KR20070088656A

KR20070088656A - 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 분석

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Publication number: KR20070088656A
Application number: KR1020077012185A
Authority: KR
Inventors: 배페나에르트 카타리나 안토니아 저마니아 조세파 마우리타 데; 다니엘르 셀린 죠제트 피터스; 헤크 지르트 마리아 로버트 반; 피터 구이도 아이다 베르메울렌; 모니크 제니 마리에 베르바에르
Original assignee: 얀센 파마슈티카 엔.브이.
Priority date: 2004-12-22
Filing date: 2005-12-13
Publication date: 2007-08-29
Also published as: CA2586477A1; CN101084319A; JP2008523836A; AU2005318206B2; NZ554516A; RU2007127714A; WO2006067071A1; AU2005318206A1; IL184117A0; EP1831393A1; RU2415946C2; US20100152277A1; NO20073761L

Abstract

본 발명은 일반적으로 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)의 생물학적 활성을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 DGAT의 생물학적 활성을 조절할 수 있는 화합물을 빠르고, 대량으로 스크린하는 방법을 제공한다. 더욱 자세하게, 본 발명은 Flashplate^TM 기술과 함께 특정 미셀(micelle)의 이용에 근거하여 DGAT 활성을 측정하기 위한 분석 시스템을 제공한다.

Description

디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제 분석{Diacylglycerol Acyltransferase Assay}

본 발명은 일반적으로 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제(diacylglycerol acyltransferase, DGAT)의 생물학적 활성을 측정하는 방법을 제공한다. 특히, 본 발명은 DGAT의 생물학적 활성을 조절할 수 있는 화합물을 빠르고, 대량으로 스크린하는 방법을 제공한다. 더욱 자세하게, 본 발명은 Flashplate^TM 기술과 함께 특정 미셀(micelle)의 이용에 근거하여 DGAT 활성을 측정하기 위한 분석 시스템을 제공한다.

트리글리세리드(Triglyceride)는 진핵 생물에서 저장되는 에너지의 주요한 형태를 나타낸다. 트리글리세리드 대사 장애 또는 불균형은 비만, 인슐린 저항성 증후군, 및 II형 당뇨병, 비알코올성 지방간 질환 및 관상동맥 심질환의 발병과 위험을 증가시킴을 암시한다(Lewis, et al, Endocrine Reviews (2002) 23:201 및 Malloy and Kane, Adv Intern Med (2001) 47:111 참조). 덧붙여, 고중성 지방혈증(hypertriglyceridemia)은 종종 암 치료법에 불리한 영향을 미친다(Bast, et al. Cancer Medicine, 5th Ed., (2000) B.C. Decker, Hamilton, Ontario, CA 참조).

트리글리세리드의 합성에서 중요한 효소는 아실 CoA: 디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제, 또는 DGAT이다. DGAT는 포유동물의 조직에서 광범위하게 발현되며 소포체(endoplasmic reticulum)에서 트리글리세리드(triglycerides, TG)를 형성하기 위하여 1,2-디아실글리세롤(1,2-diacylglycerol, DAG) 및 지방산 아실 CoA(fatty acyl CoA)의 결합을 촉진하는 마이크로솜(microsome) 효소이다(Chen and Farese, Trends Cardiovasc Med (2000) 1 0: 1 88 및 Farese, et al, Curr Opin Lipidol (2000) 1 1:229). DGAT는 트리글리세라이드 합성에 두개의 주요한 경로들, 글리세롤 인산 및 모노아실글리세롤 경로에서 디아실글리세롤에서 트리글리세리드로의 아실화 마지막 단계의 촉매 작용을 독특하게 조절하는 것으로 판단된다. 트리글리세리드는 생존을 위하여 필수적이며, 그들의 합성은 단일 메커니즘(mechanism)에 의하여 발생된다고 판단되기 때문에, DGAT 활성의 저해를 통하여 트리글리세리드 합성을 저해하는 것은 충분히 조사되지 않았다.

마우스 DGAT1 및 관련된 인간 호모로그(homolog) ARGP1 및 ARGP2를 암호화하는 유전자는 현재 클론되었으며, 특성화되었다(Cases, et al, Proc Natl Acad Sci (1998) 95:13018; Oelkers, et al, J. Biol Chem (1998) 273:26765). 마우스 DAGT1의 유전자는 DGAT 유전자의 기능을 더욱 밝혀내기 위한 DGAT 낙-아웃(knock-out) 마우스를 생성하는 데 이용된다.

뜻밖에도, 기능적인 DGAT 효소를 발현할 수 없는 마우스(Dgat-/- mice)가 생존가능하며, 여전히 트리글리세리드를 합성할 수 있으며, 이는 트리글리세리드 합성에 기여하는 다중 촉매 매커니즘이 있음을 지시한다(Smith, et al, Nature Genetics (2000) 25:87). 트리글리세리드 합성을 촉매하는 다른 효소들, 예를 들어, DGAT2 및 디아실글리세롤 트랜스아실라제(diacylglycerol transacylase) 또한 밝혀졌다(Buhman, J. Biol Chem, supra and Cases, et al, J. Biol Chem (2001) 276:38870). 마우스에서 유전자 낙아웃 연구는 DGAT2가 포유동물 트리글리세리드 합성에 중요한 기능을 수행하며, 생존에 필요한 것을 나타냈다. DGAT2 결함 마우스는 명백하게 피부에서의 약화된 투과 차단 기능 및 에너지 대사를 위한 기질의 심한 환원때문에, 지방감소적(lipopenic)이며, 출생 후 즉시 사망한다(Farese et al. JBC (2004) 279: 11767).

유의성있게, Dgat-/- 마우스는 식이-유도 비만에 저항성이 있으며, 마른 상태로 남아있다. 심지어 고지방 식이(21% 지방)를 급식하였을 때 Dgat-/- 마우스는 일반적 식이를 급식하였을 때와 유사한 무게를 유지하였으며, 더 낮은 전체 신체 트리글리세리드 레벨을 갖는다. Dgat-/- 마우스에서 비만 저항성은 감소된 칼로리 섭취때문이 아니라, 에너지 소비의 증가와 인슐린 및 렙틴에 대한 저항성 감소의 결과이다(Smith, et al, Nature Genetics, supra; Chen and Farese, Trends Cardiovasc Med . supra; and Chen, et al, J Clin Invest (2002) 109:1049). 또한, Dgat-/- 마우스는 트리글리세리드 흡수의 감소된 비율을 갖는다(Buhman, et al, J. Biol Chem (2002) 277:25474). 향상된 트리글리세리드 대사에 덧붙여, Dgat-/- 마우스는 또한 야생형 마우스와 비교하여 글루코오스 섭취 후에 낮은 글루코오스 및 인슐린 레벨을 갖는, 향상된 글루코오스 대사를 갖는다(Chen and Farese, Trends Cardiovasc Med . supra).

디아실글리세롤로부터 트리글리세리드 합성의 촉매에 기여하는 다중 효소의 발견은 주목할 만 한데, 이는 개체 내에서 해로운 부작용을 최소화하면서, 치료 결과를 성취하기 위하여, 생화학적 반응에서 하나의 촉매 매카니즘을 조절하기 위한 기회를 나타내기 때문이다.

디아실글리세롤을 트리글리세리드로 전환시키는 것을 저해하는 화합물, 예를 들어, 인간 DGAT1의 호모로그의 활성을 특이적으로 억제하는 수단,은 비만, 인슐린 저항성 증후군 및 명백한 II형 당뇨병, 울혈성 심부전(congestive heart failure), 죽상 동맥경화증(atherosclerosis)에서, 비정상적인 트리글리세리드의 대사에 의해 유발되는 병원성 영향을 치료적으로 중화시키기 위하여, 트리글리세리드의 신체 농도 및 흡수를 낮추는 데에서와, 암 치료의 중요성으로써, 용도를 찾을 것이다.

전세계적으로 사회에서, 비만, II형 당뇨병, 심장 질환 및 암 발병률이 끊임없는 증가하기 때문에, 이러한 질환들을 효율적으로 치료하고 예방하기 위한 새로운 치료법의 필요가 절박하다. 게다가 DGAT의 촉매적 활성을 강력하고 특이적으로 저해할 수 있는 화합물의 개발에 관심이 있다. 그러나 특이적 DGAT 저해제의 분리를 위한 대량 스크린은 상기 분석의 확립과 관련된 기술적 어려움 때문에, 아직 확립되어 있지 않다.

간편한 DGAT 분석은 피코몰(pmole) TG/min/mg의 마이크로솜 단백질 지시에 대하여 낮은 활성을 가지며, 몇몇 다른 효소적 반응의 생성물에 의하여 오염된다. 더욱이, DGAT 촉매 반응의 생성물은 보통 TLC 분석(Cases S., et al, PNAS (1998) 95:13018; Cheng D., et al., Biochem J. (2001) 359:707; Erickson S.K., et al., J. Lipid Res. (1980) 21:930)에 의하여 또는 성가신 유기 용매 추출 과정(Coleman R.A., et al., Meth . Enzymology (1992) 209:98)에 의하여 결정된다. 추출 과정에 속하는 주어진 많은 단계들 및 낮은 작업량의 TLC 분석은 둘다 DGAT 분석에서 현재 이용되나, 높은 작업량의 스크린 형식에서 유용하지 않다.

유효한 DGAT 분석을 향상시키기 위한 첫번째 노력에서, Ramharack R.R. 및 Spahr M.A.(EP 1 219 716 & US 2002/0127627)는 아세톤과 클로로포름의 합성물을 포함하는 용매 시스템을 이용함으로써, 과정을 변형시켰다. 상기와 같은 용매 시스템을 이용하여, 공통의 추출 과정은 1-스텝 추출 과정으로 단순화될 수 있다. 그러나 본 발명의 목적은 시간이 소요되는 추출 단계의 필요를 제거함으로써, 고효율 스크리닝에 적합한 과정이 되도록 분석을 더욱 단순화시키며, 단일 웰 형식에서 수행될 수 있는 분석을 제공하는 것이다.

[발명의 요약]

상기에서 언급한 대로, 본 발명은 특히, Flashplate^TM 기술과 함께 특정 미셀(micelle)의 이용에 근거하여, 화합물을 빠르고 대량으로 분석하도록 적용한 DGAT 분석에 관한 것이다.

게다가, 첫번째 일면에서, 본 발명은 DGAT 활성을 측정하기 위한 방법을 제공하는데, 상기 방법은; 적어도 하나의 DGAT 기질을 포함하는 미셀과, 마이크로솜을 포함하는 DGAT를 접촉시키고, 수득된 반응 혼합물에서 트리글리세리드 생성을 결정하는 것을 포함한다.

본 발명의 특정 구체예에서, 트리글리세리드 제조는 예를 들어 Flashplate와 같은 신틸레이팅 고체 지지체 시스템(scintillating solid support system)를 이용하여 결정된다.

본 발명은 또한, 시료 화합물이 DGAT 활성을 조절할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 방법을 제공하며, 상기 방법은; 시료 화합물의 존재 및 부재하에서, 적어도 하나의 DGAT 기질을 포함하는 미셀과, 마이크로솜을 포함하는 DGAT를 접촉시키고, 수득된 반응 혼합물에서 트리글리세리드 생성을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 시료 화합물의 존재 하에서 상기 TG 생산이 변화하는 것은 상기 화합물이 DGAT 활성을 조절할 수 있음을 나타낸다.

대신하는 구체예에서, 상기 언급한 스크리닝 분석에서 트리글리세리드 생산은 예를 들어 Flashplate와 같은 신틸레이팅 고체 지지체 시스템(scintillating solid support system)을 이용하여 결정된다.

본 발명의 특정 구체예에서, 상기 언급한 스크리닝 분석은 DGAT 활성을 저해하기 위한 시료 화합물의 능력을 결정하기 위하여 이용되며, 여기서, 시료 화합물의 존재하에서, TG 생산의 감소는 상기 화합물이 DGAT 저해제임을 지시한다.

본 발명에 따른 방법에서, 미셀을 포함하는 DGAT 기질의 용도를 제공하는 것 또한 본 발명의 목적이다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법에서 확인된 화합물의 치료적 유효량을 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, DGAT와 연관된 상태 및 질병을 치료하거나 예방하기 위한 방법을 제공한다.

[서열의 설명]

서열 번호:1은 인간 DGAT1의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호:2는 인간 DGAT1의 아미노산 서열이다.

서열 번호:3은 인간 DGAT2의 뉴클레오티드 서열이다.

서열 번호:4는 인간 DGAT2의 아미노산 서열이다.

도 1 384 웰 Flashplate^TM 스크리닝 분석을 이용한 DGAT 활성에서 저해제의 영향

도 2 Flashplate^TM 스크리닝 분석의 DGAT 활성에서, 미셀을 포함하는 DGAT 기질에의 포스파티딜세린(phophatidylserine, PS) 및 포스파티딜콜린(phosphatidylcholine, PC) 영향. PS의 고정된 농도(3.5 mM) 및 PC의 다른 농도에서(도 2A), 그리고 PC의 고정된 농도 및 PS의 다른 농도일 때(도 2B).

본 발명은 분석에서, 디아실글리세롤 아세틸트랜스퍼라제(DGAT) 생물학적 활성을 측정하기 위한 방법을 제공하며, 이는 DGAT 활성을 조절하기 위한 화합물의 능력을 빠르고 대량으로 스크리닝하는 것을 허용한다.

DGAT 활성은 보조효소 A(coenzymeA) 활성화 지방산의 1,2-디아실글리세로의 3-위치로의 전이에 의하여, 트리글리세리드 분자가 형성되는 것을 의미한다.

본 발명에서 이용된 바, 용어 '트리글리세리드'(TG, 트리아실글리세롤 또는 중성 지방)는 글리세롤의 지방산 트리에스테르(fatty acid triester)를 언급한다. 트리글리세리드는 전형적으로 비-극성이며 물-불용성이다. 포르포글리세리드(글리세로포스포리피드)는 생물학적 생체막의 주요한 지질(lipid) 성분이다. 동물에서 지방 및 기름은 트리글리세리드의 혼합물을 광범위하게 포함한다.

본 발명에서 이용된 바, 용어 '조절'은 기능이 증가 또는 감소하는 것을 의미한다. 바람직하게, 적어도 10%, 더욱 바람직하게, 적어도 25% 및 가장 바람직하게 적어도 50%의 DGAT 활성을 조절하는 것에 의하여, 화합물은 DGAT 활성의 '조절자'로써 정의될 수 있다.

방법은 일반적으로 적어도 하나의 DGAT 기질을 포함하는 미셀과 마이크로솜을 포함하는 DGAT를 혼합하고, 수득된 반응 혼합물을 상기 결정된 시간 동안 인큐베이션시키고, 반응을 정지시키고, DGAT 활성의 지시자로서, 제조된 TG의 양을 측정하는 단계를 함유한다.

DGAT 기질을 포함하는 미셀은 인지질 리포솜(phospholipids liposomes)으로 구성되며, 전형적으로 포스파티딜세린 또는 포스파티딜콜린을 포함하고, 더욱 바람직하게 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 포함하고, 바람직하게 포스파티딜콜린의 농도는 포스파티딜세린의 농도와 같거나 작으며, 더욱 바람직하게, 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 3:1의 몰비로 포함하여, 가장 바람직하게 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 3.5:1.3의 몰비로 포함한다. 일반적으로 본 발명의 방법에 이용되는 DGAT 기질은 예를 들면, 1-스테로일-2-아라키도닐-sn-글리세롤(1-stearoyl-2-arachidonyl-sn-glycerol) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세롤(1,2-dioleoyl-sn-glycerol)과 같은 1,2-디아실글리세롤(DAG), 및 보조효소A 활성화 지방산, 예를 들면 팔미토일 CoA(palmitoyl CoA) 또는 올레오일-CoA(oleoyl-CoA)이다. 본 발명의 특정 구체예에서, DGAT 기질을 포함하는 미셀은 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 1:1 질량비로 포함하며, DGAT 기질로서 1,2-디올레오일-sn-글리세롤을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 미셀은 기질로써 1.6mM DAG와 함께, 각각 1.3mM 및 3.5mM의 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린으로 구성된다. 미셀을 포함하는 상기 DGAT 기질은 예를 들어, 이하 실시예 3에서 제공된 것과 같이 준비될 수 있으며, 이후의 이용을 위하여 미셀 보관액(stock)을 -20℃에 보관할 수 있다.

본 발명의 방법에서 이용된 바, 미크로솜을 포함하는 DGAT는 곤충 세포-과발현 시스템 또는 조직 마이크로솜 제제로부터 얻을 수 있으며, 바람직하게는 활성 측정을 위한 효소 소스는 곤충 세포-과발현 시스템으로부터 얻을 수 있다.

조직 마이크로솜 제제는 예를 들어, Coleman R.(Coleman R., Diacylglycerol acyltransferase and monoacylglycerol acyltransferase from liver and intestine. Methods in Enzymology 1992; 209:98-104)에 개시된 대로, 간 및 장으로부터 전형적으로 얻는다.

곤충 세포-과발현 시스템에서, DGAT 효소를 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 예를 들어, 상업적으로 유효한 Bac-to-Bac 배큘로바이러스(Baculovirus) 발현 시스템과 같은 적절한 발현 벡터와 함께 형질감염되는 곤충 세포(sf9, sf21, 또는 High Five cells)의 막 제제(membrane preparation)가 이용된다. 막 제제는 종래 기술 과정을 이용하여 얻으며, 전형적으로 용해하고, 균일화 장치(homogenization device)를 이용하여 세포를 균일화시키고 초원심분리(ultracentrifugation)를 이용하여 전체 세포 막을 수집하는 것을 포함한다. 수득된 막 제제는 다음 이용을 위하여 알리코트(aliquot)로 나누어, -80℃에서 10% 글리세롤과 함께 저장될 수 있다.

그것의 기질과 함께 DGAT의 반응은 보조효소 A 활성화 지방산의 존재 하에서, 특히, 올레오일-CoA의 존재 하에서, 마이크로솜을 포함하는 DGAT와 상기에서 정의된 미셀을 접촉시키는 것에 의하여 일반적으로 개시되는데, 여기서, 임의로 상기 보조효소 A 활성화 지방산의 부분은 탐지가능하게 표지된다. 본 발명에서 사용된 바, 탐지가능한 표지는 ¹⁴C 또는 ³H와 같은 방사성동위원소 또는 예를 들어, 피렌 데칸산(decanoic acid)과 같은 형광성 표지를 의미한다. 따라서, 본 발명의 목적은 본 발명에 따른 방법에서, 방사성 표지되거나 형광성 표지된 보조효소 A 활성화 지방산의 용도, 특히 [¹⁴C]-올레오일-CoA 또는 (1-피렌-1-일)데카노일-CoA의 용도를 제공하는 것이다. 본 발명의 더욱 특정한 구체예에서는, [¹⁴C]-올레오일-CoA의 용도이다.

반응 혼합물은 전형적으로, 예를 들어, 5분-180분과 같이, 미리 결정된 시간동안, 실온에서 37℃의 온도 범위에서, 더욱 특정하게 적어도 23℃에서 적어도 15분동안, 더더욱 특정하게 37℃에서 120분동안 인큐베이션시킨다.

DGAT와 그것의 기질간의 반응의 종결은 예를 들어, N-에틸말레이미드, N-(7,10-디메틸-11-옥소-10,11-디히드로-디벤조[b,f][1,4]옥사제핀-2-일)-4-히드록시-벤자미드 또는 OT-13540 (Masahiko Ikeda, Chinatsu Suzuki, Yasuhide Inoue: Effects of OT-13540, a potential antiobesity compound, on plasma triglyceride levels in experimental hypertriglyceridemia; XIIIth International Symposium on Atherosclerosis (Kyoto, Japan,) Sep-Oct, 2003)와 같은 DGAT 저해제의 첨가에 의하여 성취될 수 있다. 대신으로, 반응은 알카라인, 예를 들면, 12.5% 무수 에탄올, 약 10% 탈이온수, 약 2.5%의 1N 수산화나트륨 및 약 78.4%의 이소프로판올, 약 19.6%의 n-헵탄 및 약 2.0%의 탈이온수를 포함하는 용액의 75%인 정지 용액(stop solution)을 함유하는 에탄올, 또는 클로로포름-메탄올과 같은 변성 액제를 이용하여 종결된다. 본 발명의 특정 구체예에서, 반응은 N-에틸말레이미드, N-(7,10-디메틸-11-옥소-10,11-디히드로-디벤조[b,f][1,4]옥사제핀-2-일)-4-히드록시-벤자미드 또는 OT-13540를 이용하여, 더욱 바람직하게는 N-에틸말레이미드를 이용하여 종료된다.

핵산

본 발명의 방법에서 이용된 바, DGAT 효소를 암호화하는 핵산 서열은 인간 DGAT1(서열 번호 2) 또는 인간 DGAT2(서열 번호 4) 둘 중 하나, 뿐만 아니라, 다른 동물, 특히 다른 포유 동물, 더욱 특정하여 인간 DGAT1 및 DGAT2의 다른 영장류의 호모로그(homologue) 및 이를 암호화하는 핵산 서열을 함유하는 것을 의미한다. 상기 호모로그 DGAT는 전형적으로 서열 번호 2 또는 서열 번호 4에 대하여, 적어도 50%, 예를 들면 60^, 70%, 80%, 90%, 95% 또는 98% 서열 동일성을 갖을 것이다. 본 발명에서 사용된 바, 핵산 서열은 DNA (게놈(genomic) 및 cDNA 포함) 및 RNA를 함유한다. 본 발명에 따른 핵산이 RNA를 함유하는 경우에, 첨부한 리스트에 나타난 서열에 대한 참조는, T를 U로 치환한 RNA 등가물에 대한 참조로써 해석되어야 한다.

본 발명의 핵산은 단일 또는 이중 가닥일 수 있다. 본 발명의 단일 가닥 핵산은 안티센스(anti-sense)핵산을 함유한다. 따라서, 서열 번호:1 또는 이의 호모로그에 대한 참조는 명확하게 그렇지 않다는 문맥이 있지 않는 한, 상보적 서열을함유한다는 것이 이해될 것이다.

본 발명의 DGAT cDNA 서열은 표준 PCR(중합효소 연쇄 반응) 클로닝 기술을 이용하여, 클론될 수 있다. 이는 서열 번호:1 또는 서열 번호:3의 반대 가닥의 5' 및 3' 말단에 한쌍의 프라이머(primer)를 제조하는 것, 포유동물 cDNA 라이브러리(library)로부터 얻은 cDNA 또는 mRNA와 접촉되도록 프라이머를 가져오는 것, 원하는 영역의 증폭을 야기하는 환경 하에서, 중합효소 연쇄 반응을 수행하는 것, 증폭된 단편을 분리하는 것(예를 들어, 아가로즈 겔상에서 반응 혼합물을 정제하는 것에 의하여) 및 증폭된 단편을 회수하는 것을 포함한다. 프라이머는 증폭된 DNA가 적합한 클로닝 벡터에 클론될 수 있도록 하기 위하여, 적합한 제한 효소 인지 부위를 함유하도록 설계될 수 있다.

서열 번호:1 또는 서열 번호:3의 서열에 100% 상동성을 갖지 않으나, 서열 번호:2 또는 서열 번호:4 또는 본 발명의 다른 폴리펩티드를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 수많은 방법에 의하여 얻을 수 있다.

예를 들어, 서열 번호:1 또는 서열 번호:3 서열의 특정위치돌연변이(site directed mutagenesis)가 수행될 수 있다. 이는 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 서열이 발현되는 특정 숙주 세포에서 코돈 참조를 최적화하기 위하여, 침묵 코돈 변화(silent codon change)가 서열에 필요한 경우에, 유용하다. 제한 효소 인지 부위를 도입하거나, 폴리뉴클레오티드에 의해 암호화된 폴리펩티드의 가능 또는 특성을 변형시키기 위하여, 다른 서열 변화가 요구될 수 있다. 예를 들어, 제공을 필요로 하는 특정 코딩 변화, 예를 들어, 보존적 치환를 나타내기 위해, 변화가 바람직할 수 있다.

본 발명의 핵산은 5' 또는 3' 말단에 추가적인 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 합성 또는 자연적 5' 리더 서열(leader sequence)은 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산에 부착될 수 있다. 추가적인 서열은 또한, 특정 숙주 세포들에서 본 발명의 핵산의 전사를 위해 필요한, 5' 또는 3' 비번역 영역(untranslated region)을 함유할 수 있다.

추가로, 다른 동물, 특히 포유 동물(예를 들면, 랫 또는 토끼), 더욱 특정하면, 마우스를 함유하는 영장류의 DGAT 호모로그(homologue)는 본 발명의 방법에서 수득, 및 이용될 수 있다. 다른 동물 종으로부터 분리한 세포 또는 조직 또는 게놈의 DNA 라이브러리로부터 제조되는 cDNA 라이브러리(library)를 제조하거나 얻는 것, 그리고, 중간에서부터 심한 가혹한 환경 하(예를 들어, 약 50℃부터 약 60℃에서, 0.03M 염화나트륨 및 0.03M 시트르산 나트륨)에서, 서열 번호:1 또는 서열 번호:3의 모두 또는 부분을 포함하는 프로브로 상기 라이브러리를 프로빙하는 것에 의하여, 상기 서열들은 수득될 수 있다.

서열 동일성

핵산 및 폴리펩티드 서열의 퍼센트 동일성은 참조 서열과 의문 서열을 비교하는, 상업적으로 유효한 알고리즘을 이용하여 측정할 수 있다. 다음 프로그램들(국립생명공학 정보센터에 의하여 제공된)은 상동성/동일성을 측정하기 위하여 이용될 수 있다: 디폴트 파라미터와 함께 사용할 수 있는 Blast, gapped BLAST, BLASTN 그리고 PSI-BLAST.

알고리즘 GAP (Genetics Computer Group, Madison, WI)은 정합의 수를 최대화하고 차이의 수를 최소화하는 2개의 완전한 서열을 정렬하는 Needleman 및 Wunsch 알고리즘을 사용한다. 일반적으로, 차이 생성 패널티 = 12 및 차이 연장 패널티 = 4를 갖는, 디폴트 파라미터가 사용된다.

핵산 서열이나 그의 일부와 의문 서열 간의 최고의 전체 정합을 결정하기 위한 다른 방법은 Brutlag et al (Comp. App . Biosci., 6; 237-245 (1990))의 알고리즘에 기초한 FASTDB 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 프로그램은 전체적 서열 정렬을 제공한다. 상기 서열 정렬의 결과는 상동성 퍼센트로 나타낸다. 상동성 퍼센트를 계산하기 위한 DNA 서열의 FASTDB 검색에서 사용되는 적절한 파라미터는: Matrix=Unitary, k-tuple=4, Mismatch penalty=1, Joining Penalty=30, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, and Window Size=500 또는 뉴클레오티드 염기에서 더 짧은 길이의 의문 서열이다. 아미노산 정렬의 상동성 퍼센트 및 유사성을 계산하기 위한 적절한 파라미터는: Matrix=PAM 150, k-tuple=2, Mismatch penalty=1, Joining Penalty=20, Randomization Group Length=0, Cutoff Score=1, Gap Penalty=5, Gap Size Penalty=0.05, and Window Size=500 또는 뉴클레오티드 염기에서 더 짧은 길이의 의문 서열이다.

벡터

본 발명의 핵산 서열은 벡터, 특히 발현 벡터에 병합될 수 있다. 벡터는 적합한 숙주 세포에서 핵산의 복제에 이용될 수 있다. 게다가, 다른 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 복제가능한 벡터에 도입하는 것, 벡터를 적합한 숙주 세포에 도입하는 것, 및 벡터의 복제를 야기할 수 있는 환경 하에서, 숙주 세포를 자라게 하는 것에 의하여, 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 제조하는 방법을 제공한다. 벡터는 숙주 세포로부터 되찾을 수 있다. 발현 벡터와 관련하여, 적합한 숙주 세포는 아래에 설명되었다.

바람직하게, 벡터 내에서 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 숙주 세포에 의하여 코딩 서열의 발현을 제공할 능력이 있는 통제 서열(control sequence)에 사용가능하게 링크되며, 예를 들어, 벡터는 발현 벡터이다.

용어 "사용가능하게 링크된"은 언급된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 그들에게 기능을 허용하게 하는 관계에 있는 근접 부위(juxtaposition)를 언급한다. 코딩 서열에 "사용가능하게 연결된" 통제 서열은 통제 서열에 적합한 환경 하에서 코딩 서열의 발현이 성취되는 방식으로 라이게이션(ligation)된다.

적합한 조절 서열(regulatory sequence)을 함유하는, 프로모터(promoter) 서열, 터미네이터 단편(terminator fragment), 폴리아데닐레이션 서열(polyadenylation sequence), 인핸서 서열(enhancer sequence), 마커 유전자 및 적절한 바와 같은 다른 서열을 포함하는 적합한 벡터는 선택되거나 설계될 수 있다. 벡터는 적절한 바와 같이, 플라스미드, 바이러스의, 예를 들어, 파지, 파지미드 또는 배큘로바이러스, 코스미드, YACs 또는 PACs일 수 있다. 벡터는 유전자 요법(gene therapy) 벡터, 예를 들어 아데노바이러스, 아데노-연관된 바이러스, 레트로바이러스(HIV, MLV와 같은) 또는 알파 바이러스 벡터에 근거를 둔 벡터를 함유한다.

벡터는 복제의 오리진(origin), 부가적으로 상기 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 부가적으로 프로모터의 조절자(regulator)와 함께 제공될 수 있다. 벡터는 하나 또는 그 이상의 선택가능한 마커 유전자, 예를 들어, 박테리아 플라스미드의 경우에, 앰피실린 저항성 유전자(ampicillin resistance gene) 또는 포유동물 벡터를 위한 네오마이신 저항성 유전자를 함유할 수 있다. 벡터는 예를 들어, RNA 제조 또는 숙주 세포의 형질감염 또는 형질전환에 이용하기 위하여, 실험상에서 이용될 수 있다. 벡터는 또한, 생체내에서 이용되도록, 예를 들어 유전자 요법의 방법에 적용될 수 있다. 다양한 다른 숙주 세포들에서, 폴리펩티드의 클로닝 및 발현을 위한 시스템은 잘 알려져 있다. 적합한 숙주 세포는 박테리아; 포유동물 및 이스트와 같은 진핵 세포; 배큘로바이러스 시스템을 함유한다. 헤테로로그(heterologous) 폴리펩티드의 발현을 위한 기술에 유용한 포유동물 세포주는 Chinese hamster ovary 세포, HeLa 세포, baby hamster kidney 세포, COS 세포 및 많은 다른 것을 함유한다.

프로모터 및 다른 발현 조절 신호는 발현 벡터가 그것을 위하여 설계된 숙주 세포에 적합하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 이스트 프로모터는 S. cerevisiae GAL4 및 ADH 프로모터, S. pombe nmt1 및 adh 프로모터를 함유한다. 포유 동물 프로모터는 카드뮴과 같은 중금속에 대한 반응을 유도할 수 있는 메탈로지오네인(Metallothionein) 프로모터를 함유한다. SV40 large T 항원 프로모터 또는 아데노바이러스 프로모터와 같은 바이러스 프로모터 또한 이용될 수 있다. 이러한 모든 프로모터들은 본 기술에서 용이하게 이용할 수 있다.

벡터는 삽입된 핵산, 융합물로써, 폴리펩티드가 생산되도록 하기 위한 핵산 및/또는 숙주 세포로부터 생산된 폴리펩티드가 세포로부터 분비되도록 하기 위한 분비 신호를 암호화하는 핵산이 발현하게 하기 위하여, 프로모터 또는 인핸서와 같은 다른 서열을 함유할 수 있다.

유전자 치료의 용도를 위한, 본 발명의 폴리펩티드의 제조용 벡터는 본 발명의 미니-유전자(mini-gene) 서열을 운반하는 벡터를 함유한다.

더욱 상세한 기술을 위하여 예를 들어, Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 2nd edition, Sambrook et al., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press를 참조한다. 핵산을 조작하기 위한, 많은 알려진 기술 및 프로토콜(protocol), 예를 들면, 핵산 컨스트럭트(construct)의 준비, 돌연변이 유발(mutagenesis), 시퀀싱(sequencing), 세포로 DNA의 도입(introducing) 및 유전자 발현, 그리고 단백질의 분석은 Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al. eds., John Wiley & Sons, 1992에 세부적으로 기술된다.

벡터는 상기에서 기술한 바와 같이, 본 발명의 폴리펩티드 발현을 제공하기 위하여, 적합한 숙주 세포에 형질전환될 수 있다. 따라서, 다른 일면에서 본 발명은 폴리펩티드를 암호화하는 코딩 서열의 벡터에 의한 발현을 제공하기 위한 환경에서, 상기에서 기술한 바와 같이 발현 벡터로 형질 전환 또는 형질 감염된 숙주 세포를 배양하는 것 및 발현된 폴리펩티드를 되찾는 것을 포함하는 본 발명에 따른 폴리펩티드를 준비하는 과정을 제공한다. 폴리펩티드는 또한, 망상적혈구 용해물(reticulocyte lysate)과 같은 실험상 시스템에서 발현될 수 있다.

본 발명의 다른 구체예는 본 발명의 폴리펩티드 복제 및 발현을 위한 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포를 제공한다. 세포는 상기 벡터에 적합하도록 선택될 것이며, 예를 들어 박테리아, 이스트, 곤충 또는 포유동물일 것이다. 숙주 세포는 암호화된 폴리펩티드를 제조하기 위하여, 유전자 발현을 위한 환경하에서 배양된다. 만약 폴리펩티드가 적합한 신호 리더 펩티드(signal leader peptide)에 커플되어 발현된다면, 그것은 세포에서 배양액으로 분비될 것이다. 발현에 의한 제조 후에, 폴리펩티드는 숙주 세포 및/또는 배양액으로부터 분리 및/또는 정제될 수 있으며, 상기 경우는 그리고 그 뒤에, 바람직하게 예를 들어, 하나 또는 그 이상의 약제학적 수용가능한 부형제(excipient), 매개제(vehicle), 담체를 함유하는 약제학적 조성물과 같은 하나 또는 그 이상의 추가적인 성분을 함유하는 조성물의 제제에 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 또한, 안티센스(antisense) RNA 또는 리보자임(ribozyme)의 제조를 제공하기 위하여, 상기에서 기술된 벡터에 안티센스 방향(orientation)으로 삽입될 수 있다.

막 제제

본 발명의 방법에서 이용된 대로, 준비된 상기 세포 막의 특성은 다음의 분석의 원리에 의하여 결정되는 몇몇 경우에 있을 수 있으나, 전형적으로 전체 세포를 거두는 것과 예를 들어, 얼음처럼 차가운 완충액(예를 들어, 20 mM Tris HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4, 4℃)에서 소니케이션(sonication)에 의하여 세포를 분쇄하는 것을 함유한다. 그 뒤에, 예를 들어, 4℃, 200xg에서 5분동안의 저속 원심분리를 하여, 결과적인 정제되지 않은 세포 용해물의 세포 파편을 제거한다.

예를 들어, 4℃, 40,000xg에서 20분 동안과 같은, 고속의 원심분리 단계를 이용하여, 한층 더한 제거 및 막 농축(enrichment)을 수행하며, 결과적인 막 펠렛(pellet)을 얼음처럼 차가운 완충액에 현탁시키는 것과 고속 원심분리 단계를 반복하는 것에 의하여 세척시킨다. 최종적으로 세척된 막 펠렛을 분석 완충액에 재현탁시킨다. 기준대로 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 이용한 브래드포드(Bradford (1976))의 방법에 의하여 단백질 농도를 측정한다. 막을 즉시 이용하거나, 다음 이용을 위하여 얼릴 수 있다.

본 발명의 방법에서, 여기에서 전에 기술된 바, DGAT 활성을 조절하는 그들의 능력을 시험할 화합물의 존재 또는 부재하에서, 막을 DGAT 기질과 함께 인큐베이션시킨다. TG 생성을 측정하는 것에 의하여 DGAT 활성을 결정하고, 여기서 전형적으로 예를 들어, 상업적으로 유효한 Flashplate^TM 기술과 같은 신틸레이팅 고체 지지체 매질(scintillating solid support medium)을 이용하여 본 발명의 미셀에서 방사성표지된 TG의 병합을 측정함으로써, 상기 TG 생성을 결정한다. 데이터는 GraphPad prism을 이용한 비-직선 커브에 맞춘다.

이러한 방식으로, DGAT 활성을 조절하는 작용제(agonist) 또는 길항제(antagonist) 화합물을 확인할 수 있다. 본 발명의 특정 목적은 DGAT 활성을 저해할 수 있는 화합물을 확인하기 위한, 예를 들어, DGAT 길항제를 확인하기 위한 방법에서 막 제제를 이용하는 것이다.

치료적 제제

따라서, 본 발명은 또한, 새로운 조절의 제제, 본 발명에 따른 분석에 의하여 수득되는 특정 길항제, 및 상기 제제를 포함하는 조성물을 제공한다. 수용체에 결합하고, 작용제 또는 길항제 활성을 갖을 수 있는 제제는 그 병리가 DGAT 효소의 활동에 의하여 특징되는, 특히 비만 및 고 트리아실글리세롤 관련 질환 치료의 방법에 이용될 수 있으며, 이러한 용도는 본 발명의 다른 일면을 형성한다.

트리아실글리세리드 대사에서 질병 또는 불균형은 비만, 인슐린 저항성 증후군, 타입 Ⅱ 당뇨병, 비알코올성 지방 간 질환 및 관상동맥 심질환의 발병 및 증가된 위험을 암시한다(Lewis, et al, Endocrine Reviews (2002) 23: 201 and Malloy and Kane, AdvIntern Med (2001) 47: 111). 덧붙여, 과중성 지방혈증(hypertriglyceridemia)은 종종 암 치료의 반대 결과이다(see, Bast, et al. Cancer Medicine, 5th Ed., (2000) B. C. Decker, Hamilton, Ontario, CA 참고).

본 발명은 또한, 이를 필요로 하는 대상에 본 발명의 화합물을 치료상 유효량으로 투여하는 것을 포함하여, 비만, 당뇨병, 신경성 식욕부진(anorexia nervosa), X증후군(syndrome X), 대사 증후군(metabolic syndrome), 인슐린 저항성(insulin resistance), 고혈당증(hyperglycemia), 고요산혈증(hyperuricemia), 고인슐린혈증(hyperinsulinemia), 고콜레스테롤혈증(hypercholesterolemia), 고지질혈증(hyperlipidemia), 이상지혈증(dyslipidemia), 혼합형 이상지혈증(mixed dyslipidemia), 과중성지방혈증(hypertriglyceridemia), 비알코올성 지방간 질환(nonalcoholic fatty liver disease), 죽상동맥경화증(atherosclerosis), 동맥경화증(arteriosclerosis), 급성 심부전(acute heart failure), 울형성 심부전(congestive heart failure), 심장 동맥 질환(coronary artery disease), 심근병증(cardiomyopathy), 심근경색증(myocardial infarction), 협심증(angina pectoris), 고혈압(hypertension), 저혈압(hypotension), 뇌종증(stroke), 허혈(ischemia), 허혈 재관류 손상(ischemic reperfusion injury), 동맥류(aneurysm), 재발협착증(restenosis), 혈관 협착(vascular stenosis), 고형 종양(solid tumors), 피부 암(skin cancer), 멜라닌종(melanoma), 림프종(lymphoma), 유방암(breast cancer), 폐암(lung cancer), 대장암(colorectal cancer), 위암(stomach cancer), 식도암(esophageal cancer), 췌장암(pancreatic cancer), 전립선암(prostate cancer), 신장암(kidney cancer), 간암(liver cancer), 방광암(bladder cancer), 자궁경부암(cervical cancer), 자궁암(uterine cancer), 고환암(testicular cancer) 및 난소암(ovarian cancer)으로 구성된 군으로부터 선택된 상태 또는 질병을 치료 또는 예방하기 위한 방법을 제공한다. 이러한 방법 및 아래 제공된 방법을 위하여, 본 발명의 화합물은 몇몇 구체예에서, 두번째 치료상의 제제와 조합하여 투여될 것이다. 제제는 본 발명의 제제의 유효량으로 투여될 수 있다. 상기-언급된 많은 상태들은 만성이고, 종종 불치성이기때문에, "치료"는 수시간, 수일 또는 수주와 같은 시간의 기간 동안 징후 감소를 얻는 것과 질환의 진행 경과를 늦추는 것을 함유하는 의도를 갖는 것으로 이해할 것이다.

그러한 제제는 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제와 함께, 제제를 포함하는 조성물로 제제화될 수 있다. 제제는 에스테르 또는 염과 같이, 산 부가 염 또는 염기 금속 염, 또는 N 또는 S 옥시드와 같이 생리적 기능성 유도체의 형태일 수 있다. 조성물은 투여에 적합한 임의의 과정 및 수단을 위하여 제제화될 수 있다. 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제는 경구(oral), 직장(rectal), 비강(nasal), 흡입(inhalable), 국소(topical)(협측(buccal) 및 혀밑(sublingual) 포함), 질(vaginal) 또는 비경구(parenteral)(피하(subcutaneous), 근육내(intramuscular), 정맥내(intravenous), 진피내(intradermal), 경막내(intrathecal) 및 경막외(epidural)) 투여에 적합한 제제에 이용된 것을 함유한다. 담체 또는 희석제의 선택은 제안된 투여의 경로에 물론 의존할 것이며, 그것의 치료적 목적과 제제에 의존할 수 있다. 제제는 단위 투여량 형태(unit dosage form)로 간편하게 존재할 수 있으며, 약학의 분야에서 잘 알려진 방법 중 어느 것에 의하여 준비될 수 있다. 그러한 방법은 활성 구성 요소와, 하나 또는 그 이상의 보조적 구성 요소를 구성하는 담체의 회합을 야기하는 단계를 함유한다. 일반적으로, 활성 구성 요소와, 액상 담체 또는 미세하게 분리되는 고체 담체 또는 둘다와의 회합을 야기하는 것, 그리고 그 다음, 필요하다면, 제품을 성형하는 것에 의하여 제제가 균일하고 상세하게 준비된다.

고형 조성물을 위하여, 간편한 비-독성 고형 담체는 예를 들어, 약제학 등급의 만니톨(mannitol), 락토오스(lactose), 셀룰로오스(cellulose), 셀룰로오스 유도체(cellulose derivatives), 전분(starch), 스테아린산 마그네슘(magnesium stearate), 사카린 나트륨(sodium saccharin), 활석(talcum), 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose), 탄산 마그네슘(magnesium carbonate) 등을 이용할 수 있다. 상기에서 정의된 바, 활성 화합물은 예를 들어, 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycols), 아세틸화된 트리글리세리드(acetylated triglycerides) 등를 담체로 이용하여, 좌약으로 제제화될 수 있다. 액상의 약제학적으로 투여가능한 조성물은 예를 들면 상기 정의된 바와 같은 활성 성분 및 임의의 약제학적 애주번트를 담체 예로서, 물, 덱스트로스 염수 용액, 글리세롤, 에탄올 등에 용해, 분산 등을 시켜 액제 또는 현탁제 등을 형성시킴으로써 제조할 수 있다. 원하는 경우, 투여하고자 하는 약제학적 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조 물질, 예로서 습윤제 또는 유제, pH 완충제 등, 예로서, 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 올레이트 등을 포함할 수 있다. 상기 제제를 제조하는 실질적인 방법은 공지되어 있거나, 본 분야의 기술자에게는 자명한 것이다; 예로서, Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, 15th Edition, 1975 참고.

투여하고자 하는 조성물 또는 제제는, 임의의 경우에서, 치료하고자 하는 대상의 증상을 완화시키기 위한 유효량으로 활성 화합물(들)의 양을 포함할 것이다.

비독성 담체로부터 구성된 0.25 내지 95% 범위의 밸런스로 활성 성분을 포함하는 제제 또는 조성물이 준비될 수 있다.

경구 투여용으로 약제학적으로 허용가능한 비독성 조성물은 일반적으로 상용화된 부형제, 예로서, 약제학적 등급의 만닛톨, 락토오스, 셀룰로오스, 셀룰로오스 유도체, 소듐 크로스카멜로오스, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 사카린, 활석, 글루코오스, 수크로오스, 마그네슘, 카보네이트 등에서 임의의 것을 혼입하여 제조한다. 상기 조성물은 액제, 현탁제, 정제, 환제, 캡슐제, 분제, 지효성 제제 등의 형태를 취한다. 상기 조성물은 1%-95%의 활성 성분, 더욱 바람직하게 2-50%, 가장 바람직하제 5-8%를 포함할 수 있다.

비경구 투여는 통상 피하, 근육 또는 정맥내의 주입에 의하여 특정화된다. 주사제는 통상의 제형으로, 액상 액제 또는 현탁제, 주사전 액상의 액제 또는 현탁제로서 적절한 고형 형태, 또는 유제로서 제조될 수 있다. 적절할 부형제는 예로서, 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등이다. 또한, 바람직한 경우, 투여하고자 하는 약제학적 조성물은 또한 최소량의 비독성 보조 물질, 예로서 습윤제 또는 유제, pH 완충제 등, 예로서, 소듐 아세테이트, 소르비탄 모노라우레이트, 트리에탄올아민 소듐 아세테이트 등을 포함할 수 있다.

상기 비경구 조성물중 포함된 활성 화합물의 퍼센트는 그의 특정 성질, 및 화합물의 활성 및 대상자의 필요에 따라 고도로 달라질 수 있다. 그러나, 액제중 0.1% 내지 10%의 화합물이 사용될 수 있고, 조성물은 고형이 이후 상기 퍼센트로 희석되는 고형인 경우, 그보다 높을 것이다. 바람직하게, 조성물은 액제중 0.2-2%의 활성제를 포함할 것이다.

본 발명은 하기 실험 설명을 참고로 하여 더욱 이해될 것이며, 본 분야의 기술자는 하기 청구범위에서 더욱 전체적으로 기술된 바, 이는 단지 본 발명의 일례라는 것을 이해할 것이다. 추가로, 본 명세서에서 다양한 공개문헌을 인용하다. 공개문헌은 본 발명이 포함하는 본 분야의 상태를 더욱 전체적으로 설명하기 위하여 본 명세서에 참고문헌으로서 인용된다.

실시예

다음 실시예들은 본 발명을 설명한다. 다른 구체예들은 본 실시예의 관점에서 본 분야의 숙련자에게 일어날 것이다.

실시예 1: DGAT 의 발현

DGAT, 아실-CoA:디아실글리세롤 아실트랜스퍼라제는 트리글리세리드 생합성에서 주요 효소이다. DGAT는 그것의 기질로서, 디아실글리세롤(DAG) 및 지방산 아실 CoA를 이용하는 것에 의하여, TAG를 형성하기 위하여, 지방산 아실-CoA에서 디아실글리세롤로의 아실 잔기 전이 반응을 촉매한다.

인간 DGAT1(서열 번호. 1)은 번역 개시(translation start), 문헌에 기재된 바 N-말단에 플래그-테그(FLAG-tag), 그리고, 곤충 세포에서 발현을 향상시키기 위한 ATG의 앞의 바이러스 코작 서열(Kozak sequence, AAX)을 함유하는 pFastBac 벡터에 클론된다. DGAT가 막 단백질이기 때문에, 발현은 SF9 세포를 이용한 문헌에 기재된 대로 수행된다(Cases, S., Smith, S.J., Zheng, Y., Myers H.M., Lear, S.R., Sande, E., Novak, S., Collins, C., Welch, C.B., Lusis, A.J., Erickson, S.K. and Farese, R.V. (1998) Proc . Natl . Acad . Sci . USA 95, 13018-13023.).

실시예 2: DGAT 막의 제제

원심분리(13000rpm-15분-4℃)를 하여, 72시간 형질 감염된 SF9 세포를 수집하고, 2×500㎖ 용해 완충액(0.1M 수크로오즈, 50mM KCl, 40mM KH₂PO₄, 30mM EDTA pH 7.2)에서 용해시켰다. 세포 디스럽터(cell disruptor)를 이용하여 세포를 균일화시켰다. 1380rpm-15분-4℃(상층액 제거)에서 원심분리시킨 다음, 펠렛을 500㎖ 용해 완충액에 재현탁시키고, 60분(4℃)동안 34000rpm(100 000g)에서 초원심분리하여 전체 세포 막을 수집하였다. 수집된 막을 용해 완충액에 재현탁시키고, 알리코트로 나누고 이용할 때까지 -80℃에서 10% 글리세롤과 함께 보관하였다.

실시예 3: 미셀의 제제

재료

a) 1,2-디올레오일(dioleoyl)-sn-글리세롤, 10 ㎎/㎖(DAG)

질소 하에서, 아세토니트릴(acetonitrile) 용액을 증발시키고, 1 ㎎/㎖의 최종 농도로 클로로포름에 타서 재구성.

b) L-a-포스파티딜콜린, 1 ㎎/㎖(PC)

1 ㎎/㎖의 최종 농도가 되도록 클로로포름에 용해시키고, 4℃에서 보관.

c) L-a-포스파티딜-L-세린, 1 1 ㎎/㎖(PS)

방법

두꺼운 유리용기(thick glass recipient) 내에서 PC 10㎖ 및 PS 10㎖에 DGA 1㎖을 첨가한다. 질소하에서 증발시키고, 얼음에 15분간 둔다. 이와 같이 얻은 현탁액을 얼음에서 소니케이션하여, 10 ml Tris/HCl (10 mM, pH 7.4)에 타서 재구성한다. 소니케이션 과정은 소니케이션 수조에서 10초 후, 얼음에서 10초간 식히는 소니케이션 사이클과, 균질한 용액을 얻을 때까지(약 15분 소요) 이러한 소니케이션 사이클을 반복하는 것으로 구성된다. 이와 같이 수득한 미셀은 이후 이용까지 -20℃에서 보관하고, 1.61 mM의 최종 농도의 DAG를 함유한다.

DGAT 포함 미셀에서 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린의 중량비로 최적의 1:1을 확실히 하기 위하여, 본 발명자는 GAT Flashplate^TM 분석에서 다른 비율의 영향을 분석하였다. 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린의 다른 조합을 위하여, 분리된 혼합물을 제조하였다. 클로로포름 내의 디올레오일-sn-글리세롤(10 ㎎/㎖), L-α-포스파티딜콜린 (1 ㎎/㎖) 및 L-포스파티딜-L-세린(1 ㎎/㎖)의 보관 용액(stock solution)의 알리코트를 유리 바이얼(glass vial) 내에서 결합시켰으며, 질소 하에서 증발시키고 얼음에 15'간 두었다. 10ml Tris/HCl (10mM, pH 7.4)에서 얼음상에 소니케이션을 하여 재구성(reconstitution)을 수행하였다. -20℃에서 알리코트를 저장하였다.

실험의 첫번째 세트에서, PC:PS 비를 바꾸기 위하여, PC의 농도를 변화시켰다. 미셀에서 3.5mM 포스파티딜세린과 함께 DGAT 활성을 위한 포스파티딜콜린의 적합한 미셀 농도는 0.8mM (도 2A)이었다. 불행하게도, 안정하지 못하거나, 미셀을 생산할 수 없게 기인하는 이러한 농도는 임계 미셀 농도가 도달되지 않았음을 지시한다. 지질은 일반적으로 그들의 용해도 특성을 기초로 정의된다. 그들은 즉시 용해되며, 사실상 물에는 불용성이다. 물에서 양쪽성 물질의 용해도 수치는 그들의 임계 미셀 농도(CMC)이다. 이것은 결집된 형태로 분자와 평형상태에 있는 자유로운 용액 내의 분자 농도로써 정의된다. 전형적인 세척 액상은 mM 농도 범위의 CMC로 세정제(detergent)를 함유한다(3). 반면, 0.8mM보다 더 높은 농도를 이용하는 것은 DGAT 활성을 감소시킨다. 본 발명자는 이러한 환경에서 1.6mM 포스파티딜콜린이 받아들일 수 있는 DGAT 활성으로, 미셀의 재생할 수 있는 형태를 위하여 적합하다는 결론을 내렸다.

PS:PC 비를 변화시키기 위하여 PS의 농도를 변화시킨 실험의 두번째 세트에서 이것을 확실하게 하였다. 1.6mM 디아실글리세롤을 함유하는 미셀에서 미셀 포스파티딜세린의 다른 농도를 테스트한 것은 3.5mM까지 DGAT 활성의 반응이 올라가는 좋은 투약 반응이 나타났으며, 그 다음 거의 최대 DGAT 활성에 도달했다(도 2B). 포스파티딜콜린과 유사하게, 포스파티딜세린을 조금 이용하는 것은 활성이 감소될 뿐만 아니라 덜 안정적이고 미셀을 생산하지 못하는 결과에 이른다. 포스파티딜셀린을 생략하는 것에 의하여 거의 모든 DGAT 활성이 사라지는 것은, 포스파티딜세린이 활성에 결정적임을 지시한다. 본 발명자는 이러한 환경에서, 3.5mM 포스파티딜셀린이, 받아들일 수 있는 DGAT 활성으로, 미셀의 재생할 수 있는 형태를 위하여 최적임을 결론내렸다. 최대 활성 뿐만 아니라, 미셀 형태에서 안정성 및 재생성을 취하여, 포스파티딜콜린 및 포스파티딜세린의 적합한 농도는 각각 1.3mM, 3.5mM에 도달한다. 이러한 세트에서, 포스파티딜세린은 DGAT 활성을 위하여 결정적이며, 포스파티딜콜린은 미셀의 안정성 및 재생성을 위하여 결정적인 것으로 보인다.

실시예 4: DGAT Flashplate ^TM 분석

재료

a) 분석 완충액

50mM Tris-HCl (pH 7.4), 150mM MgCl₂, 1mM EDTA, 0.2% BSA.

b) N-에틸말레이미드, 5M

DMSO 100% 8㎖의 최종 부피에 5g을 녹이고, 나중의 이용까지 -20℃에서 알리코트로 보관한다.

c) 기질 혼합 (1 384 웰 플레이트 = 3840㎕)

612㎕ 미셀 보관액 (최종 51μM)

16.6㎕ 올레오일CoA 9.7mM

23㎕ [³H]-올레오일CoA (49 Ci/mmol, 500 μCi/㎖)

3188.4㎕ 트리스 pH 7.4, 10mM

d) 효소 혼합 (1 384 웰 플레이트 용 = 3520㎕) (5 ㎍/㎖)

분석 완충액 3508㎕에 DGAT 막 보관액(1500 ㎍/㎖ 보관액) 11.73㎕ 첨가.

e) 정지 혼합 (1 384 웰 플레이트 용 = 7.68 ㎖) (250 mM)

3.456 ㎖의 DMSO 100%에 N-에틸말레이미드(5M) 384㎕ 첨가하고, 상기 용액 3.84 ㎖을 3.84 ㎖의 DMSO 10%로 희석.

방법

384-웰 포맷의 전체 부피 50㎕ 중, 50μM DAG, 32㎍/ml PC/PS 및 8.4μM [³H]-올레오일CoA (30 nCi/웰의 특정 활성에서)를 함유하는 50mM Tris-HCl (pH 7.4), 150 mM MgCl₂, 1mM EDTA 및 0.2% BSA에서, red shifted Basic Image FlashPlate^TM (Perkin Elmer Cat.No. SMP400)를 이용하여, 막 제제에서 DGAT 활성을 분석하였다.

세부적으로, 10㎕ 효소 혼합물 및 10㎕ 기질 혼합물을, 임의의 1㎕ DMSO (블랭크(blank) 및 대조군(control)) 또는 1㎕ 시험할 화합물의 존재 하에서, 분석 완충액 30㎕에 첨가하였다. 37℃에서 120분동안 이러한 반응 혼합물을 인큐베이션시켰으며, 정지 혼합물 20㎕를 첨가하여 효소적 반응을 정지시켰다. 플레이트를 밀봉하고, 소포(vesicle)를 실온에서 오버나이트동안 가라앉게 하였다. 1500rpm에서 5분동안 플레이트를 원심분리하였으며, Leadseeker에서 측정하였다.

고찰

우선, 실재 고효율에 적합한 분석이 상업적으로 유효하지 않는 데, 아마도, 전통적인 효소적 분석이, 그것이 막에서 파묻혀 있는 효소의 자연 환경을 모방하기 위하여 소포 제제를 이용하는 사실에 기인할 것이다. 전통적으로 TLC 분리 또는 용매 추출은 방사성표지된 TG 형태로부터 방사성표지된 DAG 또는 아실 CoA를 분리하기 위하여 필요하다. 방사성표지된 TG 형태의 측정에 앞서는 추가적인 취급 단계는, 분석의 사이클 시간을 증가시킬 뿐만 아니라, 분석의 재생성 및 일관된 판독에 영향을 주고, 이러한 전통적인 분석이 고효율 스크리닝에 덜 적합하게 한다.

본 발명의 DGAT 활성 스크리닝은 막 제제를 포함하는 DGAT 및 미셀을 포함하는 DGAT 기질이 이용되기 때문에, 여전히 효소의 자연 환경을 모방하지만, 특히, 방사성 표지된 아실 CoA로부터 방사성 표지된 TG 형태를 분리할 필요를 제거하여, 그것이 단일 웰 과정이기 때문에, DGAT 활성의 대량 스크리닝에 적용된다. 방사성 발광이, 용액에 남아있는 방사성 표지된 아실 CoA을 제외하고, 오직 Flashplate 표면과 가까운 근접성이 있는 방사성-활성 트리아실글리세롤 형태로부터만 기인하므로, 이러한 단일 웰 스크리닝 형식은 성취된다.

결론적으로, 본 발명은 시간이 소요되는 TLC 및 추출 단계들의 필요를 제거함에 의하여, 고효율 스크리닝에 더욱 적합할 수 있는 기반을 제공하며, 더욱 재생성있고 신뢰성있는 결과를 제공한다.

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Pharmaceutica NV <120> Diacylglycerol Acyltransferase Assay <130> PRD2405 <150> EP04106850.3 <151> 2004-12-22 <160> 4 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1488 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1488) <223> <400> 1 atg gac tac aag gac gac gat gac aag ggc gac cgc ggc agc tcc cgg 48 Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Asp Arg Gly Ser Ser Arg 1 5 10 15 cgc cgg agg aca ggg tcg cgg ccc tcg agc cac ggc ggc ggc ggg cct 96 Arg Arg Arg Thr Gly Ser Arg Pro Ser Ser His Gly Gly Gly Gly Pro 20 25 30 gcg gcg gcg gaa gag gag gtg cgg gac gcc gct gcg ggc ccc gac gtg 144 Ala Ala Ala Glu Glu Glu Val Arg Asp Ala Ala Ala Gly Pro Asp Val 35 40 45 gga gcc gcg ggg gac gcg cca gcc ccg gcc ccc aac aag gac gga gac 192 Gly Ala Ala Gly Asp Ala Pro Ala Pro Ala Pro Asn Lys Asp Gly Asp 50 55 60 gcc ggc gtg ggc agc ggc cac tgg gag ctg agg tgc cat cgc ctg cag 240 Ala Gly Val Gly Ser Gly His Trp Glu Leu Arg Cys His Arg Leu Gln 65 70 75 80 gat tct tta ttc agc 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tct atc act cca gtg ggc tcc ctg ctg gcg ctg atg gcg 624 Leu Val Glu Ser Ile Thr Pro Val Gly Ser Leu Leu Ala Leu Met Ala 195 200 205 cac acc atc ctc ttc ctc aag ctc ttc tcc tac cgc gac gtc aac tca 672 His Thr Ile Leu Phe Leu Lys Leu Phe Ser Tyr Arg Asp Val Asn Ser 210 215 220 tgg tgc cgc agg gcc agg gcc aag gct gcc tct gca ggg aag aag gcc 720 Trp Cys Arg Arg Ala Arg Ala Lys Ala Ala Ser Ala Gly Lys Lys Ala 225 230 235 240 agc agt gct gct gcc ccg cac acc gtg agc tac ccg gac aat ctg acc 768 Ser Ser Ala Ala Ala Pro His Thr Val Ser Tyr Pro Asp Asn Leu Thr 245 250 255 tac cgc gat ctc tac tac ttc ctc ttc gcc ccc acc ttg tgc tac gag 816 Tyr Arg Asp Leu Tyr Tyr Phe Leu Phe Ala Pro Thr Leu Cys Tyr Glu 260 265 270 ctc aac ttt ccc cgc tct ccc cgc atc cgg aag cgc ttt ctg ctg cga 864 Leu Asn Phe Pro Arg Ser Pro Arg Ile Arg Lys Arg Phe Leu Leu Arg 275 280 285 cgg atc ctt gag atg ctg ttc ttc acc cag ctc cag gtg ggg ctg atc 912 Arg Ile Leu Glu Met Leu Phe Phe Thr Gln Leu Gln Val Gly Leu Ile 290 295 300 cag cag tgg atg gtc ccc acc atc cag aac tcc atg aag ccc ttc aag 960 Gln Gln Trp Met Val Pro Thr Ile Gln Asn Ser Met Lys Pro Phe Lys 305 310 315 320 gac atg gac tac tca cgc atc atc gag cgc ctc ctg aag ctg gcg gtc 1008 Asp Met Asp Tyr Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Leu Lys Leu Ala Val 325 330 335 ccc aat cac ctc atc tgg ctc atc ttc ttc tac tgg ctc ttc cac tcc 1056 Pro Asn His Leu Ile Trp Leu Ile Phe Phe Tyr Trp Leu Phe His Ser 340 345 350 tgc ctg aat gcc gtg gct gag ctc atg cag ttt gga gac cgg gag ttc 1104 Cys Leu Asn Ala Val Ala Glu Leu Met Gln Phe Gly Asp Arg Glu Phe 355 360 365 tac cgg gac tgg tgg aac tcc gag tct gtc acc tac ttc tgg cag aac 1152 Tyr Arg Asp Trp Trp Asn Ser Glu Ser Val Thr Tyr Phe Trp Gln Asn 370 375 380 tgg aac atc cct gtg cac aag tgg tgc atc aga cac ttc tac aag ccc 1200 Trp Asn Ile Pro Val His Lys Trp Cys Ile Arg His Phe Tyr Lys Pro 385 390 395 400 atg ctt cga cgg ggc agc agc aag tgg atg gcc agg aca ggg gtg ttc 1248 Met Leu Arg Arg Gly Ser Ser Lys Trp Met Ala Arg Thr Gly Val Phe 405 410 415 ctg gcc tcg gcc ttc ttc cac gag tac ctg gtg agc gtc cct ctg cga 1296 Leu Ala Ser Ala Phe Phe His Glu Tyr Leu Val Ser Val Pro Leu Arg 420 425 430 atg ttc cgc ctc tgg gcg ttc acg ggc atg atg gct cag atc cca ctg 1344 Met Phe Arg Leu Trp Ala Phe Thr Gly Met Met Ala Gln Ile Pro Leu 435 440 445 gcc tgg ttc gtg ggc cgc ttt ttc cag ggc aac tat ggc aac gca gct 1392 Ala Trp Phe Val Gly Arg Phe Phe Gln Gly Asn Tyr Gly Asn Ala Ala 450 455 460 gtg tgg ctg tcg ctc atc atc gga cag cca ata gcc gtc ctc atg tac 1440 Val Trp Leu Ser Leu Ile Ile Gly Gln Pro Ile Ala Val Leu Met Tyr 465 470 475 480 gtc cac gac tac tac gtg ctc aac tat gag gcc cca gcg gca gag gcc 1488 Val His Asp Tyr Tyr Val Leu Asn Tyr Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala 485 490 495 <210> 2 <211> 496 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys Gly Asp Arg Gly Ser Ser Arg 1 5 10 15 Arg Arg Arg Thr Gly Ser Arg Pro Ser Ser His Gly Gly Gly Gly Pro 20 25 30 Ala Ala Ala Glu Glu Glu Val Arg Asp Ala Ala Ala Gly Pro Asp Val 35 40 45 Gly Ala Ala Gly Asp Ala Pro Ala Pro Ala Pro Asn Lys Asp Gly Asp 50 55 60 Ala Gly Val Gly Ser Gly His Trp Glu Leu Arg Cys His Arg Leu Gln 65 70 75 80 Asp Ser Leu Phe Ser Ser Asp Ser Gly Phe Ser Asn Tyr Arg Gly Ile 85 90 95 Leu Asn Trp Cys Val Val Met Leu Ile Leu Ser Asn Ala Arg Leu Phe 100 105 110 Leu Glu Asn Leu Ile Lys Tyr Gly Ile Leu Val Asp Pro Ile Gln Val 115 120 125 Val Ser Leu Phe Leu Lys Asp Pro Tyr Ser Trp Pro Ala Pro Cys Leu 130 135 140 Val Ile Ala Ala Asn Val Phe Ala Val Ala Ala Phe Gln Val Glu Lys 145 150 155 160 Arg Leu Ala Val Gly Ala Leu Thr Glu Gln Ala Gly Leu Leu Leu His 165 170 175 Val Ala Asn Leu Ala Thr Ile Leu Cys Phe Pro Ala Ala Val Val Leu 180 185 190 Leu Val Glu Ser Ile Thr Pro Val Gly Ser Leu Leu Ala Leu Met Ala 195 200 205 His Thr Ile Leu Phe Leu Lys Leu Phe Ser Tyr Arg Asp Val Asn Ser 210 215 220 Trp Cys Arg Arg Ala Arg Ala Lys Ala Ala Ser Ala Gly Lys Lys Ala 225 230 235 240 Ser Ser Ala Ala Ala Pro His Thr Val Ser Tyr Pro Asp Asn Leu Thr 245 250 255 Tyr Arg Asp Leu Tyr Tyr Phe Leu Phe Ala Pro Thr Leu Cys Tyr Glu 260 265 270 Leu Asn Phe Pro Arg Ser Pro Arg Ile Arg Lys Arg Phe Leu Leu Arg 275 280 285 Arg Ile Leu Glu Met Leu Phe Phe Thr Gln Leu Gln Val Gly Leu Ile 290 295 300 Gln Gln Trp Met Val Pro Thr Ile Gln Asn Ser Met Lys Pro Phe Lys 305 310 315 320 Asp Met Asp Tyr Ser Arg Ile Ile Glu Arg Leu Leu Lys Leu Ala Val 325 330 335 Pro Asn His Leu Ile Trp Leu Ile Phe Phe Tyr Trp Leu Phe His Ser 340 345 350 Cys Leu Asn Ala Val Ala Glu Leu Met Gln Phe Gly Asp Arg Glu Phe 355 360 365 Tyr Arg Asp Trp Trp Asn Ser Glu Ser Val Thr Tyr Phe Trp Gln Asn 370 375 380 Trp Asn Ile Pro Val His Lys Trp Cys Ile Arg His Phe Tyr Lys Pro 385 390 395 400 Met Leu Arg Arg Gly Ser Ser Lys Trp Met Ala Arg Thr Gly Val Phe 405 410 415 Leu Ala Ser Ala Phe Phe His Glu Tyr Leu Val Ser Val Pro Leu Arg 420 425 430 Met Phe Arg Leu Trp Ala Phe Thr Gly Met Met Ala Gln Ile Pro Leu 435 440 445 Ala Trp Phe Val Gly Arg Phe Phe Gln Gly Asn Tyr Gly Asn Ala Ala 450 455 460 Val Trp Leu Ser Leu Ile Ile Gly Gln Pro Ile Ala Val Leu Met Tyr 465 470 475 480 Val His Asp Tyr Tyr Val Leu Asn Tyr Glu Ala Pro Ala Ala Glu Ala 485 490 495 <210> 3 <211> 1167 <212> DNA <213> homo sapiens <220> <221> CDS <222> (1)..(1167) <223> <400> 3 atg aag acc ctc ata gcc gcc tac tcc ggg gtc ctg cgc ggc gag cgt 48 Met Lys Thr Leu Ile Ala Ala Tyr Ser Gly Val Leu Arg Gly Glu Arg 1 5 10 15 cag gcc gag gct gac cgg agc cag cgc tct cac gga gga cct gcg ctg 96 Gln Ala Glu Ala Asp Arg Ser Gln Arg Ser His Gly Gly Pro Ala Leu 20 25 30 tcg cgc gag ggg tct ggg aga tgg ggc act gga tcc agc atc ctc tcc 144 Ser Arg Glu Gly Ser Gly Arg Trp Gly Thr Gly Ser Ser Ile Leu Ser 35 40 45 gcc ctc cag gac ctc ttc tct gtc acc tgg ctc aat agg tcc aag gtg 192 Ala Leu Gln Asp Leu Phe Ser Val Thr Trp Leu Asn Arg Ser Lys Val 50 55 60 gaa aag cag cta cag gtc atc tca gtg ctc cag tgg gtc ctg tcc ttc 240 Glu Lys Gln Leu Gln Val Ile Ser Val Leu Gln Trp Val Leu Ser Phe 65 70 75 80 ctt gta ctg gga gtg gcc tgc agt gcc atc ctc atg tac ata ttc tgc 288 Leu Val Leu Gly Val Ala Cys Ser Ala Ile Leu Met Tyr Ile Phe Cys 85 90 95 act gat tgc tgg ctc atc gct gtg ctc tac ttc act tgg ctg gtg ttt 336 Thr Asp Cys Trp Leu Ile Ala Val Leu Tyr Phe Thr Trp Leu Val Phe 100 105 110 gac tgg aac aca ccc aag aaa ggt ggc agg agg tca cag tgg gtc cga 384 Asp Trp Asn Thr Pro Lys Lys Gly Gly Arg Arg Ser Gln Trp Val Arg 115 120 125 aac tgg gct gtg tgg cgc tac ttt cga gac tac ttt ccc atc cag ctg 432 Asn Trp Ala Val Trp Arg Tyr Phe Arg Asp Tyr Phe Pro Ile Gln Leu 130 135 140 gtg aag aca cac aac ctg ctg acc acc agg aac tat atc ttt gga tac 480 Val Lys Thr His Asn Leu Leu Thr Thr Arg Asn Tyr Ile Phe Gly Tyr 145 150 155 160 cac ccc cat ggt atc atg ggc ctg ggt gcc ttc tgc aac ttc agc aca 528 His Pro His Gly Ile Met Gly Leu Gly Ala Phe Cys Asn Phe Ser Thr 165 170 175 gag gcc aca gaa gtg agc aag aag ttc cca ggc ata cgg cct tac ctg 576 Glu Ala Thr Glu Val Ser Lys Lys Phe Pro Gly Ile Arg Pro Tyr Leu 180 185 190 gct aca ctg gca ggc aac ttc cga atg cct gtg ttg agg gag tac ctg 624 Ala Thr Leu Ala Gly Asn Phe Arg Met Pro Val Leu Arg Glu Tyr Leu 195 200 205 atg tct gga ggt atc tgc cct gtc agc cgg gac acc ata gac tat ttg 672 Met Ser Gly Gly Ile Cys Pro Val Ser Arg Asp Thr Ile Asp Tyr Leu 210 215 220 ctt tca aag aat ggg agt ggc aat gct atc atc atc gtg gtc ggg ggt 720 Leu Ser Lys Asn Gly Ser Gly Asn Ala Ile Ile Ile Val Val Gly Gly 225 230 235 240 gcg gct gag tct ctg agc tcc atg cct ggc aag aat gca gtc acc ctg 768 Ala Ala Glu Ser Leu Ser Ser Met Pro Gly Lys Asn Ala Val Thr Leu 245 250 255 cgg aac cgc aag ggc ttt gtg aaa ctg gcc ctg cgt cat gga gct gac 816 Arg Asn Arg Lys Gly Phe Val Lys Leu Ala Leu Arg His Gly Ala Asp 260 265 270 ctg gtt ccc atc tac tcc ttt gga gag aat gaa gtg tac aag cag gtg 864 Leu Val Pro Ile Tyr Ser Phe Gly Glu Asn Glu Val Tyr Lys Gln Val 275 280 285 atc ttc gag gag ggc tcc tgg ggc cga tgg gtc cag aag aag ttc cag 912 Ile Phe Glu Glu Gly Ser Trp Gly Arg Trp Val Gln Lys Lys Phe Gln 290 295 300 aaa tac att ggt ttc gcc cca tgc atc ttc cat ggt cga ggc ctc ttc 960 Lys Tyr Ile Gly Phe Ala Pro Cys Ile Phe His Gly Arg Gly Leu Phe 305 310 315 320 tcc tcc gac acc tgg ggg ctg gtg ccc tac tcc aag ccc atc acc act 1008 Ser Ser Asp Thr Trp Gly Leu Val Pro Tyr Ser Lys Pro Ile Thr Thr 325 330 335 gtt gtg gga gag ccc atc acc atc ccc aag ctg gag cac cca acc cag 1056 Val Val Gly Glu Pro Ile Thr Ile Pro Lys Leu Glu His Pro Thr Gln 340 345 350 caa gac atc gac ctg tac cac acc atg tac atg gag gcc ctg gtg aag 1104 Gln Asp Ile Asp Leu Tyr His Thr Met Tyr Met Glu Ala Leu Val Lys 355 360 365 ctc ttc gac aag cac aag acc aag ttc ggc ctc ccg gag act gag gtc 1152 Leu Phe Asp Lys His Lys Thr Lys Phe Gly Leu Pro Glu Thr Glu Val 370 375 380 ctg gag gtg aac tga 1167 Leu Glu Val Asn 385 <210> 4 <211> 388 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 4 Met Lys Thr Leu Ile Ala Ala Tyr Ser Gly Val Leu Arg Gly Glu Arg 1 5 10 15 Gln Ala Glu Ala Asp Arg Ser Gln Arg Ser His Gly Gly Pro Ala Leu 20 25 30 Ser Arg Glu Gly Ser Gly Arg 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Lys Asn Ala Val Thr Leu 245 250 255 Arg Asn Arg Lys Gly Phe Val Lys Leu Ala Leu Arg His Gly Ala Asp 260 265 270 Leu Val Pro Ile Tyr Ser Phe Gly Glu Asn Glu Val Tyr Lys Gln Val 275 280 285 Ile Phe Glu Glu Gly Ser Trp Gly Arg Trp Val Gln Lys Lys Phe Gln 290 295 300 Lys Tyr Ile Gly Phe Ala Pro Cys Ile Phe His Gly Arg Gly Leu Phe 305 310 315 320 Ser Ser Asp Thr Trp Gly Leu Val Pro Tyr Ser Lys Pro Ile Thr Thr 325 330 335 Val Val Gly Glu Pro Ile Thr Ile Pro Lys Leu Glu His Pro Thr Gln 340 345 350 Gln Asp Ile Asp Leu Tyr His Thr Met Tyr Met Glu Ala Leu Val Lys 355 360 365 Leu Phe Asp Lys His Lys Thr Lys Phe Gly Leu Pro Glu Thr Glu Val 370 375 380 Leu Glu Val Asn 385

Claims

적어도 하나의 DGAT 기질을 포함하는 미셀(micelle)과 미크로솜(microsome)을 포함하는 DGAT를 접촉시키고 이렇게 수득된 반응 혼합물에서 트리글리세리드 생성을 결정하는 것을 포함하는, DGAT 활성의 측정 방법.
제 1항에 있어서,

DGAT 기질을 포함하는 미셀이;

- 포스파티딜세린 또는 포스파티딜콜린을 포함하는 미셀;

- 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 포함하는 미셀; 또는

- 포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 1:1의 중량비로 포함하는 미셀로부터 선택되는 방법.
제 1항에 있어서, 반응 혼합물이, 보조효소A(coenzymeA) 활성화 지방산을 추가로 포함하는 방법.
제 3항에 있어서, 보조효소A 활성화 지방산이 팔미토일-CoA 또는 올레오일-CoA로부터 선택되는 방법.
제 3항 또는 제 4항에 있어서, 보조효소A 활성화 지방산 부분이 탐지가능하 게 표지된 방법.
제 5항에 있어서, 보조효소A 활성화 지방산이 방사성표지된 방법.
제 3항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 보조효소A 활성화 지방산이 올레오일-CoA이며, 올레오일-CoA의 부분은 [³H]-올레오일-CoA인 방법.
제 1항에 있어서, DGAT 기질이 스테아로일-2-아라키도닐-sn-글리세롤(stearoyl-2-arachidonyl-sn-glycerol) 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세롤(1,2-dioleoyl-sn-glycerol)로 구성되는 방법.
제 1항에 있어서, 미크로솜을 포함하는 DGAT가 인간 DGAT1(서열 번호 2) 단백질을 발현하는 곤충 세포의 막 제제인 방법.
제 1항에 있어서, 트리글리세리드 생성이 신틸레이팅 고체 지지체 매질(scintillating solid support medium)을 이용하여 결정하는 방법.
시료 화합물의 존재 및 부재하에서, 적어도 하나의 DGAT 기질을 포함하는 미셀과 미크로솜을 포함하는 DGAT를 접촉시키고 이렇게 수득된 반응 혼합물에서 트리글리세리드 생성을 결정하는 것을 포함하며, 시료 화합물의 존재하에서 트리글리세리드 생성의 변화가 상기 화합물이 DGAT 활성을 조절할 능력이 있음을 나타내는, 시료 화합물이 DGAT 활성을 조절할 능력이 있는지를 확인하는 방법.
제 11항에 있어서, DGAT 기질을 포함하는 미셀이;

-포스파티딜세린 또는 포스파티딜콜린을 포함하는 미셀;

-포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 포함하는 미셀;

-포스파티딜세린 농도보다 작거나 같은 포스파티딜콜린 농도를 포함하는 미셀;

-포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 3:1 몰(molar) 비로 포함하는 미셀;

-포스파티딜세린 및 포스파티딜콜린을 3.5:1.3 몰 비로 포함하는 미셀로부터 선택되는 방법.
제 11항에 있어서, 반응 혼합물이, 보조효소A 활성화 지방산을 추가로 포함하는 방법.
제 13항에 있어서, 보조효소A 활성화 지방산이 팔미토일-CoA 또는 올레오일-CoA로부터 선택된 방법.
제 13항 또는 제 14항에 있어서, 보조효소A 활성화 지방산의 부분이 탐지가능하게 표지된 방법.
제 15항에 있어서, 보조효소A 활성화 지방산의 부분이 방사성표지된 방법
제 13항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 보조효소A 활성화 지방산이 올레오일-CoA이고, 상기 올레오일-CoA의 부분은 [³H]-올레오일-CoA인 방법.
제 11항에 있어서, DGAT 기질은 스테아로일-2-아라키도닐-sn-글리세롤 또는 1,2-디올레오일-sn-글리세롤로 구성된 방법.
제 11항에 있어서, 미크로솜을 포함하는 DGAT는 인간 DGAT1(서열 번호 2) 단백질을 발현하는 곤충 세포의 막 제제인 방법.
제 11항에 있어서, 트리글리세리드 생성은 신틸레이팅 고체 지지체 매질을 이용하여 결정하는 방법.
제 11항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 확인된 화합물 의 치료적 유효량을, 이를 필요로 하는 대상에 투여하는 것을 포함하여, 병리가 DGAT 효소 작용에 의하여 특정화되는 질환, 특히, 비만 및 고 트리아실글리세롤 관련 질환을 치료하는 방법.