KR20070080335A - 애기장대 유래의 개화시기를 조절 단백질 ｃｏ의 돌연변이단백질, 상기 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절전사인자의 분리방법 및 식물의 개화시기 조절방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 돌연변이 CO 단백질 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법 및 개화시기 조절방법에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 돌연변이 CO 단백질(mCO), 상기 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법 및 상기 분리된 식물의 개화시기 조절 전사인자를 이용한 식물체의 개화시기 조절방법에 관한 것이다. 본 발명의 개화시기 조절 전사인자를 이용한다면 개화시기를 조절하여 질 좋은 다량의 농산물을 수확한다면 농가 수익은 물론 수출을 통한 외화 획득에도 크게 이바지 할 것으로 기대된다.

애기장대, CO, 식물의 개화시기

Description

애기장대 유래의 개화시기를 조절 단백질 ＣＯ의 돌연변이 단백질, 상기 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법 및 식물의 개화시기 조절방법{Mutant of CO protein from Arabidopsis thaliana for control flowering time, isolation method of CO-interacting protein, and method for control flowering time using it}

도 1은 CO 단백질과 상기 CO 단백질의 특정 아미노산을 치환 및 제거시킨 돌연변이(mutant) CO(mCO)의 아미노산 서열을 함께 나타낸 것이다.

도 2는 CO 단백질의 특정 아미노산을 치환시킨 후 효모에서 전사활성을 측정하기 위한 ONPG assay를 나타낸 그래프이다.

R327G : 327번째 아미노산이 치환된 CO,

D160G : 160번째 아미노산이 치환된 CO

도 3a 및 도 3b는 효모에서 mCO를 이용하여 CO의 결합 단백질을 획득하기 위한 yeast two-hybrid 실험을 나타낸 사진이다. 이때, 도 3a는 트립토판 및 루신이 결핍된 SD 한천 배지에서 성장한 효모이고, 도 3b는 트립토판, 루신 및 히스티딘이 결핍된 SD 한천 배지에서 성장한 효모이다.

도 4는 효모에서 CO와 결합하는 것으로 분리된 단백질 중의 하나인 AS1과 bCIP1 유전자가 결손된 동질접합의(homozygous) 돌연변이체 식물의 개화시기를 정상적인 애기장대와 CO 유전자가 결손된 동질접합의 돌연변이체를 비교하여 나타낸 그래프이다.

도 5는 대장균(E. coli)에서 CO 결합 단백질들을 GST에 접합된 형태로 발현시키고, 전기영동 후 쿠마시 염색(coomassie staining)으로 관찰한 사진이다.

1: Size marker, 2: GST-CO 단백질,

3: GST-CO 결합단백질 1, 4: GST-CO 결합단백질 2,

5: GST-CO 결합단백질 3, 6: GST-CO 결합단백질 4,

7: GST-CO 결합단백질 5, 8: GST-CO 결합단백질 6,

9: GST-CO 결합단백질 7, 10: GST 단백질

도 6은 CO 결합 단백질들의 기능을 밝히기 위해 EMSA 실험을 나타낸 것이다. 이때, 도 6a는 CO가 관련된 기존의 개화 조절 모식도(CO는 CONSTANS 유전자를, FT는 Flowering Locus T 유전자를 나타낸다)이고, 도 6b는 EMSA를 하기 위해 FT 프로모터를 3개의 부분으로 나눈 모식도이고, 도 6c는 CO 결합 단백질들이 FT 유전자의 프로모터 부분에 결합함을 X-레이로 관찰한 사진(1: ddH2O, 2: GST, 3: GST-CO, 4: CO 결합단백질 1, 5: CO 결합단백질 2, 6: CO 결합단백질 3, 7: CO 결합단백질 4, 8: CO 결합단백질 5, 9: CO 결합단백질 6, 10: CO 결합단백질 7)이다.

본 발명은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 돌연변이 CO 단백질 및 이를 이용한 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법 및 상기 분리된 식물의 개화시기 조절 전사인자를 이용한 식물체의 개화시기 조절방법에 관한 것이다.

식물에 있어 개화시기(開花時期)는 온도, 일장(photoperiod), 호르몬, 영양분 등에 의해 영향을 받는 것으로 알려져 있다. 일반적으로는 저온에 노출되었을 때 개화되는 경로(vernalization)와 일장의 길이에 따라 개화되는 경로(photoperiod; 장일 식물, 단일식물) 및 일장에 영향을 받지 않는 식물(중일식물)로 구분되고 있으며, 이러한 특성은 근원적으로 개화와 관련된 몇개의 유전자들에 의해 조절되고 있다고 보고되고 있다(Yarn Y. Levy & Caroline Dean(1998), The plant Cell, 10: 1973-1989).

또한, 농작물에 있어서의 개화시기는 수확량의 결정에 있어서 아주 중요한 역할을 하는데, 이는 농작물의 개화시기가 잘못 조절되면 수확물의 질과 양에 나쁜 영향을 미치게 되어 인간에게 상당한 경제적 손실을 초래하기 때문이다. 그 예로서, 봄철의 무(radish)는 3-4월에 파종하여 5-6월에 수확하게 되는데 이 기간 동안에 기온이 10℃ 이하로 2주간 계속되면 꽃눈이 형성되어 꽃대가 올라오게 됨(춘화반응; vernalization)으로써 상품가치가 많이 떨어지게 된다. 그래서 많은 돈을 투자하여 난방 시설을 설치하는 등 농가에 많은 부담이 되고 있다.

이에 최근에는 유전공학의 기술을 이용하여, 개화시기가 지연된 표현형을 보이는 개화 돌연변이체로부터 변이를 유발하는 유전자를 분리하고, 적합한 유전자 조작의 과정을 거쳐서 농작물 육종에 적용하려는 연구들이 활발히 진행되고 있으며, 특히 유전정보가 거의 해독되어 알려진 애기장대(Arabidopsis thaliana)를 통해 개화시기를 조절하는 유전자들이 알려져 있다(대한민국 공개특허공보 제 2001-0029127호, 제 2003-0016892호).

한편, 이미 알려진 애기장대의 CO(CONSTANS) 유전자의 경우, CO 단백질은 전사 조절인자로서 빛에 의한 개화 조절에 있어서 아주 중요한 역할을 하는 것으로 보고가 되어 있으나(Yarn Y. Levy & Caroline Dean(1998), The plant Cell, 10: 1973-1989), 분자적 수준에서 그 메카니즘은 정확히 알려진 것이 없다. 또한, CO 단백질은 DNA에 직접 결합하여 전사를 조절할 수 없기 때문에 DNA에 직접 결합할 수 있는 다른 단백질을 필요로 하지만 이 단백질에 대해서도 아직까지 보고된 바는 없다.

이와 같은 사실은 CO 유전자가 식물의 개화시기를 조절하는 데 있어서, 여러개의 유전자가 서로 복잡한 과정을 거쳐 관여하는 것으로 생각되어진다(Alon Samach & George(2000), Coupl and BioEssays, 22:38-47).

따라서, CO 유전자를 식물의 개화시기 조절에 이용하자면 원하는 시기에 개화를 유도하거나 또는 정확한 꽃의 발달을 조절하는 것과 같은 문제들을 해결하는 데에는 많은 어려움이 있다. 또한 CO의 발현 억제를 통한 개화시기의 억제는 과도한 개화 억제를 유발할 수가 있어 적절한 개화시기의 조절을 위해서는 새로운 유전 자 발굴 및 그 기능에 대한 연구가 필요하다.

지금까지 효모(yeast)를 이용한 효모 투-하이브리드(yeast two-hybrid)의 방법으로 애기장대에서 CO 단백질과 결합하는 전사인자를 찾기 위해 많은 연구가 수행되어 오고 있으나 효모에서 CO가 전사활성을 나타내어 CO 결합 단백질을 분리하지 못하고 있다.

이에 본 발명자들은 CO 단백질의 특정 아미노산의 치환을 통하여 효모에서 CO의 전사활성을 억제시켜 CO와 결합하는 전사인자들을 분리하였으며, 전사인자의 유전자가 결손된 돌연변이체를 통해 상기 분리된 전사인자들이 식물의 개화시기를 조절하는 중요한 역할을 하는 것을 밝힘으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 CO(CONSTANS) 단백질과 결합하는 식물의 개화시기를 조절하는 단백질을 분리하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 분리된 단백질을 이용하여 식물의 개화시기를 조절하는 방법을 제공하는 것이다.

상기목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 돌연변이 CO(CONSTANS) 단백질 (mCO)을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 분리방법으로 분리된 식물의 개화시기 조절 전사인자를 이용한 식물체의 개화시기 조절방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하자면 다음과 같다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 돌연변이 CO(CONSTANS) 단백질(mCO)을 제공한다.

일반적으로 개화 식물에 있어서, 개화시기 조절은 식물체의 일생 통틀어 가장 중요한 일 중의 하나로, 기온과 빛 등의 환경적인 인자와 식물체의 나이에 의해 좌우된다. 이는 식물체가 태어날 때부터 가지고 있는 유전적인 특성 등에 따라 매우 많은 단백질들의 상호 결합과 신호의 전달로 이루어진다. 개화가 잘못 조절되게 되면 식물체에는 좋지 못한 많은 변화들이 생기게 되는데 예를 들면, 개화가 빨리 되면 작물의 경우 씨앗이 적게 열리게 되고 과실의 경우 크기가 줄어들게 되고 그 맛도 또한 떨어지게 된다.

애기장대의 CO 유전자는 빛의 영향을 받아 개화시기를 조절하는 아주 중요한 핵심 유전자로 알려져 있다. 하지만 많은 노력에도 불구하고 어떤 작용 원리에 의하여 개화시기를 조절하는지는 거의 연구되어 있지 않다.

그리고, CO 단백질은 장일 조건하에서는 FT 유전자를 발현시켜 개화를 촉진 시키는 것으로 알려져 있으나 CO 단백질 자체만으로는 DNA에 결합할 수 없기 때문에 DNA 결합 영역을 가진 단백질이 CO와 상호작용을 통하여 FT의 발현을 조절하여야 한다.

이에, 본 발명은 CO 단백질의 특정 아미노산을 치환 및 제거하여 효모에서 전사활성을 제거하고 이를 이용하여 CO와 결합하는 전사인자들을 분리하였으며, 분리된 전사인자들 중에서 애기장대의 염색체쌍에서 유전자가 결손되어 있는 돌연변이체들을 얻은 후 정상적인 애기장대와 비교하여 개화가 지연되는 것을 관찰하여 이 유전자들이 개화 조절에 관여하고 있는 것을 밝혔으며, 또한 분리된 전사인자들이 FT 유전자의 프로모터 부위에 결합하여 이 유전자들의 전사를 조절하는 특성을 확인하였다. 이와 같은 결과는 본 발명에서 분리한 전사인자들이 CO와 결합하여 직접적으로 FT유전자의 발현을 조절하는 것으로 판단된다(도 6a 및 도 6c 참조).

또한, 본 발명은 상기 mCO 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법을 제공한다.

상기 mCO 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법은 ⅰ) 효모 투-하이브리드 시스템(Yeast Two-hybrid System)을 사용하여 애기장대의 전사인자들 중에서 CO와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자들을 분리하는 단계; 및 ⅱ) 상기 전사인자들이 염기서열 분석과 아마노산 서열 분석을 통해 CO 유전자의 프로모터 부위에 결합할 수 있는 영역을 가짐을 확인하는 단계를 포함하는 것이 바람직하고, 상기 전사인자를 중에서 CO와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자는 AS1과 bCIP1의 유전자인 것이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 분리방법으로 분리된 식물의 개화시기 조절 전사인자를 이용한 식물체의 개화시기 조절방법을 제공한다.

상기 식물체의 개화시기 조절방법은 개화시기 조절 전사인자로 AS1과 bCIP1 단백질인 것이 바람직하고, 또한 식물체의 형질 전환, 호르몬 및 화학 물질에 의해 식물체의 발현 유도 또는 억제되는 시스템을 구축하여 이루어지는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명하기 위한 보다 구체적으로 바람직한 본 발명의 실시 과정을 설명한다.

1. CO의 특정 아미노산 치환

본 발명의 첫 단계로 유전자 증폭(Polymerase Chain Reaction: PCR)을 이용하여 CO의 특정 아미노산을 치환 및 제거하여 효모에서 전사활성이 제거된 돌연변이 CO 단백질을 제조한 다음(도 1 및 도 3 참조), 효모 투-하이브리드 시스템(Yeast Two-hybrid System)을 이용하여(Field & Song, 1989), 애기장대의 전사인자들 중에서 CO와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자들을 분리한다.

상기 유전자들은 염기서열 분석과 아마노산 서열 분석을 통해 유전자의 프로모터 부위에 결합할 수 있는 영역을 가지고 있음을 확인한다.

2. bCIP1과 AS1 유전자의 발현이 제거된 돌연변이체의 획득

분리된 전사인자들의 기능을 확인하기 위하여 미국의 ABRC로부터 분리된 전사인자들의 유전자가 결손된 애기장대 종자를 의뢰하고, 이들 종자들 3종류의 전사인자의 유전자와 T-DNA 프라이머들의 조합 방법에 따른 유전자 증폭(PCR)의 발생 유무를 분석하여 애기장대의 한쌍의 염색체내에서 유전자의 발현이 모두 억제된 돌연변이 식물체를 획득한다. 그 결과로 AS1과 bCIP1의 유전자가 결손된 애기장대들을 확보하였다.

염색체쌍에서 AS1과 bCIP1 유전자가 결손된 동질접합의 애기장대 돌연변이체(homozygous mutant)는 강한 장일 조건(낮 16시간, 밤 8시간) 그리고 약한 장일 조건(낮 12시간, 밤 12시간)에서 정상적인 애기장대와 함께 배양하여 개화시기를 비교한다.

그 결과 개화시기가 강한 장일 조건에서는 정상적인 애기장대와 비교하여 bCIP1 유전자가 결손된 돌연변이체는 잎이 2장이 더 많은 것을 관찰하였고, 약한 장일 조건에서는 AS1과 bCIP1 유전자가 결손된 애기장대가 정상적인 애기장대에 비하여 잎이 10장이 더 많은 것을 확인하였다(표 1 및 도 4 참조).

3. 분리된 CO 결합 전사인자들의 유전자 대량생산 및 발현

(1) 전사인자들의 유전자 대량생산

전사인자들을 서열번호 2(ACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCT)로 기재되는 attB1 염기서열로 시작되는 정방향 프라이머와 서열번호 3(ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGT)으로 기재되는 attB2 염기서열로 시작되는 역방향 프라이머를 사용하여 유전자 증식법 (PCR)을 실시하고, pDONR201 벡터(Invitrogen, 미국)에 삽입한다

상기 재조합 벡터는 대장균(E. coli XL1 blue)에 형질전환시키고, 배양된 대장균에서 재조합 벡터를 대량으로 순수 분리한다.

(2) 전사인자들의 GST 융합 단백질 발현

pDEST15 벡터(Invitrogen, 미국)를 사용하여 GST(glutathion S transferase)가 결합된 형태로 단백질을 발현시킨다. 이때 재조합 벡터는 전사인자들의 유전자들이 접합된 pDONR201과 LR clonase(Invitrogen, 미국)를 이용하여 pDEST15 벡터에 전사인자들을 접합시킨다.

전사인자들의 유전자들이 삽입된 pDEST15 플라스미드는 대장균[E. coli BL21-AI oneshot strain(Stratagene, 미국)]에 형질전환시킨다.

형질전환된 대장균은 LB 액체 배지에서 O.D값이 0.8이 될 때까지 키운 후 0.2% 아라비노즈 (L-(+)-Arabinose)로 GST-bCIP1 융합 단백질의 과발현을 유도한다.

발현된 GST-bCIP1 융합 단백질은 글루타치온 세파로즈 4B 아가로스 비드(Glutathion Sepharose 4B agarose bead)와 트롬빈(Thrombin)을 이용하여 GST를 분리하고 전사인자 단백질들을 획득한다.

4. EMSA 실험을 통한 기능 분석

분리된 CO 결합 단백질들이 전사인자로서 애기장대내에서 어떤 유전자의 프 로모터에 결합하여 전사를 조절하는지를 밝히기 위해 실시하였다.

애기장대에서 개화시기를 조절하는 유전자로 알려진 FT, SOC1, 그리고 FLC 유전자의 각 프로모터 부위에서 bCIP1 단백질이 결합할 수 있을 것으로 추측되어지는 24개의 연속된 염기서열들을 임의로 선택하여 방사성동위원소로 표지하고 GST 융합 단백질들과 반응시킨 다음, 폴리아크릴아미드 겔에 전기영동하여 EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay)를 실시한 다음, 방사 위치를 확인한다.

그 결과, CO 결합 전사인자들이 FT 유전자의 프로모터 부위에 결합함을 알 수 있었다.

따라서, CO 결합 전사인자들의 유전자의 특성을 이용하여 식물체에 형질 전환, 호르몬 및 화학 물질에 의해 발현이 유도되거나 억제되는 시스템을 구축하여, 원하는 시기에 개화를 시키거나, 또는 개화를 지연시킬 수 있을 것이다.

이로써 CO 결합 전사인자의 유전자와 단백질의 개화시기 조절 특성을 이용하여 농업적 이용 즉, 수확량 증대와 품질을 높이기 위해 농업경영자가 원하는 시기에 꽃이 피게 하는 품종 개발 또는 이 단백질을 투여하여 개화를 촉진시키는 방법 등에 이용 가능하다고 생각한다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 단, 이들 실시예는 오로지 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 자 명할 것이다.

<실시예 1> 유전자 증폭을 통한 CO 단백질의 특정 아미노산 치환

CO의 유전자 염기서열과 단백질 아미노산 서열은 도 1과 같다(주: 도 1에는 CO 및 mCO의 아미노산 서열만이 기재되어 있으며, CO의 염기서열은 기재되어 있지 않습니다. 상기 내용 또는 도면을 수정하여 주시기 바랍니다. 바람직하게는 CO 및 mCO의 유전자 염기서열을 기재하는 것이 타당하다고 사료됩니다). 이중에서, 각각 160번째 아미노산 D를 G, 327번째 아미노산 R을 G로 치환하고, 368번째 아미노산 G를 제거하고, 370, 371, 372, 373번째 아미노산 V, P, S,　F를 F, L, H, S로 각각 치환시키기 위해서 각각 그 부위에 특이적인 염기서열로 구성된 상보적인 프라이머들을 합성하고 pfu Turbo DNA polymerase(Stratagene, USA)와 유전자증폭(PCR)을 이용하여 mCO를 완성하였다.

<실시예 2> mCO의 전사활성 측정

mCO 유전자를 pDEST32(Invitrogen, USA) 플라스미드(plasmid)에 GAL4 DNA 결합 부위(DNA-biding domain ; BD)가 CO 단백질의 N-말단 쪽으로 접합되게 실은 후 효모로 형질전환하였다. mCO 단백질이 효모에서 전사활성을 가지는지를 알아보기 위해 효모를 30℃에서 배양한 후 액체질소를 이용해 효모 세포를 부수고 O-Nitrophenyl-B-D-Galactopyranoside(OPNG)를 넣어 시간에 따른 색깔의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 정상적인 CO와 160번째 아미노산이 치환된 것(D160G), 그리고 327번째 아미노산이 치환된 것(R327G)은 높은 전사활성을 나타내는 것과 달리 mCO는 전사활성이 거의 없음을 확인하였다(도 2).

<실시예 3> 효모를 이용한 CO 결합 단백질의 분리

애기장대의 전사인자 cDNA 라이브러리(library)를 pDEST22(Invitrogen,미국)플라스미드에 GAL4 전사 활성화 부위(activation domain; AD) C-말단 쪽으로 접합되게 실었다. 먼저 상기 실시예 2에서 제조된 pDEST32에 실려 있는 mCO를 리튬아세테이트(LiAc) 방법(Phil James, et al., Genetics, 1996, 144: 1425-1436)에 의해 효모의 종류인 pJ69-4A 균주내에 도입한 후 루신(Leucine)이 결핍된 SD(synthetic dropout) 고체 한천 배지에서 3일간 배양하고 선별하였다. 여기서 자라난 효모를 루신이 결핍된 액체 배지에 배양하여 리튬아세테이트 방법으로 pDEST22에 실려져 있는 약 1200개의 전사인자 각각을 번호를 부여하고 효모에 도입시켜 루신(Leucine) 및 트립토판(Tryptophan), 루신, 트립토판 및 히스티딘(Histidine)이 결핍된 SD 고체 한천 배지에서 4일간 배양하였다. CO 단백질과 결합하는 단백질을 발현하는 효모들은 이들 3가지 아미노산이 결핍된 배지에서 생존하므로 여기에 자라난 효모들 각각을 루신, 트립토판 및 히스티딘이 결핍된 SD 액체 배지에서 2일간 선택 배양하였다(도 3).

1% 소디움두데실설페이트(SDS : Sodium Dodecyl Sulfate)와 100 mM 염화나트륨(NaCl)이 포함된 용액과 유리구슬을 이용하여 효모 세포를 파괴하고 CO와 결합하는 단백질을 암호(code)하는 유전자를 가지고 있는 플라스미드만 분리하였다. 상 기 플라스미드 중에서 pDEST22 종류만 선별하여 GAL4 엑티베이션 부위의 3'말단 쪽에 접합되어 있는 유전자의 염기서열을 결정하였다. 이를 위해 200 ng의 DNA를 GAL4 엑티베이션 부위에 결합하는 프라이머와 ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing Reaction Kit V2.0(Applied Biosystems)을 섞어 유전자 증식법에 의해 염기 A는 초록색, G는 검은색, T는 붉은색, 그리고 C는 파란색의 형광물질로 각각을 표지한 후 377 DNA Sequencer(Applied Biosystems)를 이용하여 형광물질로 표지된 DNA 염기의 순서를 결정하였다.

그 후 CO와 분리된 단백질들간의 결합 관계를 검증하기 위해 CO가 GAL4 DNA 결합 부위에 접합된 플라스미드(pDEST32-CO)와 분리된 단백질들을 암호화하는 유전자들이 GAL4 활성화 부위에 접합된 플라스미드(pDEST22-bCIP1) 2개를 동시에 pJ69-4A 효모에 도입하여 루신, 트리토판 및 히스티딘이 결핍된 SD 고체 배지에서 3일간 배양하였다. 자라난 효모를 다시 5-브로모-4-chloro-3-인돌릴-베타-디-갈락토피라노시드(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside : X-GAL)가 포함된 루신, 트립토판 및 히스티딘이 결핍된 SD 고체 배지에 3일간 배양하면서 색깔의 변화를 관찰한 결과 CO와 분리된 단백질들이 결합함을 다시 확인할 수 있었다.

<실시예 4> 동질접합의 돌연변이체(homozygous mutant) 선별

CO와 결합하는 단백질로 분리된 전사인자들의 기능규명을 위해 이들의 유전자가 결손되어 있는 애기장대 돌연변이체를 분리하고자 하였다. 먼저 미국의 ABRC(애기장대 돌연변이체들을 제공해주는 기관)에 의뢰하여 이들의 유전자가 결손 되어 있는 애기장대 종자를 얻었고 동질접합의 돌연변이체(homozygous mutant)를 선별하기 위해 2주 정도 자란 애기장대에 0.005%의 Silwet L-77이 포함된 용액에 240 g/㎖의 농도로 존재하는 바스타(BASTA)를 뿌려서 살아남은 식물체들만을 선별하였다. 바스타 저항성을 보이는 애기장대 잎에서 염색체를 추출하였고, 각각의 단백질이 완전히 기능을 하지 못하는 식물체를 선별하기 위해 T-DNA가 삽입된 위치를 기준으로 프라이머를 조합하였다.

삽입된 T-DNA의 길이는 7.5 Kbp 이상으로 프라이머를 이용한 유전자 증식법(PCR)을 수행하면 8 Kbp길이 이상으로 증폭이 되어야 하지만, 이는 유전자 증식법에 사용된 DNA 증식 효소가 합성할 수 있는 범위를 훨씬 넘어선 것이다. 따라서 만약 한쌍의 염색체 모두에 T-DNA가 삽입되어 있으면 DNA가 증폭되지 않을 것이고, 만약 DNA가 증폭된다면 T-DNA가 한 가닥의 염색체에만 삽입되었거나 또는 한쌍의 유전자 어디에도 삽입되지 않은 경우다. 그 결과, AS1과 bCIP1 유전자가 결손된 동질접합의 돌연변이 종자를 AS1은 4개 그리고 bCIP1은 10개를 선별할 수 있었다.

<실시예 5> 동질접합의 돌연변이체와 정상적인 애기장대의 표현형 비교

동질접합의 돌연변이체와 정상적인 애기장대를 22℃ 에서 낮 16시간 밤 8시간 그리고 낮 12시간 밤 12시간의 주기로 배양하였다. 낮 16시간 밤 8시간에서 배양된 정상적인 애기장대와 비교하여 as1 동질접합의 돌연변이체들은 개화 시기가 정상적이지만 bcip1 동질접합의 돌연변이체들은 잎이 2장정도 더 많은 조금 지연된 개화 시기를 보여주고 있다(표 1 및 도 4). 하지만 낮 12시간 밤 12시간의 주기로 배양된 as1과 bcip1 동질접합의 돌연변이체들은 정상적인 애기장대보다 잎이 10장 이상 더 많은 매우 늦은 개화 시기를 보여주고 있다. 그 결과, AS1과 bCIP1 단백질이 개화시기의 조절에 관여하는 것을 확인할 수 있었다.

식물(애기장대)		정상	AS1 돌연변이	bCIP1 돌연변이	CO 돌연변이
식물의 좌엽수(개)	낮 16시간 밤 8시간	12.9	13	14.5	27.7
	낮 12시간 밤 12시간	26	35.5	37	45

<실시예 6> 분리된 유전자의 대량생산 및 발현

<6-1> 분리된 유전자들의 대량 생산

순수한 단백질들을 분리하기 위해 각각의 단백질의 N-말단에 GST를 접합시켜 글루타치온 세파로스 4B 아가로즈 비드(Glutathion Sepharose 4B agarose bead)와 트롬빈 (Thrombin)을 이용하여 순수한 단백질을 분리하였다.

이를 위하여 전사인자들을 서열번호 2로 기재되는 attB1 염기서열로 시작되는 정방향 프라이머와 서열번호 3으로 기재되는 attB2 염기서열로 시작되는 역방향 프라이머를 사용하여 유전자 증식법(PCR)을 실시하고, pDONR201 벡터(Invitrogen, 미국)에 삽입하였다. 상기 벡터로 대장균(E. coli XL1 blue)을 형질전환하고, 대장균을 배양하여 bCIP1의 유전자가 삽입된 벡터를 대량으로 순수 분리하였다.

<6-2> GST 융합 단백질 발현

pDEST15 벡터(Invitrogen, 미국)를 사용하여 GST(glutathion S transferase)가 결합된 형태로 단백질을 발현시켰다. 이때, 재조합 벡터는 전사인자들의 유전자들이 접합된 pDONR201과 LR clonase(Invitrogen, 미국)를 이용하여 pDEST15 벡터에 전사인자들을 접합시켰다.

전사인자들의 유전자들이 삽입된 pDEST15 플라스미드는 대장균[E. coli BL21-AI oneshot strain(Stratagene, 미국)]에 형질전환시켰다. 형질전환된 대장균은 LB 액체 배지에서 O.D값이 0.8이 될 때까지 키운 후 0.2% 아라비노즈(L-(+)-Arabinose)로 GST-bCIP1 융합 단백질의 과발현을 유도하였다.

이의 배양액으로부터 세포를 침전시켜 1X PBS(Posphate-Buffered Saline)에 부유시킨 다음 라이소자임(lysozyme)과 초음파 균짖기(sonicator)를 이용해 세포를 파괴하여 GST 융합 단백질이 포함된 대장균의 단백질들을 추출하였다. 그 결과, 추출된 GST 융합 단백질들은 대장균의 단백질들과 함께 추출한 후 쿠마시 염색을 통해 GST 융합 단백질의 발현을 확인하였다(도 5).

추출된 단백질들을 GST가 결합하는 글루타치온 세파로즈 4B 아가로즈 비드(Glutathion Sepharose 4B agarose bead)가 채워진 컬럼에 통과시켜 GST1 융합 단백질만 컬럼내에 머물게 한 다음 여기에 글루타치온(Glutathione)이 포함된 용액을 흘려 GST 융합 단백질들을 획득하였다.

<실시예 7> EMSA를 통한 CO 결합 단백질들의 기능 및 작용기작 확인

상기 실시예 6을 통해 추출된 GST 융합 단백질들을 사용하여 EMSA 실험을 수행하였다. 개화를 FT는 광주기적인 조건에서 CO에 의해 발현이 조절되는 유전자로 알려져 있다(도 6a). CO는 단백질은 DNA에 결합할 수 있는 영역을 가지고 있지 않아서 FT의 전사를 조절하기 위해서는 DNA에 결합하는 전사인자가 필요하다. CO와 결합하는 것으로 분리된 단백질들이 FT 프로모터 부위에 결합하는지를 조사하기 위해 FT 유전자의 프로모터 부위를 3개의 부분으로 나누어 프라이머와 Taq polymerase를 유전자 증폭을 통해 300bp 이내의 길이로 합성하여 양쪽 말단을 방사성동위원소인 32-P로 표지하였다(도 6b).

한편, GST 융합 단백질들은 표시된 양으로 각각 달리하여 젤 리타데이션완충액(Gel Retardation buffer)과 50 mM KCl, 15% 글리세롤 및 1ㅅg poly(dI-dC)를 넣고 5분간 혼합하였다(도 6c). 그 후, 상기 방사성동위원소로 표지되고 20 kcpm의 활성을 가진 300개 미만의 연속된 염기서열과 GST 융합 단백질 용액을 혼합하고 15분간 반응을 시켰다. 그 후 0.5X TBE가 포함된 7.5%의 아크릴아미드겔에 1시간 30분 동안 전기영동 한 후 90 에서 겔을 완전히 말려서 X-ray 필름을 위에 놓고 12시간 동안 두었다가 현상을 하였다.

그 결과, 단백질을 넣지 않거나 GST 단백질만 넣고 실험한 것과 달리 GST 융합 단백질들이 FT promoter와 결합하는 것을 확인하였다(도 6c).

상기에서 살펴본 바와 같이, CO와 결합하는 것으로 분리된 전사인자들 중에서 AS1과 bCIP1 유전자가 결손되면 개화가 지연되는 효과를 보이고 있는데 이 유전 자들의 특성을 이용하여 호르몬 또는 화학 물질에 의해 발현이 유도되는 시스템을 구축하여 원하는 시기에 개화를 시키거나, 또는 발현 억제를 통해 개화를 지연시킨다면 보다 능률적이고 경제적인 방법으로 수확량을 증가시킬 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명을 이용하면, 일기나 기온과 같은 환경적 조건이 매년 변화하고 있으며, 특히 봄과 가을이 점점 짧아지면서 농작물의 재배가 어려워지고 있는 이때에 개화시기를 조절하여 질 좋은 다량의 농산물을 수확한다면 농가 수익은 물론 수출을 통한 외화 획득에도 크게 이바지 할 것으로 기대된다.

<110> INDUSTRY-ACADEMIC COOPERATION FOUNDATION GYEONGSANG NATIONAL UNIVERSITY <120> Mutant of CO protein from Arabidopsis thaliana for control flowering time, isolation method of CO-interacting protein, and method for control flowering time using it <130> a <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 372 <212> PRT <213> Arabidopsis thaliana <400> 1 Met Leu Lys Gln Glu Ser Asn Asp Ile Gly Ser Gly Glu Asn Asn Arg 1 5 10 15 Ala Arg Pro Cys Asp Thr Cys Arg Ser Asn Ala Cys Thr Val Tyr Cys 20 25 30 His Ala Asp Ser Ala Tyr Leu Cys Met Ser Cys Asp Ala Gln Val His 35 40 45 Ser Ala Asn Arg Val Ala Ser Arg His Lys Arg Val Arg Val Cys Glu 50 55 60 Ser Cys Glu Arg Ala Pro Ala Ala Phe Leu Cys Glu Ala Asp Asp Ala 65 70 75 80 Ser Leu Cys Thr Ala Cys Asp Ser Glu Val His Ser Ala Asn Pro Leu 85 90 95 Ala Arg Arg His Gln Arg Val Pro Ile Leu Pro Ile Ser Gly Asn Ser 100 105 110 Phe Ser Ser Met Thr Thr Thr His His Gln Ser Glu Lys Thr Met Thr 115 120 125 Asp Pro Glu Lys Arg Leu Val Val Asp Gln Glu Glu Gly Glu Glu Gly 130 135 140 Asp Lys Asp Ala Lys Glu Val Ala Ser Trp Leu Phe Pro Asn Ser Gly 145 150 155 160 Lys Asn Asn Asn Asn Gln Asn Asn Gly Leu Leu Phe Ser Asp Glu Tyr 165 170 175 Leu Asn Leu Val Asp Tyr Asn Ser Ser Met Asp Tyr Lys Phe Thr Gly 180 185 190 Glu Tyr Ser Gln His Gln Gln Asn Cys Ser Val Pro Gln Thr Ser Tyr 195 200 205 Gly Gly Asp Arg Val Val Pro Leu Lys Leu Glu Glu Ser Arg Gly His 210 215 220 Gln Cys His Asn Gln Gln Asn Phe Gln Phe Asn Ile Lys Tyr Gly Ser 225 230 235 240 Ser Gly Thr His Tyr Asn Asp Asn Gly Ser Ile Asn His Asn Ala Tyr 245 250 255 Ile Ser Ser Met Glu Thr Gly Val Val Pro Glu Ser Thr Ala Cys Val 260 265 270 Thr Thr Ala Ser His Pro Arg Thr Pro Lys Gly Thr Val Glu Gln Gln 275 280 285 Pro Asp Pro Ala Ser Gln Met Ile Thr Val Thr Gln Leu Ser Pro Met 290 295 300 Asp Arg Glu Ala Arg Val Leu Arg Tyr Arg Glu Lys Arg Lys Thr Arg 305 310 315 320 Lys Phe Glu Lys Thr Ile Gly Tyr Ala Ser Arg Lys Ala Tyr Ala Glu 325 330 335 Ile Arg Pro Arg Val Asn Gly Arg Phe Ala Lys Arg Glu Ile Glu Ala 340 345 350 Glu Glu Gln Gly Phe Asn Thr Met Leu Met Tyr Asn Thr Gly Tyr Ile 355 360 365 Phe Leu His Ser 370 <210> 2 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB1 <400> 2 acaagtttgt acaaaaaagc aggct 25 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> attB2 <400> 3 accactttgt acaagaaagc tgggt 25

Claims (7)

1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 애기장대(Arabidopsis thaliana) 유래의 돌연변이 CO(CONSTANS) 단백질(mCO).
2. 1항의 단백질을 이용한 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 방법은

   ⅰ) 효모 투-하이브리드 시스템(Yeast Two-hybrid System)을 사용하여 애기장대의 전사인자들 중에서 CO와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자들을 분리하는 단계; 및

   ⅱ) 상기 전사인자들이 염기서열 분석과 아마노산 서열 분석을 통해 CO 유전자의 프로모터 부위에 결합할 수 있는 영역을 가짐을 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 식물의 개화시기 조절 전사인자의 분리방법.
4. 제 3항에 있어서, 상기 전사인자를 중에서 CO와 결합하는 단백질을 코딩하는 유전자는 AS1과 bCIP1의 유전자인 것을 특징으로 하는 식물의 개화시기 조절 전사 인자의 분리방법.
5. 제 2항 방법으로 분리된 식물의 개화시기 조절 전사인자를 이용한 식물체의 개화시기 조절방법.
6. 제 5항에 있어서, 상기 개화시기 조절 전사인자는 AS1과 bCIP1 단백질인 것을 특징으로 하는 물의 개화시기 조절 전사인자를 이용한 식물체의 개화시기 조절방법.
7. 제 5항에 있어서, 상기 방법은 식물체의 형질 전환, 호르몬 및 화학 물질에 의해 식물체의 발현 유도 또는 억제되는 시스템을 구축하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 식물체의 개화시기 조절방법.

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