CN103217500A - 环糊精的检测和定量 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及含蛋白质溶液中的环糊精和环糊精衍生物的检测和量化。本发明进一步涉及评估药物制剂中的残留环糊精的存在的方法。

Description

环糊精的检测和定量
本申请是申请日为2005年12月5日，申请号为200580041782.2，申请人为比奥根艾迪克MA公司，名称为“环糊精的检测和定量”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及在含蛋白质的溶液中的环糊精以及环糊精衍生物的检测和定量。本发明进一步涉及评估药物制剂中的残留环糊精的存在的方法。
背景技术
环糊精是一种环状多糖，通常多由六个（α-环糊精）、七个（β-环糊精）或八个（γ-环糊精）葡萄糖单元组成，这些葡萄糖单元由α-1，4-葡萄糖苷键连接为环状的环。这些葡萄糖单元形成椅式构象后，所有的仲羟基位于该环的一侧，而所有的伯羟基基团均位于另一侧。其结果是，其外部表面是亲水的，从而使环糊精可水溶解。相反，环糊精的空腔是疏水的，因为它们由C3和C5原子的氢以及醚样氧连接。这种结构允许环糊精与疏水化合物形成包合物（inclusion complex）。基于该特性，环糊精广泛地用于提高难水溶药物的水溶性，加强药物稳定性，并降低药物的不期望出现的负作用。
该环糊精的羟基基团可以衍生，以改变分子的特性（例如：水溶性、结合特性）。甲基-β-环糊精（MBCD）是其中一种最常使用的环糊精衍生物。
环糊精也应用在细胞培养系统中以将疏水营养物，例如胆固醇，转运入细胞中。环糊精对培养胆固醇营养缺陷型细胞特别有用，例如胆固醇营养缺陷型CHO细胞、COS细胞以及NSO细胞。当细胞培养被用来制备自然产生的蛋白质或重组蛋白质、特别是药用蛋白质时，在纯化的蛋白质产品中作为残留的污染物存在的环糊精在药物制备中成为一个问题。因此，需要一种灵敏和快速的技术，以检测和定量含蛋白质溶液中的低水平的环糊精或环糊精衍生物。
Grosse等人（J.Chromatography B694:219(1997)）披露了一种用于检测MBCD的技术，该技术利用尺寸排除色谱法，并采用一种可与MBCD形成包合物的荧光团（1-萘酚），从而允许对该包合物的荧光检测。该技术被设计为用来检测血浆样本中的MBCD，以用作药物动力学研究，其需要在运用色谱法之前，在流动相中利用有机溶剂萃取样本,蒸发和溶解残留物。Gage等人（J.Pharm.Biomed.Analysis22:773(2000)）披露了一种利用1-萘酚，用于测量在血浆样本中的硫代丁基醚-β-环糊精的类似技术。该方法需要在运用色谱法之前处理样本，包括固相萃取、蒸发、以及溶解残留物。这些技术不能达到从蛋白质组合物中分离环糊精的效果。
在本技术领域中，需要一种用于检测蛋白质中环糊精或环糊精衍生物的存在的方法，优选地不需要样本萃取步骤。
发明内容
因此，在一个方面，本发明提供了一种用于检测在含蛋白质溶液中的环糊精或环糊精衍生物的存在的方法，该方法包括通过尺寸排除色谱法（SEC）从所述蛋白质中分离可能存在的任何环糊精或环糊精衍生物，将所述环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物，以及测量来自于所述包合物的信号的存在。
本发明的另一个方面，为一种用于确定在含蛋白质溶液中可能存在的环糊精或环糊精衍生物的量的方法，该方法包括通过SEC从所述蛋白质分离任何环糊精或环糊精衍生物，将所述环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物，测量来自于所述包合物的信号的存在，以及确定所述信号的大小，其中该信号的大小指示在该溶液中的环糊精或环糊精衍生物的量。
本发明的第三个方面，是一种评估药物制剂的方法，该方法包括：
（a）提供一种包括药用蛋白质和药学上可接受的载体的药物制剂；
（b）利用SEC分离所述药物制剂；
（c）将可能存在于所述药物制剂中的环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物；以及
（d）检测来自于所述包合物的信号，其中该信号的大小指示在该制剂中的环糊精或环糊精衍生物的量。
在本发明的一个实施方式中，该环糊精或环糊精衍生物为MBCD。
在本发明的另一个实施方式中，该制剂为一种荧光团，例如，1-萘酚。该制剂可在由SEC进行分离之前、该分离期间或者分离后与该环糊精或该环糊精衍生物相接触。
在一个实施方式中，该溶液或药物制剂的样本可不作任何准备地被装载于该SEC柱上，例如，该样本不需利用有机溶剂进行萃取、干燥、再悬浮、浓缩或其它改变。
附图说明
图1显示了有或没有MBCD的提纯natilizumab药物制剂的代表性色谱。（a）药物制剂（19.6mg/mL natilizumab）；（b）制剂缓冲液；（c）掺入1.3μg/mL MBCD的药物制剂（19.6mg/mLnatilizumab）。
图2显示了该MBCD标准的线性曲线。
图3显示了掺有MBCD的natilizumab的药物制剂的线性曲线。
具体实施方式
本发明涉及在含蛋白质的溶液中的低水平的环糊精或环糊精衍生物的检测和定量。在一个实施方式中，本发明的方法有助于评估由在环糊精或环糊精衍生物存在下生长的细胞所制备的纯化的蛋白质中的残留环糊精的存在。相应地，在一个方面，本发明提供了一种用于检测含蛋白质溶液中环糊精或环糊精衍生物的方法，该方法包括通过SEC从所述蛋白质中分离可能存在的任何环糊精或环糊精衍生物，将所述环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物，以及检测来自于所述包合物的信号的存在。
本发明的另一个方面，为一种用于测定在含蛋白质溶液中可能存在的环糊精或环糊精衍生物的量的方法，该方法包括通过SEC从所述蛋白质分离任何环糊精或环糊精衍生物，将所述环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物，检测来自于所述包合物的信号的存在，以及确定所述信号的大小，其中该信号的大小指示在该溶液中的环糊精或环糊精衍生物的量。
本发明的第三个方面，是一种评估药物制剂的方法，该方法包括：
（a）提供一种包括药用蛋白质和药学上可接受的载体的药物制剂；
（b）利用SEC分离所述药物制剂；
（c）将任何可能存在于所述药物制剂中的环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物；以及
（d）检测来自于所述包合物的信号，其中该信号的大小指示在该药物制剂中的环糊精或环糊精衍生物的量。
本文中，用语“环糊精或环糊精衍生物”是指任何已知的环糊精，尤其是α-环糊精、β-环糊精和γ-环糊精，以及任何已知的环糊精衍生物。环糊精衍生物在美国申请号3,426,011、3,453,257、3,453,258、3,453,259、3,453,260、3,459,731、3,553,191、3,565,887、4,383,992、4,535,152、4,616,008、4,638,058、4,659,696、4,746,734、4,678,598、5,594,125、5,710,268、以及5,831,081中被披露，这些美国申请在此均合并作为参考。环糊精衍生物的示例包括MBCD、羟乙基-β-环糊精以及羟丙基-β-环糊精。环糊精以及环糊精衍生物可从美国Maize Products公司、Wacker Chemicals（USA）公司以及Sigma-Aldrich Chemical公司购得。
本文中，用语“可与环糊精以及环糊精衍生物形成可检测的包合物的制剂”是指任何可与环糊精或环糊精衍生物形成包合物的制剂，其中该包合物通过由SEC柱洗脱而可被检测。该用语包括本身不可测、但含有可测标签（例如，放射性核素或荧光标签）的制剂。该用语还包括本身不可测、但可与环糊精或环糊精衍生物形成可测的包合物的制剂。检测方法的示例包括，但不限于，荧光检测、紫外线检测、放射检测、比色检测、荧光偏振检测、蒸发光散射、毛细管电泳、红外光谱、1H NMR、以及质谱。在一个实施方式中，该可检测制剂为荧光团，例如1-萘酚。也可使用其它的可检测制剂，例如酚酞和8-苯胺萘1-磺酸。
本文中，用语“药物蛋白质”是指任何已知可用于预防、治疗或改善疾病或失调的任何肽或蛋白质，例如抗体、生长因子、细胞表面受体、细胞因子、激素、毒素或者任何前述蛋白质的片段和/或融合蛋白质。用语“抗体”采用其最宽泛的含义，包括单克隆抗体、嵌合、人源化或完全人抗体以及抗原结合抗体片段和/或其衍生物，例如单链抗体、轻链或重链二聚物以及Fv、Fab和（Fab’）2片段。药物蛋白质的示例包括，但不限于，诸如促红细胞生成素、生长激素、集落刺激因子、胰岛素等蛋白质，以及诸如natilizumab、英夫单抗(infliximab)、adalimumab、MabThera、Herceptin、Palivizumab、阿昔单抗(Abciximab)、Alemtuzumab、OKT3-muromonab-CD3、Basiliximab、Gemtuzumab、ozogamicin、Omalizumab、Ibritumomab tiuxetan、Edrecolomab-Mab17-1A、Tositumomab、efalizumab、bevacizumab以及cetuximab等药用抗体。该蛋白质可从在其中自然生长的细胞中分离出来，或者从已经被遗传工程化以表达（例如被重组表达）该蛋白质的细胞中分离出来。
本文中，用语“至少90%（或更高）纯度”以及“至少90%（或更高）同质”，是指从其它蛋白质、脂质、核酸以及其它细胞组分物中提纯出来的蛋白质，从而使该蛋白质占该提纯制剂干重的至少90%（或更高）。在一些实施方式中，蛋白质可至少为91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、或99%纯度。
本文中，用于细胞系的用语“其衍生物”，是指任何由该细胞系产生的、具有至少一个新的特性的任何细胞。具有新的特性的细胞衍生物包括，但不限于，具有不同生长形式的细胞（例如，胆固醇营养缺陷型），其可由选择性的压力产生，以及被遗传工程化以表达蛋白质或显示出一些其它新的行为的细胞。
在本发明的方法中，该SEC柱可以是任何合适的尺寸，并包括任何适用于从蛋白质中分离环糊精或环糊精衍生物的SEC介质。在一个实施方式中，该SEC介质具有一个从约5-20kDa到约75-300kDa的分离范围。该SEC介质可具有约2至约6微米、优选地约3-5微米的粒度，例如，约4微米。一种合适的SEC介质的示例为TSK凝胶G2000SWXL（Tosoh Biosciences公司）。另外一种合适的SEC介质为聚合体基TSK凝胶柱。在一个优选的实施方式中，该分离由高压液相色谱法（HPLC）实施。对于HPLC，SEC柱的合适大小为直径在约5mm至约15mm的范围内，长度为约3cm至60cm。样本大小可在约10μL至约500μL的范围内，优选地为约50μL至约100μL。
加载到该SEC柱上的样本可以为来自于任何含蛋白质溶液的样本，并期望检测该样本中的环糊精或环糊精衍生物的存在。在本发明的一个实施例中，该样本来自含蛋白质的溶液，该蛋白质正在提纯过程中，或者已经被提纯，并且在该蛋白质中期望确定环糊精或环糊精衍生物的存在或者含量。在一个实施方式中，该蛋白质已经被或正在被从细胞中纯化,所述细胞生长在有环糊精或环糊精衍生物存在的细胞培养物中。该样本可取自处于蛋白提纯过程中任何阶段的溶液，例如，在细胞裂解后，在一个或更多提纯步骤后（例如离子交换色谱法，亲和色谱法，等）或者在最终提纯步骤后。溶液中的蛋白质至少为90%纯度，优选地至少为95%、96%、97%、98%、或99%纯度。在一个实施方式中，该样本取自于具有小于20μg/mL环糊精或环糊精衍生物的溶液，优选地取自具有小于10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL或1μg/mL环糊精或环糊精衍生物的溶液。
该样本可由含蛋白质溶液获取，并且只要该溶液的缓冲剂适合于SEC，该样本即可直接装载在SEC柱上。如有必要，该样本的缓冲剂可被调整为适合SEC。用于SEC的合适的缓冲剂为PH值在约2.0至约8.0之间，优选地在约5.0至约7.5之间的含水缓冲液（aqueous buffer）。合适的缓冲剂的示例包括，但不限于，磷酸钠、磷酸钾、醋酸钠、柠檬酸钠、硝酸钾、以及Tris-HCL。缓冲液还应包括足够的盐，以防止样本中的蛋白质粘附于SEC柱和SEC介质。盐的合适水平在约50mM至约300mM的范围内，优选地在约100mM至约200mM的范围内，更优选地为约140mM。可用的盐的示例包括，但不限于，氯化钠、氯化钾、硫酸钠、硫酸钾、硫酸镁、硫酸铵、磷酸铵、以及氯化镁。优选地该盐为氯化钠。
在本发明的一个实施方式中，该样本除必要时调整缓冲剂外，不进行任何准备步骤。例如，该样本不萃取（例如，利用有机溶剂或固相柱）、干燥、再悬浮、浓缩或其它改变。本发明的优点之一在于，可将样本直接装载在SEC柱上（例如，可在装入处检测药物制剂），而不需要复杂的萃取或其它操作（例如，可能会影响样本回收的溶剂或固相萃取）。
流动相可以是PH值为约2.0至约8.0之间，优选地为约5.0至约7.5之间的含水缓冲液，并包括足够的盐，以防止样本中的蛋白质粘附于柱或SEC介质（例如，约50mM至约300mM的盐，优选地约100mM至约200mM）。合适的缓冲剂和盐如上述样本制备中所列的那些。一个合适的流动相的示例为：140mM的NaCl，10mM的磷酸盐，pH值为6.45。
与环糊精或环糊精衍生物形成可检测包合物的制剂可在样本被SEC分离前，被分离过程中或者被分离后，与该样本中任何环糊精或环糊精衍生物相接触。例如，该制剂可在样本装载于柱之前而添加于该样本，该制剂可在流动相中存在，该制剂可添加于从柱上收集的洗脱组分，或者上述情况的组合。在一个优选的实施方式中，该制剂存在于流动相里。
由于不同的环糊精具有不同的结合特性，因此制剂的选择取决于将要被检测的环糊精或环糊精衍生物。合适的制剂在本领域中是熟知的，但依然要根据每种环糊精或环糊精衍生物而经验地确定。该制剂可具有固有的可检测信号（例如，荧光），或者可具有可检测的附加标签（例如，荧光团或放射性核素）。在另外的实施方式中，该制剂不具有固有的可检测信号，但当该制剂结合到环糊精或环糊精衍生物时，形成的包合物产生可检测信号。用作MBCD检测的合适荧光化合物的一个示例为1-萘酚。其它合适的荧光化合物的示例包括酚酞和8-苯胺萘1-磺酸。如果该制剂可水溶，则可直接添加入该流动相。如果该制剂是不可水溶的，它可被溶解于一种有机溶剂，包括，但不限于，甲醇、乙醇、氯仿或者丙酮，然后添加入该流动相，以使该有机溶剂为低百分比（例如，小于10%，优选地小于9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、或1%）。该流动相中制剂的浓度可足够用作要被检测的信号。例如，1-萘酚或其它荧光化合物在流动相中的浓度为约1×10-8至1×10-2M，优选地为约1×10-5至1×10-3M，更优选地为约1×10-4M。
该SEC分离可通过本领域中熟知的方法进行，采用合适的柱制备、样本装载、流动速率、组分收集和信号检测技术。例如，参见:Deutscher,Meth.Enzymol:Guide to Protein Purification,Vol.182,Academic Press,Inc.,San Diego(1990),Chapter38;Balch等人,Meth.Enzymol.,Vol.257,Academic Press,Inc.,San Diego(1995),第8章;Scopes,Protein Purification:Principles and Practice,Springer-Verlag(1994);Sambrook等人,in Molecular Cloning:ALaboratory Manual;Ausubel等人,Current Protocols in MolecularBiology，均通过引用并入。在一个优选的实施方式中该分离通过HPLC完成。信号检测器可以是任何有助于测量该制剂的检测器，例如，荧光检测器、紫外线检测器或放射检测器，并且可与该柱结合使用或者分开使用。当荧光团用作制剂时，荧光检测器可以设置为本领域中熟知的合适的激发和发射波长，例如，对于1-萘酚，分别为290nm和360nm。当该环糊精或环糊精衍生物要被定量时，该被检测信号的大小可被测量，并与标准曲线（该标准曲线由掺入递增量制剂的样本制作）相比较，以测量样本中环糊精或环糊精衍生物的量。
利用本发明的方法，环糊精或环糊精衍生物的测量限度可小于100μg/mL，优选地小于50μg/mL、20μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、2μg/mL、或1μg/mL。
蛋白质，尤其是药用蛋白质，可从细胞培养中提纯并制备为药用制剂。细胞可在环糊精或环糊精衍生物存在下培养，尤其是当该细胞依赖于疏水化合物而生长时，例如，胆固醇营养缺陷型细胞（例如，CHO、COS、或NSO细胞的胆固醇缺陷型衍生物）。在本发明的一个方面，可以评估药物制剂中的环糊精或环糊精衍生物的存在。
在本发明的方法中，可以使用任何本领域中熟知的用于蛋白质表达的细胞。示例包括NSO细胞、猴COS细胞、中国仓鼠卵巢（CHO）细胞，人类肾293细胞、人类表皮A431细胞、人类Colo205细胞、3T3细胞、CV-1细胞、HeLa细胞、以及鼠L细胞、BHK、HL-60、U937、HaK或者Jurkat细胞。细胞可利用本领域熟知的任何方法培养。在一个实施方式中，该细胞为胆固醇营养缺陷型细胞（例如，NSO细胞或者由其衍生的细胞）。在另一个实施方式中，该细胞在MBCD存在下培养。该培养的细胞可自然地表达将要被提纯的蛋白质，或者被遗传工程化以表达该蛋白质。用于遗传工程化细胞以表达目的蛋白质的方法在本领域中是熟知的。例如，参见Sambrook等人,in Molecular Cloning:A Laboratory Manual；Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology，均在此通过引用结合。细胞在环糊精或环糊精衍生物存在下培养。然后，利用本领域熟知的技术（例如，离子交换色谱法、亲和色谱法、尺寸排除色谱法、差示溶解度、超滤等），从该培养的细胞中或者从培养基中提纯蛋白质。该蛋白质可提纯为至少90%同质，优选地至少95%、96%、97%、98%、或99%同质。然后该提纯的蛋白质与药学上可接受的载体相结合以生产药物制剂。
药学上可接受的载体包括药学上可用的有利于将蛋白质加工成药剂的赋形剂和添加剂。赋形剂的示例包括，但不限于，水、盐水、磷酸盐缓冲液、葡萄糖、甘油、乙醇,及其类似物。本领域中熟知的添加剂包括，例如，表面活性剂（例如TWEEN，比如TWEEN-80）,防粘剂、消泡剂、缓冲剂、抗氧化剂（例如抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚（BHA）、丁基羟基甲苯（BHT）以及生育酚例如α-生育酚（维生素E））、防腐剂、螯合剂、增稠剂、填充剂、结合剂、润滑剂、粘度调节剂、增强剂（tonicifiers）、食用香料、着色剂、气味剂、不透明剂、悬浮剂、以及塑形剂。优选地，该药物制剂为用于注射或口服给药的合适的溶液，并含有约0.01%至约99%、优选地约0.25%至约75%的蛋白质及其赋形剂。
环糊精或环糊精衍生物的存在可在提纯的任何阶段被确定。在一个实施方式中，环糊精或环糊精衍生物的存在在最终的药物制剂中被确定。该方法可进一步包括形成一个在样本中（例如，在最终提纯的药物制剂中）的环糊精或环糊精衍生物水平的记录（例如，打印或计算机可读记录，如标签）。
以下实施例为本发明的方法和组成的示例但非限制性说明。在色谱法、药物制剂和评估中，其它多种情况和参数的合适的修改和调整是常见的，其对本领域的普通技术人员是显而易见的，亦应在本发明的精神和范围内。
实施例1
Natilizumab在胆固醇营养缺陷型细胞中被重组表达，该细胞在约720mg/L MBCD存在下培养。抗体在三个常规色谱法步骤中被提纯。开发出一种用于在每个提纯步骤后以及在最终的抗体制剂（适合于药物应用）中确定存在的MBCD的量的方法。
通过HPLC，样本在SEC柱上被分离（TSK凝胶，G2000SWXL，7.8mm×30cm）。流动相包括140mM NaCl，10mM磷酸盐，pH6.45/2%（v/v）的甲醇和10-4M的1-萘酚，样本的体积为50μL（Waters荧光检测器）或100μL（Rainin荧光检测器）。流动速率在等度条件下为1mL/分。该MBCD/1-萘酚包合物利用激发和发射波长分别为290和360nm的荧光检测器检测。
利用在pH为6.1的含水缓冲液中的MBCD标准（水中1.0mg/mL的MBCD）的连续稀释进行检测限度测试。利用该技术，确定的检测限度为1.3μg/mL。实施相同的测试，以确定来自于三个色谱柱中每个以及最终的提纯抗体制剂的洗脱样本的检测限度。该样本中的检测限度非常低，范围从1.3μg/mL到5.2μg/mL，平均为3.0μg/mL。代表性的色谱如图1所示。
为评定该测试的线性，5个含1.3、2.6、10、26、和65μg/mLMBCD的标准以50μL的体积被注入到HPLC柱。该线性最小平方回归如图2所示。结果显示该测试具有高线性，相关系数为0.998。
还利用掺入有1.3、2.6、5.0、10.0、20.0、和50.0μg/mL的MBCD的最终抗体制剂样本观察线性情况。结果（图3）显示该测试具有高线性，相关系数为0.999。
通过将峰面积与对应的MBCD标准中的那些峰面积相比较，计算出最终抗体制剂中的MBCD的回收。如表1中总结的那样，检测的MBCD浓度回收为从97%到117%。
表1
利用含1.3、2.6、10、26、和65μg/mLMBCD的5个标准确定重复率（内-测定精确度）的相对标准差。结果如表2所示，显示出该测试具有小于5%的相对标准差。
表2
Figure BDA00002942139000141
尽管已经对本发明作出了充分的描述，但本领域的普通技术人员容易理解，在不影响本发明和其任何实施方式的情况下，在多种条件、组成和其它参数的宽泛和等同的范围内，也可实现本发明。本文中引用的所有专利、专利申请和出版物均完整引入作为参考。

Claims (10)

1.一种用于检测含蛋白质溶液中的环糊精或环糊精衍生物的存在的方法，该方法包括在尺寸排除色谱柱上装载溶液样本，其中所述样本在装载于所述柱之前不进行萃取步骤，通过尺寸排除色谱法（SEC）从所述蛋白质中分离可能存在的任何环糊精或环糊精衍生物，将所述环糊精或环糊精衍生物与一种制剂相接触，该制剂与分离的环糊精或环糊精衍生物形成可检测的包合物，以及检测来自于所述包合物的信号的存在。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述环糊精或环糊精衍生物为甲基-β-环糊精。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为药用蛋白质。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为重组蛋白质。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述蛋白质为抗体。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述溶液包括小于20μg/mL的环糊精或环糊精衍生物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述制剂为荧光化合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述制剂为1-萘酚。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述方法具有小于10μg/mL的环糊精或环糊精衍生物检测限度。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述方法具有小于2μg/mL的环糊精或环糊精衍生物检测限度。
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