KR20070089171A - 과분극화 13ｃ-피루베이트를 사용한 심장 영상화 방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 자기 공명(magnetic resonance, MR) 영상화제로서 13C-피루베이트를 사용하는 심근 영상화 방법에 관한 것으로, 이 방법에 의해 심근내 세포의 생존력을 결정할 수 있다.
자기 공명 영상화, 과분극화, 피루베이트, 심근 조직, 생존력
Description
본 발명은 심근내 세포의 생존력을 결정할 수 있는, MR 영상화제로서 과분극화 13C-피루베이트를 사용한 심장 영상화 방법에 관한 것이다.
자기 공명 영상화(magnetic resonance imaging, MRI)는, 비침입성 방식으로 환자 및 의료 요원을 X선과 같은 잠재적으로 유해한 방사선에 노출시키지 않고 환자 신체 또는 그의 일부의 영상을 얻는 것을 고려하므로, 의사들이 특히 매력을 느끼게 된 영상화 기술이다. MRI는 그의 고품질 영상 때문에, 연조직 및 기관, 예를 들어 심장의 유리한 영상화 기술이다.
심장의 허혈 관련 손상 및 질환은 서양 나라에서 대부분의 사망의 원인이다. 심근 허혈은 심각한 상태이며, 심근 허혈을 조기에 신속하게 확인하고 위치를 알아내는 것만이 환자가 비가역적 심근 손상을 앓지 않도록 할 수 있다.
다른 대사 활성 조직과 마찬가지로, 심장 조직은 특히 허혈 손상에 걸리기 쉽다. 급성 심근 경색의 초기는 일반적으로 국소 운동이상으로서 나타나는 정상적인 수축 기능의 손실과 관련있다. 이는 급성 동면 상태를 유도하는 갑작스러운 관 상 관류 압력 강하 및 정상 막투과 이온 수송의 급속 정지에 기인할 수 있다. 비가역적 손상이 개시하기 전의 허혈 심근의 재관류는 정상 심장 대사 및 기능으로의 급속한 또는 지연된 복귀(기절)를 일으킬 수 있다.
자기 공명 영상화는 유용한 심장 영상화 기술로서 입증되었다. 스핀-에코(spin-echo) 영상화를 사용한 MR 기술은 심장의 해부를 나타낼 수 있지만, 심근 허혈 및 경색을 검출하기 위해서는 조영제의 사용이 필요하다. MR 조영제의 한 종류는 상자성 조영제로서, 이는 염의 형태 또는 킬레이트화/착화 잔기와의 착체 형태의 상자성 금속 이온을 포함한다.
상자성 조영제 GdDTPA(마그네비스트(Magnevist™))는 심근 영상화에 사용되는 임상 시험의 대상이었다. 이 금속 착체는 동물 및 인간의 MR 영상에서 급성 심근 경색의 확인을 개선하는 것으로 밝혀졌지만, 심근 영상화에서의 그의 임상적 사용은 그의 급속 배출 및 세포외 유체 공간내의 분포로 인해 제한된다.
상자성 금속 이온인 Mn2+은 심근 MR 영상화에 사용되는 조영제로서 사용되었다. Mn2+은 저속 Ca2+ 채널을 통해 수축 심근으로 들어가기 위해 Ca2+와 경쟁하여, 이완시간 T1의 상당한 단축이 일어나고, 따라서 정상 심근 조직에서 신호 강도가 증가된다. 시간 단위당 Mn2+의 총 유입량은 심장박동수 및 수축력이 증가하는 동안 상승된다. 그러나, 허혈 심근에서, 혈류 감소 및 수축력 감소 때문에 훨씬 더 적은 Mn2+이 흡수된다. 따라서, 허혈 심근은 조영제로서 상자성 Mn2+을 사용하는 MR 영상화에 의해 검출되고 정상 심근 조직과 구별될 수 있다.
그러나, Mn2+의 사용은 임의의 단점이 있다. 망간 염, 예를 들어 MnCl2의 사용은 이들 염의 심장 독성으로 인한 안전성 위험과 관련된다(문헌([Hu et al. Magn. Res. in Medicine 46, (2001), 884-890]) 참조). 칼슘 염을 첨가하거나 또는 염을 저속 주입의 형태로 투여함으로써 망간 염의 독성 효과를 상쇄하려는 시도가 있었다. 조영제 배합물에 칼슘을 사용하는 단점은 칼슘이 근육세포에 들어갈 때 칼슘 채널에 대하여 망간과 경쟁한다는 것이다. 이로 인해 효력이 감소되고, 이 효과를 상쇄하기 위하여는 더 다량의 조영제를 주입할 필요가 있다.
WO-A-99/01162호에는 고속 영상 생성과 함께 망간 착체를 사용하는 심근 허혈의 검출 방법이 기술되어 있다. 영상화 과정은 편리하게는 주사 후 3 내지 6 시간 이내에 수행된다고 한다. 이 방법은 독성 문제와 관련되지 않는 것으로 보이지만, 영상화 과정으로부터 결과를 얻는 것은 조영제의 투여와 영상화 과정의 개시 사이의 비교적 긴 시간에 의해 지연된다. 이로써 필요할 수도 있는 치료가 지연된다.
WO 2004/054623호에는 임의의 망간 착체를 사용하여 심근 허혈에 걸린 구역을 확인하는 방법이 기술되어 있다. 물리적 및/또는 약학적 스트레스(stress) 요법은 상기 방법의 일부인데, 정상 심근과 허혈 심근 사이의 대조(contrast) 차이가 증가하고, 따라서 더 소량의 조영제 투여량을 사용하게 한다. 그러나, 스트레스 요법은 환자에게 추가의 생리학적 긴장을 생성한다.
따라서, 허혈 심근 조직과 정상 심근 조직을 구별하여 세포 수준에서의 상기 조직의 생존력의 평가를 고려하는, MR 영상화 방법에 사용되는 시약이 필요하다. 이 시약은 또한 유리한 안전성 프로필을 가져야 한다. 즉, 임상 투여량에서 임의의 독성 부작용을 나타내지 않아야 한다. 또한, 환자에게 추가의 스트레스를 주지 않고 치료 조치의 개시를 지연시키지 않으면서 심근 조직의 생존력을 신속하고 쉽게 평가할 수 있게 하는 MR 영상화 방법이 필요하다.
WO-A-99/35508호에는 MR 조영제로서 고 T1 시약의 과분극화 용액을 사용하여 환자를 MR 조사하는 방법이 개시되어 있다. "과분극화"란 용어는 고 T1 시약에 존재하는 NMR 활성 핵(즉, 핵 스핀이 0이 아닌 핵, 바람직하게는 13C- 또는 15N-핵)의 핵 분극화를 증진시킴을 의미한다. NMR 활성 핵의 핵 분극화를 증진시키면, 이들 핵의 여기 핵 스핀 상태와 기저 핵 스핀 상태 사이의 수 차이가 상당히 증가하고, 이로 인해 MR 신호 강도가 100 배 이상 증폭된다. 과분극화 13C- 및/또는 15N-농축된 고 T1 시약을 사용하는 경우, 천연의 많은 13C 및/또는 15N은 무시할만하므로 배경 신호로부터의 간섭은 본질적으로 없을 것이고, 따라서 영상 대조가 유리하게는 높을 것이다. 과분극화에 적합한 다양한 가능한 고 T1 시약 및 MR 영상화제로서의 용도가 개시되어 있고, 그의 비제한적인 예로는 비내인성 및 내인성 화합물, 예를 들어 아세테이트, 피루베이트, 옥살레이트 또는 글루코네이트, 당(예: 글루코즈 또는 프럭토즈), 우레아, 아미드, 아미노산(예: 글루타메이트, 글리신, 시스테인 또 는 아스파르테이트), 뉴클레오티드, 비타민(예: 아스코르브산), 페니실린 유도체 및 술폰아미드가 있다. 또한 시트르산 주기(예: 푸마르산 및 피루브산)와 같은 정상 대사 주기내의 중간생성물이 대사 활성의 영상화에 바람직한 영상화제인 것으로 기술되어 있다.
과분극화 영상화제의 신호는 이완 및 (환자 신체로의 투여시) 희석으로 인해 감쇄된다는 점이 강조되어야 한다. 따라서, 생물학적 유체(예: 혈액)내 영상화제의 T1 값은 시약이 환자 신체내 표적 부위에 고도로 과분극화된 상태로 분포될 수 있도록 충분히 높아야 한다.
본 발명에 이르러 놀랍게도 심근 조직의 생존력을 평가하기 위한 영상화제로서 과분극화 13C-피루베이트를 사용할 수 있음이 발견되었다. 상이한 피루베이트 대사산물로부터 발생하는 MR 신호 진폭은 심근 조직의 대사 상태에 따라 다르다. 따라서, 이들 대사산물에 의해 형성되는 독특한 대사 피크 패턴은 검사중인 심장 조직의 대사 상태의 지문으로서 사용될 수 있고, 따라서 생육가능한 심근 조직과 생육불가능한 심근 조직의 구별을 고려한다. 이러한 점에서 과분극화 13C-피루베이트는 심근 조직의 생존력을 평가하기 위한, 즉 심근 허혈 또는 심장마비 후의 "위험한 조직"을 확인하기 위한 생체내 MR 영상화를 위한 우수한 시약이 된다. 죽은 심근 조직의 관류 평가 또는 확인을 능가하는 정보는 의사가 심근의 추가의 손상을 예방하기 위하여 환자의 적절한 치료를 개시하는데 있어서 중요하다.
따라서, 본 발명의 제1 양상은 영상화제로서 과분극화 13C-피루베이트를 사용하여 심근 조직의 생존력을 평가하기 위한 MR 영상화 방법을 제공한다.
13C-피루베이트는 우수한 안전성 프로필을 가지며, (내인성 화합물로서) 인체가 잘 견딘다. 본 발명의 방법에서 과분극화 13C-피루베이트의 사용은 투여와 MR 영상화 과정 사이에 지연이 필요하지 않기 때문에 즉각적인 결과를 얻게 한다. 이는 환자가 가능한 빨리 치료를 받을 수 있음을 뜻하며, 따라서 생존과 회복의 기회가 증가한다. 스트레스 요법은 본 발명의 방법에서 필요하지 않으며, 이것이 환자에게 더 유리하다.
NMR 활성 13C-핵의 과분극화는 상이한 방법에 의해 달성될 수 있고(예컨대, WO-A-99/35508호에 기술되어 있음), 바람직한 방법은 희기체(noble gas)로부터의 분극화 전달, "억지 기법(brute force)", 스핀 냉장, 파라수소 방법 및 동적 핵 분극화(dynamic nuclear polarisation, DNP)이다. 과분극화 13C-피루베이트를 얻기 위하여는, 13C-피루베이트를 직접 분극화하거나, 또는 13C-피루브산을 분극화하고 분극화된 13C-피루브산을, 예컨대 염기에 의해 중화함으로써 분극화 13C-피루베이트로 변환시키는 것이 바람직하다.
과분극화 13C-피루베이트를 얻기 위한 바람직한 방법은 과분극화된 희기체로부터의 분극화 전달이다. 비제로(non-zero) 핵 스핀을 갖는 희기체는 과분극화될 수 있다. 즉, 예컨대 원형으로 분극화된 빛을 사용함으로써 평형 분극화에 비하여 분극화가 증진된다. 과분극화된 희기체, 바람직하게는 3He 또는 129Xe, 또는 이들 기체의 혼합물을 사용하여 13C-핵의 과분극화를 행할 수 있다. 과분극화는 또한 동위 원소가 풍부한 과분극화된 희기체, 바람직하게는 3He 또는 129Xe를 사용하여 달성될 수 있다. 과분극화된 기체는 기체 상태일 수 있고, 이는 액체/용매에 용해될 수 있거나, 과분극화된 기체 자체가 용매로서 작용할 수 있다. 또 다르게는 기체를 냉각된 고체 표면상에 응축시켜 이 형태로 사용하거나, 또는 기화시킬 수 있다. 과분극화된 기체와 분극화될 화합물을 균질 혼합하는 것이 바람직하다. 따라서, 실온에서 액체인 13C-피루브산이 분극화되면, 과분극화된 기체는 바람직하게는 액체/용매에 용해되거나 또는 용매로서 작용한다. 13C-피루베이트가 분극화되면, 과분극화된 기체는 바람직하게는, 또한 피루베이트를 용해시키는 액체/용매에 용해된다.
과분극화 13C-피루베이트를 얻기에 바람직한 다른 방식은 매우 낮은 온도 및 높은 자기장에서의 열역학적 평형에 의해 NMR 활성 핵에 분극을 부여하는 것이다. NMR 분광계의 작용 자기장 및 온도에 비하여 과분극화는 매우 높은 자기장 및 매우 낮은 온도의 사용에 의해 행해진다(억지 기법). 사용된 자기장 강도는 가능한 높아야 하고, 적당하게는 1 T보다 높고, 바람직하게는 5 T보다 높고, 더 바람직하게는 15 T 이상이고, 특히 20 T 이상이다. 온도는 매우 낮아야 하고, 예컨대 4.2 K 이하, 바람직하게는 1.5 K 이하, 더 바람직하게는 1.0 K 이하, 특히 바람직하게는 100 mK 이하이다.
과분극화 13C-피루베이트를 얻기에 바람직한 다른 방법은 스핀 냉장 방법이다. 이 방법은 스핀 냉장 분극화에 의한 고체 화합물 또는 시스템의 스핀 분극화를 포함한다. 이 시스템은 3차 이상의 대칭 축을 갖는 적합한 상자성 물질(예: 결정 형태의 Ni2+, 란타니드 원소 또는 악티니드 이온)로 도핑되거나 또는 그와 균질 혼합된다. 기계는 DNP에 필요한 것보다 간단하고, 공명 여기 장이 적용되지 않기 때문에 균일한 자기장이 필요없다. 이 방법은 자기장의 방향에 수직인 축의 주위로 샘플을 물리적으로 회전시킴으로써 수행된다. 이 방법의 필요조건은 상자성 종이 매우 이방성인 g-인자를 가져야 한다는 것이다. 샘플 회전의 결과로서, 전자 상자성 공명은 핵 스핀과 접촉하게 되고, 핵 스핀 온도가 떨어진다. 핵 스핀 분극화가 새로운 평형에 도달할 때까지 샘플 회전을 수행한다.
더 바람직한 실시양태에서, DNP(동적 핵 분극화) 방법을 사용하여 과분극화 13C-피루베이트를 얻는다. 분극화는 상자성 화합물, 소위 상자성 시약 또는 DNP 시약에 의해 행해진다. DNP 과정동안, 일반적으로 극초단파 방사선 형태의 에너지가 제공되는데, 이는 초기에 상자성 시약을 여기시킬 것이다. 기저 상태로 감쇄되면, 상자성 시약의 짝지어지지 않은 전자로부터 샘플의 NMR 활성 핵으로 분극화가 전달된다. 일반적으로, 예컨대 DNP 과정을 액체 헬륨 및 약 1 T 이상의 자기장에서 수행함으로써, DNP 과정에 적당하거나 높은 자기장 및 매우 낮은 온도가 사용된다. 또 다르게는, 충분한 분극화 증진이 달성되는 적당한 자기장 및 임의의 온도가 상용될 수 있다. DNP 기법은 예를 들어 WO-A-98/58272호 및 WO-A-01/96895호에 기술되어 있고, 이들은 본원에 참조로 인용되어 있다. DNP 방법에 의해 과분극화된 13C-피루베이트를 얻기 위하여, 분극화될 화합물로서 13C-피루베이트 및/또는 13C-피루브산을 사용할 수 있다.
13C-피루브산 및/또는 13C-피루베이트가 사용되는 경우, 이는 주로 DNP 과정에 사용되는 상자성 시약에 좌우된다. 상자성 시약이 13C-피루브산에 가용성이면, 13C-피루브산이 바람직하게 사용되고, 상자성 시약 및 13C-피루브산에 의해 액체 혼합물, 바람직하게는 액체 용액이 형성된다. 상자성 시약이 13C-피루브산에 불용성이면, 13C-피루베이트 및/또는 13C-피루브산 및 1종 이상의 공용매가 사용되어 액체 혼합물, 바람직하게는 액체 용액을 형성한다. DNP의 성공 및 분극화 수준은 분극화될 화합물 및 서로 균질 접촉되는 상자성 시약에 의존한다. 따라서, 공용매는 바람직하게는 상자성 시약 및 13C-피루브산 및/또는 13C-피루베이트를 모두 용해시키는 공용매 또는 공용매 혼합물이다. 13C-피루베이트의 경우, 공용매로서 바람직하게는 물이 사용된다.
또한, 냉각/동결시 샘플 혼합물이 결정화된 샘플보다는 유리를 형성할 때 더 고도의 분극화 수준이 DNP 방법에 의해 달성되는 것으로 밝혀졌다. 또 다시, 유리의 형성은 상자성 시약과 분극화될 화합물의 더 균질한 접촉을 가능케 한다. 13C-피루브산은 우수한 유리 형성제이므로, 상자성 시약이 13C-피루브산에 가용성인 경우에는 언제나, 13C-피루브산이 DNP 과정에 바람직하게 사용된다. 13C-피루베이트는 염이고, 동결시 13C-피루베이트의 수용액과 상자성 시약의 액체 혼합물은 결정화된 샘플이 될 것이다. 이를 방지하기 위하여는, 글리세롤, 프로판디올 또는 글리세롤과 같은 우수한 유리 형성제인 추가의 공용매를 첨가하는 것이 바람직하다.
따라서 하나의 실시양태에서, 13C-피루베이트를 물에 용해시켜 수용액을 얻고, 상자성 시약, 글리세롤 및 임의로는 추가의 공용매를 첨가하여 액체 혼합물을 형성한다. 바람직한 실시양태에서, 13C-피루브산, 상자성 시약 및 공용매를 조합하여 액체 혼합물을 형성한다. 가장 바람직한 실시양태에서, 13C-피루브산 및 상자성 시약을 조합하여 액체 혼합물을 형성한다. 화합물의 균질 혼합은 당업계에 공지되어 있는 몇몇 수단, 예를 들어 교반, 보텍싱(vortexing) 또는 초음파처리에 의해 달성될 수 있다.
그 다음, DNP 과정을 수행하기 전에 액체 혼합물을 동결시킨다. 액체 혼합물의 냉각/동결은 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해, 예컨대 액체 혼합물을 액체 질소내에 동결시키거나 또는 간단하게는 액체 헬륨이 샘플을 동결시키는 분극자내에 액체 혼합물을 위치시킴으로써 달성될 수 있다.
전술한 바와 같이, 동적 핵 분극화(DNP)는 분극화될 화합물의 분극화를 DNP 시약, 즉 상자성 시약/화합물에 의해 행하는 분극화 방법이다.
다수의 공지의 상자성 화합물, 예컨대 전이금속(예: 크롬 (V) 이온), 유기 자유 라디칼(예: 니트록사이드 라디칼, 트리틸 라디칼 또는 자성 입자)을 DNP 시약으로서 사용할 수 있다. 이러한 DNP 시약은, 예를 들어 WO-A-99/35508호, WO-A-88/10419호, WO-A-90/00904호, WO-A-91/12024호, WO-A-93/02711호 또는 WO-A-96/39367호에 기술되어 있다.
바람직한 실시양태에서, DNP 방법에 의해 13C-피루베이트를 얻기 위하여 상자성 시약으로서 하기 화학식 I의 트리틸 라디칼이 사용된다:
상기 식에서,
M은 수소 또는 1 당량의 양이온을 나타내고;
R1은 동일하거나 상이하고, 히드록실화될 수 있는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C6- 알킬 기 또는 -(CH2)n-X-R2 기(식 중, n은 1, 2 또는 3이고, X는 O 또는 S이고, R2는 히드록실화될 수 있는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4-알킬 기임)를 나타낸다.
바람직한 실시양태에서, M은 수소 또는 1 당량의 생리학적으로 허용가능한 양이온을 나타낸다. "생리학적으로 허용가능한 양이온"이란 용어는 인간 또는 비인간 동물 생체에 의해 허용되는 양이온을 가리킨다. 바람직하게는, M은 수소 또는 알칼리 양이온, 암모늄 이온 또는 유기 아민 이온, 예를 들어 메글루민을 나타낸다. 가장 바람직하게는, M은 수소 또는 나트륨을 나타낸다.
추가의 바람직한 실시양태에서, R1은 동일하거나 상이하고, 바람직하게는 동일하고, 히드록실화될 수 있는 직쇄 또는 분지쇄 C1-C4-알킬 기, 가장 바람직하게는 메틸, 에틸, 이소프로필, 히드록시메틸 또는 히드록시에틸을 나타낸다.
추가의 바람직한 실시양태에서, R1은 동일하거나 상이하고, 바람직하게는 동일하고, -CH2-O-(C1-C3-알킬), -(CH2)2-O-CH3, -(C1-C3-알킬)-O-CH3, -CH2-S-(C1-C3-알킬), -(CH2)2-S-CH3, -(C1-C3-알킬)-S-CH3, -CH2-O-CH3, -CH2-O-C2H5, -CH2-O-C2H4OH, -CH2-CH2-O-CH3, -CH2-S-CH3, -CH2-S-C2H5, -CH2-S-C2H4OH 또는 -CH2-CH2-S-CH3, 가장 바람직하게는 -CH2-CH2-O-CH3을 나타낸다.
더 바람직한 실시양태에서, M은 수소 또는 나트륨을 나타내고, R1은 동일하고 -CH2-CH2-O-CH3을 나타낸다.
화학식 I의 트리틸 라디칼은 WO-A-91/12024호, WO-A-96/39367호, WO 97/09633호 및 WO-A-98/39277호에 상세히 기술되어 있다. 간단하게는, 라디칼은 3 몰당량의 금속화된 단량체성 아릴 화합물과 1 몰당량의 적합하게 보호된 카르복실산 유도체를 반응시켜 삼량체성 중간생성물을 형성함으로써 합성할 수 있다. 이 중간생성물을 금속화한 후, 예컨대 이산화 탄소와 반응시켜 트리카르복실산 트리틸 카르비놀을 생성하고, 이를 추가의 단계에서 강산으로 처리하여 트리아릴메틸 양이온을 생성한다. 그 다음, 이 양이온을 환원시켜 안정한 트리틸 라디칼을 형성한다.
13C-피루베이트 및/또는 13C-피루브산 및 임의로는 용매를 포함하는 액체 혼합물은 바람직하게는 화학식 I의 트리틸 라디칼 5 내지 100 mM, 더 바람직하게는 10 내지 20 mM, 특히 바람직하게는 12 내지 18 mM, 가장 바람직하게는 13 내지 17 mM을 함유한다. DNP 과정에서 분극화에 필요한 형성 시간은 더 다량의 라디칼을 사용하여 더 짧지만, 달성가능한 분극화 수준은 더 낮다. 따라서, 이들 두 효과를 서로에 대하여 균형이 맞추어져야 한다.
DNP 기법은, 예를 들어 WO-A-98/58272호 및 WO-A-01/96895호에 기술되어 있고, 이들은 본원에 참조로 인용되어 있다. 일반적으로, 예컨대 DNP 과정을 액체 헬륨 및 약 1 T 이상의 자기장에서 수행함으로써, DNP 과정에 적당하거나 높은 자기장 및 매우 낮은 온도가 사용된다. 또 다르게는, 충분한 분극화 증진이 달성되는 적당한 자기장 및 임의의 온도가 사용될 수 있다. 본 발명의 방법의 바람직한 실시양태에서, DNP 과정은 액체 헬륨 및 약 1 T 이상의 자기장에서 수행된다. 적 합한 분극화 장치는, 예를 들어 WO-A-02/37132호에 기술되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 분극화 장치는 저온유지 장치 및 분극 수단, 예컨대 자기장 생성 수단(예: 초전도성 자석)에 의해 둘러싸인 중앙 구멍내 극초단파원에 도파관에 의해 연결된 극초단파 챔버를 포함한다. 구멍은 자기장 강도가 13C 핵의 분극화가 일어나기에 충분히 높은(예컨대 1 내지 25 T) 초전도성 자석 근처의 영역 P의 수준 이상으로 수직 아래로 계속된다. 샘플 구멍은 바람직하게는 밀봉가능하고, 저압, 예컨대 1밀리바 이하 정도의 압력으로 배기될 수 있다. 샘플(즉, 상자성 시약 및 13C-피루베이트 및/또는 13C-피루브산을 포함하는 혼합물)을 도입하는 수단(예: 제거가능한 샘플-수송 관)이 구멍안에 함유될 수 있고, 이 관은 구멍의 위로부터 아래로 영역 P내 극초단파 챔버내의 임의의 위치까지 삽입될 수 있다. 영역 P는 액체 헬륨에 의해 분극화가 일어나기에 충분히 낮은 온도, 바람직하게는 0.1 내지 100 K, 더 바람직하게는 0.5 내지 10 K, 가장 바람직하게는 1 내지 5 K로 냉각된다. 샘플 도입 수단은 바람직하게는 그의 상부 말단에서 임의의 적합한 방식으로 밀봉가능하여 구멍내에 부분 진공을 유지한다. 샘플-보유 용기, 예를 들어 샘플-보유 컵은 샘플 도입 수단의 하부 말단내에 제거가능하게 설치될 수 있다. 샘플-보유 용기는 바람직하게는 낮은 비열 및 우수한 극저온 특성의 경량 물질, 예컨대 KelF(폴리클로로트리플루오로에틸렌) 또는 PEEK(폴리에테르에테르케톤)로 이루어진다. 샘플 용기는 분극화될 하나 이상의 샘플을 수용할 수 있다.
샘플을 샘플-보유 용기에 삽입하고, 액체 헬륨에 담그고, 극초단파, 바람직 하게는 약 200 ㎽, 약 94 ㎓의 주파수로 조사하였다. 분극화의 수준은 극초단파 조사중에 샘플의 고체 상태 13C-NMR 신호를 얻음으로써 감시할 수 있고, 따라서 단계 b)에서 고체 상태 13C-NMR 스펙트럼을 얻기 위한 수단을 함유하는 분극화 장치의 사용이 바람직하다. 일반적으로, 포화 곡선은 13C-NMR 신호 대 시간을 나타내는 그래프에서 얻어진다. 따라서, 언제 최적의 분극화 수준에 도달하는지를 결정하는 것이 가능하다.
분극화를 샘플이 고체 상태가 되도록 하는 방법, 예컨대 DNP 방법에 의해 수행하는 경우, 고체 샘플을 액체 상태로 전이시켜 이를 본 발명의 방법에 사용하여야 한다. 고체 분극화 혼합물을, 예를 들어 WO-A-02/37132호에 기술된 바와 같이 용해시키거나, 또는 예를 들어 WO-A-02/36005호에 기술된 것과 같이 용융시킨다. 액체 조성물을 얻기 위하여, 고체 과분극화 샘플의 용해가 바람직하고, 완충제, 바람직하게는 생리학적으로 허용가능한 완충제내의 용해가 더 바람직하다. 본 명세서에서 "완충제"란 용어는 1종 이상의 완충제, 즉 완충제의 혼합물을 가리킨다.
바람직한 완충제는 생리학적으로 허용가능한 완충제, 더 바람직하게는 약 pH 7 내지 8의 범위에서 완충작용하는 완충제, 예를 들어 인산염 완충제(KH2PO4/Na2HPO4), ACES, PIPES, 이미다졸/HCl, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS 또는 TRICIN이다. 더 바람직한 완충제는 인산염 완충제 및 TRIS이고, TRIS가 더 바람직하다. 다른 실시양태에서, 전술된 바람직한 완충제 중 1종보다 많은 완충 제, 즉 완충제의 혼합물이 사용된다.
분극화될 화합물로서 13C-피루브산이 사용되는 경우, 용해는 13C-피루브산으로부터 13C-피루베이트로의 변환을 또한 포함한다. 이를 달성하기 위하여, 13C-피루브산을 염기와 반응시킨다. 하나의 실시양태에서, 13C-피루브산을 염기와 반응시켜 이를 13C-피루베이트로 변환시킨 후, 완충제를 첨가한다. 다른 바람직한 실시양태에서, 완충제 및 염기를 하나의 용액으로 조합하고, 이 용액을 13C-피루브산에 첨가하여, 그를 용해시키고, 동시에 13C-피루브산을 13C-피루베이트로 전환시킨다. 바람직한 실시양태에서, 염기는 NaOH, Na2CO3 또는 NaHCO3의 수용액이고, 가장 바람직한 염기는 NaOH이다. 특히 바람직한 실시양태에서, NaOH를 함유하는 TRIS 완충제의 용액을 사용하여 13C-피루브산을 용해시키고, 이를 13C-피루베이트의 나트륨 염으로 변환시킨다.
다른 바람직한 실시양태에서, 완충제, 또는 적용가능한 경우 완충제/염기 조합 용액은 자유 상자성 이온과 결합하거나 착화할 수 있는 1종 이상의 화합물, 예컨대 DTPA 또는 EDTA와 같은 킬레이트화제를 추가로 포함한다. 자유 상자성 이온은 과분극화 화합물의 T1을 단축시킬 수 있는 것으로 밝혀졌는데, 이는 피하는 것이 바람직하다.
용해는 바람직하게는 WO-A-02/37132호에 개시된 방법 및/또는 장치를 사용하 여 수행될 수 있다. 과분극화를 DNP 방법에 의해 수행하였다면, 분극자로부터 물리적으로 분리되거나 또는 분극자와 용해 장치를 함유하는 장치의 일부인 용해 장치가 사용될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 용해는 이완을 개선하고 최대 과분극화를 보유하기 위하여 상승된 자기장에서 수행된다. 자기장 노드(node)는 피해야 하고, 낮은 자기장은 상기 조치에도 불구하고 이완을 증진시킬 수 있다.
과분극화를 DNP 방법에 의해 수행하는 경우, 상자성 시약 및/또는 그의 반응 생성물은 바람직하게는 13C-피루베이트 함유 용액으로부터 제거된다. 상자성 시약 및/또는 반응 생성물은 부분적으로, 실질적으로 또는 이상적으로는 완전히 제거될 수 있고, 완전 제거가 바람직하다. 예를 들어 화학식 I의 트리틸 라디칼의 반응 생성물은 히드록시 기를 포함하는 화학식 I의 화합물과 피루브산의 반응시 형성될 수 있는 에스테르일 수 있다. 상자성 시약 및/또는 그의 반응 생성물을 제거하는데 사용가능한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 일반적으로, 적용가능한 방법은 상자성 시약의 성질 및/또는 그의 반응 생성물에 좌우된다. 분극화 후의 고체 샘플을 용해하면, 라디칼이 침전할 수 있고, 이는 여과에 의해 액체 조성물로부터 쉽게 분리될 수 있다. 자성 입자가 상자성 시약으로서 사용되는 경우, 이들 입자도 역시 여과에 의해 쉽게 제거된다. 침전이 일어나지 않으면, 상자성 입자는 크로마토그래피 분리 기법, 예컨대 역상 또는 이온교환 크로마토그래피와 같은 액상 크로마토그래피에 의해 또는 추출에 의해 제거될 수 있다.
화학식 I의 트리틸 라디칼은 특징적인 자외선(UV)/가시광선 흡수 스펙트럼을 나타내기 때문에, 제거 후 액체 조성물내 그의 존재를 확인하기 위한 방법으로서 UV/가시광선 흡수 측정법을 사용하는 것이 가능하다. 정량적인 결과, 즉 용해된 과분극화 샘플에 존재하는 라디칼의 농도를 얻기 위하여, 샘플을 형성하는 특정 파장에서의 흡수가 샘플내에 상응하는 라디칼 농도를 생성하도록 광학 분광계를 보정할 수 있다.
본 발명의 방법에 사용되는 13C-피루베이트 및/또는 DNP 방법에 의해 과분극화 13C-피루베이트를 얻기 위하여 바람직하게 사용되는 13C-피루브산의 동위원소 농축은 바람직하게는 75% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 특히 바람직하게는 90% 이상이고, 90%가 넘는 동위원소 농축이 가장 바람직하다. 이상적으로는, 농축은 100%이다. 13C-피루베이트 및/또는 13C-피루브산은 C1-위치에서 동위원소 농축되거나(하기에 13C1-피루브산 및 13C1-피루베이트로 나타냄), C2-위치에서 동위원소 농축되거나(하기에 13C2-피루브산 및 13C2-피루베이트로 나타냄), C3-위치에서 동위원소 농축되거나(하기에 13C3-피루브산 및 13C3-피루베이트로 나타냄), C1- 및 C2-위치에서 동위원소 농축되거나(하기에 13C1,2-피루브산 및 13C1,2-피루베이트로 나타냄), C1- 및 C3-위치에서 동위원소 농축되거나(하기에 13C1,3-피루브산 및 13C1,3-피루베이트로 나 타냄), C2- 및 C3-위치에서 동위원소 농축되거나(하기에 13C2,3-피루브산 및 13C2,3-피루베이트로 나타냄), C1-, C2- 및 C3-위치에서 동위원소 농축되고(하기에 13C1,2,3-피루브산 및 13C1,2,3-피루베이트로 나타냄), C1-위치가 바람직한 것이다.
13C1-피루브산 및 13C1-피루베이트의 합성을 위한 몇 가지 방법이 당업계에 공지되어 있다. 간단하게는, 문헌([Seebach et al., Journal of Organic Chemistry 40(2), 1975, 231-237])에 S,S-아세탈로서 카르보닐-함유 출발물질, 예컨대 1,3-디티안 또는 2-메틸-1,3-디티안의 보호 및 활성화에 의존하는 합성 경로가 기술되어 있다. 디티안을 금속화하고, 메틸-함유 화합물 및/또는 13CO2와 반응시킨다. 이와 관련하여 기술된 적당한 동위원소 농축된 13C-성분을 사용하여, 13C1-피루베이트, 13C2-피루베이트 또는 13C1,2-피루베이트를 얻는 것이 가능하다. 이어서 카르보닐 관능기는 문헌에 기술된 통상의 방법을 사용하여 방출된다. 상이한 합성 경로는 아세트산으로부터 출발하여, 먼저 아세틸 브로마이드로 변환된 다음, Cu13CN과 반응한다. 얻어진 니트릴은 아미드에 의해 피루브산으로 변환된다(예를 들어, 문헌([S. H. Anker et al., J. Biol. Chem. 176(1948), 1333]; 또는 [J. E. Thirkettle, Chem. Commun. (1997), 1025]) 참조). 또한, 13C-피루브산은, 예컨대 미국 특허 제6,232,497호에 기술된 방법에 의해, 시판중인 나트륨 13C-피루베이트를 양성자화함으로써 얻을 수 있다.
본 발명의 방법에 사용하기 위하여, 과분극화 13C-피루베이트는 살아있는 인체 또는 비인간 동물체에 투여하기에 적합한 조성물로서 제공된다. 조성물은 바람직하게는 전술된 바와 같은 완충제 또는 완충제 혼합물을 포함한다. 조성물은 통상의 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 및 제형화 보조제를 추가로 포함할 수 있다. 따라서, 조성물은 예를 들어 안정제, 삼투압 조절제, 가용화제 등을 포함할 수 있다.
피루베이트는 심지어 고농도에서도 인체가 매우 잘 견디는 내인성 화합물이다. 시트르산 주기내 선구물질로서, 피루베이트는 인체에서 중요한 대사적 역할을 한다. 피루베이트는 상이한 화합물로 변환되는데, 그의 아미노기 전이에 의해 알라닌이 생성되고, 산화적 탈카르복실화에 의해 피루베이트는 아세틸-CoA 및 비카르보네이트로 변환되고, 피루베이트의 환원에 의해 락테이트가 생성되고, 카르복실화에 의해 옥살로아세테이트가 생성된다.
이제, 생체내 MR 영상화를 사용하여 생육가능한 심근 조직 및 생육불가능한 심근 조직을 구별하기 위하여 과분극화 13C-피루베이트의 과분극화 13C-락테이트, 과분극화 13C-비카르보네이트(13C1-피루베이트, 13C1,2-피루베이트 또는 13C1,2,3-피루베이 트의 경우에서만) 및 과분극화 13C-알라닌으로의 변환을 사용할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 과분극화 화합물의 T1은 이완 및 희석으로 인해 감쇄한다는 생각을 가져야 하기 때문에 놀랍다. 13C-피루베이트는 37℃에서 순혈종 인간의 T1 이완이 약 42초이지만, 과분극화 13C-피루베이트의 과분극화 13C-락테이트, 과분극화 13C-비카르보네이트로 및 13C-알라닌으로의 변환은 13C-피루베이트 모화합물 및 그의 대사산물로부터 신호 검출하기에 충분히 빠른 것으로 밝혀졌다. 알라닌, 비카르보네이트 및 락테이트의 양은 조사중인 심근 조직의 대사 상태에 의존한다. 과분극화 13C-락테이트, 과분극화 13C-비카르보네이트 및 과분극화 13C-알라닌의 MR 신호 강도는 이들 화합물의 양 및 검출시의 분극 정도와 관련있으며, 따라서 과분극화 13C-피루베이트의 과분극화 13C-락테이트, 과분극화 13C-비카르보네이트 및 과분극화 13C-알라닌으로의 변환을 감시함으로써, 비침입성 MR 영상화를 사용하여 인간 또는 비인간 동물 심장 조직에서의 생체내 대사 과정을 연구하는 것이 가능하다.
하기에서, "과분극화 13C-피루베이트", "13C-피루베이트" 및 "피루베이트"란 용어는 호환적으로 사용된다. 용어 "과분극화 13C-락테이트", "13C-락테이트" 및 "락테이트"; "과분극화 13C-알라닌", "13C-알라닌" 및 "알라닌"; 및 "과분극화 13C-비 카르보네이트", "13C-비카르보네이트" 및 "비카르보네이트"; 및 "과분극화 13C-대사산물", "13C-대사산물" 및 "대사산물"의 경우에도 마찬가지이다.
상이한 피루베이트 대사산물로부터 발생하는 MR 신호 진폭은 심근 조직의 대사 상태에 따라 다른 것으로 밝혀졌다. 따라서, 알라닌, 락테이트, 비카르보네이트 및 피루베이트에 의해 형성되는 독특한 대사 피크 패턴은 검사중인 심근 조직의 대사 상태의 지문으로서 사용될 수 있고, 따라서 생육가능한 심근 조직, 생육불가능한 심근 조직 및 위험한 심근 조직을 구별할 수 있다. 이로 인해 과분극화 13C-피루베이트를 포함하는 조성물은 심근 조직의 생존력을 평가하기 위한 우수한 생체내 MR 영상화 시약이 된다. 심근 조직의 생존력을 결정하는 것은 심근 허혈 또는 심장 마비후에 중요할 뿐만 아니라, 예를 들어 당뇨병 및 대사 증후군(이들 질환은 심근 조직 손상이 일어날 수 있음)이 있는 환자에서도 중요하다.
관상 동맥 질환(CAD)은 안정 협심증으로부터 급사에 이르기까지 다양한 임상 징후가 있는데, 세포의 생존력 상태에 대하여 보고할 진단 방법이 즉각적으로 유리하다. 가장 "극심한" 두 상태, 즉 정상적인 생육가능 세포 및 죽은 세포 사이에서, "위험한 심근 조직"이라 불리는, 즉 치료하지 않고 내버려 두어 허혈증이 계속되면 괴사성이 될 조직인 허혈성 심근 조직의 상이한 상태를 확인하여 환자에게 괴사를 예방하기 위한 적당한 치료를 제공하는 것이 중요하다.
허혈성 심장의 두 상이한, 그러나 매우 심각한 상태는 동면 및 기절이다. 동면은 심근 혈류가 감소되고 심장이 기능이 마찬가지로 감소된 만성 허혈 상태이 다. 심근 세포는 정상적으로 주로 지방산을 산화한다. 동면 세포에서, 글루코즈의 흡수가 증가되는데(FDG-PET 실험으로부터 알려짐), 이는 피루베이트가 이들 세포의 바람직한 기질이 될 것임을 나타낸다. 반면에, 기절 심근은 급성 허혈로서(예컨대, 주요 관상 폐색증), 혈류는 정상이지만 기능이 저하된다. 이로써 비교적 낮은 대사 활성으로 인해 저 락테이트 상태가 된다. 본 발명의 방법을 사용함으로써, 위험한 심근 조직은 낮은 13C-비카르보네이트 및/또는 높은 13C-락테이트 신호를 갖기 때문에 확인될 수 있는 것으로 밝혀졌다.
허혈증은 다양한 정도의 심근 이상을 일으킬 수 있고, 위중하고 지속되면, 세포의 괴사를 일으킬 것이다. 후자의 경우, 예컨대 과분극화 13C-피루베이트의 투여시 세포가 죽고 대사작용도 전혀 일어나지 않으며, 가능한 대사산물로부틔 신호가 13C-스펙트럼 및/또는 영상에 존재하지 않을 때 이 신호만 예상된다.
일반적으로, 조사중인 대상체, 예컨대 환자 또는 동물을 MR 자석에 위치시킨다. 전용 13C-MR RF-코일을 관심 면적을 덮도록 위치시킨다.
13C-피루베이트 및 1종 이상의 통상의 약학 담체, 부형체 및/또는 첨가제를 포함하는 영상화 매질을 비경구적으로, 바람직하게는 정맥내 또는 동맥내로 투여한다. 예컨대, 관상 동맥내에 위치된 카테터를 통해 영상화 매질을 주사함으로써 심장에 대한 직접 투여도 또한 가능하다. 영상화 매질의 투여량 및 농도는 독성 및 투여 경로와 같은 다양한 인자에 따라 좌우될 것이다. 일반적으로, 영상화 매질은 체중 ㎏당 피루베이트 1 m㏖ 이하, 바람직하게는 0.01 내지 0.05 m㏖/㎏, 더 바람직하게는 0.1 내지 0.3 m㏖/㎏이다. 투여 속도는 바람직하게는 10 ㎖/s 미만, 더 바람직하게는 6 ㎖/min 미만, 가장 바람직하게는 5 ㎖/s 내지 0.1 ㎖/s이다. 투여한 지 400 초 미만, 바람직하게는 120 초 미만, 더 바람직하게는 60 초 미만, 특히 바람직하게는 20 내지 50 초, 가장 바람직하게는 30 내지 40 초에서, 조합된 주파수 및 공간 선택적 방식으로 관심 체적을 암호화하는 MR 영상화 순서가 적용된다. 이로써 13C-락테이트, 13C-알라닌 및 13C-피루베이트의 대사 영상, 더 바람직하게는 13C-락테이트, 13C-알라닌, 13C-비카르보네이트 및 13C-피루베이트의 대사 영상이 얻어질 것이다.
관심 체적의 암호화는, 예를 들어 문헌([T. R. Brown et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 3523-3526(1982)]; [A. A. Maudsley, et al., J. Magn. Res 51, 147-152(1983)])에 기술된, 소위 분광 영상화 순서를 사용하여 달성될 수 있다. 분광 영상 데이터는 각 요소가 전 13C-MR 스펙트럼을 함유하는 다수의 체적 요소를 함유한다. 13C-피루베이트 및 그의 13C-대사산물은 모두 13C-MR 스펙트럼내에 독특한 위치를 가지며, 이들의 공명 주파수를 사용하여 그들을 확인할 수 있다. 그의 공명 주파수에서의 피크의 적분은 각각 13C-피루베이트 및 그의 13C-대사산물의 양과 직접 관련있다. 13C-피루베이트 및 각 13C-대사산물의 양을, 예를 들어 문헌 ([L. Vanhamme et al., J. Magn. Reson. 129, 35-43(1997)])에 기술된 시간 도메인 정합 과정을 사용하여 계산하면, 13C-피루베이트 및 각 13C-대사산물에 대한 영상이 생성될 수 있고, 이때 색 암호화 또는 회색 암호화는 측정된 13C-피루베이트 및 각 13C-대사산물의 양을 나타낸다.
분광 영상화 방법은 모든 종류의 MR 핵, 예컨대 1H, 31P, 23Na를 사용한 대사 영상을 생성하는데 있어서 그 가치가 입증되었지만, 분광 영상을 완전히 암호화하는데 필요한 반복 정도는 이 접근방법을 과분극화 13C에 덜 적합하게 만든다. 전체 MR 데이터를 획득하는 동안 이용가능한 과분극화 13C-신호를 확실히 하기 위하여 주의를 기울여야 한다. 감소된 신호 대 소음의 비를 희생하여, 이는 모든 상 암호화 단계에 적용되는 RF파 각도를 감소시킴으로써 달성될 수 있다. 매트릭스 크기가 클수록 더 많은 상 암호화 단계 및 더 긴 주사 시간이 필요하다.
문헌([P. C. Lauterbur, Nature, 242, 190-191,(1973)] 및 [P. Mansfield, J. Phys. C. 6, L422-L426(1973)])에 기술된 개척적인 연구를 기본으로 하는, 데이타 획득중에 판독 구배를 적용함을 포함하는 영상화 방법은 더 높은 신호 대 소음 영상 또는 등가의, 더 높은 공간 해상도 영상을 고려할 것이다. 그러나, 이들 기본 형태의 영상화 방법은 13C-피루베이트 및 그의 13C-대사산물의 별개의 영상을 생성할 수 없고 13C-피루베이트 및 그의 모든 13C-대사산물의 신호를 함유하는 영상을 생성할 것이다. 즉, 특정 대사산물의 확인은 불가능하다.
바람직한 실시양태에서, 주파수 정보를 암호화하기 위하여 멀티에코(multiechoes)를 사용할 영상화 순서가 사용된다. 별개의 물 및 지방 1H-영상을 생성할 수 있는 순서는, 예를 들어 문헌([G. Glover, J. Magn. Reson. Imaging 1991; 1:521-530] 및 [S. B. Reeder et al., MRM 51, 35-45(2004)])에 기술되어 있다. 검출할 대사산물 및 이들의 MR 주파수는 공지되어 있기 때문에, 상기 참조문헌에 논의된 접근방법을 적용하여 13C-피루베이트, 13C-알라닌 및 13C-락테이트 및 바람직하게는 13C-피루베이트, 13C-알라닌, 13C-락테이트 및 13C-비카르보네이트의 직접 영상을 획득할 수 있다. 이 과정은 과분극화된 13C-MR 신호를 더 효율적으로 사용하게 하여, 분광 영상화에 비하여 더 우수한 신호 품질, 더 높은 공간 해상도 및 더 빠른 획득 시간을 제공한다.
초기에 기술한 바와 같이, 생육가능한 심장 조직은 높은 대사 활성을 특징으로 한다. 허혈, 즉 조직으로의 혈류가 감소되면, 세포에 산소가 부적절하게 공급되고, 세포 수준의 대사 과정이 감소한다. 놀랍게도, 과분극화 13C-피루베이트를 사용하여 이용가능한 짧은 MR 영상화 시간 윈도우(window)내에서 상기 대사 변화를 가시적으로 만들 수 있다. 개별 세포의 대사 상태에 따라 좌우되는, 심근 조직내 13C-락테이트 및 13C-비카르보네이트 신호의 특히 유의적인 변화에 의해 심근 조직의 생존력을 평가할 수 있다.
따라서 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 (a) 과분극화된 13C-피루베이트를 포함하는 영상화 매질을 미리 투여한 대상체로부터 13C-피루베이트 및 그의 13C-함유 대사산물인 알라닌, 락테이트 및 임의로는 비카르보네이트의 직접 13C-MR 영상을 획득하고, (b) 임의로는 한 대사산물의 13C 신호를 검출된 임의의 다른 대사산물의 13C 신호와 서로 관련시켜 2종, 바람직하게는 3종, 가장 바람직하게는 4종의 13C 대사산물의 신호 강도 차에 근거하여 대조를 얻는 것을 포함하고, 이때 상기 13C 영상에서 위험한 심근 조직은 최저 13C-비카르보네이트 신호 및/또는 최고 13C-락테이트 신호에 의해 나타난다.
따라서 바람직한 실시양태에서, 본 발명에 따른 방법은 (a) 과분극화 13C-피루베이트를 포함하는 영상화 매질을 미리 투여한 대상체로부터 13C-피루베이트 및 그의 13C-함유 대사산물인 알라닌, 락테이트 및 임의로는 비카르보네이트의 직접 13C-MR 영상을 획득하고, (b) 임의로는 한 대사산물의 13C 신호를 검출된 임의의 다른 대사산물의 13C 신호와 서로 관련시켜 2종, 바람직하게는 3종, 가장 바람직하게는 4종의 13C 대사산물의 신호 강도 차에 근거하여 대조를 얻고, (c) 최저 13C-비카 르보네이트 신호 및/또는 최고 13C-락테이트 신호를 확인함으로써 상기 영상에서 위험한 심근 조직을 확인하는 것을 포함한다.
피루베이트 신호를 보정하기 위하여, 각각의 개별 영상에서 대사산물(락테이트, 알라닌 및 비카르보네이트) 및 피루베이트 영상을 최대값으로 표준화한다. 둘째로, 표준화된 락테이트 영상에 반전된 피루베이트 영상(예컨대, 영상의 최대 피루베이트 신호 - 매 화소의 피루베이트 수준)을 곱한다. 마지막 단계로서, 상기 공정에서 얻어진 중간 결과에 원래 락테이트 영상을 곱한다.
예로서, 비카르보네이트 신호를 보정하기 위하여, 락테이트 및 비카르보네이트 영상을 각 개별 영상에서 최대값으로 표준화한다. 둘째로, 표준화된 락테이트 영상에 반전된 비카르보네이트 영상(예컨대, 영상의 최대 비카르보네이트 신호 - 매 화소의 비카르보네이트 수준)을 곱한다. 마지막 단계로서, 상기 공정에서 얻어진 중간 결과에 원래 락테이트 영상을 곱한다. 유사한 방식으로, 알라닌 신호도 역시 분석에 포함시킬 수 있고, 변하지 않은 알라닌 신호와 함께 낮은 비카르보네이트 신호의 발견을 위험한 심근 조직의 표시로서 또한 사용할 수 있다.
대사작용이 변한 영역을 강조하기 위하여, 감소된 대사산물 신호와 함께 증가된 대사산물 신호의 임의의 조합을 상기 문단에 기술된 것과 유사한 공정에 사용할 수 있고, 이로써 가중된 대사산물 영상이 얻어진다. 놀랍게도, 심근 조직 생존력의 평가, 즉 생육가능한 심근 조직, 손상된 심근 조직 및 생육불가능한 심근 조직의 구별이 이 보정에 의해 개선된다.
해부학 및/또는 관류 정보를 본 발명의 방법에 따라 심근 조직 생존력의 평가에 포함시킬 수 있다. 해부학 정보는, 예를 들어 적합한 조영제를 사용하거나 사용하지 않고 양성자 또는 13C-MR 영상을 획득함으로써 얻을 수 있다. 심근내 상대적 관류는, 예를 들어 옴니스캔(Omniscan™)과 같은 MR 조영제를 사용하여 결정할 수 있다. 마찬가지로, 조영제의 투여없이 관류 측정하기 위한 MR 영상화 기법이 당업계에 공지되어 있다. 바람직한 실시양태에서, 비대사된 과분극화 13C-조영제를 사용하여 정량적 관류를 결정한다. 적합한 기법 및 조영제는, 예를 들어 Wo-A-02/23209호에 기술되어 있다. 더 바람직한 실시양태에서, 과분극화 13C-피루베이트를 사용하여 정량적 관류를 결정한다.
다른 바람직한 실시양태에서, 과분극화 13C-피루베이트를 포함하는 영상화 매질을 반복적으로 투여함으로써 동적 연구가 가능하다. 이는 망간계 시약(더 다량의 투여량에서 심장독성 효과를 나타냄)을 사용하는 다른 MR 심장 영상화 방법에 비하여, 본 발명에 따른 방법의 추가의 이점이다. 피루베이트의 낮은 독성 및 그의 유리한 안전성 프로필 때문에, 이 화합물의 반복 투여를 환자가 잘 견딘다.
본 발명의 방법에서 얻어진 결과에 의해 의사는 검사중인 환자에 적당한 치료법을 선택할 수 있다. 또 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명의 방법을 사용하여 치료가 성공적인지를 결정한다.
피루베이트는 또한 수축촉진(inotropic) 효과를 갖는 것으로 보고되어 있다. 따라서, 상기 화합물은 산소 비함유 라디칼이 한 역할을 하는 것으로 추측되는 기절 심근의 경우에 진단 및 치료 제제로서 동시에 사용될 수 있다.
또 하나의 양상으로부터 볼 때, 본 발명은 세포의 생존력을 평가하기 위한 MR 영상화 방법에 사용하기 위한 영상화 매질의 제조를 위한 과분극화 13C-피루베이트의 용도를 제공한다.
영상화제로서 과분극화 13C을 함유하는 영상화 매질의 제조는 15쪽 내지 21쪽에 상세하게 기술되어 있다.
또 하나의 양상으로부터 볼 때, 본 발명은 세포의 생존력을 평가하기 위한 MR 영상화 방법에 영상화제로서 사용하기 위한 과분극화 13C-피루베이트의 제조를 위한 13C-피루브산 또는 13C-피루베이트의 용도를 제공한다.
13C-피루브산 또는 13C-피루베이트로부터 과분극화 13C-피루베이트를 제조하는 바람직한 실시양태는 6쪽 내지 15쪽에 상세하게 기술되어 있다.
바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 과분극화 13C-피루베이트를 포함하는 조성물을 미리 투여한 대상체로부터 13C-피루베이트 및 그의 13C-함유 대사산물인 알라닌, 락테이트 및 임의로는 비카르보네이트의 직접 13C-MR 영상을 획득하고, (b) 임의로는 한 대사산물의 13C 신호를 검출된 임의의 다른 대사산물의 13C 신호와 서로 관련시켜 2종, 바람직하게는 3종, 가장 바람직하게는 4종의 13C 대사산물의 신호 강도 차에 근거하여 대조를 얻는 것을 포함하는, 세포의 생존력을 평가하기 위한 MR 영상화 방법에 사용하기 위한 영상화 매질의 제조를 위한 과분극화 13C-피루베이트의 용도를 제공한다.
또 하나의 바람직한 실시양태에서, 본 발명은 (a) 과분극화 13C-피루베이트를 포함하는 조성물을 미리 투여한 대상체로부터 13C-피루베이트 및 그의 13C-함유 대사산물인 알라닌, 락테이트 및 임의로는 비카르보네이트의 직접 13C-MR 영상을 획득하고, (b) 임의로는 한 대사산물의 13C 신호를 검출된 임의의 다른 대사산물의 13C 신호와 서로 관련시켜 2종, 바람직하게는 3종, 가장 바람직하게는 4종의 13C 대사산물의 신호 강도 차에 근거하여 대조를 얻는 것을 포함하는, 세포의 생존력을 평가하기 위한 MR 영상화 방법에 영상화제로서 사용하기 위한 과분극화 13C-피루베이트의 제조를 위한 13C-피루브산 또는 13C-피루베이트의 용도를 제공한다.
상기 방법 및 이 방법의 바람직한 실시양태는 24쪽 내지 29쪽에 상세하게 기술되어 있다.
실시예 1: 트리스(8-카르복시-2,2,6,6-(테트라(메톡시에틸)벤조-{1,2-4,5'} 비스-(1,3)디티올-4-일)메틸 나트륨 염의 합성
WO-A1-98/39277호의 실시예 7에 따라 합성된 트리스(8-카르복시-2,2,6,6-(테트라(히드록시에틸) 벤조-[1,2-4,5']-비스-(1,3)-디티올-4-일)메틸 나트륨 염 10 g(70 m㏖)을 아르곤 분위기하에 디메틸아세트아미드 280 ㎖에 현탁시켰다. 수소화 나트륨(2.75 g)에 이어서 요오드화 메틸(5.2 ㎖)을 첨가하고, 약간 발열성인 반응을 34 ℃ 수욕에서 1 시간동안 진행시켰다. 수소화 나트륨 및 요오드화 메틸의 첨가를 동일한 양의 각 화합물을 사용하여 2번 반복하고, 최종 첨가후에, 혼합물을 실온에서 68 시간동안 교반한 다음, 물 500 ㎖에 부었다. 1 M NaOH(수성) 40 ㎖를 사용하여 pH를 13보다 높게 조절하였고, 혼합물을 주위 온도에서 15 시간동안 교반하여 형성된 메틸 에스테르를 가수분해하였다. 그 다음, 2 M HCl(수성) 50 ㎖를 사용하여 혼합물을 pH 약 2로 산성화하고, 에틸 아세테이트로 3번 추출하였다(500 ㎖ 및 2×200 ㎖). 유기 상을 합하여 Na2SO4상에서 건조시킨 다음, 증발에 의해 건조시켰다. 조생성물(24 g)을, 용리액으로서 아세토니트릴/물을 사용하는 제조용 HPLC에 의해 정제하였다. 분획을 모아 증발시켜 아세트니트릴을 제거하였다. 남아있는 수성상을 에틸 아세테이트로 추출하고, 유기상을 Na2SO4상에서 건조시킨 다음, 증발에 의해 건조시켰다. 잔류물에 물(200 ㎖)을 첨가하고, pH를 0.1 M NaOH(수성)에 의해 7로 조심스럽게 조절하였고, 이 과정중에 잔류물은 서서히 용해되었다. 중화한 후, 수용액을 동결 건조하였다.
실시에 2:
13
C-피루브산 및 실시예 1의 트리틸 라디칼을 사용하는 DNP 방법 에 의한, 과분극화
13
C-피루베이트를 포함하는 조성물의 생성
실시예 1의 라디칼 5.0 ㎎을 13C1-피루브산(164 ㎕)에 용해시켜 20 mM 용액을 제조하였다. 샘플을 균질하게 혼합하고, 분취량의 용액(41 ㎎)을 샘플 컵에 넣어 DNP 분극자에 삽입하였다.
샘플을 극초단파(93.950 ㎓) 조사하의 3.35 T 자기장에서 1.2 K의 DNP 조건하에 분극화하였다. 2 시간 후, 분극화를 중지하고, 수산화 나트륨 및 트리스(히드로시메틸)아미노에탄(TRIS)의 수용액내 WO-A-02/37132호에 따른 용해 장치를 사용하여 샘플을 용해시켜 과분극화 나트륨 13C1-피루베이트의 중성 용액을 제공하였다. 용해된 샘플을 13C-NMR에 의해 재빨리 분석하여 분극화를 평가하였고, 19.0 %의 13C 분극화가 얻어졌다.
실시예 3:
13
C-피루브산 및 실시예 1의 트리틸 라디칼을 사용하는 DNP 방법에 의한, 과분극화
13
C-피루베이트를 포함하는 조성물의 생성
실시예 1의 라디칼(209.1 ㎎)을 13C1-피루브산(553 ㎎) 및 비표지된 피루브산(10.505 g)의 혼합물에 용해시켜 15 mM 용액을 제조하였다. 샘플을 균질하게 혼합하고, 분취량의 용액(2.015 g)을 샘플 컵에 넣어 DNP 분극자에 삽입하였다.
샘플을 극초단파(93.950 ㎓) 조사하의 3.35 T 자기장에서 1.2 K의 DNP 조건 하에 분극화하였다. 4 시간 후, 분극화를 중지하고, 수산화 나트륨 및 트리스(히드로시메틸)아미노에탄(TRIS)의 수용액내 WO-A-02/37132호에 따른 용해 장치를 사용하여 샘플을 용해시켜, 100 mM TRIS 완충제내 총 피루베이트 농도 0.5 M의 과분극화 나트륨 13C1-피루베이트의 중성 용액을 제공하였다. 용해 장치와 연속하여 크로마토그래피 칼럼을 연결시켰다. 칼럼은 배리언(Varian)사에 의해 공급되는 소수성 충전재(본데실(Bondesil)-C18, 40UM 부품 #:12213012)를 함유하는 카트리지(D=38 ㎜; h=10 ㎜)로 이루어졌다. 용해된 샘플을 라디칼을 선택적으로 흡착하는 칼럼을 통해 강제로 보냈다. 여과된 용액을 13C-NMR에 의해 재빨리 분석하여 분극화를 평가하였고, 16.5 %의 13C 분극화가 얻어졌다. 이어서 잔여 라디칼 농도를 469 ㎚에서 UV 분광광도계로 분석하였고, 0.1 μM의 검출 한계 미만인 것으로 결정되었다.
실시예 4:
13
C-피루브산 및 트리스(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸-벤조[1,2-d:4,5-d']비스(1,3)디티올-4-일)메틸 나트륨 염을 사용한, DNP 방법에 의한 과분극화
13
C-피루베이트의 생성
트리스(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸-벤조[1,2-d:4,5-d']-비스-(1,3)-디티올-4-일)메틸 나트륨 염을 WO-A-97/09633호의 실시예 29에 기술된 것과 같이 합성하였다.
트리스(8-카르복시-2,2,6,6-테트라(히드록시에톡시)메틸-벤조[1,2-d:4,5- d']-비스-(1,3)-디티올-4-일)메틸 나트륨 염을 13C1-피루브산(83.1 ㎎)에 용해시킴으로써 20 mM 용액을 제조하였다. 샘플을 균질하게 혼합하고, 샘플 컵에 넣어 DNP 분극자에 삽입하였다. 샘플을 극초단파(93.950 ㎓) 조사하의 3.35 T 자기장에서 1.2 K의 DNP 조건하에 분극화하였다. 배리언 이노바(Inova)-200 NMR 분광계를 사용하여 샘플로부터 13C-NMR 신호를 얻었다. 열평형 13C-NMR 신호 및 증진된 NMR 신호의 측정으로부터 DNP 증진을 계산하였다. 16%의 13C 분극화가 얻어졌다.
실시예 5: 본 발명에 따른 심장 영상화 과정
5.1 돼지 표본
등장성 NaCl(26 체적%), 케탈라(Ketalar)(50 ㎎/㎖)(화이자 AB(Pfizer AB)사)(42 체적%), 노르큐론(Norcuron)(10 ㎎+멸균수 5 ㎖)(오르가논(Organon)사)(21 체적%) 및 미다졸람(Midazolam)(5 ㎎/㎖)(파마 하멜른(Pharma Hameln)사)(11 체적%)을 함유하는 칵테일을 주입 펌프를 사용하여 0.6 ㎖/min의 속도로 투여하여 돼지(25 ㎏)를 마취시켰다.
13C1-피루베이트를 1차 주사한 후, 돼지를 MR 스캐너(scanner)로부터 꺼내었다. X선 유도하에, 풍선 카테터를 좌관 동맥에 삽입하고, 그 회선을 15분동안 차단시켰다. 전체 공정동안 ECG 및 혈압을 측정하였다. 허혈 기간이 끝나고 90분 후, 돼지를 다시 영상화하고, 대조군 측정을 수행했던 곳과 (거의) 같은 곳에서 13C-영상을 얻었다.
5.2 양성자 MR 영상화
돼지를 돼지 MR 코일(래피드 바이오메디컬(Rapid Biomedical)사, 독일)에 위치시키고, 표준의 임상 심장 양성자 MR 영상화 서열 라이브러리를 사용하여 영상화하여 해부학 정보를 얻고 심근의 단축 단면도 배향을 얻었다(단축 단면도의 실시예를 참조하기 위하여 도면의 양성자 기준 영상 참조).
5.3
13
C-MR 영상화
MR 시스템에 의해 발견된 양성자 주파수에 근거하여, 하기 수학식에 따라 13C1-알라닌의 MR 주파수를 계산하였다:
계산된 주파수는 왼쪽의 13C1-락테이트와 공명인 13C1-알라닌 및 13C1-알라닌의 오른쪽에서 공명하는 13C1-피루베이트 및 13C1-비카르보네이트로부터 발생하는 MR 신호를 위치시켰다. 13C-MR 코일 및 시스템 MR 주파수가 올바르게 설치되었는지를 확실하게 하기 위하여 비국소화된 MR 분광학 순서를 실행하였다. 13C-영상 장소를 근조직을 덮도록 위치시켰다(단축 단면도 두께 20 ㎜, 평면 화소 크기 7.5×7.5 ㎟). 재구성 상에서, 영상 데이터를 제로-충전하여 3.75×3.75×20 ㎣ 해상도를 얻었다. 앞다리에 12초동안 13C1-피루베이트(327 mM) 16 ㎖(1.3 ㎖/s)를 정맥내 주사하고(0.22 m㏖/㎏), 주사를 시작한 지 30초 후에(즉, 주사를 마치고 나서 18초 후), 13C-MR 순서의 화학적 이동이 시작되었다.
5.4 MR 영상화 데이터의 분석
MR 영상화에 의해, 각 요소 또는 3D 화소/화소가 13C-MR 스펙트럼을 함유하는, 16×16 요소를 함유하는 매트릭스를 얻었다. 재구성 상에서, 매트릭스를 32×32로 제로-충전하였고, 이는 공간 해상도를 개선하는데 도움이 되는 수학적 공정이다. 제조사에 의해 제공된 소프트웨어를 갖춘 MRI 스캐너에서 데이터세트(dataset)를 분석하였다. 결과는 13C1-피루베이트, 13C1-알라닌, 13C1-락테이트 및 13C1-비카르보네이트의 대사 영상이다.
5.5 결과
회선(circumflexa)의 폐색 전후의 실험 결과를 첨부된 도면에 나타내고 요약하였다.
도 1은 허혈 기간 전의 돼지에서 얻은 영상 및 스펙트럼을 나타내는데, 도 1a는 13C-피루베이트 영상을 나타내고, 도 1b는 13C-락테이트 영상을 나타내고, 도 1c는 13C-알라닌 영상을 나타내고, 도 1d는 양성자 기준 해부 영상을 나타내고, 도 1e는 13C-비카르보네이트 영상을 나타내고, 도 1f는 도 1e에 표시된 영상 중에서 선택된 화소의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도 2는 허혈 기간 후의 돼지에서 얻은 영상 및 스펙트럼을 나타내는데, 도 2a는 13C-피루베이트 영상을 나타내고, 도 2b는 13C-락테이트 영상을 나타내고, 도 2c는 13C-알라닌 영상을 나타내고, 도 2d는 양성자 기준 해부 영상을 나타내고, 도 2e는 13C-비카르보네이트 영상을 나타내고, 도 2f는 도 2e에 표시된 영상 중에서 선택된 화소의 13C-NMR 스펙트럼을 나타낸다.
도면에서 허혈 기간 전후의 양성자 기준 영상에 차이가 없음을 알 수 있다. 또한, (대조군에 비하여) 강하게 감소된 비카르보네이트 신호 및 락테이트 신호의 양성 대조는 위험한 심근 조직을 나타낸다. 허혈 기간 전후의 알라닌과 피루베이트 영상에서는 차이가 보이지 않았다.
5.6 결론
MR 영상화 검사에서 영상화제로서 과분극화 13C-피루베이트를 사용함으로써, 위험한 심근 조직을 확인할 수 있었다.
Claims (15)
- 영상화제로서 과분극화 13C-피루베이트를 사용하는, 심근 조직의 생존력을 평가하기 위한 MR 영상화 방법.
- (a) 과분극화 13C-피루베이트를 포함하는 조성물을 미리 투여한 대상체로부터 13C-피루베이트 및 그의 13C-함유 대사산물인 알라닌, 락테이트 및 임의로는 비카르보네이트의 직접 13C-MR 영상을 획득하고, (b) 임의로는 한 대사산물의 13C 신호를 검출된 임의의 다른 대사산물의 13C 신호와 서로 관련시켜 2종, 바람직하게는 3종, 가장 바람직하게는 4종의 13C 대사산물의 신호 강도 차에 근거하여 대조(contrast)를 얻는 것을 포함하는 방법.
- 제2항에 있어서, (c) 최저 13C-비카르보네이트 신호 및/또는 최고 13C-락테이트 신호를 확인함으로써 상기 영상에서 위험한 심근 조직을 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 또는 제3항에 있어서, DNP 방법에 의해 13C-피루브산 및/또는 13C-피루 베이트를 과분극화함으로써 과분극화 13C-피루베이트를 얻는 방법.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 13C-피루베이트를 포함하는 조성물이 (KH2PO4/Na2HPO4), ACES, PIPES, 이미다졸/HCl, BES, MOPS, HEPES, TES, TRIS, HEPPS 및 TRICIN으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 완충제를 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 주파수 정보를 암호화하는 멀티에코(multiechoes)를 사용하는 영상화 순서를 단계 (a)의 직접 13C-영상을 획득하는데 사용하는 방법.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 13C-피루베이트를 포함하는 조성물을 투여한 후 400 초 미만에 단계 (a)의 직접 13C-영상이 획득되는 방법.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 해부학 및/또는 관류 정보를 얻기 위하여, 양성자 MRI 조영제의 존재하 또는 부재하의 하나 이상의 양성자 영상을 획득하거나, 또는 과분극화 13C-MR 조영제를 갖는 하나 이상의 13C-영상을 획득하는 방법.
- 제8항에 있어서, 양성자 MRI 조영제의 존재하 또는 부재하에 양성자 영상을 획득하여 심근내의 상대적 관류를 결정하는 방법.
- 제8항에 있어서, 대사되지 않은 과분극화 13C-MR 조영제를 사용하여 13C-영상을 획득하여 심근내의 정량적 관류를 결정하는 방법.
- 제8항에 있어서, 과분극화 13C-피루베이트를 사용하여 13C-영상을 획득하여 심근내의 정량적 관류를 결정하는 방법.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (b)가, 락테이트 신호를 비카르보네이트의 양에 대해 보정하여 비카르보네이트 영상에 대하여 가중된 락테이트를 얻는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제12항에 있어서, (c) 최저 13C-비카르보네이트 신호 및/또는 최고 13C-락테이트 신호를 확인함으로써 상기 영상에서 위험한 심근 조직을 확인하는 것을 추가로 포함하는 방법.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 b)가 필수적인 것인 방법.
- 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 13C-피루베이트가 13C1-피루베이트인 방법.
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