KR20070083638A - 스태필로코커스 아우레우스 철포획체의 억제제에 대한스크리닝 분석 - Google Patents

스태필로코커스 아우레우스 철포획체의 억제제에 대한스크리닝 분석 Download PDF

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더 유니버시티 오브 웨스턴 온타리오
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Abstract

본 발명은 신규한 철포획체의 생합성에서 스태필로코커스 아우레우스 (에스. 아우레우스) sbn 오페론의 역할의 발견에 관한 것이다. 본 발명은 또한 철포획체의 생합성을 억제하는 화합물을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
철포획체, 스태필로코커스 아우레우스, sbn 오페론, 생합성, 스크리닝

Description

스태필로코커스 아우레우스 철포획체의 억제제에 대한 스크리닝 분석 {Screening Assays for Inhibitors of a Staphylococcus aureus Siderophore}
관련 출원에 대한 교차 언급
본원은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 2004년 9월 8일 출원된 미국 가출원 60/607,896에 기초한 우선권을 주장한다.
철은 아마도 락토바실러스 (Archibald (1983) FEMS Microbiol. Lett. 19:29-32) 및 보렐리아 부르그도르페리 (Borrelia burgdorferi) (Posey and Gherardini (2000) Science 288:1651-1653)을 제외하고 대부분의 미생물의 성장을 위해 절대적으로 필요하다. 지각에 가장 풍부한 제4의 원소임에도 불구하고, 철은 종종 성장 제한 영양소이다. 호기성 환경 및 생리학적 pH에서, 철은 제2철 (Fe3+) 상태로 존재하고, 불용성 히드록시드 및 옥시히드록시드 침전물을 형성한다. 포유동물은 철을 가용화시켜 숙주 세포에 전달하는 기능을 하는 고친화도 철 결합 당단백질, 예를 들어 트랜스페린 및 락토페린을 보유함으로써 철 제한을 극복한다 (Weinberg (1999) Emerg. Infect. Dis. 5:346-352). 이것은 유리된 세포외 철을 추가로 제한하고, 따라서 인체 내의 유리된 철의 농도는 10-18 M로 추정되고, 이 농도는 증식성 세균 감염을 지지하기 위해 필요한 것보다 수 차수 더 낮은 농도이다 (Braun et al., (1998) Bacterial iron transport: mechanisms, genetics, and regulation, p. 67-145. In A. Sigel and H. Sigel (ed.), Metal Ions in Biological Systems, vol. 35. Iron transport and storage in microorganisms, plants, and animals. Marcel Dekker, Inc., New York).
철 제한을 극복하기 위해서, 세균은 상기 필수 영양소를 획득하기 위한 복수의 상이한 메카니즘을 발전시켰다. 예를 들어, 파스퇴렐라세애 (Pasteurellaceae)의 멤버는 트랜스페린 및 락토페린의 철 부가 형태의 인식을 위한 수용체를 발현할 수 있다 (Gray-Owen and Schryvers, (1996) Trends Microbiol. 4:185-91). 그러나, 가장 흔한 철 획득 메카니즘의 하나는 철포획체로 불리는 저분자량, 고친화도 철 킬레이터 및 제2철-철포획체 복합체를 능동적으로 흡수하는 기능을 수행하는 동족체 (cognate) 세포막 수용체의 사용을 통한 것이다. 많은 철포획체는 숙주 철에 대해 트랜스페린 및 락토페린과 성공적으로 경쟁할 수 있다. 실제로, 제2철-철포획체 흡수 시스템의 발현은 세균, 예를 들어 패혈성 이. 콜라이 (E. coli) (Williams (1979) Infect. Immun. 26:925-932), 비브리오 안귈라룸 (Vibrio anguillarum) (Crosa et al. (1980) Infect. Immun. 27:897-902), 에르위니아 크리산테미 (Erwinia chrysanthemi) (Enard et al. (1988) J. Bacteriol. 170:2419-2426) 및 슈도모나스 애루기노사 (Pseudomonas aeruginosa) (Meyer et al. (1996) Infect. Immun. 64:518-523)에서 중요한 발병 인자이다.
스태필로코커스 아우레우스 (S. aureus)는 복수의 상이한 철-조절된 ABC 트랜스포터, 예를 들어 sstABCD (Morrissey et al. (2000) Infect. Immun. 68:6281- 6288), sirABC (Heinrichs et al. (1999) J. Bacteriol. 181:1436-1443) 및 fhuCBG (Sebulsky et al. (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400) 오페론에 의해 코팅되는 것을 갖는다. sst 및 sir 시스템에 대한 수송된 기질은 모르지만, fhuD1 및 fhuD2와 협력하여 fhuCBG 유전자 (Sebulsky and Heinrichs (2001) J. Bacteriol. 183:4994-5000)는 철(III)-히드록사메이트 복합체의 획득에 관련된다. 스태필로코커스의 복수의 멤버, 예를 들어 많은 코아귤라제-음성 스태필로코커스 (CoNS) 및 에스. 아우레우스의 균주는 철포획체를 생산한다. 상기 철포획체의 2종류, 즉 스태필로페린 A (Konetschny-Rapp et al. (1990) Eur. J. Biochem. 191:65-74; Meiwes et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 67:201-206) 및 스태필로페린 B (Dreschel et al. (1993) BioMetals. 6:185-192; Haag et al. (1994) FEMS Microbiol. Lett. 115:125-130)는 폴리카르복실레이트 클래스이지만, 제3의 아우레오켈린 (Courcol et al. (1997) Infect. Immun. 65:1944-1948)은 화학적으로 특성화되지 않았다. 본 발명자들의 연구에 들어가면서, 어떠한 분자유전자적 정보도 임의의 스태필로코커스 철포획체의 합성에 대해 알려지지 않았다.
에스. 아우레우스는 작은 피부 및 상처 감염에서부터 보다 심각한 후유증, 예를 들어 심내막염, 골수염 및 패혈증에 이르는 광범한 감염을 야기하는 우세한 인간 병원체이다 (Archer (1998) Clin. Infect. Dis. 26:1179-1181). 에스. 아우레우스가 많은 조직에 침습하여 성장하는 능력은 복수의 발병 인자, 예를 들어 조직 부착을 돕는 피브로넥틴-, 엘라스틴- 및 콜라겐-결합 단백질 및 조직 파괴 및 세균 전염을 야기하는 다중 외독소 및 프로테아제를 발현하는 그의 능력에 기인할 수 있다. 상기 세균이 생체내 성장 동안 철을 획득하는 능력도 그의 발병기전에 중요한 것으로 보이고, 그 생성물이 숙주 철 화합물의 결합 및(또는) 수송에 관여하는 여러 개의 상이한 유전자가 여러 연구 집단에 의해 특성화된 바 있다 (Mazmanian et al. (2003) Science 299:906-9; Modun et al. (1998) Infect. Immun. 66:3591-3596; Taylor and Heinrichs (2002) Mol. Microbiol. 43:1603-1614).
초기에, 페니실린은 최악의 에스. 아우레우스 감염의 치료에도 사용될 수 있었다. 그러나, 에스. 아우레우스의 페니실린 내성 균주의 출현은 에스. 아우레우스 감염 치료에서 페니실린의 효과를 감소시켰고, 오늘날의 병원 감염에서 에스. 아우레우스의 대부분의 균주는 페니실린에 반응하지 않는다. 에스. 아우레우스의 페니실린 내성 균주는 페니실린을 펜실린산으로 전환시키는 락타마제를 생산하여 항생 활성을 파괴시킨다. 또한, 락타마제 유전자는 종종 전형적으로 플라스미드 상에서 에피좀 상태로 전파되고, 함께 다중약물 내성을 부여하는 에피솜 성분 상의 여러 유전자 중의 하나에 지나지 않는다.
1960년대에 도입된 메티실린은 주로 에스. 아우레우스에서 페니실린 내성 문제를 극복하였다. 상기 화합물은 항생 활성을 위한 페니실린의 부분을 보존하고, 페니실린을 락타마제를 불활성화시키기 위한 우수한 기질로 만드는 다른 부분을 변성 또는 변형시킨다. 그러나, 아미노글리코시드, 테트라사이클린, 클로람페니콜, 마크롤리드 및 린코사미드를 포함하여 에스. 아우레우스에 대해 효과적인 많은 다른 항생제에 대한 내성과 함께 메티실린 내성이 에스. 아우레우스에서 발생하였다. 실제로, 에스. 아우레우스의 메티실린 내성 균주는 일반적으로 다중 약물 내성을 보인다. 메티실리안 내성 에스. 아우레우스 (MRSA)는 전세계적으로 가장 중요한 병원내 병원체 중의 하나가 되었고, 심각한 감염 통제 문제를 제기한다. 현재, 많은 균주가 반코마이신형 글리코펩티드 항생제를 제외하고 실질적으로 모든 항생제에 대해 다중내성을 보인다. 에스. 아우레우스 감염의 약물 내성은 치료를 크게 어렵게 만들고, 이는 새로운 치료제가 개발되지 않으면 훨씬 더 악화될 것이다.
따라서, 에스. 아우레우스 감염 치료를 위한 새롭고 효과적인 치료제에 대한 긴급하고 현재 충족되지 못한 의료상의 필요성이 존재한다.
<발명의 개요>
본 발명은 적어도 부분적으로는, 그의 생성물이 에스. 아우레우스에서 철포획체의 생합성에 관여하는 철-조절된, 9개 유전자 오페론 (sbn으로 명명)의 확인에 기초한 것이다. sbn 오페론의 발현은 실험 배양에서 에스. 아우레우스의 철-제한 성장에 중요할 뿐만 아니라 생체 내에서 에스. 아우레우스의 생존에도 중요하다. 그 결과, 상기 철포획체의 생합성에 관여하는 유전자 및 단백질은 에스. 아우레우스 특이적 항생제를 확인하기 위한 스크리닝 분석에 사용될 수 있는 중요한 약물 표적이다.
한 측면에서, 본 발명은 sbn 오페론을 구성하는 9개 각각의 유전자 (즉, sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 및 sbnI), sbn 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 코딩된 폴리펩티드를 생산하는 방법을 특징으로 한다.
다른 측면에서, 본 발명은 sbn 오페론의 각각의 유전자에 의해 코딩되는 Sbn 폴리펩티드를 특징으로 한다. Sbn 폴리펩티드는 SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 및 SbnI를 포함한다. 각각의 Sbn 폴리펩티드는 에스. 아우레우스 철포획체 ("스태필로박틴 (staphylobactin)"으로도 불림)의 생합성에 필요하다.
다른 측면에서, 본 발명은 스태필로코커스 아우레우스 (에스. 아우레우스)에서 철 흡수를 억제하는 항체, 안티센스 RNA 및 siRNA를 포함하는 신규한 항생제를 특징으로 한다.
본 발명의 또다른 측면은 에스. 아우레우스에서 스태필로박틴 생합성을 억제하는 물질의 확인을 위한 스크리닝 분석을 특징으로 한다. 한 실시태양에서, 분석은 sbn 유전자 생성물에 결합하여 그의 생화학적 기능을 저해하는 물질을 확인할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 상기 분석은 에스. 아우레우스에서 Sbn 폴리펩티드 및(또는) 핵산의 발현을 억제하는 물질을 확인할 수 있다.
본원에 개시되는 발명의 추가의 특징 및 잇점은 하기 상세한 설명 및 청구의 범위와 관련하여 설명될 것이다.
도 1은 sbn 오페론의 핵산 서열 (서열 1)을 보여준다.
도 2는 (A) SbnA의 핵산 서열 (서열 2), (B) 서열 2의 역 보체 (서열 3) 및 (C) 아미노산 서열 (서열 4)을 보여준다.
도 3은 (A) SbnB의 핵산 서열 (서열 5), (B) 서열 5의 역 보체 (서열 6), 및 (C) 아미노산 서열 (서열 7)을 보여준다.
도 4는 (A) SbnC의 핵산 서열 (서열 8), (B) 서열 8의 역 보체 (서열 9), 및 (C) 아미노산 서열 (서열 10)을 보여준다.
도 5는 (A) SbnD의 핵산 서열 (서열 11), (B) 서열 11의 역 보체 (서열 12), 및 (C) 아미노산 서열 (서열 13)을 보여준다.
도 6은 (A) SbnE의 핵산 서열 (서열 14), (B) 서열 14의 역 보체 (서열 15), 및 (C) 아미노산 서열 (서열 16)을 보여준다.
도 7은 (A) SbnF의 핵산 서열 (서열 17), (B) 서열 17의 역 보체 (서열 18), 및 (C) 아미노산 서열 (서열 19)을 보여준다.
도 8은 (A) SbnG의 핵산 서열 (서열 20), (B) 서열 20의 역 보체 (서열 21), 및 (C) 아미노산 서열 (서열 22)을 보여준다.
도 9는 (A) SbnH의 핵산 서열 (서열 23), (B) 서열 23의 역 보체 (서열 24), 및 (C) 아미노산 서열 (서열 25)을 보여준다.
도 10은 (A) SbnI의 핵산 서열 (서열 26), (B) 서열 26의 역 보체 (서열 27), 및 (C) 아미노산 서열 (서열 28)을 보여준다.
도 11은 RN6390, Newman, 및 그의 각각의 fur 유도체, H295 및 H706의 소비된 배양 상등액에서 철포획체 수준을 보여준다. 세균은 철-결핍 (개방 막대) 또는 철-풍부 (50 μM 염화철로 보충된 철-결핍 배지) (회색 막대) 배지에서 성장시키고, RN6390와 Newman (흑색 막대) 모두는 철-풍부 배지에서 성장시켰다. 철포획체 단위는 실시예 1에 기재된 바와 같이 계산하였다.
도 12는 에스. 아우레우스 염색체의 sir-galE 영역의 모식도이다. 화살표는 개개의 코딩 영역을 나타낸다. sbn 오페론 내의 코딩 영역은 개방 화살표로 나타내고, sir 코딩 영역은 회색 화살표로 제시되고, 철 흡수에 관여하지 않는 것을 보이는 코딩 영역은 흑색 화살표로 제시된다. SA0121은 가설적인 개방 해독 프레임 (orf)이고, 그 명칭은 N315 게놈 서열로부터 유래한 것이다. Bud는 추정 부탄디올 데히드로게나제이고, galE는 UDP-갈락토스-4-에피머라제를 코딩한다.
도 13은 sirABC 및 sbn 오페론에 대한 프로모터 영역을 보여준다 (센스 스트랜드, 서열 29; 안티센스 스트랜드, 서열 30). 추정 Fur 박스 서열은 박스로 표시하였다. 또한, sirA 및 sbnA 유전자의 예측된 출발 코돈을 예측된 샤인-달가노 (S. D.) 서열과 함께 제시한다.
도 14A-B는 에스. 아우레우스의 성장에 대한 에스. 아우레우스의 성장에 대한 sbnE 돌연변이의 효과를 보여주는 그래프이다. 50 μM FeCl3의 존재 (패널 A) 또는 부재 (패널 B) 하에 10 μM EDDHA로 보충된 TMS 배지에서 성장한 에스. 아우레우스 RN6390 (●), Newman (o), H672 (RN6390 sbnE::Km) (▼), H686 (Newman sbnE::Km) (▽), H672 + pSED32 (■) 및 H686 + pSED32 (□)의 성장 곡선. 세균은 격렬하게 진탕하면서 가지달린 플라스크에서 성장시키고, Klett 미터를 사용하여 성장을 모니터링하였다. 성장 실험은 3개의 별개의 실험으로 2회 수행하였다. 전형적인 실험 결과를 도시하였다.
도 15는 sbnE 돌연변이체가 쥐 신장 농양 모델에서 손상됨을 보여주는 그래프이다. 12마리의 마우스로 이루어진 2개의 군에 대해 꼬리 정맥에 1x107 세균을 주사하였다. 한 군에는 에스. 아우레우스 Newman을 주사하고, 다른 군에는 H686 (Newman sbnE::Km)을 감염시켰다. 주사 5일 (8마리의 마우스) 및 6일 (4마리의 마우스) 후에 마우스의 신장으로부터 회수한 CFU를 플로팅한다. 각각의 기호는 한 동물의 신장에서 스태필로코커스 카운트를 나타내고, 대시 선은 상기 분석 시스템에서 스태필로코커스에 대한 검출 한계를 나타낸다. 데이타는 3개의 독립적인 실험을 나타낸다. 통계적 유의성은 스튜던트 언페어드 (Student unpaired) t 시험을 사용하여 결정하였고, 유의성이 높은 것으로 밝혀졌다 (P < 0.003).
1. 총론
본 발명은 스태필로박틴으로 언급되는 철포획체의 생합성에서 스태필로코커스 아우레우스 (에스. 아우레우스) sbn 오페론의 역할 규명에 적어도 부분적으로 기초한다. 철포획체는 세균이 세균 성장에 필요한 철을 획득하기 위해 사용하는 고친화도 철 킬레이터이다. 에스. 아우레우스에서 철포획체 생산을 억제하는 신규한 항생제 및 추가의 철포획체 생합성 억제제를 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법을 본원에서 설명한다.
2. 정의
편의상, 본 명세서, 실시예 및 첨부하는 청구의 범위에서 사용되는 특정 용어 및 구문의 의미를 아래에 제시한다. 달리 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
용어 "물질 (agent)"은 화학적 화합물, 화학적 화합물의 혼합물, 생물학적 거대분자 (예를 들어 핵산, 항체, 단백질 또는 그의 일부, 예를 들어, 펩티드), 또는 생물학적 물질, 예를 들어 세균, 식물, 진균 또는 동물 (특히 포유동물) 세포 또는 조직으로부터 제조한 추출물을 의미하기 위해 사용된다. 물질은 본원에서 하기 설명하는 스크리닝 분석에 의해 확인할 수 있다. 상기 물질은 스태필로코커스 아우레우스에서 sbn 매개 철포획체 생합성의 억제제 또는 길항제일 수 있다. 상기 물질의 활성은 물질을 대상에서 국소 또는 전신적으로 작용하는, 생물학적으로, 생리학적으로 또는 약리학적으로 활성 물질 (또는 물질들)인 "치료제"로서 적합하게 만들 수 있다.
용어 "길항제" 또는 "억제제"는 단백질의 적어도 하나의 생물활성을 감소시키거나 억제하는 물질을 의미한다. 길항제는 단백질과 다른 분자, 예를 들어, 표적 펩티드 또는 효소 기질 사이의 상호작용을 감소시키거나 억제하는 화합물일 수 있다. 또한, 길항제는 유전자의 발현을 감소시키거나 억제하거나, 존재하는 발현된 단백질의 양을 감소시키거나 억제하는 화합물일 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "항체"는 면역글로불린 및 면역글로불린 (예를 들어, IgG, IgD, IgA, IgM 및 IgE)의 임의의 항원 결합부, 즉 항원에 특이적으로 결합하는 ("면역반응하는") 항원 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 항체는 적어도 하나의 디술피드 결합에 의해 상호 연결된 적어도 하나의 중쇄 (H) 및 적어도 하나의 경쇄 (L)를 포함할 수 있다. 용어 "VH"는 항체의 중쇄 가변 영역을 의미한다. 용어 "VL"은 항체의 경쇄 가변 영역을 의미한다. 예시적인 실시태양에서, 용어 "항체"는 구체적으로 모노클로날 및 폴리클로날 항체를 포함한다. "폴리클로날 항체"는 항원 또는 항원들로 면역화된 동물 혈청으로부터 유도된 항체를 의미한다. "모노클로날 항체"는 하이브리도마 세포의 단일 클론에 의해 생산된 항체를 의미한다. 모노클로날 항체를 생성시키는 기술은 하이브리도마 기술 (Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497 참조); 트리오마 (trioma) 기술; 인간 B 세포 하이브리도마 기술 (Kozbor, et al. (1983) Immunol. Today 4:72 참조), EBV 하이브리도마 기술 (Cole, et al., 1985 In: Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., pp. 77-96 참조) 및 파지 디스플레이를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
폴리클로날 또는 모노클로날 항체는 키메릭 또는 인간화 항체를 생성하도록 추가로 조작 또는 변형될 수 있다. "키메릭 항체"는 경쇄 및 중쇄 유전자가 상이한 종에 속하는 면역글로불린 유전자 세그먼트로 구성되도록 유전공학 처리된 면역글로불린 유전자에 의해 코딩된다. 예를 들어, 본원에 기재된 바와 같이 얻은 마우스 모노클로날 항체로부터의 유전자의 가변 (V) 세그먼트의 실질적인 부분을 인간 불변 (C) 세그먼트의 실질적인 부분에 연결시킬 수 있다. 상기 키메릭 항체는 마우스 모노클로날 항체보다 인간에 대한 항원성이 작을 것이다.
본원에서 사용되는, 용어 "인간화 항체" (HuAb)는 인간 프레임워크와 실질적으로 동일한 (즉, 적어도 85%) 프레임워크 영역을 갖고 비-인간 항체로부터의 CDR을 갖는 키메릭 항체를 의미하고, 여기서 임의의 불변 영역은 인간 면역글로불린 불변 영역과 적어도 약 85-90%, 바람직하게는 약 95%의 폴리펩티드 서열 동일성을 갖는다 (예를 들어, PCT 출원 공개 WO 90/07861 및 유럽 특허 0451216 참조). 가능하게는 CDR을 제외하고 상기 HuAb의 모든 부분은 하나 이상의 천연 인간 면역글로불린 서열의 대응하는 부분과 실질적으로 동일하다. 본원에서 사용되는 용어 "프레임워크 영역"은 문헌 [Kabat, et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunologic Interest, 4th Ed., US Dept. Health and Human Services]에 규정된 바와 같이 단일 종에서 상이한 면역글로불린 중에서 비교적 보존된 (즉, CDR 이외의 다른) 면역글로불린 경쇄 및 중쇄 가변 영역의 부분을 의미한다. 인간 불변 영역 DNA 서열은 다양한 인간 세포, 바람직하게는 불사의 B 세포로부터 공지의 과정에 따라 단리할 수 있다. 인간화 항체를 생산하기 위한 가변 영역 또는 CDR은 항원에 결합할 수 있는 모노클로날 항체로부터 유도될 수 있고, 임의의 편리한 포유동물 공급원, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 다른 척추동물에서 생산될 것이다.
용어 "항체"는 항체 단편을 포함한다. 항체 단편의 예는 Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디 및 인접하는 아미노산 잔기의 비중단된 하나의 서열로 구성되는 1차 구조체를 갖는 임의의 항체 단편, 예를 들어 단일쇄 Fv (scFv) 분자, 단지 하나의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단일쇄 폴리펩티드, 또는 회합된 중쇄 잔기가 없는 경쇄 가변 도메인의 3개의 CDR을 포함하는 그의 단편, 및 단지 하나의 중쇄 가변 영역을 포함하는 (3) 단일쇄 폴리펩티드, 또는 회합된 경쇄 잔기가 없는 중쇄 가변 영역의 3개의 CDR을 포함하는 그의 단편 (이로 제한되지 않음); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 또는 다가 구조체를 포함한다. 하나 이상의 중쇄를 포함하는 항체 단편에서, 중쇄(들)은 무손상 항체의 비-Fc 영역에서 발견되는 임의의 불변 도메인 서열 (예를 들어, IgG 이소형의 CH1)을 포함할 수 있고(있거나) 무손상 항체에서 발견되는 임의의 힌지 영역 서열을 포함할 수 있고(있거나) 중쇄(들)의 힌지 영역 서열 또는 불변 도메인 서열에 융합되거나 상기 서열 내에 위치하는 류신 지퍼 서열을 포함할 수 있다. 적합한 류신 지퍼 서열은 jun 및 fos 류신 지퍼 (Kostelney et al., (1992) J. Immunol., 148: 1547-1553) 및 GCN4 류신 지퍼 (미국 특허 6,468,532)를 포함한다. Fab 및 F(ab')2 단편에는 무손상 항체의 Fc 단편이 결여되고, 전형적으로 효소, 예를 들어 파파인 (Fab 단편의 생산) 또는 펩신 (F(ab')2 단편의 생산)을 사용한 단백질 분해 절단에 의해 생산된다.
항체가 바람직하게는 대부분의 다른 항원보다 특정 항원에 결합하는 경우 항체는 항원 또는 항원의 에피토프에 "특이적으로 결합한다". 예를 들어, 항체는 하나 이상의 다른 에피토프를 향해 약 50%, 20%, 10%, 5%, 1% 또는 0.1% 미만의 교차반응성을 가질 수 있다.
용어 "보존적 치환"은 분자 특성이 크게 유사한 아미노산 사이의 변경을 의미한다. 예를 들어, 지방족 군 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신 내의 교체는 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 때때로, 상기 아미노산 중의 하나 대신에 글리신의 치환도 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 다른 보존적 교체는 지방족 군 아스파르테이트 및 글루타메이트 내; 아미드 군 아스파라긴 및 글루타민 내; 히드록실기 세린 및 트레오닌 내; 방향족 군 페닐알라닌, 티로신 및 트립토판 내; 염기성 군 리신, 아르기닌 및 히스티딘 내; 및 황 함유 군 메티오닌 및 시스테인 내의 교체를 포함한다. 때때로, 군 메티오닌 및 류신 내의 치환도 보존적인 것으로 간주될 수 있다. 바람직한 보존적 치환 군은 아스파르테이트-글루타메이트; 아스파라긴-글루타민; 발린-류신-이소류신; 알라닌-발린; 페닐알라닌-티로신; 및 리신-아르기닌이다.
"유효량"은 치료시 유익하거나 목적하는 임상 결과를 얻기 위해 충분한 양이다. 유효량은 1회 이상의 투여량으로 환자에게 투여될 수 있다. 치료 측면에서, 유효량은 환자에서 감염을 감소시키기에 충분한 양이다. 유효량을 달성하기 위해 적절한 투여량을 결정할 때 여러 요인이 일반적으로 고려된다. 상기 요인은 환자의 연령, 성별 및 체중, 치료되는 질환, 질환의 심도 및 투여되는 물질의 형태 및 유효 농도를 포함한다.
핵산 또는 뉴클레오티드 서열을 설명하기 위해 사용될 때 "동등한"은 기능적으로 동등한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 동등한 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 뉴클레오티드 치환, 부가 또는 결실에 의해 상이한 서열, 예를 들어 대립유전자 변이체를 포함할 것이고; 따라서 유전자 코드의 다의성에 의해 상이한 서열을 포함할 것이다. 예를 들어, 핵산 변이체는 뉴클레오티드 치환, 결실, 또는 부가에 의해 생성된 것을 포함할 수 있다. 치환, 결실 또는 부가는 하나 이상의 뉴클레오티드를 수반할 수 있다. 변이체는 코딩 영역, 비-코딩 영역 또는 둘 모두에서 변형될 수 있다. 코딩 영역에서의 변형은 보존적 또는 비-보존적 아미노산 치환, 결실 또는 부가를 생성시킬 수 있다.
"상동성" 또는 별법으로 "동일성"은 2개의 펩티드 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 의미한다. 상동성은 비교를 위해 배열될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교하여 결정할 수 있다. 비교되는 서열 내의 위치에 동일한 염기 또는 아미노산이 존재할 때, 분자들은 그 위치에서 상동성이다. 서열 사이의 상동성의 정도는 서열이 공유하는 일치하거나 상동성인 위치의 수의 함수이다. 용어 "동일성 비율"은 2개의 아미노산 서열 또는 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 서열 동일성을 의미한다. 동일성은 비교를 위해 배열될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교하여 결정할 수 있다. 비교되는 서열 내의 동등한 위치에 동일한 염기 또는 아미노산이 존재할 때, 분자들은 그 위치에서 동일하고, 동등한 부위에 동일한 또는 유사한 아미노산 잔기 (예를 들어, 입체적 및(또는) 전자적 특성에서 유사한)가 존재할 때, 분자는 그 위치에서 상동성 (유사)인 것으로 언급될 수 있다. 상동성, 유사성 또는 동일성의 비율이라는 표현은 비교되는 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일 또는 유사한 아미노산의 수의 함수를 의미한다. FASTA, BLAST 또는 ENTREZ를 포함하여 상이한 정렬 알고리즘 및(또는) 프로그램을 사용할 수 있다. FASTA 및 BLAST는 GCG 서열 분석 패키지 (유니버시티 오브 위스콘신 (University of Wisconsin), 미국 위스콘신주 메디슨)의 일부로서 입수가능하고, 예를 들어 디폴트 세팅과 함께 사용될 수 있다. ENTREZ는 기관 (내셔널 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션, 내셔날 라이브러리 오브 메디신, 내셔널 인스티튜트 오브 헬쓰 (National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, 미국 메릴랜드주 베데스다))으로부터 입수가능하다. 한 실시태양에서, 두 서열의 동일성 비율은 1의 갭 가중치를 사용하여 GCG 프로그램에 의해 결정할 수 있고, 예를 들어 각각의 아미노산 갭은 2개의 서열 사이에 하나의 아미노산 또는 뉴클레오티드 미스매치가 존재하는 것처럼 가중치를 주게 된다. 정렬을 위한 다른 기술은 문헌 [Methods in Enzymology, vol. 266: Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis (1996), ed. Doolittle, Academic Press, Inc., a division of Harcourt Brace & Co., 미국 캘리포니아주 샌디에고]에 기재되어 있다. 바람직하게는, 서열 내의 갭을 허용하는 정렬 프로그램을 이용하여 서열을 정렬한다. Smith-Waterman은 서열 정렬 내의 갭을 허용하는 알고리즘의 한 종류이다 (Meth. Mol. Biol. 70: 173-187 (1997) 참조). 또한, Needleman 및 Wunsch 정렬 방법을 사용하는 GAP 프로그램을 사용하여 서열을 정렬할 수 있다. 대안적인 서치 전략은 MASPAR 컴퓨터에서 구동되는 MPSRCH 소프트웨어를 사용한다. MPSRCH는 대규모 병렬 컴퓨터에서 서열을 스코어링하기 위해 Smith-Waterman 알고리즘을 사용한다. 상기 방법은 관련성이 낮은 매치를 확인하는 능력을 개선시키고, 특히 작은 갭 및 뉴클레오티드 서열 오류를 수용한다. 핵산에 의해 코딩되는 아미노산 서열을 사용하여 단백질과 DNA 데이타베이스를 모두 서치할 수 있다. 개별 서열을 갖는 데이타베이스는 문헌 [Methods in Enzymology, ed. Doolittle, 상기 문헌]에 기재되어 있다. 데이타베이스는 Genbank, EMBL, 및 DNA Database of Japan (DDBJ)을 포함한다.
본원에서 사용되는, 용어 "감염"은 신체 조직에서 미생물, 예를 들어 에스. 아우레우스의 침습 및 증식을 의미하고, 이것은 임상적으로 불분명하거나, 경쟁적 대사, 톡신, 세포외 복제 또는 항원 항체 반응에 의해 국소 세포 손상을 야기할 수 있다. 감염은 신체 방어 메카니즘이 효과적일 경우 국소적이고, 무증상이고, 일시적일 수 있다. 국소 감염은 지속되고 확대 전파되어 급성, 아급성 또는 만성 임상 감염 또는 질병 상태가 될 수 있다. 또한, 국소 감염은 미생물이 림프계 또는 혈관계에 접촉하게 되면 전신 감염이 될 수 있다. 에스. 아우레우스의 감염은 종기, 만성 종기증, 농가진, 급성 골수염, 폐렴, 심내막염, 열상 피부 증후군, 독성 쇼크 증후군, 및 식중독을 포함하여 이로 제한되지 않는 질병 또는 병태를 야기할 수 있다.
용어 "억제하다"는 생물학적 활성, 핵산 발현 또는 단백질 발현의 임의의 저하, 감소 또는 완전한 억제를 의미한다.
"표지" 및 "검출가능한 표지"는 방사성 동위원소, 형광단, 화학발광 잔기, 효소, 효소 기질, 효소 코팩터, 효소 억제제, 염료, 금속 이온, 리간드 (예를 들어, 비오틴 또는 합텐) 등을 포함하여 이로 제한되지 않는, 검출가능한 분자를 의미한다. "형광단"은 검출가능한 범위의 형광을 보일 수 있는 물질 또는 그의 일부를 의미한다. 적절한 표지의 특정 예는 플루오레세인, 로다민, 단실, 움벨리페론, 텍사스 레드, 루미놀, NADPH, 알파- 또는 베타-갈락토시다제 및 양고추냉이 퍼옥시다제를 포함한다.
유전자에 대해 본원에서 사용되는 용어 "돌연변이체"는 돌연변이체 단백질을 코딩하는 유전자를 의미한다. 단백질과 관련하여 본원에서 사용되는 용어 "돌연변이체"는 그의 통상적이거나 정상적인 생리학적 역할을 수행하지 않는 단백질을 의미한다. 에스. 아우레우스 폴리펩티드 돌연변이체는 아미노산 치환, 결실 또는 부가에 의해 생성될 수 있다. 치환, 결실, 또는 부가는 하나 이상의 잔기를 수반할 수 있다. 이들 중에서, 에스. 아우레우스 단백질의 특성 및 활성을 변경시키는 치환, 부가 및 결실이 특히 바람직하다.
용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 임의의 길이의 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 뉴클레오티드, 또는 그의 유사체의 중합체 형태를 의미하기 위해 교환가능하게 사용된다. 폴리뉴클레오티드의 비제한적인 예는 유전자 또는 유전자 단편의 코딩 또는 비-코딩 영역, 연결 분석으로부터 규정된 로커스(들), 엑손, 인트론, 메신저 RNA (mRNA), 트랜스퍼 RNA, 리보좀 RNA, 리보자임, cDNA, 재조합 폴리뉴클레오티드, 분지된 폴리뉴클레오티드, 플라스미드, 벡터, 임의의 서열의 단리된 DNA, 임의의 서열의 단리된 RNA, 핵산 프로브 및 프라이머이다. 폴리뉴클레오티드는 변형 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 뉴클레오티드 유사체를 포함할 수 있다. 존재할 경우, 뉴클레오티드 구조의 변형은 중합체의 회합 전후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 중단될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 예를 들어 표지 성분과의 컨쥬게이션에 의해 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 용어 "재조합" 폴리뉴클레오티드는 자연에서 발생하지 않거나 비천연 배열에서 다른 폴리뉴클레오티드에 연결된 게놈, cDNA, 반합성 또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. "올리고뉴클레오티드"는 약 100개 미만의 뉴클레오티드, 예를 들어 약 75, 50, 25 또는 10개 미만의 뉴클레오티드를 갖는 단일가닥 폴리뉴클레오티드를 의미한다.
용어 "폴리펩티드", "펩티드" 및 "단백질" (단일쇄일 경우)은 아미노산의 중합체를 의미하기 위해 본원에서 교환가능하게 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 변형 아미노산을 포함할 수 있고, 비-아미노산에 의해 중단될 수 있다. 또한, 상기 용어는 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화, 또는 임의의 다른 조작, 예를 들어 표지 성분과의 컨쥬게이션에 의해 변형된 아미노산 중합체를 포함한다. 본원에서 사용되는 용어 "아미노산"은 글리신 및 D 또는 L 광학이성질체 모두, 및 아미노산 유사체 및 펩티드 모방체 (peptidomimetic)를 포함하여 천연 및(또는) 비천연 또는 합성 아미노산을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "sbn 오페론"은 공통 프로모터를 공유하는 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 및 sbnI를 포함하는 일군의 세균 유전자를 의미한다. sbnA 코딩 영역의 상류에 존재하는 프로모터 성분은 철-조절된다. 본원에서 제시된 상기 오페론은 스태필로박틴으로 언급되는 철포획체의 생합성을 책임진다. sbn 오페론에 대한 뉴클레오티드 서열은 Genbank에 기탁되었고, 기탁 번호 AY251022가 부여되었다. sbn 오페론의 각각의 코딩 영역은 스태필로박틴 철포획체의 생합성에 필요한 단백질을 코딩한다. 따라서, sbnA는 추정 시스테인 신타제를 코딩하고, sbnB는 추정 오르니틴 시클로데아미나제를 코딩하고, sbnC는 에어로박틴 생합성을 위한 추정 IucC 상동체를 코딩하고, sbnD는 추정 유출 (efflux) 단백질을 코딩하고, sbnE는 철포획체 생합성 단백질을 코딩하고, sbnF는 추정 히드록사메이트 생합성 단백질을 코딩하고, sbnG는 추정 히드록사메이트 생합성 단백질을 코딩하고, sbnH는 추정 오르니틴 또는 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩하고, sbnI는 미지의 단백질을 코딩한다.
용어 "sbn 뉴클레오티드", "sbn 핵산", 또는 "sbn 유전자"는 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 및 sbnI 핵산을 의미한다.
용어 "sbn 단백질" 또는 "sbn 폴리펩티드"는 sbn 오페론의 각각의 유전자의 생성물, 즉 "SbnA", "SbnB", "SbnC", "SbnC", "SbnD", "SbnE", "SbnF", "SbnG", "SbnH" 및 "SbnI"를 의미하고, 그의 단편 및 부분 및 그의 생물학적으로 활성인 단편 또는 부분을 포함한다. 예시적인 실시태양에서, 본원에 기재된 sbn 폴리펩티드는 스태필로박틴의 생합성에 참여한다. Sbn 폴리펩티드의 구체적인 기능은 아래에서 추가로 설명된다.
용어 "Sbn 결핍 균주"는 적어도 하나의 Sbn 단백질을 발현하지 않는 세균 균주를 의미한다.
용어 "스태필로박틴"은 sbn 오페론에 의해 합성되고 SirABC 철-철포획체 수송 시스템에 의해 세포 내로 수송되는 철-철포획체를 의미한다.
용어 "소분자"는 분자량이 약 5 kD 미만, 약 2.5 kD 미만, 약 1.5 kD 미만, 또는 약 0.9 kD 미만인 화합물을 의미한다. 소분자는 예를 들어 핵산, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드 핵산, 펩티드 모방체, 탄수화물, 지질 또는 다른 유기 (탄소 함유) 또는 무기 분자일 수 있다. 많은 제약회사는 본 발명의 임의의 분석으로 스크리닝될 수 있는 화학적 및(또는) 생물학적 혼합물, 종종 진균, 세균, 또는 조류 추출물의 광범한 라이브러리를 보유하고 있다. 용어 "유기 소분자"는 유기 또는 약용 화합물로 종종 확인된 소분자를 의미하고, 핵산, 펩티드 또는 폴리펩티드인 분자를 포함하지 않는다.
용어 "특이적으로 혼성화하다"는 검출가능한 특이적 핵산 결합을 의미한다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산은 비특이적 핵산에 대한 검출가능한 결합의 평가가능한 양을 최소화하는 혼성화 및 세척 조건 하에서 핵산 스트랜드에 선택적으로 혼성화한다. 엄격한 조건은 당업계에 공지되고 본원에서 논의되는 선택적인 혼성화 조건을 달성하기 위해 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 및 핵산과 목적하는 핵산 서열 사이의 핵산 서열 상동성은 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 이상일 것이다. 특정 경우에, 혼성화 및 세척 조건은 통상적인 혼성화 과정에 따른, 본원에서 추가로 설명되는 엄격한 조건 하에서 수행된다.
용어 "엄격한 조건" 또는 "엄격한 혼성화 조건"은 이중체를 형성하기 위해 2개의 상보성 폴리뉴클레오티드 스트랜드 사이의 특이적인 혼성화를 촉진하는 조건을 의미한다. 엄격한 조건은 규정된 이온 강도 및 pH에서 소정의 폴리뉴클레오티드 이중체의 융점 (Tm)보다 약 5℃ 더 낮도록 선택할 수 있다. 상보성 폴리뉴클레오티드 스트랜드의 길이 및 그의 GC 함량이 이중체의 Tm; 및 따라서 요구되는 혼성화 특이성의 달성에 필요한 혼성화 조건을 결정할 것이다. Tm은 50%의 폴리뉴클레오티드 서열이 완전히 매치되는 상보성 스트랜드에 혼성화하는 온도 (규정된 이온 강도 및 pH 하에서)이다. 특정한 경우에, 혼성화 조건의 엄격도를 특정 이중체의 Tm에 거의 동일하게 증가시키는 것이 바람직할 수 있다.
Tm을 평가하기 위한 다양한 기술을 이용할 수 있다. 전형적으로, 이중체 내의 G-C 염기쌍은 Tm에 약 3℃ 기여하는 것으로 추정되고, A-T 염기쌍은 약 2℃ 기여하는 것으로 추정되고, 이론적인 최대치는 약 80-100℃이다. 그러나, G-C 적층 (stacking) 상호작용, 용매 효과, 요구되는 분석 온도 등이 고려된 보다 정교한 Tm 모델이 이용가능하다. 예를 들어, 프로브는 다음 식을 사용하여 해리 온도 (Td)가 약 60℃가 되도록 디자인될 수 있다: Td = (((((3 x #GC) + (2 x #AT)) x 37) - 562)/#bp) - 5 (여기서, #GC, #AT 및 #bp는 각각 이중체의 형성에 관여하는 구아닌-시토신 염기쌍의 수, 아데닌-티민 염기쌍의 수, 및 총 염기쌍의 수이다).
혼성화는 5xSSC, 4xSSC, 3xSSC, 2xSSC, 1xSSC 또는 0.2xSSC 중에서 적어도 약 1시간, 2시간, 5시간, 12시간 또는 24시간 동안 수행할 수 있다. 혼성화 온도는 반응 엄격도를 조정하기 위해 예를 들어 약 25℃ (실온)로부터 약 45℃, 50℃, 55℃, 60℃ 또는 65℃로 증가시킬 수 있다. 혼성화 반응은 또한 엄격도에 영향을 주는 다른 물질을 포함할 수 있다. 예를 들어, 50% 포름아미드의 존재 하에 수행된 혼성화는 규정된 온도에서 혼성화 엄격도를 증가시킨다.
혼성화 반응 후에, 동일하거나 상이한 염도 및 온도에서 수행될 수 있는 단일 세척 단계, 또는 2회 이상의 세척 단계가 수행될 수 있다. 예를 들어, 세척 온도는 엄격도를 조정하기 위해 약 25℃ (실온)로부터 약 45℃, 50℃, 55℃, 60℃, 65℃, 또는 그 이상으로 증가시킬 수 있다. 세척 단계는 세제, 예를 들어 0.1 또는 0.2% SDS의 존재 하에 수행될 수 있다. 예를 들어, 혼성화 후에, 2xSSC, 0.1% SDS로 각각 약 20분 동안 65 ℃에서 2회의 세척 단계 및 임의로 2xSSC, 0.1% SDS로 각각 약 20분 동안 65 ℃에서 2회의 추가의 세척 단계를 수행할 수 있다.
예시적인 엄격한 혼성화 조건은 50% 포름아미드; 10xDenhardt (0.2% Ficoll, 0.2% 폴리비닐피롤리돈, 0.2% 소 혈청 알부민) 및 200 ㎍/ml의 변성 캐리어 DNA, 예를 들어 전단된 연어 정자 DNA를 포함하거나 이로 이루어지는 용액 중에서 65℃에서 철야 혼성화, 이어서 2xSSC, 0.1% SDS로 각각 약 20분 동안 65 ℃에서 2회의 세척 단계 및 0.2xSSC, 0.1% SDS로 각각 약 20분 동안 65 ℃에서 2회의 세척 단계를 포함한다.
혼성화는 용액 중에서 2개의 핵산을 혼성화하거나 용액 중의 한 핵산을 고체 지지체, 예를 들어 필터에 부착된 핵산에 혼성화시키는 것으로 이루어질 수 있다. 한 핵산이 고체 지지체 상에 존재할 때, 혼성화 전에 예비혼성화 단계를 수행할 수 있다. 예비혼성화는 혼성화 용액과 동일한 용액 중에서 동일한 온도에서 적어도 약 1시간, 3시간 또는 10시간 동안 수행할 수 있다 (상보성 폴리뉴클레오티드 스트랜드 없이).
적절한 엄격도 조건은 당업자에게 공지되어 있거나 당업자에 의해 실험적으로 결정될 수 있다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1-12.3.6; Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, N. Y; S. Agrawal (ed.) Methods in Molecular Biology, volume 20; Tijssen (1993) Laboratory Techniques in biochemistry and molecular biology-hybridization with nucleic acid probes, 예를 들어, part I chapter 2 "Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays", Elsevier, New York; and Tibanyenda, N. et al., Eur. J. Biochem. 139:19 (1984) and Ebel, S. et al., Biochem. 31:12083 (1992) 참조).
핵산 또는 아미노산 서열과 관련하여 사용될 때 용어 "실질적으로 상동성인"은 서열이 서로 실질적으로 동일하거나 유사하여, 형상의 상동성 및 이에 따라 유용한 정도의 하나 이상의 생물학적 (면역학적 포함) 활성을 보유하는 서열을 의미한다. 상기 용어는 서열의 통상적인 진화를 의미하고자 하는 것이 아니다.
"대상"은 인간을 포함하여 암수 포유동물을 의미한다.
"벡터"는 삽입된 핵산 분자를 숙주 세포 내로 및(또는) 사이로 전달하는 자가 복제 핵산 분자이다. 상기 용어는 핵산 분자의 세포 내로의 삽입에 1차적으로 기능하는 벡터, 핵산 복제에 1차적으로 기능하는 벡터 및 DNA 또는 RNA의 전사 및(또는) 번역을 위해 기능하는 발현 벡터를 포함한다. 또한, 상기 기능을 2개 이상 제공하는 벡터도 포함된다. 본원에서 사용되는 "발현 벡터"는 적절한 숙주 세포 내로 도입될 때 폴리펩티드(들)로 전사 및 번역될 수 있는 폴리뉴클레오티드로서 규정된다. "발현 시스템"은 대체로 요구되는 발현 생성물을 생성시키는 기능을 수행할 수 있는 발현 벡터를 포함하는 적합한 숙주 세포를 의미한다.
3. Sbn 유전자
본 발명은 본원에서 sbn 오페론 (도 1; 서열 1)으로 언급되는 에스. 아우레우스 내의 철포획체 생합성 유전자 클러스터를 포함하는 핵산 분자를 특징으로 한다. 9개의 유전자가 sbn 오페론을 형성하고, 본원에서 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 및 sbnI (도 2-10; 서열 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 및 18)로 언급된다.
또한, 본 발명의 핵산은 본원에 기재된 임의의 sbn 뉴클레오티드 서열, 그의 전체 보체 또는 돌연변이체를 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이로 이루어질 수 있다. 또다른 핵산은 sbn 유전자 또는 그의 보체와 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 동일성 또는 상동성을 갖는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 또는 필수적으로 이로 이루어질 수 있다. 실질적으로 상동성인 서열은 엄격한 혼성화 조건을 사용하여 확인할 수 있다.
유전자 코드의 다의성에 의해 본 발명의 핵산과 상이한 단리된 핵산도 본 발명의 범위에 포함된다. 예를 들어, 많은 아미노산은 하나 초과의 트리플렛에 의해 지정된다. 동일한 아미노산을 특정하는 코돈, 또는 동의어 (예를 들어, CAU 및 CAC는 히스티딘에 대해 동의어임)는 단백질의 아미노산에 영향을 주지 않는 "침묵 (silent)" 돌연변이를 생성시킬 것이다. 그러나, 본 발명의 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변경을 야기하는 DNA 서열 다형성이 존재할 것임이 예상된다. 당업자는 천연 대립유전자 변이에 의해 본 발명의 특정 단백질을 코딩하는 핵산의 하나 이상의 뉴클레오티드 (뉴클레오티드의 1% 미만부터 약 3 또는 5%까지 또는 가능하게는 그 초과) 변이가 제시된 종 사이에 존재할 수 있음을 이해할 것이다. 임의의 및 모든 상기 뉴클레오티드 변이 및 생성되는 아미노산 다형성은 본 발명의 범위에 포함된다.
본원에 개시된 폴리펩티드에 진화적으로 관련된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산이 제공되고, 여기서 "진화적으로 관련된"은 자연적으로 (예를 들어 대립유전자 변이 또는 차별적인 스플라이싱에 의해) 발생하는 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질, 및 예를 들어 조합 돌연변이 유발에 의해 유도되는 본 발명의 단백질의 돌연변이 변이체를 언급하는 것이다.
대상 폴리펩티드의 생물학적 활성 부분을 코딩하는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 단편도 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 개시되는 폴리펩티드의 활성 부분을 코딩하는 핵산의 단편은 본 발명의 폴리펩티드의 전장 아미노산 서열보다 더 짧은 뉴클레오티드를 갖고 본원에서 정의되는 전장 Sbn 단백질의 생물학적 활성의 적어도 일부를 보유하거나, 또는 전장 단백질의 생물학적 활성의 조절자로서 기능하는 제시된 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 예를 들어, 상기 단편은 단백질의 다른 분자 (예를 들어, 폴리펩티드, DNA, RNA 등)와의 상호작용을 매개하는 폴리펩티드가 그로부터 유도되는 전장 단백질의 도메인을 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.
또한, 본원에서 제공되는 핵산은 링커 서열, 변형 제한 엔도뉴클레아제 부위 및 상기 재조합 폴리펩티드의 분자 클로닝, 발현 또는 정제에 유용한 다른 서열을 포함할 수 있다.
본원에서 제공되는 Sbn 폴리펩티드를 코딩하는 핵산은 본원에 기재된 프로토콜 및 일반적으로 당업자에게 공지된 것을 따라 임의의 유기체로부터 mRNA 또는 게놈 DNA로부터 얻을 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA는 예를 들어 유기체, 예를 들어 세균, 바이러스, 포유동물 등으로부터 전체 mRNA를 단리함으로써 얻을 수 있다. 이중가닥 cDNA는 전체 mRNA로부터 제조한 후, 많은 공지된 기술 중의 임의의 하나를 사용하여 적합한 플라스미드 또는 박테리오파지 벡터에 삽입될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 또한 본 발명에서 제공된 뉴클레오티드 서열 정보에 따라 확립된 중합효소 연쇄 반응 기술을 사용하여 클로닝할 수 있다. 한 측면에서, 본 발명의 핵산, 또는 그의 단편을 증폭하는 방법은 (a) 각각 본 발명의 핵산 서열에 상보성인, 길이가 8개 뉴클레오티드인 한쌍의 단일가닥 올리고뉴클레오티드를 제공하는 단계로서, 올리고뉴클레오티드가 상보성인 서열이 적어도 10개의 뉴클레오티드로 떨어져 존재하는 단계,및 (b) 상기 쌍의 올리고뉴클레오티드 사이에 위치하는 영역의 증폭을 허용하여 핵산의 증폭을 허용하는 조건 하에 본 발명의 핵산을 포함하는 핵산과 올리고뉴클레오티드를 접촉시키는 단계를 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 스태필로박틴 생합성에 필요한 단백질을 코딩하는 단리된 유전자 (즉, sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 및 sbnI 핵산)를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터를 포함하는 숙주 세포 및 코딩된 에스. 아우레우스 폴리펩티드를 생산하는 방법을 특징으로 한다.
적절한 벡터는 공지의 기술, 예를 들어 감염, 형질도입, 형질감염, 트랜스벡션 (transvection), 전기천공 및 형질전환을 사용하여 숙주 세포 내로 도입될 수 있다. 벡터는 예를 들어 파지, 플라스미드, 바이러스 또는 레트로바이러스 벡터일 수 있다. 레트로바이러스 벡터는 복제 전능성이거나 복제 결함성일 수 있다. 복제 결함성의 경우에, 바이러스 증식은 일반적으로 보완 숙주 세포에서만 발생할 것이다.
벡터는 숙주에서 증식을 위한 선택가능 마커를 포함할 수 있다. 일반적으로, 플라스미드 벡터는 침전물, 예를 들어 인산칼슘 침전물에, 또는 대전된 지질의 복합체에 도입된다. 벡터가 바이러스일 경우, 적절한 패키징 세포주를 사용하여 시험관 내에서 패키징된 후, 숙주 세포에 형질도입될 수 있다.
바람직한 벡터는 목적하는 폴리뉴클레오티드에 시스 (cis) 작용 조절 영역을 포함한다. 적절한 트랜스 (trans) 작용 인자는 숙주에 의해 제공되거나, 보완 벡터에 의해 공급되거나 숙주 내로 도입시에 벡터 자체에 의해 공급될 수 있다.
특정 실시태양에서, 벡터는 유도가능한 및(또는) 세포 종류 특이적일 수 있는 특이적 발현을 제공한다. 상기 벡터 중에서, 조작이 쉬운 환경 인자, 예를 들어 온도 및 영양소 첨가제에 의해 유도가능한 벡터가 특히 바람직하다.
본 발명에 유용한 발현 벡터는 염색체-, 에피솜- 및 바이러스-유래 벡터, 예를 들어, 세균 플라스미드, 박테리오파지, 효모 에피솜, 효모 염색체 성분, 바이러스, 예를 들어 바큘로바이러스, 파포바 바이러스, 우두 바이러스, 아데노바이러스, 조류 폭스 바이러스, 가광견병 바이러스 및 레트로바이러스로부터 유도된 벡터, 및 이들의 조합물로부터 유도된 벡터, 예를 들어 코스미드 및 파지미드를 포함한다.
DNA 삽입체는 적절한 프로모터, 예를 들어 파지 람다 PL 프로모터, 이. 콜라이 lac, tip 및 tac 프로모터, SV40 조기 및 후기 프로모터 및 레트로바이러스 LTR의 프로모터에 작동가능하게 연결되어야 한다. 다른 적합한 프로모터는 당업자에게 공지되어 있다. 발현 구성체는 전사 개시, 종결을 위한 부위, 및 전사되는 영역에 번역을 위한 리보좀 결합 부위를 추가로 포함할 것이다. 발현 구성체에 의해 발현되는 성숙 전사체의 코딩 부분은 바람직하게는 시작부의 번역 개시 부위 및 번역되는 폴리펩티드의 말단부에 적절하게 위치하는 종결 코돈 (UAA, UGA 또는 UAG)을 포함할 것이다.
나타낸 바와 같이, 발현 벡터는 바람직하게는 적어도 하나의 선택가능 마커를 포함할 것이다. 상기 마커는 진핵세포 배양을 위한 디히드로폴레이트 리덕타제 또는 네오마이신 내성 유전자 및 이. 콜라이 및 다른 세균에서 배양을 위한 테트라사이클린, 카나마이신, 또는 암피실린 내성 유전자를 포함한다. 적절한 숙주의 대표적인 예는 세균 세포, 예를 들어 이. 콜라이, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 및 살모넬라 티피무리움 (Salmonella typhimurium) 세포; 진균 세포, 예를 들어 효모 세포; 곤충 세포, 예를 들어 초파리 (Drosophila) S2 및 Sf9 세포; 동물 세포, 예를 들어 CHO, COS 및 Bowes 흑색종 세포; 및 식물 세포를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기한 숙주 세포에 적절한 배양 배지 및 조건은 당업계에 공지되어 있다.
세균에 사용하기 바람직한 벡터에는 퀴아겐 (Quiagen)으로부터 입수가능한 pQE70, pQE60 및 pQE9, pQE1O; 스트라타젠 (Stratagene)으로부터 입수가능한 pBS 벡터, Phagescript 벡터, Bluescript 벡터, pNH8A, pNH16a, pNH18A, pNH46A; 노바겐 (Novagen)으로부터 입수가능한 pET 시리즈 벡터; 및 파마시아 (Pharmacia)로부터 입수가능한 ptrc99a, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5가 포함된다. 바람직한 진핵세포 벡터는 스트라타젠으로부터 입수가능한 pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, pXT1 및 pSG; 및 파마시아로부터 입수가능한 pSVK3, pBPV, pMSG 및 pSVL이다. 다른 적합한 벡터는 당업자가 쉽게 알 수 있을 것이다.
본 발명에 사용하기 적합한 공지의 세균 프로모터는 이. 콜라이 lacI 및 lacZ 프로모터, T3, T5 및 T7 프로모터, gpt 프로모터, 람다 PR 및 PL 프로모터, trp 프로모터 및 xyI/tet 키메릭 프로모터를 포함한다. 적합한 진핵세포 프로모터는 CMV 최조기 프로모터, HSV 티미딘 키나제 프로모터, 조기 및 후기 SV40 프로모터, 레트로바이러스 LTR, 예를 들어 라우스 육종 바이러스 (RSV)의 프로모터, 및 메탈로티오네인 프로모터, 예를 들어 마우스 메탈로티오네인-I 프로모터를 포함한다.
상기 구성체의 숙주 세포 내로의 도입은 인산칼슘 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 양이온성 지질-매개 형질감염, 전기천공, 형질도입, 감염 또는 다른 방법에 의해 수행할 수 있다. 상기 방법은 많은 표준 실험 매뉴얼에 기재되어 있다 (예를 들어, Davis, et al., Basic Methods in Molecular Biology (1986)).
보다 고등한 진핵세포에 의한 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터 내로 삽입함으로써 증가시킬 수 있다. 인핸서는 제시된 숙주 세포 종류에서 프로모터의 전사 활성을 증가시키는 작용을 하는, 대체로 약 10 내지 300개의 뉴클레오티드인, DNA의 시스 작용 성분이다. 인핸서의 예는 뉴클레오티드 100 내지 270의 복제 기점의 후부에 존재하는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 조기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후부에 존재하는 폴리오마 인핸서 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.
번역된 폴리펩티드의 소포체의 루멘 (lumen) 내로, 원형질막 주위 공간 내로 또는 세포외 환경 내로의 분비를 위해, 적절한 분비 시그날을 발현된 폴리펩티드, 예를 들어 아미노산 서열 KDEL 내에 포함시킬 수 있다. 시그날은 폴리펩티드에 내인성일 수 있거나 이종성 시그날일 수 있다.
목적하는 폴리펩티드의 코딩 서열은 상이한 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 융합 유전자의 일부로서 포함될 수 있다. 본 발명은 이종성 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질을 코딩하기 위해 본 발명의 핵산 및 본 발명의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 인 프레임 (in frame)으로 연결된 이종성 펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 이종성 서열을 포함하는 단리된 핵산을 고려한다. 이종성 폴리펩티드는 (a) 본 발명의 핵산에 의해 코딩되는 폴리펩티드의 C-말단, (b) 폴리펩티드의 N-말단 또는 (c) 폴리펩티드의 C-말단 및 N-말단에 융합될 수 있다. 특정 예에서, 이종성 서열은 융합되는 폴리펩티드의 검출, 단리, 가용화 및(또는) 안정화를 허용하는 폴리펩티드를 코딩한다. 또다른 실시태양에서, 이종성 서열은 폴리His 태그, myc, HA, GST, 단백질 A, 단백질 G, 칼모듈린-결합 펩티드, 티오레독신, 말토스-결합 단백질, 폴리아르기닌, 폴리 His-Asp, FLAG, 면역글로불린 단백질의 일부, 및 트랜스사이토시스 (transcytosis) 펩티드로 이루어지는 군 중에서 선택되는 폴리펩티드를 코딩한다.
융합 발현 시스템은 본 발명의 폴리펩티드의 면역원성 단편을 생성하는 것일 바람직할 때 유용할 수 있다. 예를 들어, 로타바이러스의 VP6 캡시드 단백질은 모노머 형태 또는 바이러스 입자 형태로 폴리펩티드의 부분을 위한 면역학적 캐리어 단백질로서 사용될 수 있다. 그에 대해 항체가 유도되는 본 발명의 폴리펩티드의 일부에 대응하는 핵산 서열은 비리온의 일부로서 단백질의 일부를 포함하는 융합 단백질을 발현하는 재조합 바이러스의 세트를 생성시키기 위해 후기 우두 바이러스 구조 단백질의 코딩 서열을 포함하는 융합 유전자 구성체 내에 포함될 수 있다. 또한, B형 간염 표면 항원이 상기 기능에 이용될 수도 있다. 유사하게, 면역원성을 향상시키기 위해 본 발명의 폴리펩티드의 일부를 포함하는 융합 단백질 및 폴리오바이러스 캡시드 단백질을 코딩하는 키메릭 구성체를 생성시킬 수 있다 (예를 들어, EP 출원 공개 0259149; 및 Evans et al, (1989) Nature 339:385; Huang et al, (1988) J. Virol. 62:3855; 및 Schlienger et al., (1992) J. Virol. 66:2 참조).
융합 단백질은 단백질의 발현 및(또는) 정제를 용이하게 할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드는 글루타티온-S-트랜스퍼라제 (GST) 융합 단백질로서 생성시킬 수 있다. 상기 GST 융합 단백질은 예를 들어 글루타티온-유도체화 매트릭스의 사용을 통해 본 발명의 폴리펩티드의 정제를 단순화시키기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al, (N. Y.: John Wiley & Sons, 1991) 참조). 또다른 실시태양에서, 재조합 단백질의 목적하는 부분의 N-말단에서 정제 리더 서열, 예를 들어 폴리-(His)/엔테로키나제 절단 부위 서열을 코딩하는 융합 유전자는 Ni2 + 금속 수지를 사용한 친화도 크로마토그래피에 의한 발현된 융합 단백질의 정제를 허용할 수 있다. 이어서, 정제 리더 서열은 정제된 단백질을 제공하기 위해서 엔테로키나제로 처리하여 후속적으로 제거될 수 있다 (예를 들어, Hochuli et al, (1987) J: Chromatography 411: 177; 및 Janknecht et al, PNAS USA 88:8972).
융합 유전자의 제조 기술은 공지되어 있다. 필수적으로, 상이한 폴리펩티드 서열을 코딩하는 상이한 DNA 단편의 연결은 라이게이션을 위한 블런트 (blunt) 말단 또는 스태거 (stagger) 말단, 적절한 말단을 제공하는 제한 효소 소화, 적절한 코헤시브 (cohesive) 말단의 충전, 바람직하지 않은 연결을 방지하기 위한 알칼린 포스파타제 처리 및 효소 라이게이션을 이용하여 종래의 기술에 따라 수행할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 융합 유전자는 자동화 DNA 합성기를 포함하여 종래의 기술에 의해 합성할 수 있다. 별법으로, 유전자 단편의 PCR 증폭은 후속적으로 어닐링되어 키메릭 유전자 서열을 생성시킬 수 있는 2개의 연속적인 유전자 단편 사이에 상보성 오버행 (overhang)을 생성시키는 앵커 (anchor) 프라이머를 사용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons: 1992 참조).
다른 실시태양에서, 본 발명의 핵산은 고체 표면, 예를 들어 플레이트, 미세적정판, 슬라이드, 비드, 입자, 구체, 필름, 스트랜드, 침전물, 겔, 시트, 튜브, 용기, 모세관, 패드, 슬라이스 등에 고정될 수 있다. 본 발명의 핵산은 어레이의 일부로서 칩 상에 고정될 수 있다. 어레이는 본원에 기재된 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 칩은 폴리뉴클레오티드 서열의 어레이의 일부로서 본 발명의 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
다른 측면은 "안티센스 요법"에서 본 발명의 핵산의 용도에 관련된다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 안티센스 요법은 전사 및(또는) 번역을 억제함으로써 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 세포 mRNA 및(또는) 게놈 DNA와 세포 조건 하에서 특이적으로 혼성화하거나 다른 방식으로 결합하는 올리고뉴클레오티드 프로브 또는 그의 유도체의 투여 또는 계내 생성을 의미한다. 결합은 종래의 염기쌍 상보성에 의해 이루어지거나, 예를 들어 DNA 이중체에 대한 결합의 경우에 이중 나선구조의 주요 그루브 (groove)에서의 특이적 상호작용을 통해 이루어질 수 있다. 일반적으로 안티센스 요법은 당업계에서 일반적으로 사용되는 기술 범위를 의미하고, 올리고뉴클레오티드 서열에 대한 특이적 결합에 의존하는 임의의 요법을 포함한다.
올리고뉴클레오티드는 다른 분자, 예를 들어 펩티드, 혼성화 촉발 가교결합제 수송제, 혼성화-촉발 절단제 등에 컨쥬게이팅될 수 있다. 안티센스 분자는 "펩티드 핵산" (PNA)일 수 있다. PNA는 리신으로 끝나는 아미노산 잔기의 펩티드 백본에 연결된 적어도 약 5개 뉴클레오티드 길이의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 안티센스 분자 또는 항-유전자 물질을 의미한다. 말단 리신은 조성물에 용해도를 부여한다. PNA는 우선적으로 상보성 단일가닥 DNA 또는 RNA에 결합하여 전사체 연장을 정지시키고, 세포에서 그의 수명을 연장시키기 위해 PEG화될 수 있다.
본 발명의 안티센스 구성체는 예를 들어 세포에서 전사될 때 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 적어도 특유한 부분에 상보성인 RNA를 생성시키는 발현 플라스미드로서 전달될 수 있다. 별법으로, 안티센스 구성체는 생체 외에서 생성되고 세포 내로 도입시에 본 발명의 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA 및(또는) 게놈 서열과 혼성화함으로써 발현을 억제하는 올리고뉴클레오티드 프로브일 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드 프로브는 내인성 뉴클레아제, 예를 들어 엑소뉴클레아제 및(또는) 엔도뉴클레아제에 저항성인 변형 올리고뉴클레오티드일 수 있고, 따라서 생체 내에서 안정하다. 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 사용하기 위한 예시적인 핵산 분자는 DNA의 포스포르아미데이트, 포스포티오에이트 및 메틸포스포네이트 유사체이다 (예를 들어 미국 특허 5,176,996; 5,264,564; 및 5,256,775 참조). 추가로, 안티센스 요법에 유용한 올리고머의 제조를 위한 일반적인 방법은 문헌 [예를 들어 van der Krol et al., (1988) Biotechniques 6:958-976; 및 Stein et al, (1988) Cancer Res 48:2659-2668]에 기재된 바 있다.
추가의 측면에서, 이중가닥의 작은 간섭 RNA (siRNA), 및 이의 투여 방법이 제공된다. siRNA는 유전자 발현을 감소시키거나 차단한다. 이론에 매이기를 원하지 않지만, 일반적으로 siRNA는 서열 특이적 mRNA 분해를 매개함으로써 유전자 발현을 억제하는 것으로 생각된다. RNA 간섭 (RNAi)은 침묵되는 유전자에 서열 상동성인 이중가닥 RNA (dsRNA)에 의해 개시되는, 특히 동물 및 식물에서 서열-특이적, 전사후 유전자 침묵 과정이다 (Elbashir et al. Nature 2001; 411(6836): 494-8). 따라서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부에 실질적인 서열 동일성을 갖는 siRNA 및 긴 dsRNA를 사용하여 본 발명의 핵산 발현을 억제할 수 있음이 이해된다.
별법으로, 본원에 기재된 Sir 또는 FhuC 폴리펩티드의 발현을 감소시키거나 차단하는 siRNA는 표적 유전자에 대한 복수의 siRNA 구성체를 시험함으로써 결정할 수 있다. 표적 유전자에 대한 상기 siRNA는 화학적으로 합성할 수 있다. 개별적인 RNA 스트랜드의 뉴클레오티드 서열은 스트랜드가 억제되는 표적 유전자에 대한 상보성 영역을 갖도록 선택된다 (즉, 상보성 RNA 스트랜드는 표적 유전자의 발현 동안 형성되는 mRNA 전사체의 영역에 상보성인 뉴클레오티드 서열, 또는 그의 프로세싱 생성물, 또는 (+) 스트랜드 바이러스의 영역을 포함한다). RNA 스트랜드의 합성 단계는 개개의 뉴클레오티드가 연속적인 합성 사이클에서 뉴클레오티드간 3'-5' 포스포디에스테르 결합의 형성을 통해 말단 대 말단으로 연결되는 고상 합성을 수반할 수 있다.
필수적으로 본원에 기재된 sbn 핵산 서열로 이루어지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 siRNA 분자가 본원에서 제공된다. siRNA 분자는 2개의 스트랜드를 포함할 수 있고, 각각의 스트랜드는 적어도 필수적으로 서로 상보성인 뉴클레오티드 서열을 포함하고, 그중 하나는 표적 유전자의 서열에 필수적으로 대응한다. 표적 유전자의 서열에 필수적으로 대응하는 서열은 "센스 표적 서열"로 언급되고, 이에 대해 필수적으로 상보성인 서열은 siRNA의 "안티센스 표적 서열"로 언급된다. 센스 및 안티센스 표적 서열의 길이는 약 15 내지 약 30개의 연속적인 뉴클레오티드; 약 19 내지 약 25개의 연속적인 뉴클레오티드; 약 19 내지 23개의 연속적인 뉴클레오티드 또는 약 19, 20, 21, 22 또는 23개의 뉴클레오티드일 수 있다. 센스 및 안티센스 서열의 길이는 그 길이의 센스 및 안티센스 표적 서열을 갖는 siRNA가 숙주 인터페론 반응을 유의하게 유도하지 않으면서 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있도록 결정된다.
SiRNA 표적 서열은 www.wewb.mit.edu/mmcmanus/www/home1.2files/siRNAs에 제공된 임의의 알고리즘을 사용하여 예측할 수 있다.
센스 표적 서열은 표적 핵산의 코딩 또는 비-코딩 부분, 또는 이들의 조합체에 필수적으로 또는 실질적으로 동일할 수 있다. 예를 들어, 센스 표적 서열은 표적 핵산 또는 그의 보체의 5' 또는 3' 비번역 영역, 프로모터, 인트론 또는 엑손에 필수적으로 상보성일 수 있다. 또한, 이는 2개의 상기 유전자 영역 사이의 경계를 포함하는 영역에 필수적으로 상보성일 수 있다.
센스 표적 서열의 뉴클레오티드 염기 조성은 약 50% 아데닌 (A) 및 티미딘 (T) 및 50% 시티딘 (C) 및 구아노신 (G)일 수 있다. 별법으로, 염기 조성은 적어도 50%의 G/G, 예를 들어 약 60%, 70% 또는 80%의 C/G일 수 있다. 따라서, 센스 표적 서열은 뉴클레오티드 염기 조성을 기초로 선택할 수 있다. siRNA에 의한 표적 핵산의 접근성과 관련하여, 이것은 예를 들어 문헌 [Lee et al. (2002) Nature Biotech. 19:500]에 기재된 바와 같이 결정할 수 있다. 상기 방법은 예를 들어 세포 추출물에서 기질 접근성을 결정하기 위해 프로브로서 표적 유전자에 상보성인 올리고뉴클레오티드의 사용을 수반한다. 올리고뉴클레오티드 프로브와 이중체 형성 후에, 기질은 RNase H에 취약하게 된다. 따라서, 예를 들어 PCR에 의해 결정된 제시된 프로브에 대한 RNase H 감수성은 선택된 부위의 접근성을 반영하고, 대응하는 siRNA가 상기 표적 유전자로부터의 전사를 얼마나 잘 억제하는지에 대한 예측치를 제시할 수 있다. 또한, 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 분석을 위한 프라이머를 확인하거나 제1 표적 서열을 확인하기 위한 안티센스 올리고뉴클레오티드를 확인하는 알고리즘을 사용할 수 있다.
센스 및 안티센스 표적 서열은 바람직하게는 두 서열을 포함하는 siRNA가 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있도록, 즉 RNA 간섭을 매개할 수 있도록 충분히 상보성이다. 예를 들어, 서열은 예를 들어 세포에서 요구되는 조건 하에서 혼성화를 허용하도록 충분히 상보성일 수 있다. 따라서, 센스 및 안티센스 표적 서열은 적어도 약 95%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 동일할 수 있고, 예를 들어 최대 5, 4, 3, 2, 1 또는 0개의 뉴클레오티드만큼 상이할 수 있다.
또한, 센스 및 안티센스 표적 서열은 바람직하게는 표적 핵산 또는 그의 보체 이외의 다른 서열과 유의하게 상호작용할 가능성이 없는 서열이다. 이것은 예를 들어 표적 세포의 게놈 내의 다른 서열과 선택된 서열을 비교함으로써 확인할 수 있다. 서열 비교는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 본원에서 추가로 설명되는 BLAST 알고리즘에 따라 수행할 수 있다. 물론, 특정 제1 표적 서열이 표적 핵산의 발현을 특이적으로 억제할 수 있고 필수적으로 다른 유전자의 발현은 억제할 수 없음을 확인하기 위해 소규모 실험도 수행할 수 있다.
siRNA는 또한 센스 및 안티센스 서열 이외에 다른 서열을 포함할 수도 있다. 예를 들어, siRNA는 적어도 하나의 스트랜드가 3' 오버행을 갖는 2개의 RNA 스트랜드로 구성된 RNA 이중체일 수 있다. 다른 스트랜드는 블런트 말단이거나 오버행을 가질 수 있다. RNA 분자가 이중가닥이고 두 스트랜드가 오버행을 포함하는 실시태양에서, 오버행의 길이는 각각의 스트랜드에 대해 동일하거나 상이할 수 있다. 특정 실시태양에서, siRNA는 센스 및 안티센스 서열을 포함하고, 이들 서열은 각각 페어링되고 약 1 내지 약 3개, 특히 약 2개의 뉴클레오티드의 오버행을 RNA의 두 3' 말단에 갖는, 약 19-25개의 뉴클레오티드로 구성된 한 RNA 스트랜드에 위치한다. 본 발명의 RNA의 안정성을 추가로 향상시키기 위해서, 3' 오버행을 분해에 대해 안정화시킬 수 있다. 한 실시태양에서, RNA는 퓨린 뉴클레오티드, 예를 들어 아데노신 또는 구아노신 뉴클레오티드를 포함함으로써 안정화된다. 별법으로, 피리미딘 뉴클레오티드의 변형 유사체에 의한 치환, 예를 들어 우리딘 2 뉴클레오티드 3' 오버행의 2'-데옥시티미딘에 의한 치환은 관용되고, RNAi의 효능에 영향을 주지 않는다. 2' 히드록실의 부재는 적어도 조직 배양 배지에서 뉴클레아제 저항성을 유의하게 향상시킬 수 있다. siRNA의 RNA 스트랜드는 5' 포스페이트 및 3' 히드록실기를 가질 수 있다.
한 실시태양에서, siRNA 분자는 이중체를 형성하는 2개의 RNA 스트랜드를 포함한다. 또다른 실시태양에서, siRNA 분자는 헤어핀 루프를 형성하는 하나의 RNA 스트랜드로 구성되고, 여기서 센스 및 안티센스 표적 서열은 혼성화하고, 2개의 표적 서열 사이의 서열은 헤어핀 구조의 루프를 필수적으로 형성하는 스페이서 서열이다. 스페이서 서열은 상기 서열을 갖는 스페이서에 의해 연결된 2개의 상보성 올리고뉴클레오티드가 헤어핀 구조 (여기서 적어도 일부의 스페이서는 헤어핀의 닫힌 말단에서 루프를 형성함)를 형성할 수 있다면 뉴클레오티드의 임의의 조합물 및 임의의 길이일 수 있다. 예를 들어, 스페이서 서열은 약 3 내지 약 30개의 뉴클레오티드; 약 3 내지 약 20개의 뉴클레오티드; 약 5 내지 약 15개의 뉴클레오티드; 약 5 내지 약 10개의 뉴클레오티드; 또는 약 3 내지 약 9개의 뉴클레오티드일 수 있다. 서열은 헤어핀 구조의 형성을 방해하지 않으면 임의의 서열일 수 있다. 특히, 스페이서 서열은 바람직하게는 제1 또는 제2 표적 서열에 대한 임의의 유의한 상동성을 갖는 서열이 아니고, 이것은 상기 서열이 헤어핀 구조의 형성을 방해할 수 있기 때문이다. 또한, 스페이서 서열은 바람직하게는 다른 서열, 예를 들어 핵산이 도입되는 세포의 게놈 서열에 유사하지 않고, 이것은 상기 서열이 세포에 바람직하지 않은 효과를 야기할 수 있기 때문이다.
당업자는 핵산, 예를 들어 RNA를 언급할 때 RNA가 예를 들어 핵산에 보다 큰 안정성을 제공하는 자연 발생 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유도체를 포함하거나 이들로 이루어질 수 있음을 이해할 것이다. 핵산이 요구되는 방식으로 기능을 수행할 수 있다면 임의의 유도체가 허용된다.
예를 들어, siRNA는 siRNA가 표적 유전자의 발현을 계속 억제할 수 있다면 뉴클레오티드 유도체를 포함할 수 있다. 예를 들어, siRNA는 하나 이상의 변형 염기 및(또는) 안정성 또는 다른 이유로 변형된 백본을 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 연결은 적어도 하나의 질소 또는 황 헤테로원자를 포함하도록 변형될 수 있다. 또한, 이상 염기, 예를 들어 단지 2개의 예로서 이노신 또는 변형 염기, 예를 들어 트리틸화 (tritylated) 염기를 포함하는 siRNA가 본 발명에 사용될 수 있다. 당업자에게 공지된 많은 유용한 목적을 위해 기능하는 매우 다양한 변형을 RNA에 부여하는 것이 이해될 것이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 siRNA는 내인성 주형으로부터 유도된, 상기 화학적으로, 효소에 의해 또는 대사적으로 변형된 형태의 siRNA를 포함한다.
siRNA를 합성할 수 있는 방식에는 제한이 없다. 따라서, 수작업 및(또는) 자동화 과정을 사용하여 시험관 내에서 또는 생체 내에서 합성할 수 있다. 시험관내 합성은 DNA (또는 cDNA) 주형, 또는 이 둘의 혼합물의 전사를 위해 예를 들어 클로닝된 RNA 중합효소 (예를 들어 T3, T7, SP6)를 사용한 화학적 또는 효소적 합성일 수 있다. SiRNA는 또한 2개의 스트랜드를 각각 예를 들어 화학적으로 합성하고 2개의 스트랜드를 혼성화시켜 이중체를 형성함으로써 제조할 수 있다. 생체 내에서, siRNA는 당업계에 공지된 재조합 기술을 사용하여 합성할 수 있다 (예를 들어, Sambrook, et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition (1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N Glover ed. 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed, 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription and Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Animal Cell Culture (R. I. Freshney ed. 1986); Immobilised Cells and Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); the series, Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds. 1987, Cold Spring Harbor Laboratory), Methods in Enzymology Vol. 154 and Vol. 155 (Wu and Grossman, and Wu, eds., respectively), Mayer and Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology (Academic Press, London), Scopes, (1987), Protein Purification: Principles and Practice, Second Edition (Springer-Verlag, N.Y.), 및 Handbook of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell eds 1986 참고). 예를 들어, 세균 세포는 siRNA가 그로부터 유도되는 DNA 주형을 포함하는 발현 벡터로 형질전환될 수 있다.
세포 외에서 합성될 경우, siRNA는 세포 내로 도입하기 전에 정제될 수 있다. 정제는 용매 (예를 들어 페놀/클로로포름) 또는 수지를 사용한 추출, 침전 (예를 들어 에탄올 중에서), 전기영동, 크로마토그래피, 또는 이들의 조합 방법에 의해 수행할 수 있다. 그러나, 정제는 siRNA의 손실을 야기할 수 있고, 따라서 최소로 수행되거나 또는 전혀 수행되지 않을 수 있다. siRNA는 보관을 위해 건조되거나 RNA 스트랜드의 어닐링 및(또는) 안정화를 촉진하기 위해 버퍼 또는 염을 포함할 수 있는 수용액에 용해될 수 있다.
이중가닥 구조체는 자가상보성 단일 RNA 스트랜드 또는 2개의 별개의 상보성 RNA 스트랜드에 의해 형성될 수 있다.
포유동물 세포는 세포외 siRNA에 반응할 수 있고, 따라서 dsRNA의 수송 메카니즘을 가질 수 있음이 공지되어 있다 (Asher et al. (1969) Nature 223 715-717). 따라서, siRNA는 체강, 간질 공간 내로 포유동물의 순환계 내로 세포 외에서 투여되거나, 경구 도입될 수 있다. 경구 도입 방법은 RNA와 포유동물의 먹이의 직접 혼합 및 먹이로 사용되는 종이 RNA를 발현되도록 공학처리된 후 영향받는 포유동물에게 급여되는 공학처리 방법을 포함한다. 예를 들어 음식 세균, 예를 들어 락토코커스 락티스 (Lactococcus lactis)는 dsRNA를 생산하도록 형질전환될 수 있다 (WO93/17117, WO97/14806 참조). 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프계 및 뇌척수액은 RNA가 주사될 수 있는 부위이다.
RNA는 세포 내에서 세포에 도입될 수 있다. 핵산을 도입하기 위한 물리적 방법도 상기 측면에서 사용할 수 있다. siRNA는 문헌 [Zernicka-Goetz et al. (1997) Development 124, 1133-1137 및 Wianny et al. (1998) Chromosoma 107, 430-439]에 기재된 미세주사 기술을 사용하여 투여할 수 있다.
세포 내에서 핵산을 도입하기 위한 다른 물리적 방법은 siRNA에 의해 덮인 입자에 의해 폭격 (bombardment), 예를 들어 siRNA가 금 입자 상에 고정되고 상처 부위에 직접 발사되는 유전자 건 (gun) 기술을 포함한다. 따라서, 본 발명은 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 유전자 건에서의 siRNA의 용도를 제공한다. 또한, siRNA 및 금 입자를 포함하는 유전자 건 요법에 적합한 조성물이 제공된다. 대안적인 물리적 방법은 siRNA의 존재 하에 세포막의 전기천공을 포함한다. 상기 방법은 대규모의 RNAi를 허용한다. 핵산을 세포에 도입하기 위한 당업계에 공지된 다른 방법, 예를 들어 지질-매개 캐리어 수송, 화학물질-매개 수송, 예를 들어 인산칼슘 등을 사용할 수 있다. siRNA는 세포에 의한 RNA 흡수의 향상, 이중체 스트랜드의 어닐링의 촉진, 어닐링된 스트랜드의 안정화, 또는 표적 유전자의 억제 증가 중의 하나 이상을 수행하는 성분과 함께 도입될 수 있다.
임의의 공지의 유전자 요법 기술을 사용하여 RNA를 투여할 수 있다. 바이러스 입자로 패키징된 바이러스 구조체는 발현 구성체의 세포 내로의 효율적인 도입과 발현 구성체에 의해 코딩되는 siRNA의 전사를 모두 달성할 것이다. 따라서, siRNA는 세포 내에서 생산될 수도 있다. 벡터, 예를 들어 siRNA 분자의 하나 또는 2개의 스트랜드를 코딩하는 핵산을 포함하는 발현 벡터가 상기 목적을 위해 사용될 수 있다. 핵산은 센스 표적 서열에 필수적으로 상보성인 안티센스 서열을 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 센스 표적 서열과 안티센스 표적 서열 사이에 스페이서 서열을 추가로 포함할 수 있다. 핵산은 세포에서 센스 및 안티센스 서열의 발현을 지시하기 위한 프로모터, 예를 들어 RNA 중합효소 II 또는 III 프로모터 및 전사 종결 시그날을 추가로 포함할 수 있다. 서열은 작동가능하게 연결될 수 있다.
한 실시태양에서, 핵산은 RNA 중합효소 III 프로모터에 작동가능하게 연결된 RNA 코딩 영역 (예를 들어, 센스 또는 안티센스 표적 서열)을 포함한다. RNA 코딩 영역 바로 뒤에는 pol III에 의한 RNA 합성의 종결을 지시하는 pol III 터미네이터 서열이 존재한다. pol III 터미네이터 서열은 일반적으로 4개 이상의 연속적인 티미딘 ("T") 잔기를 갖는다. 바람직한 실시태양에서, 5개의 연속적인 T 잔기의 클러스터가 터미네이터로서 사용되고, 이에 의해 pol III 전사가 DNA 주형의 두번째 또는 세번째 T에서 중지되어 단지 2 내지 3개의 우리딘 ("U") 잔기가 코딩 서열의 3' 말단에 추가된다. 예를 들어 인간 또는 마우스 기원의 H1 RNA 유전자 또는 U6 snRNA 유전자로부터 또는 임의의 다른 종으로부터 유도된 프로모터 단편을 포함하여 다양한 pol III 프로모터가 본 발명에 사용될 수 있다. 또한, pol III 프로모터는 다른 바람직한 특성, 예를 들어 작은 화학적 분자에 의해 임의의 위치에서 또는 조직-특이적 방식으로 유도될 수 있는 능력을 포함하도록 변형/공학처리될 수 있다. 예를 들어, 하나의 실시태양에서, 프로모터는 테트라사이클린에 의해 활성화될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 프로모터는 IPTG (lacI 시스템)에 의해 활성화될 수 있다.
siRNA는 각각 프로모터, RNA 코딩 서열 (하나는 센스 표적 서열이고, 다른 하나는 안티센스 표적 서열임) 및 종결 시그날을 포함하는 발현 카세트를 각각 포함하는 2개의 핵산, 예를 들어 벡터로 세포를 형질전환시켜 세포에서 생산할 수 있다. 별법으로, 단일 핵산은 상기 2개의 발현 카세트를 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 핵산은 안티센스 표적 서열에 연결된 스페이서에 연결된 센스 표적 서열을 포함하는 단일가닥 RNA를 코딩한다. 핵산은 도입되는 세포에서 센스 및 안티센스 표적 서열의 발현을 허용하는 벡터, 예를 들어 발현 벡터, 예를 들어 진핵세포 발현 벡터에 존재할 수 있다.
siRNA 생산을 위한 벡터는 예를 들어 문헌 [Paul et al. (2002) Nature Biotechnology 29:505; Xia et al. (2002) Nature Biotechnology 20:1006; Zeng et al. (2002) Mol. Cell 9:1327; Thijn et al. (2002) Science 296:550; BMC Biotechnol. 2002 Aug 28;2(1):15; Lee et al. (2002) Nature Biotechnology 19: 500; McManus et al. (2002) RNA 8:842; Miyagishi et al. (2002) Nature Biotechnology 19:497; Sui et al. (2002) PNAS 99:5515; Yu et al. (2002) PNAS 99:6047; Shi et al. (2003) Trends Genet. 19(1):9; Gaudilliere et al. (2002) J. Biol. Chem. 277(48):46442; US2002/0182223; US 2003/0027783; WO 01/36646 및 WO 03/006477]에 기재되어 있다. 또한, 벡터는 상업적으로 입수가능하다. 예를 들어, pSilencer는 진 써라피 시스템즈, 인크. (Gene Therapy Systems, Inc.)로부터, pSUPER RNAi 시스템은 올리고엔진 (Oligoengine)으로부터 입수가능하다.
또한, 본원에서 하나 이상의 siRNA 또는 siRNA의 RNA 코딩 영역을 코딩하는 핵산을 포함하는 조성물이 제공된다. 조성물은 제약 조성물일 수 있고 제약상 허용되는 담체를 포함한다. 조성물은 또한 조성물을 세포 또는 대상에 투여하기 위한 장치 내에 제공될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 주사기 내에 또는 스텐트 상에 존재할 수 있다. 조성물은 또한 siRNA 또는 핵산의 세포 내로의 도입을 용이하게 하는 물질을 포함할 수 있다.
일반적으로, 올리고뉴클레오티드는 당업계에 공지된, 예를 들어 각각 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Caruthers et al, Methods in Enzymology (1992) 211:3-19; Thompson et al, PCT 출원 공개 WO 99/54459; Wincott et al, Nucl Acids Res. (1995) 23:2677-2684; Wincott et al, Methods Mol Bio., (1997) 74:59; Brennan et al, Biotechnol. Bioeng. (1998) 61:33-45; 및 Brennan, 미국 특허 6,001,311]에 기재된 프로토콜을 사용하여 합성할 수 있다. 일반적으로, 올리고뉴클레오티드의 합성은 5' 말단의 종래의 핵산 보호 및 커플링기, 예를 들어 디메톡시트리틸 및 3' 말단의 포스포르아미다이트를 수반한다. 비제한적인 예에서, 소규모 합성은 켐젠스 코포레이션 (ChemGenes Corporation, 미국 01721 메릴랜드주 애실랜드 호머 애비뉴 200 애실랜드 테크놀로지 센터)에서 시판하는 리보뉴클레오시드 포스포르아미다이트를 사용하여 어플라이드 바이오시스템즈, 인크. (Applied Biosystems, Inc., 독일 바이터슈타트)에서 시판되는 Expedite 8909 RNA 합성기에서 수행된다. 별법으로, 합성은 96-웰 플레이트 합성기, 예를 들어 프로토젠 (Protogene, 미국 캘리포니아주 팔로 알토)에서 제조한 기구로, 또는 예를 들어 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 문헌 [Usman et al, J. Am. Chem. Soc. (1987) 109:7845; Scaringe et al, Nucl Acids Res. (1990) 18:5433; Wincott et al, Nucl Acids Res. (1990) 23:2677-2684; 및 Wincott et al, Methods Mol Bio. (1997) 74:59]에 기재된 바와 같은 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 별개로 합성될 수 있고, dsRNA는 합성 후에, 예를 들어 라이게이션 [Moore et al, Science (1992) 256:9923; Draper et al, PCT 공개 WO 93/23569; Shabarova et al, Nucl. Acids Res. (1991) 19:4247; Bellon et al, Nucleosides & Nucleotides (1997) 16:951; 및 Bellon et al, Bioconjugate Chem. (1997) 8:204]; 또는 합성 및(또는) 탈보호 후의 혼성화에 의해 형성될 수 있다. 핵산 분자는 종래의 방법을 사용하여 겔 전기영동에 의해 정제될 수 있거나, 또는 고압 액체 크로마토그래피 (HPLC; 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된 Wincott et al, 상기 문헌 참고)에 의해 정제되고 물에 재현탁될 수 있다.
또다른 실시태양에서, 세포 내의 특정 mRNA 또는 폴리펩티드의 수준은 그를 코딩하는 세포 또는 핵산 내로 리보자임을 도입함으로써 감소된다. 또한, 유전자 Y의 발현을 억제하기 위해 mRNA 전사체를 촉매에 의해 절단하도록 디자인된 리보자임 분자도 세포 내에 도입되거나 세포에서 발현될 수 있다 (예를 들어, Sarver et al., 1990, Science 247:1222-1225 및 미국 특허 5,093,246 참조). 통상적으로 사용되는 리보자임 모티프의 하나는 그에 대한 기질 서열 요건이 가장 작은 해머헤드이다. 해머헤드 리보자임의 디자인은 문헌 [Usman et al, Current Opin. Struct. Biol. (1996) 6:527-533]에 개시되어 있다. 우스만 (Usman)은 또한 리보자임의 치료 용도를 논의한 바 있다. 또한, 리보자임은 문헌 [Long et al, FASEB J. (1993) 7:25; Symons, Ann. Rev. Biochem. (1992) 61:641; Perrotta et al, Biochem. (1992) 31:16-17; Ojwang et al, Proc. Natl Acad. Sci. (USA) (1992) 59:10802-10806; 및 미국 특허 5,254,678]에 기재된 바와 같이 제조되어 사용될 수 있다. HIV-I RNA의 리보자임 절단은 미국 특허 5,144,019에 기재되어 있고; 리보자임을 사용한 RNA의 절단 방법은 미국 특허 5,116,742에 기재되어 있고; 리보자임의 특이성을 증가시키는 방법은 미국 특허 5,225,337 및 문헌 [Koizumi et al, Nucleic Acid Res. (1989) 17:7059-7071]에 기재되어 있다. 해머헤드 구조에서 리보자임 단편의 제조 및 용도는 문헌 [Koizumi et al, Nucleic Acids Res. (1989) 17:7059-7071]에 기재되어 있다. 헤어핀 구조에서 리보자임 단편의 제조 및 용도는 문헌 [Chowrira and Burke, Nucleic Acids Res. (1992) 20:2835]에 기재되어 있다. 또한, 리보자임은 문헌 [Daubendiek and Kool, Nat. Biotechnol (1997) 15(3):273-277]에 기재된 바와 같은 롤링 (rolling) 전사에 의해 제조할 수 있다.
유전자 발현은 신체 내의 표적 세포에서 유전자의 전사를 억제하는 삼중 나선 구조체를 형성하기 위해 표적 유전자의 조절 영역 (즉, 유전자 프로모터 및(또는) 인핸서)에 상보성인 데옥시리보뉴클레오티드 서열을 표적화함으로써 감소시킬 수 있다 (일반적으로, Helene (1991) Anticancer Drug Des., 6(6):569-84; Helene et al. (1992) Ann. NY. Acad. Sci. 660:27-36; 및 Maher (1992) Bioassays 14(12):807-15 참조).
추가의 실시태양에서, RNA 앱타머 (aptamer)가 세포 내로 도입되거나 세포에서 발현될 수 있다. RNA 앱타머는 그 번역을 특이적으로 억제할 수 있는 단백질, 예를 들어 Tat 및 Rev RNA에 대한 특이적 RNA 리간드이다 (Good et al. (1997) Gene Therapy 4: 45-54).
4. Sbn 폴리펩티드
본원에 기재된 SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 및 SbnI (도 2-10; 서열 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25 및 28)를 포함하여 에스. 아우레우스 폴리펩티드는 자연 정제된 생성물, 화학적 합성 과정의 생성물, 및 재조합 기술에 의해 원핵 또는 진핵세포 숙주 세포, 예를 들어, 세균, 효모, 고등 식물, 곤충 및 포유동물 세포에서 생산된 생성물을 포함한다. 특정 실시태양에서, 본원에 개시된 폴리펩티드는 Sbn 폴리펩티드의 기능을 억제한다.
또한, 폴리펩티드는 본원에 기재된 임의의 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어지거나, 필수적으로 그 서열로 이루어질 수 있다. 또다른 폴리펩티드는 Sbn 폴리펩티드와 적어도 약 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99%의 동일성 또는 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하거나, 그 서열로 이루어지거나, 필수적으로 그 서열로 이루어질 수 있다. 예를 들어, 자연 발생 Sbn 단백질과 약 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 아미노산이 상이한 폴리펩티드도 고려된다. 상기 차이는 치환, 예를 들어, 보존적 치환, 결실 또는 부가일 수 있다. 상기 차이는 바람직하게는 상이한 종 사이에 유의하게 보존되지 않은 영역에 존재한다. 상기 영역은 상이한 종으로부터의 Sbn 단백질의 아미노산 서열을 정렬시킴으로서 확인할 수 있다. 상기 아미노산은 예를 들어 다른 종에서 발견된 것으로 치환될 수 있다. 상기 위치 또는 다른 위치에서 치환, 삽입 또는 결실될 수 있는 다른 아미노산은 생물학적 분석과 커플링된 돌연변이 유발 연구에 의해 확인할 수 있다.
본원에 포함되는 다른 단백질은 변형 아미노산을 포함하는 것이다. 예시적인 단백질은 글리코실화, PEG화, 인산화, 또는 그 단백질이 유도되는 단백질의 적어도 하나의 생물학적 기능을 보유하는 임의의 유사한 과정에 의해 변형된 것일 수 있는 유도체 단백질이다.
또한, 단백질은 하나 이상의 비-자연 발생 아미노산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 비전형적 아미노산 또는 화학적 아미노산 유사체가 단백질에 치환 또는 부가물로서 도입될 수 있다. 비전형적 아미노산은 통상적인 아미노산의 D-이성체, 2,4-디아미노부티르산, 알파-아미노 이소부티르산, 4-아미노부티르산, Abu, 2-아미노 부티르산, 감마-Abu, 엡실론-Ahx, 6-아미노 헥산산, Aib, 2-아미노 이소부티르산, 3-아미노 프로피온산, 오르니틴, 노르류신, 노르발린, 히드록시프롤린, 사르코신, 시트룰린, 호모시트룰린, 시스테인산, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 페닐글리신, 시클로헥실알라닌, 베타-알라닌, 플루오로-아미노산, 디자이너 (designer) 아미노산, 예를 들어 베타-메틸 아미노산, C알파-메틸 아미노산, N알파-메틸 아미노산, 및 아미노산 유사체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 또한, 아미노산은 D (우선성) 또는 L (좌선성)일 수 있다.
특정 실시태양에서, 본원에 기재된 Sbn 폴리펩티드는 그의 용해도를 증가시키고(시키거나) 그의 정제, 확인, 검출, 및(또는) 구조적 특성화를 용이하게 하는 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다. 예시적인 도메인은 예를 들어 글루타티온 S-트랜스퍼라제 (GST), 단백질 A, 단백질 G, 칼모듈린-결합 펩티드, 티오레독신, 말토스 결합 단백질, HA, myc, 폴리 아르기닌, 폴리 His, 폴리 His-Asp 또는 FLAG 융합 단백질 및 태그를 포함한다. 추가의 예시적인 도메인은 생체 내에서 단백질 위치를 변경시키는 도메인, 예를 들어 시그날 펩티드, 타입 III 분비 시스템-표적화 펩티드, 트랜스사이토시스 도메인, 핵 위치 시그날 등을 포함한다. 상이한 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 하나 이상의 이종성 융합체를 포함할 수 있다. 폴리펩티드는 동일한 융합 도메인의 여러 카피를 포함할 수 있거나 또는 2개 이상의 상이한 도메인에 대한 융합체를 포함할 수 있다. 융합은 폴리펩티드의 N-말단에서, 폴리펩티드의 C-말단에서, 또는 폴리펩티드의 N-말단과 C-말단 모두에서 발생할 수 있다. 또한, 융합 단백질의 제조를 용이하게 하거나 융합 단백질의 단백질 발현 또는 구조적 제한을 최적화하기 위해 본 발명의 폴리펩티드와 융합 도메인 사이에 링커 서열을 포함하는 것도 본 발명의 범위에 포함된다. 또다른 실시태양에서, 폴리펩티드는 단백질 발현 후에 태그를 제거하기 위해 융합 폴리펩티드와 본 발명의 폴리펩티드 사이에 프로테아제 절단 부위를 포함하도록 제조될 수 있다. 적합한 엔도프로테아제의 예는 예를 들어 인자 Xa 및 TEV 프로테아제를 포함한다. 단백질은 또한 시그날 서열에 융합될 수 있다. 예를 들어, 재조합 방식으로 제조될 때, 펩티드를 코딩하는 핵산은 단백질이 세포로부터 분비되도록 그의 5' 말단에서 시그날 서열에 연결될 수 있다.
에스. 아우레우스 폴리펩티드는 공지의 방법, 예를 들어 황산암모늄 또는 에탄올 침전, 산 추출, 음이온 또는 양이온 교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 렉틴 크로마토그래피 및 고성능 액체 크로마토그래피 ("HPLC")에 의해 재조합 세포 배양액으로부터 회수 및 정제될 수 있다. 단백질은 실질적으로 순수한 제제로서 사용될 수 있고, 예를 들어 제제 내의 적어도 약 90%의 단백질이 요구되는 단백질이다. 또한, 적어도 약 50%, 60%, 70%, 또는 80%의 요구되는 단백질을 포함하는 조성물도 사용할 수 있다.
단백질은 변성되거나 변성되지 않을 수 있고, 그 결과로서 응집되거나 응집되지 않을 수 있다. 단백질은 당업계에 공지된 방법에 따라 변성될 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 화학적으로, 세포 부재 시스템에서 리보좀에 의해 또는 세포 내에서 리보좀에 의해 합성될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 화학적 합성은 당업계의 다양한 공지의 방법, 예를 들어 단계적인 고상 합성, 펩티드 단편의 입체형태 지원 재라이게이션 (conformationally-assisted re-ligation)을 통한 반합성, 클로닝된 또는 합성 펩티드 세그먼트의 효소에 의한 라이게이션 및 화학적 라이게이션을 사용하여 수행될 수 있다. 천연 화학적 라이게이션은 일시적인 티오에스테르-연결 중간체를 생성시키기 위해 2개의 비보호된 펩티드 세그먼트의 화학선택적 반응을 이용한다. 이어서, 일시적인 티오에스테르-연결 중간체는 자연적으로 재배열되어 라이게이션 부위에 결합을 갖는 전장 라이게이션 생성물을 제공한다. 전장 라이게이션 생성물은 세포 부재 합성에 의해 생산된 단백질과 화학적으로 동일하다. 전장 라이게이션 생성물은 재폴딩 및(또는) 산화되어 천연 디술피드-함유 단백질 분자를 형성할 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 6,184,344 및 6,174,530; 및 Muir et al, Curr. Opin. Biotech. (1993): vol. 4, p 420; Miller et al, Science (1989): vol. 246, p 1149; Wlodawer et al, Science (1989): vol. 245, p 616; Huang et al, Biochemistry (1991): vol. 30, p 7402; Schnolzer, et al, Int. J. Pept. Prot. Res. (1992): vol. 40, p 180-193; Rajarathnam et al, Science (1994): vol. 264, p 90; R. E. Offord, "Chemical Approaches to Protein Engineering", in Protein Design and the Development of New therapeutics and Vaccines, J. B. Hook, G. Poste, Eds., (Plenum Press, New York; 1990) pp. 253-282; Wallace et al, J. Biol. Chem. (1992): vol. 267, p 3852; Abrahmsen et al, Biochemistry (1991): vol. 30, p 4151; Chang, et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994) 91: 12544-12548; Schnlzer et al, Science (1992): vol., 3256, p 221; 및 Akaji et al, Chem. Pharm. Bull. (Tokyo) (1985) 33: 184 참조).
특정 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드의 자연 생성 또는 실험으로 유도된 상동체를 제공하는 것이 유리할 수 있다. 상기 상동체는 폴리펩티드의 자연 생성 형태의 생물학적 활성의 서브세트를 촉진 또는 억제하는 조절자로서 제한된 능력으로 기능할 수 있다. 따라서, 특이적인 생물학적 효과는 제한된 기능의 상동체로 처리함으로써 유도할 수 있고, 본 발명의 폴리펩티드의 모든 생물학적 활성에 대해 작용하는 아고니스트 또는 길항제를 사용한 처리에 비해 부작용이 더 적다. 예를 들어, 특정 단백질과 회합하는 본 발명의 야생형 폴리펩티드의 능력을 방해하지만 천연 폴리펩티드와 다른 세포 단백질 사이의 복합체 형성을 실질적으로 방해하지 않는 길항 활성의 상동체를 생성시킬 수 있다.
폴리펩티드는 본 발명의 전장 폴리펩티드로부터 유도될 수 있다. 상기 폴리펩티드의 단리된 펩티딜 부분은 상기 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 대응하는 단편으로부터 재조합 방식으로 생산된 폴리펩티드를 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 또한, 단편은 기술 당업계에 공지된, 예를 들어 종래의 Merrifield 고상 f-Moc 또는 t-Boc 화학을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 예를 들어, 단백질은 임의로 단편이 중복되지 않으면서 요구되는 길이의 단편으로 분할될 수 있거나, 요구되는 길이의 중복되는 단편으로 분할될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드의 요구되는 특성, 예를 들어 조절자로서 기능하는 능력을 갖는 펩티딜 단편을 확인하기 위해 단편을 제조하여 (재조합 또는 화학적 합성에 의해) 시험할 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 본 발명의 단백질의 펩티딜 부분은 예를 들어 각각 본 발명의 단백질의 별개의 단편을 포함하는 티오레독신 융합 단백질로서의 발현에 의해 결합 활성, 및 억제 활성에 대해 시험될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,270,181 및 5,292,646; 및 PCT 공개 WO94/02502 참조).
또다른 실시태양에서, 말단절단된 (truncated) 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 말단절단된 폴리펩티드는 1 내지 20개 또는 그 초과의 아미노산 잔기가 N- 및 C-말단의 어느 하나 또는 둘 모두로부터 제거된다. 상기 말단절단된 폴리펩티드는 전장 폴리펩티드보다 발현, 정제 또는 특성화가 보다 용이함을 입증할 수 있다. 예를 들어, 말단절단된 폴리펩티드는 결정화, 고품질의 회절 결정의 생산 또는 높은 강도 피크 및 최소 중복 피크를 갖는 HSQC 스펙트럼의 생성이 전장 폴리펩티드보다 용이함을 입증할 수 있다. 또한, 말단절단된 폴리펩티드는 특성화가 보다 용이할 수 있는, 전장 폴리펩티드의 안정한 활성 도메인을 확인할 수 있다.
치료 또는 예방 효능, 또는 안정성 (예를 들어, 생체 외 저장 수명, 생체 내에서 단백질 분해에 대한 저항 등)을 향상시키는 바와 같은 목적을 위해 본 발명의 폴리펩티드의 구조를 변형하는 것도 가능하다. 상기 변형 폴리펩티드는 자연 생성 형태의 단백질의 적어도 하나의 활성을 보유하도록 디자인될 때 본원에서 상세하게 설명되는 폴리펩티드의 "기능적 동등물"로 간주된다. 상기 변형된 폴리펩티드는 예를 들어 아미노산 치환, 결실, 또는 부가에 의해 생성될 수 있고, 상기 치환은 전체적으로 또는 부분적으로 보존적 아미노산 치환으로 이루어질 수 있다.
예를 들어, 단리된 보존적 아미노산 치환, 예를 들어 류신의 이소류신 또는 발린으로의 치환, 아스파르테이트의 글루타메이트로의 치환, 트레오닌의 세린으로의 치환이 생성되는 분자의 생물학적 활성에 큰 효과를 갖지 않을 것이라고 합리적으로 예상된다. 폴리펩티드의 아미노산 서열의 변경이 기능적 상동체를 생성시키는지는 야생형 단백질과 유사한 반응을 생성시키는 변이체 폴리펩티드의 능력을 평가함으로써 쉽게 결정할 수 있다. 2 이상의 치환이 발생한 폴리펩티드는 동일한 방식으로 쉽게 시험할 수 있다.
본 발명의 폴리펩티드의 조합 돌연변이체 세트 및 말단 절단 돌연변이체를 생성시키는 방법이 제공되고, 이는 효능있는 변이체 서열 (예를 들어, 상동체)를 확인하기에 특히 유용하다. 상기 조합 라이브러리의 스크리닝 목적은 예를 들어 본 발명의 폴리펩티드의 활성을 조절할 수 있거나 함께 신규한 활성을 갖는 상동체를 생성시키는 것이다. 자연 생성 단백질에 비해 선택적인 효능을 갖는 조합 유도된 상동체가 생성될 수 있다. 상기 상동체는 치료제 개발에 이용될 수 있다.
마찬가지로, 돌연변이 유발은 세포외 반감기가 대응하는 야생형 단백질보다 크게 상이한 상동체를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 변형된 단백질은 단백질 분해, 또는 단백질의 파괴 또는 불활성화를 야기하는 다른 세포 과정에 보다 안정하거나 덜 안정하게 될 수 있다. 상기 상동체, 및 이를 코딩하는 유전자는 단백질의 반감기를 조절함으로써 단백질 발현을 변경시키기 위해 이용될 수 있다. 상기한 바와 같이, 상기 단백질은 치료제 개발 또는 치료에 사용될 수 있다.
유사한 방식으로, 단백질 상동체는 대응하는 야생형 단백질의 활성을 방해할 수 있기 때문에 길항제로서 작용하기 위해 본 조합 방법에 의해 생성될 수 있다.
상기 방법의 대표적인 실시태양에서, 바람직하게는 가능한 가장 높은 상동성을 촉진하기 위해 일군의 단백질 상동체의 아미노산 서열을 정렬한다. 상기 일군의 변이체는 예를 들어 하나 이상의 종으로부터의 상동체, 또는 동일한 종에서 유래하지만 돌연변이에 의해 상이한 상동체를 포함할 수 있다. 정렬된 서열의 각각의 위치에 보이는 아미노산은 조합 서열의 다의성 (degenerate) 세트를 생성하도록 선택된다. 특정 실시태양에서, 조합 라이브러리는 각각 효능있는 단백질 서열의 적어도 일부를 포함하는 폴리펩티드의 라이브러리를 코딩하는 유전자의 다의성 라이브러리에 의해 생산된다. 예를 들어, 합성 올리고뉴클레오티드의 혼합물은 효능있는 뉴클레오티드 서열의 다의성 세트가 개별 폴리펩티드로서 또는 보다 큰 융합 단백질 (예를 들어 파지 디스플레이의 경우)의 세트로서 발현될 수 있도록 유전자 서열 내로 효소에 의해 라이게이션될 수 있다.
효능있는 상동체의 라이브러리를 다의성 올리고뉴클레오티드 서열로부터 생성시킬 수 있는 많은 방법이 존재한다. 다의성 유전자 서열의 화학적 합성은 자동 DNA 합성기에 의해 수행할 수 있고, 이어서 합성 유전자는 발현을 위해 적절한 벡터 내로 라이게이션될 수 있다. 유전자의 다의성 세트의 한 목적은 효능있는 단백질 서열의 요구되는 세트를 코딩하는 모든 서열을 하나의 혼합물로 제공하는 것이다. 다의성 올리고뉴클레오티드의 합성은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Narang (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al (1981) Recombinant DNA, Proc. 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: Elsevier pp. 273-289; Itakura et al (1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; Itakura et al. (1984) Science 198:1056; Ike et al, (1983) Nucleic Acid Res. 11:477 참조). 상기 기술은 다른 단백질의 유도된 발생에 사용되었다 (예를 들어, Scott et al. (1990) Science 249:386-390; Roberts et al. (1992) PNAS USA 89:2429-2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404-406; Cwirla et al. (1990) PNAS USA 87: 6378-6382; 및 미국 특허 5,223,409, 5,198,346 및 5,096,815 참고).
별법으로, 다른 형태의 돌연변이 유발을 사용하여 조합 라이브러리를 생성시킬 수 있다. 예를 들어, 단백질 상동체 (아고니스트 및 길항제 형태 모두)를 생성시키고, 예를 들어 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발 등 (Ruf et al. (1994) Biochemistry 33:1565-1572; Wang et al. (1994) J. Biol. Chem. 269:3095-3099; Balint et al (1993) Gene 137:109-118; Grodberg et al. (1993) Eur. J. Biochem. 218:597-601; Nagashima et al (1993) J. Biol. Chem. 268:2888-2892; Lowman et al (1991) Biochemistry 30:10832-10838; 및 Cunningham et al, (1989) Science 244:1081-1085), 링커 스캐닝 돌연변이 유발 (Gustin et al (1993) Virology 193:653-660; Brown et al (1992) Mol Cell Biol 12:2644-2652; McKnight et al. (1982) Science 232:316); 포화 돌연변이 유발 (Meyers et al. (1986) Science 232:613); PCR 돌연변이 유발 (Leung et al. (1989) Method Cell Mol Biol 1:11-19); 또는 랜덤 돌연변이 유발 (Miller et al. (1992) A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, Cold Spring Harbor, NY; 및 Greener et al. (1994) Strategies in Mol Biol 7:32-34)을 사용하여 라이브러리로부터 단리할 수 있다. 특히 조합 세팅에서, 링커 스캐닝 돌연변이 유발은 생물활성의 말단절단된 형태의 단백질을 확인하기 위한 매력적인 방법이다.
점 돌연변이 및 말단 절단에 의해 제조된 조합 라이브러리의 유전자 생성물의 스크리닝 및 특정 특성을 갖는 유전자 생성물에 대한 cDNA 라이브러리의 스크리닝을 위한 광범위한 기술이 당업계에 공지되어 있다. 상기 기술은 단백질 상동체의 조합 돌연변이 유발에 의해 생성된 유전자 라이브러리의 신속한 스크리닝에 일반적으로 적용될 수 있다. 큰 유전자 라이브러리의 스크리닝을 위해 가장 널리 사용되는 기술은 전형적으로 유전자 라이브러리를 복제가능 발현 벡터 내로 클로닝하고, 적절한 세포를 벡터의 라이브러리로 형질전환시키고, 요구되는 활성의 검출이, 그의 생성물이 검출된 유전자를 코딩하는 벡터의 비교적 쉬운 단리를 용이하게 하는 조건 하에서 조합 유전자를 발현시키는 것을 포함한다.
스크리닝 분석의 예시적인 실시태양에서, 후보 조합 유전자 생성물은 세포 표면 상에 디스플레이되고, 조합 유전자 생성물에 결합하는 특정 세포 또는 바이러스 입자의 능력이 "패닝 (panning) 분석"에 의해 검출된다. 예를 들어, 유전자 라이브러리는 세균 세포의 표면 막 단백질의 유전자 내로 클로닝되고 (Ladner et al, WO 88/06630; Fuchs et al, (1991) Bio/Technology 9:1370-1371; 및 Goward et al, (1992) TIBS 18:136-140), 생성되는 융합 단백질은 효능있는 기능적 상동체를 얻기 위해 예를 들어 세포 표면 단백질에 결합하는 형광 표지된 분자, 예를 들어 FITC-기질을 사용하여 패닝에 의해 검출된다. 세포는 형광 현미경으로 가시적으로 조사 및 분리될 수 있거나, 세포의 형태가 허용할 경우에는 형광-활성화 세포 분류기에 의해 분리될 수 있다. 상기 방법은 본 발명의 폴리펩티드와 상호작용할 수 있는 기질 또는 다른 폴리펩티드를 확인하기 위해 사용될 수 있다.
유사한 방식으로, 유전자 라이브러리는 바이러스 입자의 표면 상에 융합 단백질로서 발현될 수 있다. 예를 들어, 필라멘트성 파지 시스템에서 외래 펩티드 서열은 감염성 파지의 표면 상에 발현되어 두가지의 잇점을 제공할 수 있다. 먼저, 상기 파지는 고농도로 친화도 매트릭스에 적용될 수 있기 때문에, 다량의 파지를 한번에 스크리닝할 수 있다. 두번째로, 각각의 감염성 파지는 그 표면 상에 조합 유전자 생성물을 디스플레이한다. 특정 파지가 저수율로 친화도 매트릭스로부터 회수될 경우, 파지는 추가 라운드의 감염에 의해 증폭될 수 있다. 파지 gIII 또는 gVIII 코트 단백질은 바이러스 입자의 최종 패키징을 붕괴시키지 않으면서 융합 단백질을 생성시키기 위해 사용될 수 있기 때문에, 거의 동일한 이. 콜라이 필라멘트성 파지 M13, fd, 및 fl의 군이 파지 디스플레이 라이브러리에 가장 자주 사용된다 (Ladner et al., PCT 공개 WO 90/02909; Garrard et al., PCT 공개 WO 92/09690; Marks et al, (1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010; Griffiths et al, (1993) EMBO J. 12:725-734; Clackson et al, (1991) Nature 352:624-628; 및 Barbas et al, (1992) PNAS USA 89:4457-4461). 다른 파지 코트 단백질이 적절하게 사용될 수 있다.
본원에 개시된 폴리펩티드는 실제 단백질의 다른 세포 파트너에 대한 결합을 모방할 수 있는 모방체, 예를 들어 펩티드 또는 비-펩티드 물질을 생성시키기 위해 환원시킬 수 있다. 상기 설명한 돌연변이원 기술 및 티오레독신 시스템도 다른 단백질과의 단백질-단백질 상호작용에 참여하는 단백질의 결정자 맵핑에 특히 유용하다. 예시를 위해, 기질 단백질의 분자 인식에 관여하는 단백질의 중요한 잔기를 결정하여 기질 단백질에 결합할 수 있는 펩티드 모방체를 생성시키기 위해 사용할 수 있다. 이어서, 펩티드 모방체는 기질에 결합하여 야생형 단백질과의 상호작용에 필요한 중요한 잔기를 덮음으로써 단백질과 기질의 상호작용을 방지하여 야생형 단백질의 억제제로서 사용될 수 있다. 예를 들어 기질 폴리펩티드 결합에 관여하는 단백질의 아미노산 잔기를 맵핑하기 위해 스캐닝 돌연변이 유발을 사용함으로써, 기질 결합시에 잔기를 모방하는 펩티드 모방체 화합물을 생성시킬 수 있다.
예를 들어, 본원에 기재된 Sbn 단백질의 유도체는 화학적으로 변형된 펩티드 및 펩티드 모방체일 수 있다. 펩티드 모방체는 펩티드 및 단백질을 기초로 하거나 이로부터 유도된 화합물이다. 펩티드 모방체는 비천연 아미노산, 입체형태적 구속, 등량 (isosteric) 치환 등을 사용하여 공지의 펩티드 서열의 구조적 변형에 의해 얻을 수 있다. 대상 펩티드 모방체는 펩티드와 비-펩티드 합성 구조체 사이의 구조적 공간의 연속체를 구성하고; 따라서 펩티드 모방체는 약물작용 발생단을 묘사하고 펩티드를 모 펩티드의 활성을 갖는 비펩티드 화합물로 번역하는 것을 돕는데 유용할 수 있다.
또한, 대상 펩티드의 미메토프 (mimetope)가 제공될 수 있다. 상기 펩티드 모방체는 비-가수분해가능 (예를 들어 프로테아제 또는 대응하는 펩티드를 분해하는 다른 생리학적 조건에 대한 안정성 증가), 세포 분화 자극에 대한 특이성 및(또는) 효능 증가와 같은 특징을 가질 수 있다. 예시를 위해, 상기 잔기의 비-가수분해가능 펩티드 유사체는 벤조디아제핀 (예를 들어, Freidinger et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988 참조), 아제핀 (예를 들어, Huffman et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988 참조), 치환된 감마 락탐 고리 (Garvey et al., in Peptides: Chemistry and Biology, G.R. Marshall ed., ESCOM Publisher: Leiden, Netherlands, 1988), 케토-메틸렌 슈도펩티드 (Ewenson et al., (1986) J. Med. Chem. 29:295; 및 Ewenson et al., in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985), β-턴 디펩티드 코어 (Nagai et al., (1985) Tetrahedron Lett 26:647; 및 Sato et al (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1:1231)), 및 β-아미노알콜 (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126:419; 및 Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134:71)을 사용하여 생성시킬 수 있다.
펩티드 모방체를 생성시키기 위해 수행될 수 있는 다양한 측쇄 치환 이외에, 펩티드 2차 구조의 입체형태적으로 억제된 모방체도 고려된다. 펩티드의 아미드 결합에 대한 많은 대용물이 개발되어 왔다. 아미드 결합에 대해 자주 이용된 대용물은 (i) 트랜스-올레핀, (ii) 플루오로알켄, (iii) 메틸렌아미노, (iv) 포스폰아미드, 및 (v) 술폰아미드를 포함한다.
Figure 112007026815856-PCT00001
대용물의 예:
Figure 112007026815856-PCT00002
추가로,
펩티드의 주쇄(backbone)의 보다 실질적인 변형에 기초한 펩티드 모방체가 사용될 수 있다. 상기 범주에 포함되는 펩티드 모방체는 (i) 레트로-인버소 (retro-inverso) 유사체, 및 (ii) N-알킬 글리신 유사체 (소위 펩토이드)를 포함한다.
Figure 112007026815856-PCT00003
유사체의 예:
Figure 112007026815856-PCT00004
또한, 조합 화학 방법도 신규한 펩티드 모방체 개발에 집중되고 있다. 예를 들어, 소위 "펩티드 모핑 (morphing)" 전략의 한 실시태양은 광범한 펩티드 결합 치환을 포함하는 펩티드 유사체의 라이브러리의 랜덤한 생성에 촛점을 맞추고 있다.
Figure 112007026815856-PCT00005
예시적인 실시태양에서, 펩티드 모방체는 펩티드의 레트로-인버소 유사체로서 유도될 수 있다. 상기 레트로-인버소 유사체는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 문헌 [Sisto et al. 미국 특허 4,522,752]에 기재된 방법에 따라 제조할 수 있다. 레트로-인버소 유사체는 예를 들어 WO 00/01720에 기재된 바와 같이 생성시킬 수 있다. 예를 들어 몇몇 정상 펩티드 연결을 포함하는 혼합 펩티드를 생성시킬 수 있음이 이해될 것이다. 일반적인 지침으로서, 단백질 분해에 가장 취약한 부위가 전형적으로 변경되고, 덜 취약한 아미드 연결은 모방체 스위칭을 위해 임의로 선택가능하다. 최종 생성물, 또는 그의 중간체는 HPLC에 의해 정제될 수 있다.
펩티드는 D 입체이성체인 적어도 하나의 아미노산 또는 모든 아미노산을 포함할 수 있다. 다른 펩티드는 적어도 하나의 역전된 (reversed) 아미노산을 포함할 수 있다. 역전된 아미노산은 D 입체이성체일 수 있다. 펩티드의 모든 아미노산은 역전된 것일 수 있고(있거나) 모든 아미노산은 D 입체이성체일 수 있다.
또다른 예시적인 실시태양에서, 펩티드 모방체는 펩티드의 레트로-에난티오 (retro-enantio) 유사체로서 유도될 수 있다. 이와 같은 레트로-에난티오 유사체는 시판되는 D-아미노산 (또는 그의 유사체) 및 예를 들어 WO 00/01720에 기재된 표준 고상 또는 액상 펩티드-합성 기술을 사용하여 합성할 수 있다. 최종 생성물은 순수한 레트로-에난티오 유사체를 얻기 위해 HPLC에 의해 정제할 수 있다.
또다른 예시적인 실시태양에서, 트랜스-올레핀 유도체를 대상 펩티드에 대해 제조할 수 있다. 트랜스-올레핀 유사체는 문헌 [Y.K. Shue et al. (1987) Tetrahedron Letters 28:3225] 및 WO 00/01720에 기재된 방법에 따라 합성할 수 있다. 아미드 관능기 대신에 복수의 올레핀 관능기를 갖는 펩티드 유사체를 제조하기 위해 상기 방법에 의해 합성된 슈도디펩티드를 다른 슈도디펩티드에 커플링시키는 것도 가능하다.
펩티드 모방체 유도체의 또다른 클래스는 포스포네이트 유도체를 포함한다. 상기 포스포네이트 유도체의 합성은 공지의 합성 방법을 변용하여 수행할 수 있다 (예를 들어, Loots et al. in Peptides: Chemistry and Biology, (Escom Science Publishers, Leiden, 1988, p. 118); Petrillo et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium, Pierce Chemical Co. Rockland, IL, 1985) 참조).
많은 다른 펩티드 모방체 구조는 당업계에 공지되어 있고, 대상 펩티드 모방체에 사용하기 위해 쉽게 변용될 수 있다. 예시를 위해, 펩티드 모방체는 1-아자비시클로[4.3.0]노난 대용물 (Kim et al. (1997) J. Org. Chem. 62:2847 참조) 또는 N-아실 피페라진산 (Xi et al. (1998) J. Am. Chem. Soc. 720:80 참고) 또는 2-치환 피페라진 잔기를 억제된 아미노산 유사체 (Williams et al. (1996) J. Med. Chem. 39: 1345-1348 참조)로서 포함할 수 있다. 또다른 실시태양에서, 특정 아미노산 잔기는 아릴 및 비-아릴 잔기, 예를 들어 모노시클릭 또는 비시클릭 방향족 또는 헤테로방향족 핵, 또는 비방향족, 방향족-헤테로방향족 또는 비헤테로방향족 핵으로 치환될 수 있다.
대상 펩티드 모방체는 예를 들어 고효율 스크리닝과 조합된 조합 합성 기술에 의해 최적화될 수 있다.
또한, 미메토프의 다른 예는 단백질계 화합물, 탄수화물계 화합물, 지질계 화합물, 핵산계 화합물, 천연 유기 화합물, 합성에 의해 유도된 유기 화합물, 항-개별특이형 항체 및(또는) 촉매성 항체, 또는 그의 단편을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 미메토프는 예를 들어 천연 및 합성 화합물의 라이브러리를 세포 생존 및(또는) 종양 성장을 억제할 수 있는 화합물에 대해 스크리닝함으로써 얻을 수 있다. 미메토프는 또한 예를 들어 천연 및 합성 화합물의 라이브러리, 특히 화학적 또는 조합 라이브러리 (즉, 서열 또는 크기가 상이하지만 동일한 빌딩 블록을 갖는 화합물의 라이브러리)로부터 얻을 수 있다. 또한, 미메토프는 예를 들어 합리적인 약물 디자인에 의해 얻을 수 있다. 합리적인 약물 디자인 과정에서, 본 발명의 화합물의 3차원 구조는 예를 들어 핵 자기 공명 (NMR) 또는 x-선 결정학에 의해 분석할 수 있다. 이어서, 3차원 구조는 예를 들어 컴퓨터 모델링에 의해 효능있는 미메토프의 구조를 예측하기 위해 사용할 수 있다. 이어서, 예측된 미메토프 구조체는 예를 들어 화학 합성, 재조합 DNA 기술에 의해 또는 천연 원료 (예를 들어, 식물, 동물, 세균 및 진균)로부터 미메토프를 단리함으로써 생산할 수 있다.
"펩티드, 그의 변이체 및 유도체 또는 "펩티드 및 그의 유사체"는 "펩티드 치료제"에 포함되고, 임의의 펩티드 또는 그의 변형된 형태, 예를 들어 본원에 기재된 펩티드 모방체를 포함하도록 의도된다. 바람직한 펩티드 치료제는 세포 생존을 저하시키거나 세포자멸을 증가시킨다. 예를 들어, 펩티드 치료제는 예를 들어 본원에서 설명되는 분석으로 측정시에 적어도 약 2배, 5배, 10배, 30배 또는 100배의 팩터만큼 세포 생존을 저하시키거나 세포자멸을 증가시킬 수 있다.
Sbn 단백질, 그의 단편, 또는 변이체의 활성은 아래에 설명되는 활성에 대해 시험하기 적합한 적절한 기질 또는 결합 파트너 또는 다른 시약을 사용하여 분석할 수 있다.
또다른 실시태양에서, 폴리펩티드의 활성은 RNA 및(또는) 단백질 분자의 발현 수준을 분석함으로써 결정할 수 있다. 전사 수준은 예를 들어 노던 블롯, 올리고뉴클레오티드 어레이에 대한 혼성화 또는 생성되는 단백질 산물의 수준의 분석에 의해 결정할 수 있다. 번역 수준은 예를 들어 웨스턴 블로팅을 사용하여 또는 단백질 생성물에 의해 생성된 검출가능한 시그날 (예를 들어, 형광, 발광, 효소 활성 등)을 확인함으로써 결정할 수 있다. 특정 상황에 따라, 단일 유전자 또는 다수의 유전자의 전사 및(또는) 번역 수준을 검출하는 것이 바람직할 수 있다.
별법으로, 세포에서 DNA 복제, 전사 및(또는) 번역의 전체 속도를 측정하는 것이 바람직할 수 있다. 일반적으로, 이것은 생성되는 DNA, RNA 또는 단백질 생성물 내로 도입되는 검출가능한 대사체의 존재 하에 세포를 성장시킴으로써 달성할 수 있다. 예를 들어, DNA 합성 속도는 새로 합성되는 DNA 내로 도입되는 BrdU의 존재 하에 세포를 성장시킴으로써 결정할 수 있다. 이어서, BrdU의 양은 항-BrdU 항체를 사용하여 조직화학적으로 결정할 수.
다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 고체 표면, 예를 들어 미세적정판, 슬라이드, 비드, 필름 등에 고정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 어레이의 일부로서 "칩" 상에 고정될 수 있다. 복수의 어드레스를 갖는 어레이는 하나 이상의 어드레스에 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 칩은 폴리펩티드 서열의 어레이의 일부로서 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 고체 표면, 예를 들어 플레이트, 미세적정판, 슬라이드, 비드, 입자, 구체, 필름, 스트랜드, 침전물, 겔, 시트, 튜브, 용기, 모세관, 패드, 슬라이스 등에 고정될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드는 어레이의 일부로서 "칩" 상에 고정될 수 있다. 복수의 어드레스를 갖는 어레이는 하나 이상의 어드레스에 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 한 실시태양에서, 칩은 어레이의 일부로서 본 발명의 하나 이상의 폴리펩티드를 포함한다.
5. 항체 및 그의 용도
본원에서 설명되는 Sbn 폴리펩티드에 대한 항체를 제조하기 위해, 숙주 동물에게 Sbn 폴리펩티드 또는 Sbn 펩티드를 주사할 수 있다. 요구되는 표적 서열을 포함하는 상이한 길이의 펩티드를 숙주에게 주사할 수 있다. 예를 들어, 적어도 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 105, 110, 115, 120, 125, 130, 135, 140, 145 또는 150개의 아미노산의 펩티드 항원이 사용될 수 있다. 별법으로, 단백질의 일부가 에피토프를 규정하지만 항원성을 보이기에는 너무 짧을 경우, 항체를 생성하기 위해 단백질은 캐리어 분자에 컨쥬게이팅될 수 있다. 몇몇 적합한 캐리어 분자는 키홀 림펫 헤모시아닌, Ig 서열, TrpE, 및 인간 또는 소 혈청 알부민을 포함한다. 컨쥬게이션은 당업계에 공지된 방법에 의해 수행할 수 있다. 상기 방법의 하나는 단편의 시스테인 잔기를 캐리어 분자 상의 시스테인 잔기와 조합하는 것이다.
또한, 3차원 에피토프, 즉, 비-선형 에피토프에 대한 항체는 예를 들어 단백질의 결정학적 데이타를 기초로 하여 제조할 수 있다. 주사로부터 얻은 항체는 본원에서 설명되는 단백질의 짧은 항원에 대해 스크리닝될 수 있다. Sbn 펩티드에 대해 제조된 항체는 펩티드 및 전장 Sbn 단백질에 대한 활성을 시험할 수 있다. 항체는 본원에서 설명되는 Sbn 펩티드 및(또는) 전장 Sbn 단백질에 대해 적어도 약 10-6 M, 10-7 M, 10-8 M, 10-9 M, 10-10 M, 10-11 M 또는 10-12 M 이상의 친화도를 가질 수 있다.
DNA 서열에 적합한 세포 및 항체 발현 및 분비를 위한 숙주 세포는 많은 공급원, 예를 들어 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection ("Catalogue of Cell Lines and Hybridomas" 5th edition (1985), 미국 메릴랜드주 록빌)으로부터 입수할 수 있다.
폴리클로날 및 모노클로날 항체는 당업계에 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler and Milstein, Nature 1975; 256: 495-7; 및 Campbell in "Monoclonal Antibody Technology, The Production and Characterization of Rodent and Human Hybridomas" in Burdon et al, Eds. Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Volume 13, Elsevier Science Publishers, Amsterdam (1985)]에 기재된 면역학적 방법 및 문헌 [Huse et al, Science (1989) 246: 1275-81]에 기재된 재조합 DNA 방법을 포함하는 공지된 방법을 사용하여 제조된 하이브리도마에 의해 생산될 수 있다.
항체 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y. 참조). 정제 방법은 염 침전 (예를 들어 황산암모늄 사용), 이온 교환 크로마토그래피 (예를 들어, 중성 pH에서 이동하고 증가하는 이온 강도의 단계 구배로 용출되는 양이온성 또는 음이온성 교환 컬럼 상에서의), 겔 여과 크로마토그래피 (겔 여과 HPLC 포함), 및 친화도 수지, 예를 들어 단백질 A, 단백질 G, 히드록시아파타이트, 및 항-항체에 대한 크로마토그래피를 포함할 수 있다. 항체는 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 친화도 칼럼 상에서 정제할 수 있다.
다른 실시태양은 항체의 기능적 동등물을 포함하고, 예를 들어 키메릭, 인간화, 및 단일쇄 항체 및 그의 단편을 포함한다. 기능적 동등물의 생산 방법은 PCT 출원 공개 WO 93/21319; 유럽 특허 출원 239,400; PCT 출원 공개 WO 89/09622; 유럽 특허 출원 388,745; 및 유럽 특허 출원 EP 332,424에 개시되어 있다.
기능적 동등물은 본 발명의 항체의 가변 또는 초가변 영역의 아미노산 서열과 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. "실질적으로 동일한" 아미노산 서열은 본원에서 문헌 [Pearson and Lipman, (1988) Proc Natl Acd Sci USA 85: 2444-8]에 따라 FASTA 서치 방법에 의해 결정시에 다른 아미노산 서열과 적어도 70%, 바람직하게는 적어도 약 80%, 보다 바람직하게는 적어도 90%의 상동성을 갖는 서열로서 규정된다.
키메릭 항체는 실질적으로 또는 그 전체가 인간 항체 불변 영역으로부터 유도된 불변 영역 및 실질적으로 또는 그 전체가 인간 이외의 다른 포유동물의 가변 영역으로부터 유도된 가변 영역을 가질 수 있다. 인간화 항체는 실질적으로 또는 그 전체가 대응하는 인간 항체 영역으로부터 유도된, 보체 결정 영역 (CDR) 이외의 다른 불변 영역 및 가변 영역 및 실질적으로 또는 그 전부가 인간 이외의 다른 포유동물로부터 유도된 CDR을 가질 수 있다.
인간 이외의 다른 적합한 포유동물은 모노클로날 항체를 그로부터 제조할 수 있는 임의의 포유동물을 포함할 수 있다. 인간 이외의 다른 적합한 포유동물의 예는 예를 들어 토끼, 래트, 마우스, 말, 염소 또는 영장류를 포함할 수 있다.
본원에서 설명되는 Sbn 단백질에 대한 항체는 상기한 바와 같이 제조할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 본원에서 설명되는 Sbn 단백질에 대한 항체 (전체 항체 또는 항체 단편)는 항체의 반감기를 증가시키기 위해 당업자에게 알려진 방법에 따라 생체적합성 물질, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜 분자 (PEG)에 컨쥬게이팅될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 6,468,532 참조). 관능화된 PEG 중합체는 예를 들어 네크타 써라퓨틱스 (Nektar Therapeutics)로부터 입수가능하다. 시판되는 PEG 유도체는 아미노-PEG, PEG 아미노산 에스테르, PEG-히드라지드, PEG-티올, PEG-숙시네이트, 카르복시메틸화 PEG, PEG-프로피온산, PEG 아미노산, PEG 숙신이미딜 숙시네이트, PEG 숙신이미딜 프로피오네이트, 카르복시메틸화 PEG의 숙신이미딜 에스테르, PEG의 숙신이미딜 카르보네이트, 아미노산 PEG의 숙신이미딜 에스테르, PEG-옥시카르보닐이미다졸, PEG-니트로페닐 카르보네이트, PEG 트레실레이트, PEG-글리시딜 에테르, PEG-알데히드, PEG 비닐술폰, PEG-말레이미드, PEG-오르토피리딜-디술피드, 이종관능성 PEG, PEG 비닐 유도체, PEG 실란 및 PEG 포스폴리드를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 상기 PEG 유도체의 커플링을 위한 반응 조건은 폴리펩티드, 요구되는 PEG화 정도, 및 이용되는 PEG 유도체에 따라 상이할 것이다. PEG 유도체의 선택에 관련되는 몇몇 인자는 요구되는 부착 지점 (예를 들어 리신 또는 시스테인 R-기), 유도체의 가수분해 안정성 및 반응성, 연결의 안정성, 독성 및 항원성, 분석 적합성 등을 포함한다.
6. 제약 조성물
에스. 아우레우스 Sbn 항체, 안티센스 핵산, siRNA 및 다른 길항제는 당업계에 공지된 바와 같이 그의 의도하는 용도에 따라 다양한 수단에 의해 투여될 수 있다. 예를 들어, 상기 에스. 아우레우스 길항제 조성물이 경구 투여될 경우, 정제, 캡슐, 과립, 분말 또는 시럽으로 제제화될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 제제는 주사제 (정맥내, 근내 또는 피하), 점적 주입 제제 또는 좌제로서 비경구적으로 투여될 수 있다. 눈 점막 경로에 의한 적용을 위해, 본 발명의 조성물은 점안제 또는 안연고로서 제제화될 수 있다. 상기 제제는 종래의 수단으로 제제화할 수 있고, 필요한 경우, 조성물을 임의의 종래의 첨가제, 예를 들어 부형제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 교정제, 가용화제, 현탁 조제, 유화제 또는 코팅제와 혼합할 수 있다.
본 발명의 제제에서, 습윤제, 유화제 및 윤활제, 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트 및 스테아르산마그네슘, 및 착색제, 방출제, 코팅제, 감미, 풍미 및 방향제, 보존제 및 항산화제가 제제화된 물질에 존재할 수 있다.
대상 조성물은 경구, 비내, 국소 (구강 및 설하 포함), 직장, 질내, 에어로졸 및(또는) 비경구 투여에 적합할 수 있다. 제제는 편리하게 단위 투여 형태로 제공될 수 있고, 제약업계에 공지된 임의의 방법으로 제조될 수 있다. 단일 투여를 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 조성물의 양은 치료되는 대상 및 특정 투여 방식에 따라 상이하다.
상기 제제의 제조 방법은 본 발명의 조성물을 담체 및 임의로 하나 이상의 보조 성분과 회합시키는 단계를 포함한다. 일반적으로, 제제는 활성 성분을 액체 담체, 또는 미분할 고체 담체, 또는 둘 모두와 균일하고 긴밀하게 회합시킨 후, 필요한 경우 생성물을 성형함으로써 제조된다.
경구 투여에 적합한 제제는 활성 성분으로서 소정량의 그의 대상 조성물을 각각 포함하는 캡슐, 카세제, 알약, 정제, 로젠지 (향미 베이스, 대체로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용), 분말, 과립의 형태 또는 수성 또는 비수성 액체 중의 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 향정제 (불활성 염기, 예를 들어 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아를 사용)일 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 볼러스, 연질약, 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 고체 투여 형태 (캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 대상 조성물은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘, 및(또는) 다음 중 임의의 성분과 혼합된다: (1) 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토스, 수크로스, 글루코스, 만니톨 및(또는) 규산; (2) 결합제, 예를 들어 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및(또는) 아카시아; (3) 보습제, 예를 들어 글리세롤; (4) 붕해제, 예를 들어 아가-아가, 칼슘 카르보네이트, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 탄산나트륨; (5) 용액 지연제, 예를 들어 파라핀; (6) 흡수 촉진제, 예를 들어 사차 암모늄 화합물; (7) 습윤제, 예를 들어, 아세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; (8) 흡수제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트 점토; (9) 윤활제, 예를 들어 탈크, 스테아르산칼슘, 스테아르산마그네슘, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술페이트, 및 이들의 혼합물; 및 (10) 착색제. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 조성물은 완충제도 포함할 수 있다. 락토스 또는 유당과 같은 부형제, 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하는 연질 및 경질 충전 젤라틴 캡슐의 충전제로서 유사한 종류의 고체 조성물도 사용될 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 성형에 의해 제조될 수 있다. 압축 정제는 결합제 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 보존제, 붕해제 (예를 들어, 나트륨 전분 글리콜레이트 또는 가교결합된 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 표면활성 또는 분산제를 사용하여 제조할 수 있다. 성형 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤처리된 대상 조성물의 혼합물을 적합한 기기로 성형함으로써 제조될 수 있다. 정제 및 다른 고체 투여 형태, 예를 들어 당의정, 캡슐, 알약 및 과립은 임의로 코팅 및 외피, 예를 들어 장용코팅 및 제약 제제 기술 분야에 공지된 다른 코팅을 사용하여 얻거나 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다. 대상 조성물에 추가하여, 액체 투여 형태는 당업계에 통상 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히 면실, 땅콩, 옥수수, 유아, 올리브, 캐스터 및 참깨유), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
현탁액은 대상 조성물에 추가하여 현탁제, 예를 들어 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미결정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 및 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
직장 또는 질내 투여용 제제는 좌제로서 제공될 수 있고, 이는 대상 조성물을 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌제 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 적합한 비-자극성 부형제 또는 담체 (실온에서 고체이지만 체온에서 액체이고, 따라서 체강에서 용융되어 활성제를 방출함)가 혼합하여 제조할 수 있다. 또한, 질내 투여에 적합한 제제는 적절한 것으로 당업계에 공지된 상기 담체를 포함하는 질 좌약, 탐폰, 크림, 겔, 페이스트, 포움 또는 스프레이 제제를 포함한다.
대상 조성물의 경피 투여용 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 성분은 멸균 조건 하에서 제약상 허용되는 담체, 및 요구될 수 있는 임의의 보존제, 버퍼, 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 대상 조성물에 추가하여 부형제, 예를 들어 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 산화아연, 또는 이들의 혼합물을 포함할 수 있다.
분말 및 스프레이는 대상 조성물에 추가하여 부형제, 예를 들어 락토스, 탈크, 규산, 알루미늄 히드록시드, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말, 또는 상기 물질의 혼합물을 포함할 수 있다. 스프레이는 추가로 통상적인 추진제, 예를 들어 클로로플루오로탄화수소 및 휘발성 비치환 탄화수소, 예를 들어 부탄 및 프로판을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 별법으로 에어로졸에 의해 투여될 수 있다. 이것은 화합물을 포함하는 수성 에어로졸, 리포좀 제제 또는 고체 입자를 제조함으로써 달성된다. 비-수성 (예를 들어, 플루오로카본 추진제) 현탁액을 사용할 수 있다. 대상 조성물에 포함된 화합물의 분해를 야기할 수 있는 전단에 대한 활성 성분의 노출을 최소화하기 때문에, 음파 분무기를 사용할 수 있다.
통상적으로, 수성 에어로졸은 대상 조성물의 수용액 또는 현탁액을 종래의 제약상 허용되는 담체 및 안정화제와 함께 제제화함으로써 제조된다. 담체 및 안정화제는 특정 대상 조성물의 요건에 따라 상이하지만, 전형적으로 비이온계 계면활성제 (Tweens, Pluronics, 또는 폴리에틸렌 글리콜), 무해한 단백질 유사 혈청 알부민, 소르비탄 에스테르, 올레산, 레시틴, 아미노산, 예를 들어 글리신, 버퍼, 염, 당 또는 당 알콜을 포함한다. 에어로졸은 일반적으로 등장성 용액으로부터 제조된다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물은 대상 조성물을 하나 이상의 제약학상 허용되는 멸균 등장성 수용액 또는 비-수용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 항산화제, 버퍼, 정균제, 제제를 의도하는 수여자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 비후제를 포함할 수 있는 멸균 주사가능 용액 또는 분산액으로 사용 전에 재구성할 수 있는 멸균 분말과 조합하여 포함한다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비-수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등), 및 적합한 이들의 혼합물, 식물유, 예를 들어 올리브유, 및 주사가능 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
본원에서 설명되는 제약 조성물은 에스. 아우레우스 감염에 의한 병태 또는 질병, 예를 들어 종기, 만성 종기증, 농가진, 급성 골수염, 폐렴, 심내막염, 열상 피부 증후군, 독성 쇼크 증후군 및 식중독 (이로 제한되지 않음)의 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
7. sbn-매개 철포획체 생합성 억제제에 대한 예시적인 스크리닝 분석
일반적으로, 스태필로박틴 생합성을 방해함으로써 병원성 발병능을 감소시킬 수 있는 물질 또는 화합물은 천연 생성물 또는 합성 (또는 반합성) 추출물 또는 화학적 라이브러리 모두의 큰 라이브러리를 스크리닝하기 위한 본원에 개시된 분석을 사용하여 확인할 수 있다. 약물 발견 및 개발 분야의 숙련인은 물질 (예를 들어, 시험 추출물 또는 화합물)의 정확한 공급원이 본 발명의 스크리닝 과정에 중요하지 않음을 이해할 것이다. 따라서, 실질적으로 임의의 수의 화학적 추출물 또는 화합물을 본원에 기재된 방법을 사용하여 스크리닝할 수 있다. 상기 물질, 추출물, 또는 화합물의 예는 식물, 진균, 원핵 또는 동물계 추출물, 발효 브로쓰, 및 합성 화합물, 및 존재하는 화합물의 변형체를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 사카라이드, 지질, 펩티드 및 핵산계 화합물을 포함하여 이로 제한되지 않는 임의의 수의 화학 화합물의 랜덤하거나 제어된 합성 (예를 들어, 반합성 또는 총 합성)을 위한 많은 방법이 또한 이용가능하다. 합성 화합물 라이브러리는 브랜든 어소시에이츠 (Brandon Associates, 미국 뉴햄프셔주 메리맥) 및 알드리치 케미칼 (Aldrich Chemical, 미국 위스콘신주 밀워키)로부터 시판된다. 별법으로, 세균, 진균, 식물 및 동물 추출물 형태의 천연 화합물의 라이브러리는 많은 공급원, 예를 들어 바이오틱스 (Biotics, 영국 서섹스주), 제노바 (Xenova, 영국 슬라우주), 하버 브랜치 오션그래픽스 인스티튜트 (Harbor Branch Oceangraphics Institute, 미국 플로리다주 포트피어스), 및 팜나마르, 유.에스.에이 (PharmnaMar, U.S.A., 미국 매사추세츠주 캠브리지)로부터 시판되고 있다. 또한, 천연 및 합성 제조된 라이브러리는 필요한 경우 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 표준 추출 및 분획화 방법에 의해 생산된다. 또한, 요구될 경우, 임의의 라이브러리 또는 화합물은 표준 화학적, 물리적 또는 생화학적 방법을 사용하여 쉽게 변형된다.
또한, 약물 발견 및 개발 분야의 숙련인은 중복 분리 방지 (dereplication) (예를 들어, 분류학적 중복 분리 방지, 생물학적 중복 분리 방지, 및 화학적 중복 분리 방지, 또는 이들의 임의의 조합 방법) 방법 또는 그의 항-병원 활성에 대해 공지된 물질의 복사체 또는 반복체의 제거를 가능할 때마다 사용하여야 함을 쉽게 이해할 것이다.
조 추출물이 항-병원체 또는 항-발병 활성, 또는 결합 활성을 갖는 것으로 밝혀진 경우에는, 관찰된 효과에 기여하는 화학적 성분을 단리하기 위해 양성 선도 추출물의 추가의 분획화가 필요하다. 따라서, 추출, 분획화 및 정제 과정의 목적은 항-병원 활성을 갖는 조 추출물 내의 화학적 물질의 신중한 특성화 및 확인이다. 상기 이종 추출물의 분획화 및 정제 방법은 당업계에 공지되어 있다. 필요한 경우, 병원성 치료를 위해 유용한 것으로 밝혀진 화합물은 당업계에 공지된 방법에 따라 화학적으로 개질된다.
sbn 코딩 폴리펩티드 또는 스태필로박틴의 효능있는 억제제 또는 길항제는 본 발명의 핵산 서열 또는 폴리펩티드에 결합하여 그의 활성을 억제하거나 제거하는 유기 분자, 펩티드, 펩티드 모방체, 폴리펩티드, 및 항체를 포함할 수 있다. 또한, 효능있는 길항제는 폴리펩티드의 결합 부위에 결합하고 그 부위를 점유하여 세포 결합 분자에 대한 결합을 억제함으로써, 정상적인 생물학적 활성을 억제하는 소분자를 포함한다. 다른 효능있는 길항제는 안티센스 분자를 포함한다.
7.1 상호작용 분석
정제된 재조합 SbnA, SbnB, SbnG, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 및 SbnI 폴리펩티드는 Sbn 유전자 생성물에 결합하여 단백질-단백질 상호작용을 붕괴시키는 물질을 스크리닝하기 위한 분석 개발에 이용될 수 있다. SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI의 효능있는 억제제 또는 길항제는 SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI에 결합하여 그의 활성을 감소시키거나 제거하는 유기 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드 모방체 및 항체를 포함할 수 있다.
예시적인 결합 분석에서, 반응 혼합물은 SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI의 적어도 생물학적으로 활성인 부분, 목적하는 물질(들), 및 적절한 상호작용 분자를 포함하도록 생성시킬 수 있다. 상호작용 분자는 시험되는 Sbn 폴리펩티드에 따라 결정될 것이다. 바람직한 실시태양에서, 목적하는 물질은 특정 Sbn 폴리펩티드에 대한 항체이다. Sbn 폴리펩티드에 대한 항체의 결합은 철포획체의 생합성에서 Sbn 폴리펩티드의 기능을 억제할 수 있다. 특정 Sbn 폴리펩티드와 적절한 상호작용 분자의 상호작용의 검출 및 정량화는 상호작용 억제시의 물질의 효능을 결정하기 위한 수단을 제공한다. 물질의 효능은 다양한 농도의 시험 물질을 사용하여 얻어진 데이타로부터 투여량 반응 곡선을 그림으로써 평가할 수 있다. 또한, 비교를 위한 기준선을 제공하기 위해서 대조 분석도 수행할 수 있다. 대조 분석에서, 특정 Sbn 폴리펩티드와 적절한 상호작용 분자의 상호작용은 시험 물질의 부재 하에 정량화될 수 있다.
특정 Sbn 폴리펩티드와 적절한 상호작용 분자의 상호작용은 다양한 기술에 의해 검출할 수 있다. 복합체 형성의 조절은 예를 들어 검출가능하게 표지된 단백질, 예를 들어 방사성 표지된, 형광 표지된, 또는 효소에 의해 표지된 폴리펩티드를 사용하여 면역분석 또는 크로마토그래피 검출에 의해 정량화될 수 있다.
특정 Sbn 단백질과 적절한 상호작용 분자의 상호작용의 측정은 광학 바이오센서 장치에서 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하여 직접 관찰할 수 있다. 상기 방법은 보다 큰 (>5 kDa) 폴리펩티드와의 상호작용 검출에 특히 유용하고, 단백질-단백질 상호작용의 억제제 스크리닝에 적용될 수 있다.
별법으로, 하나 또는 둘 모두의 단백질의 비복합체 형태로부터 복합체의 분리를 용이하게 하고 분석 자동화를 위해 특정 Sbn 폴리펩티드 또는 적절한 상호작용 분자를 고정시키는 것이 바람직할 것이다. 예를 들어, 후보 물질의 존재 및 부재 하에서 특정 Sbn 단백질의 상호작용 분자에 대한 결합은 반응물을 수용하기 적합한 임의의 용기에서 수행할 수 있다. 그 예는 미세적정판, 시험관 및 미세원심분리기 튜브를 포함한다. 한 실시태양에서, 단백질이 매트릭스에 대해 결합하도록 허용하는 도메인을 추가한 융합 단백질을 제공할 수 있다. 예를 들어, 글루타티온-S-트랜스퍼라제/SbnA (GST/SbnA) 융합 단백질을 글루타티온 세파로스 비드 (시그마 케미칼 (Sigma Chemical, 미국 미저리주 세인트루이스)) 또는 글루타티온 유도체화 미세적정판 상에 흡착시킨 후, 예를 들어 35S-표지된 상호작용 분자, 및 시험 물질과 조합하고, 혼합물을 복합체 형성에 도움이 되는 조건, 예를 들어 염 및 pH에 대한 생리학적 조건에서 인큐베이팅할 수 있고, 약간 더 엄격한 조건이 요구될 수 있다. 인큐베이션 후에, 비드를 세척하여 임의의 비결합된 표지를 제거하고, 매트릭스를 고정시키고, 방사성 표지를 직접 (예를 들어 신틸런트 (scintillant)에 놓인 비드), 또는 복합체를 후속적으로 해리시킨 후 상등액에서 결정한다. 별법으로, 복합체는 매트릭스로부터 해리되어 SDS-PAGE에 의해 분리되고, 비드 분획에서 발견된 상호작용 분자의 수준을 표준 전기영동 기술을 사용하여 겔로부터 정량화될 수 있다.
단백질 및 다른 분자를 매트릭스 상에 고정시키기 위한 다른 기술도 대상 분석에 이용할 수 있다. 예를 들어, 특정 Sbn 단백질 또는 적절한 상호작용 분자는 비오틴 및 스트렙타비딘의 컨쥬게이션을 이용하여 고정시킬 수 있다. 예를 들어, 비오티닐화 SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI는 당업계에 공지된 기술 (예를 들어, 비오티닐화 키트, 피어스 케미칼 (Pierce Chemicals, 미국 일리노이주 록포드))을 사용하여 비오틴-NHS (N-히드록시-숙신이미드)로부터 제조하여 스트렙타비딘-코팅된 96 웰 플레이트 (피어스 케미칼)의 웰에 고정시킬 수 있다. 별법으로, SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI와 반응성이지만 폴리펩티드와 상호작용 분자 사이의 상호작용을 방해하지 않는 항체는 플레이트의 웰에 유도체화될 수 있고, SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI는 항체 컨쥬게이션에 의해 웰에 포획될 수 있다. 상기와 같이, 상호작용 분자 및 시험 화합물의 제제를 플레이트의 폴리펩티드 제시 웰에서 인큐베이팅하고, 웰에 포획된 복합체의 양은 시험 물질의 존재 또는 부재 하에 정량할 수 있다. GST-고정된 복합체에 대해 상기 설명한 것에 추가하여, 상기 복합체를 검출하기 위한 예시적인 방법은 상호작용 분자와 반응성인 항체를 사용한 복합체의 면역검출 또는 상호작용 분자와 회합된 효소 활성의 검출에 의존하는 효소-연결 분석을 포함한다.
예를 들어, 효소는 상호작용 분자와 화학적으로 컨쥬게이팅될 수 있거나 상호작용 분자와의 융합 단백질로서 제공될 수 있다. 설명을 위해, 상호작용 분자는 양고추냉이 퍼옥시다제와 화학적으로 가교결합되거나 유전적으로 융합될 수 있고, 복합체에 포획된 폴리펩티드의 양은 효소의 발색 기질, 예를 들어, 3,3'-디아미노-벤자딘 테트라히드로클로라이드 또는 4-클로로-1-나프톨을 사용하여 평가할 수 있다. 마찬가지로, 폴리펩티드 및 글루타티온-S-트랜스퍼라제를 포함하는 융합 단백질을 제공할 수 있고, 복합체 형성은 1-클로로-2,4-디니트로벤젠을 사용하여 GST 활성을 검출함으로써 정량화할 수 있다 (Habig et al. (1974) J. Biol. Chem. 249:7130).
7.2 생화학적 분석
정제된 재조합 SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 및 SbnI 폴리펩티드는 sbn 오페론을 포함하는 각각의 유전자 생성물의 생합성 활성을 억제하는 물질을 스크리닝하기 위한 분석의 개발을 용이하게 하기 위해 사용될 수 있다. SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI의 효능있는 억제제 또는 길항제는 SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI에 결합하여 그의 활성을 감소 또는 소멸시키는 유기 소분자, 펩티드, 폴리펩티드, 펩티드 모방체, 및 항체를 포함한다.
예시적인 스크리닝 분석에서, 반응 혼합물은 SbnA, SbnB, SbnC, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI의 적어도 생물학적으로 활성인 부분, 목적하는 시험 물질(들), 및 기질을 포함하도록 생성시킬 수 있다. 적절한 기질은 어떠한 Sbn 폴리펩티드가 스크리닝 분석에 사용되는지에 따라 결정될 것이다. 예를 들어, 한 예시적인 분석에서, SbnB는 L-오르니틴을 L-프롤린으로 전환시키고, 상기 반응은 2가지 방법으로 모니터링할 수 있다. 한 방법은 NAD+의 환원에 대한 분광광도 분석을 사용하여 NAD+의 NADH로의 전환을 모니터링하는 것이다. 두번째 방법은 L-오르니틴의 L-프롤린으로의 전환을 모니터링하기 위해 HPLC 기반 분석을 이용하는 것이다. 상기 반응은 스태필로박틴의 생합성의 초기에 발생한다. 다른 분석에서, SbnA 활성은 HPLC 기반 분석에 의해 모니터링된다. SbnA는 O-아세틸-L-세린을 L-2,3-디아미노프로피온산으로 전환시킨다. 반응 생성물은 다시 HPLC 기반 방법에 의해 모니터링된다. 반응은 L-오르니틴에 의해 제공된 아민기가 O-아세틸-L-세린이 L-2,3-디아미노프로피온산으로 전환되는 동안 사용되므로 SbnB의 참여를 필요로 한다. SbnH 활성은 또한 HPLC를 이용하여 측정할 수 있다. 상기 효소는 마찬가지로 L-오르니틴을 푸트레신으로 전환시킨다.
7.3 발현 분석
추가의 실시태양에서, 스태필로박틴 생합성의 길항제는 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 및 sbnI 핵산 또는 단백질의 발현에 영향을 줄 수 있다. 상기 스크리닝에서, 에스. 아우레우스 세포는 목적하는 화합물(들)로 처리된 후, 화합물(들)의 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 및 sbnI 핵산 또는 단백질 발현에 대한 효과를 분석할 수 있다.
예를 들어, 총 RNA는 임의의 적합한 기술, 예를 들어 문헌 [Chomczynski et al. (1987) Anal. Biochem. 162:156-159]에 기재된 1단계 구아니디늄-티오시아네이트-페놀-클로로포름 방법을 사용하여 시험 물질의 존재 또는 부재 하에 배양된 에스. 아우레우스 세포로부터 단리할 수 있다. 이어서, sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 또는 sbnI의 발현은 임의의 적절한 방법, 예를 들어 노던 블롯 분석, 중합효소 연쇄 반응 (PCR), 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR)과 조합된 역전사, 및 리가제 연쇄 반응 (RT-LCR)과 조합된 역전사에 의해 분석할 수 있다.
노던 블롯 분석은 문헌 [Harada et al. (1990) Cell 63:303-312]에 기재된 바와 같이 수행할 수 있다. 간단히 설명하면, 총 RNA는 시험 물질의 존재 하에 배양된 에스. 아우레우스 세포로부터 제조한다. 노던 블롯을 위해, RNA는 적절한 버퍼 (예를 들어 글리옥살/디메틸 술폭시드/인산나트륨 버퍼)에서 변성시키고, 아가로스 겔 전기영동에 적용한 후, 니트로셀룰로스 필터 상으로 옮긴다. RNA를 UV 링커에 의해 필터에 연결시킨 후, 포름아미드, SSC, Denhardt 용액, 변성 연어 정자, SDS, 및 인산나트륨 버퍼를 포함하는 용액 중에서 필터를 예비혼성화시킨다. 에스. 아우레우스 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 또는 sbnI DNA 서열은 임의의 적절한 방법 (예를 들어 32P-다중프라이밍된 DNA 표지 시스템 (아머샴 (Amersham))에 따라 표지하여 프로브로서 사용할 수 있다. 혼성화 후에, 필터를 세척하고, x-선 필름에 노출시킨다. 또한, 비교를 위한 기준선을 제공하기 위해서 대조군도 실험한다. 대조군에서, 에스. 아우레우스에서 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 또는 sbnI의 발현은 시험 물질의 부재시 정량될 수 있다.
별법으로, SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI 폴리펩티드를 코딩하는 mRNA의 수준도 예를 들어 문헌 [Makino et al. (1990) Technique 2:295-301]에 기재된 RT-PCR 방법을 사용하여 분석할 수 있다. 간단히 설명하면, 상기 방법은 시험 물질의 존재 하에 배양된 에스. 아우레우스 세포로부터 단리된 총 RNA를 RT 프라이머 및 적절한 버퍼를 포함하는 반응 혼합물에 첨가하는 것을 수반한다. 프라이머 어닐링을 위해 인큐베이팅한 후에, 혼합물을 RT 버퍼, dNTP, DTT, RNase 억제제 및 역전사효소로 보충할 수 있다. RNA의 역전사를 달성하기 위해 인큐베이션한 후에, RT 생성물을 표지된 프라이머를 사용한 PCR에 적용한다. 별법으로, 프라이머를 표지하기보다는, 표지된 dNTP를 PCR 반응 혼합물에 포함시킬 수 있다. PCR 증폭은 종래의 기술에 따라 DNA 열 순환기에서 수행할 수 있다. 증폭을 달성하기 위해 적합한 횟수의 증폭 후에, PCR 반응 혼합물을 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동시킨다. 겔을 건조시킨 후, 적절한 밴드의 방사성은 영상화 분석기를 사용하여 정량화할 수 있다. RT 및 PCR 반응 성분 및 조건, 시약 및 겔 농도 및 표지 방법은 당업계에 공지되어 있다. RT-PCR 방법의 변경은 당업자에게 자명할 것이다. 본 발명의 핵산을 검출할 수 있는 다른 PCR 방법은 문헌 [PCR Primer: A Laboratory Manual (Dieffenbach et al. eds., Cold Spring Harbor Lab Press, 1995)]에서 볼 수 있다. 또한, 비교를 위한 기준선을 제공하기 위해서 대조군도 실험할 수 있다. 대조군에서, 에스. 아우레우스에서 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 또는 sbnI의 발현은 시험 물질의 부재 하에 정량될 수 있다.
별법으로, SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 및 SbnI 폴리펩티드의 발현은 항체-기반 방법, 예를 들어 면역분석을 사용하여 에스. 아우레우스 세포를 시험 물질로 처리한 후에 정량화할 수 있다. 웨스턴 블롯, 방사성 면역분석, ELISA (효소-결합 면역흡착 분석), "샌드위치" 면역분석, 면역침전 분석, 침전소 반응, 겔 확산 침전소 반응, 면역확산 분석, 응집 분석, 보체-고정 분석, 면역방사선 분석, 형광 면역분석 및 단백질 A 면역분석과 같은 기술을 사용하는 경쟁적 및 비-경쟁적 분석 시스템을 포함하여 이로 제한되지 않는 임의의 적합한 면역분석을 사용할 수 있다.
예를 들어, SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI 폴리펩티드는 2단계 샌드위치 분석에 의해 시험 물질로 처리된 에스. 아우레우스 세포로부터 얻은 샘플에서 검출될 수 있다. 제1 단계에서, 포획 시약 (예를 들어, SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI 항체)를 사용하여 특이적인 폴리펩티드를 포획한다. 포획 시약은 임의로 고상에 고정될 수 있다. 제2 단계에서, 직접 또는 간접 표지된 검출 시약을 사용하여 포획된 마커를 검출한다. 한 실시태양에서, 검출 시약은 항체이다. 시험 물질로 처리된 에스. 아우레우스 세포에 존재하는 SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 또는 SbnI 폴리펩티드의 양은 비처리된 에스. 아우레우스 세포에 존재하는 양과 대조하여 계산할 수 있다.
적합한 효소 표지는 예를 들어 기질과 반응하여 과산화수소의 생산을 촉매하는 옥시다제로부터의 표지를 포함한다. 글루코스 옥시다제는 우수한 안정성을 갖고 그의 기질 (글루코스)을 쉽게 입수할 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 옥시다제 표지의 활성은 효소-표지된 항체/기질 반응에 의해 형성된 과산화수소의 농도를 측정함으로써 분석할 수 있다. 효소 이외에, 다른 적합한 표지는 방사성 동위원소, 예를 들어 요오드 (125I, 121I), 탄소 (14C), 황 (35S), 삼중수소 (3H)를 포함한다.
적합한 형광 표지의 예는 플루오레세인 표지, 이소티오시아네이트 표지, 로다민 표지, 피코에리트린 표지, 피코시아닌 표지, 알로피코시아닌 표지, o-프탈데히드 표지 및 플루오레스카민 표지를 포함한다.
적합한 효소 표지의 예는 말레이트 데히드로게나제, 스태필로코커스 뉴클레아제, 델타-5-스테로이드 이소머라제, 효모-알콜 데히드로게나제, 알파-글리세롤 포스페이트 데히드로게나제, 트리오스 포스페이트 이소머라제, 퍼옥시다제, 알칼린 포스파타제, 아스파라기나제, 글루코스 옥시다제, 베타-갈락토시다제, 리보뉴클레아제, 우레아제, 카탈라제, 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제, 글루코아밀라제 및 아세틸콜린 에스테라제를 포함한다. 화학발광 표지의 예는 루미놀 표지, 이소루미놀 표지, 방향족 아크리디늄 에스테르 표지, 이미다졸 표지, 아크리디늄 염 표지, 옥살레이트 에스테르 표지, 루시페린 표지, 루시페라제 표지 및 애쿠오린 표지를 포함한다.
예시
일반적으로 설명한 본 발명은 단지 본 발명의 특정 측면 및 실시태양을 예시하기 위해 포함되고 본 발명의 어떠한 방식으로도 제한하고자 하지 않은 하기 실시예를 참고하여 더 쉽게 이해할 수 있을 것이다.
실시예 1: 물질 및 방법
세균 균주, 플라스미드 및 성장 배지
본원에서 사용된 세균 균주 및 플라스미드를 표 1에 기재한다. 이. 콜라이 및 에스. 아우레우스 균주는 통상적으로 각각 Luria-Bertani 브로쓰 (디프코 (Difco)) 및 트립틱 소이 브로쓰 (디프코)에서 배양하였다. 철-제한 세균 성장은 Tris-최소 숙시네이트 배지 (TMS)에서 수행하였고, 그 조성은 문헌에 설명되었다 (Sebulsky et al., (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400). 잔류하는 유리 철은 에틸렌디아민-디(o-히드록시페닐아세트산) (EDDHA) (달리 설명하지 않는 한 1 μM)을 첨가하여 TMS 배지로부터 킬레이팅하거나, 또는 TMS는 50 μM FeCl3을 첨가하여 철-풍부하게 만들었다. 항생제는 다음 농도로 사용하였다: 에스. 아우레우스 선택을 위해 에리스로마이신 (5 ㎍/ml), 린코마이신 (20 ㎍/ml), 네오마이신 (50 ㎍/ml), 카나마이신 (50 ㎍/ml) 및 테트라사이클린 (4 ㎍/ml), 및 이. 콜라이 선택을 위해 암피실린 (100 ㎍/ml), 테트라사이클린 (10 ㎍/ml) 및 에리스로마이신 (300 ㎍/ml). 모든 시약은 Milli-Q 정수 시스템 (밀리포어 (Millipore, 캐나다 온타리오주 미시사우가))을 통해 정제된 물을 사용하여 제조하였다.
재조합 DNA 방법
플라스미드 DNA는 Qiaprep mini-spin 키트 (퀴아겐)를 사용하여 이. 콜라이로부터 단리하였다. 제한 효소 소화 및 DNA 라이게이션을 포함하는 DNA 조작은 표준 과정에 따라 수행하였다 (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor). 제한 효소는 라이프 테크놀로지스 (Life Technologies), 엠비아이 퍼멘타스 (MBI Fermentas), 뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs) 또는 로슈 다이아노스틱스 (Roche Diagnostics)로부터 구입하고, DNA 라이게이션은 Roche Rapid DNA 라이게이션 키트를 사용하여 수행하였다. PwoI (로슈)을 모든 중합효소 연쇄 반응에 사용하였다. 올리고뉴클레오티드는 라이프 테크놀로지스로부터 입수하였고, 표 1에 기재한다.
염색체 DNA 단리 및 서던 블로팅
염색체 DNA는 이전에 설명된 바와 같은 과정을 이용하여 다양한 스태필로코커스 균주로부터 단리하였다 (Sebulsky et al, (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400). 간단히 설명하면, 세포를 37℃에서 STE (0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 및 1 mM EDTA, pH 8.0) 중 10 ㎍의 리소스타핀 (시그마)에 의해 용해시키거나, 코아귤라제-음성 스태필로코커스에 대해 리소자임 (1 ㎍)을 STE에 첨가하였다. SDS (0.1%) 및 프로테이나제 K (0.5 mg)를 제제에 첨가하고, 55℃에서 2시간 인큐베이팅하였다. 서던 블로팅 기술은 본질적으로 이전에 설명된 바와 같이 수행하였고 (Sambrook et al., (1989) Molecular cloning. A laboratory manual, 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor), 혼성화는 제조사의 지시에 따라 제조되고 사용되는 디곡시게닌 (DIG) (로슈 다이아노스틱스) 표지된 프로브를 사용하여 수행하였다. 발광은 블롯을 Hyperfilm ECL (아머샴 바이오사이언시즈 (Amersham Biosciences))에 노출시켜 검출하였다.
sbnE 돌연변이체의 제조
sbnE를 갖는 3037-bp DNA 단편을 에스. 아우레우스 RN6390의 염색체로부터 PCR-증폭시키고 pBCSK+ (BamHI) 내로 클로닝하여, pSED12를 생성하였다. sbnE 코딩 영역은 특유한 NcoI 부위 (Klenow 효소로 단부-연마된 (polished))에서 플라스미드 pDG782로부터 유래된 카나마이신 내성 카세트의 삽입에 의해 중단되어, pSED17을 생성한다. 파괴된 sbnE 유전자를 함유하는 BamHI 단편을 pSED17로부터 제거하고 온도-감수성 에스. 아우레우스 자살 플라스미드 pAUL-A 내로 클로닝하여 pSED18을 생성하였다. 플라스미드 pSED18을 에스. 아우레우스 RN4220 내로 도입한 후, 문헌에 설명된 방법 (Sebulsky et al, (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400)을 이용하여 박테리오파지 80α를 사용하여 에스. 아우레우스 RN6390 내로 형질도입시켰다. pSED18을 갖는 에스. 아우레우스 RN6390을 30℃에서 중간-로그상으로 성장시킨 후, 성장 온도를 42℃로 하였다. 42℃에서 4시간 인큐베이션 후, 배양물을 카나마이신 및 네오마이신을 함유하는 배지 상으로 플레이팅하고 42℃에서 밤새 인큐베이팅하였다. 염색체 sbnE과 삽입-불활성화된 카피 사이에 대립유전자 교환의 결과로서 카나마이신 및 네오마이신에 내성이고 에리스로마이신 및 린코마이신에 감수성인 sbnE 돌연변이체가 단리되었다. Kmr 카세트의 sbnE 내로 염색체 삽입은 PCR에 의해 확인하였다.
lacZ 융합체의 생성 및 β- 갈락토시다제 분석
개별 유전자의 내부 단편을 그램 양성 세균 내에서 복제하지 않는 벡터인 pMUTIN4 (Vagner et al, (1998) Microbiology. 144:3097-3104)의 다중 클로닝 부위 내로 클로닝하였다. 이어서, 에스. 아우레우스 RN4220을 재조합 pMUTIN4 플라스미드로 형질전환시켰고, 클로닝된 DNA 서열과 염색체 상에 존재하는 것 사이의 상동성 재조합으로 재조합 플라스미드가 염색체 내로 통합되었다. 염색체 통합은 pMUTIN4-특이적 DNA 서열의 PCR-증폭에 의해 확인하였다.
lacZ에 대한 전사 융합체를 갖는 에스. 아우레우스 균주를 문헌에 기재된 방법 (Taylor and Heinrichs (2002) Mol. Microbiol. 43:1603-1614)을 이용하여 β-갈락토시다제 활성에 대해 분석하였다. 간단히 설명하면, 배양물을 1 μM EDDHA 또는 FeCl3를 보충한 TMS 내에서 O.D.600 = 0.8로 성장시켰다. 세포 (5 x 108)을 10 mM 인산칼륨 버퍼 (pH 7.8), 15 mM EDTA, 1% Triton X-100 및 10 ㎍ 리소스타핀 중에서 37℃에서 용해시켰다. 세포 파쇄물의 원심분리 후, 5 ㎕의 상등액을 Berthold 발광분석기에서 Galacto-Light Plus Chemluminescent 리포터 유전자 키트 (트로픽스 (Tropix))를 사용하여 β-갈락토시다제 활성에 대해 분석하였다. 배경은 50 RLU/s에서 설정하였고, 제시된 데이타는 3개의 독립적 샘플의 평균 rlu/s± 표준 오차이다.
철포획체 생산 분석 및 철포획체의 단리
소비된 배양 상등액 중 철포획체 활성은 크롬 아주롤 S (CAS)를 사용하여 문헌에 기재된 방법 (Schwyn and Neilands (1987) Anal. Biochem. 160:47-56)에 의해 분석하였다. 배양 상등액의 희석액을 동일 부피의 CAS 셔틀 용액과 혼합하고, 실온에서 30분 동안 상호작용하도록 두었다. TMS 배지는 블랭크로서, DESFERAL(등록상표)는 참조 표준품으로 역할을 하여, 630 nm에서 흡광도를 측정하였다. 철포획체 단위는 하기 식 1을 이용하여 계산하였다.
{A630(TMS) - A630(샘플)}/A630(TMS) X 100% (1)
철포획체 단리를 위해, 에스. 아우레우스 균주를 TMS 중에서 37℃에서 48시간 동안 격렬하게 진탕하였다. 배양 상등액을 원심분리에 의해 회수하고 동결건조하였다. 농축된 상등액을 100% 메탄올 내에 원래 배양 상등액 부피의 1/10으로 재현탁하고, Whatman No. 1 필터지를 통해 통과시켜 입자형 물질을 제거하였다. LH-20 칼럼 (아머샴 바이오사이언시즈)에 적용하기 전에 회전 증발기를 사용하여 부피를 감소시켰다. 분획들을 모으고, CAS 셔틀 용액을 사용하고 철포획체 플레이트 생물학적 분석에서 생물학적 활성에 대해 양성으로 시험된 분획을 건조시키고 물에 재현탁하고 HPLC로 검사하였다. 철포획체의 최종 정제를 위해 분석적 역상 HPLC를 사용하였다. 사용된 칼럼은 4.6 x 150 mm Waters ODS2 Spherisorb이었다. 물 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (TFA)은 용매 A를 나타낸 반면, 아세토니트릴 중 0.1% TFA를 용매 B로서 사용하였다. 사용된 크로마토그래피 방법은 다음과 같았다: 0.75 ml/min의 유속에서, 3.5분 동안 6% B, 이어서 20분에 걸쳐 6-60% B 구배. 스태필로박틴은 210 nm에서 검출되었고 보유 시간은 약 17분이었다. 스태필로박틴을 수집하고, 건조하고, 재크로마토그래피하여 순도 및 활성에 대해 검토한 후 ESI-MS로 분석하였다.
전기분무 이온화-질량 분광법 ( ESI -MS)
전기분무 이온화-MS 및 MS/MS 분석은 Z-분무원을 갖춘 Micromass 사중극자 비행시간차 (Q-TOF2) 질량 분광기 (마이크로매스 (Micromass, 영국 맨체스터))에서 수행하였다. 검출기는 [Glu]-피브리노펩티드-B의 MS/MS 스펙트럼을 사용하여 검정하였다. 철포획체 샘플의 분자 질량은 1:1 HPLC 등급 메탄올:HPLC 등급 물의 캐리어 용매로 30 μL/min의 유속에서 Waters CapLC 시스템을 사용하여 유동 주입 분석에 의해 측정하였다. 스펙트럼은 다음 파라미터를 사용하여 50 내지 1800의 m/z 범위로 양이온 방식으로 획득하였다: 모세관 전압, 3.2 kV; 콘 (cone) 전압, 30-40 V; 탈용매 온도, 200℃; 소스 온도, 80℃. 연속 (Tandem) 질량 스펙트럼은 해당 모 이온 상에서 충돌 기체로서 아르곤 및 10 내지 30 eV의 충돌 에너지를 사용하여 획득하였다. 모든 스펙트럼은 MassLynx 3.5 (마이크로매스)를 사용하여 획득하고 처리하였다.
철포획체 플레이트 생물학적 분석
에스. 아우레우스의 철-제한 성장을 촉진하는 철포획체의 능력은 이전에 설명된 바와 같이 (Sebulsky et al, (2000) J. Bacteriol. 182:4394-4400) 수행된 철포획체 플레이트 생물학적 분석을 이용하여 평가하였다. 간단히 설명하면, 에스. 아우레우스 RN6390을 20 μM EDDHA를 함유하는 고체 TMS 배지 내로 포함시켰다 (1.4 x 104 세포/ml). 에스. 아우레우스의 성장을 촉진하는 정제된 철포획체의 능력은 플레이트를 37℃에서 36시간 인큐베이션한 후 평가하였다.
마우스 신장 농양 실험
암컷 Swiss-Webster 마우스 (체중 25 g)을 챨스 리버 래보래토래스 캐나다, 인크. (Charles River Laboratories Canada, Inc.)에서 구입하여, 마이크로아이솔레이터 (microisolator) 케이지에 수용하였다. 세균을 TSB 중에서 밤새 성장시키고 회수하고 멸균 염수 중에 3회 세척하였다. 파일럿 실험에서는 에스. 아우레우스 Newman이 상기 모델에서 RN6390보다 더 양호하게 마우스를 콜로니화하였고, 급성이지만 비-치사 신장 감염을 얻기 위해 꼬리 정맥 내로 주사하기 위한 에스. 아우레우스 Newman의 최적량은 1 x 107 CFU인 것으로 나타났다. 멸균 염수에 현탁한 세균을 꼬리 정맥을 통해 정맥내 투여하였다. 주사된 생활 세균의 수는 접종물의 계열 희석액을 7.5% NaCl을 함유하는 TSB-아가 상에 플레이팅하여 확인하였다. 주사후 5 및 6일에, 마우스를 희생시키고 신장을 무균 제거하였다. PowerGen 700 Homogenizer를 사용하여, 신장을 0.1% Triton X-100를 함유하는 멸균 PBS 내에서 45초 동안 균질화하고, 균질물 희석액을 7.5% NaCl을 보충한 TSB-아가 상에 플레이팅하여 회수된 세균을 계산하였다. 제시된 데이타는 마우스당 회수된 로그 CFU이다.
컴퓨터 분석
DNA 서열 분석, 올리고뉴클레오티드 프라이머 디자인 및 뉴클레오티드 서열 정렬은 Vector NTI Suite 소프트웨어 패키지 (인포맥스 인크. (Informax Inc., 미국 메릴랜드주 베데스다)를 사용하여 수행하였다.
실시예 2: 에스 . 아우레우스 RN6390 및 Newman은 철포획체를 생산한다.
본원에서, 본 발명자들은 철포획체 생산이 배양물에서 에스. 아우레우스의 철-제한된 성장에 하는 역할을 특성화하였고; 또한 생체내 성장에 대한 그의 중요성 및 상기 세균의 병원성을 검토하였다. 이를 수행하기 위해, 에스. 아우레우스의 철포획체-생산 균주로부터 유전적으로-규정된 철포획체-결핍 돌연변이체를 생성하였다.
선행 연구에서는 에스. 아우레우스의 다양한 상이한 단리물이 스태필로페린 A 및 스태필로페린 B를 포함한 다수 철포획체를 생산하는 잠재력을 갖고 (Meiwes et al., (1990) FEMS Microbiol. Lett. 67:201-206), 유전적으로-특성화된 균주 8325-4는 철포획체(들)을 생산하였지만 정체를 결정되지 않았음 (Heinrichs et al. (1999) J. Bacteriol. 181:1436-1443; Horsburgh et al, (2001) J. Bacteriol. 183:468-475)을 보여준다. 본 발명자들은 본 실험실에서 사용되는 2개 추가의 에스. 아우레우스 균주, 즉, 균주 RN6390 및 균주 Newman이 세포를 철 결핍 조건 하에 성장시킬 때 쉽게 검출가능한 양의 철포획체 활성을 생산하지만, 철-풍부 배지 내에서 성장하는 동안 매우 적은 철포획체를 생산함을 증명한다 (도 11). 철포획체 생산 및 철(III)-철포획체 흡수를 포함한 고친화도 철 획득 시스템이 대개 많은 상이한 세균에서 Fur에 의해 조절되는 것을 유념하면, RN6390 (H295) 및 Newman (H706)의 fur 유도체가 모두 철-풍부 배지 내에서 성장될 때에도 높은 수준의 철포획체 활성을 생산하였으므로 실제로 균주 RN6390 및 Newman에서 철포획체 생산이 Fur 단백질을 통해 외인성 철 농도에 의해 조절되었음을 추가로 보였다 (도 11). 이들 발견은 에스. 아우레우스 8325-4를 사용한 호스버프 (Horsburgh) 등의 공개된 결과 (Horsburgh et al, (2001) J. Bacteriol. 183:468-475)와 일치한다.
실시예 3: 에스 . 아우레우스로부터 철포획체의 단리
또한, 본 발명자들은 어떤 철포획체(들)이 에스. 아우레우스 RN6390 및 관련 균주에 의해 생산되는지 확인하고자 하였다. 철포획체 생산은 fur 배경에서 재활성화됨을 가정할 때, 본 발명자들은 균주 H295의 배양 상등액으로부터 철포획체를 단리하였다 (RN6390 fur::Km). 초기 실험은 공개된 과정 (Haag et al. (1994) FEMS Microbiol. Lett. 115:125-130; Meiwes et al (1990) FEMS Microbiol. Lett. 67:201-206)을 이용하여 스태필로페린 A 및 스태필로페린 B의 단리에 집중하였다. 그러나, 이들 정제로 극히 적은 CAS-양성 물질을 얻었고, 이는 균주 RN6390이 스태필로페린 A 또는 스태필로페린 B를 생산하지 않거나 극히 적게 생산함을 제안한다. 그러나, 오르니박틴을 단리하기 위해 이전에 사용된 과정 (Sokol et al. (1999) Infect Immun. 67:4443-55)을 이용하여 배양 상등액을 추출하면 유의한 양의 CAS-양성 물질을 단리시켰다. LH-20 칼럼을 통해 메탄올-추출된 배양 상등액을 크로마토그래피에 적용하면 CAS-양성이고 철포획체 플레이트 생물학적 분석에서 에스. 아우레우스의 철-제한 성장을 촉진하는 분리된 분획을 얻었다. 역상 HPLC로 추가로 정제하면 생물학적 활성을 보유한 물질의 단리된 피크를 얻었다. 단리된 물질을 전기분무 이온화-질량 분광법 (ESI-MS) 분석하면 m/z = 822의 분자를 풍부하게 함유함을 보여주었고, 이는 이전에 특성화된 스태필로코커스 철포획체 (스태필로페린 A m/z = 480; 스태필로페린 B m/z = 448)보다 유의하게 더 크다. 스태필로페린 A 또는 스태필로페린 B의 질량에 일치하는 활성 LH-20 분획 내의 화합물의 존재를 검출할 수 없었다. 함께 살펴보면, 이들 결과는 스태필로코커스에서 이전에 확인되지 않은 철포획체를 단리한 것임을 강하게 제안한다. 상기 철포획체는 본원에서 스태필로박틴으로 부르고, 분자의 구조를 해명하기 위해 계속 노력하고 있다. 철포획체의 구조에 관하여, 하나의 가능성은 스태필로페린 분자 중 하나가 스태필로박틴의 구조의 일부를 구성할 수 있다는 것이다.
실시예 4: 에스 . 아우레우스로부터 철포획체 생합성 유전자 클러스터의 확인 및 분석
스태필로코커스에서 철포획체 생합성을 근원을 이루는 유전 정보를 해명하기 위해, 몇몇 균주로부터 에스. 아우레우스 게놈 서열을 조사하고, 그의 생성물이 철포획체 생합성에서 역할이 증명된 효소와 유의한 유사성을 공유하는 몇몇 개방 해독 프레임 (orf)을 확인하였다. 특히, 스태필로코커스 염색체 상에서 sirABC 오페론과 galE 사이에 위치하는 11.5-kb 유전자 클러스터 (도 12)를 확인하였고, 그의 생성물은 다른 세균에서 공지되거나 예측된 철포획체 생합성 효소와 유의한 유사성을 공유한다 (표 2 참조). SirABC 단백질은 철(III)-철포획체 수송 단백질과 높은 정도의 유사성을 공유하지만 (Heinrichs et al., (1999) J. Bacteriol. 181:1436-1443), galE (UDP-갈락토스-4-에피머라제를 코딩함)가 뉴클레오티드-당 전구체 형성에 관여한다. 11.5-kb 유전자 클러스터가 철포획체 생합성에 관여함을 가정하여, 코딩 영역 sbn을 철포획체 생합성에 대해 지정하였다.
sbn 유전자 클러스터가 에스. 아우레우스에서 철포획체 생합성에 관여함을 확인하기 위해, 제5 개방 해독 프레임 (sbnE)을 에스. 아우레우스 RN6390에서 카나마이신 내성 카세트로 삽입-불활성화시켜, 균주 H672를 생성하였다. 철-제한 H672로부터 소비된 배양 상등액의 메탄올 추출물은 철포획체 플레이트 생물학적 분석에서 에스. 아우레우스 성장을 촉진하는 물질을 전혀 함유하지 않았다. 그러나, 생물학적 활성 철포획체는 야생형 균주 (RN6390) 및 pSED32 (sbnE를 갖는 플라스미드, 여기서, sbnE의 발현은 벡터 상에 존재하는 plac 프로모터에 의해 유도되었다)를 보충한 균주 H672 모두의 철-제한 상등액의 메탄올 추출물로부터 일관되게 단리되었다. 철-제한 야생형 배양물로부터 단리된 스태필로박틴 분자는 H672 및 H675 (RN6390 fur sbnE)의 철-제한 상등액 내에 완전히 부재하였다. 이들 결과는 sbnE가 철포획체, 보다 특이적으로, 스태필로박틴의 생산에 관여하는 핵심 유전자임을 의미하였다. sbnE::km 돌연변이는 또한 에스. 아우레우스 Newman 내로 형질도입되어 균주 H686을 생성하였다. 스태필로박틴은 철-결핍 H686의 상등액에서 검출가능하지 않는 반면, 철-결핍 Newman의 배양 상등액에서 쉽게 검출가능하였다. 이들 결과는 ESI-MS로 확인하였다.
실시예 5: sbnABCDEFGHI 유전자는 오페론을 포함하고, 철은 Fur를 통해 그의 전사를 조절한다.
sbn 로커스의 처음 9개 개방 해독 프레임의 예측된 코딩 영역은 그들을 서로 분리시키는 매우 짧은 비-코딩 세그먼트에 겹치거나 그를 갖는 한편, 약 600 bp가 9번째 코딩 영역의 3' 말단과 10번째 코딩 영역의 5' 말단 사이에 존재한다. 이는 오페론이 9개 개방 해독 프레임으로 구성될 수 있음을 제안한다. 10번째 코딩 영역은 기능이 알려지지 않은 예측된 단백질을 코딩하고, 11번째 코딩 영역의 생성물은 부탄디올 데히드로게나제 (아세토인 리덕타제)와 유의한 유사상을 나타내고, 12번째 코딩 영역은 galE이고, 이는 다당체 생합성에서 당-뉴클레오티드 전구체 형성에 관여하는 UDP-갈락토스-4-에피머라제를 코딩한다.
sbn 오페론의 전사 조절을 특성화하고, 오페론의 한계를 설명하기 위한 노력으로, 표적화 염색체 lacZ 리포터 유전자 융합체를 추정 sbn 오페론 내에서 및 밖에서 몇몇 코딩 영역에 대해 생성시켰다. 이어서, 세포를 철-풍부 또는 철-결핍 성장 배지 내에서 성장시킬 때 lacZ 융합체를 갖는 균주에서 β-갈락토시다제 발현이 일어났다. 50 μM FeCl3의 존재 하에 성장시킬 때, sbnA, sbnF, sbnH 및 sbnI에 대한 융합체를 갖는 균주에서 β-갈락토시다제의 발현은 낮은 배경 수준인 반면, SAO121 및 galE에 대한 융합체를 갖는 균주에서 발현은 배경을 훨씬 넘었다 (표 3). 그러나, 철-결핍 배지에서 성장시킬 때, 모든 균주가 높은 수준의 β-갈락토시다제 발현을 보였다. 이들 결과는 sbn 오페론의 전사가 9번째 코딩 영역 (sbnI)를 통해 철-조절되고, 10번째 코딩 영역 및 galE의 발현은 철-조절되지 않고 철포획체의 생산에서 아무 역할도 하지 않을 것임을 나타낸다. sbnA는 철-결핍 성장 조건 하에 최고 수준으로 전사되는 한편, 더욱 하류의 sbn 유전자는 유사한 성장 조건 하에 보다 적은 양으로 전사되는 것으로 보인 관찰은 오페론의 발현이 sbnA 코딩 영역의 상류에 존재하는 하나의 철-조절 프로모터 성분에 의해 제어되는 것을 제안한다.
추정 sbnA 출발 코돈은 스태필로코커스 샤인-달가노 서열 (AGGAAGA)과 유사한 서열의 앞에 존재한다 (도 13) (Novick (1991) Genetic systems in staphylococci, p. 587-636. In J. H. Miller (ed.), Methods in Enzymology, vol. 204. Academic Press, Inc., San Diego, CA). 컨센서스 Fur 박스에 현저한 유사성을 갖는 약 50 bp 더욱 상류의 19-bp 서열 (TGAGAATCATTATCAATTA)이 발견되었고, 이는 sbn 오페론의 발현이 에스. 아우레우스 Fur 상동체를 통해 외인성 철 농도에 의해 조절됨을 제안한다. 이는 철포획체 생산이 fur 배경에서 재활성화된다는 본 발명자들의 초기 관찰 (상기 참조)과 일치할 것이다. 실제로, fur-결핍 배경에서, sbnF-lacZ 융합체를 갖는 균주로부터 β-갈락토시다제 발현은 세포를 철-풍부 배지에서 성장시킬 때 극히 높았고, 이는 Fur 단백질이 철-풍부 성장 조건 하에 sbn 오페론의 전사를 억제함을 나타낸다.
실시예 6: sbnE 돌연변이체는 철-결핍 배지에서 성장 결함을 나타낸다 .
에스. 아우레우스, RN6390 및 Newman의 시험관 내 성장에 대한 철포획체 생산의 기여도를 평가하기 위해, 그들의 유사유전자형 sbnE:km 돌연변이체 (각각 H672 및 H686), 및 보완된 돌연변이체를 규정된 최소 배지 내에서 성장시켰다. 10 μM EDDHA 및 50 μM FeCl3로 보충한 TMS 배지 (철-풍부 배지)에서 성장시킬 때, 모든 균주의 성장 수율은 서로 뚜렷하게 상이하지 않았다 (도 14A). 그러나, H672 및 H686 (sbnE 돌연변이체)의 성장은 FeCl3이 결핍된 것을 제외하고는 동일한 배지에서 그들의 유사유전자형 모체 및 플라스미드 pSED32를 갖는 (멀티카피 sbnE 유전자를 갖는) sbnE 돌연변이체에 비해 심하게 손상되었다 (도 14B). 철-풍부 대 철-결핍 배지는 FeCl3의 존재 또는 부재에서만 상이한 것을 가정하면, sbnE 돌연변이체의 불량한 성장 표현형이 EDDHA에 의한 다른 필수 성분의 가능한 킬레이션으로 인한 것이라는 제안은 배제될 수 있다. 따라서, sbnE 돌연변이체는 철 획득에서만 손상된다.
RN6390 및 Newman의 sbnE 돌연변이체 유도체 (각각 H672 및 H686)는 철-풍부 배지에서 그들의 유사유전자형 야생형 모체와 동등하게 성장한 한편, sbnE 돌연변이체는 반대로 심한 철 결핍 조건 하에 (즉, 10 μM EDDHA로 보충한 TMS) 성장하는 능력이 야생형에 비해 심하게 손상되었다. 그러나, 중정도 수준의 철 제한 (즉, 1 μM EDDHA로 보충한 TMS)에서, H672 및 H686은 거의 야생형에서와 같이 성장하였음을 관찰하였다. 이들 조건 하에서 성장한 돌연변이체의 상등액은 CAS 분석에서 양성으로 반응하지 않았지만, 배양 상등액에서 스태필로박틴을 검출할 수 없었다. 본 발명자들은 또한 에스. 아우레우스 RN6390이 심한 철 제한 하에 에스. 아우레우스 Newman보다 유의하게 더 잘 성장하고, CAS 분석으로 측정할 때 더 높은 수준의 철포획체 활성을 생성시키는 것으로 보였음을 관찰하였다. 결론적으로, 오페론에서 sbn 돌연변이체 (예를 들어 sbnC::Km 및 sbnE::Km)는 스태필로박틴을 생산하지 않고, 혈청 내 성장을 위해 모든 sbn 유전자가 요구됨이 밝혀졌다. 또한, sbnE 유전자는 철-풍부 성장을 위해서는 없어도 되지만, 철-제한 성장을 위해서는 요구된다.
에스. 아우레우스 RN6390은 Newman이 결핍되는 추가의 철포획체(들)을 생산하고, 중정도 수준의 철 제한 하에 생산되는 것이 타당해보인다. 심한 철 제한의 조건 하에 성장 분석에서 Newman 대 RN6390의 유의하게 보다 긴 지연기 (도 14B)가 상기 주장을 지지할 것이다. 별법으로, 2개의 균주 사이에 스태필로박틴 생산의 조절에서 차이가 있을 수 있다. 예를 들어, sbn 유전자의 발현을 위해 필요한 철 제한의 수준 또는 생산된 스태필로박틴의 양은 Newman과 RN6390에서 상이할 수 있다. 다른 연구 집단은 스태필로코커스의 상이한 구성원에 의해 생산된 철포획체의 수준의 차이를 보고하였다 (Courcol et al. (1997) Infect. Immun. 65:1944-1948; Lindsay et al. (1994) Infect. Immun. 62:2309-2314).
실시예 7: 철포획체 생산은 에스 . 아우레우스의 발병력을 향상시킨다.
에스. 아우레우스는 혈액 환경이 철-제한적이라는 사실에도 불구하고 혈액 내에서 생존하고 복제하여 감염을 일으킬 수 있다. 또한, 최근의 보고는 에스. 아우레우스가 숙주 철 공급원, 예를 들어 헴(heme) 및 헤모글로빈에 결합하는 능력이 있는 단백질을 발현할 수 있음을 증명하였다 (Mazmanian et al. (2003) Science 299:906-9). 따라서, 에스. 아우레우스 내에서 철포획체 생산이 상기 세균의 발병기전에 관여하는지 여부를 결정하기 위한 노력으로, 마우스를 콜리니화시키는 sbnE 돌연변이체의 능력을 그의 유사유전자형 모체와 비교하였다. 에스. 아우레우스 감염의 쥐 신장 농양 모델에서 Swiss-Webster 마우스를 사용하였다. 0일에, Swiss-Webster 마우스에 107 cfu의 에스. 아우레우스를 꼬리 정맥을 통해 주사하였다. 2-3일에, 마우스가 앓게 되고 유의한 체중 손실을 나타내고 몸치장을 하지 않음(lack of grooming)을 관찰하였다. 4-10일 사이에, 마우스는 빈사상태에 빠졌고, 본 발명자들은 일반적으로 후사반부에서 염증을 관찰하였다. 에스. 아우레우스 Newman을 주사한 개별 마우스의 신장은 주사 5 및 6일 후에 모두 평균 1 x 108 초과의 세균을 포함하였다 (도 15). 상기 마우스로부터의 신장은 다수의 피질 및 수질 농양을 가졌다. 반대로, H686 (Newman sbnE::km)을 주사한 마우스로부터의 신장은 관찰기능한 농양이 없고, 신장으로부터 회수한 세균의 평균수는 5일에 1 x 107 미만이고, 주사 6일 후 세균은 회수가능하지 않았으며 (도 15), 이는 sbnE 돌연변이체 세균이 상기 모델에서 유의하게 약화되었음을 설명한다. sbnE 돌연변이체는 쥐 농양 모델에서 덜 치사성이다. 따라서, 이들 데이타는 철포획체 생산이 생체 내에서 생존하는 에스. 아우레우스의 능력에서 중요 인자인 것을 의미한다.
실시예 8; sbn 오페론은 에스 . 아우레우스 내에 존재하지만 코아귤라제 -음성 스태필로코커스 내에 존재하지 않는다.
철포획체 생산의 에스. 아우레우스의 병원성에서 증명된 중요성이 주어지면, 본 발명자들은 sbn 유전자가 에스. 아우레우스에 특이적인지 여부 또는 이들이 다른 스태필로코커스 내에 또한 존재하는지 여부를 측정하였다. 저엄격도의 혼성화 조건 하에 수행된 점적 (dot blotting) 실험을 스태필로코커스의 몇몇 다른 구성원에서 sbnA, sbtiC, sbnE 및 sbnH 상동체를 검출하기 위해 수행하였다. sbn 유전자는 시험된 에스. 아우레우스의 모든 실험실 및 임상 균주에서 쉽게 검출된 반면 (사용된 균주의 전체 목록에 대해서는 표 1을 참조한다), 코아귤라제-음성 스태필로코커스의 임의의 13개의 상이한 종에서 이들 유전자의 존재를 검출할 수 없었다 (표 1 참조). 이들 유전자의 상동체는 또한 에스. 에피더미디스 (S. epidermidis) ATCC 12228 또는 RP62A의 게놈 서열 내에 존재하지 않는다. 선행 조사에서 에스. 에피더미디스 균주 내에 스태필로페린의 존재를 증명하였으므로 (Meiwes et al. (1990) FEMS Microbiol. Lett. 67:201-206), 이는 sbn 오페론이 스태필로코커스에서 이전에 확인되지 않은 철포획체의 생산에 작용한다는 생각을 더욱 지지한다. 따라서, sbn 오페론은 스태필로코커스 사이에서 에스. 아우레우스에 특이적인 것으로 보인다.
또한, 본 실험의 결과는 대부분 발병 인자의 상대적인 결핍으로 인해 일반적으로 에스. 아우레우스보다 덜 병원성인 CoNS는 스태필로박틴을 생산하는 능력이 결핍되는 것으로 나타날 것임을 제안한다. 본원에서 알 수 있는 바와 같이, sbn 오페론의 발현을 통해 합성된 상기 철포획체를 생산하는 능력은 쥐 신장 농양 모델에서 에스. 아우레우스의 향상된 발병력과 상호관련되고, 따라서, CoNS 대 에스. 아우레우스의 발병력에서 차이를 설명하는 다른 핵심 결정인자를 나타낼 수 있다.
실시예 9: sbn 오페론은 랄스토니아 솔라나세아룸 ( Ralstonia solanacearum )에서 발견된다.
흥미롭게도, 데이타베이스를 연구하여 식물병원체 랄스토니아 (예전 명칭: 슈도모나스) 솔라나세아룸의 완전 게놈 서열 내의 메가플라스미드 상에 존재하는 유사한 크기의 오페론을 밝혔고, 그의 생성물은 Sbn 단백질에 현저한 유사성을 갖는다 (표 4 참조). 실제로, 랄스토니아 상동체는 에스. 아우레우스 내의 sbn 유전자와 동일한 순서로 존재하므로 2개의 오페론은 동일한 조상으로부터 진화된 것일 가능성이 크다. 그러나, 랄스토니아 내의 sbnE 상동체는 랄스토니아 오페론 내의 코딩 영역의 나머지에 비해 상보성 스트랜드 상에 존재한다. 에스. 아우레우스와 알. 솔라나세아룸 내 영역 사이의 다른 근소한 차이는 알. 솔라나세아룸 sbnC 및 sbnD 상동체는 하나의 코딩 영역으로 융합되는 것으로 보이는 점이다. 에스. 아우레우스 내의 sbn 오페론과 알. 솔라나세아룸 내의 DNA의 상동성 영역 사이의 현저한 차이는 각각의 오페론의 mol% G+C이다. 알. 솔라나세아룸 내의 오페론은 mol% G+C가 72인 반면, 에스. 아우레우스 sbn 오페론은 mol% G+C가 37이다. 에스. 아우레우스 게놈의 mol% G+C는 약 32%이다.
실시예 10: Sbn 돌연변이체 표현형
sbn 단백질의 기능을 도 16에 제시한다.
SbnA는 추정 시스테인 신타제, 구체적으로 0-아세틸-L-세린 술프히드릴라제를 코딩한다. 따라서, SbnA는 아마도 L-세린 (또는 0-아세틸-L-세린)의 L-2,3-디아미노프로피온산으로의 전환에 관여하고, SbnB의 활성과 함께 작용할 수 있다. sbnA 유전자에 대한 lacZ 융합체를 생성하여, sbnA 유전자가 철-조절되는지 증명하기 위해 사용하였다.
SbnB는 추정 오르니틴 시클로데아미나제를 코딩하고, SbnA와 함께 작용하여 스태필로박틴에 대한 유망한 전구체인 L-2,3-디아미노프로피온산을 생산할 수 있다. 오르니틴 시클로데아미나제는 오르니틴의 탈아민화 및 프롤린으로의 고리화를 매개하고, NAD+에 의존한다. sbnB의 돌연변이는 Tet 카세트의 삽입에 의해 생성하였다. sbnB 돌연변이체는 철-제한 배지 내에서 성장이 손상되었고, 스태필로박틴을 만들지 않았다. 프롤린을 첨가하면 sbnB 돌연변이를 회피하지 않음을 또한 발견하였고, 이는 프롤린이 스태필로박틴 합성에 요구되는 목적하는 생성물일 수 없음을 제안한다. 프롤린은 철포획체 전구체인 것 같지 않은 한편, 암모니아가 스태필로박틴 생합성에 대해 목적하는 생성물일 수 있다. 특히, SbnA 및 SbnB는 스태필로페린 B의 전구체인 디아미노프로피온산을 생산할 수 있다. sbnB::Tet 돌연변이체의 철-제한된 표현형은 디아미노프로피온산을 혈청에 첨가함으로써 극복될 수 있음을 관찰하였다. 또한, 마우스 신장 농양 실험에서, sbnB 결핍 균주는 발병력이 손상되었음을 발견하였다 (데이타 비제시, n=7 마우스).
SbnC는 에어로박틴 생합성을 위한 추정 IucC 상동체를 코딩한다 (이는 에어로박틴 생합성에서 최종 축합 반응을 수행한다). sbnC의 돌연변이는 Km 카세트의 삽입에 의해 생성하였다. sbnC 돌연변이체는 철-제한 배지 내에서 sbnB 돌연변이체에서 관찰된 것과 유사한 성장 표현형을 나타냈다. 또한, sbnC 돌연변이체는 스태필로박틴을 생산하지 않는다.
SbnD는 추정 다중 약물 유출 펌프를 코딩한다. sbnD의 돌연변이는 Km 카세트의 삽입에 의해 생성하였다. sbnD 돌연변이체는 철-제한 배지 내에서 sbnB 및 sbnC 돌연변이체와 동일한 성장 표현형을 나타냈다. 날리딕스산, 테트라사이클린, 에티듐 브로마이드 및 노르플록사신에 대한 상기 균주 및 야생형 균주에서 MIC (최소 억제 농도) 값에서 차이가 관찰되지 않았다.
SbnE는 에어로박틴 생합성을 위한 추정 IucA 상동체를 코딩한다.
SbnF는 에어로박틴 생합성을 위한 추정 IucC 상동체를 코딩한다. sbnF 유전자에 대한 lacZ 융합체를 생성하고, sbnF 유전자가 철-조절되는지 증명하기 위해 사용하였다.
SbnG는 추정 알도라제를 코딩한다.
SbnH는 추정 오르니틴 또는 디아미노피멜레이트 데카르복실라제를 코딩한다. sbnH의 돌연변이는 Tet 카세트의 삽입에 의해 생성하였고, 돌연변이체는 철-제한 배지 내에서 성장이 손상되었다. 또한, lacZ에 대한 sbnH 유전자의 융합을 제조하고, 상기 융합은 sbnH 유전자가 철-조절되는지 증명하기 위해 사용하였다.
SbnI는 공개 데이타베이스 내의 임의의 단백질에 상동성을 보이지 않지만, sbnI 유전자에 대한 lacZ 융합은 상기 유전자가 철-조절되는 것을 보여준다.
실시예 11: 생화학적 분석
에스. 아우레우스 내의 SbnA, SbnB 및 SbnH의 생화학적 활성을 파괴하는 물질을 스크리닝하기 위한 분석은 다음과 같이 수행할 것이다. SbnB는 L-오르니틴을 L-프롤린으로 전환시키고, 상기 반응은 2가지 방법으로 모니터링할 수 있다. 한 방법은 NAD+의 환원에 대한 분광광도 분석을 이용하여 NAD+의 NADH로의 전환을 모니터링하는 것이다. 두번째 방법은 L-오르니틴의 L-프롤린으로의 전환을 모니터링하기 위해 HPLC 기반 분석을 이용하는 것이다. 상기 반응은 스태필로박틴의 생합성의 초기에 발생한다. 다른 분석에서, SbnA 활성은 HPLC 기반 분석에 의해 모니터링된다. SbnA는 O-아세틸-L-세린을 L-2,3-디아미노프로피온산으로 전환시킨다. 반응 생성물은 다시 HPLC 기반 방법에 의해 모니터링된다. L-오르니틴에 의해 제공된 아미노기는 O-아세틸-L-세린이 L-2,3-디아미노프로피온산으로 전환되는 동안 사용되므로, 반응에는 SbnB의 참여를 필요로 한다. SbnH 활성은 또한 HPLC를 이용하여 측정할 수 있다. 상기 효소는 아마도 L-오르니틴을 푸트레신으로 전환시킨다. 억제제에 대한 스크리닝은 반응 최종생성물을 파괴하는 화합물에 대한 스크리닝을 수반할 것이다.
실시예 12: 발현 분석
에스. 아우레우스에서 SbnA의 발현을 파괴하는 물질을 스크리닝하기 위한 분석은 다음과 같이 수행될 것이다. 야생형 에스. 아우레우스 세포를 시험 물질의 존재 또는 부재 하에 트립틱 소이 브로쓰 (TSB) (디프코) 내에서 밤새 배양할 것이다. 배양 24시간 후, 세포를 1X PBS (인산염 완충 염수)로 세척한 다음, 37℃에서 STE (0.1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl [pH 8.0], 1 mM EDTA [pH 8.0]) 중 10 ㎍의 리소스타핀을 사용하여 용해시킬 것이다. 이어서, 세포 용해물을 항-SbnA 항체 사전코팅된 플레이트로 옮기고 45 내지 60분 동안 실온에서 인큐베이팅할 것이다. 대조군으로서, 비처리된 에스. 아우레우스 세포로부터 세포 용해물을 사용할 것이다. 물로 3회 세척한 후, 알칼린 포스파타제 (AP) 또는 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP)에 컨쥬게이팅된 2차 항체를 첨가하고 1시간 동안 인큐베이팅할 것이다. 이어서, 플레이트를 세척하여 유리 항체 복합체로부터 결합된 항체를 분리할 것이다. 화학발광 기질 (알칼린 포스파타제, 또는 양고추냉이 퍼옥시다제에 대한 Super Signal 루미놀 용액 (피어스))을 사용하여 결합된 항체를 검출할 것이다. 마이크로플레이트 발광분석기를 사용하여 화학발광 시그날을 검출할 것이다. 시험 물질로 처리된 세포로부터 얻은 세포 용해물의 샘플에서 시그날의 부재는 시험 물질이 SbnA의 발현을 억제한 것을 나타낼 것이다. 또한, 유사한 발현 분석을 SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH, SbnI 및(또는) 스태필로박틴에 대해 수행할 수 있다.
본 발명의 실시는 달리 나타내지 않으면 당업계의 기술 내에 있는 세포 생물학, 세포 배양, 분자 생물학, 트랜스제닉 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학의 종래의 기술을 사용할 것이다. 상기 기술은 문헌에 기재되어 있다. 예를 들어, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., ed. by Sambrook, Fritsch and Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989); DNA Cloning, Volumes I and II (D. N. Glover ed., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ed., 1984); Mullis et al. 미국 특허 4,683,195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Transcription And Translation (B. D. Hames & S. J. Higgins eds. 1984); Culture Of Animal Cells (R. I. Freshney, Alan R. Liss, Inc., 1987); Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press, 1986); B. Perbal, A Practical Guide To Molecular Cloning (1984); the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (J. H. Miller and M. P. Calos eds., 1987, Cold Spring Harbor Laboratory); Methods In Enzymology, Vols. 154 and 155 (Wu et al. eds.), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Mayer and Walker, eds., Academic Press, London, 1987); Handbook Of Experimental Immunology, Volumes I-IV (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds., 1986); Antibodies: A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. (1987)), Manipulating the Mouse Embryo (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)을 참조한다.
참고 문헌의 포함
본원에서 언급된 모든 간행물 및 특허는 그 개개의 간행물 또는 특허가 각각 구체적으로 및 개별적으로 참고로 포함되는 것처럼 그 전부가 본원에 참고로 포함된다. 문헌이 상충되는 경우, 본원에 기재된 임의의 정의를 포함하여 본원에서 규율될 것이다.
동등물
당업자는 단지 통상적인 실험을 사용하여 본원에 기재된 본 발명의 구체적인 실시태양에 대한 많은 동등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 상기 동등물은 하기 청구의 범위에 포함되는 것이다.
Figure 112007026815856-PCT00006
Figure 112007026815856-PCT00007
Figure 112007026815856-PCT00008
sbn 오페론으로부터 발현된 단백질에 대한 아미노산 상동성 및 유사성
단백질 최근접 일치 또는 기능 세균 상동성 (%) 유사성 (%)
SbnA O-아세틸 세린 술프히드릴라제 스트렙토마이세스 아베르미티리스 (S. avermitilis) 42 62
O-아세틸 세린 술프히드릴라제 이. 콜라이 29 45
SbnB 오르니틴 시클로데아미나제 아르카에오글로부스 풀지디스 (Archaeoglobus fulgidis) 32 53
SbnC AcsA- 아크로모박틴 생합성 펙토박테리움 크리산테미 (Pectobacterium chrysanthemi) 32 50
PvsB - 비브리오페린 생합성 비브리오 파라해몰리티쿠스 (Vibrio parahaemolyticus) 23 42
IucC - 에어로박틴 생합성 이. 콜라이 24 40
SbnD 다중약물 유출 리스테리아 종 26 47
SbnE RhbC - 리조박틴 1021 생합성 시노리조븀 멜리로티 (Sinorhizobium meliloti) 26 45
PvsD - 비브리오페린 생합성 비브리오 파라해몰리티쿠스 25 45
AcsD - 아크로모박틴 생합성 펙토박테리움 크리산테미 25 43
IuCA - 에어로박틴 생합성 이. 콜라이 24 42
SbnF AcsC - 아크로모박틴 생합성 펙토박테리움 크리산테미 45 63
RhbF - 리조박틴 1021 생합성 시노리조븀 멜리로티 28 48
AlcC - 알칼리진 생합성 브로데텔라 브론키셉티카 (Bordetella bronchiseptica) 25 47
IucC - 에어로박틴 생합성 이. 콜라이 25 44
SbnG AcsB - 아크로모박틴 생합성 펙토박테리움 크리산테미 47 67
4-히드록시-2-옥소발레레이트 알돌라제 잔토모나스 캄페스트리스 (Xanthomonas campestris) 35 51
2-데히드로-3-데옥시글루카레이트 알돌라제 이. 콜라이 29 51
SbnH PvsE - 비브리오페린 생합성 비브리오 파라해몰리티쿠스 42 59
디아미노피멜레이트 데카르복실라제 잔토모나스 캄페스트리스 39 57
SbnI 알려지지 않음 NDa ND
aND, 측정되지 않음
Figure 112007026815856-PCT00009
Figure 112007026815856-PCT00010
a상동성 및 유사성은 예측된 단백질 생성물 사이에 대해서이다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNIVERSITY OF WESTERN ONTARIO <120> SCREENING ASSAYS FOR INHIBITORS OF A STAPHYLOCOCCUS AUREUS SIDEROPHORE <130> UWA-012.25 <140> PCT/IB05/004081 <141> 2005-09-08 <150> 60/607,896 <151> 2004-09-08 <160> 45 <170> PatentIn Ver. 3.3 <210> 1 <211> 11218 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 1 ttgattgaaa aaagtcaagc atgtcacgat tcattgttag attctgtagg gcaaacacct 60 atggttcaac ttcatcaact atttccgaaa catgaagtgt ttgcaaagtt agagtatatg 120 aatcctggag gcagcatgaa agatcgacct gccaagtaca tcattgaaca tggtattaaa 180 catggtttaa tcactgagaa tacacattta attgaaagta cttctggtaa tttaggcatt 240 gcgttggcaa tgatagctaa aatcaaggga ttaaaactca cgtgtgttgt tgatcctaaa 300 atatcaccaa caaatttgaa aattattaaa agttatggtg ccaatgtaga aatggttgaa 360 gaacctgatg cacatggggg ttatttaatg actcgtattg caaaggtgca agaactgtta 420 gccactattg acgatgcata ttggattaat caatatgcga atgagttaaa ttggcaatcc 480 cattatcatg gtgcaggcac agagattgtt gaaacaatta agcaacctat agattatttt 540 gtcgcgccag tcagcacgac aggtagcatt atgggtatga 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cgaatttaca 9840 tgtcgatgta gtgaaacttt attttaaaaa agcaaaggca tggtctgaaa aacatcgatt 9900 tccactcaaa catatcaatc ttggtggtgg cataggcgtt aactatgcag atttaactaa 9960 ccaatttgaa tgggataatt ttgtagaacg ttttaaaaca cttatcgttg agcaagaaat 10020 ggaagatgtg acattgaact ttgaatgtgg gcgctttatt gtggcacata ttggttacta 10080 tgtgacagaa gtgctagaca ttaagaaagt acatggtgct tggtatgcca tattaagagg 10140 aggtacgcaa caatttagac tgccggtatc ttggcaacat aaccatcctt ttgacattta 10200 tcgctataag gacaatccat attcatttga aaaagtttca atttcgagac aggacacaac 10260 gttagtcggt caattatgta caccgaaaga tgtctttgct agagaagtac agatagacgc 10320 aatcagtaca ggcgacgtta ttgttttcaa atatgcaggt gcatacggat ggtctatttc 10380 acatcacgat ttcttaagcc atccacatcc tgaatttatt tatttaacac aaacaaagga 10440 ggatgaataa ctattgaatc atattcatga acatttaaaa ttggtaccag tagataagat 10500 tgatcttcac gaaacattcg aacctttaag attggaaaaa acgaaaagta gtattgaagc 10560 agatgatttt atacgtcatc ctattttagt gacagcgatg caacatggta gatatatggt 10620 tatagatggt gtgcatcggt atacaagttt gaaagcgtta 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Phe Val Ala Pro Val Ser Thr Thr Gly Ser Ile Met Gly 180 185 190 Met Ser Arg Lys Ile Lys Glu Val His Pro Asn Ala Gln Ile Val Ala 195 200 205 Val Asp Ala Lys Gly Ser Val Ile Phe Gly Asp Lys Pro Ile Asn Arg 210 215 220 Glu Leu Pro Gly Ile Gly Ala Ser Arg Val Pro Glu Ile Leu Asn Arg 225 230 235 240 Ser Glu Ile Asn Gln Val Ile His Val Asp Asp Tyr Gln Ser Ala Leu 245 250 255 Gly Cys Arg Lys Leu Ile Asp Tyr Glu Gly Ile Phe Ala Gly Gly Ser 260 265 270 Thr Gly Ser Ile Ile Ala Ala Ile Glu Gln Leu Ile Thr Ser Ile Glu 275 280 285 Glu Gly Ala Thr Ile Val Thr Ile Leu Pro Asp Arg Gly Asp Arg Tyr 290 295 300 Leu Asp Leu Val Tyr Ser Asp Thr Trp Leu Glu Lys Met Lys Ser Arg 305 310 315 320 Gln Gly Val Lys Ser Glu 325 <210> 5 <211> 1008 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 5 atgaatagag agatgttgta tttaaataga tcagatattg aacaagcggg aggtaatcat 60 tcacaagttt atgtggacgc attaacagaa gcattaacag cccatgcgca caatgatttt 120 gtacaaccgc ttaagccgta tttaagacag gatcctgaaa atggacacat cgcagatcga 180 attattgcaa 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Staphylococcus aureus <400> 6 atataggttc aatgttgtcc caatattttg ttgttgtgcc tgttgataaa taaaataagc 60 acttgaaata tcttcgatag ccatacccat cggattaagt aatatgattt catcatcgtc 120 ttcacgtcct ggtatgtcac ctgtcacaag ttgccctagt tcagcatgaa gtgcttcttt 180 gctgaattta ccttctaaca ccaattggtt aatagttttc ttttctcgat tacattgtga 240 ccagtcatct actacgactt tgtcagcttt aataaagact tctttatgca catccatgat 300 agaaatgttg ctaataaatg cacccttttg taaccaatca tattcaatgt atggttgatc 360 cgttacggta catgtaatga ctacttcacc atttgatact gcttctttag cattttctgt 420 cgcaataaaa ttaatttccg gacgctgttg ttgccatcta tcaacaaagc gtgcacatgc 480 ttcagagaat tgatcgtaaa caaacacgcg tttaatatga tcgaattgct ctaacatact 540 ttgtaattgc ttgtctccga ttagcccgca accaatgatt gttaagtctt taaatccttt 600 tttagccaaa tgcttagctg caatcactga aactgctgca gtacgcatac tactaattaa 660 acttgcttcc ataactgcaa ttggataatt cgtttctgga tcattcaaaa taatgacacc 720 acttgcacgc tccatattac gtttcgatgg attgtcgtgc ttactaccta tccacttaat 780 acctgaaatt gcgtgttcac caccgatatg acttggcatt gcaataattc 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tcaatcactt gtgctaactt 600 agagatcggt gaatcaggca tcgtttcaaa taatgacgcc aatacatgaa tatctttatc 660 agcatggtaa ttcggtatcc cttcacgaac aatcatggca ctatttgtta ataaatccat 720 ttcaggttca actgtttgcc ctaatggatt cggtaacaat gcacgatatc cttcttcaaa 780 catcaattta aaatggggtg tttcaacctc atctttgact gatgcgataa cttgcgcggc 840 atcaattgtc cgttcaattt gttcaagatc attcgtacgt ataaaattag taattttaac 900 gtgtatcggt aattttaaat aaatgtttaa tgcttttgaa aatacagttc taaccgaaga 960 cgtcgggtac actaaatcac cggaaacgcc aaggtctttt attaaacctt gttcactata 1020 ttgcatatac tgtggatgct gtcgcaacac attgatttga taaggatgtg ttggtaataa 1080 aataaaatct ttgggtatct ctgatatatc tatgtctgct aattgataca acactttctc 1140 aacctgatct tctttacctt ctacatagcg cgtgagcaga acatcttgat gcacagctaa 1200 ataatgcaat tggaatgatg tatgacattc gggtgcatat ttctctaaat ctgcttctga 1260 aaacccactt gcactcttag gagtcggatg aaatggatga cctaagtata aagattgttc 1320 tgaaacgata taacgatcct ctacgtagtc tattgtgtta ctttgcaaat aacgcgccgt 1380 gcgatgaatg ctattatcga tgtcagacat aatttgcgcc atatgttgtt 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tcgtggaaat cttttaaggc aatacgtgta ggccaaccat tttcatgaat 480 gagcatcata ttttgtgcat gcgattcaaa ggcaataccg tgataataaa gcatatgaat 540 cattggacga atcgctacag ctaaaaattg ctttgtccaa gcttcagaac catattgttt 600 aatccacttt tcaatgaatg gtaaaccatc cttatcactt gcataaagtg cattaaatgg 660 tatcgcatcc tcttcatcga ttaacatatg atatatattt tcacgccata taacacctaa 720 cgcaccataa acttgagttt gtttataagg cgaaagttgt gtatttaaat aagactgtcc 780 taagacttcc cctagaaaaa ctgtctttaa ttcatctttt aaatacatat cttgttgctg 840 tatctgcttt aaccaatccg taatttgcgc tgcattttca attgtatgag gcgccaacac 900 tcgtttcgtt gaagtgttcg ttatacttat tggtaccttt aaataatatt ttgtcgtgtc 960 tattggcgac atcgtacgaa tcgattgttg agggtgatat agctcatcac tttcccctaa 1020 ccatagtact gtgccattaa gcctttcttc agccaaatca acttggatga catgttcaaa 1080 ctgccatggg tgtacaggta tcatctcaac atcatttaca tgtttgccag acgcttcaat 1140 ttgctgtaca aaatgttcat aagtcttatc gccaacttgt tgacgtaaca tttcgttaac 1200 tacaacattt cttgataccg tcgtttctac tttatctttg tcgatagcta accactgcag 1260 tttaacgttt ggtacaaaat caggaccaaa tttcaaatta tcactcaacg taaatcctaa 1320 acgtgatttg taacttggat gatactgatg cccttccatc gcataaaatt catagtcgtt 1380 aaatgtctca ggtgttgctg gtgggtttga ttctcgatac tgcatacttt gtgtatcttt 1440 taattctgtc tgtaataact caacaataaa ttgttctagc ttttcatcat ttttaggaaa 1500 tgtaaataca gcctctctca ataattgtgt atagtctgtt gttgtatctg cctcatctcc 1560 tacgacacgc tcaattggtg atgtgatacg tatacgatca aagctatgtg tcttttcagc 1620 agtaaaacga tactctgaat catgtccttc tattgtaaaa tgaccgacac cgtcttgata 1680 tgacgcttta tacacaacaa tattctcata aataagtgat gataccagtt gatgcattac 1740 tctagtcttt acacgattaa gaattgtttg attcacaata cgatacctcc ttgttataac 1800 aaattggatt tggtatatgt gtataaatag ggtttgcacc acaatcat 1848 <210> 19 <211> 579 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 19 Met His Gln Leu Val Ser Ser Leu Ile Tyr Glu Asn Ile Val Val Tyr 1 5 10 15 Lys Ala Ser Tyr Gln Asp Gly Val Gly His Phe Thr Ile Glu Gly His 20 25 30 Asp Ser Glu Tyr Arg Phe Thr Ala Glu Lys Thr His Ser Phe Asp Arg 35 40 45 Ile Arg Ile Thr Ser Pro Ile Glu Arg Val 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tccaaatctt gccatgcgac caccattcaa 420 acttcttaat ccttgcgggt aataacgact taatttcaca atatgctcaa ctgtctcacg 480 atctttaacg tgtggcacaa taatacctct cgcacccata tctaacactt taatgatatc 540 tctatctatc actgcagtga cacgtacaat tggtataata tgcgctgctt cagctgcacg 600 aattaaatgc gctagtgtct catcattaat cgccacgtgt tctgtatcaa tcacaacaaa 660 gtcatacccg cttgctgcga taacctcgat catcaatggg tccggtatag aattaaaaat 720 gccataaact gaatcaccat tgtttaatct atgtttcaga gatagttgtt gcatcat 777 <210> 22 <211> 259 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 22 Met Met Gln Gln Leu Ser Leu Lys His Arg Leu Asn Asn Gly Asp Ser 1 5 10 15 Val Tyr Gly Ile Phe Asn Ser Ile Pro Asp Pro Leu Met Ile Glu Val 20 25 30 Ile Ala Ala Ser Gly Tyr Asp Phe Val Val Ile Asp Thr Glu His Val 35 40 45 Ala Ile Asn Asp Glu Thr Leu Ala His Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ala 50 55 60 Ala His Ile Ile Pro Ile Val Arg Val Thr Ala Val Ile Asp Arg Asp 65 70 75 80 Ile Ile Lys Val Leu Asp Met Gly Ala Arg Gly Ile Ile Val Pro His 85 90 95 Val Lys Asp Arg Glu Thr Val Glu His Ile Val Lys Leu Ser Arg Tyr 100 105 110 Tyr Pro Gln Gly Leu Arg Ser Leu Asn Gly Gly Arg Met Ala Arg Phe 115 120 125 Gly Arg Thr Pro Leu Leu Asp Ala Met Glu Met Ala Asn Glu His Ile 130 135 140 Met Val Ile Ala Met Ile Glu Asp Val Glu Gly Val Met Ala Ile Asp 145 150 155 160 Asp Ile Ala Gln Val Glu Gly Leu Asp Met Ile Val Glu Gly Ala Ala 165 170 175 Asp Leu Ser Gln Ser Leu Gly Ile Pro Trp Gln Thr Arg Asp Asp Gln 180 185 190 Val Thr Ser His Val Gln His Ile Phe Glu Val Val Asn Ala His Gly 195 200 205 Lys His Phe Cys Ala Leu Pro Arg Glu Asp Glu Asp Ile Ala Lys Trp 210 215 220 Gln Ala Gln Gly Val Gln Thr Phe Ile Leu Gly Asp Asp Arg Gly Lys 225 230 235 240 Ile Tyr Arg His Leu Ser Ala Ser Leu Ala Thr Ser Lys Gln Lys Gly 245 250 255 Asp Glu Gly <210> 23 <211> 1200 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 23 atgcgtatag ttcaacctgt tattgaacaa ttaaaagcac aatctcatcc agtttgtcat 60 tatatctatg atttagtcgg actggaacat catttgcaac atattacatc gtcattgccg 120 agtaattgtc aaatgtacta tgcaatgaaa gcaaatagtg aacgaacaat cctagataca 180 attagtcagt atgttgaagg attcgaagtt gcatctcaag gtgaaatagc aaaaggtctt 240 gcttttaaac cagcaaatca tattattttt ggtggccctg gtaagacaga cgaggaacta 300 agatatgcag taagtgaagg tgttcagcgt attcatgttg aaagtatgca tgaattacaa 360 cggctaaatg ccatcttaga agatgaagat aagacacaac acattttatt gcgtgttaat 420 ttagcaggac catttcccaa tgcaacgttg catatggcag gacgcccaac acaatttggt 480 atttctgaag acgaagttga tgatgtcatt gaagctgcgc tagtaatgcc aaatattcat 540 ctagatggct ttcattttca ttctatttct aacaatttag actcgaattt acatgtcgat 600 gtagtgaaac tttattttaa aaaagcaaaa tcatggtctg aaaaacatcg atttccactc 660 aaacatatca atcttggtgg tggcataggc gttaactatg cagatttaac tagccaattt 720 gagtgggata attttgtaga aaattttaaa acacttatcg ttgagcaaga aatggaagat 780 gtgacattga actttgaatg tgggcgcttt attgtggcac atattggtta ctatgtgaca 840 gaagtgctag atattaagaa agtgcatggt gcttggtatg ccattttaag aggaggtacg 900 caacaattta gactgccggt atcttggcag cataaccatc cttttgaaat ttatcgttat 960 aaggacaatc catattcatt tgaaaaagtt tcaatttcga gacaggacac aacgttagtc 1020 ggtcaattat gtacaccgaa agatgtcttt gctagagaag tacagataga cgcaatcagt 1080 acaggcgacg ttattgtttt caaatatgca ggtgcatacg gatggtctat ttcacatcac 1140 gatttcttaa gccatccaca tcctgaattt atttatttaa cgcaaacaaa ggaggatgaa 1200 <210> 24 <211> 1200 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 24 ttcatcctcc tttgtttgcg ttaaataaat aaattcagga tgtggatggc ttaagaaatc 60 gtgatgtgaa atagaccatc cgtatgcacc tgcatatttg aaaacaataa cgtcgcctgt 120 actgattgcg tctatctgta cttctctagc aaagacatct ttcggtgtac ataattgacc 180 gactaacgtt gtgtcctgtc tcgaaattga aactttttca aatgaatatg gattgtcctt 240 ataacgataa atttcaaaag gatggttatg ctgccaagat accggcagtc taaattgttg 300 cgtacctcct cttaaaatgg cataccaagc accatgcact ttcttaatat ctagcacttc 360 tgtcacatag taaccaatat gtgccacaat aaagcgccca cattcaaagt tcaatgtcac 420 atcttccatt tcttgctcaa cgataagtgt tttaaaattt tctacaaaat tatcccactc 480 aaattggcta gttaaatctg catagttaac gcctatgcca ccaccaagat tgatatgttt 540 gagtggaaat cgatgttttt cagaccatga ttttgctttt ttaaaataaa gtttcactac 600 atcgacatgt aaattcgagt ctaaattgtt agaaatagaa tgaaaatgaa agccatctag 660 atgaatattt ggcattacta gcgcagcttc aatgacatca tcaacttcgt cttcagaaat 720 accaaattgt gttgggcgtc ctgccatatg caacgttgca ttgggaaatg gtcctgctaa 780 attaacacgc aataaaatgt gttgtgtctt atcttcatct tctaagatgg catttagccg 840 ttgtaattca tgcatacttt caacatgaat acgctgaaca ccttcactta ctgcatatct 900 tagttcctcg tctgtcttac cagggccacc aaaaataata tgatttgctg gtttaaaagc 960 aagacctttt gctatttcac cttgagatgc aacttcgaat ccttcaacat actgactaat 1020 tgtatctagg attgttcgtt cactatttgc tttcattgca tagtacattt gacaattact 1080 cggcaatgac gatgtaatat gttgcaaatg atgttccagt ccgactaaat catagatata 1140 atgacaaact ggatgagatt gtgcttttaa ttgttcaata acaggttgaa ctatacgcat 1200 <210> 25 <211> 400 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 25 Met Arg Ile Val Gln Pro Val Ile Glu Gln Leu Lys Ala Gln Ser His 1 5 10 15 Pro Val Cys His Tyr Ile Tyr Asp Leu Val Gly Leu Glu His His Leu 20 25 30 Gln His Ile Thr Ser Ser Leu Pro Ser Asn Cys Gln Met Tyr Tyr Ala 35 40 45 Met Lys Ala Asn Ser Glu Arg Lys Ile Leu Asp Thr Ile Ser Gln Tyr 50 55 60 Val Glu Gly Phe Glu Val Ala Ser Gln Gly Glu Ile Ala Lys Gly Leu 65 70 75 80 Ala Phe Lys Pro Ala Asn His Ile Ile Phe Gly Gly Pro Gly Lys Thr 85 90 95 Asp Glu Glu Leu Arg Tyr Ala Val Ser Glu Gly Val Gln Arg Ile His 100 105 110 Val Glu Ser Met His Glu Leu Gln Arg Leu Asn Ala Ile Leu Glu Asp 115 120 125 Glu Asp Lys Thr Gln His Ile Leu Leu Arg Val Asn Leu Ala Gly Pro 130 135 140 Phe Pro Asn Ala Thr Leu His Met Ala Gly Arg Pro Thr Gln Phe Gly 145 150 155 160 Ile Ser Glu Asp Glu Val Asp Asp Val Ile Glu Ala Ala Leu Ala Met 165 170 175 Pro Lys Ile His Leu Asp Gly Phe His Phe His Ser Ile Ser Asn Asn 180 185 190 Leu Asp Ser Asn Leu His Val Asp Val Val Lys Leu Tyr Phe Lys Lys 195 200 205 Ala Lys Ala Trp Ser Glu Lys His Arg Phe Pro Leu Lys His Ile Asn 210 215 220 Leu Gly Gly Gly Ile Gly Val Asn Tyr Ala Asp Leu Thr Asn Gln Phe 225 230 235 240 Glu Trp Asp Asn Phe Val Glu Arg Phe Lys Thr Leu Ile Val Glu Gln 245 250 255 Glu Met Glu Asp Val Thr Leu Asn Phe Glu Cys Gly Arg Phe Ile Val 260 265 270 Ala His Ile Gly Tyr Tyr Val Thr Glu Val Leu Asp Ile Lys Lys Val 275 280 285 His Gly Ala Trp Tyr Ala Ile Leu Arg Gly Gly Thr Gln Gln Phe Arg 290 295 300 Leu Pro Val Ser Trp Gln His Asn His Pro Phe Asp Ile Tyr Arg Tyr 305 310 315 320 Lys Asp Asn Pro Tyr Ser Phe Glu Lys Val Ser Ile Ser Arg Gln Asp 325 330 335 Thr Thr Leu Val Gly Gln Leu Cys Thr Pro Lys Asp Val Phe Ala Arg 340 345 350 Glu Val Gln Ile Asp Ala Ile Ser Thr Gly Asp Val Ile Val Phe Lys 355 360 365 Tyr Ala Gly Ala Tyr Gly Trp Ser Ile Ser His His Asp Phe Leu Ser 370 375 380 His Pro His Pro Glu Phe Ile Tyr Leu Thr Gln Thr Lys Glu Asp Glu 385 390 395 400 <210> 26 <211> 762 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 26 ttgaatcata ttcatgaaca tttaaaattg gtaccagtag ataagattga tcttcacgaa 60 acattcgaac ctttaagatt ggaaaaaacg aaaagtagta ttgaagcaga tgattttata 120 cgtcatccta ttttagtgac agcgatgcaa catggtagat atatggttat agatggtgtg 180 catcggtata caagtttgaa agcgttagga tgtaagaaag ttccagtgca agaaatccat 240 gaaacacaat attcaattag tacatggcaa cataaagttc catttggtgt gtggtgggaa 300 acgttacaac aagaacatcg cttgccatgg actactgaga caagacaaga agcgccattt 360 attacgatgt gtcatggtga tacagaacaa tatttgtata cgaaagattt aggcgaagca 420 cattttcaag tatgggaaaa ggttgtcgca agttatagtg gttgttgttc tgtagagaga 480 attgcacaag gtacatatcc ttgtctttct caacaagatg tactcatgaa gtatcagcca 540 ttgagttata aggaaattga agcggttgtt cataaagggg aaactgtgcc agcaggtgtg 600 acacgcttta atatttcagg acgatgtctt aatcttcaag taccactggc attacttaaa 660 caagatgatg atgttgaaca actgcgtaat tggaagcagt ttttagcaga taagtttgcc 720 aatatgagat gctatactga aaaagtatac ttggtggagc aa 762 <210> 27 <211> 762 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 27 ttgctccacc aagtatactt tttcagtata gcatctcata ttggcaaact tatctgctaa 60 aaactgcttc caattacgca gttgttcaac atcatcatct tgtttaagta atgccagtgg 120 tacttgaaga ttaagacatc gtcctgaaat attaaagcgt gtcacacctg ctggcacagt 180 ttccccttta tgaacaaccg cttcaatttc cttataactc aatggctgat acttcatgag 240 tacatcttgt tgagaaagac aaggatatgt accttgtgca attctctcta cagaacaaca 300 accactataa cttgcgacaa ccttttccca tacttgaaaa tgtgcttcgc ctaaatcttt 360 cgtatacaaa tattgttctg tatcaccatg acacatcgta ataaatggcg cttcttgtct 420 tgtctcagta gtccatggca agcgatgttc ttgttgtaac gtttcccacc acacaccaaa 480 tggaacttta tgttgccatg tactaattga atattgtgtt tcatggattt cttgcactgg 540 aactttctta catcctaacg ctttcaaact tgtataccga tgcacaccat ctataaccat 600 atatctacca tgttgcatcg ctgtcactaa aataggatga cgtataaaat catctgcttc 660 aatactactt ttcgtttttt ccaatcttaa aggttcgaat gtttcgtgaa gatcaatctt 720 atctactggt accaatttta aatgttcatg aatatgattc aa 762 <210> 28 <211> 254 <212> PRT <213> Staphylococcus aureus <400> 28 Met Asn His Ile His Glu His Leu Lys Leu Val Pro Val Asp Lys Ile 1 5 10 15 Asp Leu His Glu Thr Phe Glu Pro Leu Arg Leu Glu Lys Thr Lys Ser 20 25 30 Ser Ile Glu Ala Asp Asp Phe Ile Arg His Pro Ile Leu Val Thr Ala 35 40 45 Met Gln His Gly Arg Tyr Met Val Ile Asp Gly Val His Arg Tyr Thr 50 55 60 Ser Leu Lys Ala Leu Gly Cys Lys Lys Val Pro Val Gln Glu Ile His 65 70 75 80 Glu Thr Gln Tyr Ser Ile Ser Thr Trp Gln His Lys Val Pro Phe Gly 85 90 95 Val Trp Trp Glu Thr Leu Gln Gln Glu His Arg Leu Pro Trp Thr Thr 100 105 110 Glu Thr Arg Gln Glu Ala Pro Phe Ile Thr Met Cys His Gly Asp Thr 115 120 125 Glu Gln Tyr Leu Tyr Thr Lys Asp Leu Gly Glu Ala His Phe Gln Val 130 135 140 Trp Glu Lys Val Val Ala Ser Tyr Ser Gly Cys Cys Ser Val Glu Arg 145 150 155 160 Ile Ala Gln Gly Thr Tyr Pro Cys Leu Ser Gln Gln Asp Val Leu Met 165 170 175 Lys Tyr Gln Pro Leu Ser Tyr Lys Glu Ile Glu Ala Val Val His Lys 180 185 190 Gly Glu Thr Val Pro Ala Gly Val Thr Arg Phe Asn Ile Ser Gly Arg 195 200 205 Cys Leu Asn Leu Gln Val Pro Leu Ala Leu Leu Lys Gln Asp Asp Asp 210 215 220 Val Glu Gln Leu Arg Asn Trp Lys Gln Phe Leu Ala Asp Lys Phe Ala 225 230 235 240 Asn Met Arg Cys Tyr Thr Glu Lys Val Tyr Leu Val Glu Gln 245 250 <210> 29 <211> 236 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 29 cattgactaa ttagcctcct tcgtgatgta tgacaatgag aatcattatc acgatttagt 60 atgaattaaa ttttttccta agtcaataaa atatttatga tttacatgca acttataatt 120 atttgacata taaatgcata aaaaatataa tcctaattac ttgatagtga gaatcattat 180 caattaggta acacacaata ttatagaatt ttaaatttga ggaggaagcg cttttg 236 <210> 30 <211> 236 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 30 caaaagcgct tcctcctcaa atttaaaatt ctataatatt gtgtgttacc taattgataa 60 tgattctcac tatcaagtaa ttaggattat attttttatg catttatatg tcaaataatt 120 ataagttgca tgtaaatcat aaatatttta ttgacttagg aaaaaattta attcatacta 180 aatcgtgata atgattctca ttgtcataca tcacgaagga ggctaattag tcaatg 236 <210> 31 <211> 19 <212> DNA <213> Staphylococcus aureus <400> 31 tgagaatcat tatcaatta 19 <210> 32 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 32 ttggatccag tatatgaatc ctggaggc 28 <210> 33 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 33 ttggatccaa aaatgactga ccctttcgca tc 32 <210> 34 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 34 tggatcccat caccaattga gcgtgtcgta ggagat 36 <210> 35 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 35 tggatccttt caattgtatg aggcgccaac actcgt 36 <210> 36 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 36 ttgcggccgc gatagataga gatatcatta 30 <210> 37 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 37 ttggatccta gttaacgcct atgccacc 28 <210> 38 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 38 ttgcggccgc cccaacacaa tttggtattt ctgaa 35 <210> 39 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 39 ttggatccta cttgaaaatg tgcttcgc 28 <210> 40 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 40 ttgcggccgc aagttccatt tggtgtgtgg 30 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 41 ttggatccgg taaaacagtg aaaagagc 28 <210> 42 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 42 ttgcggccgc tattatcgct ttagtattat 30 <210> 43 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 43 ttggatcctc aacgcctgct tgagatgtt 29 <210> 44 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 44 ttggatccat tagcagacat agatatat 28 <210> 45 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic oligonucleotide <400> 45 ttggatccta gtgtctcatc attaatcg 28

Claims (32)

  1. 서열 2의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  2. 서열 5의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  3. 서열 8의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  4. 서열 11의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  5. 서열 14의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  6. 서열 17의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  7. 서열 20의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  8. 서열 23의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  9. 서열 26의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산.
  10. 서열 4를 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  11. 서열 7을 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  12. 서열 10을 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  13. 서열 13을 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  14. 서열 16을 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  15. 서열 19를 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  16. 서열 22를 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  17. 서열 25를 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  18. 서열 28을 포함하는 단리된 Sbn 폴리펩티드.
  19. 서열 4, 서열 7, 서열 10, 서열 13, 서열 16, 서열 19, 서열 22, 서열 25 또는 서열 28에 대한 항체 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  20. 서열 4, 서열 7, 서열 10, 서열 13, 서열 16, 서열 19, 서열 22, 서열 25 또는 서열 28의 단편인 폴리펩티드 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  21. 서열 2, 서열 5, 서열 8, 서열 11, 서열 14, 서열 17, 서열 20, 서열 23 또는 서열 26에 안티센스인 핵산 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  22. 서열 2, 서열 5, 서열 8, 서열 11, 서열 14, 서열 17, 서열 20, 서열 23 또는 서열 26의 핵산을 포함하는 siRNA 분자 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  23. 대상에게 유효량의 제19항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 에스. 아우레우스의 감염에 의해 유발되거나 상기 감염이 원인이 되는 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
  24. 대상에게 유효량의 제20항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 에스. 아우레우스의 감염에 의해 유발되거나 상기 감염이 원인이 되는 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
  25. 대상에게 유효량의 제21항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 에스. 아우레우스의 감염에 의해 유발되거나 상기 감염이 원인이 되는 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
  26. 대상에게 유효량의 제22항의 제약 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 대상에서 에스. 아우레우스의 감염에 의해 유발되거나 상기 감염이 원인이 되는 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하는 방법.
  27. (i) 물질의 부재시 Sbn 폴리펩티드와 상호작용 분자 사이의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 Sbn 폴리펩티드를 상기 물질의 존재 하에 적절한 상호작용 분자와 접촉시키고;
    (ii) Sbn 폴리펩티드와 상호작용 분자 사이의 상호작용의 수준을 측정하는 것을 포함하고,
    여기서 물질의 부재시에 비해 물질의 존재시 Sbn 폴리펩티드와 상호작용 분자 사이의 상호작용의 상이한 수준은 상기 물질이 Sbn 폴리펩티드와 상호작용 분자 사이의 상호작용을 억제함을 나타내는 것인, Sbn 폴리펩티드에 결합하고 철포획체의 생합성을 억제하는 물질을 확인하기 위한 방법.
  28. 제27항에 있어서, Sbn 폴리펩티드가 스태필로코커스 아우레우스 SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 및 SbnI로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  29. (i) 물질의 부재시 Sbn 폴리펩티드와 기질 사이의 상호작용을 허용하는 조건 하에서 Sbn 폴리펩티드를 상기 물질의 존재 하에 기질과 접촉시키고;
    (ii) Sbn 폴리펩티드의 생화학적 활성을 측정하는 것을 포함하고,
    여기서 물질의 부재시에 비해 물질의 존재시 Sbn 폴리펩티드 활성의 감소된 수준은 상기 물질이 Sbn 폴리펩티드를 억제함을 나타내는 것인, 철포획체의 생합성을 억제하는 물질을 확인하기 위한 방법.
  30. 제29항에 있어서, Sbn 폴리펩티드가 스태필로코커스 아우레우스 SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 및 SbnI로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  31. (i) 야생형 스태필로코커스 아우레우스 균주를 후보 물질의 존재 또는 부재 하에 배양하고;
    (ii) Sbn 폴리펩티드의 발현을 비교하는 것을 포함하고,
    여기서 상기 물질로 처리된 세포 내에서 Sbn 폴리펩티드의 발현의 보다 큰 감소는 상기 물질이 스태필로코커스 아우레우스 내에서 Sbn 폴리펩티드의 발현을 억제함을 나타내는 것인, 스태필로코커스 아우레우스 내에서 SbnA, SbnB, SbnC, SbnD, SbnE, SbnF, SbnG, SbnH 및 SbnI로 이루어진 군 중에서 선택되는 폴리펩티드 의 발현을 억제하는 물질을 확인하기 위한 방법.
  32. (i) 야생형 스태필로코커스 아우레우스 균주를 후보 물질의 존재 또는 부재 하에 배양하고;
    (ii) sbn 핵산의 발현을 비교하는 것을 포함하고,
    여기서 상기 물질로 처리된 세포에서 sbn 핵산 발현의 보다 큰 감소는 상기 물질이 스태필로코커스 아우레우스 내에서 sbn 핵산의 발현을 억제함을 나타내는 것인, 스태필로코커스 아우레우스 내에서 sbnA, sbnB, sbnC, sbnD, sbnE, sbnF, sbnG, sbnH 및 sbnI 핵산으로 이루어진 군 중에서 선택되는 핵산의 발현을 억제하는 물질을 확인하기 위한 방법.
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