KR20060131975A - 변형된 종양 용해 바이러스 - Google Patents

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KR20060131975A
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cva21
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KR1020067021119A
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에바 수사네 요한슨
대런 레이몬드 샤프렌
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바이로타르그 피티와이 엘티디
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Publication date
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Abstract

본 발명은 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 선택된 피코르나바이러스 및 피험체를 치료하는 방법을 제공한다.

Description

변형된 종양 용해 바이러스{Modified Oncolytic Viruses}
본 발명은 변형된 종양 용해 피코르나바이러스(Picornavirus) 및 피험체의 치료방법에 관한 것이다.
세포 표면 분자에의 바이러스의 부착은 바이러스 복제의 최초 단계이며, 따라서 특이적 세포 바이러스 수용체는 바이러스 조직 향성(tropism)의 주 결정요소이다. 붕괴 촉진 인자(DAF/CD55)는 4개의 세포외 짧은 공통 반복단위(SCR)로 이루어진 70kDa의 글리코실 포스파티딜 이노시톨(GPI) 고정 보체 조절 단백질로서, 몇몇 에코바이러스(EV), 쿡사키 B 바이러스(CVB) 및 쿡사키바이러스 A21(CVA21)을 포함한 많은 인간 장 바이러스(enterovirus)에 대한 막 부착 단백질로서 작용한다. 일반적으로, DAF에 대한 바이러스 결합만으로는 장 바이러스 감염을 허용하기에 불충분하고 DAF와의 상호작용은 세포 유입의 전제 조건으로 여겨지는 135S 변경 (A) 입자를 유발하지 않는다. 장 바이러스 감염에 대한 DAF의 생리학적 역할은 감염성 바이러스를 결합 및 농축시킴으로써, 제2의 기능적 세포 유입 수용체와의 상호작용을 통한 세포 유입의 기회를 증가시키는 막 격리 수용체인 것으로 가정된다.
많은 다른 피코르나바이러스 수용체들처럼(폴리오바이러스, 주 수용체군 리노바이러스 및 쿡사키 B 바이러스가 이용), CVA21 세포 내화 수용체(internalizing receptor)인 세포간 유착 분자-1(ICAM-1/CD54)은 면역 글로불린-상과의 일원이며, 5배축을 둘러싼 캡시드 캐년(canyon) 내에 결합한다. 캐년 기저의 바이러스 수용체간의 상호작용은 캡시드를 비안정화시켜서 입체형태(conformational) 변화를 유도하며, 이는 바이러스 탈막(uncoating)의 전조이다.
CVA21의 원형 변종(Kuykendall)은 호흡성 감염의 원인체로서, ICAM-1과 DAF 모두에 결합한다. 그러나, 표면 발현 DAF에 대한 CVA21의 원형 변종의 결합은 A-입자의 형성 또는 생성적 감염을 개시하기에 불충분하며, ICAM-1과의 상호작용이 세포 유입에 필요하다. DAF의 비바이러스 결합 영역에 대한 단클론 항체(mAb)에 의해 표면 DAF가 가교될 때 CVA21 감염 동안 DAF의 보다 기능적 역할이 관찰되어, ICAM-1의 부재시에 감염을 가능케 한다.
본 출원인은 ICAM-1을 인식하는 종양 용해 바이러스를 이용하여 악성 종양을 치료하는 새로운 방법을 이미 개발하였다(WO 01/37866). 다수의 암 세포 유형에 대해 다양한 쿡사키 A 변종을 이용하여 우수한 치료 결과를 얻었다. 가능한 암 치료를 확장하고 훨씬 더 효과적인 치료를 제공하기 위해, 본 발명자들은 변형 및 생물선택(bioselection)에 의해 개선된 종양 용해 및 살상 성질을 갖는 신규 종양 용해 바이러스를 얻었다.
발명의 개요
제1측면에서, 본 발명은 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 선택된 피코르나바이러스를 제공한다.
바람직하게, 선택된 피코르나바이러스는 세포상의 붕괴-촉진 인자(DAF)를 통해 세포를 용해성 감염할 수 있다.
바람직하게, 피코르나바이러스는 쿡사키바이러스를 포함하는 장 바이러스, 에코바이러스, 폴리오바이러스, 미분류된 장 바이러스, 리노바이러스, 파라에코바이러스, 헤파토바이러스 및 카디오바이러스의 원형 및 임상 분리 변종으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 형태에서, 피코르나바이러스는 쿡사키바이러스이다. 바람직하게, 쿡사키바이러스는 유형 A 또는 B, 보다 바람직하게는 쿡사키바이러스 A., 더욱 더 바람직하게는 쿡사키바이러스는 쿡사키바이러스 A21이다.
바람직한 형태에서, 피코르나바이러스는 에코바이러스이다. 바람직하게, 에코바이러스는 에코바이러스 6, 7, 11, 12, 13 또는 29이다.
바람직한 형태에서, 피코르나바이러스는 폴리오바이러스이다. 바람직하게, 폴리오바이러스는 폴리오바이러스 유형 1, 2 또는 3이다.
바람직한 형태에서, 피코르나바이러스는 리노바이러스이다. 바람직하게, 리노바이러스는 리노바이러스의 주군(major group) 또는 리노바이러스의 소군(major group)의 구성원이다.
한 바람직한 형태에서, 피코르나바이러스는 ICAM-1이 없는 DAF-발현의 세포주에서 ICAM-1이 없는 세포를 용해성 감염할 수 없는 피코르나바이러스를 계대 및 ICAM-1이 없는 세포를 용해성 감염할 수 있는 선택된 피코르나바이러스를 회수함으로써 생물선택된다.
또 하나의 바람직한 형태에서, 피코르나바이러스는 ICAM-1에의 접근이 항-ICAM-1 항체의 이용에 의해 차단된 세포에서의 계대 또는 부위 지향 돌연변이 유발과 같은 임의의 공지된 방법에 의해 변경, 돌연변이 또는 변형될 수 있다.
바람직하게, 선택된 피코르나바이러스는 야생형 바이러스와 비교하여 하나 이상의 캡시드 단백질에 변경을 갖는다. 예를 들어 쿡사키바이러스에서, 캡시드 단백질은 VP1, VP2 및 VP3로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 돌연변이는 VP3 R96H; VP3 E101A; VP3 A239S; VP2 S164L 및 VP2 V209 가운데 하나 이상으로부터 선택된다.
바람직하게, 세포는 신생물, 보다 바람직하게는 신생물은 DAF-발현 신생물이다. 예는 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백혈병, 흑색종, 전암(pre-cancerous) 세포, 식도암, 유방암, 뇌암, 난소암, 위 및 장암을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
제2측면에서, 본 발명은 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염할 수 있는 분리된 피코르나바이러스의 핵산 분자를 제공한다. 한 구현예에서 핵산 분자는 피코르나바이러스로부터 유도될 수 있으며, 바이러스로부터의 단일 가닥 RNA 또는 상보성 DNA일 수 있다. 바람직하게, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 및 서열 번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다.
제3측면에서, 본 발명은 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염할 수 있는 피코르나바이러스를 생물선택하는 방법에 있어서, 세 포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염할 수 없는 피코르나바이러스를 적합한 세포주 내에서 충분한 계대수 동안 배양 및 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염할 수 있는 피코르나바이러스를 선택하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 세포주는 가로무늬 근육종, 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백혈병, 흑색종, 전암(pre-cancerous) 세포, 식도암, 유방암, 뇌암, 난소암, 위 및 장암과 같은 인간 암으로부터 선택된다. 보다 바람직하게, 세포주는 ICAM-1을 발현하지 않는 DAF-발현 세포주이다.
전형적으로, 충분한 계대수는 일반적으로 최대 약 10이다. 그러나, 피코르나바이러스와 세포 유형에 따라 1 내지 100 또는 그 이상의 계대를 이용할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 한 구현예에서 4계대를 이용한다. 또 하나의 구현예에서 5계대를 이용한다. 또다른 구현예에서, 6, 7, 또는 8계대를 이용할 수 있다.
제4측면에서, 본 발명은 본 발명의 제3측면에 따른 방법으로부터 얻은 피코르나바이러스를 제공한다.
제5측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제4측면에 따른 분리된 피코르나바이러스와 함께, 적합한 약학적 허용 부형제 또는 희석제를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
제6측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2측면에 따른 바이러스 핵산 분자 또는 바이러스 핵산의 상보성 DNA 카피와 함께, 적합한 약학적 허용 부형제 또는 희석제를 함유하는 약학적 조성물을 제공한다.
제7측면에서, 본 발명은 신생물을 앓는 포유류 내 신생물을 치료하는 방법에 있어서, 본 발명의 제1 또는 제5측면에 따른 분리된 피코르나바이러스의 유효량을, 신생물 세포의 바이러스-매개 종양 용해를 일으키는 조건하에서 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 신생물은 DAF-발현 신생물이다. 예는 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백혈병, 흑색종, 전암(pre-cancerous) 세포, 식도암, 유방암, 뇌암, 난소암, 위 및 장암을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
제8측면에서, 본 발명은 신생물을 앓는 포유류 내 신생물을 치료하는 방법에 있어서, 본 발명의 제2측면에 따른 핵산 분자 또는 바이러스 핵산의 상보성 DNA 카피 또는 본 발명의 제6측면에 따른 약학적 조성물의 유효량을, 신생물 세포의 바이러스-매개 종양 용해를 일으키는 조건하에서 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
바람직하게, 신생물은 DAF-발현 신생물이다. 예는 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백혈병, 흑색종, 전암(pre-cancerous) 세포, 식도암, 유방암, 뇌암 및 난소암을 포함하나, 이에 한정되지는 않는다.
제9측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 또는 제5측면에 따른 분리된 피코르나바이러스의 요법 또는 치료법에 있어서의 용도를 제공한다.
제10측면에서, 본 발명은 본 발명의 제2측면에 따른 핵산 분자의 요법 또는 치료법에 있어서의 용도를 제공한다.
제11측면에서, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 CVA21-DAFv 형태 의 분리된 선택된 피코르나바이러스, 또는 그 변형 또는 변경된 형태를 제공한다.
제12측면에서, 본 발명은 세포간 유착 분자(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 선택된 피코르나바이러스의 포유류 내 신생물 치료용 의약 제조에 있어서의 용도를 제공한다. 한 바람직한 구현예에서, 신생물 세포의 적어도 일부가 살상되도록 피코르나바이러스로 포유류 내 신생물을 치료하는 의약의 제조에 있어서의 본 발명의 피코르나바이러스 생성을 위한 접종물의 용도를 제공한다.
제13측면에서, 본 발명은 포유류 내 신생물을 치료하는 바이러스 생성을 위해 포유류에 접종물을 적용하는 적용기에 있어서, 적용기는 접종물이 포유류와 접촉하도록 접종물로 함침된 지역을 포함하고, 바이러스는 세포간 유착 분자(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 선택된 피코르나바이러스인 적용기를 제공한다.
본 명세서에서 설명한 바이러스의 시료는 부다페스트 조약의 규정에 의거, 오스트레일리아 2073 NSW Pymble Suakin Street 1(PO Box 385) Australian Govenment Analytical Laboratories (National Measurement Institute)에 기탁하였다. 분리주 CVA21 #272101(기탁번호 NM05/43993 ), CVA21 #275238(기탁번호 NM05/43991 ) 및 CVA21 #272598(기탁번호 NM05/43992 )을 2005년 1월 14일에 기탁하였다. CVA21-DAFv를 기탁번호 NM05/43996 으로 2005년 1월 17일에 기탁하였다.
본 명세서 전체에서, 문맥이 달리 요구하지 않는 한, 단어 "포함하다" 또는 "포함한다" 또는 "포함하는"과 같은 변형 형태는 기술한 구성요소, 정수 또는 단 계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 군을 포함하면서, 임의의 다른 구성요소, 정수 또는 단계, 또는 구성요소, 정수 또는 단계의 군을 배제하지 않는 것을 의미하는 것으로 이해하여야 한다.
본 명세서에 포함된 어떠한 문서, 행위, 물질, 장치, 물품 등등의 논의는 본 발명의 문맥을 제공하기 위한 목적일 뿐이다. 어떠한 이들 사항도 본 출원의 우선일 이전에 본 발명과 관련된 기술분야에서 종래 기술의 기본의 일부를 구성하거나 공지된 일반적 지식이었다는 자인으로 받아들여져서는 아니된다.
본 발명을 보다 명확하게 이해할 수 있도록 하기 위해, 바람직한 형태들을 다음의 도면 및 실시예를 참조하여 설명한다.
도 1. [35S]-메티오닌 표지 CVA21 원형(Kuykendall) 및 3개의 CVA21 임상 분리주(#272101, #275238, #272598)의 (A) DAF 발현 CHO 세포 및 (B) ICAM-1 발현 CHO 세포에의 항-ICAM-1 MAb의 존재 및 부재시 결합. 결합한 [35S]-메티오닌 표지 바이러스의 수준은 액체 섬광 계수로 측정하였다. 결과는 3벌의 시료의 평균 + SD로 표현하였다. Y-축은 결합한 바이러스를 나타낸다(cpm×102).
도 2. [35S]-메티오닌 표지 CVA21 원형 Kuykendall (A) 및 임상 분리주 #272101 (B)의 항-DAF SCR 1 MAb, 항-ICAM-1 영역 1 MAb 및/또는 PI-PLC 처리의 존재시 HeLa 세포에의 결합. 결합한 [35S]-메티오닌 표지 바이러스의 수준은 액체 섬 광 계수로 측정하였다. 결과는 3벌의 시료의 평균 + SD로 표현하였다. Y-축은 결합한 바이러스를 나타낸다(cpm×102).
도 3. [35S]-메티오닌 표지 CVA21 원형(Kuykendall) 및 3개의 CVA21 임상 분리주(#272101, #275238, #272598)의 DAF 또는 ICAM-1만을 또는 조합으로 발현하는 CHO 세포에의 결합. (A) 표면 DAF 및 ICAM-1 발현의 유세포 분석. 이입된 CHO 세포는 접합체만, 항-DAF MAb(IH4) 또는 항-ICAM-1 MAb(WEHI)으로 배양하였으며 특이적 결합은 FACStar analyzer상에서 측정하였다. 색칠한 히스토그램은 접합체의 결합을, 빈 히스토그램은 항-DAF MAb의 결합을, 그리고 점선 히스토그램은 항-ICAM-1 Mab의 결합을 나타낸다. (B) 결합한 [35S]-메티오닌 표지 바이러스의 수준은 액체 섬광 계수로 측정하였다. 결과는 3벌의 시료의 평균 + SD로 표현하였다. Y-축은 결합한 바이러스를 나타낸다(cpm×102).
도 4. 항-DAF MAb IA10 (SCR 1), VIIIA7 (SCR 2), IH4 (SCR 3) 및 IIH6 (SCR 4)의 존재하에 CVA21 원형(Kuykendall) 및 임상 분리주(#272101, #275238, #272598)에 의한 ICAM-1 음성 RD 세포의 용해성 감염. 96-웰 플레이트에서 배양한 RD 세포의 단층에 항-DAF MAb(20㎍/㎖)를 추가하였다. 37℃에서 1h 동안의 배양 후 세포를 CVA21 분리주의 대략 103 TCID50/웰로 접종하고 37℃에서 48h 동안 배양하였다. 세포 단층을 크리스탈 바이올렛/메탄올 용액으로 염색한 뒤 540nm에서의 흡광도를 측정하여 세포 용해를 평가하였다. 결과는 2벌의 웰의 평균 용해 퍼센트로 표 현하였다.
도 5. 원형 CVA21 Kuykendall 변종 및 임상 분리주 #272101, #275238, 및 #272598에 대한 VP1, VP2 및 VP3 캡시드 단백질의 다중 서열 정렬. Kuykendall 변종에 대한 임상 분리주의 아미노산 변화는 굵은 글씨로 나타내었다. 서열 정렬은 Clustal X 프로그램을 이용하여 생성하였다. CVA21-ICAM-1 결합 족문을 구성하는 개별 아미노산은 박스로 강조하였다.
도 6. CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv에 의한 SkMel28 및 RD 세포의 감염. (A) RD 및 SkMel28 세포상의 ICAM-1 및 DAF 발현의 유세포 분석. 실선 히스토그램은 접합체만의 결합을, 점선 히스토그램은 항-ICAM-1 mAb의 결합을 나타내며, 항-DAF mAb의 결합은 색칠한 히스토그램으로 도시하였다. (B) 96-웰 플레이트 내 SkMel28 및 RD 세포의 단층을 CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv의 10배 희석물로 접종하였다. 72h 동안의 배양 후, 단층을 고정 및 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. +는 현미경 관찰시 검출된 CPE를 나타낸다. (C) RD 세포상의 CVA21-DAF 변이와 비교한 SkMel28 세포상의 CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv의 대표적 플라크 형태. 바이러스의 연속 희석물로 세포를 감염시키고, 감염 후 1h에 0.7% 아가로스를 함유하는 DMEM을 위에 얹었다. 플레이트를 37℃에서 접종하고 감염 후 48h에 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다.
도 7. CVA21-DAFv 결합 및 용해성 감염에 대한 항-DAF 및 항-ICAM-1 mAb의 효과. (A) CHO, CHO-DAF, CHO-ICAM-1 및 DOV13 세포상의 DAF 및 ICAM-1의 표면 수준의 유세포 분석. 실선 히스토그램은 접합체만의 결합을, 점선 히스토그램은 항- ICAM-1 mAb의 결합을 나타내며, 항-DAF mAb의 결합은 색칠한 히스토그램으로 도시하였다. 액체 섬광 계수로 측정한 CHO, CHO-ICAM-1, CHO-DAF, RD 및 DOV13 세포상의 표면 발현 ICAM-1(B) 및 DAF(C)에 대한 방사성 표지 바이러스 결합. 결과는 3벌의 시료의 평균 + SD로 표현하였다. (D) RD 및 DOV13 세포의 CVA21 용해성 감염에 대한 DAF의 mAb 가교의 효과. 96-웰 플레이트 내 단층을 CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv로의 접종에 앞서 항-DAF SCR3 mAb로 전배양하였다(1-106 TCID50/웰). 37℃에서 72h 동안의 배양 후, 세포 단층을 고정 및 크리스탈 바이올렛 용액으로 염색하였다. +는 현미경 관찰시 검출된 CPE를 나타낸다. * 101 TCID50/㎖ 미만의 바이러스 역가.
도 8. DAF로부터의 CVA21-DAFv 용출. (A) 표면 DAF에 대한 CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv 결합 강도의 비교. CHO-DAF 세포를 방사성 표지 바이러스로 2h 동안 4℃에서 배양한 뒤, 세포-결합 바이러스를 다양한 농도의 항-DAF SCR1 mAb (IA10)로 1h 동안 얼음상에서 용출하였다. 상층액의 용출 바이러스 수준을 모니터하였고 결과는 세포 용출 방사성 표지 바이러스의 %로서 표시하였다. (B) DAF 및 ICAM-1 결합 CVA21-DAFv 비리온의 침강. CHO-DAF 및 CHO-ICAM-1 세포를 방사성 표지 CVA21-DAFv 비리온으로 2h 동안 4℃에서 배양한 뒤, 세포-결합 바이러스를 2h 동안 37℃에서 용출하도록 하였다. 용출한 비리온의 침강을 5-30% 설탕 구배상에서 분석하였다. 성숙한 비리온(160S) 및 프로비리온(125S)을 내부 이동 대조군으로 이동하였 다.
도 9. 항-DAF SCR1 mAb 및 가용성 DAF(sDAF)에 의한 CVA21-DAFv 용해성 감염의 억제. (A) RD 세포의 융합성 단층을 CVA21-DAFv 감염에 앞서 항-DAF SCR1 mAb IA10으로 배양하였다. 24h 동안 37℃에서의 배양 후, 세포의 세포 용해를 검사하고 사진 촬영하였다. (B) CVA21-DAFv를 sDAF(85㎍/㎕)로 1h 동안 37℃에서 배양하고 RD 세포 단층에 첨가하였다. 48h 동안 37℃에서의 배양 후, 세포의 세포 용해를 검사하고 사진 촬영하였다.
도 10. CVA21의 예측되는 수용체-바이러스 결합 표면의 확대도. (A) 동일면으로 제시된 하나의 CVA21 프로토머의 평면도, 여기에서 VP1은 노란색, VP2는 분홍색, 그리고 VP3은 심홍색으로 묘사. 숫자는 20면체 5-, 3-, 및 2-배축의 대응 위치를 나타낸다. 상호작용하는 ICAM-1 및 DAF 분자는 웜 드로잉(worm drawing)으로 도시하였고, DAF는 담황색으로, 캐년-결합 ICAM-1은 녹색이다. CVA21 어버이의 VP3 R96 잔기의 위치(공간-채움 모드)는 VP1 C-말단 루프에 의해 부분적으로 덮여 있고, 아르기닌 측쇄의 단 하나의 질소 원자(* 옆의 청색 면)가 바이러스 표면으로부터 보인다. (B) CVA21 프로토머의 측면도, 단백질 색깔은 상기와 같고 VP3 잔기 R96 및 E101이 공간-채움 모드에서 강조됨. 그림은 프로그램 pymol(http://www.pymol.org)로 생성하였다.
도 11. 키메라 DAF/CD46 수용체에 대한 방사성 표지 CVA21의 결합. (A) 야생형 DAF, CD46 및 DAF/CD46 키메라 분자의 개략적 표현. (B) DAF 및 CD46의 개별 SCR들에 대한 mAb 결합의 유세포 분석. 항-DAF mAb는 IA10 (SCR1), IH4 (SCR3), IIH6 (SCR4) 그리고 항-CD46 mAb (SCR1) 는 MCI20.6이었다. 적절한 mAb로 배양한 뒤, 세포를 PBS로 세척하고 100㎕의 PBS (덴마크의 DAKO A/S) 내 염소 항-마우스 면역 글로불린의 R-피코에리트린-접합 F(ab')2 단편에 재현탁시킨 뒤 얼음상에서 20분간 배양하였다. 세포를 상기와 같이 세척 및 펠렛화하고, PBS에 재현탁시키고 FACStar 분석기(오스트레일리아 시드니의 Becton Dickenson)로 DAF 및 CD46 발현에 대해 분석하였다. (C) DAF, CD46 또는 키메라 DAF/CD46 분자를 발현하는 CHO 세포에의 방사성 표지 CVA21 결합. 세포를 대략 2×105 cpm의 35S-표지 CVA21로 1h 동안 37℃에서 배양한 뒤 PBS로 4회 세척하였다. 세포 결합 CVA21의 양을 액체 섬광법으로 측정하였다. 결과는 3벌의 평균 + SD로 표시하였다.
도 12. 시간, 온도 및 배지의 pH에 대한 DAF 발현 CHO 세포로부터의 CVA21 용출. (A) CVA21은 세포 표면 발현 DAF에 4℃에서 결합하였고, 2시간 후에 용출하였는데 온도를 추가 0, 1, 5, 15, 30 및 60분 동안 37℃로 올리면서 수행하였다. 용출한 CVA21의 수준을 액체 섬광 계수로 측정하였다. (B) CVA21은 세포 표면 발현 DAF에 4℃에서 2h 동안 결합하였고, 추가 30분 동안 적절한 온도에서의 배양에 의해 용출하였다. (C) CVA21은 세포 표면 발현 DAF에 4℃에서 2h 동안 결합하였고, 추가 30분 동안 37℃에서 적절한 pH의 배지에서의 배양에 의해 용출하였다.
도 13. DAF 및 ICAM-1로부터의 용출 후의 CVA21의 감염력. (A) 4℃에서 세포 표면 발현 DAF 및 ICAM-1에의 [35S]-메티오닌 표지 CVA21 결합, 및 37℃에서의 배양 후 각 수용체로부터 방사성 표지 바이러스의 후속 용출의 수준. 결합한 [35S]-메티오닌 표지 바이러스의 수준은 액체 섬광 계수로 1450 Microbeta TRILUX (핀랜드 Turku의 Wallac) 상에서 측정하였다. 결과는 3벌의 시료의 평균 + SD로 표현하였다. (B) 세포 표면 발현 DAF 및 ICAM-1에의 결합 및 그로부터의 용출 후의 CVA21에 의한 RD-ICAM-1 세포의 용해성 감염. 세포 생존은 크리스탈 바이올렛/메탄올 용액으로 염색하여 4벌의 웰로부터 정량화하고 염색한 세포 단층의 상대적 흡광도를 멀티스캔 효소 면역 측정법 플레이트 판독기(미국 버지니아주 McLean의 Flow Laboratories)상에서 540nm에서 읽었다. 50% 종말점 역가를 Reed 및 Muench의 방법을 이용하여 계산하였고, 여기에서 흡광도가 무바이러스 웰 대조군 - 3 표준 편차보다 작은 경우 양(positive)으로 기록하였다.
도 14. 가교된 DAF로부터의 용출 후 CVA21의 감염력. (A) 0℃ 및 37℃에서 RD 세포상의 세포 표면 발현 ICAM-1(RD-ICAM-1) 및 RD 세포상의 mAb 가교된 DAF로부터의 [35S]-메티오닌 표지 CVA21의 용출. 용출한 [35S]-메티오닌 표지 바이러스의 수준은 액체 섬광 계수로 1450 Microbeta TRILUX (핀랜드 Turku의 Wallac) 상에서 측정하였다. 결과는 3벌의 시료로부터 용출한 바이러스 퍼센트 + SD로 표현하였다. (B) 대조군 CVA21과 비교하여 ICAM-1 또는 mAb 가교된 DAF에의 결합 및 그로부터의 용출 후 CVA21에 의한 RD-ICAM-1 세포의 용해성 감염. 세포 생존은 크리스탈 바이올렛/메탄올 용액으로 염색하여 4벌의 웰로부터 정량화하고 염색한 세포 단층의 상대적 흡광도를 멀티스캔 효소 면역 측정법 플레이트 판독기(미국 버지니아주 McLean의 Flow Laboratories)상에서 540nm에서 읽었다. 50% 종말점 역가는 도 13에서 설명한 바와 같이 계산하였다. (C) ICAM-1 또는 가교된 DAF에 대한 CVA21 결합의 강도. RD-ICAM-1 세포 또는 DAF-가교된 RD 세포[항-DAF SCR3 (IH4) mAb로 전배양한 RD 세포]를 대략 2×105 cpm의 35S-표지 CVA21로 2h 동안 0℃에서 배양하였다. 저온의 PBS로 4회 세척 뒤, 세포를 다수의 튜브에 나누고 다양한 농도(0-100㎍/㎕)의 항-DAF SCR1 mAb 또는 항-ICAM-1 영역 1 mAb로 1h 동안 0℃에서 배양하였다. 세포와 상층액의 방사성을 액체 섬광 계수로 모니터하고 그 결과를 세포 용출 35S-표지 CVA21의 %로 표시하였다.
도 15. ICAM-1 발현의 지연 유도 이후 RD 세포의 CVA21 유도 용해성 감염. (A) 아데노바이러스 형질도입된 ICAM-1 발현의 시간 경과. 인간 ICAM-1 cDNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스 2.5×107 TCID50/㎖에 의한 형질도입으로, RD 세포가 인간 ICAM-1을 발현하도록 유도하였다. 항-ICAM-1 영역 mAb (IH4)를 이용하여 아데노바이러스 접종 후 여러 시점에서 ICAM-1 발현에 대해 유세포 분석으로 세포를 평가하였다. (B) 인간 ICAM-1 또는 CD36 cDNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스에 의한 형질도입 또는 가상 형질도입 후 24h에서 DAF, ICAM-1 및 CD36의 표면 발현을 나타내는 RD 세포의 유세포 분석. 실선 히스토그램은 DAF 발현을, 분홍색 히스토그램은 ICAM-1 발현을 그리고 청색 히스토그램은 CD36 발현을 나타낸다. ICAM-1 cDNA 또는 CD36 cDNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스는 Adeno-quest Kit(Quantum Biotechnologies Inc)를 이용하여 제조업체의 수칙에 따라 구성하였다. (C) 최대 24시간 후의 ICAM-1의 지연 발현을 통한 RD 세포의 CVA21 용해성 감염. DAF에 대한 CVA21 (moi = 1.0 TCID50) 결합 후 0, 6 및 24h에서 ICAM-1 또는 CD36 cDNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스 2.5×107 TCID50/㎖에 의한 형질도입으로, RD 세포가 ICAM-1 또는 CD36을 발현하도록 유도하였다. 미형질도입 RD 세포가 대조군으로 작용하였다. 4벌의 웰로부터의 세포 생존은 크리스탈 바이올렛/메탄올 용액으로 염색하여 정량화하고, 염색한 세포 단층의 상대적 흡광도를 멀티스캔 효소 면역 측정법 플레이트 판독기(미국 버지니아주 McLean의 Flow Laboratories)상에서 540nm에서 읽었다. 50% 종말점 역가를 Reed 및 Muench의 방법을 이용하여 계산하였고, 여기에서 흡광도가 무바이러스 웰 대조군 - 3 표준 편차보다 작은 경우 양(positive)으로 기록하였다. (D) CVA21 유도 용해성 감염. CVA21 (moi = 1.0 TCID50) 에 의한 배양 직후 인간 ICAM-1 또는 CD36 cDNA를 함유하는 재조합 아데노바이러스에 의한 형질도입 또는 가상 형질도입 후 24h에서 RD 세포 단층의 현미경 사진 (× 200).
도 16. 유방암, 난소암, 전립선암 및 결장암 세포주상의 수용체 발현. 3개의 인간 유방암, 난소암, 전립선암 및 결장암 세포주상의 ICAM-1 및 DAF 발현의 유세포 분석. 검은색이 칠해진 히스토그램은 접합체만을 나타내고, ICAM-1 발현은 회색 히스토그램으로 표현되고 DAF 발현은 빈 히스토그램으로 도시하였다.
도 17. CVA21-DAFv에 의한 생체 내 종양 용해. 인간 유방암, 난소암, 전립선암 및 결장암 세포의 시험관 내 배양물의 CVA21-DAFv-유도 감염의 현미경 사진. 세 포 단층을 CVA21 어버이 또는 CVA21-DAFv로 감염시키고 세포 변성 효과를 모니터하였다. 감염 후 72시간 동안 단층을 사진 촬영하였다.
도 18. 인간 유방암, 난소암, 전립선암 및 결장암 세포주에서의 CVA21-DAFv의 종양 용해 능력의 정량화. 96-웰 플레이트 내 암세포의 단층을 CVA21 또는 CVA21-DAFv의 스톡 제제의 10-배 희석물로 접종하였다. 72시간 동안의 배양 후, 단층의 세포 변성 효과 존재를 조사하였다. 50% 감염성 종말점 역가를 Reed 및 Muench의 방법을 이용하여, 현미경상 검출가능한 세포변성 효과(CPE)를 나타낸 웰을 양으로 기록함으로써 계산하였다.
도 19. CVA21-DAFv에 의한 인간 전립선 이종이식의 생체 내 종양 용해. 2×106개의 PC3 세포의 주사 뒤 측복부에 성장하는 피하 PC3 종양(대략 50-100㎣)을 함유하는 SCID(중증 합병성 면역 결핍) 마우스에 CVA21 어버이, CVA21-DAFv 또는 PBS의 단일 투약으로 정맥주사를 투여하였다. 평균 종양 크기는 캘리퍼스로 외부를 측정하였고 종양 부피는 타원체에 대한 공식을 이용하여 추산하였다. 종양 부피는 6마리의 처리한 마우스의 평균 +/- SE로 표시된다.
도 20. CVA21 #272598 분리주의 캡시드 부호화 지역의 서열. 각각 서열 번호 1 및 서열 번호 2에 대응하는 (a) 뉴클레오티드 서열 및 (b) 번역된 아미노산 서열.
도 21. CVA21 #275238 분리주의 캡시드 부호화 지역의 서열. 각각 서열 번호 3 및 서열 번호 4에 대응하는 (a) 뉴클레오티드 서열 및 (b) 번역된 아미노산 서 열.
도 22. CVA21 #272101 분리주의 캡시드 부호화 지역의 서열. 각각 서열 번호 5 및 서열 번호 6에 대응하는 (a) 뉴클레오티드 서열 및 (b) 번역된 아미노산 서열.
도 23. CVA21-DAFv의 캡시드 부호화 지역의 서열. 각각 서열 번호 7 및 서열 번호 8에 대응하는 (a) 뉴클레오티드 서열 및 (b) 번역된 아미노산 서열.
발명의 구현을 위한 형태(들)
제한된 유형의 암의 치료 용도에 몇몇 자연 발생 피코르나바이러스, 그리고 레오바이러스와 같은 기타 바이러스가 적합하다는 것이 공지되어 있지만, 개선된 치료를 개발할 필요가 여전히 존재한다. 암 치료의 가능한 범위를 확장하고 훨씬 더 효과적인 치료를 제공하기 위해, 본 발명자들은 변형 및 생물선택(bioselection)에 의해 신규 종양 용해 피코르나바이러스를 얻었다.
본 명세서에서 설명한 바와 같이, 본 발명자들은 DAF는 발현하지만 ICAM-1은 발현하지 않는, 보통은 야생형 피코르나바이러스 감염에 저항성인 세포를 용해성 감염하도록 야생형 피코르나바이러스를 생물선택할 수 있다는 사실을 발견하였다. 피코르나바이러스 감염에 대한 세포의 "저항성"은, 바이러스에 의한 세포의 감염이 유의적인 바이러스 생산 또는 수율을 나타내지 않았다는 것을 의미한다. "감수성" 세포는 세포 변성(cytopathic) 효과의 유도, 바이러스 단백질 합성, 및/또는 바이러스 생산을 나타내는 세포이다.
이 발견에 근거하여, 본 발명자들은 포유류의 신생물(neoplasm)을 치료하는 용도에 적합한 새로운 피코르나바이러스를 얻는 방법을 개발하였다. 포유류는 인간 또는 사회적, 경제적 또는 연구적 중요성을 갖는, 마우스, 개, 고양이, 양, 염소, 소, 말, 돼지, 인간 이외의 영장류 및 인간을 포함하나 이에 한정되지는 않는 임의의 종의 개체일 수 있다. 바람직한 구현예에서, 포유류는 인간이다.
피코르나바이러스는 자연 발생 또는 변형일 수 있다. 피코르나바이러스는 자연의 공급원에서 분리할 수 있고 실험실에서 인간이 의도적으로 변형하지 않은 때에 "자연 발생"이다. 예를 들어, 피코르나바이러스는 "야외 공급원": 즉 인간 환자로부터 얻을 수 있다.
피코르나바이러스는 변형되면서도, DAF 및/또는 ICAM-1을 발현하는 포유류 세포를 용해성 감염할 수 있다. 변형된 피코르나바이러스를 얻을 때까지 자연 발생 피코르나바이러스를 다수의 계대에 대해 세포주에서 배양함으로써 피코르나바이러스를 생물선택할 수 있다. 적합한 세포주는 암 세포주와 같은 DAF-발현 세포를 포함한다. 다른 세포주도 적합하다는 것을 이해하여야 한다.
피코르나바이러스는 피험체의 세포에 투여하기 전에 화학적 또는 생화학적으로 전처리할 수 있다(예컨대 키모트립신이나 트립신과 같은 프로테아제로 처리). 프로테아제 전처리는 바이러스의 외부 껍질(coat) 또는 캡시드를 제거하며 바이러스의 감염성을 증가시킬 수 있다. 피코르나바이러스는 리포좀 또는 마이셀(micelle) 내에 덮여져서 피코르나바이러스에 대한 면역을 발달시킨 포유류의 면역 반응을 감소 또는 방지할 수 있다. 예를 들어, 비리온(virion)을 마이셀 형성 농도의 알킬 설페이트 세제의 존재하에 키모트립신으로 처리하여 새로운 감염성 서 브비리온(subvirion) 입자를 생성할 수 있다.
피코르나바이러스는 서로 다른 병원성 표현형을 갖는 둘 이상의 유형의 피코르나바이러스의 재조합 피코르나바이러스가 되어, 서로 다른 항원 결정인자를 함유함으로써 피코르나바이러스 아형에 이전에 노출되었던 포유류의 면역 반응을 감소 또는 방지하도록 할 수 있다. 이러한 재조합 비리온은 서로 다른 아형의 피코르나바이러스로 포유류 세포를 동시 감염(co-infection)시키고, 서로 다른 아형 껍질 단백질의 재분류 및 비리온 캡시드 결과물로의 혼입에 의해 생성할 수 있다.
피코르나바이러스는 예컨대 VP1, VP2 및 VP3과 같은 돌연변이 껍질 단백질의 비리온 외부 캡시드로의 혼입으로 변형시킬 수 있다. 단백질은 대체, 삽입 또는 결실에 의해 돌연변이시킬 수 있다. 대체는 자연적인 아미노산 대신 다른 아미노산의 삽입을 포함한다. 삽입은 하나 이상의 위치에서 단백질로의 추가 아미노산 잔기의 삽입을 포함한다. 결실은 단백질 내 하나 이상의 아미노산 잔기의 결실을 포함한다. 이러한 돌연변이는 당업계에 공지된 방법으로 생성할 수 있다. 예를 들어, 껍질 단백질 가운데 하나를 부호화하는 유전자의 올리고뉴클레오티드 부위 지향 돌연변이 유발(mutagenesis)의 결과, 원하는 돌연변이 껍질 단백질을 생성할 수 있다. 피코르나바이러스 감염 포유류 세포 내에서의 돌연변이 단백질의 시험관 내(in vitro) 발현의 결과, 돌연변이 단백질의 피코르나바이러스 비리온 입자 내 혼입이 일어날 것이다.
피코르나바이러스는 또한 피코르나바이러스에 대한 면역 반응을 감소 또는 제거하도록 변형시킬 수 있다. 이러한 변형된 피코르나바이러스는 "면역 보호 피코 르나바이러스"라 지칭한다. 이러한 변형은 피코르나바이러스를 포유류 면역 체계로부터 가리기 위해 리포좀, 마이셀 또는 기타 운반체 내에 피코르나바이러스를 포장(packaging)하는 것을 포함할 수 있다. 대안으로, 피코르나바이러스 비리온 입자의 외부 캡시드를 제거 또는 변화시킬 수 있는데, 왜냐하면 외부 캡시드에 존재하는 단백질은 숙주의 체액 및 세포 반응의 주 결정인자이기 때문이다.
본 발명의 방법에서, 피코르나바이러스를 포유류 개체의 신생물에 투여한다. 이용할 수 있는 인간 피코르나바이러스의 대표적 유형은 장 바이러스, 쿡사키바이러스, 에코바이러스, 폴리오바이러스 및 미분류된 장 바이러스, 리노바이러스, 파라에코바이러스, 헤파토바이러스 및 카디오바이러스를 포함한다. 바람직한 형태에서, 피코르나바이러스는 쿡사키바이러스이다. 바람직하게는, 쿡사키바이러스는 유형 A, 보다 바람직하게는 쿡사키바이러스 A21이다. 서로 다른 동물 종의 피코르나바이러스와 같은 피코르나바이러스의 서로 다른 변종 및/또는 서로 다른 혈청형의 조합을 이용할 수 있다. 피코르나바이러스는 "자연 발생"이다: 즉, 자연의 공급원에서 분리할 수 있고 실험실에서 인간이 의도적으로 변형하지 않았다. 예를 들어, 피코르나바이러스는 "야외 공급원": 즉 인간 환자로부터 생물선택할 수 있다. 요구된다면, 피코르나바이러스는 신생물에 투여하기 전에 화학적 또는 생화학적으로 전처리할 수 있다(예컨대 키모트립신이나 트립신과 같은 프로테아제로 처리). 이러한 전처리는 바이러스의 외부 껍질을 제거함으로써, 그 결과 보다 양호한 바이러스 감염성이 나타날 수 있다.
신생물은 고형 신생물(예컨대 육종 또는 암종)이거나, 조혈 계통에 영향을 주는 암적 성장("조혈 신생물", 예컨대 림프종 또는 백혈병)일 수 있다. 신생물은 비정상적 조직 성장으로서, 일반적으로 구별되는 덩어리를 형성하며, 정상적 조직 성장보다 빠르게 세포 증식에 의해 성장한다. 신생물은 정상 조직과의 구조적 조직화 및 기능적 조화의 부분적 또는 완전한 결여를 보인다. 본 명세서에서 사용된 "신생물"은 "종양"으로도 지칭되며, 고형 신생물은 물론 조혈 신생물도 망라하고자 한다. 신생물의 적어도 일부의 세포는 DAF 및/또는 ICAM-1을 발현한다. 본 발명의 방법에 의한 치료에 특히 감수성인 신생물의 하나는 흑색종이다. 본 발명의 방법에 의한 치료에 특히 감수성인 다른 신생물은 유방암, 뇌암(예컨대 아교모세포종), 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백혈병, 난소암, 위 및 장암 등을 포함한다.
피코르나바이러스는 인산염 완충 식염수와 같은 생리학적 허용 담체 또는 운반체 내에서 신생물로 전형적으로 투여한다. "신생물에의 투여"는 피코르나바이러스를 신생물 세포(본 명세서에서 "신생물성 세포"로도 지칭)와 접촉하는 방식으로 투여한다는 것을 뜻한다. 피코르나바이러스의 투여 경로는 물론 그 제형, 담체 또는 운반체는 신생물의 유형은 물론 그 위치에 의존한다. 매우 다양한 투여 경로를 이용할 수 있다. 예를 들어 접근 가능한 고형 신생물의 경우, 피코르나바이러스는 신생물에의 직접 주입으로 투여할 수 있다. 예를 들어 조혈 신생물의 경우, 피코르나바이러스는 정맥주사 또는 혈관주사로 투여할 수 있다. 체내에서 쉽게 접근할 수 없는 전이 또는 뇌종양과 같은 신생물의 경우, 피코르나바이러스는 포유류의 신체를 통해 전신 수송되어 신생물에 도달하는 방식으로 투여할 수 있다(예컨대, 경막 투여, 정맥주사 또는 근육주사). 대안으로, 피코르나바이러스는 단일 고형 신생물에 직접 투여할 수 있고, 그러면 여기에서 신체를 통해 전이로 전신 운반된다. 또한, 피코르나바이러스는 피하투여, 복강투여, 국소투여(예컨대 흑색종에 대해), 경구투여(예컨대 구강 또는 식도 신생물에 대해), 직장투여(예컨대 직장결장 신생물에 대해), 질투여(예컨대 자궁경부 또는 질 신생물에 대해), 비강투여 또는 흡입 분사(예컨대 폐 신생물에 대해)할 수 있다.
일반적으로, 적합한 조성물은 당업자에게 공지된 방법에 따라 제조할 수 있으며 따라서 약학적 허용 담체, 희석제 및/또는 보조제(adjuvant)를 포함할 수 있다.
이들 조성물은 표준 경로로 투여할 수 있다. 일반적으로, 조성물은 비경구(예컨대 정맥주사, 척수강내, 피하 또는 근육주사), 경구 또는 국소 경로로 투여할 수 있다. 보다 바람직하게는 투여는 비경구 경로에 의한다.
담체, 희석제 및 보조제는 조성물의 다른 성분과의 적합성 관점에서 "허용가능"하여야 하며, 그 수령자에게 유해하지 않아야 한다.
약학적 허용 담체 또는 희석제는 탈이온수(demineralised water) 또는 증류수; 식염수; 식물 기반 오일, 예컨대 땅콩유, 홍화유, 올리브유, 면실유, 옥수수유, 참기름, 아라키스유(arachis oil) 또는 코코넛유; 폴리실록세인을 포함하는 실리콘 오일, 예컨대 메틸 폴리실록세인, 페닐 폴리실록세인 및 메틸페닐 폴리솔폭세인; 휘발성 실리콘, 미네랄 오일, 예컨대 액체 파라핀, 연질 파라핀 또는 스쿠알레인; 셀룰로스 유도체, 예컨대 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 카복시메틸셀룰로스, 소듐 카복시메틸셀룰로스 또는 하이드록시프로필메틸셀룰로스; 저급 알칸올, 예컨대 에탄올 또는 아이소-프로판올; 저급 아랄칸올; 저급 폴리알킬렌 글리콜 또는 저급 알킬렌 글리콜, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜 또는 글리세린; 지방산 에스테르, 예컨대 아이소프로필 팔미테이트, 아이소프로필 미리스테이트 또는 에틸 올레에이트; 폴리비닐피롤리돈; 한천; 트라가칸트 고무 또는 아카시아 고무, 및 석유 젤리이다. 전형적으로, 담체 또는 담체들은 조성물의 10 중량% 내지 99.9 중량%를 형성할 것이다.
본 발명의 조성물은 경구 소화에 적합한 제형(예컨대 캡슐, 정제, 당의제, 엘릭서제)의 형태, 국부투여에 적합한 연고, 크림 또는 로션의 형태, 안약으로서의 전달에 적합한 형태, 흡입투여, 예컨대 비강내 흡입 또는 경구 흡입에 적합한 에어로졸 형태, 비경구투여 즉 피하, 근육 또는 정맥주사에 적합한 형태가 될 수 있다.
주사 용액 또는 현탁액으로서의 투여를 위해, 비독성 비경구 허용 희석제 또는 담체는 링거 용액, 등장 식염수, 인산염 완충 식염수, 에탄올 및 1,2-프로필렌 글리콜을 포함할 수 있다.
경구 용도에 적합한 담체, 희석제, 부형제 및 보조제의 몇몇 예는 땅콩유, 액체 파라핀, 카복시메틸셀룰로스 소듐, 메틸셀룰로스, 알진산 소듐, 아카시아 고무, 트라가칸트 고무, 덱스트로스, 설탕, 소르비톨, 마니톨, 젤라틴 및 레시틴을 포함할 수 있다. 이에 덧붙여 이들 경구 제형은 적합한 착향 및 착색제를 함유할 수 있다. 캡슐 형태로 사용시 캡슐은 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다 이스테아레이트와 같은 붕해를 지연시키는 화합물로 코팅될 수 있다.
보조제는 연화제, 유화제, 증점제, 보존제, 살균제 및 완충제를 전형적으로 포함한다.
경구 투여용 고체 형태는 인간 및 수의과 약학 진료에 허용가능한 바인더, 감미제, 붕해제, 희석제, 착향제, 코팅제, 보존제, 윤활제 및/또는 시간 지연제를 함유할 수 있다. 적합한 바인더는 아카시아 검, 젤라틴, 옥수수 전분, 트라가칸트 검, 알진산 소듐, 카복시메틸셀룰로스 또는 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다. 적합한 감미제는 설탕, 유당, 포도당, 아스파탐 또는 사카린을 포함한다. 적합한 붕해제는 옥수수 전분, 메틸셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 구아 검, 잔탄 검, 벤토나이트, 알진산 또는 한천을 포함한다. 적합한 희석제는 유당, 소르비톨, 마니톨, 덱스트로스, 백토, 셀룰로스, 탄산 칼슘, 칼슘 실리케이트 또는 인산 이칼슘을 포함한다. 적합한 착향제는 박하유, 윈터그린, 체리, 오렌지 또는 래즈베리 향 오일을 포함한다. 적합한 코팅제는 아크릴산 및/또는 메타크릴산 및/또는 이들의 에스터의 중합체 또는 공중합체, 왁스, 지방 알콜, 제인(zein), 셸락, 또는 글루텐을 포함한다. 적합한 보존제는 벤조산 소듐, 비타민 E, 알파-토코페롤, 아스코르브산, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤 또는 중아황산 소듐을 포함한다. 적합한 윤활제는 스테아르산 마그네슘, 스테아르산, 올레산 소듐, 염화 소듐 또는 활석을 포함한다. 적합한 시간 지연제는 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 다이스테아레이트를 포함한다.
경구 투여용 액체 형태는 상기 물질들에 더해 액체 담체를 함유할 수 있다. 적합한 액체 담체는 물, 오일 예컨대 올리브유, 땅콩유, 참기름, 해바라기유, 홍화유, 아라키스유, 코코넛유, 액체 파라핀, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올, 프로판올, 아이소프로판올, 글리세롤, 지방 알콜, 트리글리세라이드 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
경구 투여용 현탁액은 분산제 및/또는 현탁제를 더 포함할 수 있다. 적합한 현탁제는 카복시메틸셀룰로스 소듐, 메틸셀룰로스, 하이드록시프로필메틸-셀룰로스, 폴리-비닐피롤리돈, 알진산 소듐 또는 아세틸 알콜을 포함한다. 적합한 분산제는 레시틴, 스테아르산과 같은 지방산의 폴리옥시에틸렌 에스터, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노- 또는 다이-올레에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노- 또는 다이-올레에이트, -스테아레이트 또는 -라우레이트 등을 포함한다.
경구 투여용 유제(emulsion)는 하나 이상의 유화제를 더 포함할 수 있다. 적합한 유화제는 상기 예시된 분산제 또는 자연 검 예컨대 구아 검, 아카시아 검 또는 트라가칸트 검을 포함한다.
비경구 투여 조성물의 조제방법은 당업자에게 명백하며, 예컨대 Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa.에 보다 상세히 기술되어 있으며, 이는 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
본 발명의 국소 제형은 활성 성분과 함께 하나 이상의 허용가능한 담체, 및 선택적으로 임의의 기타 치료 성분을 포함할 수 있다. 국소 투여에 적합한 제형은 치료가 필요한 부위로의 피부를 통한 관통에 적합한 액체 또는 반-액체 제제, 예컨 대 도찰제, 로션, 크림, 연고 또는 페이스트, 그리고 눈, 귀 또는 코에의 투여에 적합한 물약을 포함한다.
본 발명에 따른 물약은 멸균(sterile) 수성 또는 유성 용액 또는 현탁액을 포함할 수 있다. 이는 살균제 및/또는 살진균제 및/또는 임의의 기타 적합한 보존제, 그리고 선택적으로 계면활성제를 포함하는 수용액에 활성 성분을 용해시켜 조제할 수 있다. 생성된 용액은 여과로 투명하게 하고, 적합한 용기로 옮긴 뒤 멸균할 수 있다. 멸균은 1시간 반 동안 90℃-100℃에서 고압멸균(autoclave) 또는 유지, 또는 여과 뒤 무균(aseptic) 기법으로 용기로 옮김으로써 달성할 수 있다. 물약에 포함될 수 있는 적합한 살균제 및 살진균제의 예는 질산 또는 아세트산 페닐수은 (0.002%), 벤즈알코늄 클로라이드 (0.01%) 및 클로르헥시딘 아세테이트 (0.01%)이다. 유성 용액의 조제에 적합한 용매는 글리세롤, 희석 알콜 및 프로필렌 글리콜을 포함한다.
본 발명에 따른 로션은 피부 또는 눈에의 도포에 적합한 것들을 포함한다. 점안약은 선택적으로 살균제를 함유하는 멸균 수용액을 포함할 수 있고, 물약의 조제와 관련하여 앞서 기술한 방법과 유사한 방법으로 조제할 수 있다. 피부 도포용 로션 또는 연고는 알콜 또는 아세톤, 및/또는 글리세롤과 같은 보습제, 또는 피마자유 또는 아라키스유와 같은 오일과 같은, 건조 촉진 및 피부 냉각제를 포함할 수도 있다.
본 발명에 따른 크림, 연고 또는 페이스트는 외부 도포용 활성 성분의 반-고체 제형이다. 이는 미분 또는 분말 형태의 활성 성분을, 단독 또는 용액으로 또는 수성 또는 비수성 유체의 현탁액으로 유지성 또는 비유지성 기제와 혼합하여 만들 수 있다. 기제는 탄화수소 예컨대 경질, 연질 또는 액체 파라핀, 글리세롤, 밀랍, 금속성 비누; 점액(mucilage); 자연 기원의 오일 예컨대 아몬드유, 옥수수유, 아라키스유, 피마자유 또는 올리브유; 양털지방 또는 그 유도체, 또는 스테아르산 또는 올레산과 같은 지방산과 프로필렌 글리콜 또는 마크로골과 같은 알콜을 포함할 수 있다.
조성물은 소르비탄 에스터 또는 그 폴리옥시에틸렌 유도체와 같은 음이온, 양이온 또는 비이온 계면활성제와 같은 임의의 적합한 계면활성제를 혼입할 수 있다. 자연 검, 셀룰로스 유도체 또는 실리카성 실리카(silicaceous silica)와 같은 무기 물질과 같은 현탁제, 및 라놀린과 같은 기타 성분 또한 포함할 수 있다.
피코르나바이러스 또는 피코르나바이러스로부터 얻은 또는 유도된 핵산은 신생물 치료에 충분한 양으로 투여한다(예컨대, "유효량"). 피코르나바이러스의 신생물 세포 투여가 신생물 세포의 종양 용해를 일으켜, 그 결과 신생물 크기의 감소 또는 신생물의 완전한 제거를 가져올 때 신생물은 "치료"된다. 신생물 크기의 감소 또는 바람직하게는 신생물의 제거는 피코르나바이러스에 의한 신생물 세포의 용해("종양 용해")에 의해 일반적으로 유발된다. 유효량은 개체 기준으로 결정될 것이며, 적어도 부분적으로는 피코르나바이러스의 유형; 개체의 크기, 연령, 성; 및 신생물의 크기 및 기타 특성의 고려에 근거할 수 있다. 예를 들어, 인간의 치료의 경우, 존재하는 종양의 유형, 크기 및 개수에 따라 대략 102 내지 1012 의 플라크 형성 단위(PFU)의 피코르나바이러스를 이용할 수 있다. 바람직하게, 접종물은 약 105 PFU 초과, 예를 들어 약 105 내지 106 PFU 또는 약 106 내지 107 PFU를 함유할 것이다. 보다 바람직하게, 접종물은 약 1×106 내지 약 5×106 PFU, 예컨대 약 3×106 PFU를 함유할 수 있다. 예를 들어, 인간의 흑색종 치료의 경우, 하나 이상의 약 3×106 PFU의 접종물을 이용할 수 있다. 피코르나바이러스는 단일 투약, 또는 다수 투약(즉 일회 초과 투약)으로 투여할 수 있다. 다수 투약은 동시에 또는 연속적으로(예컨대 수일 또는 수주의 기간 동안) 투여할 수 있다. 전형적으로, 치료적 적용에서 치료는 질병 상태의 지속 동안, 예컨대 적어도 신생물을 통상의 방법으로 더 이상 검출할 수 없을 때까지가 될 것이다. 예컨대 치료하는 의사가 검출되지 않는 신생물이 존재할 수 있다는 의심이 들 때, 검출가능한 신생물의 존재를 넘어 일정 기간 동안 치료를 지속하는 것이 바람직할 수 있다는 것 또한 고려한다. 피코르나바이러스 또는 핵산은 동일 개체의 하나 이상의 신생물에 투여할 수도 있다.
피코르나바이러스의 다수 투여를 원하는 경우, 이미 투여한 바이러스에 대한 면역 반응의 효과를 회피 또는 최소화하기 위해 각 시점에 서로 다른 바이러스를 투여할 수 있고, 치료 과정은 1 내지 2주 이상 동안에 이를 수 있으며 이는 담당 의사가 결정할 수 있다. 보다 바람직하게, 포유류가 이미 노출되지 않은 또는 표준 기법으로 측정시 포유류가 상대적으로 작은 면역 반응을 일으키는 바이러스를 투여할 수 있다.
본 발명은 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염시킬 수 있는 피코르나바이러스의 분리된 핵산 분자를 포함한다. 한 구현예에서, 핵산은 피코르나바이러스로부터 유도될 수 있으며 바이러스로부터의 단일 가닥 RNA 또는 상보성 DNA일 수 있다. 본 발명의 핵산 서열은 피코르나바이러스로부터 유도된 핵산 서열, 예컨대 바이러스 지놈(genome)을 부호화하는 핵산 서열 또는 바이러스의 생성을 허용 또는 세포 내 용해성 감염을 유도하는 데 충분한 그 서열을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 예를 들어, 핵산 분자는 상보성 DNA 분자와 같은 단일 바이러스 RNA 또는 DNA 분자, 또는 서로 다른 바이러스 서열을 부호화하는 복수의 그러한 분자를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "폴리뉴클레오티드"는 디옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 염기 또는 공지 유사체 또는 자연 뉴클레오티드 또는 이의 혼합물의 단일- 또는 이중-가닥 중합체를 지칭한다.
본 명세서의 문맥에서 용어 "유도된"은 따라서 서열이 피코르나바이러스로부터 직접 분리된 바이러스 RNA, 합성 RNA, 분리된 서열에 대응하는 cDNA일 수 있다는 것을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 이 용어는 또한 야생형 서열 또는 부모 서열과 대비하여 서열 내 하나 이상의 돌연변이, 예컨대 캡시드 단백질의 돌연변이를 포함하는 합성 폴리뉴클레오티드 서열도 포함한다.
바이러스 RNA 분리를 위해 어떠한 적합한 방법도 이용할 수 있으며, 이는 Trizol® LS 시약(미국 뉴욕주 Life Technologies Grand Island의 GIBCO BRL)과 같은 바이러스 RNA의 분리용 상업적 키트 형태로 제공되는 바와 같은 페놀/클로로폼 추출의 이용을 기반으로 한 방법, Ambion MagMax™ 바이러스 RNA 분리 키트와 같은 자기 비드 기반 분리를 이용하는 분리 방법을 포함한다. 바이러스 RNA 분리를 위한 방법은 예컨대 Ausubel, F., et al., eds. Current Protocols in Molecular Biology. 1992, Green Publishing Associates and Wiley-Interscience, John Wiley and Sons: New York. 및 Sambrook et al., (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York에 일반적으로 기술되어 있다.
본 발명은 본 명세서의 문맥에서 "분리된" 것으로 간주되기 위해 바이러스 RNA와 같은 핵산 서열이, 바이러스로부터 직접 분리된, 합성된, 플라스미드 분자로서 제공되는 또는 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 cDNA 주형으로부터에서와 같이 시험관 내(in vitro) 생성된 것인지에 관계없이, 세포 부스러기와 같은 오염 물질이 없을 것을 요구하지 않는다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 본 명세서의 문맥에서 RNA는 세포 단백질과 같은 공급원 물질로부터의 비-RNA 성분이 RNA로부터 부분적으로 또는 완전히 제거된 때에 분리된 것으로 간주될 것이다. 예를 들어, RNA는 비-RNA 물질의 50% 초과가 제거된 때 "분리된" 것으로 간주될 수 있을 것이다. 비-RNA 물질의 60% 초과가 제거되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 비-RNA 물질의 70%, 80% 또는 90% 초과가 제거될 것이다. 전형적으로, RNA는 10% 미만의 오염 물질, 보다 전형적으로는 5% 미만의 오염 물질을 함유할 것이다. 따라서, RNA는 바이러스 RNA에 대해 바람직하게는 95% 초과로 순수, 더욱 더 바람직하게는 97% 초과로 순수 또는 99% 초과로 순수할 것이다.
바람직하게, 핵산 분자는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 및 서열 번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열을 포함한다. 당업자는, 유전 부호의 축퇴를 고려하면 이들 폴리뉴클레오티드 분자에 상당한 서열 변이(variation)가 가능하다는 것을 인식할 것이다.
본 발명은 또한 예컨대 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 및 서열 번호 7과 같이 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오티드와 실질적으로 유사한 분리된 폴리뉴클레오티드 서열을 제공하며, 여기에서 이러한 서열은 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염시킬 수 있는 피코르나바이러스의 능력을 포함 또는 제공한다. 폴리뉴클레오티드 서열 변이는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 및 서열 번호 7 가운데 하나 이상의 서열과 정성적 생물학적 공통 활성을 소유한다. 본 명세서에서 사용된 용어 "실질적으로 유사"는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 및 서열 번호 7 가운데 하나에 나타난 서열에 약 60% 이상, 보다 바람직하게는 약 70% 이상, 더욱 더 바람직하게는 약 80% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 나타내는 데 이용된다. 전형적으로, 이러한 서열은 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 및 서열 번호 7 가운데 하나에 보다 바람직하게는 약 90% 이상, 그리고 가장 바람직하게는 약 95% 이상 동일할 것이다.
본 명세서에서 사용된 "서열 동일성"이란 GCG 프로그램 패키지에 제공되는 GAP(Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1996, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711) (Needleman, S.B. and Wunsch, C.D., (1970), Journal of Molecular Biology, 48, 443-453)와 같은 당업계에 공지된 컴퓨터 프로그램에 의해 특정 비교 범위에서 최대 대응이 되도록 정렬시에 동일한 두 서열 내 잔기를 지칭한다.
본 발명의 서열에 대한 상기 설명에 더해, 본 발명의 서열은 변이 서열, 예를 들어 폴리펩티드 서열의 경우 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 변경 예컨대 보존성 아미노산 변화를 포함하는 서열, 및 폴리뉴클레오티드 서열의 경우 하나 이상의 아미노산 치환, 결실 및/또는 변경 예컨대 하나 이상의 보존성 아미노산 변화를 포함하는 폴리펩티드 서열을 부호화하는 서열을 포함한다는 것을 이해하여야 한다. 이들 변화는 바람직하게는 사소한 속성으로서, 즉 서열의 활성, 예컨대 세포간 부착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염시킬 수 있는 능력을 바이러스에 부여, 에 상당한 영향을 주지 않는 보존성 아미노산 치환 및 기타 치환이다. 보존성 아미노산 치환 및 그 도입 방법은 당업계에 공지되어 있으며 폴리펩티드 사슬(단백질의 1차 서열) 내에서 하나의 아미노산을 유사한 성질을 갖는 또 하나의 아미노산으로 치환 또는 대체하는 것을 일반적으로 지칭한다. 예를 들어, 전하를 띤 아미노산 글루탐산(Glu)으로 유사하게 전하를 띤 아미노산 아스파르트산(Asp)을 치환하는 것은 보존적 아미노산 치환이 될 것이다. 다음 표를 지침으로 이용할 수 있다.
보존적 아미노산 치환
염기성 아르기닌, 리신, 히스티딘 소수성 류신, 아이소류신, 발린
산성 글루탐산, 아스파르트산 방향족 페닐알라닌, 트립토판, 티로신
극성 글루타민, 아스파라긴 소형 글리신, 알라닌, 세린, 트레오닌, 메티오닌
변이 서열(variant sequence)은 예컨대 본 명세서에서 기술한 캡시드 단백질 변경의 보존적 치환을 포함한다. 예를 들어, 변이체(mutant) VP3 R96H의 보존적 치환, 예컨대 VP3 R96K를 포함하는 서열은 원하는 성질을 가질 수 있을 것으로 예측될 것이다. 유사하게, 변이체 VP3 E101A의 보존적 치환, 예컨대 VP3 E101G, VP3 E101T, VP3 E101S, 또는 VP3 E101M을 포함하는 하나 이상의 서열은 원하는 성질을 가질 수 있을 것으로 예측될 것이다. 추가 예로서, 변이체 VP3 A239S의 보존적 치환, 예컨대 VP3 A239G, VP3 A239T 또는 VP3 A239M을 포함하는 하나 이상의 서열은 원하는 성질을 가질 수 있을 것으로 예측될 것이다. 더 추가의 예로서, 변이체 VP2 S164L의 보존적 치환, 예컨대 VP2 S164I 또는 VP2 S164V를 포함하는 하나 이상의 서열은 원하는 성질을 가질 수 있을 것으로 예측될 것이다.
변이 서열은 본 명세서에서 설명한 본 발명에 따른 기능성에 대해 용이하게 시험할 수 있다.
피코르나바이러스는 RNA 지놈 또는 지놈의 상보성 DNA 카피를 이용하여 간접 투여할 수 있다는 것을 이해하여야 한다. 투여시, 피코르나바이러스는 여전히 세포 내에서 복제가 가능하여, 원하는 용해성 감염 및 살상을 유발할 수 있을 것이다.
따라서, 본래대로의 바이러스 대신, 바이러스 생성을 위한 핵산을 혼입한 바이러스 또는 기타 플라스미드 또는 발현 벡터를 종양에 주입하여, 종양 세포가 이를 취해 세포 내에서 본래대로의 바이러스를 생성시켜 치료를 일으킬 수 있다. 적합한 발현 벡터는 바이러스 생성에 필요한 바이러스 단백질을 부호화하는 DNA(예컨대 지놈 DNA 또는 cDNA) 삽입(insert)의 발현 능력이 있는 플라스미드를 포함한다. 발현 벡터는 삽입된 핵산이 작동 연결된 전사 조절 제어 서열을 전형적으로 포함할 것이다. "작동 연결"이란 핵산 삽입이 삽입의 판독틀 내 이동 없이 삽입된 서열(들)의 전사를 허용하는 전사 조절 제어 서열에 연결되어 있는 것을 의미한다. 이러한 전사 조절 제어 서열은 전사 개시를 위한 RNA 폴리머라제의 결합 촉진을 위한 프로모터, 그리고 리보솜의 전사된 mRNA에의 결합 실현을 위한 전사 제어 요소를 포함한다.
보다 구체적으로, 용어 본 명세서에서 사용된 "조절 제어 서열"은 임의의 DNA 서열의 전사 구동 및 전사 수준 제어(즉 조절)에 관여하는 어떠한 DNA도 망라하도록 사용된다. 예를 들어, 5' 조절 제어 서열은 부호 서열의 상부에 위치하며, 프로모터 및 5' 미해독 선도 서열을 포함할 수 있는 DNA 서열이다. 3' 조절 제어 서열은 부호 서열(들)의 하부에 위치하며, 하나 이상의 폴리아데닐화 신호를 비롯하여 적합한 전사 종결 (및/또는) 조절 신호를 포함할 수 있는 DNA 서열이다. 본 명세서에서 사용된 용어 "프로모터"는 전사의 개시 동안에 DNA-의존성 RNA 폴리머라제가 인식 및 결합(직접 또는 간접)하는 어떠한 DNA 서열도 망라한다. 프로모터는 전사 개시 부위, 그리고 전사 개시 인자 및 RNA 폴리머라제의 결합 부위를 포함하며, 유전자 발현 조절 단백질이 결합할 수 있는 다양한 기타 부위 또는 서열(예컨대 증강자)을 포함할 수 있다.
포유류 세포의 이입(transfection)에 적합한 많은 발현 벡터가 당업계에 공지되어 있다. 포유류 세포의 이입에 적합한 발현 벡터는 pSV2neo, pEF-PGk, puro, pTk2 및 폴리아데닐화 부위 및 연장 인자 1-x 프로모터를 혼입한 비복제 아데노바이러스 셔틀 벡터 그리고 거대세포 바이러스(cytomegalovirus, CMV)를 가장 바람직하게 혼입한 pAdEasy 기반 발현 벡터를 포함한다(예컨대 He et al., 1998 참조). 폴리펩티드 연장 인자-알파 2를 프로모터로서 채용하는 플라스미드 pEFBOS 또한 이용할 수 있다. 바이러스 생성에 필요한 바이러스 단백질을 부호화하는 cDNA는 바이러스 RNA 지놈 또는 그 단편을 역전사하여 제조하고, 당업계에 널리 공지된 재조합 기법, 예컨대 Sambrook et al. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Ed., Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, and Ausubel et al., (1994), Current Protocols in Molecular Biology, USA, Vol. 1 and 2에 기술된 방법을 이용하여 적합한 벡터 내에 혼입할 수 있다.
cDNA 대신, 세포는 정제된 비리온에서 추출한 바이러스 RNA로 이입(transfection)시킬 수 있고, 또는 예를 들어 RNA 전사물을, Ansardi, D.C., et al., 2001에 기술된 바와 같이 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 cDNA 주형으로부터 시험관 내 생성할 수 있다.
유사하게, 바이러스 단백질의 발현 및 바이러스 생성을 위해 단일 플라스미드 또는 RNA 분자를 투여할 수 있거나, 세포의 이입 및 바이러스 생성을 위해 서로 다른 바이러스 단백질들을 부호화하는 복수의 RNA 분자 또는 플라스미드를 투여할 수 있다.
플라스미드 또는 RNA는 세포의 이입 촉진용 담체 운반체의 부재 상태로 또는 그러한 운반체와 함께, 종양 세포에 의한 섭취를 위해 종양에 예컨대 국부투여 또는 주사투여할 수 있다. 적합한 담체 운반체는 당업계에 통상적으로 공지된 수중유(oil-in-water) 유제로서 전형적으로 제공되는 리포좀을 포함한다. 리포좀은 지질의 조합, 특히 리포좀에 막 안정성을 부여하는 콜레스테롤과 같은 하나 이상의 스테로이드 또는 스테로이드 전구체와 통상 함께 높은 상전이 온도 인지질과 같은 인지질을 전형적으로 포함할 것이다. 리포좀 제공에 유용한 지질의 예는 포스파티딜 화합물, 예컨대 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 스핑고지질, 포스파티딜에탄올아민, 세레브로사이드 및 갱글리오사이드를 포함한다. 다이아실 포스파티딜글리세롤이 특히 적합하며, 여기에서 지질 모이어티(moiety)는 14 내지 18개의 탄소 원자, 보다 바람직하게는 16 내지 18개의 탄소 원자를 함유하며, 포화되어 있다.
피코르나바이러스 또는 피코르나바이러스를 포함하는 조성물은 리포좀 형태로 투여할 수 있다. 리포좀은 인지질 또는 기타 지질 물질로부터 일반적으로 유도되며, 수성 매질에 분산된 단일- 또는 다중-층상(lamellar) 수화 액정에 의해 형성된다. 리포좀을 형성할 수 있는 임의의 비독성 생리학적 허용 및 대사가능한 지질을 이용할 수 있다. 리포좀 형태의 조성물은 안정제, 보존제, 부형제 등등을 함유할 수 있다. 바람직한 지질은 인지질 및 포스파티딜콜린(레시틴)이며 자연 및 합성 모두가 가능하다. 리포좀 형성방법은 당업계에 공지되어 있으며, 이와 관련하여 특히 Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p.33 이하를 참조하며, 이 내용은 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
리포좀의 표적 세포와의 상호작용은 수동적 또는 능동적이 될 수 있다. 능동 표적화는, 표적 세포가 발현하는 대응 리간드와 결합 또는 기타 상호작용하는 특정 리간드의 리포좀 막 내 편입에 의한 리포좀의 변형을 포함한다. 이러한 리간드는 예컨대 단클론 항체 또는 그 결합 단편(예컨대 Fab 또는 F(ab')2 단편), 당 또는 당지질 모이어티, 또는 바이러스 단백질을 포함하고, 또는 DAF에 특이적인 단클론 항체가 특히 바람직하다.
피코르나바이러스는 다른 치료제와 함께 투여할 수 있다. 예를 들어, 피코르나바이러스는 하나 이상의 피코르나바이러스의 서로 다른 혈청형(들) 또는 변종(들)과 함께 투여할 수 있다. 피코르나바이러스의 추가 혈청형(들) 또는 변종(들)은 본 발명의 피코르나바이러스와 같거나 다른 세포 감염에 대한 수용체 요구조건을 가질 수 있다.
추가 예로서, 피코르나바이러스 또는 그 조합은 치료되는 개체 내 면역 반응을 조절 또는 억제할 수 있는 하나 이상의 물질과 함께 투여할 수 있다. 이 방식으로, 바이러스 감염에 대한 개체의 자연 면역 반응을 변경함으로써, 바람직하게는 보다 효과적인 바이러스 감염 및/또는 종양 용해성 결과가 가능하다. 전형적으로, 면역 반응을 변경할 수 있는 물질은 면역 반응을 억제할 수 있는 물질이다. 인간 개체와 같은 개체 내 면역을 조절 또는 억제할 수 있는 물질은 예컨대 The Merck Index, Thirteenth Edition, Merck & Co. Inc, Whitehouse Station, NJ, USA.에 기술되어 있으며, 그 내용은 참조에 의해 본 명세서에 편입된다.
피코르나바이러스, 또는 그 조합은 항신생제로도 지칭되는 하나 이상의 화학요법제와 조합하여 이용할 수 있다. 항신생제는 예컨대 The Merck Index, Thirteenth Edition, Merck & Co. Inc, Whitehouse Station, NJ, USA.에 기술되어 있다. 예를 들어, 피코르나바이러스는 화학요법제와 함께 투여할 수 있으며, 그 예는 아드리아마이신, 탁솔, 플루오로우라실, 멜팔란, 시스플라틴, 알파 인터페론, COMP (사이클로포스파마이드, 빈크리스틴, 메토트렉세이트 및 프레드니손), 에토포사이드, mBACOD (메토트렉세이트, 블레오마이신, 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 빈크리스틴 및 덱사메타손), PROMACE/MOPP (프레드니손, 메토트렉세이트(류코빈 구조제와 함께), 독소루비신, 사이클로포스파마이드, 탁솔, 에토포사이드/메클로레타민, 빈크리스틴, 프레드니손 및 프로카바진), 빈크리스틴, 빈블라스틴, 안지오인히빈, TNP-470, 펜토산 폴리설페이트, 혈소판 인자 4, 안지오스타틴, LM-609, SU-101, CM-101, 테크갈란, 탈리도마이드, SP-PG 등등이다. 다른 화학요법제는 질소 머스터드와 같은 알킬화제, 예컨대 메클로레타민, 멜판, 클로람부실, 사이클로포스파마이드 및 이포스파마이드; 나이트로소요소, 예컨대 카무스틴, 로무스틴, 세무스틴 및 스트렙토조신; 에틸렌이민, 예컨대 싸이오테파 및 헥사메틸멜라민; 엽산 유사체, 예컨대 메토트렉세이트; 피리미딘 유사체, 예컨대 5-플루오로우라실, 사이토신 아라비노사이드; 퓨린 유사체, 예컨대 6-머캡토퓨린 및 6-싸이오구아닌; 항종양 항생제, 예컨대 악티노마이신 D; 안트라사이클린, 예컨대 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신 C 및 메트라마이신; 호르몬 및 호르몬 길항제, 예컨대 타목시펜 및 코르티오스테로이드 및 각종 물질, 예컨대 시스플라틴 및 브레퀴나르(brequinar)를 포함한다. 피코르나바이러스는 예컨대 흑색종 치료를 위해 블레오마이신, 빈데신, 빈크리스틴, 닥타마이신, 프로카바진, 로무스틴 또는 다카바진 가운데 하나 이상과 조합하여 사용할 수 있다. 피코르나바이러스는 예컨대 난소암 치료를 위해 시스플라틴 및 카보플라틴 가운데 하나 이상과 조합하여 사용할 수 있다. 예컨대 유방암 치료를 위해 피코르나바이러스와 조합하여 사용할 수 있는 화학요법제의 추가 예는 사이클로포스파마이드(사이톡산), 메토트렉세이트(아메톱테린, 멕세이트, 폴렉스), 및 플루오로우라실(플루오로우라실, 5-Fu, 아드루실)[약자 CMF]; 사이클로포스파마이드, 옥소루비신(아드리아마이신), 및 플루오로우라실[약자 CAF]; 독소루비신(아드리아마이신) 및 사이클로포스파마이드[약자 AC]; 독소루비신(아드리아마이신) 및 사이클로포스파마이드와 함께 파클리탁셀(탁솔); 독소루비신(아드리아마이신) 다음 CMF; 사이클로포스파마이드, 에피루비신(엘렌스), 및 플루오로우라실을 포함한다. 유방암 여성의 치료에 이용하는 다른 화학요법 약물은 예컨대 도세탁셀(탁소텔), 비노렐빈(나벨빈), 젬시타빈(젬자), 및 카페시타빈(젤로다)을 포함한다.
하나 이상의 추가 물질, 예컨대 하나 이상의 추가적 피코르나바이러스, 면역 반응을 조절 또는 자극할 수 있는 하나 이상의 물질, 또는 하나 이상의 항신생제와의 "조합"에 의한 피코르나바이러스의 이용 또는 투여는 피코르나바이러스와 추가 물질(들)이 중첩되는 시간적 효과와 같은 치료 효과를 갖는 임의의 방식의 이용 또는 투여를 의미한다. 조합의 구성 성분들은 원하는 치료 효과를 제공하는 어떠한 순서로도 동시에 또는 개별적으로 투여할 수 있다. 조합 요법의 고려시, 피코르나바이러스와 추가 물질(들)은 물리적 혼합으로, 또는 투여 수칙이 있거나 없는 키트 형태와 같이 별도로 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 키트는 본 발명의 방법을 실행하는 데 필요한 기타 성분, 예컨대 완충액 및/또는 희석제를 포함할 수도 있다. 키트는 다양한 성분을 수용하기 위한 용기 및 본 발명의 방법에서 키트 성분을 이용하기 위한 수칙을 전형적으로 포함한다.
본 발명의 약학적 조성물은 하나 이상의 추가 치료 물질(들)과 물리적 혼합된 피코르나바이러스의 조성물은 물론, 피코르나바이러스를 유일한 치료 활성 물질로 포함하는 조성물도 포함한다는 것을 이해하여야 한다.
본 발명의 방법에서 피코르나바이러스는 신생물 치료의 다른 방법, 예컨대 신생물의 수술적 용적 축소(debulking) 또는 절제 및/또는 화학 요법 및/또는 방사선 요법과 결합하여 이용할 수 있다. 예를 들어, 고형 신생물의 치료를 원하는 경우, 피코르나바이러스는 신생물의 수술적 용적 축소 또는 절제의 보조약(adjunct)으로서 이용할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "분리된" 바이러스는, 바이러스와 함께 발견되는 성분의 전부 또는 일부가 제거된 또는 그로부터 제거된 바이러스이며, 이는 자연 발생 바이러스 또는 인간이 의도적 또는 비의도적으로 변형한 바이러스인지에 관계없다. 이러한 성분은 오염 성분으로 지칭할 수 있다. "분리된" 바이러스는 모든 오염 성분이 제거된 의미의 바이러스의 순수 제제일 필요는 없다는 것을 이해하여야 한다. 따라서, 바이러스는 비-바이러스 성분이 바이러스로부터 부분적으로 또는 완전히 제거된 때에 "분리된" 것으로 간주될 것이다. 예컨대 바이러스는 오염 물질의 대략 50% 초과가 제거된 때 "분리된" 것으로 간주될 것이다. 오염 물질의 대략 60% 초과가 제거되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 오염 물질의 대략 70% 초과가 제거된다. 전형적으로, 분리된 바이러스는 오염 물질의 대략 80% 초과 또는 오염 물질의 대략 90% 초과가 제거되어 있다. 보다 전형적으로, 오염 물질의 대략 95% 초과, 또는 대략 97% 초과가 제거된다. 한 구현예에서, 오염 물질의 99% 초과가 제거된다.
본 명세서에서 사용된 "ICAM-1의 실질적 부재시"는 세포를 참조하여 사용시, 세포가 ICAM-1을 최소로 발현 또는 발현하지 않는다는 것을 뜻한다. 특히, 감염을 위해 ICAM-1의 존재를 필요로 하는 바이러스에 의한 세포의 용해성 감염의 기초를 제공하기에 그러한 세포가 불충분한 ICAM-1을 발현한다는 것을 이해하여야 한다.
본 명세서에서 사용된 세포를 바이러스와 "접촉"시키는 것은 바이러스가 세포와 접촉할 기회를 갖도록 바이러스를 세포의 배양물 내에 위치시키는 것을 지칭하며, 이는 바이러스의 성공적 감염 또는 세포자멸사(apoptosis)에 의한 세포 사멸의 유도로 이어질 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "바이러스 감염"은 바이러스의 세포 내 유입 및 후속하는 바이러스의 세포 내 복제 또는 세포자멸사에 의한 세포 사멸의 유도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "감염 다중도"는 바이러스를 이용하여 세포를 접촉시킬 때 세포 개수에 대한 바이러스 개수의 비율을 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "세포 용해"는 세포의 세포막의 파괴 및 후속하는 세포 내용물 전부 또는 일부의 배출 또는 세포자멸사에 의한 세포 사멸의 유도를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "완전한 용해"는 다수 세포의 배양물에서 모든 세포의 용해를 지칭한다.
본 명세서에서 사용된 "배양 조건"은 세포 배양에 사용하는 조건을 지칭하며, 이는 온도, 배양 용기의 유형, 습도, 배양 용기에 이용하는 CO2 또는 임의의 기타 기체의 농도, 배지의 유형, 배양 세포의 최초 밀도, 그리고 세포가 바이러스로 감염된 경우에는 최초의 감염 다중도를 포함하나 이에 한정되지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 "세포 연관된" 바이러스는 바이러스가 생성된 세포의 일부에 부착 또는 포착된 바이러스를 지칭한다. 따라서, 바이러스는 숙주 세포의 용해 전에는 세포 연관되어 있다. 세포 용해가 시작된 때, 바이러스는 깨진 세포의 일부에 여전히 부착 또는 포착되어 세포 연관을 유지할 수 있다. 그러나, 바이러스가 배지로 유리 상태로 배출되면, 더 이상 세포 연관되지 않는다.
본 명세서에서 세포는 세포막이 파열되어 세포 내용물의 적어도 일부가 세포로부터 배출되는 때에 "파괴"된다. 세포는 예를 들어 냉동-해동, 초음파 처리 또는 세제 처리리로 파괴될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 바이러스의 "수확"은 앞서 바이러스로 감염된 세포 배양물로부터 생산된 바이러스를 수집하는 행위를 지칭한다. 바이러스의 수확은 만일 바이러스가 여전히 세포 연관되어 있다면 숙주 세포를 깨는 것을 포함할 수 있다. 대안으로 하지만 덜 바람직하게는, 배지로 배출된 바이러스 입자를 배지로부터 수확할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "세포 변성 효과"는 세포가 팽윤 및 외관상 과립성(granular)이 되는 것으로 나타나며 세포막은 파괴된다. 세포 변성 효과를 보이는 세포는 생존 세포 계수(viable cell count)에서 음성 염색되는데, 왜냐하면 이는 염색약 또는 세포 DNA의 분해를 흡수할 것이기 때문이다.
본 명세서에서 사용된 "고착 세포"는 세포 배양물에서 배양 용기에 고착하는 세포를 지칭한다. 고착 세포의 예는 단층 세포, 즉 배양 용기 표면상에 단일 세포층을 형성하는 세포이다. "현탁 세포" 또는 "현탁된 세포"는 세포 배양물에서 배양 용기에 고착하지 않는 세포를 지칭한다. 현탁 세포는 "스핀 배양물", 즉 배양 과정 동안 배지를 계속하여 교반하는 배양물에서 성장할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "세포의 생존도" 또는 "생존 유지 세포의 백분율"은 모집단에서 세포 변성 효과를 보이지 않는 세포의 백분율이다.
본 명세서에서 사용된 "수확 시점"은 피코르나바이러스를 수확 및 정제하는 시점을 지칭한다. 바이러스는 역가가 충분히 높고 바이러스가 아직 세포-연관일 때에 바람직하게 수확한다. 완전한 세포 용해가 일어난 뒤에도 바이러스를 수확할 수 있지만, 정제 과정의 간소화를 위해 세포로부터 배출되기 전에 바이러스를 수확하는 것이 선호된다. 따라서, 세포의 생존도는 바이러스가 아직 세포-연관인지의 지표로서 관례적으로 측정한다. 바이러스는 5% 이상의 세포가 생존일 때 일반적으로 수확한다. 바람직하게, 바이러스는 20-95%의 세포가 생존일 때, 보다 바람직하게는 35-90%의 세포가 생존 유지일 때, 그리고 가장 바람직하게는 50-80%의 세포가 생존 유지일 때 수확한다.
본 발명을 보다 명확하게 이해시키기 위해 바람직한 형태를 다음의 실시예 및 도면을 참조하여 설명할 것이나, 이는 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 아니된다.
재료 및 방법
세포 및 바이러스
쿡사키바이러스 A21 (CVA21) 원형 변종 Kuykendall 및 세 개의 임상 분리주 (#272101, #272598 및 #275238)를 오스트레일리아 빅토리아 멜버른 페어필드 호스피탈의 Entero-respiratory Laboratory의 Margery Kennett 박사로부터 얻었다. 분리주 #272101은 HIV 감염된 26세 남성으로부터, 분리주 #275238은 영아 돌연사 증후군으로 사망한 3개월 된 아기로부터, 분리주 #272598은 급성 크룹을 앓고 있는 8세 소년으로부터 얻었다. 임상 CVA 분리주를 HeLa 세포 및/또는 인간 폐 섬유모세포 또는 HeLa-T 세포에서 대략 3회, 그리고 ICAM-1 발현 가로무늬근육종(RD) 세포(RD-ICAM-1)에서 1회 계대하였다 (Shafren, D. R., D. J. Dorahy, R. A. Ingham, G. F. Burns, 및 R. D. Barry. 1997. Coxackievirus A21 binds to decay-accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule 1 for cell entry(쿡사키바이러스 A21은 붕괴-촉진 인자에 결합하나, 세포 유입을 위해서 세포간 유착 분자 1을 필요로 함). J. Virol. 71:4736-4743). CVA21의 원형 변종을 HeLa 및/또는 인간 폐 섬유모세포 또는 HeLa-T 세포에서 대략 10회, 그리고 RD-ICAM-1 세포에서 3-4회 계대하였다.
CVA21 원형 변종 (Kuykendall, GenBank 기탁 번호 AF465515)을 Margery Kennett 박사로부터 얻어서 SkMel28 세포(본 명세서에서 CVA21 어버이로 지칭)에서 이중-플라크 정제하였다. 본 명세서에서 기술한 바와 같이 RD 세포에서 연속 계대하여 ICAM-1 음성 세포에서 성장하도록 CVA21-DAFv를 생물선택하였다. 생체 내(in vivo) 연구를 위한 바이러스를 SkMel28 (CVA 21 어버이) 또는 RD 세포(CVA21-DAFv)의 단층에서 조제하고 앞서 설명한 바와 같이 5-30% 설탕 구배에서 속도 원심분리로 정제하고, 피크 분획을 모으고, PBS에 대해 투석 및 80℃에서 저장하였다. 바이러스 스톡(CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv)의 역가는 Reed 및 Muench의 종말점 방법을 이용하여 SkMel28 세포상에서 측정하였다.
HeLa 세포는 미국 버지니아주 마나사스의 American Type Culture Collection으로부터 얻었다. 한편, 중국 햄스터 난소(CHO) 세포는 오스트레일리아 빅토리아 하이델베르그의 Austin Research Institute의 Bruce Loveland 박사로부터 얻었다.
인간 흑색종 세포주 SkMel28은 S. J. Ralph 박사(오스트레일리아 빅토리아의 Monash University의 Department of Biochemistry and Molecular Biology)로부터 얻었다. 가로무늬근육종(RD) 세포는 Margery Kennett 박사(오스트레일리아 빅토리아 멜버른 페어필드 호스피탈의 Entero-respiratory Laboratory)로부터 얻었다; 난소암성 세포주 DOV13은 Ian Campbell 박사(오스트레일리아 멜버른의 Peter MacCallum Cancer Center)로부터 얻었다. ICAM-1 또는 DAF를 안정하게 발현하는 CHO 세포(CHO-DAF 및 CHO-ICAM-1 세포). CVA21 원형 변종(Kuykendall, GenBank 기탁 번호 AF465515)은 Margery Kennett 박사로부터 얻어서 SkMel28 세포에서 번식시켰다.
인간 유방암 세포주(MDA-MB157, MDA-MB453, ZR-75-1), 상피성 난소암 세포주(OVHS-1, OAW-42, DOV13) 및 무한 증식(immortalized) 정상 인간 난소 표면 상피 세포주(HOSE)는 Peter MacCallum Cancer Centre(오스트레일리아 멜버른)로부터 얻었다; 인간 전립선 세포주(PC3 및 DU145)는 오스트레일리아 시드니의 Garvan Institute로부터 얻었고, LNCaP 세포는 오스트레일리아 멜버른의 Bernard O'Brien Institute of Microsurgery의 Elizabeth Williams로부터 얻었다; 인간 직장결장암 세포주(HCT 116, SW620)는 Peter MacCallum Cancer Centre로부터 얻었고, HT-29는 John Hunter Hospital(오스트레일리아 뉴캐슬)로부터 얻었다.
항체
ICAM-1의 제1영역에 특이적인 항-ICAM-1 MAb WEHI(Berendt, A. R., A. McDowell, A. G. Craig, P. A. Bates, M. J. E. Sternberg, K. Marsh, C. I. Newbold, 및 N. Hogg. 1992. The binding site on ICAM-1 for Plasmodium falciparum-infected erythrocytes overlaps, but is distinct from the LFA-1 binding site(Plasmodium falciparum 감염 적혈구에 대한 ICAM-1상의 결합 부위는 겹치지만, LFA-1 결합 부위와는 구별됨). Cell 68:71-81)는 오스트레일리아 퀸즈랜드의 Queensland Institute of Medical Research의 Andrew Boyd로부터 공급받았다. 항-DAF Mab IA10(IgG2a)는 DAF의 제1 짧은 공통 반복 단위(SCR)를 인식하고, VIIIA7(IgG1)은 제3 SCR 및 제2 SCR의 일부를 인식하고(Kinoshita, T., M. E. Medof, R. Silber 및 V. Nussenzweig. 1985. Distribution of decay accelerating factor in the peripheral blood of normal individuals and patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(정상인 및 발작성 야간 혈색소뇨증 환자의 말초 혈액 내 붕괴 촉진 인자의 분포). J. Exp. Med. 162:75-92), IH4(IgG1)는 DAF의 제3 SCR을 인식하고(Coyne, K. E., E. S. Hall, M. A. Thompson, M. A. Arce, T. Kinoshoita, T. Fujita, D. J. Anstee, W. Rosse, 및 D. M. Lublin. 1992. Mapping of epitopes, glycosylation sites, and complement regulatory domains in human decay accelerating factor(인간 붕괴 촉진 인자의 에피토프, 글리코실화 부위 및 보체 조절 영역의 맵핑). J. Immunol. 149:2906-2913), IIH6(IgG1)은 제4 SCR을 인식한다(Kinoshita, T., M. E. Medof, R. Silber 및 V. Nussenzweig. 1985. Distribution of decay accelerating factor in the peripheral blood of normal individuals and patients with paroxysmal nocturnal hemoglobinuria(정상인 및 발작성 야간 혈색소뇨증 환자의 말초 혈액 내 붕괴 촉진 인자의 분포). J. Exp. Med. 162:75-92). MAb IA10, VIIIA7 및 IIH6은 일본 오사카 오사카 대학 면역조절과의 Taroh Kinoshita 박사로부터 기증받았다. MAb IH4는 오스트레일리아 빅토리아 하이델베르그 Austin Research Institute의 Bruce Loveland 박사의 기증이었다.
DAF의 SCR3에 특이적인 항-DAF mAb IH4(Coyne, K. E., E. S. Hall, M. A. Thompson, M. A. Arce, T. Kinoshoita, T. Fujita, D. J. Anstee, W. Rosse, 및 D. M. Lublin. 1992. Mapping of epitopes, glycosylation sites, and complement regulatory domains in human decay accelerating factor(인간 붕괴 촉진 인자의 에피토프, 글리코실화 부위 및 보체 조절 영역의 맵핑). J. Immunol. 149:2906-2913) 및 인간 재조합 용해성 DAF(sDAF)는 Bruce Loveland 박사의 기증이었다; SCR1에 대한 항-DAF mAb IA10은 Taroh Kinoshita 박사(일본 오사카 오사카 대학의 면역조절과)의 기증이었다; 항-ICAM-1 WEHI mAb는 ICAM-1의 N-말단 영역에 대한 것이고(Hoover-Litty, H., 및 J. M. Greve. 1993. Formation of rhinovirus-soluble ICAM-1 complexes and conformational changes in the virion(리노바이러스 용해성 ICAM-1 착물의 형성 및 비리온 내 입체형태 변화). J. Virol. 67:390-397), Andrew Boyd 박사(오스트레일리아 퀸즈랜드의 Queensland Institute for Medical Research)로부터 공급받았다.
바이러스 정제 및 방사성 표지 결합 검정
6-웰 조직 배양 플레이트 내 RD-ICAM-1 세포의 융합성(confluent) 단층을 500㎕의 적절한 CVA21 변종(1×105 TCID50/㎖)으로 1시간 동안 37℃에서 접종하였다. 메티오닌/시스테인이 없는 DMEM(미국 오하이오주 Aurora의 ICN Biochemicals)으로 3회 세척하여 미결합 바이러스를 제거하고, 메티오닌/시스테인이 없는 DMEM을 첨가한 뒤, 세포 단층을 2시간 더 배양하고 300μCi의 [35S]-메티오닌/시스테인 Trans-Label(미국 캘리포니아주 Irvine의 ICN Radiochemicals)을 첨가하였다. 다음으로, 감염된 단층을 37℃에서 5% CO2 환경에서 12시간 동안 배양하였다. 3회의 냉동/해동 사이클 뒤, 바이러스 용해질을 5-30% 설탕 구배에서 정제하였다(Shafren, D. R., R. C. Bates, M. V. Agrez, R. L. Herd, G. F. Burns, 및 R. D. Barry. 1995. Coxsackieviruses B1, B3 and B5 use decay accelerating factor as a receptor for cell attachment(쿡사키바이러스 B1, B3 및 B5는 세포 부착을 위한 수용체로서 붕괴 촉진 인자를 이용). J. Virol. 69:3873-3877). 각 시험관 바닥으로부터 분획을 수집하고 1450 Microbeta TRILUX(핀랜드 Turku의 Wallac)상에서 액체 섬광 계수로 모니터하여 방사성 표지 결합 검정에 이용할 160S 피크 분획을 확인하였다.
HeLa 세포를 이용한 방사성 표지 바이러스 결합 검정을 24-웰 조직 배양 플레이트에서 수행하였다(Shafren et al. 1995). 이입된 CHO 세포의 바이러스 결합 검정을 세포 현탁을 이용하여 수행하였다. 1% 우혈청 알부민(BSA)을 함유하는 800㎕의 DMEM 내의 대략 1×106 개의 세포를 300㎕(대략 1×105 CPM)의 [35S]-메티오닌 표지 바이러스의 존재하에 2시간 동안 상온에서 배양하였다. 다음, 세포를 200㎕의 0.2M NaOH-1% 소듐 도데실 설페이트(SDS)에 용해된 무혈청 DMEM으로 4회 세척한 뒤 [35S]-메티오닌 표지된 바이러스 결합의 양을 액체 섬광 계수로 측정하였다. 필요한 경우, 방사성 표지 바이러스의 첨가 전에, 세포를 20㎍/㎖의 항-DAF 또는 항-ICAM-1 MAb 또는 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C(PI-PLC)(오스트레일리아 사우스 웨일즈 시드니의 Sigma Chemicals)(5×106개의 세포당 1.0U)로 1시간 동안 37℃에서 전배양하였다(Davitz, M. A., M. G. Low, 및 V. Nussenzweig. 1986. Release of decay-accelerating factor(DAF) from the cell membrane by phosphatidylinositol-specific phospholipase C(PI-PLC). Selective modification of a complement regulatory protein(포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제 C(PI-PLC)에 의한 세포막으로부터의 붕괴 촉진 인자(DAF)의 배출. 보체 조절 단백질의 선택적 변형). J. Exp. Med. 163:1150-1161).
바이러스 감염력 검정
96-웰 조직 배양 플레이트 내 RD 및 RD-ICAM-1 세포 단층을 1% 우태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM 내 CVA21의 10배 연속 희석(4벌로 100㎕/웰)으로 접종하고 5% CO2 환경에서 48시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포 생존은 접종된 단층을 100㎕/웰의 크리스탈 바이올렛/메탄올 용액(PBS 내 0.1% 크리스탈 바이올렛, 20% 메탄올, 4.0% 폼알데하이드)으로 24시간 동안 염색하여 정량화하였다. 증류수 세척 뒤, 염색된 세포 단층의 상대적 흡광도를 멀티스캔 효소 면역 측정법 플레이트 판독기(미국 버지니아주 McLean의 Flow Laboratories)상에서 540nm에서 읽었다. 50% 종말점 역가를 Reed 및 Muench의 방법을 이용하여(Reed, L. J., 및 H. A. Muench. 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints(50% 종말점 추산을 위한 간단한 방법). Am. J. Hyg. 27:493-497), 흡광도 값이 무바이러스 웰 대조군의 3 표준 편차(SD)보다 작은 경우 양(positive)으로 기록함으로써 계산하였다.
항-수용체 MAb에 의한 세포 단층 전처리가 필요한 경우, 세포를 MAb(1㎍/ml)의 존재하에 1시간 동안 37℃에서 배양하였다. 다음, 세포 단층을 적절한 바이러스의 4벌의 시료로 접종하고 37℃에서 5% CO2 환경에서 48시간 동안 배양한 뒤 상기 설명한 바와 같이 염색하였다.
세포 이입
CHO 및 RD 세포를 앞서 설명한 바와 같이 ICAM-1 및/또는 DAF를 발현하도록 이입시켰다(Shafren, D. R., D. J. Dorahy, S. J. Greive, G. F. Burns, 및 R. D. Barry. 1997. Mouse cells expressing human intercelluar adhesion molecule-1 are susceptible to infection by coxsackievirus A21(인간 세포간 유착 분자-1을 발현하는 마우스 세포는 쿡사키바이러스 A21에 의한 감염에 감수성을 가짐). J. Virol. 71:785-789). 간략히 설명하면, 500㎕ 부피의 세포(5×106 내지 1×107개의 세포/㎖)를 전기 천공 완충액(20mM HEPES, 137mM NaCl, 5mM KCl, 0.7mM Na2PO4, 6mM 포도당, pH 7.05)에 재현탁시키고, DAF 또는 ICAM-1을 부호화하는 75㎍의 pEF-BOS(Mizushima, S., 및 S. Nagata. 1990. pEF-BOS, a powerful mammalian expression vector(강력한 포유류 발현 벡터). Nucl. Acid. Res. 18:5322) 및 5㎍의 pcDNA.neo와 전기 천공 큐벳(미국 캘리포니아주 리치몬드의 Bio-Rad)에서 혼합하였다. 세포를 Bio-Rad 유전자 펄서로 300V 및 250㎌에서 펄스시키고, 조직 배양 플라스크에 접종한 뒤, 융합성 단층이 형성될 때까지 37℃에서 48시간 동안 배양하였다. 수용체 발현 이입 세포를 G-418 함유 DMEM(400㎍/㎕)에서 선택한 뒤, 적절한 항-수용체 MAb를 이용하여 형광 활성 세포 분류에 의해 더 강화(enrich)시켰다.
유세포 분석(Flow cytometry)
이입된 세포상에서의 DAF 및 ICAM-1 표면 발현을 유세포 분석으로 분석하였다. 간략히 설명하면, 분산된 세포(1×106)를 적절한 MAb(PBS 내 5㎍/ml)로 20분간 얼음상에서 배양하였다. 다음, 세포를 PBS로 세척하고 1000×g로 5분간 펠렛화한 뒤, PBS(덴마크의 DAKO A/S)에 희석된 염소 항-마우스 면역 글로불린의 R-피코에리트린-접합 F(ab')2 단편 100㎕에 재현탁시키고, 20분간 얼음상에서 배양하였다. 세포를 상기와 같이 세척 및 펠렛화하고, PBS에 재현탁시키고 FACStar 분석기(오스트레일리아 시드니의 Becton Dickenson)로 DAF 및 ICAM-1 발현에 대해 분석하였다.
분산된 세포(1×106)를 항-DAF IH4 또는 항-ICAM-1 MAb(PBS 내 5㎍/ml)로 20분간 얼음상에서 배양하였다. 다음, 세포를 PBS로 세척하고 1000×g로 5분간 펠렛화한 뒤, PBS(덴마크의 DAKO A/S)에 희석된 염소 항-마우스 면역 글로불린의 R-피코에리트린-접합 F(ab')2 단편 100㎕에 재현탁시키고, 20분간 얼음상에서 배양하였다. 세포를 상기와 같이 세척 및 펠렛화하고, PBS에 재현탁시키고 FACStar 분석기(오스트레일리아 시드니의 Becton Dickenson)로 DAF 및 ICAM-1 발현에 대해 분석하였다.
바이러스 RNA 서열 분석
CVA21 분리주를 RD-ICAM-1 세포의 융합성 단층에서 증식시켰다. 바이러스 세포 용해질을 저속 원심분리로 사전 투명화시키고 상층액 내 비리온을 SW 41 Ti 로터에서 3시간 동안 40,000rpm, 4℃에서 초원심분리로 펠렛화시켰다. 바이러스 펠렛을 TE 완충액(10mM Tris-HCl, 1mM EDTA, pH 7.5)에 재현탁시키고, TRIZOL Ls 시약(Gibco BRL Life Technologies)을 이용하여 각 변종으로부터 RNA를 분리하고, 지놈의 P1 지역을 기존에 설명된 장거리 전략(Lindberg, A. M., C. Polacek, 및 S. Johansson. 1997. Amplication and cloning of complete enterovirus genomes by long distance PCR(장거리 PCR에 의한 완전 장 바이러스 지놈의 증폭 및 클로닝). J. Virol. Meth. 65:191-199)을 이용하여 증폭하였다. CVA21 P1 지역의 뉴클레오티드 서열을, 프라이머 이동(walking) 전략을 이용하고 ABI Prism BigDye™ 종결제 사이클 서열 결정 즉시 반응 키트(스웨덴의 PE Biosystems)(Lindberg et al. 1997)를 제조업체의 수칙에 따라 채용하여, 정제된 PCR 앰플리콘으로부터 결정하였다. Clustal X program을 이용하여 뉴클레오티드 서열 정렬을 생성하였다(Thompson, J. D., D. G. Higgins, 및 T. J. Gobson. 1994. Clustal_W - improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice(Clustal_W - 서열 가중화, 위치-특이적 갭 페널티 및 가중 매트릭스 선택을 통한 진행적 다중 서열 정렬의 감도 개선). Nucleic Acids Res. 22:4673-4680).
뉴클레오티드 기탁 번호
본 연구에서 설명한 CVA21 임상 분리주 #272101, #275238 및 #272598의 P1 지역(캡시드 부호화 지역)의 뉴클레오티드 서열을 GenBank에 기탁하였고, 할당받은 기탁 번호는 각각 AY319942, AY319943 및 AY319944이다.
바이러스의 분자 특성화 및 구조 모델링
QIAmp 바이러스 RNA 미니 키트를 이용하여 CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv 변종으로부터 바이러스 RNA를 추출하고, CVA21 특이적 프라이머를 이용하여 캡시드 부호화 지역을 제조업자의 수칙에 따라 1단계 RT-PCR(Qiagen OneStep RT-PCR Kit)로 증폭하였다. 뉴클레오티드 서열을, 정제된 PCR 생성물(QIAGEN GmbH의 QIAquick Gel Extraction Kit)을 사이클 서열 결정 반응에서 이용하고, ABI Prism BigDye™ 종결제 사이클 서열 결정 즉시 반응 키트(PE Biosystems)를 제조업체의 수칙에 따라 이용하여 결정하였다.
CVA21 주 구조 단백질(VP1-3)의 모델을, 폴리오바이러스 수용체 구조의 예측에 이용한 것과 유사한 방법으로 DEC 알파 스테이션에서 프로그램 Modeller으로 구축하였다. FASTA가 생성한 정렬을 가지고 폴리오바이러스 1, EV1, EV11, CVB3, CVA9 및 돼지 폐포병 바이러스(PDB 코드 각각 1AR7, 1EV1, 1H8T, 1COV, 1D4M, 및 1OOP)를 포함하며 분자 구조가 이미 결정되고 50% 초과의 서열 동일성을 함유하는 상동성 장 바이러스 캡시드 단백질에 대해 CVA21 어버이 서열을 정렬하였다. CVA21-DAFv 캡시드에 대한 ICAM-1 및 DAF의 위치를 각각 인간 리노바이러스 3 및 EV12와의 리간드 접촉에 따라 정렬하였다.
바이러스 감염력 검정
96-웰 조직 배양 플레이트 내 융합성 세포 단층을 100㎕의 바이러스의 10배 연속 희석으로 접종하고 72시간 동안 37℃에서 배양하였다. 세포 생존 정량화를 위해, 플레이트를 크리스탈 바이올렛/메탄올 용액으로 고정시키고 현미경으로 관찰하였다. 50% 종말점 역가를 Reed 및 Muench의 방법을 이용하여(Reed, L. J., 및 H. A. Muench. 1938. A simple method of estimating fifty percent endpoints(50% 종말점 추산을 위한 간단한 방법). Am. J. Hyg. 27:493-497) 계산하였다. 바이러스 매개 세포 용해의 mAb 효과 평가를 위해, 상기와 같은 바이러스 첨가 및 세포 용해 정량화에 앞서 세포 단층을 50㎕의 항-DAF SCR3 IH4 (5㎍/ml) mAb로 배양하였다. 항-DAF SCR1 mAb 차단을 갖는 세포 용해 검정을 위해, 바이러스 접종(106 TCID50)에 앞서 6-웰 플레이트 내 RD 세포의 단층을 항-DAF SCR1 mAb (15㎍/ml)로 전처리하였다. 1시간 동안 37℃에서의 배양 후에, 미결합 바이러스를 제거하고 단층에 둘베코의 변형 이글 배지(DMEM)를 얹었다. SkMel28 세포상에서의 적정에 의한 바이러스 수율을 연구하여 항-DAF SCR1 mAb의 억제를 평가하였다.
방사성 표지 바이러스 결합 검정
어버이 및 CVA21-DAFv 변종을 각각 SkMel28 및 RD 세포에서 35S-메티오닌으로 방사성 표지하고, 5-30% 설탕 구배상에서 정제하였다. 분산된 세포(1×106)를 mAb(1% 소혈청 알부민[BSA]을 함유하는 DMEM에 희석된 20㎍/ml)로 1시간 동안 상온에서 전배양하고, 2% 우태아 혈청(FCS)을 함유하는 DMEM에서 1시간 동안 상온에서 35S-표지된 설탕 정제된 바이러스(5×105 cpm)로 배양하였다. DMEM-2% FCS로 3회 세척한 뒤, 35S-메티오닌 표지 바이러스 결합의 양을 1450 Microbeta TRILUX (핀랜드 Turku의 Wallac) 상에서 액체 섬광 계수에 의하여 측정하였다.
DAF 및 ICAM-1 결합 비리온의 침강
정제된 방사성 표지 160S CVA21-DAFv 비리온(2.5×106 cpm)을 CHO-DAF 또는 CHO-ICAM-1 세포(2×107)로 DMEM-1% BSA에서 2시간 동안 4℃에서 배양하였다. 미결합 비리온을 DMEM-2% FCS로 4회 세척하여 제거하고 세포 결합 비리온은 2시간 동안 37℃에서 용출되도록 하였다. 세포를 원심 분리로 제거하고, 용출된 비리온을 5-30% 설탕 구배상에 올려 놓고 95분간 4℃에서 SW41Ti 로터에서 36,000rpm으로 원심분리하였다. 분획(~700㎕)을 구배의 바닥으로부터 수집하고 방사성을 액체 섬광 계수에 의해 측정하였다.
항-DAF mAb에 의한 세포-결합 바이러스의 용출
CHO-DAF 세포(3×106)를 방사성 표지 바이러스(4×105 cpm)로 4℃에서 2시간 동안 배양하였다. 미결합 비리온을 얼음 냉각 DMEM-2% FCS로 4회 세척하여 제거하고, 세포를 100㎕의 DMEM-2% FCS에 재현탁시킨 뒤 여러 농도(0-50㎍/㎕)의 항-DAF SCR1 mAb(IA10)로 배양하였다. 얼음상에서의 1시간 동안의 mAb 경쟁 뒤에 세포를 펠렛화하였다. 상층액을 수확하여 용출된 바이러스 수준을 모니터하고, 그 결과를 세포 용출 방사성 표지 바이러스의 백분율로 표현한다.
용해성 DAF에 의한 바이러스의 중화
인간 재조합 sDAF(85㎍/ml, PBS에 희석)를 CVA21-DAFv의 50% 조직 배양 감염량(TCID50) 1,000으로 배양하였다. 37℃에서 1시간 동안의 배양 후, 바이러스-DAF 혼합물을 96-웰 플레이트 내 RD 세포 단층에 적용하고, 48시간 동안 더 배양하였다.
전립선암 이종이식의 CVA21-DAFv 요법
SCID 마우스를 University of Newcastle Animal Care and Ethics Committee가 승인하는 프로토콜에 따라 무병원균 조건에서 사육하였다. PC3 세포를 시험관 내 생육, 수확, PBS로 2회 세척 및 멸균 PBS에 재현탁하였다. 이종이식에 이용하는 세포의 95% 초과가 생존임을 트리판 블루 염색으로 확인하였다. 이종이식에 앞서, 동물을 3% 아이소플루오란으로 마취하였다. 마취된 7주령 SCID 마우스의 측복부에 2×106개의 PC3 세포를 피하주사하여 종양 세포를 이종이식하였다. 이종이식 성장은 매일 모니터하고 캘리퍼스로 측정하였다. 종양 부피의 추산은 타원체에 대한 공식을 이용하여 계산하였다. 만질 수 있는 크기의 종양이 수립된 다음(50-100㎣), PC3 종양에 CVA21 어버이, CVA21-DAFv(3×107 TCID50) 또는 PBS를 정맥주사로 투여하고 42일의 기간 동안 모니터하였다. 혈청 내 바이러스 역가를 바이러스 감염력 검정으로 모니터하였다.
결과
I. 장 바이러스 캡시드 상호작용
CVA21의 임상 변종은 DAF 및 ICAM-1에 결합
CVA21의 임상 분리주가 DAF 및 ICAM-1에 원형 Kuykendall 변종과 유사한 또는 상이한 방식으로 결합하는지 결정하기 위해, DAF 또는 ICAM-1을 발현하도록 안정하게 이입된 CHO 세포를 방사성 표지 바이러스 결합 검정에서 이용하였다. 어떠한 CVA21 분리주에 대해서도 DAF 또는 ICAM-1의 부재시 CHO 세포에 대한 유의적인 결합은 관찰되지 않았다(도 1). CVA21 변종 모두는 DAF를 발현하는 CHO 세포에 결합하였으며(도 1A), 이는 원형 CVA21 Kuykendall 변종에 대해 이미 밝혀진 상호작용이다. 예상대로, 모든 임상 CVA21 분리주는 CHO 세포 표면상에 발현한 ICAM-1에도 결합하였다(도 1B). CVA21/ICAM-1 상호작용의 특이성의 확인은 항-ICAM-1 영역 1 특이적 MAb가 ICAM-1에 대한 바이러스 결합을 완전히 제거한 작용에 의해 입증하였다(도 1B). 종합하여, 이들 결과는 CVA21의 임상 분리주는 두 분리된 세포 수용체 DAF 및 ICAM-1에 원형 변종과 유사한 방법으로 결합한다는 것을 확인시켜 준다.
CVA21의 임상 분리주의 DAF/ICAM-1과의 상호작용의 특성을 더 조사하기 위해, CVA21 바이러스 결합 검정을 DAF와 ICAM-1을 편재 동시발현(co-expression)하는 HeLa 세포에 대해 수행하였다. CVA21 결합은 개별 수용체의 MAb 차단 또는 조합에 의한 MAb 차단으로 평가하였다(도 2). 원형 Kuykendall 변종의 세포 부착(도 2A)을 임상 CVA21 분리주 #272101와 비교하였고(도 2B), 양자 모두는 MAb 수용체 차단의 부재시 HeLa 세포에 대해 높은 수준의 결합을 나타내었다(도 2). DAF SCR 1의 특이적 MAb 차단은 바이러스 결합을 부분적으로 차단하였지만, ICAM-1과의 상호작용 때문에 바이러스 부착을 완전히 제거할 수는 없었다. ICAM-1에 대한 접근을 MAb 차단으로 억제하였을 때, 바이러스 결합은 감소하였으며, 이는 원형보다 임상 분리주 #272101의 경우 더욱 그러하였지만(도 2B), DAF에 대한 교대적 바이러스 부착 때문에 완전히 억제되지는 않았다. DAF 및 ICAM-1의 N-말단 영역에 대한 CVA21의 임상 및 원형 변종의 특이성은 항-DAF SCR 1 및 항-ICAM-1 영역 1 MAb가 포스파티딜이노시톨-특이적 포스포리파제-C(이는 GPI-연결 단백질을 분열시킴) 및 항-ICAM-1 MAb의 조합에 의한 세포의 전처리와 동일한 정도로 바이러스 부착을 억제하는 능력을 갖는다는 것으로 입증되었다. 모두를 고려하면, 이들 결과는 임상 분리주 #272101는 원형 변종과 유사하게 DAF의 제1 SCR 및 ICAM-1의 N-말단 영역에 결합한다는 것을 확인시켜 준다.
DAF 및 ICAM-1에 대한 CVA21 결합은 부가적이지 않음
DAF 또는 ICAM-1 단독 또는 조합에 결합하는 CVA21 임상 분리주의 능력을 평가하여, 숙주 세포의 표면상의 두 수용체 모두의 존재가 부가적 비리온 세포 부착에 기여하는지를 결정하였다. 이 질문에 답하기 위해, DAF 또는 ICAM-1 단독 또는 조합을 발현하도록 CHO 세포를 이입하였다. 유세포 분석은 수용체 단독 또는 조합을 발현하는 세포상에서 서로 필적할 만한 수준의 DAF 또는 ICAM-1 발현을 나타내었다(도 3A). CHO 세포에 대한 최소 수준의 기본 결합이 모든 CVA21 변종에 대해 관찰되었다. 개별 발현된 DAF 또는 ICAM-1에 대한 유의적 수준의 결합을 모든 변종 CVA21이 나타내었다(도 3B). 놀랍게도, DAF 및 ICAM-1을 동시발현하는 CHO 세포에 결합한 방사성 표지 바이러스의 양은 이들 수용체가 단독으로 발현된 경우의 결합량에 비해 유의적으로 감소하였다(도 3B).
CVA21의 임상 분리주는 DAF와의 상호작용을 통해 ICAM-1 음성 세포의 용해성 감염을 유도
ICAM-1은 CVA21 원형 변종의 성공적인 숙주 세포 유입의 주 결정요소이다. 그러나, ICAM-1 발현이 결여된 세포의 CVA21-매개 용해성 감염이 MAb 가교된 DAF의 존재하에 가능하다. 임상 CVA21 분리주가 가교된 DAF와의 구별되는 상호작용을 통해 ICAM-1 음성 세포를 용해성 감염시킬 수 있는지를 조사하였다. CVA21의 단일 투입 다중도에 의한 접종에 앞서, RD 세포의 단층을 개별 SCR 1, 2, 3 or 4 또는 DAF의 항-SCR 1 및 SCR 3의 조합에 대한 특이적 MAb로 처리하거나 처리하지 않았다. DAF SCR 2, 3 및 4에 대한 MAb로 전처리한 RD 세포의 배양물에서 CVA21-매개 용해성 감염을 관찰하였다(도 4). 특이적 CVA21 캡시드/DAF 상호작용이 용해성 세포 감염을 실제로 매개하였다는 확인은 항-SCR 3 DAF MAb로 전처리한 세포에 항-SCR 1 DAF MAb를 첨가하면 세포 용해가 완전히 차단되었다는 발견이 제공하였다.
흥미롭게도, 2개의 임상 CVA21 분리주 #275238과 #272598은 항-DAF MAb에 의한 가교의 부재시에 ICAM-1 음성 RD 세포를 용해성 감염시킬 수 있었다(도 4). 일반적으로, DAF에 대한 장 바이러스 결합은 추가적인 내화 수용체와의 상호작용에 대한 비리온의 격리로서 여겨지며, 결론적으로 현재까지 DAF와의 상호작용을 통해서만 매개되는 세포 용해성 감염을 보여 준 확실한 보고는 없었다. DAF의 항체 가교 및 ICAM-1 모두의 부재시 세포를 용해성 감염시킬 수 있는 CVA21 임상 분리주 #275238 및 #272598의 능력은 그러한 수용체 용도의 첫 시연이다. 항-DAF SCR 1 MAb에 의한 차단 뒤에 이들 CVA21 변종에 의한 세포 용해의 완전한 억제(도 4) 및 자손 바이러스 생성의 유의적 감소는 이 발견의 완전성을 더욱 확인시켜 준다.
이 신규 DAF 용도의 분석을 계속하기 위해, DAF 단독(RD) 또는 ICAM-1 조합(RD-ICAM-1) 발현의 단층 세포 배양물상에서 CVA21의 임상 및 원형 변종의 용해성 감염력 역가를 측정하였다. CVA21의 모든 변종은 높은 수준의 세포 용해 활성을 DAF 및 ICAM-1 모두를 발현하는 세포에서 나타내었지만 분리주 #275238 및 #272598만이 RD-ICAM-1 세포의 값과 필적할 만한 용해성 역가를 DAF만 발현하는 RD 세포에서 유도하는 것으로 관찰되었다. 사실, 분리주 #275238은 RD-ICAM-1 세포에서보다 대략 20배 큰 용해성 역가를 RD 세포에서 얻었다. 흥미롭게도, 높은 바이러스 투입 다중도에서 분리주 #272101이 DAF만 발현하는 RD 세포의 유의성 있는 용해성 감염 수준을 추가로 나타내었다. 이 원형 변종의 RD 세포에서의 최소이지만 검출가능한 수준의 용해성 활성은 향상된 DAF 이용 표현형을 갖는 비리온의 소 모집단에 기인한 것일 수 있다.
CVA21 임상 분리주의 ICAM-1 결합 족문(footprint)의 분석
조사한 CVA21의 모든 변종이 강한 ICAM-1 부착/내화 표현형을 나타내었기 때문에(도 1), 이들이 보존 ICMA-1 결합 족문을 보유하는지를 살펴보았다. CVA21-ICAM-1 수용체 결합 족문을 구성하는 잔기는 정제된 ICAM-1 및 원형 Kuykendall 비리온으로 초냉동-전자 현미경을 이용하여 기존에 동정되었다. 모든 CVA21 변종의 P1 부호화 지역의 아미노산 서열 분석은 보존 ICAM-1 족문의 존재를 밝혔으며, 이는 Ala의 Val로의 VP2 168에서의 보존성 부호화 변화를 제외하고는 기존에 발표된 족문와 동일하였다(도 5).
ICAM-1의 부재시 DAF 발현 세포를 용해성 감염시키는 CVA21 임상 분리주의 원형에 대해 증가된 능력(도 4)을 설명하기 위한 시도에서, ICAM-1 결합 족문 외부의 아미노산 차이점을 찾아 보았다(도 5). 3개의 CVA21 임상 분리주와 원형 변종간에 다수의 아미노산 변화가 P1 지역에서 검출되었다(도 5). VP4 부호화 지역에서는 어떠한 CVA21 변종간에도 아미노산 변화가 검출되지 않았다. VP3, VP2 및 VP1 캡시드 단백질에서는 모든 임상 분리주에서 원형 변종에 대해 동일 위치에서의 13개의 동일한 변화가 검출되었다. 덧붙여, 분리주 #272101은 위치 VP3 239가 Ser으로 비유사 변화를 보여 다른 두 임상 분리주에서의 Ala과 대비되었고, VP1, VP2, VP3를 통해 산개된 원형 변종에 대한 9개의 별개의 추가적 아미노산 변화를 보유하였다(도 5). 아미노산 수준에서 분리주 #272598과 #275238은 동일하였지만, 뉴클레오티드 레벨에서는 양자간의 다수의 침묵 돌연변이가 검출되었다.
II . 쿡사키바이러스 A21 변이의 생물선택 및 분자 특성화
ICAM-1 상호작용과 독립적으로 세포를 용해성 감염하는 CVA21 변이의 생물선택
CVA21 원형 변종의 세포 부착은 DAF 및/또는 ICAM-1에의 결합에 의해 매개된다. ICAM-1 상호작용만이 세포 내화를 촉진하며 CVA21과 DAF간의 상호작용은 DAF가 항-DAF mAb에 의해 가교되지 않는 한 생산적인 용해성 세포 감염을 유도하지 않는다. CVA21은 또한 세포가 ICAM-1로 이입된 경우 DAF-발현 RD 세포를 용해성 감염할 수 있어, CVA21이 RD 세포에서 복제하지 못하는 것은 세포 유입 수준에서만 그러하다는 것을 시사한다. 인간 흑색종 세포주 SkMel28은 CVA21의 원형 변종의 높은 바이러스 역가로의 성장을 지원하며, 유세포 분석은 ICAM-1 및 DAF(기하 평균 형광[GMF] 43.2) 모두의 높은 수준의 표면 발현을 밝혀 주었다(도 6A).
SkMel28 세포에서 이중-플라크 정제한 CVA21 원형 변종(여기에서는 CVA21 어버이로 지칭)의 조제는 계대 반복(4계대)에 의해 RD 세포의 빠른 용해성 감염을 생성하도록 적합화하였다. 유세포 분석은 RD 세포가 SkMel28 세포에 대해 필적할 만한 높은 수준의 DAF(GMF 64.0)를 발현하지만, 표면 ICAM-1은 발현하지 않는다는 것을 밝혔다(도 6A). RD 세포에서 어버이 CVA21의 순차적 계대는 ICAM-1의 부재시 빠른 용해성 감염을 유도하는 능력을 보유하는 CVA21 변이(CVA21-DAFv로 지칭)를 어버이 모집단으로부터 생물선택하였다. ICAM-1 및 DAF 이중 발현 SkMel28 세포는 어버이 및 CVA21-DAFv 모두의 용해성 감염을 107 TCID50/㎕ 초과로 지원한 반면, CVA21-DAFv만이 RD 세포에서 상당한 용해성 역가를 유도하였다(도 6B).
CVA21 - DAFv 의 표현형 성질
ICAM-1 음성 RD 세포에 대한 적합화 후, CVA21-DAFv는 SkMel28 및 RD 세포 모두의 단층에 대해 유사한 효율(5×107 PFU/㎕)로 플라크를 생성하였다. 어버이 변종의 경우 RD 세포상에서 높은 바이러스 투입 다중성에도 불구하고 플라크를 관찰할 수 없었다(SkMel28 세포상에서 1×108 PFU/㎕). CVA21-DAFv는 상이한 세포 기질상에서 미세한 표현형 차이를 가지고 플라크를 유도하였다; RD 세포상에서 감염 후 2일 이내에 흐린 플라크를 관찰한 반면, SkMel28 세포상에서는 높은 해상도의 작은 플라크만을 관찰하였다(도 6C). SkMel28 세포에서 CVA21-DAFv의 10번의 연속 역계대(back passage)는 복귀 변이주(revertant)를 어버이 표현형에 대해 선택하지 않았으며 CVA21-DAFv는 낮은 감염 다중도에서 RD 세포를 용해성 감염하는 능력을 여전히 유지하였다(1 TCID50/96-웰, 데이터 미도시). 그러므로, CVA21-DAFv의 향상된 DAF-이용은 안정적이고 선호되는 표현형인 것으로 보인다. 더 흥미로운 것은 CVA21-DAFv(102 TCID50)는 어버이 변종(102 TCID50)과 비교하여 높은 수준의 종합(pooled) 면역 글로불린을 중화에 필요로 한다는 발견으로서(1:63 대 1:178), 이는 RD 세포에서의 생물 선택 동안 CVA21-DAFv의 혈청학적 특이성의 부분적인 변경을 시사한다.
CVA21 - DAFv 는 DAF 및 ICAM -1의 N-말단 영역에 결합
CVA21의 원형 변종은 ICAM-1 및 DAF 모두의 N-말단 영역에 결합한다. CVA21-DAFv가 원형 변종과 유사한 방법으로 ICAM-1 및/또는 DAF에 직접 결합하는지 알아보기 위해, 방사성 표지 결합 검정을 ICAM-1 또는 DAF를 안정적 발현하는 CHO 세포, RD 세포 및 난소 암종 세포주 DOV13을 이용하여 수행하였다. 유세포 분석 연구는 각각의 이입된 CHO 세포주상에서 높은 수준의 DAF 또는 ICAM-1 표면 발현을 보여 주었고(CHO-DAF 세포상의 DAF 발현에 대한 GMF 296.2), RD 및 DOV13 세포 표면상에서는 DAF만이 발현하였다(각각 RD 및 DOV13 세포상의 DAF 발현에 대한 GMF 64.0 및 84.0)(도 6A 및 도 7A). CVA21 어버이 변종이 ICAM-1 및 DAF 모두에 결합하였다(도 7B 및 7C). 유의적 수준의 CVA21-DAFv가 CHO-DAF 및 CHO-ICAM-1 세포 모두에 결합한 반면, CHO 세포에 대해서는 기본 결합만이 관찰되었다(도 7B 및 7C). 이입된 CHO 세포상의 표면 발현 ICAM-1 및 DAF와의 바이러스 상호작용의 특이성은 바이러스 부착의 특이적 항-DAF 및 항-ICAM-1 mAb 차단을 이용하여 확인하였다. 항-ICAM-1(WEHI) 및 항-DAF SCR1 (IA10) mAb 차단은 두 바이러스 모두의 결합을 기본수준으로 감소시킨 반면, 항-DAF SCR3 (IH4) mAb 차단은 이입된 CHO 세포에 대한 어느 CVA21 제제의 바이러스 결합에도 영향을 주지 않아서(도 7B 및 7C), 어버이 변종과 CVA21-DAFv는 ICAM-1 및 DAF의 N-말단 영역에 결합할 수 있다는 결론을 내렸다.
DAF의 항체 가교는 CVA21-DAFv의 세포 감염력을 향상시키지 않음
CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv 변종간에 DAF 결합/이용의 미세한 차이점이 존재하는지를 알아보기 위해, 방사성 표지 바이러스 결합 검정을 이용하여 표면 DAF 가교의 존재 및 부재시에 RD 및 DOV13 세포에의 상대적 부착 수준을 평가하였다. 어버이 CVA21 및 CVA21-DAFv 모두가 높은 수준의 표면 DAF를 발현하는 CHO 세포에 결합하는 반면(도 7), CVA21의 원형 변종은 DAF 발현, ICAM-1 음성 RD 세포에 잘 결합하지 않았다. 이는 본 연구에서 이용한 CHO-DAF 세포상의 표면 발현 DAF가 RD 및 DOV13 세포상에서보다 높은 수준이기 때문일 가능성이 가장 높다(도 6A 및 도 7A). 생물선택된 CVA21-DAFv는 RD 및 DOV13 세포 모두에 유의적 수준의 부착을 나타낸 반면, 어버이 변종의 경우 이들 세포에 대한 부착이 없거나 거의 없는 것으로 관찰되었다(도 7C). CHO-DAF 세포와 유사하게, RD 및 DOV13 세포에 대한 CVA21-DAFv 특이적 결합은 항-SCR1 mAb 전처리에 의해 기본 수준으로 감소하였다(도 7C).
DAF의 비바이러스 결합 SCR3 영역에 대한 mAb에 의한 표면 발현 DAF의 가교는 RD 세포에 대한 원형 CVA21의 결합을 증가시켰고, 세포를 용해성 감염에 감수성으로 만들었다. 다음으로, CHO-DAF 및 DOV13 세포의 표면상의 DAF의 가교가 RD 세포에서 관찰된 바와 같이 증가된 바이러스 결합을 가져오는지를 알아보았다. 항-SCR3 전처리는 어버이 CVA21 바이러스 결합을 RD 세포상에서 8배 그리고 DOV13 세포상에서 4배 향상시켰다(도 7C). CVA21-DAFv의 경우, 항-DAF SCR3 전처리는 RD 또는 DOV13 세포 어디에 대한 결합 향상 효과도 없거나 거의 없었다. 사실은, DOV13 세포에 대한 CVA21-DAFv의 결합의 약간의 감소를 관찰하였다(도 7C). mAb 가교 DAF의 부재시 CVA21-DAFv가 RD 및 DOV13 세포에 유의적 수준으로 결합할 수 있는 능력은 어버이 변종과 비교하여 CVA21-DAFv의 향상된 DAF-결합 표현형을 시사한다. 양 바이러스 모두에서 CHO-DAF 세포에 대한 바이러스 부착은 항-DAF SCR3 mAb 전처리에 의해 영향을 받지 않았다(도 7C). 안정하게 이입된 CHO-DAF 세포상의 표면 발현 DAF의 수준은 일과성 DAF-발현 CHO 세포에서보다 유의적으로 높아서, 항-DAF SCR3 mAb 전처리가 어버이 CVA21의 바이러스 부착을 증가시킬 수 없는 데 대한 가능한 설명을 제공한다.
항-DAF SCR3 mAb 전처리가 CVA21 어버이 또는 CVA21-DAFv에 의한 용해성 감염에 대한 RD 및 DOV13 세포의 감수성에 영향을 주는지를 결정하기 위해, RD 및 DOV13 세포의 융합성 단층을 바이러스 접종 전에 항-DAF SCR3 mAb로 전배양하였다. 바이러스 감염이 3일간 37℃에서 진행하도록 둔 뒤 단층의 용해성 감염을 평가하였다. 항-DAF SCR3 mAb 가교의 부재시, RD 및 DOV13 세포 모두는 높은 바이러스 투입 다중도(106 TCID50/웰)에서도 CVA21 어버이 변종에 의한 감염에 굴절성(refractile)이었다. 이와 대조적으로, RD 및 DOV13 세포는 항-DAF SCR3 mAb 전처리에 의해 어버이 CVA21 용해성 감염에 감수적이 되었다(도 7D). CVA21-DAFv는 ICAM-1 음성 RD 및 DOV13 세포 모두에서 용해성 바이러스 역가를 유도하였다(>105.5 TCID50/㎖). 놀랍게도, 항-DAF SCR3 mAb 전처리는 mAb가 없는 경우에 관찰되는 역가와 비교하여 RD 및 DOV13 세포 모두에서의 CVA21-DAFv의 용해성 역가를 ∼100배 감소시켰다(도 7D). DAF-발현 세포에 대한 CVA21-DAFv 결합은 항-DAF SCR3 mAb 전처리로 향상되지 않았으며 DOV13의 경우에는 감소된 부착을 낳았다. 이들 결과는 DAF SCR3의 mAb 차단이 DAF SCR1-결합 CVA21-DAFv의 세포 유입 기전을 방해할 수 있다는 것을 시사한다(도 7).
DAF가 아니라 ICAM-1 상호작용이 CVA21-DAFv의 캡시드 입체형태 변화를 유도
DAF에 결합하고 ICAM-1 음성 세포를 용해성 감염시키는 CVA21-DAFv의 증가된 능력의 배경지식을 가지고(도 6 및 도 7), 어버이 CVA21 변종 및 CVA21-DAFv의 DAF에 대한 상대적 결합 강도(stringency)를 비교하였다. 방사성 표시 비리온을 CHO-DAF 세포에 2시간 동안 4℃에서 결합시키고 미결합 비리온을 제거한 뒤, 항-DAF SCR1 mAb 농도를 증가시키면서 세포로부터 세포 결합 비리온을 용출하였다. CHO-DAF 세포의 표면으로부터 CVA21-DAFv 비리온을 떼어내는 것은 CVA21 어버이 비리온에 비해 대략 10배 높은 농도의 항-DAF SCR1 mAb가 필요하였다(도 8A). 이 발견은 CVA21-DAFv가 CVA21 어버이보다 캡시드의 덜 접근가능한 부위에서 DAF에 결합하거나, DAF에 높은 친화도를 가지고 결합한다는 것을 시사한다.
DAF는 장 바이러스 격리 수용체로 작용하는 것으로 가정되며, 일반적으로 DAF-장 바이러스 상호작용은 검출가능한 캡시드 입체형태 변화의 형성을 유도할 수 없다. CVA21-DAFv A-입자 형성이 표면 발현 DAF 또는 ICAM-1과의 상호작용으로 유도되는지를 알아보기 위해, 정제된 160S 비리온을 CHO-DAF 또는 CHO-ICAM-1 세포로 2시간 동안 4℃에서 배양하였다. 미결합 비리온을 제거한 뒤, 세포-결합 비리온이 2시간 동안 37℃에서 용출되도록 한 뒤, 5-30% 설탕 구배상에서 속도 원심분리처리하였다. ICAM-1로부터 용출한 CVA21-DAFv 비리온은 A 입자의 형성을 나타내는 감소된 침강 계수를 나타내고, CVA21 원형 변종의 경우 관찰되는 것과 유사한 없거나 거의 없는 감염력을 유지하였다. CVA21-DAFv의 향상된 DAF 상호작용에도 불구하고, CVA21-DAFv 비리온은 어떠한 검출가능한 입체형태 변화 없이 DAF로부터 용출하였고(도 8B) 비리온은 높은 수준의 감염력을 유지하였다.
DAF의 차단은 RD 세포에서 CVA21-DAFv의 용해성 감염을 억제
용해성 세포 감염 및 경쟁적 결합 검정은 어버이 CVA21 변종과 비교하여 표면 발현 DAF와 CVA21-DAFv간의 향상된 상호작용을 시사한다(도 7 및 도 8). 이처럼 관찰된 증가된 상호작용 때문에, 항-DAF SCR1 mAb가 어버이 변종과 대조적으로 RD 세포의 CVA21-DAFv 용해성 감염을 차단할 수 있는지를 알아보았다. 항-DAF SCR1 mAb는 106 TCID50/웰의 투입 다중도에서도 RD 세포의 CVA21-DAFv 유도 용해성 감염에 대한 완전한 보호를 제공하였다(도 9A). 더 나아가, 항-DAF SCR1 mAb에 의한 RD 세포의 전처리는 자손 바이러스의 생성을 유의적으로 억제하였다.
CVA21-DAFv가 세포 감염력을 위해 표면 DAF와의 직접 상호작용을 필요로 한다는 점을 더 확증하기 위해, 인간 재조합 sDAF(Bruce Loveland 박사, 미발표 커뮤니케이션)가 RD 세포의 감염을 억제하는 능력을 평가하였다. CVA21-DAFv와의 가용성 DAF 상호작용은 세포 용해성 감염을 유의적으로 억제하였지만, 비-DAF 결합 CVA20에 의한 감염 감소에는 검출가능한 효과를 나타내지 않았다. CVA20은 ICAM-1에도 결합하지만, 세포 유입을 위해서는 아직 동정되지 않은 수용체를 필요로 한다(도 9B). 전체적으로, 이들 결과는 CVA21-DAFv 용해성 감염은 항-DAF SCR1 mAb 및 sDAF에 의해 억제된다는 것을 입증하여, CVA21-DAFv의 유입에서 DAF 상호작용의 중요성을 확인시켜 준다.
CVA21-DAFv의 DAF 표현형을 부여하는 분자 결정요소들
CVA21-DAFv의 확장된 세포 향성(tropism) 및 증가된 DAF-이용을 더 알아보기 위해, CVA21 어버이 변종 및 CVA21-DAFv 모두의 캡시드-부호화 지역의 뉴클레오티드 서열을 결정하였다. 캡시드 단백질 서열은 DAF 및 ICAM-1과의 상호작용이 잘 특성화되어 있는 CVA21 Kuykendall 원형 변종과 비교하였다. 이중 플라크-정제된 어버이 변종의 캡시드-부호화 지역의 서열 분석은 CVA21 원형 서열(GenBank AF465515)과 비교하여 VP2 (S164L)에서의 하나의 부호화 치환을 밝혀 냈다. CVA21 어버이 서열의 DAF 및 ICAM-1 결합 성질(도 7)은 이 VP2 아미노산 치환에 의해 원형 변종에 대해 변경되지 않았다. RD 세포에서의 생물선택 후, 이 VP2 L164 잔기는 CVA21-DAFv에 남아 있었으며, 2개의 추가적 아미노산 치환이 VP3 (R96H 및 E101A)에서, 하나의 침묵 변이가 VP2 (V209)에서 검출되었다. VP2 L164 아미노산 치환은 어버이 변종과 CVA21-DAFv간에 공유되므로, CVA21-DAFv의 향상된 DAF-결합 표현형을 부여하는 데 관여하는 것으로는 여겨지지 않는다. CVA21-DAFv는 뉴클레오티드 위치 2038 (VP3 101)에서 혼합 집단(C/A)을 나타내어 Ala/Glu 결과로 이어지는 반면, 이 위치에서 어버이 CVA21은 A (Glu)만을 부호화하였다.
CVA21의 분자 구조는 원자 해상도로 결정되어 있지 않기 때문에, CVA21 어버이 및 CVA21-DAFv간의 DAF-결합 차이를 설명하기 위한 시도로서, 관련된 피코르나바이러스들의 기존에 결정된 구조와의 유사성에 기초하여 어버이 CVA21의 구조의 모델을 만들었다. CVA21-DAFv의 향상된 DAF-결합 표현형을 아마도 부여하는 돌연변이 (VP3 R96H 및 E101A)는 캡시드 단백질 VP1, VP2 및 VP3의 계면에 매립된 것으로 예측된다(도 5 및 도 10). VP3 잔기 R96 및 E101은 측면은 VP3 C 말단 그리고 상부는 VP1 C 말단으로 덮여 있고 아르기닌(R96)의 측쇄 질소 원자만이 용매에 접근가능하다 (도 10A의 청색 구). DAF에 대한 CVA21-DAFv 부착은 EV12의 경우에서처럼 캡시드 캐년 외부에서 일어나는 것으로 가정된다. CVA21-DAFv VP3 H96 및 A101 돌연변이는 제안된 EV12-DAF 결합 부위에 직접 위치하지 않지만, 그들의 위치는 DAF 결합 족문에 대한 향상된 입체형태 또는 접근가능성을 부여할 수 있으며, 그 결과 어버이 변종과 비교하여 DAF에 대한 증가된 결합 친화도를 나타낼 수 있다(도 8A).
III. DAF 및 쿡사키바이러스 A21 매개 세포 감염력
CVA21은 DAF의 N-말단 영역에 결합
DAF의 개별 짧은 공통 반복단위(SCR)에 대한 사전 항체 차단 연구는 CVA21이 DAF SCR1에 결합한다는 것을 시사하였다. 그러나, 장 바이러스 DAF 결합 에피토프의 위치 맵핑이 DAF 결합 mAb로부터의 입체 장애에 의해 간접 영향을 받을 수 있는 가능성도 있을 수 있다. 이 질문에 답하기 위해, 표면 발현 키메라 DAF 분자 및 DAF 결실 구성체(construct)를 이용하여 EV70의 DAF 결합 영역의 SCR1에 대한(Karnauchow, T. M., S. Dawe, D. M. Lublin, 및 K. Dimock 1998. Short consensus repeat domain 1 of decay-accelerating factor is required for enterovirus 70 binding(붕괴 촉진 인자의 짧은 공통 반복단위 영역 1이 장 바이러스 70 결합에 필요). J. Virol. 72:9380-9383), CVB3 SCR2-3에 대한(Bergelson, J. M., J. G. Mohanty, R. L. Crowell, N. F. St. John, D. M. Lublin 및 R. W. Crowell 1995. Coxsackievirus B3 adapted to growth in RD cells binds to decay-accelerating factor(CD55)(RD 세포에서 성장하도록 적합화된 쿡사키바이러스 B3은 붕괴 촉진 인자(CD55)에 결합). J. Virol. 69:1903-1906), 그리고 EV7의 SCR3에 대한(Powell, R. M., T. Ward, D. J. Evans, 및 J. W. Almond 1997. Interaction between echovirus 7 and its receptor, decay-accelerating factor(CD55): evidence for a second cellular factor in A-particle formation(에코바이러스 7과 그 수용체, 붕괴 촉진 인자(CD55)간의 상호작용:A-입자 형성에서의 제2 세포 인자의 증거). J. Virol. 71:9306-9312) 맵핑을 한다. CVA21-DAF 결합 지역의 위치를 확인하고자, 키메라 DAF/CD46 수용체(도 11A)를 채용하였는데, 여기에서 CD46 막 보조인자 단백질(MCP[CD46]) 영역은 대응 영역 DAF로 대체되었으며, 방사성 표지 CVA21에 결합하는 능력을 평가하였다. 키메라 및 야생형 수용체의 표면 발현의 상대적 수준은 개별 DAF SCR 및 CD46에 특이적인 mAb를 이용하여 유세포 분석으로 평가하였다(도 11B). 항-DAF SCR1 (IA10), SCR3 (IH4) 및 SCR4 (IIH6) mAb는 각각 DAF SCR1/2, SCR3 또는 SCR4를 함유하는 야생형 DAF 및 DAF/CD46 키메라 수용체에만 결합하였다. 어느 항-DAF mAb도 야생형 CD46에 결합하지 않았다. CD46의 SCR1을 인식하는 항-CD46 mAb (MCI20.6)은 CD46의 SCR1을 함유하는 야생형 CD46 또는 DAF/CD46 키메라 수용체에만 결합하였다. 유의적 수준의 방사성 표지 CVA21이 야생형 DAF 및 DAF SCR1/CD46 키메라 수용체에 결합하였지만, 야생형 CD46 또는 나머지 키메라 구성체에는 결합하지 않았다(도 11C). 야생형 DAF 및 키메라 DAF SCR1/CD46 분자 모두에 대한 CVA21 결합이 항-DAF SCR1 mAb의 항체 차단으로 억제되었다. 본 조사에서 DAF SCR2/CD46 키메라 수용체는 이용할 수 없었지만, 상기 발견들은 CVA21 캡시드 결합 에피토프가 EV70의 경우처럼 DAF 분자의 제1 SCR에 아마도 위치할 가능성이 가장 높다는 것을 분명히 입증한다.
CVA21의 결합 및 DAF로부터의 용출
피코르나바이러스 세포 부착 및 후속 세포 유입은 최초 부착 이후에 특정 세포 표면 수용체(들)로부터 높은 수준의 바이러스 입자 용출로 특징지워져서, 수용체 매개 바이러스 용출이 피코르나바이러스 감염의 발병기전(pathogenesis)에서 중요한 역할을 할 수 있다는 것을 시사한다. 많은 피코르나바이러스와 유사하게, CVA21은 그 자연 내화 수용체, 이 경우에는 ICAM-1로부터 용출되면, 상당히 감소된 감염력을 보유하여, 후속 감염을 개시할 능력을 최소화한다. 그러나, 표면 발현 DAF로부터 직접 용출한 CVA21 입자의 상대적 동역학(kinetics)과 감염력의 특성화는 기존에 수행되지 않았었다. 그리하여, 본 발명자들은 DAF로부터의 CVA21 용출에 시간, 온도 및 pH가 미치는 효과에 조사를 집중하였고, 여기에서 방사성 표지 바이러스 결합 검정은 DAF 발현 CHO 세포를 CVA21 결합 기질로서 이용하여 수행하였다. DAF로부터의 CVA21 용출은 15분에서 최대 수준에 도달하였고 이 시점 이후에는 더 이상 유의적 용출 증가가 없었다(도 12A). DAF로부터 용출한 CVA21의 양은 용출 시간을 30분으로 일정하게 유지하면서 4℃에서 42℃로 온도를 점차 올림으로써 증가하였다(도 12B). 이 환경에서, CVA21의 최대 수준은 42℃에서 용출하였다. 42℃에서 용출한 바이러스의 감염력이 37℃에서 용출한 바이러스보다 유의적으로 낮은 것은 놀라운 사실이 아니었다. 37℃ 초과의 온도는 비리온 캡시드의 완전성(integrity)에 악영향을 주어 감소된 수용체 결합 및 따라서 감소된 감염 능력을 낳을 수 있다. 용출 시간을 30분으로 그리고 온도를 37℃로 유지하면서 용출 환경의 pH를 pH 5.5에서 pH 8.0으로 증가시킨 결과, DAF로부터 용출한 CVA21의 수준이 계속하여 증가하였다(도 12C).
DAF로부터 용출한 CVA21은 감염력을 유지
용출한 피코르나바이러스 입자의 대부분은 세포 결합 비리온이 특이적 수용체 유도 캡시드 입체형태 변화를 겪는 결과 비감염성인 것으로 일반적으로 여겨진다. 표면 발현 DAF 또는 ICAM-1에의 결합 및 그로부터의 용출이 CVA21 감염력에 미치는 상대적 효과를 비교하기 위해, CHO-DAF 및 CHO-ICAM-1 발현 세포를 CVA21 결합 기질로서 이용하여 방사성 표지 바이러스 결합 및 세포 용해 검정을 수행하였다. 유세포 분석은 적절한 이입된 CHO 세포 표면상에서 높은 수준의 DAF 및 ICAM-1 발현을 밝혀 주었다. 유사한 수준의 방사성 표지 CVA21이 이입된 세포의 표면상의 DAF 및 ICAM-1 모두에 결합 및 그로부터 용출한다(도 13A). ICAM-1로부터 용출한 바이러스와 대조적으로, DAF로부터 용출한 CVA21만이 유의적인 감염력 유지를 보여 주었다(>105 TCID50/100CPM)(도 13B). 가교된 DAF로부터의 용출 후에 높은 수준의 감염력을 CVA21이 유지하는지 결정하기 위해, 유사한 프로토콜을 채용하였고, DAF는 항-DAF SCR3 mAb (IH4) 전처리로 가교시켰다. ICAM-1로부터의 용출은 ICAM-1로 이입된 RD 세포(RD-ICAM-1)로부터 평가하였다. 0℃에서는 양 수용체 모두로부터 최소 수준의 CVA21이 용출한 반면, 37℃에서는 양 수용체 모두로부터 15 내지 20%의 결합 바이러스가 용출하였다(도 14A). 그러나, 앞서 관찰한 것처럼(도 13A), ICAM-1로부터 용출한 CVA21은 거의 감염력을 보유하지 않은 반면(<1.0 TCID50/100CPM), 가교된 DAF로부터 용출한 CVA21은 유의적인 감염력을 나타내었다(>102.5 TCID50/100CPM)(도 14B). RD-ICAM-1 세포 표면상의 낮은 수준의 DAF 존재에도 불구하고, 바이러스 용출물 내 감염성 CVA21의 결핍은 양 수용체 모두가 세포 표면상에서 동시발현될 때 CVA21 결합이 DAF에 비해 ICAM-1에 대한 선호도를 갖는다는 것을 시사한다.
표면 DAF 및 ICAM-1에 대한 CVA21 결합의 상대적 강도를 평가하고자, 방사성 표지 비리온을 RD-ICAM-1 세포상의 ICAM-1 또는 RD 세포 표면상의 mAb 가교된 DAF에 0℃에서 결합시켰다. 미결합 비리온의 제거 후에, 적절한 가교된 DAF 또는 ICAM-1 발현 세포 현탁액에 CVA21 수용체 차단 mAb (항-DAF SCR1 또는 항-ICAM 영역 1)를 농도를 증가시키면서 첨가하였다. 항-ICAM-1 영역 1 mAb의 RD-ICAM-1 세포에의 첨가는 ICAM-1 결합 CVA21을 떼어내는 데 효과가 없거나 거의 없었다(도 14C). 이와 대조적으로, 가교된 DAF RD 세포를 최저 0.1㎍/ml 농도의 항-DAF SCR1 mAb로 처리하면 DAF 결합 CVA21의 대략 50%의 배출을 촉진하였고, mAb 농도를 1.0㎍/ml로 증가시킨 결과, 본질적으로 모든 DAF 결합 바이러스가 방출되었다(도 14C).
CVA21은 ICAM-1의 지연 발현 후에 DAF에 결합, 감염력 유지 및 생산적 감염 개시가 가능
표면 발현 DAF로부터 용출한 CVA21이 높은 수준의 감염력을 유지한다는 것을 확인한 뒤(도 13 및 도 14), 연구는 DAF-용출 바이러스가 자연적 CVA21 감염의 발병기전에 적극적 역할을 할 수 있는지에 초점을 맞추었다. 관심을 가진 구체적인 질문은 표면 발현 DAF에 의해 격리된 바이러스가 세포 표면 ICAM-1의 지연 유도를 이용하여 생산적 감염을 개시할 수 있는지를 결정하는 것이었다. 인체 전체의 내인성 ICAM-1의 표면 발현은 상대적으로 낮아서, 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 인터류킨(IL)-1β와 같은 감염성 사이토킨의 작용에 의한 유도를 기다리는 것으로 일반적으로 받아들여지고 있다. 이러한 환경을 시뮬레이션하고자, CVA21 용해성 감염에 보통은 굴절성인 DAF 발현 RD 세포(ICAM-1 음성)를, 표면 DAF에의 CVA21 결합 후 0, 6 및 24h에 ICAM-1 또는 CD36을 발현하도록 (재조합 아데노바이러스 벡터를 이용하여) 형질도입시켰다. 유세포 분석은 형질도입 후 4h에서 유의적 수준의 표면 ICAM-1 발현을 밝혔고, 이는 아데노바이러스 접종 후 대략 16h에서 최대 수준으로 증가하였다(도 15A). 추가 유세포 분석(도 15B) 및 웨스턴 블롯 검정은 적절한 수용체 함유 재조합 아데노바이러스에 의한 RD 세포의 형질도입 후 24h에서 ICAM-1 및 CD36 모두의 높은 수준의 발현을 확인시켜 주었고, 내인성 DAF 발현은 모든 세포에서 비슷비슷하였다. 내인성 DAF에 대한 바이러스 결합 후 0, 6 또는 24h에서 형질도입된 ICAM-1 또는 CD36 수용체 발현의 존재하에 증식한 자손 CVA21의 수준을 비교하기 위해, 바이러스 감염력 검정을 수행하였다. CVA21 최초 접종 후 0, 6 또는 24h에서 ICAM-1을 발현하도록 유도된 RD 세포는 가상(mock) 수용체(CD36)를 발현하도록 유도된 세포 또는 미형질도입 RD 세포보다 유의적으로 높은 바이러스 수율(대략 200배)을 나타내었다(도 15C). DAF-결합 뒤 0, 6, 24h에서 ICAM-1을 발현하도록 형질도입된 RD 세포에서의 CVA21의 다중 사이클 복제 결과, 세포 단층의 완전한 용해성 파괴가 나타난 반면, CD36 발현 세포 또는 미형질도입 세포에서는 세포 용해가 관찰되지 않았다(도 15D).
IV. 쿡사키바이러스 A21 DAF 변이(CVA21-DAFv)에 의한 인간 유방암, 전립선암, 결장암 및 난소암 세포의 시험관 내 용해
CVA21 원형 변종은 높은 수준의 CVA21 세포 수용체, 세포간 유착 분자-1(ICAM-1) 및 붕괴 촉진 인자(DAF)를 발현하는 악성 흑색종을 빠르게 표적화 및 용해할 수 있다. 최근에, 본 발명자들은 생물선택된 CVA21-DAFv 변종이 향상된 수용체 특이성을 나타내며, ICAM-1 또는 DAF 또는 두 수용체 모두의 조합을 발현하는 세포를 빠르게 감염 및 용해할 수 있다는 것을 보인 바 있다. 이 연구에서, 바이러스 수용체 발현은 다양한 조직 기원의 12개의 인간 암세포주의 패널에 대해 조사하였다; 인간 유방암으로부터 유도된 종양 세포주 3개(MDA-MB157, MDA-MB453, ZR-75-1), 난소암 세포주 3개(DOV13, OAW-42, OVHS-1), 전립선암성 세포 3개(DU145, LNCaP, PC3) 및 인간 결장암 세포 3개(HCT116, HT-29, SW620). 유세포 분석으로 측정한 바, 유의적 수준의 ICAM-1이 3/3 유방암, 1/3 난소암, 2/3 전립선암 및 3/3 결장암 세포주에서 검출되었고, 12개 세포주 모두가 높은 수준의 DAF를 발현하는 것으로 발견되었다(도 16).
CVA21-DAFv가 CVA21 원형 변종보다 광범위한 종양 용해 능력을 나타내는지 조사하기 위해, CVA21-DAFv를 이용하여 유방암, 난소암, 전립선암 및 결장암성 세포의 패널에 접종하였다. 현미경 관찰 결과, CVA21-DAFv로 접종한 시험관 내 배양물 12개 모두가 세포 사멸을 낳는 둥근 표현형(세포 변성 효과의 특성)을 나타내었다. 이와 대조적으로, CVA21의 원형 변종으로 접종한 7/12의 암 세포주에 대해서만 세포 변성 효과가 관찰되었다(도 17). CVA21-DAFv의 종양 용해 능력의 정량화는 시험한 시험관 내 배양물 12개 모두의 >103 TCID50/㎖의 역가의 용해성 감염을 지원한 반면, CVA21 어버이 변종은 7/12의 암 세포주에서만 유의적 용해성 감염(>104 TCID50/㎖)을 유도하였다(도 18). 무시할 만한 수준의 표면 ICAM-1을 발현하는 세포주 (ZR-75-1, DOV13, OAW-42, LNCap 및 HCT116)는 CVA21의 어버이 변종의 복제는 지원하지 않은 반면, 이들 세포주는 CVA21-DAFv에 의해서는 용이하게 감염되는 것을 관찰하였다. ICAM-1이 아니라 표면 DAF의 존재만이 생물선택된 CVA21-DAFv 변종의 용해성 감염에 필요하므로, 이 변종은 어버이 CVA21 변종보다 광범위한 인간 암세포주를 살상하는 데 분명히 보다 효과적이다.
V. CVA21-DAFv에 의한 인간 전립선 이종이식의 생체 내 종양 용해
생체 내 데이터는 CVA21-DAVv가 세포 표면에 ICAM-1 및/또는 DAF를 발현하는 인간 암 세포를 특이적이고 효과적으로 표적화한다는 것을 입증하였다. 암세포 패널의 관찰된 시험관 내 종양 용해가 CVA21-DAFv를 생체 내 항암 요법으로 예측하는지를 알아보기 위해, 전립선 종양 이종이식에 대한 CVA21-DAFv의 치료 효과를 평가하였다. 사전형성된 PC3 전립선 이종이식(50-100㎣)을 함유하는 SCID 마우스에 CVA21-DAFv, CVA21 어버이 또는 PBS를 단일 정맥 투약하고, 종양 부하를 42일 동안 평가하였다(도 19). CVA21-DAFv 또는 CVA21 어버이로 처리한 마우스에서 유의적인 종양 부피 감소가 바이러스 투여 후 최소 11일에 관찰되었다. 윤리적 이유로, PBS로 처리한 마우스는 그 종양 부하가 University Animal Ethics committee가 부과한 상한선에 도달하였기 때문에 바이러스 처리 후 14일에 안락사시켰다. 용해성 바이러스 감염력 검정으로 측정한 결과, CVA21-DAFv 및 CVA21 어버이 처리 마우스 모두에 대해 유사한 혈청 바이러스 부하(대략 105 내지 107 TCID50/ml)를 관찰하였다. 이들 결과는 CVA21-DAFv가 인간 전립선 이종이식의 종양 부하 감소에 있어서 CVA21 어버이 변종만큼 효과적이라는 것을 입증한다.
토의
I. 장 바이러스 캡시드 상호작용
CVA21의 원형 변종에 의한 생산적 세포 감염은 표면 발현 DAF 및 ICAM-1과의 별개의 상호작용에 의해 매개된다. 이 관계에서 DAF는 CVA21을 세포 표면으로 격리하여, 캡시드 입체형태 변화 및 세포 유입을 유도하는 ICAM-1과의 후속 상호작용이 일어나도록 작용한다. 그러나, 다중의 시험관 내 세포 계대가 수용체 이용의 이 패턴에 기여하는지 아닌지는 많은 논쟁이 있는 문제이다. 특히, 계통발생학적으로 관련된 원형 군 A 쿡사키바이러스 A13, A15, A18 및 A20 역시 세포 내화 수용체로서 ICAM-1을 채용하지만 표면 발현 DAF에는 결합하지 않는다는 것을 고려하면, DAF-결합 표현형은 많은 추측의 영역이었다. 따라서, CVA21 원형 변종 Kuykendall의 DAF 결합 표현형이 CVA21의 낮은 시험관 내 계대 임상 분리주에서 보존되는지, 또는 단순히 세포 배양물 내 다중 계대의 인공물(artifact)인지를 관찰하기 위해 조사를 수행하였다.
본 명세서에서 제시한 방사성 표지 바이러스 결합 검정은 CVA21의 임상 분리주 3개가 DAF 또는 ICAM-1에 독립적으로 결합하는 능력(도 1)에 의해 특징지워지는, 원형 CVA21 변종(Kuykendall)과 유사한 수용체 부착 패턴을 보인다는 것을 시사한다. DAF 또는 ICAM-1에 대한 MAb차단이 바이러스 결합을 완전히 억제하지 못하는 것은(도 2) 두 수용체 모두가 CVA21의 임상 분리주의 부착/감염 과정에 필수적 역할을 한다는 것을 시사한다. 반면, DAF 및 ICAM-1의 높은 수준의 동시발현 환경에서의 CVA21 결합에 대한 연구는 두 수용체가 개별적으로 발현되는 환경보다 감소된 정도의 바이러스 결합을 보여 준다(도 3). 이들 발견은 다수의 수용체의 높은 수준의 동시발현은 최적의 용해성 감염에 실제로는 억제성일 수 있다는 것을 시사한다. 숙주 세포 표면상에 동시발현시 DAF 및 ICAM-1의 근접성 결과 입체 장애를 낳아 수용체 결합 부위의 이용가능성 감소를 유발할 수 있을 것이다. 만일 이것이 사실이라면 숙주 세포상의 두 수용체 모두의 높은 수준의 발현은 부착 수준의 증가와 반드시 연관되지는 않지만, 한 바이러스에 대해 두 상이한 세포 수용체의 비유사한 발현 수준 환경은 잠재적 잇점을 가질 수 있다고 추론할 수 있다. 그러한 환경은 인간 장관의 점막 표면상에서 일어날 수 있을 것인데, 여기에서 DAF 발현은 편재적이고 ICAM-1보다 유의적으로 높은 수준이며, ICAM-1의 내인성 발현 수준은 상대적으로 낮아서 적절한 사이토카인에 의한 유도를 기다린다.
본 연구의 예상치 못한 발견은 항체 가교의 부재시 DAF 결합만을 통해 RD 세포를 용해성 감염시킴으로써 DAF 상호작용을 보다 기능적 역할로서 이용하는 저계대 임상 CVA21 분리주의 능력이었다(도 4). 이 새로운 발견의 가능한 설명은 임상 CVA21 분리주의 바이러스 캡시드가 원형 변종보다 더욱 실질적인 방법으로 DAF를 가교시켜, 항-DAF MAb의 인공 가교 작용과 유사한 작용기전으로 바이러스 내화를 가능케 할 수 있다는 것이다(도 4). 유사하게, 수용체 이용의 차이점이 CVB3 원형 및 저계대 임상 분리주간에 관찰되었다. 보다 최근에, 서로 다른 αν 인테그린 이용에 있어서의 차이점이 구제역 바이러스(FMDV)의 실험실 및 야외-변종간에 보고된 바 있어, 바이러스 분리주가 그 세포 수용체에 대해 변경된 친화도를 나타낼 수 있다는 것을 보여 준다.
여기에서 우리는 ICAM-1의 부재시, MAb 가교된 DAF가 원형 및 임상 CVA21 변종 모두에 대해 기능적 내화 수용체로서 작용할 수 있다는 것을 확인하였다(도 4). MAb 가교된 DAF가 매개하는 CVA21의 유입은 소포(caveola)를 경유하여 일어나며, 이는 ICAM-1과의 바이러스 상호작용 동안 채용되는 클라트린-코팅 오목(pits) 유입 경로와는 대조된다는 것이 기존에 제안된 바 있다. 가교된 DAF를 포함하는 소포 경유 CVA21 유입은 MAb 뭉치화 DAF가 소포로의 동원 이후 세포내이입(endocytosis)된다는 것을 시사하는 증거에 의해 뒷받침된다. 소포 매개 CVA21 유입에서의 DAF 상호작용의 역할 가능성은 EV11의 DAF 결합 변종의 지질 뗏목(lipid raft) 및/또는 소포 경유 세포 내화에 관한 최근의 보고에 의해 확인되었다.
포유류 체내를 통한 DAF의 광범위한 발현은 DAF에 대해 더 높은 친화성을 보이고 이 수용체를 내화에 이용할 수 있는 바이러스에 적응적 잇점을 제공한다. 이러한 바이러스는 인체를 통한 이동에 쉽게 이용할 수 있는 운반체를 DAF-결합 바이러스에 제공하는 적혈구상의 DAF 발현 때문에 다른 변종과 비교하여 증가된 병원성을 가질 수 있다. 흥미롭게도, 분극된(polarized) 상피 세포(여기에서 그 자연 내화 수용체, 쿡사키-및 아데노바이러스 수용체는 세포-세포 연접에 위치하고 DAF는 상층 표면(apical surface)에 위치)에서의 쿡사키바이러스 B3 및 B5 분리주의 연속 계대는 DAF 결합 변이를 선택하여, 상피 세포 점막 표면의 DAF 감염의 중요한 역할을 시사한다.
캡시드 구조 단백질의 지놈 부호화의 P1 지역의 유전자 분석은 임상 CVA21 분리주와 원형 변종간에 추론된 아미노산 서열의 다수의 차이점을 검출하였다(도 5). 관찰된 부호화 변화는 어느 것도 기존에 결정된 ICAM-1 족문에 맵핑되지 않았고 그 차이점은 VP1, VP2 및 VP3를 통해 산개되어 있었다. ICAM-1 족문을 구성하는 잔기는 VP2의 아미노산 168을 제외하고는 원형 Kuykendall 변종과 모든 임상 분리주 모두에서 보존되었다(도 5). VP2의 위치 168에서 아미노산 치환은 Val에서 Ala으로 보존적이며 ICAM-1 결합 부위의 입체형태에 잠재적 의미가 거의 없다. DAF만 발현하는 RD 세포에서 유의적 용해성 활성을 나타내지만 나머지 임상 분리주만큼 크지는 않은 임상 분리주 #272101은 원형 변종에 대하여 모든 임상 분리주들간에 관찰된 14개의 부호화 변화 가운데 13개를 보유하였다. 다른 임상 분리주들과 비교하여 #272101에서의 9개의 추가 변화의 존재가 분리주 #275238 및 #272598이 나타내는 향상된 DAF 이용 표현형에 일종의 억제를 끼쳤을 수 있다. DAF 및 ICAM-1 모두가 높은 환경에서 증가된 DAF 이용 표현형을 보유하는 임상 CVA21 분리주의 반복된 시험관 내 세포 계대는 기능적 DAF 상호작용을 감소하는 댓가로 증가된 ICAM-1 이용을 갖는 비리온의 생물선택에 원동력을 제공할 수 있다. 이러한 비리온 집단의 생성은 변경된 수용체 이용 표현형에 관여하는 핵심 P1 아미노산 변화의 동정을 얻어 낼 수 있을 것이다.
분리주 #272101의 감소된 DAF 이용에 대한 가능한 설명은 DAF 결합 표현형을 상실한 생물선택된 EV11 변이(variant)가 VP1의 BC 루프 및 VP2의 퍼프 지역의 특이적 아미노산 변화를 보유한다는 보고로부터 얻어진다. 우리의 서열 분석은 #272101의 VP1의 BC 루프 및 VP2의 퍼프 지역에 그러한 특유의 차이점이 존재하고, 다른 CVA 임상 분리주의 동일 캡시드 지역에는 그렇지 않다는 것을 밝혔다(도 5). 결론적인 것으로 나타나지는 않았지만, 바이러스 부착/세포 유입의 환경에서 모든 임상 분리주들과 원형간에 관찰된 이들 13개의 아미노산 변화가 증가된 DAF 이용 표현형의 발달에 잠재적 역할을 할 수 있을 것이다. 그러나, 본 연구에서 다루지는 않았지만 세포 용해성 감염 매개에서 바이러스 지놈의 다른 지역(예컨대 5' 비전사 지역)에 위치한 추가 변화의 관여를 배제할 수는 없다.
그러나, DAF/EV7, DAF/CVB3 상호작용과 DAF/CVA21 상호작용간의 중요한 차이점은 EV 및 CVB 결합에는 DAF SCR 2, 3 또는 4가 관여하는 반면, CVA21 부착에는 DAF SCR 1이 관여한다는 점이다. EV7, CVB3 및 CVA21 캡시드간의 전체적 구조 유사성을 감안하면, 2개의 별개의 수용체의 N-말단 영역(즉 DAF 및 ICAM-1)과 CVA21 캡시드상의 별개의 결합 부위와의 관여가 감염의 어느 단계에서도 일어날 수 있다고 제안된다. 그러나, EV7/CVB3 결합에 DAF의 SCR 2-4의 관여는, CVB3의 경우 CAR과 같은 추가 수용체와의 상호작용이 DAF의 상호작용 후에 일어나서, 바이러스 캡시드상의 특이적 DAF 결합 에피토프에의 접근 방해를 최소화하도록 할 수 있다는 것을 시사한다. ICAM-1 음성 RD 세포를 용해성 감염할 수 있는 임상 분리주에 상대적인 원형 변종의 VP1의 이동(migration)에 있어서의 미세한 차이의 검출이 흥미로운 점이 될 수 있을 것이다. 유사하게, RD 세포 내 연속 계대 후에 생성되는 CVB3 원형의 변이(CB3-RD)가 원형에 비해 변경된 VP1 이동성을 보였고, 어버이 변종과 비교시 DAF에 대한 변경된 수용체 특이성과 연관되었다.
종합하면, 본 연구에서의 결과는 임상 분리주들의 그 세포 수용체에 대한 전체 결합 능력은 원형 변종과 비교하여 보존되었지만, 임상 CVA21 분리주들의 수용체 이용 능력에는 구분되는 차이점이 존재하는 것으로 보인다. CVB3 야외 변종과 유사하게, 임상 CVA21 분리주는 세포 용해성 감염에서 증가된 DAF 이용을 촉진하는 표현형을 보유하며, 이는 아마도 인간 내 계대의 결과일 때문일 가능성이 가장 높다. 숙주 세포의 부착 및/또는 감염을 위해 DAF 및 ICAM-1 모두를 이용하는 CVA21의 능력은, 개별 및/또는 다중 수용체 이용을 가능케 하여 바이러스의 조직 향성을 확장하고 생산적 감염의 기회를 대단히 증가시키는 유리한 표현형의 보존을 시사한다.
II. 쿡사키바이러스 A21 변이의 생물선택 및 분자 특성화
많은 다른 장 바이러스의 경우에서처럼, DAF가 CVA21의 원형 변종의 부착 수용체로 작용하지만, ICAM-1이 생산적 CVA21 감염에 필요하다. 본 연구에서 우리는 ICAM-1 음성 세포에서 시험관 내 생물선택된 CVA21의 변이로서, 변경 및 확장된 세포 향성을 획득한 것을 설명한다(도 6 및 7). 본 명세서에서 제시한 방사성 표지 바이러스 결합 검정은, ICAM-1 음성 RD 세포 내 다중 계대에도 불구하고 CVA21-DAFv가 ICAM-1의 N-말단 영역 또는 DAF SCR1에 독립적으로 결합하는 능력을 유지한다는 것을(도 7) 시사한다. 극히 높은 수준의 표면 발현 DAF의 환경에서(즉 최대 수준의 발현으로 선택된 CHO-DAF 세포), 어버이 및 CVA21-DAFv 모두가 DAF에 유사한 수준으로 결합하는 반면, CVA21-DAFv만이 유의적으로 낮은 외인성 DAF의 표면 발현을 나타내는 RD 및 DOV13 세포에 부착하였다. 기존 연구와 일치하게, 항-DAF SCR3 mAb에 의한 DAF의 mAb 가교는 어버이 CVA21의 DAF-발현 RD 및 DOV13 세포에의 결합을 유의적으로 증가시켰고 ICAM-1의 부재시 용해성 감염을 촉진시켰다(도 7). 그러나, mAb 가교된 RD 또는 DOV13 세포에 대한 CVA21-DAFv에 의한 바이러스 결합 또는 용해성 감염의 증가는 관찰되지 않았다. 이 발견은 어버이 변종과 비교하여 생물선택된 CVA21-DAFv가 DAF와의 상호작용을 최적화하였고, 그러한 상호작용은 DAF의 mAb 가교에 의해 더 이상 향상되지 않는다는 것을 시사한다. 항-DAF SCR1 mAb와 경쟁하는 에피토프로 배양하는 동안 어버이 CVA21 비리온이 CVA21-DAFv보다 표면 발현 DAF로부터 더 쉽게 떨어짐을 암시하는 데이터는 어버이 변종과 비교하여 CVA21-DAFv의 향상된 DAF-결합 표현형의 가정을 더욱 뒷받침한다(도 8).
CVA21 원형 변종에 대한 DAF의 역할은 바이러스를 미감염 상태로 유지하여 유입 수용체 ICAM-1와의 상호작용을 기다리는 것이며, DAF에 대한 직접 결합만으로는 CVA21 원형 변종에 의한 생산성 감염이 개시되지 않는다고 가정된다. 이입된 CHO 세포 표면상의 DAF 또는 ICAM-1의 높은 수준의 표면 발현에도 불구하고(도 7A), CVA21 또는 CVA21-DAFv에 의한 검출가능한 세포 감염은 관찰할 수 없었다(데이터 미도시). 그러나, CVA21-DAFv에 의한 향상된 DAF-이용을 지지하는 증거는 높은 바이러스 투입에서도 항-DAF SCR1 mAb 차단만으로 완전히 차단할 수 있는 ICAM-1 음성 RD 및 DOV13 세포의 용해성 감염에 의해 얻어진다(도 9). 이는 DAF 및 ICAM-1 모두에 대한 mAb가 완전한 감염 차단에 필요한 DAF 및 ICAM-1 동시발현의 다중 수용체 환경에 이용시에 동일한 mAb가 CVA21 어버이 변종에 대해 나타내는 부분적 차단과 대조된다. 이들 발견은 CVA21-DAFv가 표면 DAF를 기능적 세포 수용체로서 채용한다는 가정을 뒷받침한다. 장 바이러스 감염에 억제 효과를 나타내는 것으로 기존에 알려진 것에 필적하는 농도의 sDAF에 의해 CVA21-DAFv 감염이 억제되었다는 관찰은 RD 세포의 CVA21-DAFv 감염에서의 DAF의 역할의 중요성을 더욱 강조한다(도 9). 추가적으로, 이는 생물선택 과정 동안 CVA21-DAFv가 ICAM-1의 부재시 세포 내화에 관여하는 또 하나의 아직 미동정된 제2세포 수용체를 이용하도록 적합화되었을 가능성에 반하는 증거를 제공한다. 어버이 CVA21과 비교하여 CVA21-DAFv의 향상된 DAF-결합 표현형은(도 7 및 8), RD 세포에서뿐 아니라 DAF-발현 난소암 세포(DOV13)에서도 증가된 세포 용해성 감염(도 7)으로 번역되는 것으로 보인다.
많은 인간 장 바이러스의 DAF에 대한 결합 상호작용에는 많은 뚜렷한 차이점이 있다. CVB3, EV7 및 EV12 비리온상의 DAF-결합 부위는 20면체의 2배 대칭축에서 캡시드 캐년 외부에 위치하는 것으로 가정된다. EV11 또한 캐년 지역 외부에서 DAF와 상호작용하지만, DAF 결합 족문은 비리온의 5배 축 부근에 위치하는 것으로 가정된다. DAF에 부착하는 인간 장 바이러스들 가운데, 장 바이러스 70과 CVA21만이 DAF의 N-말단 SCR1 영역에 결합하고, 나머지 DAF-결합 장 바이러스들은 중앙 영역(SCR2-4)과 상호작용한다. DAF에 대한 장 바이러스 결합이 캐년 외부에 위치하는 사실에 덧붙여, 이 상호작용은 세포 감염 또는 A-입자의 형성으로 이어지지 않는 것으로 보고되어 있다. DAF 결합이 정량적으로 평가되어 있는 EV11의 경우, DAF와의 상호작용은 유사한 친화도이나 느린 동역학인 리노바이러스 3에 대한 캐년-결합 ICAM-1 분자의 상호작용에 비해 낮은 친화도이다.
CVA21-DAFv가 향상된 DAF-결합 표현형을 나타내고 있음에도 불구하고, 캡시드 부호화 지역 내 2개의 아미노산만이 어버이 변종과 상이하다. 생물선택 과정 동안, CVA21-DAFv는 ICAM-1에 결합하는 능력을 유지하였다(도 7). 그러므로, 어느 관찰된 캡시드 돌연변이도 북쪽 및 남쪽 캐년 가장자리에 걸쳐 있다고 가정되는 기존에 결정되어 있는 ICAM-1 결합 족문에 위치하지 않았다는 것은 놀라운 일이 아니다. CVA21-DAFv의 관찰된 돌연변이는 VP1 및 VP3의 C-말단 및 VP2 EF-루프에 의해 둘러싸인 VP3 α-나선(CD-루프) 내 캡시드 캐년의 외부에 위치하는 것으로 예측된다(도 10). 두 돌연변이는 VP1 R270 및 VP3 H329와의 상호작용을 통해 VP1 및 VP3의 C-말단과 가까운 접촉을 하는 것으로 예측된다. CVA21-DAFv VP3에서 관찰된 돌연변이는 EV12의 표면상의 DAF 결합 족문에 해당하는 VP1의 C-말단 지역 및 VP3 α-나선의 입체형태를 향상시키는 데 관여할 수 있다고 제안된다. 이러한 입체형태 변화 결과, CVA21-DAFv 캡시드와 DAF간에 접촉이 보다 잘 일어날 것이다. VP3 H96 및 A101의 존재에 의한 CVA21-DAFv 비리온의 2-배 함요(depression)와 DAF간의 친화도 증가의 가정은 항-DAF SCR1 mAb 접종으로 표면 발현 DAF로부터 떼어내는 데 CVA21-DAFv가 어버이 비리온보다 어렵다는 발견과 일치한다(도 8A). DAF의 mAb 가교 및 ICAM-1 발현의 부재시 DAF-발현 RD 세포를 다양한 정도로 용해성 감염할 수 있는 CVA21의 저계대 임상 분리주 역시 VP3 H96을 부호화하지만, CVA21-DAFv에서 관찰되는 A101 돌연변이는 부호화하지 않는다. 이와 비교하여, 원형 CVA21 변종은 VP3 R96을 부호화한다. 방사성 표지된 CVA21-DAFv 비리온의 표면 DAF에 부착하는 능력의 향상은 다른 바이러스 지놈 지역의 관여보다도 캡시드-부호화 지역 내 돌연변이를 반영한다.
원형 CVA21에 의한 가교된 DAF-매개 세포 용해성 감염은 ICAM-1 상호작용을 통해 매개되는 것보다 느린 속도로 일어나서, 세포 유입은 서로 다른 유입 기전을 통해 일어나는 것으로 제시된다. 원형 CVA21의 가교된 DAF-매개 유입은 검출가능한 A-입자 형성 없이 일어나고 소포가 관여하는 것으로 가정되며, EV11의 DAF-결합 변종 및 EV1의 유입에 최근에 결부된 신규 유입 경로이다. EV1의 세포 표면상의 그 수용체 α2β1에의 부착은 인테그린 뭉치화를 일으키며, 가교된 DAF를 통한 원형 CVA21 매개 유입과 유사한 방법으로 바이러스 유입을 촉진하는 것으로 제시된다. mAb 가교 뒤, DAF는 세포 표면상에서 보다 선호되는 입체형태로 제공되어, 세포를 원형 CVA21에 의한 감염에 감수적으로 만드는 것으로 가정된다. CVA21-DAFv의 표면 DAF에의 결합은 검출가능한 A-입자 형성의 부재 가운데 일어나는 것으로 보인다(도 8B). 이 결과에 대한 가능한 설명은 저계대 임상 CVA21 분리주(역시 VP3 H96 잔기를 보유)에 대해 기존에 가정된 것과 유사한 방법으로 CVA21-DAFv 비리온이 DAF를 효과적으로 가교함으로써 mAb의 가교라는 인공 작용과 연관되는 작용기전에 의해 세포로의 유입을 얻는다는 것이다. 세포 표면으로부터 용출한 검출가능한 CVA21-DAFv A-입자의 명백한 결핍은 A-입자가 형성되지 않고 있다는 것을 입증하지는 않는다. A-입자는 만일 후속 탈막 현상이 160S에서 135S 입자로의 최초의 DAF 매개 변환보다 빠른 속도로 일어난다면 축적되지 못할 것이다. 세포 유입을 위해 α2β1 인테그린을 이용하는 EV1은 캡시드 캐년 내 α2β1 인테그린의 기능적 α2I 영역에 결합한다. 전통적인 캐년-결합 수용체임에도 불구하고, α2I와의 EV1 상호작용은 바이러스 탈막을 일으키지 않으며, 이는 폴리오바이러스에 대한 폴리오바이러스 수용체의 가용성 형태 및 리노바이러스에 대한 ICAM-1의 결합과 대조된다. α2β1-발현 세포와 EV1간의 상호작용은 그러나 비리온의 입체형태 변화를 매개하는 것으로 암시되어 왔지만, EV1 탈막에 추가 세포 분자가 필요한지는 밝혀지지 않은 상태이다. 유사한 방식으로, CVA21-DAFv 탈막에 추가 세포 단백질이 필요한지, 또는 바이러스 캡시드 내 돌연변이의 존재가 캡시드를 불안정화시켜 수용체 매개 입체형태 변화의 필요성을 피할 수 있는지는 배제할 수 없다.
다양한 표현형과 조직 기원(RD 및 DOV13)의 두 암세포주를 용해성 감염하는 CVA21-DAFv의 능력은 기능적 수용체로서의 DAF의 후천성 이용이 생물선택 과정에서 채용한 특정 세포 기질에 한정되지 않는다는 점을 강조한다. 세포를 보체-매개 공격으로부터 보호하기 위해 DAF 및 다른 보체 조절 단백질의 발현이 상이한 기원의 많은 종양 세포의 표면상에서 정상 세포에 비해 향상된다. 표면-발현 DAF와의 특이적 캡시드 상호작용을 통한 CVA21-DAFv 매개 종양 용해는 향상된 DAF-결합 표현형 때문에 많은 인간 악성종양의 제어에 잠재적 효과가 있을 것으로 제안된다. 악성 흑색종 세포 표면에서 모두 과발현되는 ICAM-1과 DAF를 통해 표적화된, 흑색종 제어에 효과적인 CVA21의 원형 변종의 성공적인 적용은 이 전략을 뒷받침한다. 본 연구의 주요 발견은 신규 종양 표적 종양 용해 장 바이러스의 개발에서 바이러스 생물선택이 직접 유전자 조작의 경쟁력 있는 대안이 될 수 있다는 것이다.
III. 쿡사키바이러스 A21-DAF 매개 세포 감염력
DAF와의 장 바이러스 상호작용은 원형 및 임상 분리주간에 다양한 것으로 보인다. ICAM-1 발현 및 항체 가교된 DAF의 부재시, CVA21의 임상 분리주는 다양한 정도로 숙주 세포 용해성 감염을 달성하며 이는 아마도 특이적 바이러스 캡시드 상호작용을 통한 DAF의 가교에 의해서이다. 그러나, 많은 임상 장 바이러스 분리주에 대한 DAF 상호작용의 상세한 설명에도 불구하고, 용해성 감염 동안 DAF의 직접적인 기능적 역할은 아직 명확해지지 않았다. 장 바이러스-DAF 상호작용을 연구한 많은 연구의 일반적인 일치의견은 DAF가 바이러스 격리 수용체로서 기능함으로써, 추가적인 기능적 내화 수용체로의 바이러스 제공(presentation)을 향상시킨다는 것이다.
본 연구에서 우리는 DAF-결합 에코- 및 쿡사키 B군 바이러스와 달리 CVA21은 DAF의 N-말단 SCR에 결합한다는 것을 확인하였다(도 11). 시간, 온도 및 pH와 같은 생물리학적 파라미터들이 DAF로부터의 CVA21 용출에 끼치는 영향을 다룬 연구는 CVA21 입자가 DAF로부터 비교적 빠르게 용출하며, 이 용출은 온도와 pH 증가에 민감하다는 것을 강조한다(도 12). ICAM-1로부터의 CVA21 용출은 DAF로부터 용출한 비리온과 비교하여 바이러스 감염력의 현저한 감소가 특징이다(도 13 및 도 14). ICAM-1로부터 용출한 CVA21 비리온은 수용체 결합의 결과 비가역적 캡시드 입체형태 변화를 겪으며, 따라서 결합 및 용해성 감염 개시 능력이 없게 된다. 이와 대조적으로, mAb 가교된 DAF와의 CVA21 상호작용은 A 입자 형성을 일으키지 않는다. 수용체 결합시 비감염성 A 입자로의 입체형태 변화는 PV, 주군 HRV, 및 CVB3와 같은 많은 피코르나바이러스에서 특징적이다. DAF 용출 입자가 감염성을 유지하는 능력은 아마도 DAF가 CVA21 캡시드 입체형태 변화를 유도하지 못하는 결과일 가능성이 가장 높다. DAF 발현 CHO 세포로부터 용출한 CVA21 입자는 설탕 구배에서 감염성 160S 입자와 유사한 침강 계수를 보유한 반면, ICAM-1 발현 CHO 세포로부터 용출한 CVA21 입자는 135S 변경 입자에 가까운 감소된 침강 계수를 나타내었다. DAF 상호작용 후 CVA21 감염력의 유지는 ICAM-1 결합과 비교하여 DAF 결합에 서로 다른 지역의 비리온 캡시드가 관여하고 있는 결과일 것이다. CVA21 캐년이 ICAM-1의 부착 부위인 반면, DAF는 접근이 보다 용이한 캡시드의 2배 함요에서 결합하는 것으로 가정되며, 이는 극저온 전자현미경 재구성을 이용하여 EV7에 대해 최근에 확인된 제안이다. 유사하게, EV11 또한 캐년의 외부의 캡시드 지역에서 DAF와 결합하는 것으로 가정되지만, 이 경우에서 결합은 20면체 5배축이 관여하는 것으로 제안된다. 이들 결과는 DAF가 세포 부착에 주로 관여한다는 이론을 뒷받침하는데, 2배 함요에서의 결합은 캡시드 입체형태의 검출가능한 변화를 촉발하는 것으로 가정되지 않기 때문이다.
장 바이러스 캡시드에의 DAF 결합의 본질은 매우 빠른 해리 속도 상수의 결과의 결론으로서 낮은 친화도인 것으로 제안된다. 이와 대조적으로, 유사한 구조의 바이러스 캡시드와 ICAM-1의 상호작용은 상당한 친화도이지만 유의적으로 낮은 동역학을 가지며 이는 캡시드 캐년이라는 상대적으로 접근이 어려운 부위에의 결합과 일치한다. 수용체 결합 에피토프와 경쟁하는 mAb에의 노출 동안 DAF-결합 비리온이 ICAM-1 결합 비리온보다 용이하게 떨어지는 사실은 DAF보다 ICAM-1에 대한 보다 강한 결합을 시사한다. 그러므로, DAF-결합 CVA21의 mAb 매개 떨어짐에서의 외견적 상이함은 캡시드 표면상의 수용체 결합 부위들의 개별 위치에 대한 상대적인 접근 때문일 수 있다. 즉, 아마도 2-배 함요에서의 향상된 mAb 접근가능성에 기인한 바이러스 DAF의 용이한 해리 및 캡시드 캐년에 대한 mAb의 한정된 접근에 기인한 바이러스 ICAM-1 결합의 어려운 해리이다.
DAF와의 CVA21 상호작용의 가역성 본질은 (ICAM-1 음성 세포상의) DAF에 결합하고 최대 24h 동안 감염 상태를 유지하는 CVA21의 능력으로 강조되었다. 감염력의 유지는 지연된 ICAM-1 발현의 제공시 DAF-결합 비리온이 세포 유입 및 후속 용해성 감염을 일으키도록 하였다(도 15). 세포의 세포병리학의 검출가능한 변화가 없는 가운데, 아데노-CD36으로 형질도입된 RD 세포 및 RD 세포의 단층상의 상대적으로 높은 수준의 감염성 CVA21이(도 15) 조사 과정을 통해 지속되었다; 이는 감염력을 유지하는 DAF에 결합한 잔류 바이러스 접종물에 기인한 때문일 가능성이 가장 높다(도 13 및 도 14). 대안으로, 이는 향상된 DAF 이용 표현형을 보유하며, DAF의 가교를 허용하고 후속하는 느린 감염을 개시하는 CVA21 원형 제제 내 비리온의 아-집단의 존재 때문일 수 있으며, 이는 CVA21의 임상 분리주에 대해 기존에 설명된 사실이다.
부착 수용체로서 DAF를 이용하고 높은 감염 능력을 유지하는 CVA21의 능력은, 포유류 몸체를 통한 광범위한 DAF 분포, 특히 적혈구상의 분포를 감안하면 극히 유리한 작용기전이다. 이 환경에서, DAF 발현 적혈구는 몸체를 통한 용이한 수송 운반체를 바이러스에 제공하며, 여기에서 감염성 바이러스는 적혈구 표면을 떠나 용해성 감염을 위해 ICAM-1 발현 세포와 상호작용할 수 있다. ICAM-1의 세포 표면 발현은 종양 괴사 인자(TNF)-α 및 인터류킨(IL)-1β와 같은 염증성 사이토킨의 존재하에 향상된다. 인간 리노바이러스 감염 동안, 감염된 세포는 둘러싼 세포상에 향상된 ICAM-1 발현을 매개하는 이러한 사이토킨을 배출한다.
본 명세서에서 제시한 데이터는 CVA21 용해성 감염 동안 DAF의 주역할은 격리 수용체로서 작용하여, 바이러스를 감염성 상태로 유지 및 ICAM-1 상호작용을 통한 세포 유입 기회의 대기라는 것을 확인시켜 준다. 상대적으로 짧은 결합 및 용출 사이클링이 암시하듯이, CVA21은 세포 감염 동안 여러 번 DAF에 결합 및 그로부터 용출할 가능성이 가장 높다. 우리는 DAF로부터의 용출은 후속 단계에서의 생산성 감염을 개시하는 CVA21의 능력에 해를 끼치지 않으며, 그리고 둘 이상의 구분되는 기전에 의해 이 바이러스가 숙주 세포 유입을 달성할 기회를 사실은 증가시킨다고 제안한다. 첫째, 바이러스는 수용체 결합 능력 따라서 세포 감염력을 유지하는 가운데 DAF에 결합 및 용출할 수 있다. 둘째, CVA21은 DAF에 결합, 그리고 바이러스 내화 및 후속 용해성 감염을 가능케 하는 동일 세포 또는 근접 세포상의 유의적 수준의 ICAM-1 발현의 이용가능성을 기다릴 수 있다. 바이러스 진화 및 발병기전 모두의 측면에서, DAF에 결합하는 능력은 세포 감염력, 즉 병독성(virulent) 임상 CVA21 분리주에서 유지 및 심지어는 향상되는 표현형의 최대화에 있어서 CVA21의 원형 변종 및 기타 DAF-결합 장 바이러스에 가장 유리한 것으로 간주되어야만 한다.
IV. 쿡사키바이러스 A21 DAF 변이(CVA21-DAFv)에 의한 인간 유방암, 전립선암, 결장암 및 난소암 세포의 시험관 내 용해
여기에서 제시하는 연구는 시험관 내 선택 접근법으로 분리된 CVA21-DAFv의 특이적 종양 용해 능력을 설명한다. 12개의 인간 암세포주의 패널을 이용하여, 우리는 이 생물선택된 변종이 시험한 종양-유도 세포주 모두를 빠르게 감염한다는 것을 입증하였다. 이와 대조적으로, CVA21-DAFv가 유도된 CVA21 어버이 변종은 시험한 암세포주 12개 가운데 7개에서만 종양 용해를 매개하였다. 중요한 것은, 어버이 CVA21과 비교하여 CVA21-DAFv의 탁월한 종양 용해 활성은 이 생물선택된 변종이 생성된 RD 세포에만 국한되지 않고, 시험한 갖가지 조직 기원의 다른 인간 암세포주의 대다수에서 관찰되었다는 점이다(도 18). CVA21-DAFv가 세포 유입에 ICAM-1의 존재를 필요로 하는 어버이 CVA21에 비해 다수의 시험한 종양 세포주를 용해성 감염한다는 관찰은 깊은 임상적 효과를 가질 수 있다. 인간 고형 종양은 흔히 큰 덩어리의 밀집 세포로서, 항상 ICAM-1을 발현할 수 없다. 더욱이, ICAM-1의 발현은 전립선암 세포의 전이 잠재성과 연관된 것으로 밝혀졌다. 즉, ICAM-1은 전이성이 덜한 LNCaP 세포와 비교하여 전이성이 많은 세포주 DU145 및 PC3상에서 발현한다. 본 연구에서 우리는 LNCaP 세포는 CVA21의 어버이 변종에 의한 감염에 저항성이지만, 이 세포주는 물론 DU145 및 PC3가 CVA21-DAFv의 생물선택된 변이에 의해 용해된다는 것을 보여 주었다.
V. CVA21-DAFv에 의한 인간 전립선 이종이식의 생체 내 종양 용해
CVA21-DAFv는 CVA21 어버이 변종보다 광범위한 암세포주에 대해 종양 용해 활성을 보였지만, 생물선택된 변종의 단일 투약도 생체 내 인간 전립선 이종이식 모델에서 종양 부하 감소에 동일하게 효과적이었다. 종합하면, 여기에서 제시된 증거는 CVA21-DAFv는 많은 이질 암 유형에 대한 생물-요법으로서 이용될 잠재력을 갖는다는 것을 입증한다.
정리
CVA21의 낮은 세포 배양 계대 임상 분리주는 DAF-결합 표현형, 따라서 세포 배양의 다수의 계대로부터 획득될 것으로 예상되지 않는 것을 가지고 ICAM-1뿐만 아니라 DAF에도 결합하는 것으로 알려져 왔다. 장 바이러스 감염에서 DAF의 보다 기능적 역할에 대한 증거의 증가는 항-DAF mAb 가교 또는 표면 발현 ICAM-1의 부재시 DAF-발현 세포를 용해성 감염하는 능력을 보유하는 이러한 임상 CVA21 분리주의 증가된 DAF 이용 표현형에 의해 입증되어 왔다.
우리는 ICAM-1 음성 가로무늬근육종(RD) 세포를 용해성 감염하도록 생물선택된 CVA21의 변이, CVA21-DAFv의 수용체 이용의 본질을 조사하였다. 우리는 DAF-발현 RD 세포에서의 다수의 계대 후에, CVA21-DAFv가 ICAM-1에 결합하는 잠재력을 유지하면서 어버이 변종과 비교하여 DAF에 결합하는 증가된 능력을 나타낸다는 것을 보여 주었다. RD 세포의 용해성 감염은 항-DAF SCR mAb 차단에 의해 완전히 제거되어, DAF와의 상호작용만으로 용해성 감염을 매개할 수 있음을 시사한다. CVA21-DAFv의 세포 상호작용의 분자적 기초를 더 잘 이해하고자, CVA21-DAFv의 캡시드 부호화 지역의 뉴클레오티드 서열을 결정하여 어버이 CVA21의 것과 비교하였다. 서열 비교는 CVA21-DAFv의 VP3의 2개의 특유한 아미노산 치환의 존재를 밝혀 내었으며 이는 DAF와의 향상된 바이러스 캡시드 상호작용을 부여하는 것으로 예측된다.
넓게 설명한 본 발명의 사상 또는 범위를 벗어나지 않고 구체적 구현예에서 나타난 바와 같이 본 발명에 많은 변화 및/또는 변경이 가해질 수 있다는 것을 당업계의 숙련된 자라면 이해할 것이다. 제시한 구현예들은 따라서 모든 측면에서 예시적으로 간주되어야 하며 제한적으로 간주되어서는 아니된다.
<110> ViroTarg Pty Limited <120> Modified Oncolytic Viruses <130> 699860C <150> US 60/552,095 <151> 2004-03-11 <160> 8 <170> PatentIn version 3.2 <210> 1 <211> 2637 <212> DNA <213> Coxsackievirus A <400> 1 atgggggctc aagtctcaac tcaaaagacc ggtgcgcacg agaatcaaaa cgtggcagct 60 aatggatcca ccattaatta tactactatc aattactaca aagatagcgc gagtaattcg 120 gccactagac aagatctttc ccaagatcca tcaaaattca cggaaccggt taaggactta 180 atgttgaaaa cagcaccagc tttaaattca ccaaatgtgg aagcatgtgg atacagtgac 240 cgtgtaagac aaattaccct gggtaactca accattacca cacaagaagc agctaatgct 300 attgttgctt atggtgagtg gcctacttac ataaatgact cagaagcaaa cccagtagat 360 gcacccactg aaccagacgt tagtagcaac aggttttaca ccctagaatc ggtgtcttgg 420 aagactacct caaggggttg gtggtggaaa ctaccagact gtctaaaaga catgggaatg 480 tttggtcaga acatgtacta ccactactta ggacgctctg gttataccat tcatgtccag 540 tgcaatgcct caaaatttca ccaaggggca ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc 600 atggcctgca acactgagag caaaacatca tatgtttcat acattaacgc aaatcctggt 660 gagaggggcg gtgagttcac 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420 aagaccactt caaggggatg gtggtggaag ttaccagatt gtttgaagga catgggaatg 480 tttggtcaga atatgtacta tcactacttg gggcgctctg gttacaccat tcatgtccag 540 tgcaacgctt caaaatttca ccaaggggcg ttaggagttt ttctgatacc agagtttgtc 600 atggcttgca acactgagag taaaacgtca tacgtttcat acatcaatgc aaatcctggt 660 gagagaggcg gtgagtttac gaacacctac aatccgttaa atacagacgc cagtgagggc 720 agaaagtttg cagcattgga ttatttgctg ggttctggtg ttctagcagg aaacgccttt 780 gtgtacccgc accagatcat caacctacgt accaacaaca gtgcaacaat tgtggtgcca 840 tacgtaaact cacttgtgat tgattgtatg gcaaaacaca ataactgggg cattgtcata 900 ttaccactgg cacccttggc ctttgccgca acatcgtcac cacaggtgcc tattacagtg 960 accattgcac ccatgtgtac agaattcaat gggttgagaa acatcaccgt cccagtacat 1020 caagggttgc cgacaatgaa cacacctggt tccaatcaat tccttacatc tgatgacttc 1080 cagtcgccct gtgccttacc taattttgat gttactccac caatacacat acccggggaa 1140 gtaaagaata tgatggaact agctgaaatt gacacattga tcccaatgaa cgcagtggac 1200 gggaaggtga acacaatgga gatgtatcaa ataccattga atgacaattt gagcaaggca 1260 cctatattct gtttatccct atcacctgct tctgataaac gactgagcca caccatgttg 1320 ggtgmaatcc taaattatta cacccattgg acggggtcca tcaggttcac ctttctattt 1380 tgtggtagta tgatggccac tggtaaactg ctcctcagct attccccacc gggagctaaa 1440 ccaccaacca atcgcaagga tgcaatgcta ggcacacaca tcatctggga cctagggtta 1500 caatccagtt gttccatggt tgcaccgtgg atctccaaca cagtgtacag acggtgtgca 1560 cgtgatgact tcactgaggg cggatttata acttgcttct atcaaactag aattgtggta 1620 cctgcttcaa cccctaccag tatgttcatg ttaggctttg ttagtgcgtg tccagacttc 1680 agtgtcagac tgcttaggga cactccccat attagtcaat cgaaactaat aggacgtaca 1740 caaggcattg aagacctcat tgacacagcg ataaagaatg ccttaagagt gtcccaacca 1800 ccctcgaccc agtcaactga agcaactagt ggagtgaata gccaggaggt gccagctcta 1860 actgctgtgg aaacaggagc atctggtcaa gcaatcccca gtgatgtggt ggaaactagg 1920 cacgtggtaa attacaaaac caggtctgaa tcgtgtcttg agtcattctt tgggagagct 1980 gcgtgtgtca caatcctatc cttgaccaac tcctccaaga gcggagagga gaaaaagcat 2040 ttcaacatat ggaatattac atacaccgac actgtccagt tacgcagaaa attagagttt 2100 ttcacgtatt ccaggtttga tcttgaaatg acttttgtat tcacagagaa ctatcctagt 2160 acagccagtg gagaagtgcg aaaccaggtg taccagatca tgtatattcc accaggggca 2220 ccccgcccat catcctggga tgactacaca tggcaatcct cttcaaaccc ttccatcttc 2280 tacatgtatg gaaatgcacc tccacggatg tcaattcctt acgtagggat tgccaatgcc 2340 tattcacact tctacgatgg ctttgcacgg gtgccacttg agggtgagaa caccgatgct 2400 ggcgacacgt tttacggttt agtgtccata aatgattttg gagttttagc agttagagca 2460 gtaaaccgca gtaatccaca tacaatacac acatctgtga gagtgtacat gaaaccaaaa 2520 cacattcggt gttggtgccc cagacctcct cgagctgtat tatacagggg agagggagtg 2580 gacatgatat ccagtgcaat tctacctctg accaaggtag actcaattac cactttt 2637 <210> 8 <211> 879 <212> PRT <213> Coxsackievirus A <220> <221> misc_feature <222> (442)..(442) <223> Xaa can be any naturally occurring amino acid <400> 8 Met Gly Ala Gln Val Ser Thr Gln Lys Thr Gly Ala His Glu Asn Gln 1 5 10 15 Asn Val Ala Ala Asn Gly Ser Thr Ile Asn Tyr Thr Thr Ile Asn Tyr 20 25 30 Tyr Lys Asp Ser Ala Ser Asn Ser Ala Thr Arg Gln Asp Leu Ser Gln 35 40 45 Asp Pro Ser Lys Phe Thr Glu Pro Val Lys Asp Leu Met Leu Lys Thr 50 55 60 Ala Pro Ala Leu Asn Ser Pro Asn Val Glu Ala Cys Gly Tyr Ser Asp 65 70 75 80 Arg Val Arg Gln Ile Thr Leu Gly Asn Ser Thr Ile Thr Thr Gln Glu 85 90 95 Ala Ala Asn Ala Ile Val Ala Tyr Gly Glu Trp Pro Thr Tyr Ile Asn 100 105 110 Asp Ser Glu Ala Asn Pro Val Asp Ala Pro Thr Glu Pro Asp Val Ser 115 120 125 Ser Asn Arg Phe Tyr Thr Leu Glu Ser Val Ser Trp Lys Thr Thr Ser 130 135 140 Arg Gly Trp Trp Trp Lys Leu Pro Asp Cys Leu Lys Asp Met Gly Met 145 150 155 160 Phe Gly Gln Asn Met Tyr Tyr His Tyr Leu Gly Arg Ser Gly Tyr Thr 165 170 175 Ile His Val Gln Cys Asn Ala Ser Lys Phe His Gln Gly Ala Leu Gly 180 185 190 Val Phe Leu Ile Pro Glu Phe Val Met Ala Cys Asn Thr Glu Ser Lys 195 200 205 Thr Ser Tyr Val Ser Tyr Ile Asn Ala Asn Pro Gly Glu Arg Gly Gly 210 215 220 Glu Phe Thr Asn Thr Tyr Asn Pro Leu Asn Thr Asp Ala Ser Glu Gly 225 230 235 240 Arg Lys Phe Ala Ala Leu Asp Tyr Leu Leu Gly Ser Gly Val Leu Ala 245 250 255 Gly Asn Ala Phe Val Tyr Pro His Gln Ile Ile Asn Leu Arg Thr Asn 260 265 270 Asn Ser Ala Thr Ile Val Val Pro Tyr Val Asn Ser Leu Val Ile Asp 275 280 285 Cys Met Ala Lys His Asn Asn Trp Gly Ile Val Ile Leu Pro Leu Ala 290 295 300 Pro Leu Ala Phe Ala Ala Thr Ser Ser Pro Gln Val Pro Ile Thr Val 305 310 315 320 Thr Ile Ala Pro Met Cys Thr Glu Phe Asn Gly Leu Arg Asn Ile Thr 325 330 335 Val Pro Val His Gln Gly Leu Pro Thr Met Asn Thr Pro Gly Ser Asn 340 345 350 Gln Phe Leu Thr Ser Asp Asp Phe Gln Ser Pro Cys Ala Leu Pro Asn 355 360 365 Phe Asp Val Thr Pro Pro Ile His Ile Pro Gly Glu Val Lys Asn Met 370 375 380 Met Glu Leu Ala Glu Ile Asp Thr Leu Ile Pro Met Asn Ala Val Asp 385 390 395 400 Gly Lys Val Asn Thr Met Glu Met Tyr Gln Ile Pro Leu Asn Asp Asn 405 410 415 Leu Ser Lys Ala Pro Ile Phe Cys Leu Ser Leu Ser Pro Ala Ser Asp 420 425 430 Lys Arg Leu Ser His Thr Met Leu Gly Xaa Ile Leu Asn Tyr Tyr Thr 435 440 445 His Trp Thr Gly Ser Ile Arg Phe Thr Phe Leu Phe Cys Gly Ser Met 450 455 460 Met Ala Thr Gly Lys Leu Leu Leu Ser Tyr Ser Pro Pro Gly Ala Lys 465 470 475 480 Pro Pro Thr Asn Arg Lys Asp Ala Met Leu Gly Thr His Ile Ile Trp 485 490 495 Asp Leu Gly Leu Gln Ser Ser Cys Ser Met Val Ala Pro Trp Ile Ser 500 505 510 Asn Thr Val Tyr Arg Arg Cys Ala Arg Asp Asp Phe Thr Glu Gly Gly 515 520 525 Phe Ile Thr Cys Phe Tyr Gln Thr Arg Ile Val Val Pro Ala Ser Thr 530 535 540 Pro Thr Ser Met Phe Met Leu Gly Phe Val Ser Ala Cys Pro Asp Phe 545 550 555 560 Ser Val Arg Leu Leu Arg Asp Thr Pro His Ile Ser Gln Ser Lys Leu 565 570 575 Ile Gly Arg Thr Gln Gly Ile Glu Asp Leu Ile Asp Thr Ala Ile Lys 580 585 590 Asn Ala Leu Arg Val Ser Gln Pro Pro Ser Thr Gln Ser Thr Glu Ala 595 600 605 Thr Ser Gly Val Asn Ser Gln Glu Val Pro Ala Leu Thr Ala Val Glu 610 615 620 Thr Gly Ala Ser Gly Gln Ala Ile Pro Ser Asp Val Val Glu Thr Arg 625 630 635 640 His Val Val Asn Tyr Lys Thr Arg Ser Glu Ser Cys Leu Glu Ser Phe 645 650 655 Phe Gly Arg Ala Ala Cys Val Thr Ile Leu Ser Leu Thr Asn Ser Ser 660 665 670 Lys Ser Gly Glu Glu Lys Lys His Phe Asn Ile Trp Asn Ile Thr Tyr 675 680 685 Thr Asp Thr Val Gln Leu Arg Arg Lys Leu Glu Phe Phe Thr Tyr Ser 690 695 700 Arg Phe Asp Leu Glu Met Thr Phe Val Phe Thr Glu Asn Tyr Pro Ser 705 710 715 720 Thr Ala Ser Gly Glu Val Arg Asn Gln Val Tyr Gln Ile Met Tyr Ile 725 730 735 Pro Pro Gly Ala Pro Arg Pro Ser Ser Trp Asp Asp Tyr Thr Trp Gln 740 745 750 Ser Ser Ser Asn Pro Ser Ile Phe Tyr Met Tyr Gly Asn Ala Pro Pro 755 760 765 Arg Met Ser Ile Pro Tyr Val Gly Ile Ala Asn Ala Tyr Ser His Phe 770 775 780 Tyr Asp Gly Phe Ala Arg Val Pro Leu Glu Gly Glu Asn Thr Asp Ala 785 790 795 800 Gly Asp Thr Phe Tyr Gly Leu Val Ser Ile Asn Asp Phe Gly Val Leu 805 810 815 Ala Val Arg Ala Val Asn Arg Ser Asn Pro His Thr Ile His Thr Ser 820 825 830 Val Arg Val Tyr Met Lys Pro Lys His Ile Arg Cys Trp Cys Pro Arg 835 840 845 Pro Pro Arg Ala Val Leu Tyr Arg Gly Glu Gly Val Asp Met Ile Ser 850 855 860 Ser Ala Ile Leu Pro Leu Thr Lys Val Asp Ser Ile Thr Thr Phe 865 870 875

Claims (41)

  1. 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 선택된 피코르나바이러스.
  2. 제1항에 있어서,
    선택된 피코르나바이러스는 세포상의 붕괴-촉진 인자(DAF)를 통해 세포를 용해성 감염할 수 있는, 피코르나바이러스.
  3. 제1항에 있어서,
    피코르나바이러스는 쿡사키바이러스를 포함하는 장 바이러스, 에코바이러스, 폴리오바이러스, 미분류된 장 바이러스, 리노바이러스, 파라에코바이러스, 헤파토바이러스 및 카디오바이러스의 원형 및 임상 분리 변종으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 피코르나바이러스.
  4. 제1항에 있어서,
    피코르나바이러스는 쿡사키바이러스인, 피코르나바이러스.
  5. 제4항에 있어서,
    쿡사키바이러스는 유형 A인, 피코르나바이러스.
  6. 제4항에 있어서,
    쿡사키바이러스는 쿡사키바이러스 A21인, 피코르나바이러스.
  7. 제1항에 있어서,
    피코르나바이러스는 에코바이러스인, 피코르나바이러스.
  8. 제7항에 있어서,
    에코바이러스는 에코바이러스 6, 7, 11, 12, 13 또는 29인, 피코르나바이러스.
  9. 제1항에 있어서,
    피코르나바이러스는 폴리오바이러스인, 피코르나바이러스.
  10. 제9항에 있어서,
    폴리오바이러스는 폴리오바이러스 유형 1, 2 또는 3인, 피코르나바이러스.
  11. 제1항에 있어서,
    피코르나바이러스는 리노바이러스인, 피코르나바이러스.
  12. 제11항에 있어서,
    리노바이러스는 리노바이러스의 주군(major group) 또는 리노바이러스의 소군(major group)의 구성원인, 피코르나바이러스.
  13. 제1항에 있어서,
    피코르나바이러스는 ICAM-1이 없는 DAF-발현의 세포주에서 ICAM-1이 없는 세포를 용해성 감염할 수 없는 피코르나바이러스를 계대 및 ICAM-1이 없는 세포를 용해성 감염할 수 있는 선택된 피코르나바이러스를 회수함으로써 생물선택된, 피코르나바이러스.
  14. 제1항에 있어서,
    피코르나바이러스는 ICAM-1에의 접근이 항-ICAM-1 항체의 이용에 의해 차단된 세포에서의 계대 또는 부위 지향 돌연변이 유발과 같은 방법에 의해 변경, 돌연변이 또는 변형된, 피코르나바이러스.
  15. 제1항에 있어서,
    선택된 피코르나바이러스는 야생형 바이러스와 비교하여 하나 이상의 캡시드 단백질에 변경을 갖는, 피코르나바이러스.
  16. 제15항에 있어서,
    피코르나바이러스는 VP1, VP2 및 VP3로부터 선택된 캡시드 단백질의 변경을 포함하는 쿡사키바이러스인, 피코르나바이러스.
  17. 제16항에 있어서,
    돌연변이는 VP3 R96H; VP3 E101A; VP3 A239S; VP2 S164L 및 VP2 V209 가운데 하나 이상으로부터 선택되는, 피코르나바이러스.
  18. 제1항에 있어서,
    선택된 피코르나바이러스는 서열 번호 1, 서열 번호 3, 서열 번호 5, 및 서열 번호 7로 이루어진 군으로부터 선택되는 핵산 서열에 의해 부호화된 캡시드 단백질을 포함하는, 피코르나바이러스.
  19. 제1항에 있어서,
    세포는 신생물인, 피코르나바이러스.
  20. 제19항에 있어서,
    신생물은 DAF-발현 신생물인, 피코르나바이러스.
  21. 제20항에 있어서,
    신생물은 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백 혈병, 흑색종, 전암(pre-cancerous) 세포, 식도암, 유방암, 뇌암, 난소암, 위 및 장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 피코르나바이러스.
  22. 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 피코르나바이러스로부터 유도된 핵산 분자.
  23. 제22항에 있어서,
    핵산은 단일 가닥 RNA 또는 상보성 DNA인, 핵산.
  24. 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염할 수 있는 피코르나바이러스를 생물선택하는 방법에 있어서,
    세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염할 수 없는 피코르나바이러스를 적합한 세포주 내에서 충분한 계대수 동안 배양 및 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염할 수 있는 피코르나바이러스를 선택하는 것을 포함하는, 방법.
  25. 제24항에 있어서,
    세포주는 가로무늬 근육종, 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백혈병, 흑색종, 전암(pre-cancerous) 세포, 식도암, 유방암, 뇌암, 난소암, 위 및 장암과 같은 인간 암으로부터 선택되는, 방법.
  26. 제25항에 있어서,
    세포주는 ICAM-1을 발현하지 않는 DAF-발현 세포주인, 방법.
  27. 제24항의 방법으로부터 얻은 피코르나바이러스.
  28. 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 피코르나바이러스와 함께, 적합한 약학적 허용 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  29. 세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 피코르나바이러스의 바이러스 핵산 분자와 함께, 적합한 약학적 허용 부형제 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
  30. 신생물을 앓는 포유류 내 신생물을 치료하는 방법에 있어서,
    세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 피코르나바이러스의 유효량을, 신생물 세포의 바이러스-매개 종양 용해를 일으키는 조건하에서 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  31. 제30항에 있어서,
    신생물은 DAF-발현 신생물인, 방법.
  32. 제30항에 있어서,
    신생물은 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백혈병, 흑색종, 전암(pre-cancerous) 세포, 식도암, 유방암, 뇌암, 난소암, 위 및 장암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  33. 신생물을 앓는 포유류 내 신생물을 치료하는 방법에 있어서,
    세포간 유착 분자-1(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 피코르나바이러스로부터 유도된 핵산 분자의 유효량을, 신생물 세포의 바이러스-매개 종양 용해를 일으키는 조건하에서 포유류에 투여하는 것을 포함하는 방법.
  34. 제33항에 있어서,
    신생물은 DAF-발현 신생물인, 방법.
  35. 제33항에 있어서,
    신생물은 폐암, 전립선암, 직장결장암, 갑상선암, 신장암, 부신암, 간암, 백 혈병, 흑색종, 전암(pre-cancerous) 세포, 식도암, 유방암, 뇌암 및 난소암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법.
  36. 세포간 유착 분자(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 피코르나바이러스의 요법 또는 치료법에 있어서의 용도.
  37. 세포간 유착 분자(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 피코르나바이러스로부터 유도된 핵산 분자의 요법 또는 치료법에 있어서의 용도.
  38. 세포간 유착 분자(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 선택된 피코르나바이러스의 포유류 내 신생물 치료용 의약 제조에 있어서의 용도.
  39. 포유류 내 신생물을 치료하는 바이러스 생성을 위해 포유류에 접종물을 적용하는 적용기에 있어서,
    적용기는 접종물이 포유류와 접촉하도록 접종물로 함침된 지역을 포함하고, 바이러스는 세포간 유착 분자(ICAM-1)의 실질적인 부재시 세포를 용해성 감염 또는 세포 내 세포자멸사를 유도할 수 있는 분리된 선택된 피코르나바이러스인, 적용기.
  40. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 CVA21-DAFv 형태의 분리된 선택된 피코르나바이러스.
  41. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 CVA21 #272101, 275238 및 272598로 이루어진 군으로부터 선택되는 CVA21 변종의 형태의 분리된 선택된 피코르나바이러스.
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