよび前記移動相が約５．０〜約７．５のｐＨを有する、請求項３６に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９０％純粋である、請求項２１に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９５％純粋である、請求項３８に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９８％純粋である、請求項３９に記載の方法。
製薬調製物を評価する方法であって、該方法は、以下の工程：
（ａ）治療用タンパク質および薬学的に受容可能なキャリアを含む製薬調製物を提供する工程；
（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）カラムに該製薬調製物のサンプルをローディングする工程であって、該サンプルが、該カラムにローディングされる前に抽出工程を受けない、工程；
（ｃ）ＳＥＣによって該製薬調製物を分離する工程；
（ｄ）分離されたシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体と検出可能な包接複合体を形成する薬剤と、該製薬調製物中に存在し得る任意のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体とを接触させる工程；および
（ｅ）該包接複合体からのシグナルを検出する工程
を包含し、ここで、該シグナルのサイズは、該調製物中のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の量を示す、方法。
前記シクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体が、メチル−β−シクロデキストリンである、請求項４１に記載の方法。
前記タンパク質が組換えタンパク質である、請求項４１に記載の方法。
前記タンパク質が抗体である、請求項４１に記載の方法。
前記タンパク質がモノクローナル抗体である、請求項４１に記載の方法。
前記製薬調製物が、２０μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体を含む、請求項４１に記載の方法。
前記薬剤が蛍光化合物である、請求項４１に記載の方法。
前記薬剤が１−ナフトールである、請求項４７に記載の方法。
前記方法が、１０μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出限界を有する、請求項４１に記載の方法。
前記方法が、２μｇ／ｍＬ未満のシクロデキストリンまたはシクロデキストリン誘導体の検出限界を有する、請求項４９に記載の方法。
前記カラムが、約５〜２０ｋＤａから約７５〜３００ｋＤａの分離範囲を有する、請求項４１に記載の方法。
前記カラムが、約２ミクロン〜約６ミクロンの粒径を有するＳＥＣ媒体を含む、請求項４１に記載の方法。
前記ＳＥＣ媒体が、約４ミクロンの粒径を有する、請求項４１に記載の方法。
前記薬剤が前記分離工程中、移動相に存在する、請求項４１に記載の方法。
前記分離が、約５０ｍＭ〜約３００ｍＭの濃度の塩を含む移動相を使用する、請求項４１に記載の方法。
前記サンプルおよび前記移動相が、約２．０〜約８．０のｐＨを有する、請求項４１に記載の方法。
前記サンプルおよび前記移動相が、約５．０〜約７．５のｐＨを有する、請求項５６に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９０％純粋である、請求項４１に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９５％純粋である、請求項５８に記載の方法。
前記タンパク質が少なくとも９８％純粋である、請求項５９に記載の方法。