KR20070085116A - 우수한 항종양 치료제인 시알릴테트라오실카보하이드레이트에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체ｓｃ１０４ 및 이들의 유도체 - Google Patents

Abstract

본 발명은 시알릴테트라오실 카보하이드레이트와 결합하며 면역 효능 세포를 필요로 하지 않고 세포사를 직접 유도할 수 있는 분리된 특이적 결합 구성체를 제공한다. 그러한 결합 구성체는 항체 또는 이의 부분일 수 있다. 또한 그러한 결합 구성체의 의약 용도 및 그러한 결합 구성체를 코딩하는 핵산이 제공된다.

시알릴테트라오실 카보하이드레이트, 마우스 단일클론성 항체, 결장 종양,특이적 결합 구성체, 세포사

Description

우수한 항종양 치료제인 시알릴테트라오실 카보하이드레이트에 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체 ＳＣ１０４ 및 이들의 유도체{MONOCLONAL ANTIBODY SC104 AND DERIVATIVE THEREOF SPECIFICALLY BINDING TO A SIALYLTETRAOSYL CARBOHYDRATE AS A POTENTIAL ANTI-TUMOR THERAPEUTIC AGENT}

본 발명은 암 및 자궁내막증과 관계있는 에피토프와 결합하는, 특이적 결합 구성체, 특히 항체 및 이의 분체에 관한 것이다. 그러한 막은 종양의 진단 및 치료에 유용하다.

GM2, GD3 및 GM3 강글리오사이드류에 결합하는 항체는 알려져 있으나, 시알릴테트라오실세라아미드와 결합하나, GM1, GD1a, GT1b 또는 시알릴 루이스 항원과 결합하지 않는 항체는 이전에 설명된 바가 없다. 본 명세서에서 “SC104”로서 지칭되는 마우스 단일클론성 항체 (mab)를 4 개의 결장암 세포주들과 순차적으로 면역화하는 데까지 만들었고, 이는 결장 종양의 71%와 결합하는 것으로 나타난다. SC104는 지질 (세라마이드) 또는 단백질 골격에 존재할 수 있는, 시알릴테트라오실 카보하이드레이트에 특이적이며, 식도, 결장, 위장, 유방, 이하선 (parotid), 및 자궁내막 종양을 인식한다. 이러한 SC104는 그것이 IgG1 항체이기 때문에 독특하다 할 수 있다. 카보하이드레이트 항원의 면역학적 특성 중 하나는 그것이 통상 T-세포 비의존성 반응을 이끌어 내서, IgM 항체를 생성하는 결과를 가져온다는 것이다. SC104는 결장 세포주 C170으로부터 얻은 지질 추출물의 HPLTC 플레이트를 면역염색함으로써 시알릴테트라오실세라마이드와 결합한다는 것이 밝혀졌다. SC104는 또한 시알릴테트라오실 카보하이드레이트를 가지는 단백질 분체에 결합하는 것으로 밝혀졌다. 정상적인 조직을 인지하는 것이 최소화되었고, 이는 대장, 침샘, 소장, 흉선, 편도선, 및 자궁 경부에서는 중간 정도로 염색하는 것으로 제한된다. 본 발명은 또한 놀랍게도 상기 항체가 세포사를 유도한다는 것을 발견하였다.

본 발명의 첫 번째 관점에 따라서, 시알릴테트라오실 카보하이드레이트와 결합할 수 있고, 면역 효능 세포에 대한 필요 없이 직접적으로 세포사를 유도할 수 있는 분리된 특이적 결합 구성체를 제공한다.

본 발명의 두 번째 관점에 따라서, 시알릴테트라오실 카보하이드레이트와 결합할 수 있는 분리된 특이적 결합 구성체를 제공하는 바, 상기 시알릴테트라오실 카보하이드레이트는 도 1a의 아미노산 서열의 잔기 44 또는 49 내지 54, 69 내지 84, 및 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 도메인들로부터 선택된 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 구성체와 결합할 수 있다.

상기 결합 도메인은 도 1a의 잔기 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 두 번째 관점의 분리된 특이적 결합 구성원은 도 1a의 잔기 44나 49 내지 54, 69 내지 84 또는 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 도메인들로부터 선택된 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 구성체는 도 1a의 아미노산 서열의 잔기 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 아미노산을 포함하는 결합 도메인을 포함한다. 이러한 구체예에서, 상기 분리된 결합 구성체는 도 1a에 도시된 아미노산 서열의 잔기 44나 49 내지 54 및 잔기 69 내지 84로서 결합 도메인들 중 하나 또는 둘 다, 바람직하게는 둘 다를 부가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 두 번째 관점의 하나의 분리된 특이적 결합 구성체는 도 1a에 도시된 아미노산 서열의 잔기 19 내지 138로서 실질적으로 설정된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.

세 번째 관점에서, 본 발명은 시알릴테트라오실 카보하이드레이트와 결합할 수 있는 분리된 특이적 결합 구성체를 제공하는 것으로, 상기 시알릴테트라오실 카보하이드레이트는 도 1c의 아미노산 서열의 잔기 46 내지 55, 71 내지 77 및 110 내지 118로서 실질적으로 설정된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 도메인으로부터 선택된 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 구성체와 결합할 수 있다.

상기 결합 도메인은 도 1c의 아미노산 서열의 잔기 110 내지 118로서 실질적으로 설정된 바와 같은 아미노산 서열을 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 본 발명의 세 번째 관점의 분리된 특이적 결합 구성원은 도 1c의 아미노산 서열의 잔기 46 내지 55, 71 내지 77 및 110 내지 118로서 실질적으 로 설정된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 도메인들로부터 선택된 하나 이상의 결합 도메인을 포함한다.

일 구체예에서, 상기 구성체는 도 1c의 아미노산 서열의 잔기 110 내지 118로서 실질적으로 설정된 바와 같은 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인을 포함한다. 이러한 구체예에서, 상기 분리된 특이적 결합 구성원은 도 1c에 도시된 아미노산 서열의 자기 46 내지 55 및 잔기 71 내지 77로서 실질적으로 설정된 결합 도메인 중 하나 또는 둘 다, 바람직하게는 둘 다를 부가적으로 포함할 수 있다.

복수개의 동일하거나 상이한 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는 특이적 결합구성체는 본 발명의 범주 내에 포함된다. 그러한 또는 각각의 결합 도메인은 인간 항체 골격과 접합될 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 결합 부위는 전체 인간 항체 또는 이의 가변 영역의 CDR을 대체할 수 있다.

본 발명의 세 번째 관점의 하나의 분리된 특이적 결합 구성체는 도 1c에 도시된 아미노산 서열의 잔기 23 내지 128로서 실질적으로 설정된 바와 같은 서열을 포함한다.

네 번째 관점에서, 본 발명은 상기 두 번째 관점의 결합 구성체를 상기 세 번째 관점의 결합 구성체와 조합 또는 공동하여 포함하는 상기 특이적 결합 구성체를 제공한다. 그러한 결합 구성체는 Fv, (Fab')2, 또는 scFV 항체 분체의 형태로 존재할 수 있다.

본 발명의 특이적 결합 구성체는 검출가능한 또는 기능성 표식자를 가지고 있을 수있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은 본 발명의 첫 번, 두 번, 세 번 및 네 번째 관점의 특이적 결합 구성체를 암호화하는 서열을 포함하는 분리된 핵산, 및 상기 결합 구성체의 발현을 실현하는 조건하에서 상기 핵산을 발현하고 및 그 결합 구성체를 회수하는 것을 포함하는 본 발명의 특이적 결합 구성체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 특이적 결합 구성체는, 본 발명의 특이적 결합 구성체의 유효한 양을 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 인간 또는 동물의 치료 또는 진단의 방법, 예를 들어 환자 (바람직하게는 인간)에서 종양을 치료하는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 본 발명의 특이적 결합 구성체가 결합하는 항원을 제공한다. 일 구체예에서, 바람직하게는 특이적으로 본 발명의 특이적 결합 구성체에 의해 결합될 수 있는 시알릴테트라오실 카보하이드레이트를 제공한다. 상기 시알릴테트라오실 카보하이드레이트는 분리된 형태로 제공될 수 있고 이에 대한 특이적 결합 구성체를 더 개발하는 검출 방법에 사용될 수 있다. 예를 들어 일 군의 화합물을 상기 시알릴테트라오실 카보하이드레이트에 특이적으로 결합하는 구성체 라이브러리에 대하여 검색할 수 있다. 시알릴테트라오실 카보하이드레이트는 지질 골격 (예를 들어, 시알릴테트라오실세라마이드) 또는 단백질 골격 상에 있을 수 있다. 단백질 골격 상에 있는 경우, SDS-PAGE에 의해 측정 결과 약 50-75 kDa의 분자량을 가진다.

이하, 본 발명의 이러한 및 다른 관점들을 더욱 상세히 설명하고자 한다.

본 명세서에 사용된 바와 같이, “특이적 결합 구성체”는 서로에 대하여 결 합 특이성을 가지는 분자 쌍의 구성체다. 특이적 결합 쌍의 구성체는 자연적으로 유도되거나 또는 전체적으로 또는 부분적으로 합성 생성될 수 있다. 상기 분자쌍의 한 구성체는 표면상에 돌출부 또는 공동부 (cavity)일 수 있는 부위를 가지는 데, 이는 상기 분자쌍의 다른 구성체의 공간적 및 극성적 구조에 특이적으로 결합하며 따라서 그에 상보적인 것이다. 따라서, 상기 쌍의 구성체들은 상호 특이적으로 결합하는 특성을 가진다. 특이적 결합 쌍의 유형 보기는 항원-항체, 비오틴-아비딘, 호르몬-호르몬 수용체, 수용체-리간드, 및 효소-기질을 포함한다. 본 발명은 또한 본 명세서에서 정의된 항원과 결합하는 작은 분자에 관한 것이지만, 일반적으로 항원-항체 유형 반응에 관한 것이다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이 “치료”는 인간 또는 비인간 동물, 바람직하게는 포유류에게 이롭게 할 수 있는 임의의 섭생을 포함한다. 치료는 기존의 상태에 관한 것일 수 있고 예방적 (방지 치료)일 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 바, “종양”은 조직의 비정상적인 성장을 의미한다. 그것은 국소화되어 있거나 (양성) 또는 근처의 조직에 침입 (악성) 또는 멀리 있는 조직에 침입(전이)할 수 있다. 종양은 암을 야기하는 신생물 성장을 포함하며, 식도, 결장, 위장, 유방 및 자궁내막 종양은 물론, 비제한적으로 백혈구 세포를 포함하는 암성 조직 또는 세포주를 포함한다. 사용되는 바와 같이, “종양”은 자궁내막증을 그 범위 내에 포함하고 있다.

용어 “항체”는 본 명세서에서 사용되는 바와 같이 면역글로불린 분자를 지칭하고 및 면역글로불린 분자, 천연적이건 또는 부분적으로 또는 전체가 합성된 것 이건 간에, 예를 들어 항원과 특이적으로 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 분자의 면역적으로 활성인 부분을 포함한다. 상기 용어는 또한 항체 결합 도메인이거나 이와 동질적인 결합 도메인을 가지는 임의의 폴리펩타이드 또는 단백질을 망라하고 있다. 이러한 것은 천원으로부터 유도된 것일 수 있고 또는 부분적으로 또는 전부 합성으로 생성될 수 있다. 항체의 예는 면역글로불린 이소타입 (즉, IgG, IgE, IgM, IgD 및 IgA) 및 이들의 이소타입성 부차 등급류; Fab, scFv, Fv, dAb, Fd와 같은 항원 결합 도메인을 포함하는 분체; 및 다이어바디 (diabody)이다. 항체는 다중클론성 또는 단일클론성일 수 있다. 단일 클론성 항체는 본 명세서에서 “mab”로 지칭된다.

단일클론성인 다른 항체를 사용하고 재조합 DNA 기술을 사용하여 원래의 항체의 특이성을 유지하는 다른 항체나 키메릭 분자를 생성하는 것이 가능하다. 그러한 기술은

항체의 면역글로불린 가변 영역 또는 상보성 결정 부위 (CDR)를 암호화하고 있는 DNA를 다른 면역글로불린의 불변 영역 또는 불변 영역 더하기 골격 부위에 도입하는 것을 포함한다. 예를 들어, EP-A-184187, GB 2188638A 또는 EP-A-239400를 참조하라. 항체를 생성하는 하이브리도마 또는 다른 세포를, 생성된 항체의 결합 특이성을 변화시키거나 시키지 못할 수 있는 유전적 변이 또는 다른 변화에 처하게 할 수 있다.

항체가 여러 다양한 방식으로 변경될 수 있음에 따라서, 용어 “항체”는 임의의 특이적 결합 구성체 또는 획득된 특이성을 가지는 결합 도메인을 가지는 물질 을 망라하는 것으로 해석되어야 한다. 따라서, 이 용어는, 천연이건 전체가 또는 부분적으로 합성 생성된 것이건 간에, 면역글로불린 결합 도메인을 포함하는 임의의 폴리펩타이드를 위시한, 항체 분체, 유도체, 항체와 기능적으로 동일하거나 유사한 물질, 및 인체화된 항체를 망라한다. 다른 폴리펩타이드에 융합된 면역글로불린 결합 도메인 또는 이의 등가체를 포함하는 키메릭 분자가 따라서 해당된다. 키메릭 항체의 클로닝 및 발현은 EP-A-0120694 및 EP-A-0125023에 설명되어 있다. 인체화된 항체는 비인간, 예를 들어, 쥐의 항체의 가변 영역 및 인간 항체의 불변 영역을 가지는 개질된 항체일 수 있다. 인간화된 항체를 만드는 방법은, 예를 들어, 미국 특허 제 5225539 호에 설명되어 있다.

전 항체의 분체가 결합 항원의 기능을 수행할 수 있다는 것이 밝혀져 있다. 결합 분체의 예는 (i) VL, VH, CL 및 CHI 도메인으로 구성되는 Fab 분체; (ii) VH 및 CH1 도메인으로 구성되는 Fd 분체; (iii) 단일 항체의 VL 및 VH로 구성되는 Fv 분체; (iv) VH 도메인으로 구성되는 dAb 분체 (Ward, E. S. 등, Nature 341: 544-546 (1989) ); (v) 분리된 CDR 부위; (vi) 두 개의 연결된 Fab 분체를 포함하는 이가 분체인, F (ab’)2 분체 (vii) VH 도메인 및 VL 도메인이 펩타이드 연결체로 연결되어 두 도메인이 연합하여 하나의 항원 결합 부위를 형성하는, 단일 사슬 Fv 분자 (scFv) (Bird et al., Science 242: 423-426 (1988) ; Huston 등, PNAS USA 85: 5879-5883 (1988) ); (viii) 이중특이성 단일 사슬 Fv 이량체 (PCT/US92/09965) 및 (ix) “다이아바디", 즉 유전자 융합으로 제조된 다중특이성 분체 (W094/13804; P. Hollinger 등, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993)).

다이아바디는 폴리펩타이드들의 다량체 (multimer)로서, 각 폴리펩타이드는 면역글로불린 경 사슬의 결합 부위를 포함하는 제 1 도메인과 면역글로불린 중 사슬의 결합 부위를 포함하는 제 2 도메인을 포함하며, 상기 두 도메인은 (예를 들어, 펩타이드 연결체에 의해) 연결되어 있으나 서로 연합되어 항원 결합 부위를 형성할 수 없는 것이다: 이 항원 결합 부위는 상기 다량체 내의 한 폴리펩타이드의 제 1 도메인과 상기 다량체 내의 다른 폴리펩타이드의 제 2 도메인과의 연합으로 형성된다 (W094/13804).

이중 항체가 사용되는 경우, 이것들은 다양한 방식 (Hollinger & Winter, Current Opinion Biotechnol. 4: 446-449 (1993))으로 제작될 수 있는, 예를 들어, 화학적으로 또는 하이브리드 하이브리도마로부터 제조될 수 있는 통상적인 이중특이성 항체일 수 있거나, 전술한 임의의 이중특이성 항체 분체일 수 있다. 전체 항체보다 scFv 이량체 또는 다이아바디를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 다이아바디 및 scFv는 Fc 부위 없이 가변 도메인만을 사용하여 제조될 수 있고, 항-유전자형 반응의 효과를 상당히 감소시킨다. 이중 특이성 항체의 다른 형태는 Traunecker 등의 EMBO Journal 10: 3655-3659 (1991)에 설명된 단일 사슬인 “야누신스 (Janusins)”를 포함한다.

이중특이성 전체 항체에 대립되는 것으로서, 이중특이성 다이아바디가 또한 그것들이 E.coli.에서 용이하게 제작되고 발현될 수 있기 때문에 유용할 수 있다.

파지 디스플레이 (WO94/13804)를 사용하여, 적절한 결합 특이성을 가지는 다이아바디 (및 항체 분체와 같은 다른 폴리펩타이드)를 라이브러리로부터 용이하게 선택할 수 있다. 다이아바디의 하나의 팔이, 예를 들어, 항원 X에 대해 특이성을 가진 채로 일정하게 유지된다면, 다른 팔이 가변적으로 되고 적절한 특이성의 항체가 선택되는 라이브러리를 만들 수 있다.

“항원 결합 도메인”은 항원의 부분 또는 전체에 특이적으로 결합하고 상보적인 부위를 포함하는 항체의 부분이다. 항원이 클 경우, 항체는 항원의 특정 부분, 에피토프라고 불리는 부분에만 결합될 수 있다. 항원 결합 도메인은 하나 이상의 항체 가변 도메인에 의해 제공될 수 있다. 항원 결합 도메인은 항체 경 사슬 가변 영역 (VL) 및 항체 중 사슬 가변 영역 (VH)를 포함할 수 있다.

“특이적”이란 용어는 일반적으로 특이적 결합 쌍의 하나가 그것의 특이적 결합파트너(들)외의 다른 분자에 임의의 상당한 결합을 보이지 않는, 예를 들어, 임의의 다른 분자와 약 30%, 바람직하게는 20%, 10% 또는 1% 미만의 교차 반응성을 보이는 상황을 지칭한다. 상기 용어는 또한 예를 들어, 항원 결합 도메인이 많은 항원이 가지는 특정 에피토프에 대하여 특이적인 경우에 적용될 수 있고, 이 경우, 상기 항원 결합 도메인을 가지는 특이적 결합 구성체는 상기 에피토프를 가지는 다양한 항원에 결합될 수 있을 것이다.

“분리된”이란 용어는 본 발명의 특이적 결합 구성체 또는 그러한 결합 구성체를 암호화하고 있는 핵산이, 바람직하게는, 본 발명에 따라서 존재하는 상태를 의미한다. 구성체 및 핵산은 일반적으로, 그들이 자연적인 환경 또는 시험관 또는 생체 내에서 실행되는 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 때의 그러한 환경 (즉, 세포 배양액)에서 발견되는 다른 폴리펩타이드 또는 핵산과 같이, 그들이 자연적으로 연 합된 물질이 없다는 또는 거의 없다. 특이적 결합 구성체 민 핵산은 희석제 또는 보조제와 같이 조성될 수 있고 여전히 실제적일 목적상 분리될 수 있다-예를 들어, 상기 구성체는 면역 분석에 사용하기 위해 마이크로타이터 플레이트를 코팅하는데 사용시 젤라틴 또는 다른 담체와 통상 혼합되거나, 또는 진단 또는 요법에 사용될 때는 약학적 허용 담체 또는 희석제와 혼합될 것이다.

특이적 결합 구성체는 자연적으로 또는 이형적 진핵 세포의 시스템에 의해 글리코실화될 수 있고 또는 (예를 들어 원핵 세포에서의 발현으로 생성된다면), 비글리코실화될 수 있다.

“실질적으로 설정된 바와 같은"이란 본 발명의 CDR 부위가 도 1a 및 1c의 특이 부위와 동일하거나 매우 상동이라는 것을 의미한다. “매우 상동인”은 CDR에서 1 내지 5, 1 내지 4, 1 내지 3, 2 또는 1 나의 치환체가 만들어 질 수 있다는 것을 뜻한다.

본 발명은 또한 도 1a 또는 1c에 설정된 바와 같은 아미노산 서열을 가지는 폴리펩타이드, 도 1a 또는 1c에 설정된 바와 같은 핵산 서열을 가지는 폴리뉴클레오타이드 및 이에 실질적으로 동일한, 예를 들어, 70%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99% 동일성을 가지는 서열을 그 범주 내에 포함한다. 두 개 아미노산 서열 또는 두 개 핵산 서열의 동일성 %는 일반적으로 서열들을 최적 비교 목적으로 배치하고 (즉, 제 1 서열을 제 2 서열과 최선으로 배열하기 위해 간극이 도입될 수도 있다), 및 상응하는 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드를 비교함으로써 결정된다. 상기 “최선으로 배열”은 최고의 동일성 퍼센트를 결과하는 두 개 서열의 배 열을 뜻한다. 동일성 퍼센트는 서열 내에서 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오타이드의 수를 비교함으로써 결정된다 (즉, % 동일성=동일한 위치의 수/위치의 전체 수 x 100).

당해 분야의 숙련자에게 공지된 수학적 알고리즘을 사용하여 두 서열 간의 동일성 퍼센트를 결정할 수 있다. 두 개 서열을 비교하는 수학적 알고리즘의 예는 Karlin 및Altschul의 (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 2264-2268에서 주창되고, Karlin 및 Altschul의 (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 5873-5877에서 개정된 알고리즘이다. Altschul 등 (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램은 그러한 알고리즘을 포함하고 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 스코어=100, 단어길이=12로 설정된 NBLAST 프로그램을 사용하여 수행함으로써 본 발명의 단백질 분자에 상동인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. BLAST 단백질 검색은 스코어=50, 단어길이=3로 설정된 XBLAST 프로그램을 사용하여 수행함으로써 본 발명의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 비교 목적상 간극된 배열을 얻기 위해, Gapped BLAST을 Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402에서 설명된 바와 같이 이용할 수 있다. 택일적으로, PSI-Blast을 사용하여, 분자간 소원 관계 (distant relationship)를 검출하는 반복 검색을 실시할 수 있다 (Id.). BLAST, Gapped BLAST, 및 PSI-Blast 프로그램을 사용할 때, 각 프로그램들 (XBLAST 및 NBLAST)의 원래 설정 변수를 사용할 수 있다. 참조 http://www.ncbi.nlm.nih.gov. 서열들의 비료에 이용된 수학적 알고리즘의 다른 예는 Myers 및 Miller, CABIOS (1989)의 알고리즘이다. GCG 서열 배열 소프트웨어 패 키지의 부분인 ALIGN 프로그램 (버전 2.0)은 그러한 알고리즘을 포함하고 있다. 당해 분야 알려진 서열 분석에 사용되는 다른 알고리즘은 Torellis 및 Robotti (1994) Comput. Appl. Biosci., 10 :3-5에서 설명된 바와 같은 ADVANCE 및 ADAM; 및 Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. 85: 2444-8에서 설명된 FASTA를 포함한다. FASTA 내에서 ktup는 탐색의 민감도 및 속도를 세팅하는 제어 옵션이다.

본 발명의 분리된 특이적 결합 구성체는, 시알릴테트라오실세라마이드 자체이거나 단백질 분체상에 존재할 수 있는, 시알릴테트라오실 카보하이드레이트에 결합될 수 있다. 일 구체예에서, 도 1a의 잔기 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는, CDR3 부위는 이러한 부위를 시알릴테트라오실 카보하이드레이트에 결합시키게 허용하는 구조체에 지지될 수 있다.

본 발명의 CDR3를 가지는 구조체는 일반적으로, 재배치된 면역글로불린 유전자에 의해 암호화된 자연 발생적 VH 및 VL 항체 가변 도메인의 CDR3 부위에 상응하는 위치에 CDR3이 존재하는 항체 중 또는 경사슬 서열 또는 이의 실질적인 부분에 대한 것이다. 면역글로불린 가변 도메인의 구조 및 위치는 Kabat, E. A., 등의 Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4th Edition, US Department of Health and Human Services, (1987), 및 현재는 인터넷으로 이용할 수 있는 이의 최신 판 (http://immuno.bme.nwu/edu))을 참조함으로써 결정될 수 있다.

도 1a의 잔기 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 바와 같은 아미노산 서열은 CDR3로서 인간 중사슬 가변 도메인 또는 이의 실질적인 부분에 포함될 수 있고, 도 1c의 잔기 110 내지 118로서 실질적으로 설정된 바와 같은 아미노산 서열은 CDR3로서 인간 경사슬 가변 도메인 또는 이의 실질적인 부분에 포함될 수 있다.

상기 가변 도메인들은 임의의 미생물 라인이나 재배치된 인간 가변 도메인으로부터 유도될 수 있거나 또는 공지된 인간 가변 도메인의 콘센서스 서열에 기초한 합성 가변 도메인일 수 있다. 본 발명의 CDR3-유도 서열은 재조합 DNA 기술을 사용하여, CDR3 부위가 결여된 가변 도메인의 멤버로서 가입될 수 있다.

예를 들어, Marks 등 (Bio/Technology 10: 779-783 (1992))은 가변 도메인 지역의 5’ 말단에 또는 그 근처에 지정된 콘센서스 프라이머들을 인간 VH 유전자등의 제 3 골격 부위에 대한 콘센서스 프라이머와 연계하여 사용하여 CDR3가 결여된 VH 가변 도메인 군을 제공하는, 항체 가변 도메인 군을 생성하는 방법을 설명하고 있다. Marks 등은 또한 이러한 일 단의 가변 도메인을 어떻게 특정 항체의 CDR3과 조합하는 가에 대해 설명하고 있다. 유사한 기술을 사용하여, 본 발명의 CDR3-유도 서열을 CDR3이 결여된 일단의 VH 또는 VL 도메인과 섞을 수 있고, 섞여진 완전한 VH 또는 VL 도메인을 원래 VL 또는 VH 도메인과 조합하여 본 발명의 특이적 결합 구성체를 제공할 수 있다. 다음 이러한 일단의 구성체를 W092/01047의 파지 표현 시스템과 같은 적절한 숙주 시스템에서 표현시켜 적합한 특이적 결합 구성체를 선택할 수 있다. 구성체의 일단은 104 개의 구성체 이상, 예를 들어, 106 내지 108 또는 1010 구성체로부터 선택된 임의의 것으로 구성될 수 있다.

유사한 뒤섞기 또는 조합 기술은 또한 β-락탐메이즈 유전자와 관련하여 기술을 서술하지만 항체의 생성에 이러한 방법이 사용될 수 있다고 내다본 Stemmer (Nature 370:389-391 (1994))에 의해 또한 밝혀졌다.

다른 방법은 SC104 VH 또는 VL을 랜덤 돌연변이화하여 전체 가변 도메인 내에서 돌연변이가 일어나게 함으로써 본 발명의 CDR3-유도 서열을 가지는 신규한 VH 또는 VL 부위를 생성하는 것이다. 그러한 기술은, 에러-경향 (error-prone) PCR을 사용하는 것으로, Gram 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 3576- 3580 (1992))에 의해 설명된 것이다.

사용될 수 있는 다른 방법은 VH 또는 VL 유전자의 CDR 부위에 돌연변이를 지정하는 것이다 그러한 기술은 Barbas 등 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91: 3809-3813 (1994)) 및 Schier 등 (J. Mol. Biol. 263: 551-567 (1996))에 의해 개시되어 있다.

면역글로불린 가변 도메인의 실질적인 부분은 일반적으로 적어도 세 개의 CDR 부위와 함께 그들의 간섭 골격 부위 (intervening framework region)도 포함한다. 그 부분은 또한 제 1 및 제 4 골격 부위 중 하나 또는 둘 다를 적어도 약 50%를 포함하고, 이 50%는 제 1 골격 부위의 C-말단 50% 및 제 4 골격 부위의 N-말단 50%이다. 상기 가변 도메인의 실질적인 부분의 N-말단 또는 C-말단부는 자연 발생되는 가변 도메인 부위와 정상적으로 연합되어 있지 않는 것일 수 있다. 예를 들어, 재조합 DNA 기술로써 본 발명의 특이적 결합 구성체를 제조하는 것은, 클로닝 또는 다른 조작 단계를 용이하게 하기 위해 도입된 링커에 의해 암호화된 N- 또는 C-말단 잔기의 도입, 즉 하기에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 면역글로불린 중사슬, 다른 가변 도메인 (예를 들어, 다이아바디의 생성에), 또는 단백질 표식자 를 포함하는 추가의 단백질 서열에 본 발명의 가변 도메인을 연결시키는 링커의 도입을 결과하게 된다.

본 발명의 일 구체예는 도 1a 및 1c에서 실질적으로 설정된 바와 같은 VL 및 VH 부위에 대한 아미노산 서열, 즉, 도 1a의 아미노산 19 내지 138 및 도 1c의 아미노산 23 내지 128에 기초한 결합 도메인 쌍을 포함하는 특이적 결합 구성체를 제공한다. 이러한 서열들 중 어느 하나에 근거한 단일 결합 부위는 본 발명의 또 다른 관점을 형성한다. 도 1a에서 실질적으로 설정된 아미노산 서열에 근거한 결합 도메인의 경우, 면역글로불린 VH 도메인이 특이적 방식으로 표적 항원을 결합할 수 있다고 알려져 있기 때문에 그러한 결합 도메인을 표적 제제로서 사용할 수 있다.

상기 단일 사슬 특이적 결합 도메인들의 어느 하나의 경우에, 이러한 도메인들이 본 명세서에서 개시된 SC104 항체와 동일하거나 그만큼의 세포 내 특성을 가지는 두 개-도메인 특이적 결합 구성체를 형성할 수 있는 상보성 도메인에 대하여 검색하는데 사용될 수 있다.

이것은 W092/01047에서 설명된 바와 같이, H 또는 L 사슬 클론을 포함하는 개별 콜로니를 사용하여 나머지 다른 사슬 (L 또는 H)을 암호화하는 클론들의 완전한 라이브러리를 감염시키고 결과된 두-사슬 특이적 결합 구성체를 동일 참고 문헌에 서술된 것과 같은 파니 디스플레이 기술에 따라 선택하는, 소위 계급적 이중 조합 방식 (hierarchical dual combinatorial approach)를 사용하는 파지 디스플레이 스크리닝 방법으로 성취될 수 있다. 이러한 기술은 또한 전술한 Marks 등의 문헌에서 설명되어 있다.

본 발명의 특이적 결합 구성체는 항체 불변 영역 또는 이의 부분을 더 포함할 수 있다.

예를 들어, 도 1c에 나타난 VL 부위에 근거한 특이적 결합 구성체는 그것들의 C-말단부에서 인간 Cκ 또는 Cλ 사슬을 포함하는 항체 경사슬 불변 도메인에 부착될 수 있다. 유사하게, 도 1a 또는 1b에 나타난 VH 부위에 근거한 특이적 결합 구성체는 그것들의 C-말단부에서 임의의 항체 이소타입, 즉 IgG, IgA, IgE 및 IgM 및 이 이소타입의 임의의 부차 종류, 특히 IgGl 및 IgG4로부터 유도된 면역글로불린 중 사슬의 전체 또는 부분에 부착될 수 있다.

SC104는 종양 세포주의 사멸을 현탁액 상으로 야기하고 결장 종양 및 흩어진(disaggregated) 종양조직으로부터 유도된 세포에서 어팝토시스 또는 세포 예정사 (programmed cell death)의 특이적 개시를 야기하는 것으로 밝혀져 있다. 따라서, 본 발명의 특이적 결합 구성체를 종양의 성장을 저해하거나 종양에서 어팝토시스를 유도하는 치료제로서 사용될 수 있다. 어팝토시스는 세포가 활성적으로 자살하는 과정이다. 어팝토시스는 정상적인 발달의 여러 관점에 있어서 필수적인 것이고 조식 항상성을 유지하는데 요구되는 것으로 충분히 인지되어 있다. 그러나, 가끔, 세포예정사로 지칭되는, 자살에 의한 세포사는 유기체의 생명보존에 위협이 되는 세포를 파괴하는데 필요하다. 세포가 어팝토시스에 의해 자살하게 되는 두 가지 상이한 기작이 있다. 하나는 세포 내로부터 일어나는 신호에 의해 개시되는 것이고, 나머지 하나는 세포 표면에서 수용체와 결합하는 외부 신호 9즉 분자)에 의한 것이다.

본 발명의 특이적 결합 구성체는 인간 또는 동물 대상체에서 종양의 진단과 치료 방법에 사용될 수 있다.

진단에 사용시, 본 발명의 특이적 결합 구성체는, 항체 이미지화 분야에 공지된 통상적인 화학 기술을 사용하여, 본 발명의 특이 결합 구성체에 부착될 수 있는, 검출 가능한 표식자, 예를 들어, 131I 또는 99Tc와 같은 방사성 표식자로 표식될 수 있다 표식자는 또한 서양 고추냉이 페록시다제 (horseradish peroxidase)와 같은 효소 표식자를 포함한다. 표식자는 비오틴과 같은 화학 분체를 더 포함하고, 이는 특이적 동족계열의 검출가능한 분체, 즉 표식된 아비딘과의 결합을 통해 검출될 수 있다.

비록 본 발명의 특이적 결합 구성체가 자체적으로 암 세포를 살해하는데 효과적이라는 것이 나타난다고 할 지라도, 그것들은 추가로 기능성 표식자로 표식될 수 있다. 기능적 표식자는 암의 파괴를 야기하도록 암 부위로 겨냥하도록 고안되어 있는 물질을 포함한다. 그러한 기능성 표식자는 리신과 같은 독소, 약물전구체를 활성 약물로 변환시킬 수 있는 박테리아성 카르복시펩티다제 또는 니트로리덕타제와 같은 효소를 포함한다. 또한, 상기 특이적 결합 구성체는 칼리케아미신 (calicheamicin)과 같은 화학치료제 (chemotherapeutic) 또는 세포독성 제제, 또는 90Y 또는 131I와 같은 방사성 표식자에 부착되거나 다르게는 연합되어 있을 수 있다.

더욱이, 본 발명의 특이적 결합 구성체는 치료될 증상에 따라서, 단독으로, 또는 다른 치료제와 조합하여 동시에 또는 연속적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 특이적 결합 구성체 및 종양의 치료에 동시에, 분리적으로 또는 연속적으로 사용되는 조합된 제조물로서 활성제를 포함하는 생성물을 또한 제공한다. 활성 제제는 5-플루오로우라실 (5-Fluorouracil), 시스플라틴(cisplatin), 미토마이신 (Mitomycin) C, 옥살리플라틴 (oxaliplatin) 및 타목시펜 (tamoxifen)을 위시한, 본 발명의 결합 구성체와 협력적으로 작용할 수 있는 화학치료제 또는 세포 독성제를 포함할 수 있다. 다른 활성 제제는 비-스테레오성 항-염증성 약물 (예를 들어, 파라세타몰 (paracetamol), 이부프로펜 (ibuprofen) 또는 케토프로펜(ketoprofen)과 같은 진통제 또는 모르핀이나 항구토제와 같은 아편제의 적절한 양을 포함할 수 있다.

이론에 얽매이지 않게 되길 바라는 바, 본 발명의 결합 구성체가 상기 활성 제제와 협력하여 종양 살해를 향상시키는 능력은 면역 효능자 (effector) 기작에 의한 것이 아니라, 표면에 결합된 시알릴테트라오실 카보하이드레이트에 결합하는 결합 구성체의 직접적인 결과일 수 있다. .

본 발명의 특이적 결합 구성체는 상기 특이적 결합 구성체에 더하여 적어도 하나의 성분을 포함할 수 있는 약학적 조성물의 형태로 통상 투여될 것이다. 상기 약학적 조성물은 활성 성분에 더하여, 약학적 허용 부형제, 희석제, 담체, 완충제, 안정제, 또는 당해 분야의 숙련자에게 공지된 다른 물질을 포함할 수 있다. 그러한 물질들은 비독성이어야하고 활성 성분의 효능을 방해하지 않아야 한다. 담체 및 다른 물질의 정확한 성질은 경구 또는 주사, 예를 들어, 정맥 주사일 수 있는 투여 경로에 의존한다.

비록 카테터나 다른 외과적 튜브를 통한 전달이 또한 사용된다고 할지라도, 주사는 조성물의 치료적 투여에 대한 일차적인 경로가 될 것으로 보인다. 특정의 적합한 투여 경로는 정맥내, 피하내, 근육내 투여를 포함한다. 분말 제형으로부터 제 구성된 액체 제형이 이용될 수 있다.

정맥내 투여 또는 감염 부위에로의 주사를 위해, 활성 성분은 발열원이 없고 적절한 pH, 등장도 및 안정성을 가지는 비경구적으로 허용된 수용액의 형태로 있을 수 있다. 당해 분야의 관련 기술자는 예를 들어, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 락테이트화된 링거 주사액과 같은 등장성 담체를 사용하여 적절한 용액을 제조할 수 있을 것이다. 방부제, 안정제, 완충제, 항산화제 및/또는 다른 첨가제를 필요시 포함할 수 있다.

경구 투여용 약학 조성물은 정제, 캡슐, 분말 또는 액체 제형으로 있을 수 있다. 정제는 젤라틴 또는 보조제와 같은 고형 담체를 포함할 수 있다. 액체 약학 조성물은 일반적으로 물, 광유, 동물성 또는 식물성 오일, 미네랄 오일 또는 합성 유와 같은 액체 담체를 포함한다. 생리적 식염액, 덱스트로즈 또는 다른 당 용액 또는 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜류를 포함할 수 있다. 제형이 액체인 경우, 예를 들어 pH 6.8-7.6인 비-인산 완충액 또는 동결건조된 분말을 포함하는 생리적 염용액일 수 있다.

상기 조성물은 혈액을 위시한 특정 조직에 놓여 지는, 미소구체, 리포좀 다른 미소입자성 전달 시스템 또는 서방성 제형을 통해 투여될 수 있다. 서방성 담체의 적절한 예는 반투과성 중합체 매트릭스를 공유된 물품의 형태로, 예를 들어 좌 약 또는 미소 캡슐 형태로 포함한다. 이식성 또는 미소캡슐형 서방성 매트릭스는 폴리락타이드류 (미국 특허 3,773,919; EP-A-0058481), L-글루탐 산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체 (Sidman 등, Biopolymers 22 (1): 1985), 폴리(2-하이드록시에틸-메타클릴레이트) 또는 에틸렌 비닐 아세테이트 (Langer 등, J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277, 1981, 및 Langer, Chem. Tech. 12:98-105, 1982)을 포함한다. 상기 폴리펩타이드류를 포함하는 리포좀은 공지된 방법으로 제조된다: DE3,218, 121A; Epstein 등, PNAS USA, 82: 3688-3692, 1985; Hwang 등, PNAS USA, 77: 4030-4034, 1980; EP-A-0052522; E-A-0036676; EP-A-0088046; EP-A- 0143949; EP-A-0142541; JP-A-83-11808; 미극 특허 4,485,045 및 4,544,545. 보통, 상기 리포좀은 지질 내용물이 콜레스테롤보다 약 30몰% 더 큰, 작은 (약 200-800 옹스트롬) 단일 박판 형태로서, 상기 선택된 비율은 최적의 폴리펩타이드 누출속도에 맞춰진다.

상기 조성물을 종양 부위 또는 다른 바람직한 부위에 국소적 방식으로 투여되거나, 종양 또는 다른 세포를 표적하는 방식으로 전달될 수 있다.

상기 조성물은 개인에게 혜택을 나타내기에 충분한 “치료적으로 유효한”양으로 개인에게 투여되는 것이 바람직하다. 투여된 실제 양, 및 투여의 속도 및 시간 경과 양태는 치료되는 실체의 특성 및 심각성에 좌우된다. 치료의 처방, 즉 투약량의 결정 등은 일반 개업의 및 다른 의사들의 책임 내에 있고, 통상 치료될 질환, 환자 개인의 상태, 전달 부위, 투여 방법 및 의사에게 알려진 다른 요소를 고려한다. 본 발명의 조성물은 특히 존재하는 종양 특히 암의 치료, 및 처음 치료 또 는 수술 후 그러한 조건의 재발을 방지하는 것과 관련이 있다. 전술한 기술 및 지침의 예는 Remington's Pharmaceutical Sciences, 16 판, Oslo, A. (ed), 1980에서 찾을 수 있다.

최적의 투약량은 예를 들어, 나이, 성별, 체중, 치료될 상태의 심각성, 투여될 활성성분 및 투여 경로를 위시한, 수많은 변수에 기초하여 의사에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로, 폴리펩타이드류 및 항체의 혈액 농도가 수용체를 포화시키는 것이 바람직하다. 약 0.1 nM보다 초과하는 농도로 되는 것이 일반적으로 충분한 것으로 된다. 예를 들어, 항체의 100 mg/m² 의 투여량은 약 8일에 걸쳐 약 20nM의 혈액 농도를 나타낸다.

대략적인 가이드라인으로서, 항체의 투여량은 일 주간 10-300 mg/m²의 양으로 제시된다. 동등한 투여량의 항체 분체를 더 빈번한 주기로 사용하여 혈액 농도를 시알릴테트라오실 카보하이드레이트의 포화를 나타내는 농도보다 초과하여 유지시켜야 한다.

의사의 숙련 기술내에 있는 바와 같이, 조성물의 투여량은 결합 구성체의 특성, 즉, 결합 능력과 생체내 혈장 반감기, 제형에서의 폴리펩타이드의 농도, 투여 경로, 투약 위치 및 속도, 관련 환자의 임상적 허용치, 환자 증상의 병원론적 상태 등에 의존한다. 예를 들어, , 비록 투약이 일회 투여당 10 μg 내지 6 mg 범위일 지라도, 한 환자에 일회 투여당 300 μg의 항체 투여량이 바람직하다. 연속적인 접종 시는 상이한 투여량이 사용된다: 의사는 시초 접종량을 투여한 다음 상대적으로 더 적은 투여량의 항체로 증폭시킬 수 있다.

본 발명은 또한 암에 대하여 예방적인 면역 반응을 증강시키는 면역화 스케줄을 최적화시키는 것에 관한 것이다.

본 발명의 결합 구성체는 전부 또는 부분적으로 화학 합성에 의해 생성될 수 있다. 결합 구성체는 공지된, 표준 액체, 또는 바람직하게는 고상 펩타이드 합성 방법에 따라 용이하게 제조될 수 있고, 이의 일반적인 설명은 여러 곳에서 얻을 수 있다 (참고, 예를 들어, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984)에서, M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984)에서; 및 Applied Biosystems 430A Users Manual, ABI Inc., Foster City, California에서), 또는 그것들은 액상 방법에 의해서 또는 고상, 액상 및 용액 화학에 의해서, 즉 먼저 각각의 펩타이드 부분을 완성하고 다음으로, 필요하고 적절할 때, 임의의 존재하는 보호기를 제거한후 각 카르본 또는 황산 또는 이의 반응성 유도체의 반응에 의해 잔기 X를 도입함으로써, 용액에서 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 결합 구성체를 생성하는 다른 편리한 방법은 발현 시스템에서 핵산을 사용하여 이를 암호화하는 핵산을 발현하는 것이다.

본 발명은 본 발명의 특이적 결합 구성체를 암호화하는 분리된 핵산을 제공한다. 핵산은 DNA 및 RNA를 포함한다. 바람직한 관점에서, 본 발명은 상기 정의한 바와 같은 본 발명의 특이적 결합 구성체를 암호화하는 핵산을 제공한다. 그러한 핵산은 도 1a, 1b 및 1c에 도시되어 있다. 기술자는 그러한 핵산에 대하여 치환, 결실 및/또는 첨가를 결정할 수 있고, 이것은 여전히 본 발명의 특이적 결합 구성체를 제공하게 될 것이다.

본 발명은 또한 전술한 바와 같은 적어도 하나의 핵산을 포함하는 플라즈미드, 벡터, 전사 또는 발현 카세트의 형태로 작제물을 제공한다. 본 발명은 또한 전술한 바와 같이 하나 이상의 작제물을 포함하는 재조합 숙주 세포를 제공한다. 언급한 바와 같이, 암호화하는 핵산서열로부터 발현하는 것을 포함하는 특이적 결합 구성체를 생성하는 방법이 그런 것 처럼, 본 발명의 특이적 결합 구성체를 암호화하는 핵산은 본 발명의 관점을 형성한다. 발현에 의한 생성 후, 특이적 결합 구성체는 임의의 적절한 기술을 사용하여 분리 및/또는 정제되어 적절할 때 사용될 수 있다.

클로닝하고, 다양한 상이한 숙주 세포에서 폴리펩타이드를 발현하는 시스템은 공지되어 있다. 적절한 숙주 세포는 박테리아, 포유동물 세포, 효모 및 바큘로바이러스 (baculovirus) 시스템을 포함한다. 이형 폴리펩타이드의 발현 분야에 이용가능한 포유동물 세포주는 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포, HeLa 세포, BHK (baby hamster kidney) 세포, NSO 마우수 흑색종 세포 및 많은 다른 것들을 포함한다. 일반적으로 바람직한 박테리아 숙주는 E. coli이다. E. coli와 같은 원핵 세포에서, 항체 및 항체 분체를 발현하는 것은 당해 분야에서 잘 확립되어 있다. 리뷰를 위해, 예를 들어 Pluckthun, Bio/Technology 9: 545-551 (1991)을 참조할 수 있다. 특이적 결합 구성체의 생성에 대한 택일적 조건으로서, 배양 상태의 진핵 세포에서 의 발현 또한 당해 기술 분야의 숙련자에게 이용가능하고, 이는 최근 리뷰로, Reff, Curr. Opinion Biotech. 4: 573-576 (1993); Trill et al., Curr. Opinion Biotech. 6: 553- 560 (1995)을 참조할 수 있다.

프로모터 서열, 종결자 서열, 폴리아데닐화 서열, 인핸서 서열, 표식자 유전자 및 적절한 다른 서열들을 위시한 적절한 조절 서열을 포함하는 적절한 벡터를 선택하거나 작제할 수 있다. 벡터는 적절한 플라즈미드, 바이러스, 예를 들어, 파지 또는 파지미드일 수 있다. 좀 더 상세한 것은 Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual: 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)을 참조할 수 있다. 핵산의 조작에 대한 공지된 많은 기술과 방법, 예를 들어, 핵산 작제물의 제조, 돌연변이 발생, 시퀀싱, 세포 내로 DNA 도입, 유전자 발현 및 단백질 분석은 Ausubel 등, eds., Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Edition, John Wiley & Sons (1992).에 상세히 설명되어 있다.

따라서, 본 발명의 또 다른 관점은 본 명세서에서 개시된 바와 같이 핵산 서열을 함유하는 숙주 세포를 제공한다. 또 다른 관점은 그러한 핵산을 숙주 세포로 도입하는 것을 포함하는 방법을 제공한다. 이러한 도입은 임의의 이용가능한 기술을 사용할 수 있다. 진행 세포에 대해서는, 적절한 기술은 칼슘 포스페이트 형질 도입, DEAE-덱스트란, 전기천공법, 리포좀-매개 형질 도입, 및 레트로바이러스 또는 백시니아와 같이 다른 바이러스를 사용하는 형질유도를 포함할 수 있고 곤충 세포를 위해서는 바큘로바이러스를 사용할 수 있다. 박테리아 세포의 경우, 염화 칼슘 형질전환, 전기천공법 및 박테리오파지를 이용한 형질감염을 포함한다. 상기 도 입 후에는 핵산으로부터의 발현을 야기하거나 허용, 즉 유전자의 발현 조건하에서 숙주 세포를 배양한다.

일 구체예에서, 본 발명의 핵산은 숙주 세포의 게놈에 통합된다. 통합은 표준 기술에 따라서, 게놈과의 재조합을 촉진하는 서열을 포함함으로써 촉진될 수 있다.

본 발명은, 특이적 결합 구성체 또는 전술한 바와 같은 폴리펩타이드를 발현하기 위해, 발현시스템에서 전술한 바와 같이 작제물을 사용하는 것을 포함하는 방법을 또한 제공한다.

다른 각각의 관점에 대하여, 본 발명의 각 관점의 바람직한 특성은 필요시 변경된다. 본 명세서에서 언급된 선행 기술 문헌들은 법률에 의해 허용되는 최대 한도로 편입되어 있다.

실시예

본 발명은 하기 비제한적 실시예를 통해 더욱 설명될 것이다.

첨부된 도면을 참조하면:

도 1a는 SC104 항체 중사슬 가변 도메인과 일 부분 불변 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 나타내며, 도 1b는 도 la에서 밑줄친 것과 동일한 서열을 나타내고 있으나 Kabat 넘버링 시스템을 사용하였고, 및 도 lc는 SC104 항체 경 사슬 가변 도메인과 일부분 불변 영역의 핵산 및 아미노산 서열을 나타낸다. 도 ld는 형질감염된 세포주에 의해 생성된 SC104 항체의 키메릭 변형체가 표적 세포주에 결합하는 것을 증거하고 있다.

도 2a는 일 단의 세포주 (Colo205, C170, MCF-7, MDA-231, MDA-435, T47D, ZR75, MKN45, RID9, T24, A431, PA1 및 OAW28 (ECACC로부터 수득))에 SC104가 결합하는 것을 증명하는 그래프이다. 세포들은 ELISA로 염색되었고 결과들은 각 세포주에 대하여 흡광도 (405nm)로서 표시된다. 도 2b는 하기 세포주에 SC104가 결합하는 것을 증명하는 그래프이다: C170, HT-29, LoVo, Colo205, MKN45, RID9 및 A431. 세포들은 간접 면역형광법 (indirect immunofluorescence)으로 염색되었고 유세포 분석기 (flow cytometry)로 분석하였다. 결과는 각 세포주에 대하여 X-평균으로서 표시된다. SC101/29는 양성 대조군으로서 Scancell에 의해 공급되며 Lewis^{y /b}를 인지한다. 이소타입된 상응 항체를 음성 대조군으로 사용한다.

도 3은 간접 면역형광법으로 평가하고 유세포 분석기로 분석한 결과 갓 해체된 결장 종양 세포에 단일 클론성 항체가 결합하는 것을 증명하는 그래프이다. 각 점은 개별 종양에 대한 평균 형광을 가르킨다.

도 4는 정제된 CEA, C14 항원 및 종양 당지질 추출물에 대한 SC104 mab의 결합을 증명하는 그래프이다. C14 항원 (C14 단일클론성 항체 상에서 친화력 크로마토그래피를 사용하여 침으로부터 정제된 90KD의 당단백질), CEA (365 mab을 사용한 친화력 크로마토그래피로써 결장 종양 생 메타스타제 (metastase)로부터 정제된 180KD의 당단백질) 및 당지질 추출물 (결장 종양으로부터 3:1 메탄올 클로로포름 w/v을 사용하여 추출한 당지질)을 마이크로타이터 플레이트 상에서 37℃로 밤새 항 온처리하여 건조시켰다. SC104 mab의 결합을 ELISA로 분석하였고 결과를 흡광도 405nm로서 표시하였다. SC101 및 항-CEA 항체를 양성 대조군으로 사용한다.

도 5는 HPTLC 플레이트를 나타내는 것으로서, A. 36 ml 베드 체적 컬럼으로부터 수집된 분획물의 SC104 면역염색. 레인 W는 분획화 전의 전체 C170 추출물이다. 수집된 첫 번 6 x 10 ml 분획물들을 레인 1 내지 6에 부여한 반면 마지막 14개 레인들은 수집된 후속 14 x 3 ml 분획물을 나타낸다. SC104 항원은 R_F 0.53을 가지며, 분획 6에 위치될 수 있다. B. 이차 항체만의 결합이 SC104에 특이적이라는 것을 가르키는 아무런 밴드도 보여주지 않는다.

도 6은 (A) R_F 0.50 및 0.61 사이의 R_F 값을 가지는 세 개 밴드를 드러내는 분획 6의 오르시놀 염색. (B) 동일한 분획물을 SC104 면역염색하여 R_F 0.36과 0.39 사이의 세 개 밀집 밴드를 나타내는 것을 보이는 HPTLC 플레이트이다.

도 7은 전체 C170 추출물 (레인 W), 분획 6 (레인 6) 및 탈-글리코실화된 지질 (레인 L)의 SC104 면역 염색을 보여주는 HPTLC 플레이트이다. 항원은 전체 추출물 및 분획 6 (R_F 0.38 내지 0.46)에서 관찰되지만, 세라마이드 글리카나제에 의한 탈-글리코실화 후에는 지질 분획에서 더 이상 검출되지 않았다.

도 8은 부분적으로 정제된 SC104 면역염색을 나타내는 HPTLC 플레이트이다. 연필로 표시된 것은 요오드 증기 염색에 의해 검출된 지질의 위치를 가르킨다. 레인 1 및 2는 각각 수성 및 유기상으로 분리후 세라마이드 글리카나제 처리된 항원을 함유한다. 배출된 올리고당류는 수성상으로 분할되고 자유 지질들은 유기상으로 분할된다. 임의의 미처리 당지질은 전체적인 극성에 따라서 어느 한 쪽의 상으로 분할될 것이다. 레인 3 및 4는 세라마이드 글리카나제의 부재 하에서 동일하게 수성 및 유기 분할된 분획이다. 항원은 탈-글리코실화 전에 검출되지만 (R_F 0.48 및 0.40), 올리고당 제거후에는 안된다.

도 9는 SC104 면역염색 (A) 및 C170 세포로부터 얻은 단순한 (레인 S), 당지질 (레인 G), 및 인지질 (레인 P) 분획의 오르시놀 염색 (B)을 나타내는 HPTLC 플레이트이다. 항원은 단순 및 인지질 분획 (R_F 0.54, 0.51 및 0.41)에서 검출되나 중성 당지질 부분에서는 안된다. 오르시놀 염색하면, 두 개의 구별된 밴드가 인지질 분획 (R_FF 0.54 및 0.51)에서 항원과 같이 이동하는 것으로 나타난다.

도 10은 오르시놀 (A) 또는 SC104 면역염색 (B) 한 후 전체 C170 지질 추출물의 이차원적 HPTLC 플레이트를 나타낸다. 제 1 차원은 50:40:10 클로로포름:메탄올:CaCl2 (0.5% w/v)에서 전개되었고 및 제 2 차원은 10:4:2:2:1 클로로포름:아세톤:메탄올:아세트 산:물에서 전개되었다. 항원은 제 1 차원에서 R_F 0.48으로써 이동하나 2 차원으로는 이동하지 않는다. 오르시놀 염색 밴드는 다시 항원과 같이 이동하는 것으로 나타난다.

도 11은 뉴라미니다제 (neuramidase) 절단에 의한 탈-시알릴화된 (레인 1과 2) 및 탈-시알릴화가 없이 (레인 3) 항원의 SC104 면역염색을 나타내는 HPTLC 플레이트이다. 탈-시알릴화는 약한 극성 (R_F 0.46) 클러스터에서는 더 강한 염색을 및 강한 극성 (R_F 0.62) 클러스터에서는 염색 감소를 결과하였다.

도 12는 실리카 컬럼으로부터 얻은 C170 지질 분획의 HPTLC 플레이트를 나타내고 있다. 플레이트를 SC104 (A), 이차 항체 만 (B) 또는 오르시놀로 염색된 이차 항체 (C) 또는 닌히드린으로 염색된 이차 항체 (D)로 탐침하였다. 항원은 전체 추출물에서 (레인 W), 및 시알릴화된 당지질 분획에서 (레인 N1, N2 및 N3) 검출되었다. 아무런 항원이 단순 (레인 S) 또는 인지질/중성 당지질 분획 (레인 P)에서 발견되지 않았다.

도 13은 SC104 항원이 SC104와 교차 반응을 하는 것으로 나타나는 반면, 항-시알릴 Lewis^a (임상 잠재력에 대하여 이전에 평가된 생체분자) 또는 19/9 항체와는 교차 반응하지 않는다는 것을 증명하는 그래프이다.

도 14는 SC104-Protein A 세파로즈 컬럼을 사용하여 얻어진 SC104 면역-정제 항원에 대한 밴드가, 은 염색된 젤 상에서 확인시 50-75 Kda 사이에 존재한다는 것을 나타내고 있다.

도 15는 C170 세포에 결합하는 것에 대해 SC104 비오틴과 경쟁하는, 가래로부터 얻은 정제된 SC104 분획을 나타낸다.

도 16은 C170 종양 세포에 대한 SC104 또는 대조군 791T/36 항체의 효과를 나타내는 막대그래프이다. 세포들은 FITC 표지된 아넥신(annexin) 및 요오드화 프로피디움(propidium iodide)으로 염색한 다음 이중 색깔 유세포 분석기로 분석하였다. 결과는 아넥신, PI 또는 둘 다로 염색되는 세포의 %로 표시된다. SC101/29는 양성 대조군으로 포함된다.

도 17은 부착(adherent) C170세포에 6시간 노출 후 판 카스파제 (pan caspase)의 FITC-z-FMK-vad 활성화를 나타내는 그래프이다. 결과는 X-평균으로 표시된다.

도 18은 SC104 항체로 처리된 부착 세포 상에서 카스파제 6 활성화를 증명한다. SC101 항체 처리된 세포는 음성대조군으로 포함된다.

도 19는 SC104 처리된 세포 (A)가 또한 3μM z- FMK-vad 저해체 (B)에 또한 노출될 때, 세포사가 유의하게 감소될 수 있는냐를 아넥신 V FITC 및 요오드화 프로피디움을 사용하여 분석한 것을 나타내고 있다

도 20은 일 군의 종양 세포들(Colo205, C170, HT29 및 LoVo)이 SC104 및 SC101/29에 노출시 %생존도(viability) (약물에 노출된 세포의 수/대조군에 노출된 세포의 수)를 나타내는 그래프이다. 살아있는 세포의 수는 MTS 및 490nm에서의 광학 밀도 판독값에 의해 결정되었다.

도 21은 MTS 및 490nm에서의 광학밀도 판독에 의해 결정시, 통상적인 세포 생존 결과 (% 생존도 = 약물에 노출된 세포의 수/대조군에 노출된 세포의 수)로부터 외삽된, 종양 세포주 C170, Colo205, HT-29 및 LoVo에 대한 IC50 를 나타낸다.

도 22는 셀픽스(Cellfix) 또는 글루타르알데하이드에 의한 종양 세포 고정화는 배지 단독에서 미처리된 것들과 비교하여 종양 세포주 C170에 대한 항체의 결합을 유의하게 변경시키지 않는 다는 것을 나타내는 그래프이다. 세포는 간접 면역형광법으로 염색하였고, 유세포 분석기로 분석하였으며 결과는 평균 선형 형광값으 로 표시된다.

도 23a는 항원의 부재하에서 SC104 친동종 (homophilic) 특성으로 결합하지 않는다는 것을 나타낸다. 마이크로타이터 플레이트를 SC104 항체의 농도를 증가시키기 전에 염소 항-마우스 IgG Fc 특이성 항체로 코팅하였다. 결합된 SC104 항체를 염소 항-마우스 고추냉이 페록시다제 및 TMB를 사용하여 ELISA로 검출하였다. SC104가 그 자체에 결합할 수 있는가를 결정하기 위해 SC104 비오틴을 첨가하고 그 결합을 SA-HRP/TMB로 검출하였다. 대조군은 SA-HRP/TMB로 검출되지 못하는 SC104를 포함하였고, 그러나 SC104 및 SC104 비오틴 둘다는 염소 항-마우스 HRP로 검출될 수 있었다. 결과는 570nm에서의 흡광도로 표시된다. 도 23b는 SC104가 C14 항원 존재하에서 친동종 행태로 결합하는 것을 나타낸다. 플레이트를 C14 항원으로 코팅하고 SC104를 각 웰의 항원에 첨가하였다. 이것을 염소 항-마우스 HRP/TMB로 확인하였다. 다음 SC104 비오틴을 농도를 증가시키면서 첨가하고 결합을 SA-HRP/TMB로 검출하였다. 결과는 650nm에서 흡광도로서 표시한다.

도 24는 세포에 대한 5-플루오로우라실 및 SC104 항체의 효과를 증명하는 그래프이다. C170 세포를 SC104 또는 대조군 791T/36 항체 (미도시) 및 5-FU에 노출시켰다. 세포의 수를 MTS 및 490nm에서의 광학밀도 측정값으로 결정하였다.

도 25는 C170 세포에 대하여5-FU, 시스플라틴(Cisplatin), 미토마이신(Mitomycin) C, 올살리플라틴 (Oxaliplatin) 및 타목시펜 (Tamoxifen) 단독 또는 SC104 항체와 조합하여, 또는 SC104 항체 단독의 효과를 나타내는 그래프이다.

도 26은 누드 마우스에서 자라는 C170 이종이식편의 성장에 대하여, SC104, 5-FU/류코보린(leucovorin) 및 SC104와 5FU/류코보린의 조합물의 효과를 나타내는 그래프이다. a) 동물을 SC104 복강내 주사 (0.2mg), 대조군 항체 복강내 주사 (0.2mg) 및 5-FU/류코보린 (12.5mg/Kg 정맥내 주사) 또는 SC104 복강내 주사 (0.2mg) 및 5-FU/류코보린 (12.5mg/Kg 정맥내 주사)으로 실험 1, 3, 5, 7, 21, 22일째에 처리할 때 C170 이종이식편의 단면적을 측정(mm)함으로써 이종이식편의 성장을 실험 7, 9, 12, 14 및 16일째에 측정하였다. b) C170 이종이식편을 발현하는 누드 마우스의 성장에 대하여 SC104, 5-FU/류코보린 또는 SC104과 5-FU의 효과를 나타내는 생존 그래프이다. 동물들을 실험 1, 3, 5, 7, 21, 22일째에 SC104 복강내주사 (0.2mg), 대조군 항체 복강내 주사 (0.2mg)와 5-FU/류코보린 (12.5mg/Kg 정맥내주사) 또는 SC104 복강내 주사 (0.2mg) 및 5FU/류코보린 (12.5 mg/Kg 정맥내 주사)로 처리하였다 c) 실험 1, 3, 5, 7, 21, 22일 째에 SC104 복강내 주사 (0.2mg), 대조군 항체 복강내 주사 (0.2mg) 및 5-FU/류코보린 (12.5mg/Kg 정맥내 주사) 또는 SC104 복강내 주사 (0.2mg) and 5- FU/류코보린 (12.5mg/Kg 정맥내 주사)로 처리한 후 동물의 무게를 실험 7, 14, 21, 28 및 36일째에 측정하였다.

도 27은 누드 마우스에서 자라는 C170 이종이식편의 성장에 대하여, SC104, 5 FU/류코보린 및 SC104 과 5FU/류코보린의 조합물의 효과를 나타내는 그래프이다. 실험 1, 3, 5, 7, 21, 22일째에 마우스를 %FU/류코보린 25mg/Kg 정맥내 주사로 처리하였고 실험 5일째에 시작하여 일주일 세번씩 SC104 항체 (0.2mg)로 처리하였다. 동물을 SC104 복강내 주사 (0.2mg), 대조군 항체 복강내 주사 (0.2mg)와 5FU/류코보린 또는 SC104 복강내주사 (0.2mg)와 5FU/류코보린으로 처리할 때, 실험 7, 9, 12, 14 및 16일째에 C170 이종이식편의 단면적을 측정(mm)함으로써 그 성장을 측정하였다. C170 이종이식편을 발현하는 누드 마우스의 생존에 대하여 SC101, 5FU/류코보린 또는 SC101와 5FU의 조합물의 효과를 나타내는 그래프.

실시예 1 SC104 단일클론성 항체의 생성

방법

면역화: 표 1에 설정된 섭생요법 이후에 SC104의 생성을 위한 면역화 방식에 일 단의 분리된 종양 세포주를 사용하였다. BALB/c 암컷 마우스 (6-12 주령, Bantin 및Kingman, Hull) C146, C168, C170 및 JW 세포의 100μl 현탁액으로 0, 4, 13 및 14 개월에서 각각 접종하였다. 처음 두 번의 면역화에는 5x106 세포/ml의 세포 밀도를 사용하였고 두 번6째 두 번의 면역화에는 밀도를 5x105 세포/ml로 감소시켰다. 첫 번의 경우 세포를 프로운트의 완전 보조제에 현탁하였고 두 번째 및 후속 면역화에는 프로운트 불완전 보조제를 사용하였다. 최종 면역화 5일 후, 비장 세포를 수거하고 PSNS 1 세포와 융합하였다

면역화 과정

일	세포 유형	세포 수	투여 경로
0	C170	5x106	복강내
42	C146	5x106	복강내
56	Colo205	5x105	복강내
96	JW	5x105	복강내

하이브리도마 생성

마우스를 경추 탈골시켜 희생시키고 비장을 무균적으로 제거하였다. 상기 비장을 무혈청 RPMI (20ml, 37 ℃)를 담고 있는 페트리디쉬에 옮기고 세포를 배지로 부드럽게 풀었다. 조직 파편들은 2분간 세포 현탁액 밑으로 가라앉혔다. 다음 현탁액에 남아있는 개별 비장 세포들을 원심분리로 수거하고, 무혈청 RPMI에 재현탁하고 계수하였다. 수거된 P3NS1 세포를 계수하고 재현탁시켰다. 두 가지 유형의 세포를 1:10 세포, P3NS1:비장세포의 비율로 혼합하였다. 세포 혼합물을 펠렛으로서 수거하고 부드럽게 툭툭 쳐서 느슨하게 풀었다. 가온된 폴리에틸렌 글리콜 1500을 1 분에 걸쳐 첨가하고 (50% 용액 Sigma chemicals로부터 판매), 그 후에 실온에서 배양하였다 (1 분). 다음, 가온된 무혈청 배지를 일 분간에 걸쳐 첨가한 후, 무혈청 배지 20ml를 더 첨가하였다. 재현탁된 세포를 펠렛으로 수거하고 15% 우태아 혈청 및 HAT 선택 제제를 함유하는 가온된 RPMI1640에 부드럽게 분산하였다. 이 세포 현탁액을 래트 복강 삼출 세포 (PECS)로 미리 코팅된 96-웰 플레이트 상에 분주하였다. 다음 플레이트를 37℃, 5% CO2, 95% 공기에서 생존된 하이브리도마의 콜로니들이 발견될 때까지 배양하였다. 결장 종양 특이성 항체의 생성을 비-경쟁적 샌드위치 ELISA에서 C170 세포를 일차 층으로서 사용하여 스크린하였다. 양성 웰들로부터 얻어진 세포를 한 곳에 모아 5, 2.5, 1 및 0.5 세포/웰 (100 μl/웰)의 세포 농도로 96-웰 플레이트에 걸쳐 깔았다. 플레이트를 37℃, 5% CO₂, 95% 공기에서 콜로니를 가진 웰 내의 배지가 오렌지색으로 전환될 때까지 배양하였다.

스크리닝 과정

ELISA. 표준 비-경쟁적 ELISA 방법을 사용하여 적정함으로써 면역화된 마우스의 혈청 내에서의 항체 반응을 분석하였다. 96-웰 조직 배양 플레이트를 10% 우태아 혈청을 함유하는 RPMI 1640에서 5x105 세포/ml 밀도를 가지는 C170 세포로 코팅하였다. 상기 플레이트를 37℃, 5% CO2, 95% 공기 조건에서 밤새 배양하였다. 다음, 세포를 0.5% 글루타르알데히드를 함유하는 인산 완충액 (pH7.3, PBS) (10분, 25℃, 100 μl/웰)로 고정하기 전에, PBS로 세 번 세척하였다. 남아있는 비-특이적 결합 부위를 1% 우혈청 알부민 (분획 V, Sigma Chemicals Ltd.)로 1 시간 항온처리하여 차단하였다. 세포를 0.05% Tween 20를 함유한 PBS로 구성되는 완충액으로 세 번 세척한 후 비경쟁적 샌드위치 ELISA를 사용하여 증폭후 (post-boost) 혈청을 C170 세포로의 결합에 대하여 분석하였다. 면역전 (pre-immunisation) 혈청을 음성 대조군으로서 사용하였다.

면역조직화학

냉동된 결장 종양 절편물을 간접 면역페록시다제 (immuoperoxidase) 염색함으로써 종양 조직에 대한 하이브리도마 상등액의 결합을 결정하였다. 동결보존된 종양의 조직 절편 (5 μm)를 3% H2O2를 함유한 0.1% NaN3로 15 분간 처리하여 내재성 페록시다제를 저해하였다. 이 후, 10% 인간 혈청 및 1% BSA를 함유한 PBS로 30 분간 실온에서 항온처리하였고, 다음 하이브리도마 상등액을 포화 수준에서 첨가하여 비특이적 배경 염색을 최소화 하였다. 결합된 항체를 페록시다제 (Dako Ltd., Bucks., UK)에 연계된 토끼 항-마우스 Ig를 사용하여 검출하였고, 많이 세척한 후에, 슬라이드를 extensive washing the slides were stained with 0.05% 디아미노벤지딘 및 0.01% H₂0₂를 함유한 0.05M Tris-HCI, pH7.6로 염색하고 헤마톡실린으로 대항염색 (counterstain)하였다.

결과

SC104는 마우스를 4 가지 결장 암세포주로 면역화함으로써 얻어진 단일클론성 항체 (mab)이다. 그것은 결장 종양 절편에 대하여 면역조직화학법을 실시하고 면역 세포주 중 하나에 대하여 ELISA를 실시함으로써 스크린되었다. 그것을 세번 클론하였고 마우스 IgG1 mab인 것으로 나타났다. 표 2는 그것이 Lewis^y/b 합텐을 인식하는 양성 대조군 항체보다 더 높은 강도를 가지고 C170 세포에 결합하는 것을 나타내고 있다. 그것은 또한 Lewis^{y /b} 항체 또는 항-CEA 항체에 비해 결장 종양을 강하게 염색하는 것을 나타내고 있다. 그것은 항-CEA 항체에 비하여 정상적인 결장 조직을 약하게 염색하는 것을 나타내고 있다.

SC104 mab의 스크리닝

항체	C170 ELISA (OD 405nm)	면역조직화학a
		결정 종양	정상 결장
SC104	0.301	3+	+
항체-Lewisy/b	0.161	2+	뮤신 염색 만
항-CEA	0.001	2+	+
무항체	0.001	-	-

a- - 음성, + 최소, 2+ 강함, 3+ 매우 강함

실시예 2 SC104 항체의 서열

방법

마우스 면역글로불린 SC104의 중 및 경 카파 사슬 가변 영역의 증폭 및 서열 분석. 항체 생성을 미리 ELISA로 검사한 후, 하이브리도마SC104/1E9로부터 총 RNA로 검출하였다.

총 RNA의 5 g으로부터 합성된 cDNA를 SC104의 중 및 경 사슬 가변 도메인의 증폭을 위해 주형으로 사용하였다. 하기 리더 서열과 어닐링하는 순방 (forward) 올리고뉴클레오타이드 및 각 사슬의 불변 영역의 CH1 도메인에 어닐링하는 역방 (reverse) 올리고뉴클레오타이드를 각각 높은 충실도의 효소 pfu turbo (Stratgene)을 사용하는 PCR 반응에 이용하였다.

순방향 프라이머

5'- ATG AGA GTG CTG ATT CTT TTG TG-3' 중사슬

5'-ATG GAT TT(A/T) CA(A/G) GTG CAG ATT (A/T)TC AGC TTC-3' 카파사슬

역방향 프라이머

5'-CCC AAG CTT CCA GGG (A/G)CC A(A/G)(G/T) GGA TA(A/G) ACG G(A/G)T GG-3' 중사슬

5'-CCC AAG CTT ACT GGA TGG TGG GAA GAT GGA-3' 카파 사슬

증폭 단편물을 TA 벡터 pCR2.1 (Invitrogen)로 클론하였다. 삽입물을 함유하는 클론들을 제한 분석으로 확인하고 프라이머 T7 및 M13 역방향 (Lark Technologies)을 사용하는 DNA 시퀀싱으로 확인하였다. 서열을 분석하고, 하기 상보성 결정 부위 (CDR)을 항체 SC104의 중 및 경 사슬에 대하여 확인하였다 (도 la, b 및 c).

양 사슬에 대하여 시퀀싱 및 번역 분석이 올바른지를 확인하기 위해, 정제되고 농밀화된 SC104 항체의 10 μg을 변성하고, 0.75mm 두께 8% SDS-PAGE 젤 상에서 전기영동으로 분리하고, 반-건조 전기블랏팅으로 PVDF 상에 전이하였다. 아미도 블랙으로 염색한후 카파 (25KDa) 및 중 사슬 (50KDa)를 분리하였고 에드만 분해법으로 N 말단적으로 서열화하였다 (Alta Biosciences).

단백질 시퀀싱으로 양 사슬에 대하여 분석된 DNA 및 번역된 서열을 확인하였다.

중사슬

가변 영역 (55bp-414bp)

CDRI (130bp-162bp)

G Y S I T S G Y S W H

GGCTACTCCATCACGAGTGGTTATAGTTGGCAC

Kabat 넘버링에 따른 (145bp-162bp)

S G Y S W H

AGTGGTTATAGTTGGCAC

CDR2 (205bp-252bp)

H I H F S G R P T Y N P S L S S

CACATTCACTTCAGTGGTAGACCTACTTACAATCCATCTCTCAGCAGT

CDR3 (349bp-381bp)

K G K G S D D G L N Y

AAGGGAAAAGGTTCCGACGATGGTTTGAACTAC

신호 선도 서열 (Signal leader sequence) (lbp-54bp)

FR1 (55bp-129bp)

FR2 (163bp-204bp)

FR3 (253bp-348bp)

FR4 (382bp-414bp)

CH1 (415bp 전방)

카파 경사슬

가변 영역 (67bp-384bp)

CDRI (136bp-165bp)

S A S S S L S Y T H

AGTGCCAGCTCAAGTTTAAGTTACATACAC CDR2 (211bp-231bp)

D T S N L A S

GACACATCCAACCTGGCTTCT CDR3 (328bp-354bp)

F Q G S E Y P L T

TTTCAGGGGAGTGAGTATCCACTCACG

신호 선도 서열 (lbp-66bp)

FR1 (67bp-135bp)

FR2 (166bp-210bp)

FR3 (232bp-327bp)

FR4 (355bp-384bp)

CH1 (385bp 전방)

실시예 3 키메릭 SC104 단일 클론성 항체의 발현

DNA 서열로부터 기능성 항체의 발현을 증명하기 위해, 고안된 상보성 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 부위 지정 돌연변이로써, pCR2.1 내의 골격 4의 말단에 있는 중 및 경 사슬 가변 영역으로 Afel 및 BsiWl 제한 부위를 도입하였다.

중사슬 가변 Afel

순방향 프라이머

5'- C TCA GTC ACC GTC TCT AGC GCT AAA ACG ACA CCC CCA CC-3'

역방향 프라이머

5'-GG TGG GGG TGT CGT TTT AGC GCT AGA GAC GGT GAC TGA G-3'

경사슬 가변 BsiWl

순방향 프라이머

5'- CC AAG CTG GAA ATG ACA CGT ACG GAT GCT GCA CCA ACT G-3'

역방향 프라이머

5'-C AGT TGG TGC AGC ATC CGT ACG TGT CAT TTC CAG CTT GG-3'

SC104의 쥐 중 및 경 사슬 가변 영역을 pCR2.1으로부터 잘라내고, 각 사승의 인간 Fc 불변 영역과 각각 프레임내로 융합된 포유동물 발현 벡터 pDCORIG IB의 HindIII/Afe1 및 BamHI/BsiW1 부위로 클론하였다. 이러한 플라즈미드를 제한 분석으로 검사하고, DNA 시퀀싱으로 확인하였다.

상기 플라즈미드 15 μg 및 유전자주스 (genejuice, Novagen)를 제작자의 지시에 따라 CHO-S로 안정하게 형질감염시켰다. 형질감염체를 제오신 (Zeocin) (300 μg/ml)을 함유한 배지에서 14일간 선별하였다. 상기 형질 감염체로부터 분비된 기능성 키메릭 SC104 항체의 발현은 세포주 C170의 세포표면으로의 결합을 통해 및 유세포 분석기를 사용하여 확인되었다 (도 ld).

간략히, RPMI/10% FCS에서 세척한 후, 상기 키메릭 항체를 포함하는 사용된 배지 또는 배지 만으로 C170 세포를 4℃에서 30분간 배양하였다. 세포를 세척하고 CH2 도메인에 특이적인 FITC-부착 토끼 항-인간 IgG 항체(DAKO, F0123)로 4℃에서 30분간 더 항온처리하였다. 세포를 다시 세척하고, 재현탁하고 유세포 분석기로 분석하였다

실시예 4 SC104 단일클론성 항체를 사용한 결합 연구

실험 1

방법

정상적인 및 종양 조직의 면역조직화학 염색. 인간 조직을 Inveresk 승인 공급처로부터 수득하였다. 사용된 각 조직은 액체 질소에 순간 냉동되었고 약 -70℃(±10℃)에서 보관되었다. 냉각 절편물을 절단하고 슈퍼프로스트 플러스 (Superfrost plus) 슬라이드 상에 두었다. 모든 조직 샘플을 각 조직에 적절한 항원 표식자로 처리하여 그 조직에서 항원의 보존 상황을 확인하였다. 사용된 표식자는 상피 함유 조직에 대해서는 케라틴이며, 모든 임파성 조직에 대해서는 CD45이고, 모든 심장 및 골격근에 대해서는 데스민(desmin)이다. 관련이 없는 세 공여자로부터의 조직을 검사하였다. 사용된 염색 방법은 아비딘-비오틴-페록시다제 복합체와 함께 이차 및 삼차 항체를 사용하는 간접, 2 또는 3-단계 방법이었다. 과산화 수소를 사용하여 내재적 페록시다제 활성을 차단하였다. 모든 조직 절편물을 일련의 아비딘-비오틴으로 처리함으로써 내재적 비오틴을 차단하였다. 삼차 항체를 사용할 때, 모든 조직 절편물을 정상 돼지 혈청으로 처리하였고, 이는 삼차 항체가 조직에 결합하는 것을 저해한다. 양성 대조군 조직 상에서의 염색, 음성 대조군 상에서의 무염색, 및 대조군 조직 염색에 대한 고착 효과에 의해 면역조직화학적 염색 방법을 평가하였다. 6 개 결장 종양 공여체 1 개 심장 공여체에 대하여 0 또는 50 μg/ml 농도에서 SC104를 시험하였다. 조직을 아세톤 또는 중성 완충 포르말린에서 고정하였다. 두 개의 결장 종양 시편이 양성 대조군으로 사용하기에 충분할 정도로 잘 염색되었고 심장 시편은 염색되지 않았다. 최대의 염색 강도를 주는 SC104의 최소 농도는 l μg/ml이었고, 이 농도는 후속 작업에 사용되었다.

결과

SC104를 일 단의 냉동 종양 및 정상 조직 절편물에 대한 결합에 대하여 스크린하였다 (표 3). 결장, 자궁내막, 식도, 귀밑 침샘선 및 위의 신생 상피에 대하여 양성적인 염색이 있었고, 6 개의 유방 종양 중 3 개에서 적은 수의 상피 세포가 덜 강하게 염색되었다. 정상적인 대장, 귀밑 침샘선, 편도선 및 요도 경부의 상피에서 염색이 되었다. 적은 수의 방광 상피 세포, 단일 공여자의 분산된 흉선 임파구, 피부의 상피 세포, 전립선, 유방 및 난관의 상피 세포, 폐의 폐포내면액 세포, 및 하나의 공여자의 뇌로부터 얻어진 적은 수의 신경교 세포에서 덜 강한 염색이 이뤄졌다. 위와 소장의 점막이 염색되었다. 정상적인 인간 심장, 신장, 태반 또는 비장에서 특이적 염색은 이뤄지지 않았다. 이러한 결과들은 항원이 일단의 상피 세포에서 발현될 수 있지만 그러나 위장관 내에서 주로 국소화되어 있다는 것을 제시하고 있다. 상기 면역조직화학은 항원이 결장 종양 상에서 주변 정상 조직보다 더 강하게 발현된다는 것을 제시하고 있다.

냉동 종양 및 정상 조직 절편에 대한 SC104 항체의 면역반응성

조직	항-EGF Mab	SC104 결합		염색에 대한 주석
종양
폐	6/6	0
식도	4/4	4/4
유방	0	3/6
신장	ND	0
결장	3/8	8/8
난소	0	0
이하선	0	2/2
전립선	0	0
위	0	4/4
고환	ND	0/1
자궁내막	1/2	2/2
정상 조직
뇌	0	1/2		한 공여자의 뇌에서 얻은 적은 수의 분산된 신경교 세포
유방	3/3	2/3		상피세포 분산되고 중간 정도
난소관	0	2/3		상피세포 분산되고 중간 정도
심장	0	0
신장	0	0
대장	3/3	3/3		상피 세포, 점막, 분산 옅은 내지 중간정도
폐	0	2/3		폐포 내면 세포, 하나의 공여자 최소, 다른 한 공여자 옅은 정도
난소	0	3/3		낭포성 세포 분산되고 중간정도
태반	3/3	0
전립선	3/3	3/3		상피 세포 분산되고 중간정도
귀밑 침샘	3/3	3/3		중간 정도
피부	/30	2/3		분산 최소 염색
소장	0	3/3		점막 표면, 분산되고 최소 정도
비장	0	0
위	0	2/3		점막 표면, 분산되고 옅은 정도
흉선	0	3/3		상피 세포, Hassall의 미립자, 막 분산 옅은 정도
편도선	0	3/3		케라틴화된 상피, 막, 분산되고 옅은 내지 중간 정도
방광	2/3	2/2		상피 세포 전이성 상피, 막 분산되고 옅은
요도 경부	3/3	3/3		상피 세포, 막, 분산되고 옅은 내지 중간 정도

참조: ND 실행되지 않음(not done).

실험 2

방법

간접 면역형광 및 유세포분석기에 의한 종양 세포주에 대한 결합 분석. C170, Colo205, MKN45, R1D9, 및 791T 세포 (105)를 50 l of SC104 mab (0-20 μg/ml)의 50μl에 재현탁시키고 얼음상에서 20분간 배양하였다.

RPMI/10% FCS에서 샘플을 3 번 세척한후, 세포를 FITC-표지 토끼 항-마우스 (1/50: Dako Ltd, Bucks, UK) 항체로 처리하고 얼음 상에서 30 분간 항온 처리한 후 FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA) 상에서 분석하였다. 결과는 평균 선형 형광 (MLF)으로 표시된다.

ELISA에 의한 종양세포로의 결합 분석. 96-웰 조직 배양 플레이트를 10% 우태아 혈청을 포함하는 RPMI 1640에서 5x105 세포/ml (100 μl/웰)의 세포밀도로 세포로 코팅하였다. 상기 플레이트를 37℃, 5% CO2, 95% 공기에서 밤새 배양하였다. 다음, 상기 세포를 인산염 완충액 (pH7.3, PBS)로 두 번 세척한 후, 0.5% 글루타르알데히드를 함유하는 PBS (l0 분, 25℃, 100 μl/웰)로 고정하였다. 남아있는 비-특이적 결합 부위를 1% 우혈청 알부민 (분획 V, Sigma Chemicals Ltd.)을 함유하는 PBS로 1 시간 처리하여 차단하였다. 세포를 0.05% Tween 20을 함유하는 인산완충액으로 구성되는 세척액으로 세 번 세척하였다. 세포를 SC104 (1 μg/ml)로 1 시간 실온에서 처리한 다음 결합된 항체를 염소 항-마우스 고추냉이 페록시다제 and ABTS로 검출하였다. 결과는 405nm 흡광도로 표시한다.

결과

일 단의 종양 세포주 상에서의 항원 발현의 특성을 ELISA를 통해 밝혔다 (도 2a). SC104 항체는 위장관 출처의 세포주에 주로 결합하였다. SC104는 1500 내지 4,000 MLF를 가지는 C170, Colo205 및 R1D9 세포와 결합하였다.

실험 3

방법

일차 종양 결합. 결장암 절제 (resection) 때, 종양 시편을 얻었다. 시편을 잘게 저미고 0.05% 콜라게나제 (Type IV, Boehringer Mannheim, Lewes, UK)로 20 분간 37℃에서 분해하였다. 종양 세포 현탁액을 제거하고 Hanks 균형 염 용액 (Gibco BRL, Paisley, UK)으로 3 번 세척하였다. 새로운 콜라게나제를 잔류하고 있는 조직에 넣고 20 분간 다시 배양하였다. 이러한 과정을 두 번 반복한 후 모든 분해물로부터 얻어진 세포를 합치고 이를 20% 우태아 혈청(Gibco)을 포함하는 둘베코 배지 (Dulbecco's medium)에 재현탁하였다. 세포를 1 시간 동안 4℃에서 SC104 mab (1 μg)로 항온처리하였다. 세포를 두 번 세척하고 한 시간 동안 더 FITC-부착 토끼 항-마우스 면역글로불린 (Dako Ltd., Bucks., UK)으로 항온 처리하였다. 정상적인 마우스 면역글로불린을 음성 대조군으로 사용하였고 이 형광을 SC104을 사용하여 얻은 형광에서 감하였다. 세포를 세 번 세척한 후, FACScan (Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)상에서 분석하였다. 결과는 평균 선형 형광 (MLF)으로 표시된다. 고형 종양의 분해는 적혈구, 임파구, 기질 (stromal) 세포, 대식세포, 내피 세포를 포함한 혼합된 세포 군집을 결과한다. 상피 세포의 퍼센트는 사이토케라틴 mab를 염색함으로써 측정된다. Cam 5.2.는 단지 22±13% (범위 10-60)였다. 그러나, 포워드 상기 악성 세포 크기 범위에 있는 세포를 선택적으로 분석하기 위해 전방 각도 광분산 게이팅 (forward angle light scatter gating) 후, 분석된 세포의 79±4% (범위 69-86)는 상피성이었다. 더욱이, 종양 간의 변이는 상당히 감소되었다. 항-CD45 mab F-10-89로 염색하여 측정할 때 총 핵체 갯 수 중에서 백혈구의 백분율은 74±16 (범위 40-90)이다. 이것은 악성 크기에 대한 FACS IV 게이팅 후에 5.5±5% (범위 1-20)으로 현저히 감소되었다. 악성 크기 범위에서 분석된 세포의 총 수에서 기질 세포의 백분율은 3.5±3% (범위 1-13)였다.

결과

SC104는 또한 세포당 4x105 항원의 평균 항원 밀도 (범위 1.5-10x106 항원; 도 3)를 가지는 새롭게 분해된 결장 종양 세포의 >80%에 강하게 결합하는 것으로 나타난다.

실험 4

방법

종양 및 정상적 세포막 추출물 결합. 결장 및 정상적인 결장 세포막의 핵외 추출물을 생성하고 SC104 결합을 ELISA로 분석하였다.

결과

면역조직화학에 의해 얻어진 등차 염색을 더 정량화하기 위해, 일차 결장 종양 및 절개 가장자리로부터 얻은 정상적인 결장의 외핵막 제조물을 얻었다. SC104를 가진 이러한 막을 ELISA 염색하면, 정상적인 결장은 약하게 염색되게 종양 막은 중간 정도에서 강하게 염색되는 것이 관찰되고, 평균 T:N 비율이 6:1이었다 (표 4).

종양 및 정상 막 추출물에 대한 SC104의 상대적 결합

환자	외핵막에 대한 SC104 mab의 결합
	결장 종양	정상 결장	TiN 비율
1	0.001	0.001
2	0.437	0.068	6.6:1
3	0.221	0.217	1:1
4	0.278	0.042	7:1
5	0.196	0.066	3:1
6	0.281	0.035	8:1
7	0.102	0.139	1:1

방법

정제된 항원 제조물에 대한 결합. C14 항원 (C14 단일클론성 항체 상에서 친화력 크로마토그래피에 의해 침으로부터 정제된 90Kda의 당단백질), CEA (365 mab를 사용한 친화력 크로마토그래피로써 결장 종양 생 메타스타제로부터 정제된 80Kda의 당단백질) 및 당지질 추출물 (결장 종양으로부터 3:1 메탄올: 클로로포름 w/v에서 추출된 당지질)을 마이크로타이터 플레이트상에서 밤새 37℃에서 항온처리하여 건조시켰다. SC104 mab의 결합을 전술한 바와 같이 ELISA로 분석하였다.

Lewisy 합텐 및 타입 I 및 타입 II H 혈액 그룹 항원 (Sigma, Poole, Dorset)을 밤새 37℃에서 항온처리하여 마이크로타이터 플레이트 상에서 건조시켰다. SC104 mab를 전술한 바와 같이 ELISA로 분석하였다.

결과

SC104 항체에 의해 인식된 항원의 특성을 시험하고 확인하기 위해, 이를 사용하여 세 가지 상이한 항원 제조물을 염색하였다 (도 4). 첫 번은 CEA로서 이는 공지되어 있고 결장 종양에 의해 발현되는 면역원성 항원이다. 비록 항-CEA 항원이 기능적 항원의 존재를 확인케하는 양호한 반응성을 나타냈지만, CEA의 상당한 염색이 관찰되지 않았다. 두 번째 제조물은 침으로부터 추출된 당단백질을 발현하는 Lewis^y/b 이다. 이러한 항원은 광 범위한 탄수화물 잔기를 가지는 90KDa 당단백질이다. 항-Lewis^{y /b} 항체 및 SC104 항체는 이러한 당단백질에 결합되는 반면 항-CEA 항체는 결합에 실패하였다. 메탄올/클로로포름 종양 당지질 추출물을 분석하였을 때 유사 결과가 나타났다. 이러한 결과는 당단백질 및 당지질 둘 다에 나타나는 탄수화물 잔기를 인지하며 이것은 Lewis^{y /b}을 인식할 것이라는 것을 제시한다. SC104가 혈액 그룹 항원에 결합하지 않는다는 것을 증명하기 위해, Lewis^y, H 타입 I 및 타입 II 혈액 그룹 합텐에 결합하는 것에 대해 그것을 ELISA로 스크린하였다 (표 5). 항-H 항체는 모든 세 가지 합텐에 Lewis^{y /b} 항체는 Lewis^y 합텐에 강하게 결합하였으나, SC104는 이러한 합텐의 어느 것과도 반응하지 않았다.

혈액 그룹 항원으로의 SC104 결합

	혈액 그룹 항원에 대한 항체의 결합 ELISA 측정(OD 405 nm)
항체	Lewisy	H 혈액 그룹 타입 I	H 혈액 그룹 유형 II
SC104	0057	0.087	0.076
항-H	2058	2.174	1.331
항-Lewisy /b	0.662	0.129	0.097

실시예 5 SC104 단일클론성 항체에 의해 인식되는 종양 당지질의 동정

실험 1

지질 추출 및 면역염색 방법의 최적화

방법

C170 종양 세포로부터의 지질 추출. 정체된 부착 조직 배양물을 트립신화 시켜 C170 세포의 펠렛 (l ml 채운 세포 부피)을 얻었다. 상기 펠렛을 PBS에서 세척하고, 원심 분리후 잉여 완충액을 흡입으로 제거하고, -80℃에서 보관하였다. 펠렛을 클로로포름:메탄올 (3:1, v/v, 19m1)로 추출하였다. 결과된 에멀젼을 50ml 용매 저항성 (Tefzel) 원심분리 튜브에 넣고 8,000 rpm 속도로 15분간 4℃에서 원심분리하였다. 회전 증발기를 사용하여 30℃에서 상등액을 건조하고 작은 부피 (~l ml) 클로로포름:메탄올:0.5% CaCl2(aq) (50:40:10)에 재현탁하였다.

지질추출물의 HPTLC 분석. 상기 샘플을 Merck HPTLC 플레이트 상에 다중 점적하고 클로로포름:메탄올:0.5% CaCl2(aq) (50:40:10)에서 표준으로서 전개시켰다. 상기 플레이트를 건조시킨 후 요오드 증기 탱크에 두었다. 밴드를 연필로 표시하고 요오드를 밤새 플레이트에서 증발시켰다. 다음 항원의 위치를 알기 위해 면역염색하였다.

전개된 HPTLC 플레이트의 면역염색. SC104 면역염색을 위해, 플레이트를 폴리이소부틸 메틸메타크릴레이트 (0.1 % w/v 용액) 헥산:클로로포를 (9:1)에 15 초간 침지한 다음 건조시켰다. 다음 플레이트를 3% BSA를 함유한 PBS로 l 시간동안 실온에서 차단시킨 후, 실온에서 1 시간 동안 시험 항체 용액 (10 μg/ml) 또는 BSA 용액에서 항온처리하였다. 다음, 상기 플레이트를 PBS/Tween-20 (0.1%)에서 세 번 세척한 후 실온에서 1 시간 동안, Dako에서 구입한 토끼 항-마우스 HRP 접합체로 항온 처리하였다. 다음 상기 플레이트 PBS/Tween-20 (0.1%)에서 세 번 세척하고 10 mM Tris, 100 mM NaCI pH7.0, 0.1% Tween에서 한번 세척하고 Sigma-FAST BCIP/NBT 시약으로 발색하였다.

전개된 HPTLC 플레이트들의 화학적 염색. 오르시놀 염색을 사용하여 탄수화물 분체의 존재를 검출하였다. 전개된 HPTLC 플레이트를 건조시키고 오르시놀 시약으로 완전히 코팅될 때까지 스프레이하였다. 상기 플레이트를 고온 공기의 스팀에서 건조시키고 100℃에서 15 분간 항온처리 하였다. 닌히드린 염색을 사용하여 자유 아미노기를 함유하는 분자를 검출하였다. 먼저 전개된 HPTLC 플레이트를 건조시킨 후 완전히 젖을 때까지 닌히드린 용액 (0.25 % 닌히드린 w/v을 함유하는 아세톤)에 침지시켰다. 다음 플레이트를 실온에서 수시간 전개하였다.

결과

상기 항원은 원 2:1 용매 추출과 비교하여 밴드수에서 아무런 변화없이, 3:1 클로로포름:메탄올 혼합물에서 성공적으로 추출되었다. 그러나, 용매를 4:1 클로로포름:메탄올로 증가시키면 HPTLC에 의해 검출되는 밴드의 수가 줄어드는 것으로 나타나며 결론적으로 추출 목적으로는 사용되지 않는다.

초기 면역염색 실험은 또한 HPTLC 플레이트를 0.1% w/v 폴리이소부칠 메타크릴레이트를 함유하는 헥산에서 60초 항온처리하였다; 하지만, 항원을 재현가능하게 검출하기 위해서는 이를 15 초로 감소시키는 것이 필요하다는 것이 발견되었다. 최종적으로, 최대 감도를 얻기 위해, 포스파타제 기질로 항온 처리하기 전에 HPTLC 플레이트를 인산염 없이 세척하는 것이 필요하다는 것이 밝혀졌다.

SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅 실험으로, 이미 SC104 항원이 전체 세포 추출물, 세포용해물, 및 세포막 제조시 만들어진 불용성 펠렛에서 검출될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 상기 항원은 세포막 제조물 자체에서는 검출되지 않았다. 이에 더하여, 세포막에서 생성된 불용성 펠렛의 HPTLC 분리 및 면역염색으로 또한 항원을 검출될 수 있었다. 이것은 항원이 지질이거나 매우 소수성 단백질이라는 것을 암시하고 있다.

실험 2

실리카 컬럼 크로마토그래피에 의한 항원 함유 분획의 분석

방법

지질 추출물의 실리카 컬럼 분획화. 실리카 슬러리를 함유한 클로로포름:메탄올:0.5% CaCl2(aq) (50: 40:10)을 중력 컬럼 (150 mm i.d.)에 채웠다. C170 추출물을 ~l ml 클로로포름:메탄올:0.5% CaCl2(aq) (50:40:10)에 재용해하고 상기 컬럼에 부가하고 및 동일한 용매 조건을 사용하여 용출하였다. 분획물을 수집하고 HPTLC로 분석하였다. SC104 면역염색을 실시하여 항원의 위치를 정하고 화학 면역 방법을 사용하여 상기 분획의 특징을 더 분석하였다.

항원의 세라마이드 글리카나제 절단.

세라마이드 글리카나제 절단으로 당지질로부터 올리고당을 배출하였다. 항원 oligosaccharides from 당지질 molecules.

Antigen solution in 50 mM 소듐 아세테이트, pH 5.0, 0.1 % w/v 소듐 콜레이트의 항원 용액을 세라마이드 글리카나제 용액과 혼합하였고 (50 μl 항원에 대하여 1 μl), 37℃에서 3시간 항원처리하였다. 250 μl 클로로포름:메탄올 (2:1)과 혼합한 후 짧게 원심분리함으로써 탈글리코실화된 지질을 상기 배출된 올리고당으로부터 분리하였다. 상층 수성상을 하층 유기상으로부터 분리하고 이 둘을 따로 건조 감량하였다.

결과

C170 지질 추출물의 작은 규모 분획화 (~0.5ml 채워진 세포 부피)를 50:40:10 클로로포름:메탄올:CaCl2 (0.5 % w/v 수용액 내)을 이동상으로서 사용하는 ~10 ml 베드 부피 실리카 컬럼상에서 수행되었다. 그러나, 항원 특성화를 위해, 이러한 방법을 규모증가시키는 것이 필요하였다. 이것은 ~10 ml 채워진 세포 부피를 사용하여 지질 추출물을 얻고 상기 컬럼 부피를 ~36 ml로 증가시킴으로써 가능하다는 것이 나타났다.

전체 지질 추출물을 상기 규모증가된 컬럼상에 부과하고, 분획을 수집하고, 및 항원-함유 분획을 면역염색으로 검출하였다 (도 5). 0.53의 R_F를 가진 항원을 검출하였다. HPTLC 및 화학 염색을 사용하여 이러한 분획의 특성을 더욱 분석하였다. HPTLC 플레이트의 오르시놀 염색을 사용하여 당지질의 탄수화물 분체를 검출하였다. 이것은 0.50과 0.61 사이의 R_F 값을 가진 세 개의 밴드를 검출하였고 항원의 시초 R_F 값에 상응하는 것으로 보인다. 그러나, 오르시놀 염색으로 동시에 반복된 면역염색을 통해, 세 개의 밴드가 R_F 0.36과 0.39 사이에서 검출되면서, 항원의 R_F가 이상하게 전이된 것이 밝혀졌다 (도 6). 이것은 오르시놀 염색으로 검출된 밴드는 항원에 상응하는 것이 아니라 당지질 오염체를 나타내는 것을 의미할 수 있다.

이러한 항원이 단백질인지를 확인하기 위해, 상기 분획을 SDS-PAGE 및 웨스턴 블랏팅으로 분석하였다. 젤을 실버 염색하여 매우 낮은 수준의 단백질 오염을 드러냈다; 그러나, 웨스턴 블랏팅은 상기 제조물에서 임의의 항원을 특이적으로 검출하는 데 실패했고, 이는 항원 자체가 단백질이 아니라는 것을 암시한다.

항원-함유 분획의 분주물을 세라마이드 글리카나제로 처리하여 탄수화물을 제거하였다. 2:1 클로로포름:메탄올을 사용하여 글리칸류를 지질 부분으로부터 분리하였다; 자유 글리칸류는 메탄올로 구획되고 및 상기 탈-글리코실화 지질은 클로로포름으로 구획된다고 예상된다. 다음, 면역염색 및 화학 염색 기술을 순전한 당지질 및 탈-글리코실화된 지질의 HPTLC 플레이트 상에서 수행하였다. 탈-글리코실화된 지질이 아닌 순전한 당지질을 이용한 면역염색으로 항원 (R_F 0.38 - 0.46)의 존재를 밝혔다 (도 7). 그러나, 나중의 실험에서, 미절단된 항원의 구획은 매우 가변적이고, 항원은 때때로 수성, 유기 또는 양쪽 상에서 검출 되어 진다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 세라마이드 글리카나제 처리 유기 분획에서 항원의 검출을 실패한다고 해서, 이것이 확정되는 것은 아니다. 이는 항원의 세라마이드 글리카나제 제거라기 보다, 항원을 수성상으로 구획하는 것으로 인한 것이다.

상기 실험을 확증하기 위해, 절단 후 분석하는 것을 유기 및 수성상 둘 다를 가지고 반복하였다. HPTLC 및 요오드 염색에 의한 샘플 분석을 통해 올리고 당 제거 후 양 쪽 분획에서 SC104 결합이 결여되어 있다는 것이 밝혀졌다 (도 8). 이것은 SC104가 순전한 당지질을 인식하며 이러한 인식은 올리고당 제거 후에는 상실된다는 것을 가르킨다.

포스타티딜에탄올아민, 포스파티딜 세린 및 관련된 리소 (lyso) 군은 닌히드린염색에 의해 검출될 수 있는 자유 아미노 기를 가진다. 양 쪽 순전한 당지질 및 세라마이드 글리카나제 처리 분획의 HPTLC 및 닌히드린 염색으로, 0.51과 0.54 사이의 R_F 값을 가지는 인지질의 존재가 밝혀졌다. 그러나, 이는 특히 단일 실리카 컬럼 정제 방법을 사용할 때 인지질 및 당지질의 공동 용출이 공통적인 문제점이라고 문헌들이 나타내고 있기 때문에, 항원과 같이 움직이는 오염물일 수 있다. 이것은 그러한 방법은 특성화하기에 충분한 순도를 가지는 전체 추출물로부터 항원을 용해하기에 불충분할 수 있다는 것을 가르킨다.

실험 3

전체 지질 추출물을 지질 부차 군으로 분획화 및 항원의 위치 파악

방법

지질을 전술한 바와 같이, ~2 ml 채워진 세포 부피 C170 세포로부터 추출하였다. 증발후, 상기 추출물을 ~l ml 클로로포름에 재현탁하였다. 10 ml 베드 부피 실리카 컬럼 (150 mm i.d.)를 100% 클로로포름에서 준비하였다. 상기 샘플을 컬럼에 첨가하고 컬럼을 중력하에서 하기 용매에서 세척하였다: 10 컬럼 부피 클로로포름, 단순 지질류 용출; 40 컬럼 부피 아세톤, 중성 당지질류 용출; 10 컬럼 부피 메탄올, 강글리오사이드류 및 인지질류 용출.

분획들을 수집하고 회전 증발로 건조 감량하고 4℃에서 저장한 후 분석하였다.

항원의 뉴라미니다제 절단

항원 용액 (5 μl)을 5 μl 10x 완충액 용액과 혼합하고, 뉴라미니다제 및 10 μl 뉴라미니다제 용액을 첨가하였다. 결과된 최종 부피를 50 μl로 증가시키고, 혼합하고 및 37℃에서 1 시간 항온처리하였다.

산 가수분해에 의한 화학적 탈시알릴화. 0.05 M 황산의 항원 용액을 80℃에서 2 시간 가열하였다. 다음 이 샘플을 냉각시키고 4℃에서 저장한 후 분석하였다.

결과

인지질류로부터 당지질류를 제거하기 위해, 10 ml 실리카 컬럼을 클로로포름으로 평형화시켰다. 전체 C170 지질 추출물을 ~2 ml 채워진 세포 부피로부터 얻었다. 이를 컬럼에 적용하고, 이 컬럼을 클로로포름으로 세척하여 단순 지질류를 용출하였다; 아세톤으로 당지질을 용출하였고; 최종적으로 메탄올로 인지질을 용출하였다.

HPTLC 분리 및 면역염색하여 상기 전체 추출물 및 인지질 분획에서 (R_F 0.54, 0.51 및 0.41) 적어도 세 개의 항원 밴드를 상기 단순 지질 분획에서 (R_F 0.51; 도 9) 단일 밴드를 검출하였다. 그러나, 어떠한 항원도 당지질 분획에서 검출되지 않았다. 닌히드린 염색으로 전체 추출물 및 인지질 분획에서만 인지질이 존재한다는 것이 밝혀졌다. 그러나, 오르시놀 염색으로 당지질류가 당지질 및 인지질 분획 양 쪽에서 존재한다는 것을 밝혀졌다. 유의하게도, 두 개의 구별된 밴드들이, 항원과 함께 이동하는 것처럼 보이는 인지질 분획 (R_F 0.54 및 0.51)에서 발견되었고, 이는 다시 항원이 탄수화물 분체를 가질 수 있다는 것을 알려준다.

더욱이, 판독결과는 비록 상기 방법이 중성 당지질류를 인지질류로부터 분리하는데사용될 수 있지만, 시알릴화된 당지질류가 인지질류와 같이 용출된다는 것을 나타내고 있다. 이는 항원 및 오르시놀 양성 밴드의 공동 이동과 함께, 항원이 시알릴화된 당지질일 수 있는 어떤 증거를 제공한다; 반면 상기 중성 당지질 분획에서 항원이 없다는 것은 당지질이 SC104에 의해 인지되려면 반드시 시알릴화되어야 한다는 것을 제시하고 있다.

상기 항원이 시알릴화된 당지질이고 인지질이 아니라는 추가의 증거는 2D HPTLC를 사용하여 전체 지질 추출물을 분리하고 및 상기 플레이트를 면역염색 및 화학 염색을 통해 분석함으로써 얻어졌다. 일차 차원에서, 상기 HPTLC 플레이트를 표준 50:40:10 클로로포름:메탄올:CaCl₂ 용매 혼합물에서 전개하였다. 다음 상기 플레이트를 건조시키고, 90도 회전시키고 클로로포름: 아세톤: 메탄올: 아세트 산: 물 10:4:2:2:1에서 전개하였다. 면역염색을 통해, 상기 이차 차원에서 항원이 매우 조금 움직였다는 것이 밝혀졌다 (도 10). 이것은, 중성 당지질류가 아세톤에서 이동하기 때문에, 항원이 중성 당지질이 아니라는 것을 또한 알려준다. 탄수화물의 오르시놀 염색은 다시, 양 쪽 차원으로 항원과 같이 이동한 밴드를 보여주고 있고, 반면에 자유 아미노기의 닌히드린 염색은 일 차 차원으로 같이 이동하였지만 이 차 차원으로는 항원으로부터 분리된 화합물이 있다는 것을 나타내고 있다. 뉴라미니다제 절단을 이용하여 항원 인지에 대한 시알 산 제거의 효과를 검출하였다. HPTLC를 면역 염색하면, 뉴라미니다제 처리로 두 집단의 밴드가 제공되는 전과 후에, 인지질/강글리오사이드 샘플이 분리되었다; R_F 0.46에서 더 높은 극성의 집단 및 R_F 0.62에서 더 낮은 극성의 집단 (도 11). 비록 동일한 밴드들이 뉴라미니다제 처리 전 후에 검출된다고 하더라도, 염색 프로필의 강도에서는 전이가 있었다. 뉴라미니다제 처리하게 되면, 처리되지 않은 대조군에 비해, R_F 0.46 집단에서 더 강한 염색이 그리고, R_F 0.62 집단에서 강도 감소가 나타난다. 이는 시알산 제거가 오직 부분적일 지라도, 상황이 최적이 아니기 때문에, 더 극성인 R_F 0.62 집단(cluster)으로부터 시알산을 제거하면 덜 극성 집단의 분자를 형성하게 되며, 이들은 항체에 의해 여전히 검출된다. 뉴라미니다제 절단 후 검출된 최소 극성 밴드들이 미처리된 강글리오사이드/인지질 분획에서 최소 극성 밴드들과 같이 이동함에 따라, 이러한 집단은 그 자체가 시알릴화된 형태, 필시 모노시알릴화와 상응하여야만 되는 반면 상기 더 극성인 집단은 다이시알릴화된 형태와 상응한다는 것이 가정된다.

다음 실리카 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 차별적으로 시알릴화된 당지질류를 분획화하였다. 지질 추출물 샘플을 컬럼 상에 부과하고 분획을 용출하여 단순 지질 (클로로포름); 시알릴화되지 않은 당지질류 및 인지질류 (클로로포름: 메탄올: 아세톤: 아세트 산: 물 52: 8:8:18:4, 후속으로 클로로포름:메탄올 4:1); 모노시알릴화된 당지질류 (클로로포름: 메탄올 2:3); 다이시알릴화된 당지질류 (클로로포름: 메탄올: 물 65: 25:4) 및 최종적으로 폴리시알릴화된 당지질류 (클로로포름: 메탄올:물 60: 35:8)을 얻었다.

다음, 분획들을 건조 감량시키고 HPTLC로 분석한 후, 면역염색 및 화학 염색을 실시하였다 (도 12).

오르시놀 및 닌히드린 염색은 인지질류 및 당지질류 둘다 시알릴화된 당지질 분획에 존재한다는 것을 나타내었다. 그러나, 상기 항원은 다시 오르시놀 양성 당지질류와 같이 이동하나, 닌히드린 양성 인지질류와는 같이 이동하지 않는다는 것으로 나타난다.

이러한 샘플들의 HPTLC 및 면역염색은 전체 추출물에서 세 집단의 항원이 있고 (R_F -0.49, -0.38 및 -0.24), 이들 중 가장 극성인 것은 매우 희미하게 염색된다는 것을 나타내고 있다. 어떠한 항원도 단수 지질 분획 또는 상기 인지질/중성 당지질 분획에서 발견되지 않았지만, 시알릴화된 분획에서는 항원이 검출되었다. 이것은 항원이 시알릴화된 당지질이고 인지질이 아니라는 것을 확인하여 준다. 밴드 집단들 중 두 개는 모노시알릴화된 분획 (R_F -0.49 및 R_F -0.38)에서 검출되었다. 다이시알릴화된 분획에서, 희미한 염색이 가장 극성 (R_F -0.24) 및 최소 극성 (R_F -0.49) 집단에 대해서 가시화되어 있고, 가장 강한 염색이 중간 집단(R_F -0.38)에 대하여 검출되었다. 폴리시알릴화된 분획에서 두 개의 집단이 가시화된다 (R_F -0.38 및 R_F -0.24). 이는 최소 극성 집단이 모노시알릴화되어 있고, 중간 집단은 다이시알릴화된 구조를 나타내고 및 가장 극성 집단은 세가지 또는 가능하게는 네가지 시알산을 가지는 것으로 나타내고 있다.

다음 산 가수분해를 사용하여 상기 항원을 화학적으로 탈시알릴화하였다. 이 방법은 효소적 방법보다 더 공격적이며, 시알산의 완전한 제거를 결과하게 된다. HPTLC 및 SC104 면역염색은 시알산의 화학적 제거는 SC104 결합의 완벽한 상실을 결과하는 것을 증명하며, 이는 상기 항원의 시알화가 항원 결합에 필요하다는 추가의 증거를 제공한다.

그러므로 SC104는 모노, 다이 및 심지어 폴리시알릴화된 당지질과 결합하는 것으로 나타난다. 그러나, 이것은 어시알로 (asialo) 형태에 결합하지 않는다. 이것은 항원이 반드시 모노시알릴화 되어야 하나, 추가의 시알산의 존재는 SC104의 결합에 영향을 주지 않는다는 것을 가르킨다. 다이시알릴화된 형태에 대한 염색의 강도 증가는 또한 비록 하나의 시알산의 존재 만을 요할 지라도, 항원은 두 개의 시알 산을 가지는 것으로 가장 공통적으로 나타나고 있다. 그러나 이것이 수거하기전 C170 세포의 나이 및 배양 조건에 따른 것인지는 현재 분명하지 않다.

실험 4

상업적으로 이용가능한 표준물과 항원의 비교

방법

SC104 항원을 많은 상업적으로 이용가능한 지질 표준물과 비교하였다. 각 표준물의 보기를 HPTLC 플레이트 상에 점적하고 50:40:10 클로로포름:메탄올:CaCl2 (0.5 % w/v)에서 전개하였다. 플레이트를 또한 부분적으로 정제된 SC104 항원으로 점적하였다. 각 표준물의 이동은 요오드 증기 염색으로 검출하였고 각각의 위치를 플레이트 상에 표시하였다. 다음 플레이트를 SC104으로 탐침하였다. 어떠한 표준물도 SC104에 의해 인식되지 않았고, 이는 어떤 표준물도 상기 항원이 아니라는 것을 제시하고 있다.

결과

표준물에 대해 얻어진 R_F 값들을 하기 표 6에 기재한다. 이러한 수치들을 가변적으로 시알릴화된 SC104 항원에 대해 얻어진, 극성 및 시알릴화 정도의 올림 차순으로 기재된 R_F 값들의 범위와 비교한다.

표준물	구조	RF		SC104 RF
락토실세라마이드	Glc-β1, 1-Cer	0.79
글로보트리아오실 세라마이드 (Gb3)	Gal-α1, 4Gal-β 4Glc-β1, 1-Cer	0.71
끌로보테트라오실 세라마이드 (글로보사이드)	GalNAc-β1, 3Gal-α1, 4Gal-β1, 4Glc-β1, 1Cer	0.62
글로보펜타오실세라마이드 (포르스만)	GalNAc-α1, 3GalNAc-β1, 3Gal-α1, 4Gal-β1, 4Glc-β1, 1-Cer	0.56
GM3	NeuAc-Galβ1, 4-Glc-β1, 1-Cer	0.53		0.53
				0.49
AGM1	Galβ1, 3-GalNAc-β1, 4-Galβ1, 4Glc-β1, 1-Cer	0.48
GM1	Galβ1, 3-GalNAc-β1, 4-(NeuAc)Galβ1, 4Glc-β1, 1-Cer	0.39		0.39
				0.36
GD3	NeuAc-NeuAc-Galβ1, 4Glc-β1, 1-Cer	0.33
				<0.24
GD1a	NeuAc-Galβ1, 3-GalNAc-β1, 4-(NeuAc)Gal β1, 4Glc-β1, 1-Cer	0.22
GD1b	Galβ1, 3-GalNAc-β1, 4-(NeuAc-NeuAc)Galβ1, 4Glc-β1, 1-Cer	0.16
GT1b	NeuAc-Galβ1, 3-GalNAc-β1, 4-(NeuAc-NeuAc)Galβ1, 4Glc-β1, 1-Cer	0.08

최소 극성 SC104 항원이 GM3과 같이 이동하며, 가장 극성인 분자는 GDla 및 GDlb와 유사한 R_F 값을 가지고 이동한다는 것이 나타난다. 그러나 모든 경우에 있어서, 표준물 자체는 인식되지 않는다.

표준 강글리오사이드류의 많은 것들과 비견되는 R_F 값을 가진 항원의 이동은, 시알릴화에 대한 요구사항과 함께, 항원이 세 개 또는 네 개 단당으로 구성되는 짧은 중성 올리고 당 골격을 가진다는 것을 암시하고 있다. 이것은 더 용이하게 다중 시알릴화될 수 있기때문에, 실제적으로 테트라오실 구조라는 것이 가장 설득력 있다. 검출되는 최소의 극성 항원은 더 짧은 올리고당 골격으로 구성되는 부분적 항원 구조인 것이 유력하다.

실시예 6 SC104 mab에 의해 인식되는 종양 당단백질의 동정

실험 1

방법

SC104 항원 정제 및 특성화. SC104 특이성 항원을 0.1M pH 7.6 Tris 0.5% NP40과 1:1 비율로 혼합된 타액 샘플로부터 정제하였다. 간략히, 공유결합 링커로서 이베틸피멜리미데이트 2를 사용하는 Protein ACl-6B 세파로즈에 SC104 S136A를 가교시킴으로써 면역-친화성을 생성하였다.

결과

상기 항원이 SC104와 교차반응하지만 (도 13a), 항-시알릴 Lewis^a 또는 19/9 항체와 교차 반응하지 않는다는 것은 주목할 만하다.

실험 2

방법

SC104 항원의 서열 확인

SC104 특이적 항원을 실험 1에서 개요된 바와 같이 타액으로부터 정제하였고, 샘플을 10% SDS-PAGE 상에서 전개하고 공급자 지시에 따라 실버 염색하였다 (Bio-Rad Silver stain kit, catalogue number 1610443). 관심의 밴드를 후속적으로 MALDI 분석하였다.

결과

50-75kDa 사이에 있는 SC104 항원에 대한 밴드를 실버염색된 젤 상에서 확인하였다 (도 14). MALDI 서열 분석은 아래와 같은 가능한 화합물을 제시하였다:

P04839 GP91-PHOX) (GP91-1) (헴 결합 막 당단백질)

Q99741 세포 분역 조절 단백질 6 동족체 (CDC6-관련 단백질)

Q14451 성장 인자 수용체-결합 단백질 7 (GRB7 어댑터 단백질)

P14618 파이루베이트 키나제, 이소자임 Ml/M2 (EC 2.7.1.40) (파이루베이트 키나제근육 이소자임)

096013 세린/트레오닌-단백질 키나제 PAK 4 (EC 2.7.1.37) (p21-활성화된 키나제 4)

P01833 (중합체성 Ig 수용체)

SC104가 탄수화물을 인식하기 때문에, 이러한 결과들은 시알릴테트라소일당이이러한 당단백질 상에서 발현될 수 있다는 것을 가르킨다.

실험 3

방법

SC104 단백질 A 세파로즈 컬럼을 사용하는 면역-정제된 항체를 이용한 경쟁 분석. SC104 정제 분획을, ELISA 기술에 근거한 실험을 이용한 C170 세포로의 SC104 결합에 대한 경쟁자로서 사용하였다(도 15). 마이크로타이터 플레이트를 C170의 5x104/웰로 코팅하였고, 세포를 고정시키고 차단한 후 증가하는 항원 비율로 혼합한 비오틴화된 항원 (0.1 μg/웰)의 용액으로 항온처리하였다. 결합된 SC104 비오틴화된 항체를 SA-HRP 및 TMB로 검출하였다. 결과는 650nm 흡광도로 표시된다.

결과

단백질 ACl-6B 세파로즈면역-친화력 컬럼을 이용한 면역-정제된 SC104 항원은 그의 표적에 대한 항체의 결합을 특이적으로 저해하는 능력이 있다는 것이 나타났다.

실시예 7 SC104는 종양 세포 살해를 직접적으로 유도한다.

실험 1

방법

아넥신/PI. 실온에서 4시간 동안 SC104 항체 (1 μg/ml) 또는 적절한 대조군으로 배양한 종양 세포 (1x105 분주물) 현탁액을 또한 FITC-표지된 아넥신 및 요오드화 프로피디움 (Sigma, Poole, Dorset)으로 염색하였고 그 후 이중 색깔 유세포분석기로 분석하였다.

결과

본 연구는 새로이 해체한 결장 종양을 강하게 염색하는 것을 나타내고 있다. 그러나 이러한 연구 중에, SC104 항체는 종양 세포사를 가속화하는 것으로 나타났다. 정상적으로는 부착 단층으로서 성장하는 종양 세포주가 현탁 상태에 놓여 있게 되고 SC104 항체로 염색하여 유세포분석하면, 유사 현상이 관측되었다. 상기 항체가 어팝토시스 또는 괴사를 유도하느냐를 결정하기 위해, SC104 항체에 노출된 세포를 아넥신 및 요오드화 프로피디움으로 대항염색하였다(도 16). 대조군 항체로 염색된 세포 25% 미만이 아넥신 또는 요오드화 프로피디움으로 염색되었다. 반면에, 10 μg/ml SC104보다 큰 농도에 노출된 세포는 세포의 30%가 아넥신으로, 75%가 PI 및 65%가 둘 다로 강하게 염색되었다.

아넥신 단독으로 염색된 세포는 어팝토시스 초기 간계에 나타나는 반면 아넥신 및 PI 둘 다에 염색되는 세포는 어팝토시스/괴사의 후기에 나타난다.

실험 2

방법

판 카스파제 활성화. 2x105 결장 C170 세포를 SC104 30 μg/ml에 6 시간까지 노출시키고 판 카스파제 FITC-FMK-vad (caspACE FITC-vad-FMK, Promega, catalogue number G7462)를 사용하여 카스파제를 활성화시켰다. 상기 세포를 유세포분석기로 분석하였다. 대조군은 음성 대조군 쥐 항체 및 Fas 항체를 100 ng/ml로 포함하였다.

결과

분석 결과는 5 시간 후에 SC104가 판 카스파제를 활성화시킨다는 것을 보이고 있다(도 17).

실험 3

방법

SC104 mab에 의한 카스파제 6. 2x105 결장 C170 세포를 SC104 1- 100 μg/ml에 6 시간 노출시키고 세포 용해물을 생성하였다. 다음, 이 용해물을 12% SDS-PAGE에 전개시키고, 웨스턴 블랏팅하고, 카스파제 6 특이적 항체 (절개된 카스파제 6 항체, Cell Signalling Technology (NEB), catalogue number 9761)로 탐침하였다. SC101에 노출된 항체를 음성 대조군으로 포함하였다.

결과

웨스턴 블랏을 전개하면 (도 18), SC104 mab 10, 및 더욱 강하게 100 μg/ml에 노출된 C170 세포에서 카스파제 6가 활성화 된 것이 나타난다. SC101 mab로 처리된 그러한 세포들은 카스파제 6의 그러한 활성을 보이지 않았다.

실험 4

방법

z-FMK-vad 카스파제 저해체를 이용한 세포사의 SC104 저해. 2x105 C170 세포를 SC104 3 μg/ml로 처리하고 반을 3 μM z-FMK-vad 저해체 (Promega, catalogue number G7232)로 처리하고 밤새 배양하였다. 다음날 세포 생존도를 아넥신 V FITC 및 요오드와 프로피디움을 사용하여 분석하였다.

결과

상기 저해체 존재하에서 살아있는 세포가 23% 증가하였고 (도 19), 이는 ‘전형적(classic)’ 어팝토시스 경로에 의해 SC104 결장 세포를 살해하는 것을 강력히 나타낸다..

실험 5

방법

세포 성장의 저해. 1x103 결장 C170, C168, C146, CaC02, Colo205, LoVo 및 HT29 세포를 평평한 바닥 96-웰 플레이트의 개별 웰에 분주하고 37℃에서 밤새 부착하도록 두었다. 다음날, 상기 세포를: 10, 3, 1, 0.3 및 0 μg/ml SC104 mab로 처리하였다. 음성 대조군으로서, 100, 30, 10, 3 및 0 μg/ml 농도의 791T/36를 사용된 약물의 각 농도에 대하여 적정하였다. 세 벌의 웰을 사용하였다. 세포를 5 일간 37℃에서 방치한 후 MTS 시약을 각 웰에 첨가하고 490 nm에서 광학 밀도를 판독하였다.

결과

부착 세포 증식에 대한 SC104을 MTS 분석으로 측정하였다. 10 μg/ml을 초과하는 농도에서, SC104는, 그러나 대조군 항체는 아니고, 결장 종양 세포주 C170 및 Colo205의 성장을 저해하였고, 그러나 HT29 또는 LoVo을 저해하지는 않았다 (도 20). 도 21은 종양 세포주 C170, Colo205, HT29 및 LoVo에 대한 IC50 값을 나타낸다. 다른 유방 및 결장 종양 세포주에서 유사 결과를 얻었다 (도 7). 이러한 결과들은 SC104가 고 투여량에서 어팝토시스를 유도함으로써 종양 세포 증식을 저해하고 있다는 것을 나타낸다. 그러나 세포/세포 접촉을 상실한 부유 세포들은 더 적은 항체 농도에서 빠르게 세포사로 돌입하였다.

SC104의 세포 성장 저해

세포주	MTS 염색으로 측정된 세포 성장 저해도 %
	SC104 (30μg/ml)	791T/36 (30μg/ml)
C170	70	10
C146	65	6
C168	55	3
CaCO2	20	2
Colo205	55	5
HT-29Z	5	5

실험 3 친동종 결합

방법

새로운 및 고정된 세포상에서의 FACS. 새로운 것이거나 0.5% 글루타르알데히드로 1 시간 고정시킨 것이거나 간에, C170 세포 (105)를 SC104 mab (0-100 μg/ml) 100 μl에 재현탁하고 얼음 위에서 1 시간 배양하였다. 샘플을 RPMI/10% FCS에서 3 번 세척하고, 세포를 FITC 표지 토끼 항-마우스 (1/80: Dako Ltd, Bucks, UK) 항체로 처리하고 얼음 위에 30 분간 두고 전술한 바와 같이 FACS로 분석하였다.

친동종 결합용 ELISA. 평평한 바닥의 유연한 96 웰 ELISA 플레이트를 항-마우스 IgG Fc 특이적 항체로 코팅하거나 PBS에 녹인 C14 항원 3 μg/ml (100 μl/웰)으로 코팅하고 밤새 건조시켰다. 플레이트를 PBS로 세 번 세척한 후 PBS/1% BSA와 실온에서 1 시간 결합시켰다. SC104 항체 (0-100 μg/ml)를 얼음 위에 1 시간 두었다. 상기 플레이트를 PBS/0.05% tween-20에서 3 번 세척한 후, 비오틴화된 SC104를 첨가하고 얼음 위에서 30 분간 배양하였다. PBS 0.05% tween-20에서 세 번 더 세척한 후, 항-마우스 SA-HRP (1/1000; Dako, High Wycombe, UK) 또는 염소 항-마우스 Fc (1/1000: Dako, High Wycombe, UK)를 적절히 첨가하고 얼음 위에 30 분간 두었다. 플레이트를 PBS/0.05% tween-20에서 5 번 세척한 후 TMB 기질을 100 μl/웰로 첨가하고 570nm에서 판독하였다.

결과

C170 종양 세포의 표면에 있는 SC104 합텐의 수는 세포당 약 4x105 부위이다. 그러나 항원의 이러한 수는 SC104 1 μg/ml으로 쉽게 포화된다. 그러므로 10 배 넘는 항체가 세포 살해에 필요한 이유를 납득하기 어렵다. 이것은, 항체 결합시 더 많은 부위가 드러나는 것이 있을 수 있다. 따라서 항체 포화 곡선이 새로운 및 고정된 세포 상에서 형성된다. 상기 항원은 100 μg/ml의 SC104 농도에서도 포화되지 않으며, 곡선들은 새로운 및 고정된 세포에서 유사하며, 이는 추가의 항원이 드러날 것 같지 않는다는 것을 나타낸다(도 22). 이러한 결과들은 GD3 강글리오사이드를 인식하는 마우스 mab의 R24상에서의 이전의 데이타와 유사하다. 이러한 항체는 비-포화성 항체 결합을 나타내며, 일련의 뛰어난 실험에서 항원과 그 자체 둘다에 결합할 수 있는 친동종 결합 항체임이 나타났다 (결과 미도시). 그러므로, ELISA 플레이트를 미표지된 SC104로 코팅하고 SC104 비오틴 HRP-아비딘의 결합을 특정함으로써 SC104가 자체에 결합하는 능력에 대하여 조사하였다. SC104는 자체에 결합하지 않았다 (도 23), 그러나 SC104 합텐을 나타내는 정제된 당단백질을 사용하여 플레이트를 코팅할 때는, SC104는 화학량론적으로 10 μg/ml까지 결합하였고 이 후, 이러한 농도를 훨씬 넘어서 결합하였다 (도 23). 이러한 결과는 낮은 항체 농도에서, 항체가 항원에 결합하지만, 높은 농도에서는 항원에 결합된 항체가 항체와 더 결합할 수 있다는 것을 제시하고 있다. 이것은 항체의 기능적 항원항체 결합력 (functional avidity)를 극적으로 증가시킬 수 있고, 이는 높은 농도의 항원을 가진 세포 상에 항체의 격자를 세우는 결과를 낳는다. 이러한 격자 형성은 높은 항체 농도에서 어팝토시스를 결과하는 다중 신호를 유발할 수 있다.

실험 4 세포 독성 약물과 연계한 세포 성장의 세포 내 저해

1x10³ 결장 C170 세포를 평평한 바닥의 96-웰 플레이트의 개별 웰에 분주하고 밤새 37℃에서 부착되도록 두었다. 다음날, 세포를 시스플라틴, 미토마이신 C, 옥살리플라틴 및 타목시펜으로 최종 농도 10, 3, 1, 0.3, 0.1 및 0 μM에서 처리하였다. 약물의 각 농도에 대하여, 하기 농도의 SC104를 적정하였다: 10, 3, 1, 0.3 및 0 μg/ml. 음성 대조군으로서, 100, 30, 10, 3 and 0 μg/ml 농도의 791T/36를 사용한 약물의 각 농도에 대하여 적정하였다. 두 겹의 웰을 사용하였다. 세포를 37℃에서 5 일간 두고 각 웰에 MTS 시약을 첨가하고 490 nm에서 광학 밀도를 판독하였다.

결과

화학 요법 제제로 SC104가 보이는 추가의 살해능은 시험관에서 MTS 분석으로 조사하였다. 모든 약물은 SC104 또는 대조군 항체 (0.3-100 μg/ml)의 존재하에서 0.1-10 μg/ml 사이에서 적정되었다. 도 24는 SC104 및 5-FU의 조합물로 처리된 세포에 대한 대표적인 실험을 나타낸다. 도 25는 SC104가 시스플라틴, 미토마이신 C, 5-FU 및 타목시펜으로 추가의 상해를 나타내는 것을 보이는 결과를 요약하고 있다. 아무런 추가 효과가 옥살리플라틴으로는 나타나지 않았다.

실험 5 세포독성 약물과 연계한 종양 세포 성장의 생체내 저해

방법

예방 모델. 결장 종양 세포주, C170을 누드 마우스에서 유지하였다. 치료 목적으로,마우스를 희생시키고 종양을 절제하였다. 종양을 잘게 저미고 3mm² 절편을, 4 개 실험 군으로 무작위적으로 나눈 30 마리의 수컷 마우스의 피하에 이식하였다.

마우스의 C170 이종이식편의 3mm² 조각을 체외배양하였다. 1, 3, 5, 7 및 28 일째에 마우스 군들을 5-FU/류코보린 (12.5mg/Kg)로 정맥내 관류시켰다. 동일 일에, 마우스를 또한 SC104 mab 0.2 mg으로 복강내 투여하였다. 대조군 마우스를 SC104 단독으로 또는 대조군 마우스 IgG 항체와 5-FU/류코보린으로 투여하였다. 종양 크기를 캘리퍼스로 측정하였고 종양의 단면적을 7, 9, 12, 14 및 16일 째에 계산하였다. 동물의 체중을 측정하여 치료의 독성을 산정하였다. 실험 종결시 종양의 무게를 재어 항-종양 효능을 산정하였다.

치료 모델. C170을 누드 마우스에서 유지하였다. 치료 목적으로,마우스를 희생시키고 종양을 절제하였다. 종양을 잘게 저미고 3mm² 절편을, 4 개 실험 군으로 무작위적으로 나눈 30 마리의 수컷 마우스의 피하에 이식하였다.

마우스의 C170 이종이식편의 3mm² 조각을 체외배양하였다. 3, 5, 7, 21 및 22 일째에 마우스 군들을 5-FU/류코보린 (12.5 mg/Kg)로 정맥내 관류시켰다. 동일 일에, 마우스를 또한 SC104 mab 0.2 mg으로 복강내 투여하였다. 대조군 마우스를 SC104 단독으로 또는 대조군 마우스 IgG 항체와 5-FU/류코보린으로 투여하였다. 종양 크기를 캘리퍼스로 측정하였고 종양의 단면적을 12, 16, 19 및 23일 째에 계산하였다.

결과

이러한 효과가 생체 내에서 종양 성장의 저해로 반영이 되는지를 결정하기 위해, SC104를 C170 종양의 3 mm² 추출물로 이식된 마우스 또는 항체 투여 전에 5 일간 성장하도록 허용된 C170 종양에 3 주 간격으로 (200 μg/투여)으로 투여하였다. 동물을 SC104 단독, 최대 투여 용량의 5-FU/류코보린 또는 이 둘의 조합물로 3 주간 처리하였다. 도 26a는 SC104 또는 5-FU/류코보린 단독 처리는 둘 다 새롭게 체외 배양된 종양의 종양 성장을 50% 저해하는 것으로 나타난다. 이와는 달리, 둘의 조합물은 성장을 상승작용적으로 저해하였다. 모든 군에서 종양들은 스태거드 터미네이션 (staggered termination)이 개시될 때 16 일 까지 종양 성장에서 일시적으로 증가하는 것을 나타낸다.

9일째부터, 모든 다른 치료군과 비교할 때, 조합적으로 치료한 군은 하기와 같이 유의할만한 성장 저해를 나타냈다:- SC104 및 5-FU, 제 9일; 37% 저해, p = 0.004; 제 12일; 59% 저해, p = 0.002; 제 14일; 74% 저해, p=<0.001; 제 16일; 76% 저해, p=<0.001.

5-FU, 제 9일; 40% 저해, p=0.004; 제 12일; 45% 저해, p=0.004; 제 14일; 58% 저해, p=<0.001; 제 6일; 62% 저해, p=<0.001.

SC104, 제 9일; 32% 저해, p=0.017; 제 12일; 44% 저해, p=0.004; 제 14일; 54% 저해, p= 0.001; 제 16일; 62% 저해 p= <0.001. 모든 통계치는 ANOVA로 산정하였다.

SC104 처리 군 및 세포독성 제제 5-FU/류코보린을 받은 군 사이에 유의할 만한 차이는 없었다. 이는 SC104, 5-FU 또는 이의 조합으로 처리된 마우스의 생존이 상당히 향상되는 것과 연계된다 (도 26b). SC104 및 5-FU의 조합으로 처리된 군은 담체 대조군 및 5-FU 처리된 군에 비해 하기와 같이 향상된 생존율을 나타낸다:-

조합물:담체: p=0.0038.

조합물:세포독성 제제: p=0.0111 (모든 통계치는 Log Rank에 의해 산정됨)

SC104의 이러한 투여량은 모든 마우스에게서 견딜 수 있는 것이어서, 체중 감소나 임의의 다른 심한 병인을 보이지 않았다 (도 26c). 최종적으로, C170 이종이식 종양편의 이식 7일 후에 SC104를 치료적으로 투여하였을 때, 5FU 이나 SC104 단독 어느 것도 성장을 유의하게 저해시키지 못하였으나, 5FU/류코보린과 조합하여 사용될 때, 그것은 종양 성장을 유의하게 저해시켰고 생존을 향상시켰다 (도 27). SC104 플러스 5-FU/류코보린은 최종 중량/시간을 상당히 감소시켰고 종양 성장을 저해하여 C170 피하 이종이식 모델에서 상당한 생존증가를 가져왔다.

<110> Scancell Limited <120> MONOCLONAL ANTIBODY SC104 AND DERIVATIVE THEREOF SPECIFICALLY BINDING TO A SIALYLTETRAOSYL CARBOHYDRATE AS A POTENTIAL ANTI-TUMOR THERAPEUTIC AGENT <150> PCT/GB2005/001805 <151> 2005-05-11 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer (Heavy Chain) <400> 1 atgagagtgc tgattctttt gtg 23 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward Primer (Kappa Chain) <400> 2 atggatttwc argtgcagat twtcagcttc 30 <210> 3 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer (Heavy Chain) <400> 3 cccaagcttc cagggrccar kggataracg grtgg 35 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse Primer (Kappa Chain) <400> 4 cccaagctta ctggatggtg ggaagatgga 30 <210> 5 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly Tyr Ser Trp His 1 5 10 <210> 6 <211> 33 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 6 ggctactcca tcacgagtgg ttatagttgg cac 33 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Mus musculus <400> 17 Phe Gln Gly Ser Glu Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 18 tttcagggga gtgagtatcc actcacg 27 <210> 19 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 19 ctcagtcacc gtctctagcg ctaaaacgac acccccacc 39 <210> 20 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 20 ggtgggggtg tcgttttagc gctagagacg gtgactgag 39 <210> 21 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 21 ccaagctgga aatgacacgt acggatgctg caccaactg 39 <210> 22 <211> 39 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 22 cagttggtgc agcatccgta cgtgtcattt ccagcttgg 39 <210> 23 <211> 154 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 23 Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Cys Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 35 40 45 Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Met 50 55 60 Glu Trp Met Gly His Ile His Phe Ser Gly Arg Pro Thr Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Leu Leu Gln Leu Lys Phe Val Thr Thr Glu Asp Thr Ser Thr Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Lys Gly Lys Gly Ser Asp Asp Gly Leu Asn Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro 130 135 140 Pro Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Ser Leu 145 150 <210> 24 <211> 463 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 24 atgagagtgc tgattctttt gtgcctgttc acagcctttc ctggtatcct gtctgatgtg 60 cagcttcagg agtcaggacc tgacctggtg aaaccttctc agtcactttc actcacctgc 120 actgtcactg gctactccat cacgagtggt tatagttggc actgggtccg gcagtttcca 180 ggaaacaaaa tggaatggat gggccacatt cacttcagtg gtagacctac ttacaatcca 240 tctctcagca gtcgaatctc gatcactcga gacacatcca agaaccagtt cctcctgcaa 300 ttgaaatttg tgactactga agacacatcc acatattttt gtgcaaggaa gggaaaaggt 360 tccgacgatg gtttgaacta ctggggtcaa ggaatctcag tcaccgtctc ttcagccaaa 420 acgacacccc cacccgttta tcccttggtc cctggaagct tgg 463 <210> 25 <211> 154 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 25 Met Arg Val Leu Ile Leu Leu Cys Leu Phe Thr Ala Phe Pro Gly Ile 1 5 10 15 Leu Ser Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro 20 25 30 Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr 35 40 45 Ser Gly Tyr Ser Trp His Trp Val Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Met 50 55 60 Glu Trp Met Gly His Ile His Phe Ser Gly Arg Pro Thr Tyr Asn Pro 65 70 75 80 Ser Leu Ser Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln 85 90 95 Phe Leu Leu Gln Leu Lys Phe Val Thr Thr Glu Asp Thr Ser Thr Tyr 100 105 110 Phe Cys Ala Arg Lys Gly Lys Gly Ser Asp Asp Gly Leu Asn Tyr Trp 115 120 125 Gly Gln Gly Ile Ser Val Thr Val Ser Ser Ala Lys Thr Thr Pro Pro 130 135 140 Pro Val Tyr Pro Leu Val Pro Gly Ser Leu 145 150 <210> 26 <211> 463 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 26 atgagagtgc tgattctttt gtgcctgttc acagcctttc ctggtatcct gtctgatgtg 60 cagcttcagg agtcaggacc tgacctggtg aaaccttctc agtcactttc actcacctgc 120 actgtcactg gctactccat cacgagtggt tatagttggc actgggtccg gcagtttcca 180 ggaaacaaaa tggaatggat gggccacatt cacttcagtg gtagacctac ttacaatcca 240 tctctcagca gtcgaatctc gatcactcga gacacatcca agaaccagtt cctcctgcaa 300 ttgaaatttg tgactactga agacacatcc acatattttt gtgcaaggaa gggaaaaggt 360 tccgacgatg gtttgaacta ctggggtcaa ggaatctcag tcaccgtctc ttcagccaaa 420 acgacacccc cacccgttta tcccttggtc cctggaagct tgg 463 <210> 27 <211> 147 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 27 Met Asp Leu Gln Val Gln Ile Phe Ser Phe Leu Leu Ile Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Ile Met Ser Arg Gly Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile 20 25 30 Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser 35 40 45 Ser Ser Leu Ser Tyr Ile His Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Arg Thr Ser 50 55 60 Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro 65 70 75 80 Gly Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Asn Ser Tyr Ser Leu Thr Ile 85 90 95 Ser Ser Met Glu Ala Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly 100 105 110 Ser Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Met Thr 115 120 125 Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Lys 130 135 140 Leu Gly Lys 145 <210> 28 <211> 443 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 atggatttac aggtgcagat tttcagcttc ctgctaatca gtgcctcagt cataatgtcc 60 agaggagaaa atgttctcac ccagtctcca gtaatcatgt ctgcatctcc aggggaaaag 120 gtcaccatga cctgcagtgc cagctcaagt ttaagttaca tacactggta ccagcagaag 180 tcaagaacct cccccaaact ctggatttat gacacatcca acctggcttc tggagtccca 240 ggtcgcttca gtggcagtgg gtctggaaac tcttattctc tcacgatcag cagcatggag 300 gctgaagatg ttgccactta ttactgtttt caggggagtg agtatccact cacgttcggg 360 ggggggacca agctggaaat gacacgggct gatgctgcac caactgtatc catcttccca 420 ccatccagta agcttgggaa ggg 443

Claims (27)

1. 시알릴테트라오실 카보하이드레이트와 결합하며 면역 효능 세포를 필요로 하지 않고 세포사를 직접 유도할 수 있는 분리된 특이적 결합 구성체.
2. 시알릴테트라오실 카보하이드레이트가 도 1a의 아미노산 서열의 잔기 44 또는 49 내지 54, 69 내지 84, 및 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 도메인들로부터 선택된 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 구성체에 의해 결합될 수 있는, 시알릴테트라오실 카보하이드레이트와 결합할 수 있는 분리된 특이적 결합 구성체.
3. 제 2 항에 있어서, 상기 결합 도메인은 도 1a의 잔기 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 구성체.
4. 제 2 항 또는 제 3 항에 있어서, 도 1의 아미노산 서열의 잔기 44 또는 49 내지 54, 69 내지 84 또는 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 도메인들로부터 선택된 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 특이적 결합 구성체.
5. 제 4 항에 있어서, 도 1a의 잔기 117 내지 127로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 구성체.
6. 제 5 항에 있어서, 도 1a에 표시된 아미노산 서열의 잔기 44 또는 49 내지 54 및 잔기 69 내지 84로서 실질적으로 설정된 결합 도메인들 중 하나 또는 둘 다를 추가로 포함하는 것인 결합 구성체.
7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 도메인 또는 각 결합 도메인은 인간 항체 골격(framework)에 의해 수반되는 것인 결합 구성체.
8. 제 4 항 내지 제 6 항 중 어느 하나의 항에 있어서, 도 1a에 표시된 아미노산 서열의 잔기 19 내지 138로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 구성체.
9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 결합 구성체.
10. 시알릴테트라오실 카보하이드레이트가 도 1c의 아미노산 서열의 잔기 46 내지 55, 71 내지 77 및 110 내지 118로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 도메인들부터 선택된 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 구성체에 의해 결 합될 수 있는, 시알릴테트라오실 카보하이드레이트와 결합할 수 있는 분리된 특이적 결합 구성체.
11. 제 10 항에 있어서, 상기 결합 도메인은 도 1c의 아미노산 서열의 잔기 110 내지 118로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 것인 결합 구성체.
12. 제 10 항 또는 제 11 항에 있어서, 도 1c의 아미노산 서열의 잔기 46 내지 55, 71 내지 77 및 110 내지 118로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 도메인들로부터 선택된 하나 이상의 결합 도메인을 포함하는 것인 결합 구성체.
13. 제 12 항에 있어서, 도 1c의 아미노산 서열의 잔기 110 내지 118로서 실질적으로 설정된 아미노산 서열을 포함하는 결합 도메인을 포함하는 것인 결합 구성체.
14. 제 13 항에 있어서, 도 1c에 표시된 아미노산 서열의 잔기 46 내지 55 및 잔기 71 내지 77로서 실질적으로 설정된 결합 도메인 중 하나 또는 둘다를 추가로 포함하는 것인 결합 구성체.
15. 제 10 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 결합 도메인 또는 각 결합 도메인은 인간 항체 골격에 의해 수반되는 것인 결합 구성체.
16. 제 12 항 내지 제 14 항 중 어느 한 항에 있어서, 도 1c에 표시된 아미노산 서열의 잔기 23 내지 128로서 실질적으로 설정된 서열을 포함하는 것인 결합 구성체.
17. 제 10 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 불변 영역을 추가로 포함하는 것인 결합 구성체.
18. 제 2 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 결합 구성체와 제 10 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항의 결합 구성체를 병용 또는 연합하여서 되는, 특이적 결합 구성체.
19. 의약 용도로 사용되는 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 결합 구성체.
20. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 결합 구성체 및 약제학적으로 허용가능한 부형제, 희석제, 담체, 완충제 또는 안정제를 포함하는 약학 조성물.
21. 종양 환자에게 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 결합 구성체의 유효한 양을 투여하는 것을 포함하는, 환자의 종양을 치료하는 방법.
22. 종양 치료용의 약물을 제조하는데 사용되는, 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 따른 결합 구성체의 용도.
23. 종양 치료에 동시적으로, 개별적으로 또는 순차적으로 사용하기 위해 조합된 제조물로서 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성체 및 활성 제제를 포함하는 제품.
24. 제 23 항에 있어서, 상기 활성 제제가 독소루비신, 탁솔, 5-플루오로우라실, 이리노테칸 (irinotecan) 및/또는 시스플라틴인 것인 제품.
25. 제 1 항 또는 제 18 항 중 어느 한 항의 결합 구성체를 코딩하는 핵산.
26. 제 1 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항의 특이적 결합 구성체에 의해 결합될 수 있는 시알릴테트라오실 카보하이드레이트.
27. 제 26 항에 있어서, 지질 또는 단백질 골격 상에 존재하는 시알릴테트라오실 카보하이드레이트.

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