JP2008510685A - 血液ガンを治療するための方法および組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
略称「MM」は本明細書中では多発性骨髄腫の代わりに使用される。
図1は、多発性骨髄腫細胞株に対するICAM−1およびDAFのフローサイトメトリー分析を示す。多発性骨髄腫細胞株(RPMI−8226、U266およびNCI−H929)および正常なPBMCを抗ICAM−1mAbおよび抗DAFmAbにより二重染色した。抗ICAM−1mAbはFITCと直接にコンジュゲート化され、抗DAFmAbが、PEに連結された二次コンジュゲートを介して間接的に染色された。
図2は、多発性骨髄腫細胞株に対するCVA21の細胞変性効果を示す。多発性骨髄腫細胞株および正常なPBMCに対するCVA21の細胞変性効果を評価するために、RPMI−8226、U266、NCI−H929およびPMBCの6ウエルプレートでの培養物をCVA21の存在下または非存在下において37℃で48時間インキュベーションした(約1MOI)。細胞上清をウエルのそれぞれから注意深く吸引し、細胞を0.01%トリパンブルー溶液で染色した。CVA21によって破壊された非生存性細胞がトリパンブルーによって陽性に染色され、一方、生存性細胞はこの色素を排除することができた。顕微鏡写真を100倍の倍率で撮影した。
図3は、MMTアッセイを使用するMM細胞株および正常なPBMCに対するCVA21の腫瘍退縮作用を示す。MM細胞株(RPMI−8226、U266およびNCI−H929)および正常なPBMCは、48時間にわたる連続CVA21に対する示差的感受性を明らかにする。誤差バーは群あたり四連ウエルの平均値の標準誤差を示す。
図4は、多発性骨髄腫細胞株感染後のCVA21収量を示す。CVA21による24時間および48時間の感染の後における感染性ウイルス粒子を生じさせるMM細胞株(NCI−H929、U266およびRPMI−8226)の能力。約1MOIのCVA21を感染させた後、ウイルスの増加を、正常なPBMCとは対照的に、多発性骨髄腫細胞株のそれぞれにおいて検出することができる。
図5は、多発性骨髄腫細胞におけるCVA21のウイルス成長曲線を示す。同時感染(約1の感染多重度)および示された時間間隔でのウイルス子孫の回収の後でのU266(黒丸)、NCI−H929(白丸)およびRPMI−8226(下向き黒三角)の細胞株におけるCVA21のウイルス成長曲線。サンプルの滴定を三連で行い、各時点での平均ウイルス収量をプロットした。
図6は、CVA21を感染させたRPMI−8226細胞、NCI−H929細胞およびU266細胞におけるDNA断片化の分析を示す。RPMI−8226細胞、NCI−H929細胞およびU266細胞にCVA21を24時間感染させた(〜10TCID50/細胞のMOI)。総DNAを感染細胞および非感染細胞から抽出し、断片化をアガロースゲル電気泳動によって評価した。骨髄腫細胞株からのDNAサンプルが示される:RPMI−8226(レーン1および2)、NCI−H929(レーン3および4)およびU266(レーン5および6)。レーン「M」は1kbのDNAラダーを含有する。培地単独で培養されたMM細胞株から抽出されたDNAが、レーン1、レーン3およびレーン5に示され、これに対して、レーン2、レーン4およびレーン6は、CVA21により処理された細胞株から抽出された細胞DNAを含有する。
図7は、PBMCとの混合物からの多発性骨髄腫細胞の生体外除去を示す。正常なPBMCと多発性骨髄腫細胞(RPMI−8226およびU266)との混合物を一緒に培養し、これにCVA21を3日間感染させて、多発性骨髄腫除去の効率を評価した。生存している骨髄腫細胞(CD138+/PI−)およびPBMC(CD138−/PI−)をフローサイトメトリーによって評価した。除去処理サンプル(「CVA21」)および除去非処理サンプル(「ウイルスなし」)のフローサイトメトリープロットがRPMI−8226細胞株およびU266細胞株の両方について示される。
図8は、多発性骨髄腫の臨床サンプルにおけるICAM−1発現の分析(図8A)およびCVA21の成長阻害(図8B)を示す。図8A:患者の骨髄吸引物を多発性骨髄腫患者から得て(臨床サンプル#001)、単一細胞懸濁物を得るために処理した。細胞を抗CD138抗体および抗ICAM−1抗体により二重染色した。ICAM−1の発現について陽性である骨髄腫細胞がドットプロットの上部右側象限(CD138+/ICAM−1+)に現れる。原発性腫瘍サンプルにおける細胞の約37%がCD138+のプラスマ細胞からなっていた。図8B:患者からの臨床での骨髄細胞に、その後、CVA21を様々な濃度で感染させ、ガン細胞の成長阻害をMTTアッセイによって評価した。グラフは、サンプル#001について、異なる投入量のウイルスでの細胞生存率を示す。
図9は、多発性骨髄腫プラスマ細胞を骨髄臨床サンプルから除去するCVA21の能力を示す(図9A〜図9C)。図9A:患者#001からの骨髄サンプルを、ウイルスなし、〜2.75TCID50/細胞、〜5.5TCID50/細胞または〜11TCID50/細胞のいずれかと72時間インキュベーションし、その後、フローサイトメトリーにより分析して、依然として生存している骨髄腫細胞の割合を評価した。細胞をヨウ化プロピジウムおよび抗CD138−FITC抗体により二重染色した。異なる濃度のウイルスによる除去処理の後で残っている生存している骨髄腫細胞を各ドットプロットの下部右側象限(CD138+/PI−)に認めることができる。図9B:0TCID50/細胞、〜2.75TCID50/細胞、〜5.5TCID50/細胞を48時間感染させたCVA21感染の原発性腫瘍サンプルの顕微鏡写真。細胞の集塊化を、ウイルスなしのコントロールと比較して、両方のウイルス処理サンプルにおいて認めることができる(40倍の倍率)。図9C:上記のフローサイトメトリーデータから計算された、異なる濃度のウイルスによる攻撃の後での生存性骨髄腫細胞の割合。
図10は、CVA21はプラスマ細胞をMMおよびMGUSのBMから選択的に除去することを示す(図10A〜図10E)。図10A:CD138+細胞におけるICAM−1発現。抗CD138および抗ICAM−1による染色の後における、患者#005からの代表的なドットプロット。図10B(i):再発MM患者(#001、#002および#008)、部分的寛解でのMM患者(#003)、意味未確定の単クローン性高ガンマグロブリン血症(MGUS)の患者(#004、#006)、および、診断時にMMの患者(#007)から得られたBMサンプルのインビトロ感染および殺傷。7名の患者から得られたBMサンプルに、CVA21を、0TCID50/細胞(mock)、3TCID50/細胞または10TCID50/細胞の感染多重度(MOI)でインビトロ感染させた。サンプルを感染後48時間で集め、CD138について染色した後でフローサイトメトリーによって分析した。10,000個の事象をサンプルあたり記録した。CD138陽性であった生存性細胞の割合が示される。図10B(ii):本明細書中の表1に示されるような様々な条件による合計で19個の臨床サンプルについての累積的結果。図10C:BM子孫はCVA21に対して抵抗性がある。CVA21を、0TCID50/細胞(mock)、3TCID50/細胞および10TCID50/細胞のMOIで48時間感染させた3つのBMサンプルからの残存細胞(約10,000個の細胞)を3mlのMethoCult GF4434完全メチルセルロース培養培地(Stem Cell Technologies、Vancouver、カナダ)で培養した。CFU−GMの培養を6ウエルプレートのウエルで行い、37℃および5%CO2において14日間インキュベーションした。CFU−GMを、倒立型顕微鏡を使用して、20個以上の細胞の顆粒球および/またはマクロファージからなるコロニーとしてスコア化した。それぞれの濃度でのCVA21による感染の後における平均コロニー数が示される。誤差バーは3つのサンプルの平均値の標準誤差を示す。示されるコロニー数は、置床された1x104細胞あたりである。CFU−GM、顆粒球/マクロファージのコロニー形成ユニット。図10D:PBMC(CD138−)集団は、フローサイトメトリーによって評価されたとき、CVA21除去処理後も依然として生存性であった。上記の(B)(i)に記載される7つの患者BMサンプルへの感染の後、CD138−細胞を同様に定量した。この集団はCVA21感染後も比較的変化を受けずにいた。図10E:図10B(ii)に記載されるような患者由来のBMサンプルのインビトロ感染および殺傷。結果がCD138+細胞の減少率として表される。
図11は、B細胞リンパ腫、B前リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病(APML)、単球性白血病および多発性骨髄腫の細胞株に対するICAM−1およびDAFのフローサイトメトリー分析を示す(図11A〜図11B)。(A)B細胞リンパ腫細胞株SCOTT、B前リンパ球性白血病細胞株JVM13、急性前骨髄球性白血病(APML)細胞株NB4、および、(B)急性前骨髄球性白血病(APML)細胞株HL−60、単球性白血病細胞株U937および多発性骨髄腫細胞株H929を、抗ICAM−1mAbおよび抗DAFmAbにより二重染色した。抗ICAM−1mAbはFITCと直接にコンジュゲート化され、抗DAFmAbが、PEに連結された二次コンジュゲートを介して間接的に染色された。
図12は、MMTアッセイを使用した、選択された血液ガン細胞株に対するCVA21、CVA18、CVA15およびCVA13の腫瘍退縮作用を示すグラフである(図12A〜図12C)。(A)MM細胞株RPMI−8226、(B)単球性白血病細胞株U937および(C)急性前骨髄球性白血病(APML)細胞株HL−60は、48時間について示されるように、連続ウイルスに対する示差的な感受性を明らかにする。
図13は、選択された血液ガン細胞株の感染後におけるCVA21収量を示すグラフである。CVA21による24時間および48時間の感染の後で感染性ウイルス粒子を生じさせる、(菱形)MM細胞株RPMI−8226、(四角)単球性白血病細胞株U937および(三角)急性前骨髄球性白血病(APML)細胞株HL−60の能力。約10TCID50/細胞のCVA21を感染させた後、ウイルスの増加がMM細胞株RPMI−8226においてだけ検出された。
細胞およびウイルス
コクサッキーAウイルスCVA21の原型株(Kuykendall株)をM.Kennett博士(Enterorespiratory Laboratory、Fairfield Hospital、Melbourne、Victoria、オーストラリア)から得た。CVA21を2回プラーク精製し、ICAM−1を発現するメラノーマ細胞(SK−Mel−28)において成長させた。ウイルスは、CVA21、CVA18、CVA15およびCVA13の研究室保存株であった。コクサッキーAウイルスのこれらの原型株、CVA13(Flores)、CVA15(G−9)、CVA18(G−13)およびCVA21(Kuykendall)もまたM.Kennett博士から得た。最初に、CVA13、CVA15およびCVA18をHeLa−B細胞において増殖させ、一方、CVA21KuykendallをRD−ICAM−1細胞において増殖させた。その後、これらのウイルスの作業用の研究室ストックをSK−Mel−28細胞においてこれらの保存株から調製した。
すべての手順が、University of Newcastle Human Care and Ethics Committee(Newcastle、NSW、オーストラリア)およびHunter Area Health Service Human Care and Ethics Committee(Newcastle、NSW、オーストラリア)で承認された。原発性腫瘍細胞を、多発性骨髄腫の診断のために定期的な骨髄検査を受けている患者から得た。骨髄吸引物を、表1に示されるように19名の患者から集めた。
ICAM−1のN末端ドメイン(Berendt AR他、Cell、1992、68:71〜81)に対する、フルオレセインイソチオシアナート(FITC)とコンジュゲート化された市販の抗CD54抗体(Immunotech Coulter、Marseilles、フランス)を、表面に発現したICAM−1を染色するために使用した。抗DAFmAbをB.Loveland博士(Austin Research Institute、Heidelberg、Victoria、オーストラリア)から得た。抗CD138−FITCmAb(Serotec、Oxford、英国)はプラスマ細胞抗原Syndecan−1に対して特異的であった。フィコエリトリン(PE)とコンジュゲート化されている別の市販の抗CD138抗体をMiltenyi Biotec(CA、米国)から得た。
多発性骨髄腫細胞株および他の血液ガン細胞株(B細胞リンパ腫、B前リンパ球性白血病、急性前骨髄球性白血病(APML)および単球性白血病)におけるICAM−1およびDAFの表面発現を二色フローサイトメトリーによって分析した。簡単に記載すると、分散させた細胞(1x106個)を、直接にコンジュゲート化された抗CD54−FITCmAb(リン酸塩緩衝化生理的食塩水(PBS)に希釈された5μg/ml)と氷上で20分間インキュベーションした。その後、細胞をPBSにより洗浄し、1000xgで5分間ペレット化し、その後、抗DAF IH4mAb(PBSにおいて5μg/ml)による二重標識化を氷上で20分間行った。細胞をPBSにより洗浄し、100μlの二次抗体溶液(PBSにおいて1:100希釈されたヤギ抗マウス免疫グロブリンのR−フィコエリトリンコンジュゲート化F(ab’)2フラグメント)(DAKO A/S、デンマーク)に再懸濁し、氷上で20分間インキュベーションした。それぞれの細胞株について、適切なコンジュゲートコントロール抗体による染色もまた並行して行った。細胞を上記のように洗浄およびペレット化し、PBSに再懸濁し、FACStar分析計(Becton Dickinson、Sydney、オーストラリア)を使用してICAM−1発現およびDAF発現について分析した。
多発性骨髄腫細胞株のRPMI−8226、U266およびNCI−H929を、CVA21の存在下または非存在下で48時間、6ウエルプレートで培養した。健康な志願者から得られた正常なヒト末梢血単核細胞をコントロールとして使用した。感染多重度(MOI)はそれぞれの培養物について約5TCID50/細胞であった。細胞変性効果(CPE)を、トリパンブルー生存性染色を使用してCVA21感染後48時間で評価した。多発性骨髄腫細胞株によって上清中に分泌されたタンパク質に対するトリパンブルーの親和性のために、培養上清を、染色前に、先を丸めた26ゲージのニードルによるゆっくりした吸引によって最初に除いた。残った細胞を0.4%トリパンブルー溶液により5分間染色した。写真を100倍の倍率で撮影した。
改変型の微量培養テトラゾリウムアッセイ(Alley MC他、Cancer Res.、1988、48:589〜601)を、多発性骨髄腫細胞株の成長に対する、CVA21濃度を増大させたときの影響を調べるために使用した。簡単に記載すると、多発性骨髄腫細胞を指数期の維持培養物から集め、100μlの体積で反復して96ウエル培養プレートにおいて分散させた(1x105細胞/ウエル)。100μlの培養培地、または、ウイルスを含有する培養培地(2x10−5〜20TCID50/細胞)を適切なウエルに分注した。他のコクサッキーAウイルス(CVA13、CVA15およびCVA18)の成長阻害をCVA21と比較するために、1x10−4〜100TCID50/細胞の範囲での10倍の連続希釈物を使用した。細胞を含有しないウエルを培地単独またはウイルス溶液単独の「バックグラウンド」測定のために利用した。
CVA21のCPEを3つの骨髄腫細胞株で測定した後、感染期間中に産生された感染性ウイルス粒子の収量を測定するための実験を、U266細胞、RPMI−8226細胞、NCI−H929細胞およびPBMCにおいて行った。各細胞株に由来する約3x106個の細胞を1TCID50/細胞のMOIにより感染させた。CVA21を接種したU266細胞、RPMI−8226細胞、NCI−H929細胞およびPBMCをPBSにより2回洗浄し、600μlのRPMIに再懸濁し、その後、それぞれを3つの200μlのアリコートに分割した(約1x106細胞/チューブ)。これらのチューブを37℃でインキュベーションし、細胞株のそれぞれに由来する1つのアリコートを、0時間、12時間、24時間および48時間の時間で集め、細胞を3回の連続した凍結・解凍サイクルによって集めた。細胞溶解物のそれぞれにおけるウイルス収量をSK−Mel−28細胞における終点滴定アッセイによって評価した。結果が図4に示される。
3つの骨髄腫細胞株におけるCVA21の複製速度を調べるために、1x106個のU266細胞、RPMI−8226細胞またはNCI−H929細胞を含有するチューブに、約3x106TCID50のCVA21を含有する100μlのウイルスアリコートを感染させた(〜3TCID50/細胞のMOI)。チューブを室温で30分間穏やかに振とうし、その後、細胞を毎回5mlのRPMIにより5回洗浄し、細胞を、1%FCSを含有するRPMIの1mlに再懸濁した。その後、CVA21を接種した細胞のそれぞれのチューブを、適切な時点での回収のために9個の別個の100μlアリコート(〜1x105細胞/チューブ)に分割した。チューブを実験期間中37℃でインキュベーションした。同時感染を、0時間、2時間、4時間、6時間、8時間、10時間、12時間、24時間および48時間の時間間隔で中断し、試験された細胞株のそれぞれに由来する1つのアリコートをそれぞれの時点で集め、細胞を3回の連続した凍結・解凍サイクルによって溶解し、室温における5分間の10,000xgでの遠心分離に供し、その後、細胞溶解物におけるウイルス収量を終点滴定アッセイで測定した。
MM細胞のCVA21感染によるアポトーシスの誘導を、ゲノムDNAの断片化を検出することによって測定した。MM細胞株のRPMI−8226、U266およびNCI−H929を6ウエルプレートで培養し(5x105細胞/ウエル)、分析前に37℃で24時間、CVA21(〜10TCID50/細胞のMOI)により感染させたか、または、培地単独により非感染のままにした。細胞を800gでの5分間の遠心分離によってペレット化し、その後、500μlの溶解緩衝液(5mMのTris−HCl、20mMのEDTA、0.5%のTritonX−100、pH8.0)を細胞ペレットに加え、氷上で20分間インキュベーションした。溶解物を12,000gで20分間遠心分離し、DNAを、フェノール:クロロホルムを使用して上清から抽出した。DNAをエタノール沈殿し、70%エタノールで洗浄し、RNase(50μg/ml)を含有する30μlのTAEに再懸濁した。DNAサンプルをアガロースゲル電気泳動による分析の前に37℃で30分間インキュベーションした。15μlの抽出されたDNAを3μlの負荷緩衝液(TAEにおいて0.25%のオレンジG、40%のグリセロール)と混合し、その後、臭化エチジウムを含有する1.2%TAEアガロースゲルで分離した。ゲルをUV光のもとで可視化し、像を、Gel Docシステム(Bio−RAD、Regents Park、New South Wales、オーストラリア)を使用してデジタル画像として記録した。
U266およびRPMI−8226の骨髄腫細胞株をそれぞれ、10%の最終的なプラスマ細胞濃度をもたらすように、10%FCSが補充されたRPMI培地においてPBMCと混合した。細胞混合物を、72時間、CVA21(総細胞集団あたり1MOI)で処理したか、または、非処理のままにした。除去の3日目に、細胞集団の各混合物からのサンプルをPBSにおいて集め、無傷のガン細胞の数を、抗CD138−FITC(10μl/ml)で最初に30分間染色し、その後、ヨウ化プロピジウム(PI)(5μg/ml)で10分間染色した後、フローサイトメトリーを使用して評価した。FACStar分析計(Becton Dickinson、Sydney、オーストラリア)での分析の前に、細胞を5mlのPBSで洗浄し、1000gでの遠心分離によってペレット化した。もはや生存していないか、または無傷でない細胞がヨウ化プロピジウムにより陽性に染色され(PI+)、一方、抗CD138−FITCによる染色を、多発性骨髄腫細胞(CD138+)を正常なPBMC(CD138−)から明らかにするために使用した。
原発性腫瘍サンプルを、インフォームドコンセントが得られた2名の多発性骨髄腫患者から得た。定期的な診断のときに採取された骨髄吸引物からの余剰細胞のみをこの研究では使用した。最初に、ICAM−1受容体のレベルを、上記で記載されたような標準的な表面受容体染色プロトコルに基づく、原発性腫瘍細胞(1x105細胞)の抗CD138−PE抗体(10μg/ml)および抗ICAM−1−FITC抗体(5μg/ml)による二重染色によってそれぞれの臨床サンプルについて評価した。その後、成長阻害/MTTアッセイを、CVA21を感染させた臨床サンプルに対して三連で行った。約1x105細胞(5%FCSを含有するRPMIにおいて)を、その後、0TCID50/細胞から16TCID50/細胞までの範囲での10倍連続希釈でCVA21による腫瘍退縮を評価するために96ウエルプレートのウエルに接種した。これらの細胞を、MTTアッセイを使用する分析の前に37℃で48時間インキュベーションした。
MM細胞はICAM−1およびDAFを発現する
フローサイトメトリーを使用して、いくつかのMM細胞株の表面におけるCVA21細胞進入受容体のICAM−1およびDAFの相対的なレベルを評価した。U266細胞、RPMI−8226細胞およびNCI−H929細胞を、抗ICAM−1抗体および抗DAF抗体による二重染色の後でのフローサイトメトリーによって分析した。これら3つの細胞株のそれぞれが、コンジュゲートコントロールと比較して、それぞれのドットプロット(図1)の上部右側象限における染色細胞によって強調されるように、ICAM−1およびDAFの両方の上昇したレベルを明らかにした。しかしながら、PBMCサンプルにおけるすべての細胞がICAM−1の表面発現を示したわけではなく、細胞の大部分がICAM−1について陰性に染色された。しかしながら、PBMCは、コンジュゲートサンプルとは対照的に、二重染色されたサンプルでのPBMC集団の上方への移動において見られるように、DAF発現について陽性であった。
ピコルナウイルスによる感染および溶解に対する血液ガンの潜在的な感受性をさらに調べるために、細胞進入受容体のICAM−1およびDAFの発現を一連の代表的な細胞株について明らかにした。フローサイトメトリーを使用して、B細胞リンパ腫細胞株SCOTT、B前リンパ球性白血病細胞株JVM13、急性前骨髄球性白血病(APML)細胞株のNB4およびHL−60、単球性白血病細胞株U937、ならびに多発性骨髄腫細胞株H929の表面におけるCVA21細胞進入受容体のICAM−1およびDAFの相対的なレベルを抗ICAM−1抗体および抗DAF抗体による二重染色の後で評価した。B細胞リンパ腫細胞株SCOTT、B前リンパ球性白血病細胞株JVM13およびMM細胞株H929は、コンジュゲートコントロールと比較して、それぞれのドットプロット(図11Aおよび図11B)の上部右側象限における染色細胞によって強調されるように、ICAM−1およびDAFの両方の発現を明らかにした。単球性白血病細胞株U937もまた、より少程度ではあったが、ICAM−1およびDAFの上昇したレベルを明らかにした。DAF発現について陽性に染色されたが、急性前骨髄球性白血病(APML)細胞株のNB4およびHL−60における細胞の大部分がICAM−1について陰性に染色された。
ICAM−1およびDAFを発現する多発性骨髄腫細胞がCVA21による腫瘍退縮に対して感受性であるかどうかを評価するために、細胞にCVA21(約5TCID50/細胞のMOI)を37℃で48時間感染させた。多発性骨髄腫細胞株のそれぞれが24時間においてCVA21感染の初期徴候を示した。U266細胞株、RPMI−8226細胞株およびNCI−H929細胞株におけるCVA21の最大の細胞変性効果が、細胞の集塊化および凝集ならびにトリパンブルーの取り込み(図2)によって見られるように、感染後の24時間〜48時間で観測された。ヒト末梢血単核細胞における細胞変性効果は、これら3つの多発性骨髄腫細胞株と比較して最小限であった。
様々な多発性骨髄腫細胞株に対するCVA21の示差的な殺傷および成長阻害を、MTT細胞生存性アッセイを使用して、より詳しく調べた。平板培養されたU266細胞、RPMI−8226細胞およびNCI−H929細胞を、増大する濃度のCVA21に48時間さらした。CVA21の腫瘍退縮作用をCVA21の増大する用量の関数としてのMTT生存率によって明らかにした。図3はCVA21暴露後の成長阻害プロフィルおよび用量依存的な肩を例示する。アッセイされたMM細胞株のそれぞれが感受性であることが見出され、RPMI−8226細胞株およびU266細胞株では、低濃度のCVA21に対する応答における著しい成長阻害が明らかにされた。正常なPBMCは、高濃度のウイルスに対する暴露の後では成長が阻害され、しかしながら、20MOIでさえ、PBMCの生存率は、それぞれが10%未満の生存率であったMM細胞株と比較して、80%であった。
さらなる腫瘍退縮作用のために感染性子孫を産生するCVA21感染のMM細胞の能力を明らかにするために、U266、RPMI−8226、NCI−H929およびPBMCとのCVA21感染の後におけるウイルス収量を測定した。感染後の24時間および48時間で、3つの骨髄腫細胞株からのウイルス収量は、0時間の時点と比較して、ウイルス力価の劇的な増大を示した(図4)。しかしながら、PBMCはCVA21収量の増大を示しておらず、このことは、CVA21は正常なヒトPBMCにおける複製が許容されないという証拠を提供している。CVA21は、CVA21複製またはウイルス収量の増大を何ら伴うことなく、6日の延長された期間までPBMCにおいて増殖することができた(データ示さず)。
悪性細胞のウイルス療法の1つの利点は、局所的部位または遠方の部位でさえ、周囲の悪性細胞をさらに標的とすることができる感染性子孫ウイルスが産生され得ることである。3つの多発性骨髄腫細胞株の同時感染の後、完全な細胞および上清を、示された時点で集めた(図5)。ガン性細胞株におけるCVA21の複製が非常に迅速であることが見出され、感染させた多発性骨髄腫細胞からのウイルス力価の増大が、CVA21によるウイルス接種後の4時間もの早期に観測された。U266細胞、RPMI−8226細胞およびNCI−H929細胞におけるCVA21の1段階成長曲線分析では、感染後の8時間〜12時間での最大力価への効率的なウイルス複製が明らかにされた。
CVA21が感染期間中に多発性骨髄腫細胞のアポトーシスを誘導するかどうかを明らかにするために、CVA21を、RPMI−8226細胞、NCI−H929細胞またはU266細胞のいずれかと〜10TCID50/細胞のMOIとインキュベーションし、アポトーシスを感染後24時間でのDNA断片化アッセイによって評価した。CVA21は、感染させたU266細胞(レーン6)ではなく、感染させたRPMI−8226細胞およびNCI−H929細胞(それぞれ、レーン2およびレーン4)においてアポトーシスに特徴的なDNAラダー化を誘導した(図6)。DNA断片化が、CVA21で処理されたU266細胞では観測されなかった。このことは、この細胞株におけるCVA21による腫瘍退縮はアポトーシスを誘導しなかったことを示している。これらの結果は、CVA21はRPMI−8226細胞およびNCI−H929細胞においてアポトーシスを誘導することができ、しかし、U266骨髄腫細胞の腫瘍退縮の期間中にはアポトーシス防止のシグナル伝達経路を活性化し得ることを示唆する。レーン1、レーン3およびレーン5は、mock感染のコントロール細胞から抽出されたDNAを含有した。
正常な細胞ではなく、多発性骨髄腫細胞の腫瘍退縮についてのCVA21の特異性を、多発性骨髄腫細胞を、約10%の腫瘍負荷をもたらすように正常なヒト末梢血単核細胞と混合し、CVA21による3日間の除去処理を行うことによって調べた。抗CD138−FITCおよびPIで染色することによって、正常なPBMCおよび多発性骨髄腫細胞の生存性集団および非生存性集団を区別することができる。図7(「ウイルスなし」)に示されるように、CVA21による感染の前では生存性のRPMI−8226細胞またはU266細胞の集団(CD138+/PI−)をフローサイトメトリーのドットプロットの下部右側象限に見ることができる。RPMI−8226同時培養物またはU266同時培養物をCVA21により3日間にわたって1TCID50/細胞のMOIで除去処理した後では、0.26%未満および0.51%未満の生存性骨髄腫細胞がそれぞれ残存している。CVA21は約98%のRPMI−8226細胞および約95.7%のU266細胞を同時培養物から除去することができた。生存性リンパ球集団が下部左側象限に示され、CD138およびPIに関して陰性に染色される。ウイルスを感染させた後、これらの集団は、CVA21に対する3日間の暴露の後でさえ、比較的変化しないままである。
いくつかの多発性骨髄腫細胞株の効果的な腫瘍退縮をインビトロで明らかにした後、2つの原発性多発性骨髄腫の骨髄サンプルからのガン性細胞の生体外除去を確認した。定期的な診断を受けている2名の患者からの骨髄吸引物を単一細胞懸濁物に処理した。細胞を最初に、多発性骨髄腫細胞におけるICAM−1の表面発現を明らかにするために、抗CD138抗体および抗ICAM−1抗体により染色した。骨髄腫状態(CD138+)とICAM−1発現との間での著しい相関が、調べられた両方の臨床サンプルにおいて見出された。臨床サンプルの一方からの結果が図8Aに示される。臨床サンプル#001において、総細胞の約37%が多発性骨髄腫プラスマ細胞であり、CD138マーカーおよびICAM−1の両方を発現していた。骨髄腫細胞の類似する集団が第2の患者において見出され、約41%の細胞がCD138およびICAM−1の両方により染色された(データ示さず)。
細胞に感染し、細胞を破壊するためにICAM−1を使用する他のコクサッキーAウイルス(例えば、CVA13、CVA15およびCVA18など)もまた、多発性骨髄腫細胞の成長を阻害することができた。RPMI−8226細胞を代表的な多発性骨髄腫細胞株として使用したとき、この細胞のCVA13処置、CVA15処置およびCVA18処置では、0.1TCID50/ml〜100TCID50/mlの濃度で、CVA21の抗腫瘍効果と類似する抗腫瘍効果が明らかにされた(図12A)。CVA13、CVA15、CVA18およびCVA21の効果は、多発性骨髄腫でないガン細胞のU937およびHL−60に対してアッセイされたとき、それほど一致していなかった(図12Bおよび図12C)。ある程度の成長阻害がU937細胞およびHL−60細胞に対してこれらのウイルスのそれぞれにより観測されたが、これらの細胞の感染の後でのCVA21成長の収量に対する詳細な研究では、ガン細胞株のU937およびHL−60はウイルスの複製を支援することができず、従って、ウイルス療法のための理想的な候補になり得ないことが示唆される(図13)。
コクサッキーウイルスA21は、悪性メラノーマに対する効果的な抗腫瘍性薬剤であることが初めて示された新規な腫瘍退縮薬剤である。CVA21は、軽い上部気道感染症に広く伴うピコルナウイルスであり、ヒトにおいて重篤な疾患を引き起こすことは知られていない(Rueckert RR、ピコルナウイルス科:ウイルスおよびその複製、Fields BN、Knipe DM、Howley PM編、Fields Virology、第1巻、Philadelphia:Lippincott−Raven;1996:609〜645)。これらの結果は、CVA21が、いくつかのMM細胞株のインビトロ試験の後において多発性骨髄腫に対する強力な腫瘍退縮性薬剤であることを明らかにしている。この結論は、MM細胞株に対するCVA21の観測された細胞変性効果(図2)によって、また、MTTアッセイを介して確認されるようなMM細胞に対するCVA21の著しい成長阻害/細胞毒性(図3)によって裏付けられる。
本発明者らのデータは、インビボでのMM細胞および血液ガン細胞の直接的な腫瘍退縮における潜在的な適用、そして、末梢幹細胞の自家移植片の生体外での除去処理における潜在的な適用とともに、CVA21および他のピコルナウイルス(例えば、CVA13、CVA15およびCVA18など)がインビトロでの多発性骨髄腫細胞株および他の血液ガン細胞株に対する効果的な腫瘍退縮性薬剤であることを明らかにしている。
Claims (22)
- 対象における血液ガンを治療および/または予防するための方法であって、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む、方法。
- ピコルナウイルスは、コクサッキーウイルス、エコーウイルス、ポリオウイルス、未分類のエンテロウイルスを含むエンテロウイルス、ライノウイルス、パラエコーウイルス、ヘパトウイルスおよびカルジオウイルスの原型株および臨床単離株からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- ピコルナウイルスは、CVA13、CVA15、CVA18、CVA20、CVA21、その改変形態およびその組合せからなる群から選択されるコクサッキーA群ウイルスである、請求項1に記載の方法。
- ピコルナウイルスは、静脈内投与、腫瘍内投与、腹腔内投与、筋肉内投与、自家幹細胞移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去、または移植に先立つ自家移植片内の悪性細胞の生体外除去によって投与される、請求項1に記載の方法。
- 自家移植片は造血系幹細胞を含む、請求項4に記載の方法。
- ウイルス用量の範囲は、約0.01感染性ウイルスユニット/細胞〜約1000感染性ウイルスユニット/細胞である、請求項1に記載の方法。
- ウイルスは、効果的な量の化学療法剤との組合せで対象に投与される、請求項1に記載の方法。
- ウイルスは、効果的な量のプロバイオティクス剤との組合せで対象に投与される、請求項1に記載の方法。
- 血液ガンは、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、B前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される、請求項1に記載の方法。
- 血液ガンの細胞は、ウイルス−細胞進入受容体分子の細胞間接着分子−1(ICAM−1)および/または崩壊促進因子(DAF)を過剰発現する、請求項1に記載の方法。
- 血液ガンの細胞はNF−κBを構成的に発現する、請求項1に記載の方法。
- 対象における多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、B前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される血液ガンを、治療および/または予防するための方法であって、CVA13、CVA15、CVA18およびCVA21またはその組合せからなる群から選択されるピコルナウイルスの治療効果的な量を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように投与することを含む、方法。
- 対象における血液ガンを治療および/または予防するための方法であって、ピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の治療効果的な量を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによって殺されるように投与することを含む、方法。
- ピコルナウイルスは、CVA13、CVA15、CVA18、CVA20、CVA21からなる群から選択されるコクサッキーA群ウイルスである、請求項13に記載の方法。
- 対象はヒトである、請求項1または13に記載の方法。
- 対象における血液ガンを治療および/または予防することにおいて使用される医薬組成物であって、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態の効果的な量を、医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒に含む、医薬組成物。
- 対象における血液ガンを治療および/または予防することにおいて使用される医薬組成物であって、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の効果的な量を、医薬的に許容され得る賦形剤、希釈剤またはキャリアと一緒に含む、医薬組成物。
- 対象における血液ガンを治療および/または予防するための医薬品の製造における、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態の使用。
- ピコルナウイルスは、CVA13、CVA15、CVA18、CVA20、CVA21からなる群から選択されるコクサッキーA群ウイルスである、請求項18に記載の使用。
- 血液ガンは、多発性骨髄腫、B細胞リンパ腫、B前リンパ球性白血病および単球性白血病からなる群から選択される、請求項18に記載の使用。
- 対象における血液ガンを治療および/または予防するための医薬品の製造における、血液ガンに溶解感染することができるピコルナウイルスまたはその改変形態に由来する核酸分子の使用。
- 血液腫瘍細胞または血液ガン細胞に対する対象における免疫応答を誘導するための方法であって、対象の前記細胞に、治療効果的な量のピコルナウイルスまたはその改変形態を、ガンの少なくとも一部の細胞がウイルスによる腫瘍退縮を受けるように感染させることを含む、方法。
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