KR20070083578A - 혈액암의 치료방법 및 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 종양-용해성 피코나바이러스 및 혈액암을 갖는 환자를 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 이들은, 환자에게 직접적 또는 간접적으로 투여하는 방법 및 이식 전 자가 이식편 내 악성 세포의 생체 외 퍼징 방법에서, 콕사키바이러스와 같은 피코나바이러스를 사용하는, 골수종의 치료를 위한 방법 및 조성물을 포함한다.
피코나바이러스, 종양-용해, 혈액암, 골수종

Description

혈액암의 치료방법 및 조성물{Methods and compositions for treatment of hematologic cancers}
본 발명은 종양용해성 피코나바이러스 (oncolytic Piconavirus), 및 혈액암을 앓는 환자를 치료하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
혈액암은 "혈액 시스템의" 암이다. 이러한 암은 종종 적혈구 (산소-운반 세포) 보다는 백혈구 (질환 및 감염과 싸우는 세포)에 영향을 끼친다. 이들 암 중 일부는 모든 혈액 세포가 만들어지는 골수에 존재한다. 일부는 백혈구가 유동하는 림프절 및 기타 림프 조직에 존재한다. 백혈구에 대한 일반적인 암은 백혈병, 호킨스 림프종, 기타 림프종 및 다발성 골수종이다.
다발성 골수종 (MM)은 모든 타입의 사람 암 중 약 1%를 차지하는 B-세포암으로써, 골수구 백혈병 또는 호킨스 질환보다 일반적이다.
다발성 골수종은 빈혈, 심각한 골 통증, 일부의 경우 병적 골절, 증가된 감염 위험, 고칼슘혈증 및 신부전을 일으킬 수 있다. 화학요법이 증상 MM에 대해 바람직한 초기 치료이나, 이 질환은 화학요법제에 대해 내성이 매우 크며, 초기에 이 러한 치료에 반응하는 대부분의 환자가 종국에는 재발한다.
암의 진행을 조절하는 새로운 시도는 종양용해성 바이러스를 사용하는 것이다. 종양용해성 바이러스는 정상적인 숙주 세포는 온전하게 남기면서 악성 세포를 선택적으로 파괴 또는 "용해"시킬 수 있는 바이러스이다. 많은 사람의 고형암은 종양용해 활성을 갖는 많은 바이러스에 민감하며, 이들 바이러스 각각은 선택적인 종양용해를 중재할 독특한 생활사를 갖는다. 일부 암에 대해 효과적일 수 있는 3개의 공지된 종양용해성 바이러스에는 레오바이러스 (Alain T, et al. Blood. 2002;100:4146-4153; Thirukkumaran CM, et al. Blood. 2003;102:377-387), 홍역 바이러스 (Grote D, et al. Blood. 2001;97:3746-3754), 및 뉴캐슬병 바이러스 (Schirrmacher V, et al. Int J Oncol. 2001;18:945-952)가 있다.
최근, 일반적인 감기 바이러스인 콕사키바이러스 A21 (Coxsackievirus A21: CVA21)이 면역결핍 마우스 모델에서 사람 흑색종 이종이식편에 대해 효과적인 것으로 밝혀졌다 (Shafren DR, et al. Clin Cancer Res. 2004; 10:53-60). CVA21은 세포 감염을 매개할 부패-촉진 인자 (decay-accelerating factor: DAF) 및 세포 표면 분자 분자간-부착 분자 1 (cell surface molecules intercellular-adhesion molecule 1: ICAM-1)을 선택적으로 이용하는 것으로 공지된 엔테로바이러스이다. 비록 CVA21이 DAF에 결합할 수 있지만, ICAM-1은 세포의 CVA21 감염에 대한 주요 수용체이며, 세포 표면에 ICAM-1의 발현 없이, CVA21은 정상적 조건 하에서는 세포로 투입될 수 없고 숙주 세포의 감염을 달성할 수 없다.
본 발명자는 이전에 ICAM-1을 인식하는 종양용해 바이러스를 사용하는 고형 종양을 치료하는 새로운 방법을 개발한 바 있다 (PCT/AUOO/01461: WO 01/37866, 표제: "환자에 있어서 암을 치료하는 방법 및 이를 이용하는 약학적 조성물(A Method of Treating a Malignancy in a Subject and a Pharmaceutical Composition For Use in Same)"). 다수의 고형 종양 세포 타입에 대해 콕사키바이러스 A 스트레인을 사용함으로써 우수한 치료 효과가 나타났다. 또한, 세포 감염성을 위해 인테그린 α2β1를 인식하는 에코바이러스와 같은 바이러스를 이용하는 포유동물에서의 비정상 세포, 예를 들어 암세포의 치료를 위한 새로운 방법이 본 출원인에 의해 개발되었다 (PCT/AU2003/001688: WO2004/054613, 표제: "환자에 있어서 직접 피코나바이러스-처방된 종양용해를 통하여 암을 치료하는 방법(A method of treating a malignancy in a subject via direct Picornaviral-mediated oncolysis)"). 놀랍게도, 본 발명자는, 가능한 암치료를 확대시키고 보다 효율적인 치료를 제공하는데 있어, 피코나바이러스 분리물이 혈액암에서 종양용해제로서 적합할 수 있다는 것을 밝혀내었다.
발명의 요지
제1 양상으로, 본 발명은 암의 적어도 일부의 세포가 바이러스성 종양용해를 겪도록 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
제2 양상으로, 본 발명은 암의 적어도 일부의 세포가 바이러스성 종양용해를 겪도록 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 다발성 골수종, B 세포 림프종, B 프로림프구성 백혈병 및 단핵구성 백혈병으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 형태에서, 환자는 사람이다.
공지의 분류된 피코나바이러스 및 미분류된 피코나바이러스를 포함한 어떠한 피코나바이러스도 피코나바이러스로 사용될 수 있다. 바람직하게는 피코나 바이러스는 프로토타입 및 임상적으로 분리된 스트레인으로 구성된 그룹 중에서 선택된다. 하나의 바람직한 방법에서, 피코나바이러스는 콕사키바이러스 (Coxsackievirus), 에코바이러스 (Echovirus), 폴리오바이러스 (Poliovirus) 및 미분류된 엔테로바이러스를 포함한 엔테로바이러스, 또는 리노바이러스 (Rhinovirus), 파라에코바이러스 (Paraechovirus), 헤파토바이러스 (Hepatovirus), 카디오바이러스 (Cardiovirus), 아프토바이러스(Aphthovirus), 에보바이러스 (Erbovirus), 코보바이러스 (Kobovirus) 및 테스코바이러스 (Teschovirus)를 포함할 수 있는 다른 속의 피코나바이러스이다.
바람직한 형태에서, 피코나바이러스는 콕사키바이러스이다. 바람직하게는, 콕사키 A 그룹 바이러스는 CVA13, CVA15, CVA18, CVA20, CVA21, 이의 변형 형태 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹 중에서 선택된다. 보다 바람직하게는, 콕사키 A 그룹은 CVA13, CVA15, CVA18, CVA20 또는 CVA21 중에서 선택된다.
바람직한 양태에서, 콕사키 A 그룹 바이러스는 CVA15 또는 CVA21이다. 바람 직하게는. 콕사키 A 그룹 바이러스는 CVA15이다. 보다 바람직하게는, CVA15는 G-9이다.
또 다른 바람직한 형태에서, 콕사키 A 그룹 바이러스는 CVA21이다. 보다 바람직하게는, CVA21은 쿠이켄달 (Kuykendall) 스트레인이다.
본원에 사용되는 용어 '혈액암'은 비고형 종양, 예를 들어 백혈병, 다발성 골수종, 호킨스 질환, 비-호킨스질환, 척수형성이상, 및 림프종, 예를 들어 B 세포 림프종을 포함한다. 백혈병의 예는, 이로 제한됨이 없이, 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 및 림프구성 백혈병 (CLL), B 프로림프구성 백혈병 및 단핵구성 백혈병을 포함한다. 바람직한 형태에서, 혈액암은 다발성 골수암이다.
바람직한 형태에서, 혈액암은 하나 이상의 화학요법제(들)에 내성이거나 이러한 세포를 포함한다.
바람직한 형태에서, 피코나바이러스는 임의의 적합한 방식으로 사람 환자에게 투여된다. 예를 들어, 바이러스는 정맥내, 종양내, 복강내, 근육내, 안내, 피하, 경구, 국소 또는 자가 줄기 세포 이식 전 자가 이식편의 악성 세포를 생체 외 퍼징하여 투여될 수 있다. 하나의 형태에서, 상기 방법은 예를 들어 MGUS의 예방적 치료를 포함한다. 하나의 형태에서, 상기 방법은 혈액암, 예를 들어 다발성 골수종에 대한 전신적 항종양제를 포함한다. 하나의 형태에서, 상기 방법은 이식 전 자가 이식편의 악성 세포를 생체 외 퍼징하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 자가 이식편은 조혈 줄기 세포를 포함한다.
바람직한 형태에서, 바이러스 투여량 범위는 약 0.01 내지 약 1000 감염성 바이러스 단위/세포일 수 있다.
하나의 바람직한 형태에서, 바이러스는 유효량의 화학요법제와 배합하여 환자에 투여될 수 있다.
또 다른 바람직한 형태에서, 바이러스는 유효량의 프로바이오틱 제제와 배합하여 환자에게 투여될 수 있다.
혈액암 세포는 바이러스-세포 투입 수용체 분자 세포간 부착 분자-1 (intercellular adhesion molecule-1: ICAM-1) 및/또는 부패-촉진 인자 (decay-accelerating factor: DAF)를 과발현할 수 있다.
혈액암 세포는 NF-κB를 구성적으로 발현할 수 있다.
제3 양상으로, 본 발명은 암의 적어도 일부의 세포가 바이러스에 의해 죽도록 피코나바이러스로부터 유래되는 핵산 분자 또는 이의 변형 형태의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
핵산 분자는 바이러스로부터의 단쇄 RNA 또는 상보적 DNA일 수 있다.
바람직한 형태에서, 피코나바이러스는 콕사키바이러스이다. 바람직하게는, 콕사키바이러스는 타입 A이다. 보다 바람직하게는, 콕사키바이러스 A21 (CVA21)이다. 바람직하게는, CVA21은 쿠이켄달 스트레인이다.
제4 양상으로, 본 발명은 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 유효량을 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 제약학적 조성물을 제공한다.
제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체는 당업자에게 널리 공지되며, 이로 제한됨이 없이, 치료제의 투여를 위한 비히클로서 사용될 수 있는 임의 불활성 물질을 포함한다. 바람직한 형태에서, 제약학적으로 허용되는 담체는 리포좀일 수 있다
제5 양상으로, 본 발명은 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스로부터 유래되는 핵산 분자 또는 이의 변형 형태의 유효량을 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 제약학적 조성물을 제공한다.
바람직한 형태에서, 제약학적 조성물은 또한 특정 종양 마커에 결합하는 단일클론 항체를 포함할 수 있는 리포좀을 추가로 포함하며, 이는 핵산-리포좀 컴플렉스의 표적화를 가능하게 한다.
제6 양상으로, 본 발명은 암세포의 적어도 일부가 바이러스성 종양용해를 겪도록 본 발명의 제3 및 제4 양상에 따른 제약학적 조성물의 치료학적 유효량을 투여함을 포함하여, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법을 제공한다.
제7 양상으로, 본 발명은 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법에서 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제와 함께 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 이용을 제공한다.
제8 양상으로, 본 발명은 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법에서 제약학적으로 허용되는 부형제 또는 희석제와 함께 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스로부터 유래되는 핵산 분자 또는 이의 변형 형태의 이용을 제공한다.
제9 양상으로, 본 발명은 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조에 있어 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 이용을 제공한다.
제10 양상으로, 본 발명은 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 약물의 제조에 있어 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스로부터 유래되는 핵산 분자 또는 이의 변형 형태의 이용을 제공한다.
제11 양상으로, 본 발명은 암의 적어도 일부의 세포가 바이러스성 종양용해를 겪도록 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 치료학적 유효량으로 포유동물의 세포를 감염시킴을 포함하여, 혈액 종양 또는 암 세포에 대해 포유동물의 면역 반응을 유도하는 방법을 제공한다.
본원 명세서를 통해, 달리 언급이 없는 한, 용어 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형 형태는, 임의 다른 요소, 정수 또는 단계, 또는 요소, 정수 또는 단계의 그룹을 제외함이 없이, 이들을 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본원 명세서에 포함된 문헌, 행위, 물질, 디바이스, 제품 등에 대한 어떠한 기술도, 단지 본 발명에 대한 설명을 목적으로 제공된다. 이들 소재 중 임의의 것 또는 모두가, 본원의 우선일 전 본원과 관련된, 선행 기술의 기초 중 일부를 형성하거나 호주 또는 기타 지역의 기술 분야에서 일반적인 지식을 형성한다는 것을 인정하려는 것이 아니다.
본원 발명이 보다 정확히 이해될 수 있도록 하기 위해, 하기 도면 및 실시예를 참조로 하여 바람직한 형태가 기술될 것이다.
약어
본원에 사용된 용어 "MM"는 다발성 골수종에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "CVA"는 콕사키 A 그룹에 대해 사용된다. 예를 들어, CVA21은 콕사키바이러스 A21에 대한 약어이다. 당 기술 분야의 문헌에서는 다양하게 약어 "CAV" 및 "CVA" 콕사키 A 그룹 바이러스를 사용하며, 본 발명의 목적 상 이들 약어가 동일한 유기체를 언급하며 서로 교환가능하다는 것을 알 것이다.
본원에 사용된 용어 "MOI"는 감염의 다중성에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "MGUS"는 미지의 단일클론 감마글로불린병증에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "BM"은 골수에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "CFU-GM"은 콜로니 형성 단위 과립구/대식구에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "MTT 검정"은 화합물 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨브로마이드를 사용하는 마이크로배양 테트라졸륨 검정에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "PI"는 요오드화 프로피디움에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "PBMC"는 말초혈 단핵구에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "BMSC" 골수 간질 세포에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "mAb"는 단일클론 항체에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "TCID50"는 조직 배양 감염 용량의 50 %에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "PFU"는 플라크 형성 단위에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "CPE"는 세포변성 효과에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "ICAM-1"은 세포간-부착 분자 1에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "DAF"는 부패-촉진 인자에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "kb" 킬로염기에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "DNA"는 데옥시리보핵산에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "RNA"는 리보핵산에 대해 사용된다.
본원에 사용된 용어 "ELISA"는 효소-결합된 면역흡착 검정에 대해 사용된다.
도 1은 다발성 골수종 세포주에 대한 ICAM-1 및 DAF의 유동 세포측정 분석을 나타낸다.
다발성 골수종 세포주 RPMI-8226, U266 및 NCI-H929 세포 및 정상 PBMC를 항-ICAM-1 및 항-DAF mAb로 이중 염색하였다. 항-ICAM-1 mAb는 FITC와 직접적으로 접합되었으며, 항-DAF mAb는 PE에 결합된 제2 접합체를 통해 간접적으로 염색되었 다.
도 2는 다발성 골수종 세포주에 대한 CVA21의 세포변성 효과를 나타낸다. 다발성 골수종 세포주 및 정상 PBMC에 대한 세포변성 효과를 평가하기 위해, 6-웰 플레이트 중의 RPMI-8226, U266, NCI-H929 및 PBMC 배양물을 37 ℃에서 48시간 동안 CVA21의 존재 또는 부재 하에 인큐베이션하였다 (MOI 약 1). 세포 상등액을 각각의 웰로부터 조심스럽게 흡출하고, 세포를 0.01 % 트립판 블루 용액으로 염색하였다. CVA21 감염에 의해 파괴된 비생존 세포는 트립판 블루로 양성적으로 염색되는 한편, 생존 세포는 염색되지 않았다. 현미경 사진은 100배 확대한 것이다.
도 3은 MMT 검정을 이용한 MM 세포주 및 정상 PBMC에 대한 종양용해 작용을 나타낸다.
MM 세포주 RPMI-8226, U266 및 NCI-H929 및 정상 PBMC는 48시간 동안 연속적 CVA21에 대해 상이한 민감성을 나타낸다. 에러 바는 그룹당 4중 웰의 평균의 표준편차를 나타낸다.
도 4는 다발성 골수종 세포주의 감염 후 CVA21 생성을 나타낸다.
24시간 및 48시간 동안 CVA21로 감염시킨 후 감염성 바이러스 입자를 수득하기 위한 MM 세포주 NCI-H929, U266 및 RPMI-8226의 능력을 나타낸다. 약 1 MOI의 CVA21로 감염시킨 후, 정상 PBMC와는 반대로, 각각의 다발성 골수종 세포에서 바이러스의 증가가 검출될 수 있다.
도 5는 다발성 골수종 세포에서 CVA21의 바이러스 성장 곡선을 나타낸다. 동시적 감염 (MOI 약 1) 후 U266 (●), NCI-H929 (o) 및 RPMI-8226 (▼) 세포주에 서의 CVA21의 바이러스 성장 곡선 및 지시된 시간 간격에서의 바이러스 생성물을 나타낸다. 시료의 적정을 삼중으로 수행하였으며, 각각의 시점에서의 평균적 바이러스 생성량을 플로팅하였다.
도 6은 CVA21로 감염된 RPMI-8226, NCI-H929, 및 U266 세포에서의 DNA 분절화에 대한 분석을 나타낸다.
RPMI-8226, NCI-H929, 및 U266 세포를 CVA21 (MOI 약 10 TClD50/세포)로 24시간 동안 감염시켰다. 총 DNA를 감염된 세포 및 비감염된 세포로부터 추출하고, 분절화를 아가로즈 겔 전기영동으로 평가하였다. 골수종 세포주 RPMI-8226 (레인 1 및 2), NCI-H929 (레인 3 및 4) 및 U266 (레인 5 및 6)로부터의 DNA 시료가 나타나 있다. 레인 "M"은 1 kb DNA 래더를 포함한다. 배지 단독에서 배양된 MM 세포주로부터 추출된 DNA는 레인 1, 3 및 5에 나타나 있으며, 레인 2, 4 및 6은 CVA21로 처리된 세포주로부터 추출된 세포 DNA를 포함한다.
도 7은 PBMC를 갖는 혼합물로부터 다발성 골수종 세포의 생체 외 퍼징을 나타낸다.
정상 PBMC와 다발성 골수종 세포 RPMI-8226 및 U266의 혼합물을 함께 배양하고, 3일 동안 CVA21로 감염시켜 다발성 골수종 퍼징의 효율을 평가하였다. 생존 골수종 세포 (CD138+/PI-) 및 PBMC (CD138-/PI-)를 유동 세포측정법으로 평가하였다. 퍼징된 ("CVA21") 시료 및 퍼징되지 않은 ("바이러스 부재") 시료의 유동 세포측정 플롯을 RPMI-8226 및 U266 세포주 모두에 대해 나타내었다.
도 8은 임상적 다발적 골수종 시료에 대한 ICAM-1 발현의 분석 및 CVA21의 성장 억제를 나타낸다.
(A) 환자의 골수 흡출물을 다발성 골수종 환자 (임상 시료 #001)로부터 입수하여 처리함으로써 단일 세포 현탁액을 수득하였다. 세포를 항-CD138 및 항-ICAM-1 항체로 염색하였다. ICAM-1 발현에 대해 양성인 골수종 세포는 도트 플롯의 우측 상단에 나타나 있다 (CD138+/ICAM-1+). 원발성 종양 시료의 세포 약 37 %가 CD138+ 혈장 세포로 구성된다.
(B) 이어서, 환자로부터의 임상 골수 세포를 다양한 농도의 CVA21로 감염시키고, 암세포 성장 억제를 MTT 검정으로 평가하였다. 그래프는 시료 #001에 대해 상이한 투입량의 바이러스에서의 세포 생존율 (%)을 나타낸다.
도 9는 임상 골수 시료로부터의 다발성 골수종 혈장 세포를 퍼징하는 CVA21의 능력을 나타낸다.
(A) 환자 #001로부터의 골수 시료를 바이러스 부재, 약 2.75 TCID50/세포, 약 5.5 TCID50/세포 또는 약 11 TCID50/세포와 함께 인큐베이션하고, 유동 세포측정으로 분석하기 전 72시간 동안 인큐베이션하여 생존 골수종 세포의 비율 (%)을 평가하였다. 세포를 요오드화 프로피디움 및 항-CD138-FITC 항체로 이중 염색하였다. 상이한 농도의 바이러스로 퍼징한 후 생존 골수종 세포는 각각의 도트 플롯의 우측 하단에서 볼 수 있다 ((CD138+/PI-).
(B) 48시간 동안 0, 약 2.75 및 약 5.5 TCID50/세포로 감염된 CVA21 감염된 원발성 종양 시료의 현미경사진을 나타낸다. 바이러스 부재의 대조군과 비교하여, 2가지 바이러스로 처리된 시료에서 세포 응괴를 볼 수 있다 (40배 확대).
(C) 상기한 유동 세포측정 자료로부터 계산된, 상이한 농도의 바이러스로 챌린지한 후의 생존 골수종 세포의 비율 (%)을 나타낸다.
도 10은 CVA21이 MM 및 MGUS BM으로부터의 혈장 세포를 선택적으로 퍼징한다는 것을 나타낸다.
(A) CD138+ 세포에서의 ICAM-1 발현을 나타낸다. 항-CD138 및 항-ICAM-1으로 염색한 후 환자 #005로부터의 대표적인 도트 플롯을 나타낸다.
(B)(i) 재발 MM (#001, #002 및 #008), 부분적으로 완화된 MM (#003); 미지의 단일클론 감마글로불린병증 (MGUS) (#004, #006) 및 진단된 MM (#007)를 갖는 환자로부터의 BM 시료의 시험관 내 감염 및 사멸을 나타낸다. 7명의 환자로부터의 BM 시료를 0 (모의: mock), 3 또는 10 TCID5O/세포 MOI의 CVA21로 시험관 내 감염시켰다. 감염시킨지 48시간 후 시료를 수집하고, CD138에 대한 염색 후 유동 세포측정법으로 분석하였다. 시료 당 10,000개 사건을 기록하였다: CD138 양성인 생존 세포의 비율 (%)을 나타내었다.
(B) (ii) 표 1에 나타낸 바와 같은 조건을 갖는 총 19개의 임상 시료에 대한 축적된 결과를 나타낸다.
(C) BM 전구세포 (progenitor)는 CVA21에 내성이다. 48시간 동안 0 (mock), 3 및 10 TCID50/세포 MOI의 CVA21로 감염된 3개의 BM 시료로부터의 잔류 세포 (약 10,000개 세포)를 3 ml의 MethoCult GF4434 완전 메틸셀룰로즈 배양 배지 (Stem Cell Technologies, Vancouver, Canada) 중에서 배양하였다. CFU-GM 배양을 6-웰 플레이트의 웰에서 수행하고 37 ℃, 5% CO2에서 14일 동안 인큐베이션하였다. CFU-GM을 도립현미경을 사용하여 20개 이상 세포의 과립구 및/또는 대식구로 이루어진 콜로니로서 등급을 매겼다. 각각의 농도의 CVA21로 감염시킨 후 콜로니의 평균수가 나타나 있다. 에러 바는 3개 시료의 평균치의 표준편차를 나타낸다. 플레이팅된 1 x 104개 세포에 대한 콜로니의 수를 나타낸다. CFU-GM는 콜로니 형성 단위 과립구/대식구이다.
(D) PBMC (CD138-) 집단은 유동 세포측정법으로 평가 시 CVA21 퍼징 후 여전히 생존하였다. (B)(i)에서 상술된 7명의 환자의 BM 시료의 감염 후, CD138- 세포를 정량화하였다. 이 집단은 CVA21 감염 후 비교적 변화되지 않았다.
(E) 도 10B(ii)에서 상술된 바와 같이 환자로부터의 BM 시료의 시험관 내 감염 및 사멸을 나타낸다. 결과는 CD138+ 세포의 감소율 (%)로 나타내었다.
도 11 (A 및 B)는 B 세포 림프종, B 프로림프구 백혈병, 급성 프로골수구 백혈병 (APML), 단핵구성 백혈병 및 다발성 골수종 세포주에 대한 ICAM-1 및 DAF의 유동 세포측정 분석을 나타낸다.
(A) B 세포 림프종 세포주 SCOTT, B 프로림프구성 백혈병 세포주 JVM13, 급 성 프로골수구 백혈병 (APML) 세포주 NB4 및 (B) HL-60, 단핵구성 백혈병 세포주 U937 및 다발성 골수종 세포주 H929를 항-ICAM-1 및 항-DAF mAb로 이중 염색하였다. 항-ICAM-1 mAb는 FITC와 직접적으로 접합시키고, 항-DAF mAb는 PE에 결합된 제2 접합체를 통해 간접적으로 염색하였다.
도 12는 MMT 검정을 이용하여 선택된 혈액암 세포주에 대한 CVA21, CVA18, CVA15 및 CVA13의 종양용해 작용을 나타낸다.
(A) MM 세포주 RPMI-8226, (B) 단핵구성 백혈병 세포주 U937 및 (C) 급성 프로골수구 백혈병 (APML) 세포주 HL-60은 48시간 동안 나타낸 바와 같이 연속적 바이러스에 대해 차등 민감성을 나타내었다.
도 13은 선택된 혈액암 세포주에 대한 감염 후 CVA21의 생성을 나타낸다.
24시간 및 48시간 동안 CVA21로 감염시킨 후 감염성 바이러스 입자를 수득하기 위한 (◇) MM 세포주 RPMI-8226, (□) 단핵구성 백혈병 세포주 U937 및 (Δ) 급성 프로골수구 백혈병 (APML) 세포주 HL-60의 능력을 나타낸다. 약 10 TCID50/세포의 CVA21로 감염시킨 후, MM 세포주 RPMI-8226에서만 바이러스의 증가가 검출되었다.
일부 천연 발생 피코나바이러스 및 기타 바이러스, 예를 들어 레오바이러스가 제한된 타입의 암 치료에 사용하기에 적합한 것으로 공지되었지만, 여전히 개선된 치료법을 개발할 필요가 있다.
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명자는 피코나바이러스가 혈액 종양 또는 암을 용해적으로 감염시킬 수 있다는 것을 밝혀내었다. "민감한" 세포는 세포변성 효과, 바이러스 단백질 합성, 및/또는 바이러스 생산의 유도를 보인 세포이다.
이러한 발견에 기초하여, 본 발명자는 포유동물에서 혈액암의 치료 및/또는 예방을 위한 방법 및 조성물을 계발하였다. 포유동물은 본 발명에 따른 처치를 필요로 하는 임의의 포유동물일 수 있다. 포유동물은 사람 또는, 이로 제한됨이 없이, 마우스, 개, 고양이, 양, 염소, 소 (cow), 말, 돼지, 비-사람 영장류를 포함한, 사회적, 경제적 또는 연구에 중요한 임의의 종의 개체일 수 있다. 바람직한 양태에서, 포유동물은 사람이다.
세포의 죽음은 통상적으로 바이러스에 의한 세포의 감염으로부터 발생할 것이며, 바이러스의 세포 내 복제에 의한 세포의 용해 또는 세포의 카스파제의 활성화의 결과일 수 있는 아폽토시스 (apoptosis)를 유도하는 감염에 의해 발생될 수 있다. 일단 용해가 일어나면, 감염된 세포의 세포용해 내용물은 파괴된 혈장막으로부터 흘러나올 수 있으며 비정상적 세포에 대한 면역반응을 유도할 수 있는 세포 표면 항원을 포함한 항원이 방출될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 포유동물에서 혈액 종양 또는 암세포의 처치는 이러한 세포에 대한 포유동물의 면역성을 증강시킬 수 있다.
피코나 바이러스는 공지의 분류된 피코나바이러스 및 아직 미분류된 피코나바이러스를 포함한 임의의 피코나바이러스일 수 있다. 피코나바이러스는 원형 (prototype) 및 임상적으로 분리된 모두로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다. 사람 피코나바이러스의 대표적인 타입은 엔테로바이러스, 콕사키바이러스, 에코바이러스, 폴리오바이러스, 및 미분류된 엔테로바이러스, 리노바이러스, 파라에코바이러스, 해파토바이러스, 및 카디오바이러스를 포함한다. 하나의 바람직한 방법에서, 피코나바이러스는 콕사키바이러스, 에코바이러스, 폴리오바이러스 및 미분류 엔테로바이러스를 포함한 엔테로바이러스, 또는 리노바이러스, 파라에코바이러스, 해파토바이러스, 카디오바이러스, 아프토바이러스, 에보바이러스, 코보바이러스 및 테스코바이러스를 포함할 수 있는 피코나바이러스의 다른 속으로부터 것이다. 바람직한 형태에서, 피코나바이러스는 콕사키바이러스이다. 바람직하게는, 콕사키바이러스는 타입 A, 보다 바람직하게는 콕사키바이러스 A21이다.
바람직하게는, 바이러스는 콕사키 A-그룹 바이러스 중에서 선택될 수 있다. CVA21이 바람직하고, 특히 CVA21 (쿠이켄달) (Sickles G.M., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 102:742; Shafren D. et al J. Virol 1997, 71:4736; Hughes et al, J. Gen Virol. 1989, 70:2943; Schmidt, NJ., et al, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 1961, 107:63)이다. CVA21 (쿠이켄달)는 ATCC (the American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, United States of America)로부터 수탁번호 제VR-850호로 입수가능하다. 또한, 다른 바람직한 콕사키 A-그룹 바이러스도 ATCC로부터 입수가능하며, CVA13 (수탁번호 제VR-171호), CVA15, 특히 G-9 (수탁번호 제VR-1021호) 및 CVA18 (수탁번호 제VR-1024호 및 제VR-176호)를 포함한다.
피코나바이러스는 천연 발생적이거나 변형될 수 있다. 피코나바이러스는 자연으로부터 분리될 수 있는 경우 "천연발생적"이며, 실험실에서 사람에 의해 의도적으로 변형된 바 없다. 예를 들어, 피코나바이러스는 "필드 공급원", 즉 사람 환자로부터 수득될 수 있다.
피코나바이러스는 변형될 수 있으나 여전히 혈액 종양 또는 암을 용해적으로 감염시킬 수 있다.
바람직하게는, 본원에 기술된 방법 또는 조성물에 사용되는 피코나바이러스는 수용 환자에서 바이러스감염에 대해 소수의 임상적 증상을 일으키거나 단지 미미한 임상적 증상을 일으킬 것이다.
피코나바이러스는 상이한 항원 결정자를 포함하여 피코나바이러스 서브타입의 사전 노출된 포유동물에 의한 면역반응을 감소시키거나 예방하도록 상이한 병원성 표현형을 갖는 2개 이상의 타입의 피코나바이러스부터의 재조합 피코나바이러스일 수 있다.
본 발명의 방법에서 피코나바이러스는 각각의 환자의 혈액 종양 또는 암에 투여될 수 있다. 피코나바이러스, 예를 들어 상이한 종의 동물로부터의 콕사키바이러스의 상이한 혈청형 및/또는 상이한 스트레인 및/또는 상이한 종 및/또는 상이한 속의 배합물이 사용될 수 있다. 필요한 경우, 피코나바이러스는 신생물에 투여하기 전 화학적으로 또는 생화학적으로 예비처리 (예를 들어, 프로테아제, 예를 들어 키모트립신 또는 트립신을 사용한 처리)될 수 있다. 이러한 예비처리는 바이러스의 외부 코트를 제거시킴으로써 바이러스의 감염성을 높일 수 있다.
피코나바이러스는 다른 치료제와 함께 배합하여 투여되거나 사용될 수 있다. 예를 들어, 피코나바이러스는 피코나바이러스의 하나 이상의 상이한 스트레인(들) 또는 혈청형(들) 또는 종 또는 속과 함께 투여될 수 있다. 피코나바이러스의 추가의 스트레인(들) 또는 혈청형(들) 또는 종 및 속은 세포 감염에 대해 본 발명의 피코나바이러스와 동일하거나 상이한 수용체 요구조건을 가질 수 있다.
추가의 예로써, 피코나바이러스 또는 이의 배합물은 처치될 개체에서 면역 반응을 조절 또는 억제할 수 있는 하나 이상의 제제와 배합하여 투여될 수 있다. 이러한 방식으로, 바이러스 감염에 대한 개체의 천연 면역 반응이 변형되어, 바람직하게는 보다 유효한 바이러스 감염 및/또는 종양용해 및/또는 치료 결과를 가능하게 할 수 있다. 통상적으로, 면역 반응을 변형시킬 수 있는 제제는 면역 반응을 억제시킬 수 있는 제제이다. 개체, 예를 들어 사람 개체에서 면역 반응을 조절 또는 억제할 수 있는 제제는, 예를 들어 문헌 (The Merck Index, Thirteenth Edition, Merck & Co. Inc, Whitehouse Station, NJ, USA., 이의 내용이 본원에 참조로 삽입됨)에 기술되어 있다.
피코나바이러스 또는 이의 배합물은, 또한 항신생물제로도 언급되는 하나 이상의 화학요법제와 함께 배합하여 사용될 수 있다. 항신생물제는, 예를 들어 문헌 (The Merck Index, Thirteenth Edition, Merck & Co. Inc, Whitehouse Station, NJ, USA)에 기술되어 있다. 예를 들어, 피코나바이러스는 화학요법제, 예를 들어 아드리아마이신, 탁솔, 플루오로우라실, 멜팔란, 시스플라틴, 알파 인터페론, COMP (사이클로포스파미드, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 프레드니손), 에토포시드, mBACOD (메톡트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파미드, 빈크리스틴 및 덱사메타손), PROMACE/MOPP (프레드니손, 메토트렉세이트 (w/루이코빈 구조), 독소루비신, 사이클로포스파미드, 탁솔, 에토포시드/메클로에타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 안지오인히빈, TNP-470, 펜토산 폴리설페이트, 혈소판 인자 4, 안지오스타틴, LM-609, SU-101, CM-101, 테크갈란 (Techgalan), 탈리도미드, SP-PG 등과 함께 투여될 수 있다. 다른 화학요법제는 알킬화제, 예를 들어 질소 머스타드 (메클로에타민, 멜판, 클로람부실, 사이클로포스파미드 및 이포스파미드를 포함); 니트로소우레아 (카르무스틴, 로무스틴, 세무스틴 및 스트렙토조신을 포함); 알킬 설포네이트 (부술판을 포함); 트리아진 (다카바진을 포함); 에티엔이민 (티오테파 및 헥사메틸멜라민을 포함); 폴산 유도체 (메토트렉세이트를 포함); 피리미딘 동족체 (5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드를 포함); 퓨린 동족체 (6-머캅토퓨린 및 6-티오구아닌을 포함); 항종양 항생제 (악티노마이신 D를 포함); 안트라사이클린 (독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신 C 및 메트라마이신을 포함); 호르몬 및 호르몬 길항제 (타목시펜 및 코르티오스테로이드 및 시스플라틴 및 브레키나르를 포함한 기타 제제를 포함)를 포함한다. 피코나바이러스는, 예를 들어 흑색종의 치료를 위해, 하나 이상의 블레오마이신, 빈데신, 빈크리스틴, 닥타마이신, 프로카바진, 로무스틴 또는 다카바진과 배합하여 사용될 수 있다. 피코나바이러스는, 예를 들어 난소암의 치료를 위해, 하나 이상의 시스플라틴 및 카보플라틴과 배합하여 사용될 수 있다. 예를 들어 유방암의 치료를 위해 피코나바이러스와 배합하여 사용될 수 있는 화학요법제에 대한 추가의 예는, 사이클로포스파미드 (시톡산), 메토트렉세이트 (아메토프테린, 멕세이트, 폴렉스), 및 플루오로우라실 (플루오로우라실, 5-FU, 아드루실) [약어 CMF]; 사이클로포스파미드, 독소루비신 (아드리아마이신), 및 플루오로우라실 [약어 CAF]; 독소루비신 (아드리아마이신) 및 사이클로포스파미드 [약어 AC]; 독소루비신 (아드리아마이신) 및 사이클로포스파미드 + 파클리탁셀 (탁솔); 독소루비신 (아드리아마이신)에 이어 CMF; 사이클로포스파미드, 에피루비신 (엘렌스), 및 플루오로우라실을 포함한다. 유방암을 갖는 여성을 치료하기 위해 사용되는 다른 화학요법 약물은, 예를 들어 독세탁셀 (탁소테레), 비노렐빈 (나벨빈), 겜시타빈 (겜자), 및 카페시타빈 (젤로다)를 포함한다.
피코나바이러스 또는 이의 배합물은 혈액암의 치료를 위해 공지의 치료제와 배합하여, 예를 들어 탈리도미드, 프로테오좀 억제제 및 아르센산 트리옥사이드와 함께 흑색종의 치료를 위해 사용될 수 있다.
하나 이상의 추가의 제제, 예를 들어 하나 이상의 추가의 피코나바이러스, 면역 반응을 조절 또는 자극할 수 있는 하나 이상의 제제, 또는 하나 이상의 항신생물제와 함께 "배합하여" 사용 또는 투여된다는 것은, 피코나바이러스 및 추가의 제제 (들)이 치료 효과, 예를 들어 중복되는 일시적 효과를 갖는 방식으로 사용 또는 투여되는 것을 의미하는 것으로 이해될 것이다. 배합물의 구성원은 동시에 또는 목적하는 치료 효과를 제공하는 임의의 순서로 개별적으로 투여될 수 있다. 배합 치료를 고려하는 경우, 피코나바이러스 및 추가의 제제(들)은 물리적인 혼합물이거나, 별도로, 예를 들어 투여를 위한 설명서의 존재 또는 부재하에 키트 형태로 제공될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 방법을 수행하기 위해 필요하거나 바람직한 다른 성분들, 예를 들어 완충물 및/또는 희석물을 포함할 수 있다. 키트는 통상적으로 다양한 성분들을 하우징하기 위한 용기 및 본 발명의 방법으로 키트 성분들을 사용하기 위한 설명서를 포함한다.
본 발명의 제약학적 조성물은 하나 이상의 추가적인 치료학적 제제(들)과 함께 물리적으로 혼합된 피코나바이러스의 조성물 뿐만 아니라 유일한 치료학적 활성제로서 피코나바이러스를 포함하는 조성물을 포함한다는 것을 알 수 있을 것이다.
피코나바이러스는 유효량의 프로바이오틱 제제와 배합하여 투여될 수 있다. 프로바이오틱 제제는, 이로 제한됨이 없이, 락토바실루스 아시도필루스 (Lactobacillus acidophilus), 엘. 가세리 (L. gasseri ), 엘 코푸수스 (L. confusus ), 스트렙토코쿠스 테르모필루스 ( Streptococcus thermophilus ), 비피도박테리움 브레베 ( Bifidobacterium breve ) 및 비. 롱검 (B. longum )을 포함할 수 있다.
혈액암, 예를 들어 백혈별, 림프종 및 골수종은 골수 세포 또는 림프 조직으로부터 발생하는 암이다. 혈액암은 고형 종양으로 성장하거나 백혈병과 같이 혈액에서 발생하는 분리된 세포로서 성장할 수 있다.
통상적으로, 혈액암 세포의 적어도 일부는 ICAM-1 및/또는 DAF를 발현한다. 통상적으로, 혈액암 세포의 적어도 일부는 비-악성 세포와 비교하여 ICAM-1 및/또는 DAF를 과발현한다. 본 발명의 방법에 의한 치료에 특히 민감한 혈액 종양 또는 암은 백혈병, 다발성 골수종, 호킨스 질환, 비-호킨스 질환, 골수이상, 및 림프종을 포함한다. 백혈병의 예는, 이로 제한됨이 없이, 만성적 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병 (ALL), 만성 및 림프구성 백혈병 (CLL)을 포함한다.
피코나바이러스는 통상적으로 생리학적으로 허용되는 담체 또는 비히클, 예를 들어 포스페이트-완충된 염수로 혈액암에 투여된다. "혈액암에 투여"란 피코나바이러스가 혈액암의 세포와 접촉하도록 투여된다는 것을 나타낸다. 피코나바이러스가 투여되는 경로 및 제형, 담체 또는 비히클은 신생물의 위치 및 타입에 의존할 것이다. 다양한 투여 경로가 이용될 수 있다. 예를 들어, 접근가능한 고형 신생물에 대해, 피코나바이러스는 신생물에 직접적으로 투여될 수 있다. 혈액 신생물에 대해서, 예를 들어 피코나바이러스는 전형적으로 정맥 내 또는 혈관 내로 투여될 수 있다. 예를 들어, 정맥 내 전달은 예를 들어 점적주입을 이용하여 정맥 시스템에 느린 주입을 통해 또는 단일 또는 다수의 볼루스 투여 주사를 통해 투여될 수 있다. 신체 내에 쉽게 접근가능하지 않은 신생물, 예를 들어 전이 또는 뇌 종양에 대해서는, 포유동물의 신체를 통해 전신적으로 수송되어 신생물에 도달되도록 (예: 격막내, 정맥내 또는 근육내로) 투여된다. 달리는, 피코나바이러스는 단일의 고형 신생물에 직접적으로 투여될 수 있으며, 이 경우 피코나바이러스는 신체를 통해 전이물로 전신적으로 운반된다. 또한, 피코나바이러스는 피하, 복강내, 국소적, 경구적, 직장으로, 질로, 비강으로 또는 흡입 분무로 투여될 수 있다.
일반적으로, 적합한 조성물은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조될 수 있으며, 따라서, 제약학적으로 허용되는 담체, 희석제 및/또는 보조제를 포함할 수 있다.
조성물은 표준 경로에 의해 투여될 수 있다. 일반적으로, 조성물은 비경구 (예: 정맥내, 척추내, 피하 또는 근육내), 경구 또는 국소 경로로 투여될 수 있다. 보다 바람직하게는, 투여는 비경구 경로에 의한다.
담체, 희석제 및 보조제는 조성물의 다른 성분과 조화되고 수령자에게 해롭지 않다는 점에서 "허용적"이어야 한다.
제약학적으로 허용되는 담체 또는 희석제는, 예를 들어 탈염수 또는 증류수; 염수 용액; 식물성 기재유, 예를 들어 낙화생유 (peanut oil), 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수유, 참깨유, 아라키스유 (arachis oil) 또는 코코넛유; 실리콘유 (폴리실록산 포함), 예를 들어 메틸 폴리실록산, 페닐 폴리실록산 및 메틸페닐 폴리실록산; 휘발성 실리콘; 광유, 예를 들어 액체 파라핀, 연성 파라핀 또는 스쿠알란; 셀룰로즈 유도체, 예를 들어 메틸 셀룰로즈, 에틸 셀룰로즈, 카복시메틸셀룰로즈, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈 또는 히드록시프로필메틸셀룰로즈; 저급 알칸올, 예를 들어 에탄올 또는 이소프로판올; 저급 아르알칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르, 예를 들어 이소프로필 팔미테이트, 이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레에이트; 폴리비닐피롤리돈; 아가; 트라가칸트 검 또는 아카시이 검, 및 바셀린을 포함한다. 전형적으로, 담체는 조성물의 10 % 내지 99.9 %를 형성할 것이다.
조성물은 주사에 의한 투여에 적합한 형태, 경구 섭취에 적합한 제형의 형태 (예를 들어, 캡슐제, 정제, 캐플릿, 엑리서제), 국소 투여에 적합한 연고, 크림 또는 로션의 형태, 안 점액으로 전달하기에 적합한 형태, 흡입, 예를 들어 비강내 흡입 또는 경구 흡입에 의한 투여에 적합한 에어로졸 형태, 비경구 투여, 즉 피하, 근육내 또는 정맥내 투여에 적합한 형태일 수 있다.
주사 용액 또는 현탁물로 투여하기 위한, 무독성의 비경구적으로 허용되는 희석제 또는 담체는, 링거 용액, 등장염수, 포스페이트 완충 염수, 에탄올 및 1,2-프로필 글리콜을 포함할 수 있다.
경구 사용을 위한 적합한 담체, 희석제, 부형제 및 보조제는, 예를 들어 낙화생유, 액체 파라핀, 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 나트륨 알기네이트, 아라비아 검, 트라가칸트 검, 덱스트로즈, 슈크로즈, 소르비톨, 만니톨, 젤라틴 및 레시틴을 포함한다. 또한, 이들 경구 제형물은 적합한 풍미제 및 착색제를 포함할 수 있다. 캡슐제 형태로 사용되는 경우, 캡슐은 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트 (붕해를 지연)와 같은 화합물로 코팅될 수 있다.
보조제는 통상적으로 연화제, 유화제, 농조화제, 방부제, 살균제 및 완충제를 포함한다.
경구 투여를 위한 고체 형태는 사람 및 척추동물의 제약학적 실시에 적합한 결합제, 감미제, 붕해제, 희석제, 풍미제, 코팅제, 방부제, 윤활제 및/또는 지연제를 포함할 수 있다. 적합한 결합제는, 아라비아 검, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸트 검, 나트륨 알기네이트, 카복시메틸셀룰로즈 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 감미제는 슈크로즈, 락토즈, 글루코즈, 아스파탐 또는 사카린을 포함한다. 적합한 붕해제는 옥수수 전분, 메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 잔탄 검, 벤토나이트, 알긴산 또는 아가를 포함한다. 적합한 희석제는 락토즈, 소르비톨, 만니톨, 덱스트로즈, 카올린, 셀룰로즈, 탄산칼슘, 규산칼슘 또는 인산이칼슘을 포함한다. 적합한 풍미제는 박하유, 동록유, 체리, 오렌지 또는 나무딸기 풍미제를 포함한다. 적합한 코팅제는 아크릴산 및/또는 메타크릴산의 중합체 또는 공중합체 및/또는 이들의 에스테르, 왁스, 지방산 알콜, 제인, 쉘락 또는 글루텐을 포함한다. 적합한 방부제는 나트륨 벤조에이트, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 중아황산나트륨을 포함한다. 적합한 윤활제는 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산, 나트륨 올레에이트, 염화나트륨 또는 활석을 포함한다. 적합한 지연제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트를 포함한다.
경구 투여를 위한 액체 형태는 상술한 제제 이외에 액체 담체를 포함할 수 있다. 적합한 액체 담체는 물, 오일, 예를 들어 올리브유, 낙화생유, 참깨유, 해바라기유, 홍화유, 아라키스유, 코코넛유, 액체 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 글리세롤, 지방산 알콜, 트리글리세라이드 또는 이의 혼합물을 포함한다.
경구 투여를 위한 현탁물은 추가로 분산제 및/또는 현탁제를 포함할 수 있다. 적합한 현탁제는 나트륨 카복시메틸셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 히드록시프로필메틸셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 나트륨 알기네이트 또는 아세틸 알콜을 포함한다. 적합한 분산제는 레시틴, 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 예를 들어 스테아르산의 폴리옥시에틸렌 에스테르, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노- 또는 디-올레에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 디-올레에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트 및 이와 유사한 것들 포함한다.
경구 투여를 위한 에멀젼은 하나 이상의 유화제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 유화제는 상기 예시된 바와 같은 분산제 또는 천연 검, 예를 들어 구아 검, 아라비아 검 또는 트라가칸트 검을 포함한다.
비경구 투여용 조성물을 제조하는 방법은 당업자에게 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., 본원에 참조로 삽입됨]에 상세히 기술되어 있다.
본 발명의 국소 제형은 하나 이상의 허용되는 담체 및 임의의 다른 치료 성분과 함께 활성 성분을 포함한다. 국소 투여에 적합한 제형은 치료가 필요한 부위로 피부를 통해 투과하기에 적합한 액체 또는 반-액체 제제, 예를 들어 도찰제, 로션, 크림, 연고제 또는 페이스트, 및 눈, 귀 또는 코에 투여하는데 적합한 점적제를 포함한다.
본 발명에 따른 점적제는 멸균 수성 또는 유성 용액 또는 현탁물을 포함할 수 있다. 이들은 활성 성분을 살균제 및/또는 살진균제 및/또는 임의의 다른 적합한 보존제, 및 임의로 표면활성제를 포함하는 수용액 중에 용해시킴으로써 제조될 수 있다. 이어서, 생성된 용액은 여과에 의해 청명화되고, 적합합 용기로 옮긴 후, 멸균될 수 있다. 멸균화는 90 내지 100 ℃에서 30분 동안 오토클레이브 또는 유지시키거나 여과시키고, 무균 기술로 용기에 옮김으로써 달성될 수 있다. 점적제에 포함시키기에 적합한 살균제 및 살진균제의 예는, 페닐수은 니트레이트 또는 아세테이트 (0.002 %), 벤즈알코늄 클로라이드 (0.01 %) 및 클로르헥시딘 아세테이트 (0.01 %)이다. 유성 용액 제조하기에 적합한 용매는 글리세롤, 희석된 알콜 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
본 발명에 따른 로션은 피부 또는 눈에 적용하기에 적합한 것을 포함한다. 눈 로션은 임으로 살균제를 포함하는 멸균 수용액을 포함할 수 있으며, 점적제의 제조와 관련하여 상술된 바와 유사한 방법에 의해 제조될 수 있다. 피부에 적용하기 위한 로션 또는 도찰제는 또한 건조를 서두르고 피부를 냉각시키기 위한 제제, 예를 들어 알콜 또는 아세톤, 및 보습제, 예를 들어 글리세롤, 또는 오일, 예를 들어 피마자유 또는 아라키스유를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트는 외적 적용을 위한 활성 성분의 반-고체 제형이다. 이들은 미분되거나 분말화된 형태의 활성 성분을 단독으로 또는 수성 또는 비-수성 유체 중의 용액 또는 현탁물에 기름진 또는 기름지지 않은 기재와 함께 혼합함으로써 제조될 수 있다. 기재는 탄화수소, 예를 들어 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀납, 금속성 비누; 점액(mucilage); 천연 기원의 오일, 예를 들어 아몬드유, 옥수수유, 아라키스유, 피마자유 또는 올리브유; 양모지 또는 이의 유도체, 또는 지방산, 예를 들어 스테아르산 또는 올레산을 알콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜 또는 마크로골과 함께 포함할 수 있다.
조성물은 임의의 적합한 계면활성제, 예를 들어 음이온성, 양이온성 또는 비이온성 계면활성제, 예를 들어 소르비탄 에스테르 또는 이의 폴리옥시에틸렌 유도체를 혼입할 수 있다. 현탁화제, 예를 들어 천연 검, 셀룰로즈 유도체 또는 무기 물질, 예를 들어 실리카성 실리카 (silicaceous silica) 및 기타 성분, 예를 들어 라놀린이 포함될 수도 있다.
다수의 피코나바이러스의 투여가 필요한 경우, 이전에 투여된 바이러스에 대한 면역 반응의 효과를 피하거나 최소화시키기 위해 매번 상이한 바이러스가 투여될 수 있으며, 처치 과정은 주치의에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 1 내지 2주 또는 그 이상, 예를 들어 1 내지 2개월 또는 그 이상 동안 연장될 수 있다. 매우 바람직하게는, 포유동물이 이전에 노출된 바 없거나 표준 기술로 측정 시포유동물이 비교적 미미한 면역 반응을 일으키는 바이러스가 투여될 수 있다.
다양한 투여 경로가 이용될 수 있다. 예를 들어, 혈액암에 대한 투여 경로는 정맥내, 종양내, 복강내, 근육내, 안내, 피하, 경구, 국소, 또는 자가 줄기 세포 이식 전 자가 이식편 내 악성 세포의 생체 외 퍼징에 의할 수 있다.
피코나바이러스는 혈액암을 치료하기에 충분한 양 (예를 들어, "유효량")으로 투여된다. 혈액암은 암 세포에 대한 피코나바이러스의 투여가 암세포의 적어도 일부를 종양용해하여 암의 정도를 감소시키거나 바람직하게는 완전히 암을 제거하는 경우 "치료"된다. 암의 정도의 감소 또는 바람직하게는 암의 제거는 일반적으로 피코나바이러스에 의한 혈액암 세포의 용해 ("종양용해")에 의해 야기된다.
유효량은 개별적인 기초자료에 의해 결정될 것이며, 적어도 부분적으로 피코나바이러스의 타입; 개체의 크기, 나이, 성별; 혈액암의 타입, 정도 및 기타 특성에 기초할 수 있다. 예를 들어, 사람의 치료에서는, 특수한 상황, 예를 들어 존재하는 암의 타입, 크기 및 정도에 따라 약 102 내지 1010 플라크 형성 단위 (PFU)가 사용될 수 있다. 예를 들어, 접종물은 약 105 PFU 초과, 예를 들어 약 105 내지 약 106 PFU 또는 약 106 내지 약 107PFU 또는 약 107 내지 약 108 PFU를 포함할 수 있다. 추가의 예로써, 바이러스 용량의 범위는 약 0.01 내지 약 1000 감염 바이러스 단위/세포, 예를 들어 약 0.01 내지 약 0.1 감염 바이러스 단위/세포, 또는 약 0.1 내지 약 1 감염 바이러스 단위/세포, 또는 약 1 내지 약 10 감염 바이러스 단위/세포, 또는 약 10 내지 약 100 감염 바이러스 단위/세포, 또는 약 100 내지 약 1000 감염 바이러스 단위/세포일 수 있다.
피코나바이러스는 단독 용량, 또는 다수 용량 (즉, 1회 초과 용량)으로 투여될 수 있다. 다수 용량은 동시에 또는 연속적으로 (예를 들어, 수일 또는 수주의기간에 걸쳐) 투여될 수 있다. 통상적으로, 치료적 적용에서, 처치는 질환의 상태의 지속 동안, 예를 들어 적어도 혈액암이 통상의 수단으로는 더 이상 검출되지 않을 때까지 일 수 있다. 또한, 검출가능한 암의 존재를 경과한 기간 동안, 예를 들어 치료 의사가 검출가능하지 않은 신생물이 존재할 수 있다고 의심하는 기간 동안 처치를 계속하는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 피코나바이러스는 동일한 개체에 있는 1개 초과의 혈액암에 대해 투여될 수 있다.
또한, 피코나바이러스는 바이러스-감염된 암세포에서 용해 반응을 일으키도록 DNA 게놈 또는 게놈의 상보성 DNA 카피 또는 이의 충분한 부분을 사용하여 간접적으로 투여될 수 있다. 투여되는 경우, 피코나바이러스는 세포에서 복제할 수 있어 목적하는 용해 감염 및 치사를 일으킬 것이다.
전형적으로, 환자는 초기 용량의 바이러스로 처치된 후, 후속적으로 환자가 갖고 있는 인자, 예를 들어 바이러스의 초기 투여에 대한 환자의 반응 및 초기 처치로부터 발생하는 바이러스 감염 및 악성 세포 죽음의 정도에 대해 추가의 바이러스를 투여하는 결정이 내려지기 전 적합한 기간 동안 모니터링될 것이다.
바람직하게는, 개체는 예정된 간격으로 일정 기간에 걸쳐 바이러스로 처치될 것이다. 간격은 각각의 환경에서 적합하게 결정되는 바와 같이 매일 또는 24시간 부터 72시간까지 또는 그 이상, 예를 들어 주단위로 또는 개월 단위일 수 있다. 예를 들어, 이전에 투여되거나 접촉된 바이러스에 대한 임의의 면역 반응의 효과를 피하거나 최소화시키기 위해, 매번 동일하거나 상이한 바이러스가 투여될 수 있으며, 처치 과정은 주치의에 의해 결정될 수 있는 바와 같이 1 내지 2주 또는 그 이상으로 연장될 수 있다. 가장 바람직하게는, 개체가 이전에 노출된 바 없거나 표준 기술로 측정될 수 있는 바와 같이 개체가 비교적 미미한 면역 반응을 일으키는 바이러스가 투여될 것이다. 달리 및 필요한 경우, 바이러스의 투여는, 예를 들어 투여되는 바이러스에 대한 수령체의 면역 반응을 감소시키는 것이 필요한 경우, 면역 조절제와 함께 배합될 수 있다.
용이 입수가능한 공지의 바이러스가 본 발명의 방법에 적합하게 사용될 수 있지만, 통상의 기술로 변형되거나 조작되는 바이러스도 사용될 수 있다. 예를 들어, 세포 수용체로서 추가의 세포 부착 분자를 사용하도록 바이러스를 변형시킬 수 있다. 예를 들어, 콕사키바이러스 A9 (CVA9)와 같이, 콕사키바이러스 A21가 바이러스 캡시드 표면에 펩타이드 모티프 "RGD"를 발현하도록 부위-지시된 돌연변이유발을 이용해 변형될 수 있다. RGD 모티프는 모든 αv 인테그린 헤테로이량체에 의해 인지되며, 이러한 캡시드 변형은, 예를 들어 바이러스를, 악성 흑색종 병소의 표면에서 ICAM-1과 배합하여 상향-조절되어 인테그린 분자와의 상호작용을 통해 또는 ICAM-1과의 후속한 상호작용을 통해 바이러스의 끌어들임을 향상시키는 것으로 밝혀진 세포 부착 분자인 인테그린 αvβ3와 결합시킬 수 있다. 달리는, 바이러스는 셀렉틴, 예를 들어 E-셀렉틴을 인지하거나 NF-κB 시그날화 경로를 표적하도록 변형될 수 있다.
바이러스는 세포 투입을 위한 대체적 분자를 인지하도록 변형되거나 선택될 수 있다. 이러한 변형 및 선택을 위한 방법이 출원인의 공동-계류중인 출원 제PCT/AU2005/000048호 (표제: "Modified oncolytic viruses", 이의 내용이 본원에 참조로 삽입됨)에 기술되어 있다. 예를 들어, 제PCT/AU2005/000048호는 ICAM-1의 실질적인 부재 하에서, 예를 들어 세포 상의 DAF를 통해 세포에서 아폽토시스를 유도하거나 용해적으로 감염시킬 수 있는 분리된 선별된 피코나바이러스를 기술한다.
본 발명은 특정 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 기술될 것이며, 이러한 실시예는 어떠한 방식으로도 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 간주되지 말아야 한다.
재료 및 방법
세포 및 바이러스
콕사키 A 바이러스 CVA21 (쿠이겐다 스트레인)의 원형 스트레인을 엠. 케네트 박사로부터 입수하였다 (Dr. M. Kennett, Enterorespiratory Laboratory, Fairfield Hospital, Melbourne, Victoria, Australia). CVA21은 이중 플라크 정제되었으며, ICAM-1 발현 흑색종 세포 (SK-Mel-28)에서 성장시켰다. 바이러스는 CVA21, CVA18, CVA15 및 CVA13의 실험실 스톡 스트레인이었다. 콕사키 A 바이러스 CVA13 (Flores), CVA15 (G-9), CVA18 (G-13), 및 CVA21 (Kuykendall)의 원형 스트레이도 엠 케네트 박사로부터 입수하였다. 원래, CVA13, CVA15, 및 CVA18은 HeLa-B 세포에서 증식하며 CVA21 쿠이켄달은 RD-ICAM-1 세포에서 증식하였다. 이들 바이러스의 작업용 실험 스톡은 SK-Mel-28 세포에서 이들 스톡으로부터 제조되었다.
SK-Mel-28 세포는 피. 허시 박사로부터 얻었다 (Dr. P. Hersey, Oncology, Mater Hospital, Waratah, New South Wales, Australia). U266, RPMI-8226 및 NCI-H929 다발성 골수종 세포주는 엘. 린츠 박사로부터 입수하였다 (Dr. L. Lincz, Hematology, Mater Misericordiae Hospital (Hunter Hematology Research Group), Edith Street, Waratah, New South Wales, 2298, Australia). 추가의 세포주 B 세포 림프종 세포주 SCOTT, B 프로림프구성 백혈병 세포주 JVM13, 급성 프로골수구 백혈병 (APML) 세호주 NB4 및 HL-60, 및 단핵구성 백혈병 세포주 U937도 엘. 린츠 박사로부터 얻었다. SK-Mel-28 세포는 10 % 우태 혈청 (FCS)를 포함하는 DMEM에서 유지되고, U266, RPMI-8226, NCI-H929, SCOTT, JVM13, NB4, HL-60 및 U937 세포는 10 % FCS를 포함하는 RPMI에서 배양하였다. 모든 세포주는 5% CO2 환경 하에 37 ℃에서 유지되었다. 건강한 공여자로부터의 정상 말초혈 단핵구 (PBMC)는, 35분 동안 400 xg에서 원심분리하기 전, 4:1 비율의 Ficoll-Hypaque Plus 구배에서 전혈 시료를 가해 분리하였다. 중간층을 수집하고, 포스페이트 완충된 염수 (PBS) 중에 재현탁시킨 후, 사용 전 PBS에 2회 세척하였다.
원발성 종양 세포
모든 공정은 뉴캐슬 대학의 인권 보호 및 윤리 위원회 (the University of Newcastle Human Care and Ethics Committee, Newcastle, NSW3 Australia) 및 헌터 에어리어 건강 서비스 인권 보호 및 윤리 위원회 (the Hunter Area Health Service Human Care and Ethics Committee, Newcastle, NSW5 Australia)에서 승인되었다. 원발성 종양 세포는 다발성 골수종 진단을 위해 통상의 골수 조사를 받는 환자로부터 입수하였다. 골수 흡출물은 표 1에 나타난 바와 같이 19명의 환자로부터 수집되었다.
환자 ID 시료채위일 성별 나이 상태
1 2004.06.21 남성 55 재발
2 2004.06.30 남성 76 재발
3 2004.07.20 여성 44 지속
4 2004.07.28 여성 69 MGUS
5 2004.07.28 남성 80 MM 진단 시료
6 2004.08.11 남성 85 MGUS
7 2004.09.10 여성 77 진단
8 2005.02.14 남성 44 진단
9 2005.02.16 남성 46 예비-이식
10 2005.02.23 여성 75 무효 천자 (dry tap)
11 2005.02.28 남성 55 PR
12 2005.03.02 남성 70 재발
13 2005.04.13 남성 57 PR
14 2005.05.11 여성 80 MGUS
15 2005.06.01 여성 72 왈덴스트롬스 마크로글로불린혈증
16 2005.06.01 여성 60 MM 진단
17 2005.08.03 여성 67 MGUS
18 2005.08.10 남성 66 혈질세포종
19 2005.08.10 여성 72 MGUS
"PR": 부분적 완화; "무효 천자"는 골수 (골 입자) 없음을 의미한다. 모든 환자는 정보제공된 것에 대해 동의하였다. 단일 세포 현탁물은 시료를 Lymphoprep 용액 (Nycomed, Oslo, Norway)에 2:1의 비율로 오버레이 (overlaying)함으로써 골수 시료로부터 수득하였으며, 400 xg에서 30분 동안 원심분리하였다. 단핵구층을 수집하고, PBS에 2회 세척한 후, 추가의 실험에 사용하기 전, 5 % FCS를 함유하는 PRMI에 재현탁하였다.
항체
ICAM-1의 N-말단 도메인에 대해 지시되는 플로오레세인-이소티오시아네이트 (FITC)와 접합된 시판되는 항-CD54 항체 (Immunotech Coulter, Marseilles, France)를 표면 발현된 ICAM-1을 염색하는데 사용하였다. 항-DAF IH4 mAb를 비. 러브랜드 박사 (Dr. B. Loveland, Austin Research Institute, Heidelberg, Victoria, Australia)로부터 입수하였다. 항-CD138-FITC mAb (Serotec, Oxford, UK)는 혈장 세포 항원 Syndecan-1에 대해 특이적이었다. 피코에리트린 (PE)과 접합된 또 다른 시판되는 항-CD138 항체는 밀테니 바이오텍 (Miltenyi Biotec, CA, USA)으로부터 입수하였다.
유동 세포측정
다발성 골수종 세포주 및 다른 혈액암 주 B 세포 림프종, B 프로림프구성 백혈병, 급성 프로골수구 백혈병 (APML) 및 단핵구성 백혈병에 대한 ICAM-1 및 DAF 표면 발현을 2색 유동 혈구측정법으로 분석하였다. 간단히, 분산된 세포 (1 x 106)를 20분 동안 직접적으로 접합된 항-CD54-FITC mAb (5μg/ml, PBS 중 희석)와 함께 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 PBS로 세척하고, 얼음상에서 5분 동안 항-DAF IH4 mAb (5μg/ml, PBS 중)로 이중 표지하기 전에 5분 동안 1000 xg에서 펠렛화하였다. 세포를 PBS로 세척하고, 100 μl의 제2 항체 용액, PBS (DAKO A/S, Denmark) 중에 1:100으로 희석되고 20분 동안 얼음 상에서 인큐베이션된 염소 항-마우스 면역글로불린의 R-피코에리트린-접합된 F(ab')2 단편에 재현탁하였다. 각각의 세포주에 대해, 적합한 접합체 대조군 항체를 사용한 염색을 함께 수행하였다. 세포를 상기와 같이 세척하고 펠렛화한 후, PBS 중에 재현탁시키고, FACStar 분석기 (Becton Dickenson, Sydney, Australia)를 사용하여 ICAM-1 및 DAF 발현에 대해 분석하였다.
바이러스 용해적 감염 및 세포 생존 검정
다발성 골수종 세포주 RPMI-8226, U266 및 NCI-H929을 48시간 동안 CVA21의 존재 또는 부재 하에 6-웰 플레이트에서 배양하였다. 건강한 지원자로부터 수득된 정상 사람 말초혈 단핵구를 대조군으로 사용하였다. 감염의 다중성 (MOI)는 각각의 배양물에 대해 약 5 TCID50/세포였다. 세포변성 효과 (CPE)는 트립판 블루 생존 염색을 이용하여 CVA21 감염 후 48시간에 평가하였다. 다발성 골수종 세포주에 의해 배양 상등액으로 분비된 단백질에 대한 트립판 블루의 친화성 때문에, 염색하기 전, 먼저 배양 상등액을 무딘 26-게이지의 바늘을 통해 서서히 흡출시켜 제거하였다. 나머지 세포는 5분 동안 0.4 % 트립판 블루 용액으로 염색하였다. 사진은 100배 확대한 것이다.
시험관 내 성장 억제 검정
마이크로배양 테트라졸륨 검정의 변형된 버젼 (Alley MC, et al. Cancer Res. 1988;48:589-601)을 이용하여 다발성 골수종 세포주의 성장에 대한 증가하는 농도의 CVA21의 효과를 연구하였다. 간단히 설명하면, 다발성 골수종 세포를 대수기 유지 배양물로부터 수거하고, 100 μl 용적 (1 x 105개 세포/웰)으로 반복 96-웰 배양 플레이트에 분배하였다. lOO μl의 배양 배지 또는 바이러스 (2 x 10-5 - 20 TCID50/세포) 함유 배양 배지를 적합한 웰에 분배하였다, CVA21을 다른 콕사키 A 바이러스 (CVA13, CVA15 및 CVA18)와 성장 억제를 비교하기 위해서, 1x1O-4 내지 100 TCID50/세포의 10배 연속 희석물을 사용하였다. 세포를 함유하지 않는 웰은 배지 단독으로 이용하거나, 바이러스 용액 단독은 블랭크 "배경 (background)" 결정에 이용하였다.
배양 플레이트를 MTT 시약 (Sigma Chemicals, Sydney, New South Wales, Australia)을 가하기 전에, 37 ℃에서 2일 동안 인큐베이션하였다. MTT 스톡 용액을 5 mg MTT/ml PBS 용액으로 제조하고, 0.2 μm 필터 단위로 멸균 여과한 후, 4 ℃에서 저장하였다. 2일 인큐베이션한 후 성장 억제의 수준을 측정하기 위해서, 20 μl의 스톡 MTT 용액을 각각의 배양 웰에 가하고, 추가로 4시간 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다.
인큐베이션 후, 세포 상등액을 무딘 26-게이지 바늘을 통해 느린 흡출에 의해 웰로부터 제거시키고, 150 μl의 DMSO로 대체하였다. 포마잔 결정을 실온 (RT)에서 적당히 흔들어 철저히 용해시키고, 각각의 웰의 흡광도를 ELISA 플레이트 판독기 (Flow Laboratories, McLean, Virginia, USA)를 사용하여 540 nm에서 측정하였다. 이어서, 세포주 성장 억제를 평균 '배경" 흡광도를 감한 후 대조군 흡광도 판독치에 대한 백분율 (%)로서 평균 흡광 단위로 나타내었다.
바이러스 생산 및 종점 적정
3개의 골수종 세포주에서 CVA21 CPE의 결정 후, 감염 동안 생성된 감염성 바이러스 이자의 생산을 측정하기 위한 실험을 U266, RPMI-8226, NCI-H929 세포 및 PBMC에서 수행하였다. 각각의 세포주로부터의 약 3 x 106개 세포를 1 TCID50/세포의 MOI로 감염시켰다. CVA21 접종된 U266, RPMI-8226, NCI-H929 세포 및 PBMC를 PBS로 2회 세척하고, 3개의 200 μl 분취물 (~ l x 106개 세포/튜브)로 나누기 전에 600 μl의 RPMI에 재현탁시켰다. 튜브를 37 ℃에서 인큐베이션하고, 각각의 세포주로부터의 하나의 분취물을 수집하고 세포를 3개의 연속 냉동-해동 사이클에 의해 0, 12, 24 및 48시간에 수거하였다. 각각의 세포 용해물 중 바이러스의 생성량은 SK-Mel-28 세포에서 종점 적정 검정에 의해 평가되었다. 결과가 도 4에 나타나 있다.
간단히, 종점 적정 검정을 위해, 96-웰 조직 배양 플레이트 내의 SK-Mel-28 세포의 융합 (confluent) 단층을 10배 연속 바이러스 희석물 (100 μl/웰, 4중)로 접종하고, 48시간 동안 5 % CO2 환경에서 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 세포 생존을 24시간 동안 크리스탈 바이올렛/메탄올 용액 (0.1 % 크리스탈 바이올렛, 20 % 메탄올, 4.0 % 포름알데히드, PBS 중)과 함께 인큐베이션하고 증류수로 3회 세척하여 정량화하였으며, 각각의 웰의 상대적 흡광도를 다중스캔 효소-결합 면역흡착 검정 플레이트 판독기 (Flow Laboratories, McLean, Virginia, USA)에서 540 nm에서 판독하였다. 50 % 바이러스 종점 역가를 SpearmanKarber 방법 (흡광도 값이 대조군의 바이러스 비함유 웰에 대한 평균 - 3개의 표준편차 (SD) 보다 적은 경우, 웰을 양성으로 분류)을 이용하여 계산하였다.
또한, 감염 동안 생성되는 감염성 바이러스 입자 (CVA21)의 생산을 측정하기 위한 실험을 선택된 혈액암 세포주, 즉 MM 세포주 RPMI-8226, 단핵구성 백혈병 세포주 U937 및 급성 프로골수구 백혈병 (APML) 세포주 HL-60에서 수행하였다. 세포를 lO TCID50/세포의 CVA21로 감염시키지만, 방법은 상술된 바와 유사하고, 세척한 후 새로운 배지 (RPMI 10 % FCS)에 넣기 전에 바이러스를 37 ℃에서 30분 동안 결합시켰다. 세포 및 상등액을 감염 후 0, 24 및 48시간에 수거하고, 바이러스 양을 SK-MEL-28 세포의 단층에 종점 적정에 의해 측정하였다. 결과가 도 13에 나타나 있다.
바이러스 성장 속도
3개의 골수종 세포주에서 CVA21의 복제 동력학을 조사하기 위해서, 1 x 106개의 U266, RPMI-8226 또는 NCI-H929 세포를 함유하는 튜브를 약 3 x 106 TCID50의 CVA21 (MOI ~ 3 TCID50/세포)를 포함하는 100 μl 바이러스 분취물로 감염시켰다. 튜브를 실온에서 30분 동안 적당히 흔든 후, 세포를 매번 5 ml의 RPMI로 5회 세척하고, 1 % FCS를 함유하는 1 ml의 RPMI에 재현탁하였다. 이어서, CVA21 접종된 세포의 각 튜브를 적절한 시점에서 수집하기 위해 9개의 분리된 100 μl 분취물 (~ 1 x 105개 세포/튜브)로 나누었다. 튜브를 실험하는 동안 37 ℃에서 인큐베이션하였다. 동시에 진행된 감염을 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24 및 48시간 간격으로 중단시키고, 시험되는 각 세포주로부터 하나의 분취물을 각 시점에서 수집하고, 세포를 3번의 연속적 냉동-해동 사이클로 용해시키며, 세포 용해물 중의 바이러스 생산량을 종점 적정 검정으로 측정하기 전, 5분 동안 실온에서 10,000 xg에서 원심분리시켰다.
DNA 단편화 검정
MM 세포의 CVA21 감염에 의한 아폽토시스의 유도는 게놈 DNA 단편화의 검출에 의해 측정하였다. MM 세포주 RPMI-8226, U266 및 NCI-H929를 6-웰 플레이트 (5 x 105개 세포/웰)에서 배양하고, 분석 전 37 ℃에서 24시간 동안 CVA21 (MOI ~ 1O TCID50/세포)로 감염시키거나 배지 단독으로 처리하였다. 세포를 5분 동안 800 g에서 원심분리시켜 펠렛화한 후, 500 μl의 용해 완충액 (5 mM Tris-HCl, 2O mM EDTA, 0.5 % 트리톤 X-100, pH 8.0)을 세포 펠렛에 가하고 20분 동안 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 용해물을 20분 동안 12,000 g에서 원심분리하고, DNA를 페놀:클로로포름을 사용하여 상등액으로분터 추출하였다. DNA를 에탄올 침전시키고, 70 % 에탄올로 세척한 후, 30 μl의 TAE 함유 RNase (50 μg/ml)에 재현탁시켰다. DNA 시료를 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분석하기 전 37 ℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 15 μl의 추출된 DNA를 3 μl의 로딩 완충액 (0.25 % 오렌지 G, 40 % 글리세롤, TAE 중)과 혼합한 후, 에티듐 브로마이드를 함유하는 1.2 % TAE 아가로즈 겔 상에서 분석하였다. 겔을 UV광으로 가시화하고, 이미지를 Gel Doc 시스템 (Bio-RAD, Regents Park, New South Wales, Australia)을 사용하여 디지털로 입력하였다.
정상 PBMC 와 함께 공동-배양된 골수종 세포주의 선택적 CVA21 감염
U266 및 RPMI-8226 골수종 세포를 각각 10 % FCS로 보충된 RPMI 배지 중의 PBMC와 혼합하여 최종 혈장 세포 농도를 10 %로 만들었다. 세포 혼합물을 72시간 동안 CVA21 (1 MOI/총 세포군)로 처리하거나 비처리하였다. 퍼징한지 3일째에, 세포군의 각 혼합물로부터의 시료를 PBS에 수거하고, 온전한 암세포의 수를 30분 동안 항-CD138-FITC (10 μl/ml)로 염색하고 이어서 10분 동안 요오드화 프로피디움 (PI) (5 μg/ml)로 염색한 후 유동 혈구측정법을 이용하여 평가하였다. 세포를 5 ml의 PBS로 세척하고, FACStar 분석기 (Becton Dickenson, Sydney, Australia)에서 분석하기 전, 1000 g에서 원심분리하여 펠렛화시켰다. 더 이상 생존하지 못하거나 온전하지 못한 세포는 요오드화 프로피디움 (PI+)으로 양성적으로 염색되었으며, 항-CD138-FITC를 사용한 염색은 정상 PBMC (CD138-)로부터 다발성 골수종 세포 (CD138+)를 측정하는데 이용되었다.
CVA21 로 환자의 골수 시료의 생체 외 퍼징
사전 동의를 얻은 2명의 다발성 골수종 환자로부터 원발성 종양 시료를 얻었으며, 통상의 진단 동안 수집된 골수 흡출물로부터의 여분 세포를 본 연구에 사용하였다. 먼저, 상술된 바와 같은 표준 표면 수용체 염색 프로토콜에 기초하여 항-CD138-PE (10 μg/ml) 및 항-ICAM-1-FITC 항체 (5 μg/ml)를 사용하여 원발성 종양 세포 (1 x 105개 세포) 를 이중 염색함으로써 각각의 임상 시료를 분석하였다. 이어서, CVA21로 3중으로 감염된 임상 시료에 대해 성장 억제/MTT 검정을 수행하였다. 이어서, 약 1 x 105개의 세포 (5 % FCS를 함유하는 RPMI 중)를 96-웰 플레이트의 웰에 시딩하고 0 내지 16 TCID50/세포의 10배 연속 희석물로 CVA21 종양용해를 평가하였다. 이들 세포는 MTT 검정을 이용한 분석 전에 37 ℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
성장 억제 검정 후, 임상 골수 시료 단일 세포 현탁물 (1 x 106개 세포, 5 % FCS를 함유하는 RPMI 중)을 6-웰 플레이트의 각 웰에 시딩하고, 48시간 동안 0, 2.75, 5.5 및 11 TCID50/세포 농도의 CVA21과 함께 인큐베이션하였다. 이어서, 세포를 적당히 피펫팅하여 수거하여, 4 ml의 PBS 중에 재현탁시킨 후, 세포 생존성을 분석하기 전에 1회 세척하였다. MM 세포에 대한 CVA21 매개된 종양용해의 선택성을 세포 생존성 염료 요오드화 프로피디움 (5 μg/ml) 및 항--CD138-FITC (10 μg/ml) 항체를 사용하는 유동 혈구측정법으로 측정하였다.
표 1에 나타난 바와 같은 추가의 임상 시료 (총 19개)를 유사하게 검정하였다.
결과
MM 세포는 ICAM -1 및 DAF 를 발현한다.
유동 세포측정을 수개의 MM 세포주의 표면에 있는 CVA21 세포-투입 수용체 ICAM-1 및 DAF의 상대적 수준을 평가하는데 이용하였다. U266, RPMI-8226 및 NCI-H929 세포를 항-ICAM-1 및 항-DAF 항체로 이중 염색 후 유동 세포측정법으로 분석하였다. 3개의 세포주 각각은 ICAM-1 및 DAF 모두 증가된 수준을 나타내었으며, 접합체 대조군가 비교하여 각각의 도트 플롯 (도 1)의 상단 우측에 있는 염색 세포에 의해 강조된다. 그러나, PBMC 시료 중의 모든 세포가 ICAM-1 표면 발현을 나타내는 것은 아니었으며, 대부분의 세포는 ICAM-1에 대해 음성적으로 염색되었다. 그러나, PBMC는 DAF 발현에 대해 양성이었으며, 접합체 대조군과는 반대로 이중 염색된 시료에서 PBMC 집단은 위쪽으로 이동하였다.
혈액암 세포주에서 ICAM -1 및 DAF 의 발현
피코나바이러스 감염 및 용해에 대한 혈액암의 잠재적 민감성을 더욱 조사하기 위해서, 세포 투입 수용체 ICAM-1 및 DAF의 발현을 대표적인 세포주의 패널에 대해 측정하였다. 유동 세포측정을 이용하여 항-ICAM-1 및 항-DAF 항체로의 이중 염색 후 B 세포 림프종 세포주 SCOTT, B 프로림프구성 백혈병 세포주 JVM13, 급성 프로림프구성 백혈병 (APML) 세포주 NB4 및 HL-60, 단핵구성 백혈병 세포주 U937 및 다발성 골수종 세포주 H929의 표면에 있는 CVA21 세포-투입 수용체 ICAM-1 및 DAF의 상대적 수준을 평가하였다. B 세포 림프종 세포주 SCOTT, B 프로림프구성 백혈병 세포주 JVM13 및 MM 세포주 H929는 ICAM-1 및 DAF 모두를 발현하였으며, 접합체 대조군과 비교하여 각각의 도트 플롯 (도 11A 및 B)의 우측 상단에 있는 염색된 세포에 의해 강조된다. 또한, 단핵구성 백혈병 세포주 U937은 정도는 낮지만 증가된 수준의 ICAM-1 및 DAF를 나타내었다. 급성 프로골수구 백혈병 (APML) 세포주 NB4 및 HL-60의 대부분의 세포는 DAF 발현에 대해서는 양성으로 염색되지만, ICAM-1에 대해서는 음성적으로 염색되었다.
MM 세포는 CVA21 에 의한 용해적 감염에 민감하다.
ICAM-1 및 DAF를 발현하는 다발성 골수종 세포가 CVA21에 민감한지의 여부를 평가하기 위해서, 세포를 37 ℃에서 48시간 동안 CVA21 (MOI ~ 5 TCID50/세포)로 감염시켰다. 각각의 다발성 골수종 세포주는 24시간에 CVA21 감염에 대해 초기 신호를 나타내었다. U266, RPMI-8226 및 NCI-H929 세포주에서 CVA21의 최대 세포변성 효과는, 세포의 덩어리화 및 응집 및 트립판 블루의 흡수로 나타나는 바와 같이, 감염 후 24 내지 48시간 사이에 관측되었다 (도 2). 사람 말초혈 단핵구에서의 세포변성 효과는 3개의 다발성 골수종 세포주와 비교하여 최소였다.
CVA21 감염은 MM 세포의 성장을 억제한다.
다양한 다발성 골수종 세포주에 대한 CVA21의 상이한 치사 및 성장 억제를 MTT 세포 생존성 검정을 이용하여 보다 상세히 조사하였다. 플레이팅된 U266, RPMI-8226 및 NCI-H929 세포를 48시간 동안 증가하는 농도의 CVA21에 노출시켰다. CVA21의 종양용해 효과를 증가하는 용량의 CVA21의 함수로서 MTT 생존에 의해 측정하였다. 도 3은 CVA21 노출 후의 성장 억제 프로필 및 용량-의존적 숄더 (shoulder)를 설명한다. 검정된 MM 세포주 각각은 민감한 것으로 밝혀졌으며, RPMI-8226 및 U266 세포주는 저농도의 CVA21에 반응하여 상당한 성장 억제를 나타내었다. 정상 PBMC는 고농도의 바이러스에 노출 후 성장이 억제되었으며, 심지어 20 MOI에서도 80 % 생존하였으며, 이는 10 % 이하의 생존을 갖는 MM 세포주와 비교된다.
MM 세포는 자손 CVA21 의 증식을 지지한다.
추가의 종양용해 효과를 위해 감염성 자손을 생성하는 MM 세포를 감염시킨 CVA21의 능력을 측정하기 위해, U266, RPMI-8226, NCI-H929 및 PBMC를 사용하여 CVA21 감염 후 바이러스 생산을 측정하였다. 감염 후 24 및 48시간에, 3개의 골수종 세포주로부터의 바이러스 생산은 0 시점에 비교하여 바이러스 역가의 극적 증가를 나타내었다 (도 4). 그러나, PBMC는 CVA21 생산에 증가를 증가를 나타내지 않았으며, 이는 CVA21은 정상적 PBMC 내에서는 자유롭게 복제하지 않는다는 것을 입증한다. CVA21은 어떠한 CVA21 복제 및 바이러스 생산이 증가 없이 6일의 연장된 기간까지 PBMC에서 증식하였다 (자료 미기재).
유사하게 평가하였을 때, 비록 동일 조건은 아니지만, 단핵구성 백혈병 세포주 U937 및 급성 프로골수구 백혈병 (APML) 세포주 HL-60은 감염 후 24시간 또는 48시간에 CVA21 생산이 증가하지 않았으며, 이는 CVA21이 U937 또는 HL-60에서 자유롭게 복제하지 않는다는 것을 제시한다 (도 13).
CVA21 는 MM 세포에서 빠른 성장 속도를 갖는다.
악성 세포의 바이러스 치료에 대한 하나의 이점은, 국부적 또는 원위적 부위에서 주변 악성 세포를 추가로 표적할 수 있는 감염성 자손 바이러스를 생성하는 능력이다. 3개의 다발성 골수종 세포주로 동시 감염 후, 완전한 세포 및 상등액을 지시된 시점에서 수집하였다 (도 5). 암성 세포주에서 CVA21의 복제는 매우 빠른 것으로 밝혀졌으며, CVA21로의 바이러스 접종 후 4시간과 같이 빠르게 감염된 다발성 골수종 세포로부터의 바이러스 역가 증가가 관측되었다. U266, RPMI-8226 및 NCI-H929 세포에서의 CVA21의 1-단계 성장 곡선 분석 결과, 감염 후 8 내지 12시간 사이에 최대 역가로의 효과적인 바이러스 복제를 나타내었다.
RPMI -8226 및 NCI - H929 세포에서 CVA21 유도된 아폽토시스
CVA21이 감염 동안 다발성 골수종 세포의 아폽토시스를 유도하는지의 여부를 측정하기 위해, CVA21을 약 10 TCID50/세포의 MOI로 RPMI-8226, NCI-H929 또는 U266 세포와 함께 인큐베이션하고, 감염 후 24시간에 DNA 분절화로 아폽토시스를 평가하였다. CVA21은 RPMI-8226 및 NCI-H929 세포 (각각 레인 2 및 4)는 아폽토시스의 DNA 사다리화 (laddering) 특징을 유도하였으나 감염된 U266 세포 (레인 6)에서는 그렇지 아니하였다 (도 6). CVA21로 처리된 U266 세포에서는 DNA 분절화가 관측되지 않았으며, 이는 이러한 세포주에서 CVA21 종양용해가 아폽토시스를 유도하지 않았다는 것을 나타낸다. 이러한 결과는 CVA21이 RPMI-8226 및 NCI-H929 세포에서 아폽토시스를 유도할 수 있으나 U266 골수종 세포의 종양용해 동안 항-아폽토시스 시그날화 경로를 활성화시킬 수 있다는 것을 제시한다. 레인 1, 3 및 5는 모의 (mock)-감염된 대조군 세포로부터 추출된 DNA를 포함하였다.
악성 및 비악성 세포를 포함하는 골수종 공동-배양물의 생체 외 퍼징
다발성 경화증 세포는 종양용해하나 정상 세포는 종양용해하지 않는 CVA21의 특이성을, 약 10 %의 종양 부과가 되도록 정상 사람 말초혈 단핵구와 함께 다발성 골수종 세포를 혼합하고 3일 동안 CVA21로 퍼징하여 조사하였다. 정상 PBMC 및 다발성 골수종 세포의 생존 및 비-생존 집단을 항-CD138-FITC 및 PI로 염색함으로써 구별될 수 있었다. 도 7 ("바이러스 부재")에 나타난 바와 같이, CVA21로의 감염 전, 생존 RPMI-8226 또는 U266 세포의 집단 (CD138+/PI-)은 유동 세포측정 도트 플롯의 우측 하단에서 볼 수 있다. 3일 동안 1 TCID50/세포의 MOI로 CVA21을 사용하여 RPMI-8226 또는 U266 공동-배양물을 퍼징한 후, 각각 0.26 % 및 0.51 % 미만의 생존 골수종 세포가 남았다. CVA21은 공동-배양물로부터 약 98 %의 RPMI-8226 및 약 95.7 %의 U266 세포를 퍼징할 수 있었다. 생존 림프구 집단은 좌측 하단에 나타나며, CD138 및 PI로 음성적으로 염색된다. 바이러스로 감염 후, 이들 집단은 CVA21에 노출된 지 3일 후에도 비교적 변화되지 않는다.
임상 골수 시료로부터의 다발성 골수종 세포의 퍼징
시험관 내에서 수개의 다발성 골수종 세포주의 효과적인 종양용해를 입증한 후, 2개의 원발성의 다발성 골수종 골수 시료로부터의 암성 세포를 생체 외 퍼징하였다. 통상의 진단을 받은 2명의 환자로부터의 골수 흡출물을 단일 세포 현탁물로 처리하였다. 먼저, 세포를 항-CD138 및 항-ICAM-1 항체로 염색하여 다발성 골수종 세포에 대한 ICAM-1의 표면 발현을 측정하였다. 골수종 상태 (CD138+)와 ICAM-1 발현 사이의 유의한 관계가 시험된 2개의 임상 시료 모두에서 밝혀졌으며, 임상 시료 중 하나의 결과가 도 8A에 나타나 있다. 임상 시료 #001에서, 총 세포의 약 37 %가 다발성 골수종-혈장 세포이고, CD138 마커 및 ICAM-1을 모두 발현하였다. 유사한 집단의 골수종 세포가 제2 환자에서도 나타났으며, 약 41 %의 세포가 CD138 및 ICAM-1 모두로 염색되었다 (자료 미기재).
환자 임상 시료에 대한 MTT 검정의 결과로부터, CVA21 처리가 상이한 농도의 바이러스로 48시간 인큐베이션한 후 용량-의존적 방식으로 골수종 세포 성장을 억제한다는 것이 확인되었다. 다양한 농도의 CVA21로 원발성 종양 세포 (시료 #001)의 챌린지 후, 세포 증식율 (%)이 고용량의 바이러스 투입에 의해 확실히 감소되었다 (도 8B). 원발성 종양 시료는 일정 비율의 비-악성 세포도 포함하므로, MM 세포를 특이적으로 감염시키는 CVA21의 특이성은 측정되지 못했다.
CVA21이 다발성 골수종 세포는 특이적 용해를 중재하나 정상 세포는 그렇지 않도록 선택적인가를 시험하기 위해서, 원발성 종양 세포를 48시간 동안 다양한 농도의 CVA21로 감염시킨 후, 항-CD138 항체 및 요오드화 프로피디움으로 염색하여 분석하였다. 유동 세포측정법을 이용하여, CD138+ 및 CD138- 세포의 생존성을 측정하고 (도 9A), 48시간에서의 3가지 농도의 CVA21 감염에 의한 세포변성 효과를 관측하였다 (도 9B). 0, 2.75, 5.5 및 11 TCID50/세포 농도의 CVA21과 함께 48시간 동안 인큐베이션된 임상 시료 #001로부터의 종양 세포는, 유동 세포측정에 의해 계수 시, 생존 골수종 세포 (CD138+/PI-)의 비율 (%)이 바이러스 투입의 증가에 따라 감소하는 것으로 나타났다 (도 9A). 11 TCID50/세포의 CVA21로 감염된 원발성 종양 세포는 감염된 악성 종양 세포 비율 (%)을 74 % 감소시켰다. 이러한 원발성 종양 시료에서, 비-생존 골수종 세포 (CD138+/PI+)의 수는 확고히 증가하였으며, 생존 골수종 세포 (CD138+/PI-)는 감소하였다.
또한, 이러한 결과는 다른 임상 시료에서도 반영되었으며, CVA21과 함께 보다 장기간 동안 인큐베이션한 후 생존 세포의 감소율이 최대 90 %에 도달하였다 (자료 미기재). 바이러스 부재의 처리에서조차, 2개의 임상 시료 모두 존재하는 비-생존 세포의 수준이 낮았으며, 보다 중요하게는 비-생존 CD130- 세포의 수준이 시험된 임상 시료에서 바이러스 처리 후 실질적으로 증가하지 않았다. 고려할 또 다른 인자는, 48시간 동안 이들 세포의 생체 외 배양이 바이러스 부재의 대조군에서 관측되는 바와 같이 저수준의 세포 죽음에 기여될 수 있다는 것이다. 상이한 농도의 CVA21로 처리한 후 남아있는 임상 시료 #001로부터의 생존하는 다발성 골수종 세포의 비율 (%)이 유동 세포측정으로부터 요약되었으며, 도 9C에 나타나 있다.
생체 외 퍼징 제제로서 CVA21의 임상적 유용성을 더욱 평가하기 위해서, 추가의 BM 흡출물을 조사하였다. MM을 갖는 5명의 환자 및 MGUS를 갖는 2명의 환자로부터의 BM 흡출물을 약 3 및 10 MOI 농도의 CVA21로 감염시킨 결과가 도 10B(i)에 나타나 있다. 일정 조건 (표 1)을 갖는 총 19개의 임상 시료에 대한 축적 결과가 도 10B(ii)에 나타나 있다. 시험된 모든 임상 시료로부터의 CD138+ 세포 집단은 ICAM-1을 발현하였으며, 환자 시료 #006으로부터의 대표적인 도트 플롯을 나타내었다 (도 10A). CVA21은, 생존 CD138 세포의 실질적 감소로 나타나는 바와 같이 바이러스로의 단독 처리 후 시험된 7개의 임상 시료 모두에서 강력한 종양용해 퍼징 효과를 나타내었으며, 시료 #008에서 MM 세포에 대해 최대 97.2 % 제거율을 나타내었다 (도 10B(i) 및 10E). 생존 CD138- 정상 세포의 수준은 바이러스 처리 후 실질적으로 감소하지 않았다 (도 10D). 보다 중요하게는, 이러한 분획 중의 전구세포는 혈액생성을 지지하는 능력을 보유하였다. 도 10C는 생존 전구세포가 CVA21로의 원발성 시료 처리 후 배양될 수 있다는 것을 나타낸다; 3명의 환자 시료로부터의 CFU-GM 콜로니의 평균수가 나타나 있다. 대조군 시료로 감염된 모의군과 비교하여 CFU-GM 콜로니의 수는 바이러스 처리군에서 57 내지 70 % 낮았다.
CVA13 , CVA15 및 CVA18 에 대한 혈액암 세포주의 민감성
세포를 감염시키고 파괴하기 위해 ICAM-1를 이용하는 다른 콕사키 A 바이러스 (예: CVA13, CVA15 및 CVA18)도 다발성 골수종 세포 성장을 억제할 수 있었다. 대표적인 다발성 골수종 세포주로서 RPMI-8226을 사용하여, 이들 세포를 CVA13, CVA15 및 CVA18 처리한 결과, 0.1 내지 100 TCID50/ml의 농도에서 CVA21에서와 유사한 항-종양 효과를 나타내었다 (도 12A). CVA13, CVA15, CVA18 및 CVA21의 효과는 비-다발성 골수종 암세포 U937 및 HL-60에 대해 분석한 결과 덜 일관되었다 (도 12B 및 C). U937 및 HL-60에 대해 각각의 바이러스가 다소간의 성장 억제를 나타내었으나, 이들 세포의 감염 후 CVA21 성장 결과에 대한 자세한 조사는, 암세포주 U937 및 HL-60이 바이러스 복제를 지지할 수 없어 바이러스 치료에 대한 이상적인 후보물일 수 없음을 시사한다 (도 13).
토의
콕사키바이러스 A21은 악성 흑색종에 대한 효과적인 항종양제인 것으로 처음으로 밝혀진 신규한 종양용해제이다. CVA21은 통상 가벼운 상부 호흡관 감염과 관련된 피코나바이러스이며, 사람에서 심각한 질환을 일으키는 것으로는 알려진 바 없다 (Rueckert RR. Picornaviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM5 eds. Fields Virology. Vol 1. Philadelphia: Lippincott-Raven; 1996:609-645). 이러한 결과는 CVA21이 수개의 MM 세포주의 시험관 내 시험 후 다발성 골수종에 대해 강력한 종양용해제라는 것을 입증한다. 이러한 결론은 MM 세포주에 대한 CVA21의 관측된 세포변성 효과 (도 2)에 의해, 또한 MTT 검정을 통해 입증되는 바와 같이 MM 세포에 대한 CVA21의 상당한 성장 억제/세포독성에 의해 지지된다 (도 3).
또한, 본원에 보고된 자료는 다른 피코나바이러스, 예를 들어 CVA13, CVA15 및 CVA18이 MM 세포에 대해 강력한 종양용해제라는 것을 입증한다 (도 12).
이러한 효과는, MM 세포 보다 뚜렷한 고용량 의존성을 갖기는 하지만, CVA13, CVA15, CVA18 및 CVA21에 대한 단핵구성 백혈병 세포주 U937의 반응성에 의해 본원에서 입증되는 바와 같이 MM 세포에 대해 제한되지 않는다 (도 12B).
유동 세포측정에 의해, 다발성 골수종 세포주 U266, RPMI-8226 및 NCI-H929가, CVA21 종양용해 선택성 및 효율의 결정인자인, CVA21 바이러스-투입 수용체 ICAM-1 및 DAF를 고수준을 발현한다는 것이 확인되었다 (도 1).
또한, 추가의 혈액암으로부터 확립된 세포주에서 ICAM-1 및 DAF의 발현이 입증되었으며, 이는 피코나바이러스에 의한 혈액암의 광범위한 잠재력을 강조한다. 도 11에 나타난 바와 같이, B 세포 림프종 세포주 SCOTT 및 B 프로림프구성 백혈병 세포주 JVM13 모두 ICAM-1과 DAF 모두를 발현하였다. 또한, 단핵구성 백혈병 세포주 U937도 비록 보다 낮은 정도이긴 하지만 증가된 수준의 ICAM-1 및 DAF를 나타내었다. 급성 프로골수구 백혈병 (APML) 세포주 HL-60의 CVA21에 대한 검출가능한 민감성의 뚜렷한 부재와 일치하게, 다수의 HL-60 세포는 ICAM-1에 대해 음성적으로 염색되었다.
B 세포 림프종 세포주 SCOTT 및 B 프로림프구성 백혈병 세포주 JVM13은 본원에 기술된 배양 조건 하에서 매우 느리게 성장하였다. 그 결과, 다양한 다른 혈액암 세포주에 대해 입증된 바와 같이, CVA에 의한 이들 세포주의 종양용해적 감염 효율을 직접적으로 입증할 수 없었다. 그러나, 이들 세포주 각각에 대한 ICAM-1 및 DAF의 입증된 발현에 비추어, 본 출원인은 B 세포 림프종 및 B 프로림프구성 백혈병 각각이 본 발명의 방법에 민감할 것이라고 믿는다.
MM 세포에 의한 고수준의 ICAM-1 발현은 문헌에 잘 보고되어 있으며, 이는 MM 에 대한 잠재적 처치로서 항-ICAM-1 mAb 치료를 위한 수개의 제안을 제공한다 (van de Stolpe A, van der Saag PT. Journal of Molecular Medicine. 1996;74:13-33; Huang YW, et al. Cancer Res. 1995;55:610-616). MM 세포에서 고수준의 ICAM-1 발현에 대한 이유는 MM 세포에서 전사 인자 NF-κB의 구성적 활성화에 의해 설명될 수 있다 (Hideshima T, et al. JBiol Chem. 2002;277: 16639-16647).
NF-κB는 MM 병인 및 약물 내성에 관련된 세포 생존 인자이며, MM 세포에서 부착 분자 발현에 중요한 조절자이다 (Chauhan D, et al. Blood. 1996;87:1104-1112). ICAM-1 유전자의 5' 프로모터 영역은 수개의 κB 인핸서 요소를 포함하며, ICAM-1 발현의 조절에 있어 가장 중요한 전사-조절 요소 중의 하나를 나타낸다. MM 세포에서 NF-κB의 활성화 및 이에 따른 ICAM-1과 같은 부착 분자의 상향-조절이 골수 간질 세포 (BMSC)에 결합하는 MM 세포를 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (Hideshima T, et al. Oncogene. 2001;20:4519-4527). 또한, BMSC에 MM 세포가 부착하면, MM의 성장 및 항-아폽토시스 인자인 BMSC에 의한 IL-6 (인터류킨-6) 전사의 NF-κB-의존적 상향-조절을 유도한다는 것이 확인되었다 (Chauhan D, et al. Blood. 1997;89:227-234).
MTT/성장 억제 검정은 세포독성/성장 억제의 최대 수준이 20 TCID50/세포의 초기 CVA21 투입 용량에서 관측되는 것으로 나타났다 (도 3). 이러한 결과는, CVA21이 시험된 3종의 다발성 골수종 세포주 모두에 대해 강력한 세포독성 및 살세포 효과를 보이면서 정상적인 사람 말초혈 단핵구에 대해서는 감소된 세포독성을 갖는다는 것을 나타내며 (도 3), CVA21 감염 후 관측되는 세포변성 효과를 뒷받침한다 (도 2).
바람직한 종양용해성 바이러스에 대한 하나의 이상적인 속성은, 추가의 종양용해를 일으키도록 국부적 또는 원위적 위치에 있는 주변의 비감염된 종양 세포로 퍼질 수 있는 자손 바이러스를 생성할 수 있는 능력이다. CVA21은 다발성 골수종 세포주 각각에서 효과적으로 복제할 수 있어 복제 적격 종양용해제로의 사용을 지지한다. 상이한 골수종 세포주에서의 CVA21의 복제 결과, 초기 투입 용량이 크기상으로 100 내지 1000배 증대되나, 동일한 조건 하에서 CVA21로 감염된 정상 PBMC에서는 생산적인 바이러스 생산이 없었다 (도 4).
바람직한 바이러스성 종양용해제의 또 다른 중요한 속성은 최적 수준의 복제 효율이다. 1-단계 바이러스 성장 곡선 분석으로부터, CVA21은 MM 세포내에서 효율적이고 신속하게 복제하여, 감염 후 8 내지 12 시간에 피크 수준의 바이러스 생산에 도달한다 (도 5). 이러한 비교적 신속한 복제 사이클은 MM 질환의 전개를 널리 퍼뜨리고 조절하는 자손 바이러스의 능력을 촉진할 수 있다. MM 세포 성장을 억제할 CVA21의 복제능 및 세포독성이 MM에 대한 CVA21 바이러스치료, 예를 들어 생체 내에서 MM의 치료 및 생체 외에서 MM 세포의 선택적 퍼징을 지지하는 추가의 증거이다.
본원에서 보고되는 결과는, 자손 바이러스의 생산이, 추가의 종양용해를 일으키도록 국부적 또는 원위적 위치에 있는 주변의 비감염된 종양 세포로 퍼뜨리는 것을 가능하게 하는 면에서는 바람직하지만, 피코나바이러스에 의한 종양용해 감염을 통한 혈액암 세포 죽음에는 필요하지 않은 것으로 입증된다. 본원에서 단핵구성 백혈병 세포주 U937은 CVA에 민감한 것으로 입증되었으나 (도 12), 아직 CVA21 성장을 지지할 정도로 관측가능한 능력이 입증되지는 않았다 (도 13). 이러한 암의 치료는 피코나바이러스의 다중 투여가 특히 유리할 수 있다.
CVA21이 MM 세포의 죽음을 일으키는 정확한 기작은 아직 미지이다; 그 과정은 상이한 임상 시료 및 MM 세포주에 존재하는 유전적 돌연변이 및 세포성 형질전환 사건에 매우 의존적일 것이다. 다른 피코나바이러스와 함께 CVA21이 숙주의 세포 단백질 합성의 중지, 세포 당단백질 수송의 차단, 아폽토시스의 유도 및 전사 인자의 단백용해적 분해의 조합을 통해 세포 죽음을 매개하는 것으로 생각된다 (Rueckert RR. Picornaviridae: The Viruses and Their Replication. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, eds. Fields Virology. Vol. 1. Philadelphia: Lippincott-Raven; 1996:609-645). CVA21 감염된 RPMI-8226 및 NCI-H929 세포에서 수행된 DNA 분절화 검정에 따라, CVA21는 이들 2개의 세포주에서 아폽토시스를 유도하나 U266 세포에서는 아폽토시스를 유도할 수 없다 (도 6). U266 세포는 세포 생존 및 성장을 위해 오토크린 또는 파라크린 IL-6 자극에 의존적이다. 시그날 변환자 및 전사의 활성자 (STAT)-3과 같이 사이토킨 중재된 전사 인자의 활성화와 연결되어, IL-6 시그날화 경로는 CVA21 감염 후 U266 세포의 항-아폽토시스 반응에 다소간의 영향을 끼칠 수 있다.
최근의 연구에 따르면 (Bharti AC, et al. Blood. 2004; 103:3175-3184), U266 세포는 세포의 핵에서 구성적으로 활성화된 STAT3을 보이나, RPMI-8226 세포는 구성적으로 활성화된 STAT3에 대해 음성인 것으로 나타났다. 그러나, NF-κB 의 화학적 억제제는 STAT3 활성화와 무관하게 U266 및 RPMI-8226 세포주 모두의 아폽토시스를 유도하는 것으로 나타났으며, 이는 STAT3이 화학적 NF-κB 억제제에 의해 유발되는 아폽토시스에서 역할을 하는 것으로 보이지 않는다는 것을 제시한다. 그러나, 이러한 결과는, STAT3 활성화 경로의 활성화가 사실상 CVA21 감염된 골수종 세포의 종양용해에서 항-아폽토시스 역할을 할 수 있다는 것을 나타낸다.
NF-κB 계열의 전사 인자의 역할은 실제로 복잡하며, 프로-아폽토시스 및 항-아폽토시스 시그날화 모두에 역할을 할 수 있다는 것을 제시하는 증거가 있다. MM의 치료를 위한 새로운 제제, 예를 들어 탈리도미드 (Keifer JA, et al J Biol. Cheni. 2001 ;276:22382-22387), 프로테오좀 억제제 PS-341 (Hideshima T, et al. Cancer Res. 2001 ;61 :3071-3076), 및 아르센산 트리옥사이드 As2O3 (Kapahi P5 et al. J. Biol. Ckem. 2000;275:36062-36066)이 NF-κB 활성화를 억제하고 예비임상적 및 초기 임상 시도에서 MM에 대한 통상의 약물 내성을 극복하는 것을 돕는 것으로 밝혀졌다.
이러한 연구에서 임상 시료로부터 수집된 자료는, CVA21 및 다른 피코나바이러스의 관측된 종양용해능이 다발성 골수종 세포주 뿐만 아니라 다른 혈액암 세포주 및 생체 외에서 감염된 원발성 종양 시료에서도 효과적이라는 것을 제시한다. 임상 시료는 골수에 존재하는 CD138 혈장 세포를 상당 수준 가졌다 (이들 모두는 유동 세포측정으로 시험 시 ICAM-1을 발현하였다 (도 8A)). 증가된 용량의 CVA21로 감염 시, 실질적인 성장 억류 및 종양 세포 퍼징이 모든 임상 시료에서 관측되었으며, 하나의 시료 (#008)에서 최대 98 %의 억제를 나타내었다. 정상 세포 및 악성 세포에 대한 CVA21의 효과를 보다 상세히 평가하기 위해서, 유동 세포측정법으로 분석하기 전, 세포를 항-CD138 및 PI로 염색하였다. CVA21은 17개의 측정가능한 임상 시료 중 14개에서 악성 세포를 80 % 초과로 효과적으로 감소시켰다 (도 10E). 추가의 임상 시료 (총 19개)의 분석으로, 이러한 관측의 일반성을 확인하였다 (도 10). 바이러스 투입량의 증가 및 CVA21 감염의 연장은 암세포 퍼징 수준을 증대시킬 수 있다. 본 연구에 사용된 임상 시료는 CVA21에 의한 MM 세포의 유익한 퍼징을 뒷받침한다.
전구 줄기 세포의 생존성을 지탱하는 것과 함께 환자 시료로부터의 골수종 종양 세포의 실질적 제거는, CVA21이 골수종 세포를 특이적으로 죽이고 정상 전구세포에는 비교적 미미한 영향을 끼칠 수 있다는 것을 분명히 입증한다. 또한, CVA21 처리는 이전에 비처리된 종양 세포 및 과도하게 전처리된 화학-내성 종양 세포에 대해 효과적이었으며, 이는 CVA21이 MM에 대해 유용한 치료적 선택일 수 있다는 것을 나타낸다. MM, MGUS에 대한 무증상 전구체를 갖는 것으로 진단된 환자로부터의 예비-암성 혈장 세포를 제거하는데 있어서도 CVA21이 상당히 효과적이었다. 이러한 환자의 30 % 이하가 MM을 발병하나, 현재 각각의 예후를 예측할 수 없으므로, 이러한 양성 이상은 일반적으로 비처리된다. 이러한 그룹의 환자에서 예방법으로서 CVA21의 잠재적 사용은 MM에 대한 예방적 처치로서 바이러스 치료에 대한 새로운 역할을 제시한다.
또한, CVA21은 악성 세포에 대한 직접적 세포독성 효과와는 별도로 MM의 치료에서 다른 역할을 할 수 있다. 대부분의 MM 세포가 초기에는 기존 약물 치료에 민감하나, 대부분의 경우에서 약물 내성은 MM에 대해 일반적인 양상이다. 빈크리스틴 및 독소루비신과 같은 제제와 배합하여 화학-감작제로서 CVA21의 사용은 제제 단독의 사용보다 개선된 결과를 초래할 수 있으며, 또한 MM 치료법으로서 CVA21을 조사할 추가의 이유가 된다.
현재, 다발성 경화증에 대한 수단이 제한되어 있으며, 새로운 치료가 필요하다. 다발성 경화증 환자의 면역 손상된 상태는 이러한 암을 앓는 환자를 바이러스 치료하는 것에 대한 진정한 우려를 제기하는 한편, 항-바이러스 면역의 결핍 때문에 이들 환자에서 CVA21 바이러스치료가 가장 성공적일 것이라고 할 수 있다. 또한, MM은 서서히 증식하는 악성 혈장 세포의 축적이 특징적인 질환이며, CVA21 종양용해에 의해 부여되는 종양의 효과적인 조절을 위한 이상적인 기회를 제공한다. 바이러스치료는, 자손 바이러스의 퍼짐이 효과적이지 않다면 빠르게 성장하는 종양이 바이러스 종양용해를 피할 수 있기 때문에, 서서히 성장하는 종양에서 가장 효과적인 것으로 예측되었다.
CVA21이 환자에서 해로운 결과를 갖는다면, CVA21 감염은 항-바이러스 화합물, 예를 들어 플레코나릴 (Rogers JM, et al. Adv Exp Med Biol. 1999;458:69-76), 또는 면역 혈청 글로불린 (Rotbart HA. Pediatr Infect Dis J. 1999;18:632-633)에 의해 조절될 수 있다. 또 다른 대안은 생체 외에서 MM 및 기타 혈액 종양 세포의 퍼징을 위한 CVA21의 사용을 포함한다. 최근에, 자가 줄기 세포 이식을 위한 새로운 퍼징 방법으로서 종양용해성 레오바이러스의 사용이 일정 범위의 혈액암에 대해 평가되었으나, 성분채집 산물의 혼합물로부터 농축된 생체 외 다발성 골수종 세포의 퍼징이 불완전하였다 (Thirukkumaran CM, et al. Blood. 2003;102:377-387). CVA21은 다발성 골수종 세포에 대해 선택적인 세포독성을갖는 독특한 종양용해성 바이러스이며, 또한 생체 외 퍼징 제제로서 향상된 잠재성을 가질 수 있다.
요약
상기 자료는 CVA21 및 기타 피코나바이러스, 예를 들어 CVA13, CVA15 및 CVA18가 다발성 골수종 세포주 및 기타 혈액암 세포주에 대해 시험관 내에서 효과적인 종양용해제이며, 생체 내에서 MM 및 혈액암 세포의 직접적 종양 용해 및 생체 외에서 말초 줄기 세포의 자가 이식편의 퍼징에 잠재적 적용을 갖는다는 것을 입증한다.
본 발명을 상술된 방식으로 상세히 기술하였으나, 당업자라면, 광범위하게 기술되는 본 발명의 취지 또는 범위로부터 이탈함이 없이, 특정 양태로 나타낸 발명에 대해 다수의 생략, 치환 및/또는 변형을 포함한 다수의 변화 및/또는 변형이 이루어질 수 있다는 것을 알 것이다. 따라서, 본 발명의 양태는 설명되는 바와 같은 모든 양상으로 고려되는 비제한적인 것이다.
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Claims (22)

  1. 암의 적어도 일부의 세포가 바이러스성 종양-용해를 겪도록 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 피코나바이러스가 콕사키바이러스, 에코바이러스, 폴리오바이러스, 미분류된 엔테로바이러스, 리노바이러스, 파라에코바이러스, 헤파토바이러스 및 카디오바이러스를 포함한 엔테로바이러스의 원형 및 임상적으로 분리된 스트레인으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 피코나바이러스가 CVA13, CVA15, CVA18, CVA20, CVA21, 이의 변형 형태 및 이들의 배합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 콕사키 A 그룹 바이러스인 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 피코나바이러스가 정맥내, 종양내, 복강내, 근육내, 자가 줄기 세포 이식 전 자가 이식편 내의 악성 세포의 생체 외 퍼징, 또는 이식 전 자가 이식편 내 의 악성 세포의 생체 외 퍼징으로 투여되는 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 자가 이식편이 조혈 줄기 세포를 포함하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스 투여량 범위가 약 0.01 내지 약 1000 감염성 바이러스 단위/세포인 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스가 환자에게 유효량의 화학요법제와 배합 투여되는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 바이러스가 환자에게 유효량의 프로바이오틱 제제와 배합 투여되는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 혈액암이 다발성 골수종, B 세포 림프종, B 프로림프구성 백혈병 및 단핵구성 백혈병으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 혈액암의 세포가 바이러스-세포 도입 수용체 분자 세포간 부착 분자-1 (ICAM-1) 및/또는 부패-촉진 인자 (DAF)를 과발현하는 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 혈액암의 세포가 NF-κB를 구성적으로 발현하는 방법.
  12. 암의 적어도 일부의 세포가 바이러스성 종양-용해를 겪도록 CVA13, CVA15, CVA18 및 CVA21로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 피코타바이러스 또는 이의 배합물의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 다발성 골수종, B 세포 림프종, B 프로림프구성 백혈병 및 단핵구성 백혈병으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  13. 암의 적어도 일부의 세포가 바이러스에 의해 죽도록 피코나바이러스로부터 유래되는 핵산 분자 또는 이의 변형 형태의 치료학적 유효량을 환자에게 투여함을 포함하여, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는 방법.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 피코나바이러스가 CVA13, CVA15, CVA18, CVA20 및 CVA21로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 콕사키 A 그룹 바이러스인 방법.
  15. 제1항 또는 제13항에 있어서,
    상기 환자가 사람인 방법.
  16. 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 유효량을 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 제약학적 조성물.
  17. 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스로부터 유래되는 핵산 분자 또는 이의 변형 형태의 유효량을 제약학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 포함하는, 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하는데 사용하기 위한 제약학적 조성물.
  18. 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조하는데 있어 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 용도.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 피코나바이러스가 CVA13, CVA15, CVA18, CVA20 및 CVA21로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 콕사키 A 그룹 바이러스인 용도.
  20. 제18항에 있어서,
    상기 혈액암이 다발성 골수종, B 세포 림프종, B 프로림프구성 백혈병 및 단핵구성 백혈병으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 용도.
  21. 환자의 혈액암을 치료 및/또는 예방하기 위한 약제를 제조하는데 있어 혈액암을 용해적으로 감염시킬 수 있는 피코나바이러스로부터 유래되는 핵산 분자 또는 이의 변형 형태의 용도.
  22. 암의 적어도 일부의 세포가 바이러스성 종양-용해를 겪도록 피코나바이러스 또는 이의 변형 형태의 치료학적 유효량으로 환자의 세포를 감염시킴을 포함하여, 혈액 종양 또는 암 세포에 대해 환자의 면역 반응을 유도하는 방법.
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