KR20070073932A - 줄기 세포 유래 혈소판 - Google Patents

Abstract

인간 배아 줄기 세포를 우선 조혈 세포계로 분화시키고, 이어서 혈소판을 생성하는 거핵 세포로 분화하도록 유도시킨다. 거핵 세포의 적절한 시험관 내 배양을 통해서 혈소판이 생성되며 혈소판의 저장고가 얻어진다. 이를 통해서 최초로, 수많은 환자들에게 필요한 인간 혈액 인자를 시험관 내에서 생성시키는 것이 가능하게 되었다.

혈소판, 배아, 줄기 세포, 혈액, 응고

Description

줄기 세포 유래 혈소판{PLATELETS FROM STEM CELLS}

관련 출원의 교차 참증

본 출원은 2004년 11월 1일 가출원된 미국 가출원 제60/623,922호 및 2005년 9월 7일 가출원된 미국 가출원 제60/714,578호를 우선권으로 주장한다.

연구 또는 개발에 대한 연방 정부 지원과 관련된 진술

추후 확정될 예정임.

줄기 세포는 다양한 다른 분화된 세포 유형으로 분화할 수 있는 세포로 정의된다. 배아 줄기 세포는 전체는 아니지만, 성체의 분화된 세포 유형의 대부분으로 분화할 수 있는 배아 유래의 줄기 세포이다. 줄기 세포는 이의 다능성(pluripotent)으로 언급되는데, 다능성은 다양한 세포 유형으로 분화할 수 있는 이들 세포의 능력을 의미한다. 연구 집단에게 높은 흥미를 끌고 있는 다능성 줄기 세포 유형으로는, 본 발명에서 종종 hES 또는 인간 ES 세포로 축약되는, 인간 배아 줄기 세포이며, 이는 인간 배아 공급원 유래의 배아 줄기 세포이다. 인간 배아 줄기 세포는 이들이 다른 세포 유형으로 분화할 수 있을 뿐만 아니라 배양 상태로 무한 증식이 가능하며, 따라서, 적어도 이론적으로는, 기능이 상실되거나 손상된 인간 조직을 대체할 수 있는 조직 및 세포를 공급할 수 있기 때문에 매우 과학적인 흥미를 끄는 연구 대상이다. 배양 상태로 존재하는 인간 배아 줄기 세포는 과학적인 연구 용도의 유전적으로 안정한 인간 세포 및 조직을 무한한 양으로 제공할 수 있는 잠재력이 있으며 인간 건강을 보조할 수 있는 다양한 치료 프로토콜을 제공할 수 있다. 치료 목적으로 인간 신체에 융합시키거나 이식할 수 있는 분화 세포 또는 조직을 개발하기 위해서, 향후 인간 배아 줄기 세포를 증식시켜서 특정 세포계로 분화되도록 조절할 수 있을 것으로 예측하고 있다.

혈소판은 혈액 응고를 위해서 필수적인 혈액 성분이다. 혈소판은 세포 내(subcellular) 혈액 성분으로, 핵이 존재하지는 않으나 세포막, 수용체, 효소, 과립(granule) 및 기타 세포 프로세스를 보유하므로, 혈전 형성을 개시하도록 혈액 내에서 몇몇 인자에 반응할 수 있다. 전쟁터에서 화학 제제에 노출되거나 또는 고용량의 방사선에 노출되었거나, 그리고 다른 기타 의학적 상태, 예컨대 혈소판 감소증, 특히 백혈병 환자의 치료를 위한 골수 절제술 이후 등에서, 환자가 다량의 외상성 혈액 손실을 겪을 때, 혈소판 수혈이 지시된다. 보관 시 혈소판의 수명이 짧아서(FDA 및 AABB 규제에 의해 통상 단지 5일 정도임) 전쟁터 및 민간 건강 관리 시스템에서 혈소판 부족이 재발할 수 있다.

의료 목적으로 최근 저장된 혈액 세포 성분 중에서, 혈소판은 가장 약한 성분 중 하나이다. 현재 혈소판을 장기간 보관할 수 있는 임상적으로 적용가능한 방법은 존재하지 않는다. 현대 건강 관리 단체의 경우, 혈소판에 대한 5 일의 저장 수명이, 시험 및 운송에 필요한 시간을 고려한 후에는, 4 내지 5일의 임상 저장 수명으로 바뀌게 된다. 많은 혈액 은행들이 혈소판을 신선하게 재고 상태로 유지시키 면서 운송하는데 지속적으로 어려움을 겪고 있다. 야전 병원에 혈소판을 신뢰할만하게 공급하는 것도 여전히 큰 문제점으로 남아있다.

신체에서, 혈소판은 거핵 세포(megakaryocytes)로 알려진 세포에서 형성되는 프로혈소판, 또는 돌기(processes)로부터 발생된다. 생쥐 및 성인 조혈 모세포로부터 거핵 세포를 분화시키는 연구가 이루어져 왔으나, 이러한 분화의 분자적 기전은 아직 밝혀지지 않았다. 성인 조혈 모세포 및 거핵 세포를 장기 배양하는 것이 어려워서, 이들 세포의 정제 및 유전적 조작은 거의 불가능하다. 천연 인간 거핵 세포 cDNA 라이브러리는 존재하지 않으며 정상 거핵 세포의 유전적 프로파일도 존재하지 않는다. 생쥐의 배아 줄기 세포의 시험관 내 분화로 혈소판을 생성할 수 있음이 증명되었으나, 이들 혈소판의 생물학적 기능은 아직 검증되지 않았다. 인간 및 생쥐의 혈소판은 상당한 차이가 있다. 생쥐의 혈소판은 인간 혈소판과 비교하여 보다 작으며 과립 불균질성(heterogeneity)도 상당한 것으로 나타난다. 거핵 세포에서 혈소판을 방출하는 인간 및 생쥐의 기전이 상당히 다를 것으로 보인다.

여전히 거핵 세포에서 혈소판이 형성되고 버딩하는 프로세스에 대해 명확하게 이해하는 데는 상당히 부족한 점이 많다. 현재 받아들여지고 있는 이론은 혈장 및 내피 결합 막 인자를 포함하는 인자들의 조합, 거핵 세포의 세포골격이나 세포내 소기관 재배열, 및 혈류의 전단력이 결합되어 거핵 세포 상에 형성된 프로혈소판 구조에서 성숙한 혈소판이 최종적으로 분리되도록 야기한다는 것이다. 그러나, 이 이론은 전반적으로 증명되지 않았으며 여전히 거핵 세포에서 혈소판의 형성 및 분리는 밝혀내야 할 것들이 많이 남아있는 연구 분야이다.

- 발명의 요약 -

본 발명은 인간 배아 줄기 세포가 조혈 세포계로 분화하는 데 적합한 조건하에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계; 상기 조혈 세포계를 거핵 세포로 배양하는 단계; 상기 거핵 세포를 배양하여 혈소판을 생성하는 단계; 및 상기 혈소판을 회수하는 단계를 포함하는 인간 혈소판을 생성시키는 방법으로 요약된다.

본 발명은 또한 수요가 있는 즉시, 치료학적으로 상당한 양으로 시험관 내에서 생성한 인간 혈소판의 일정 분량(quantities)으로 요약된다.

본 발명의 특징은 인간 혈류에서 마주치는 인자들이 시험관 내에서 생성된 혈소판과 결합되어 있지 않는다는 점이다.

본 발명의 다른 목적, 특징 및 장점은 이하 구체적인 설명을 통해 분명해질 것이다.

본 발명에서 숙고한 것은 인간 배아 줄기 세포로부터 시작하여 시험관 내(in vitro)에서 배양 및 분화시키는 과정을 통해 혈소판을 생성시키는 것이다. 시험관 내 배양 상태에서 거핵 세포를 생성하도록 인간 배아 줄기 세포(hES 세포)를 유도시키고, 상기 거핵 세포를 배양하여 생물학적으로 기능성의 인간 혈소판을 생성시킨다. 이러한 과정은 3 단계의 주요한 과정을 통해 수행되는 것으로 볼 수 있다. 첫 번째 주요 단계는 인간 ES 세포를 조혈 세포로 유도(directed) 분화시키는 것이며, 분화 과정은 몇몇 방식으로 수행할 수 있다. hEs 세포를 조혈 세포계로 분화시키는 2 종류의 방법을 본 발명에서 구체적으로 설명한다. 조혈 세포계로 분화시키는 과정의 한 기술은, 기존에 공지인 기술을 사용하여, 인간 배아 줄기 세포(ES 세포)를 배양하여 배상체(EBs)를 형성시킨다. 거핵 세포 전구체에 선택적인 배지 내 세포 현탁물로 상기 배상체를 분리시킨 후, 다양한 분화된 세포 유형으로 분화가 개시될 수 있도록 배상체를 배양한다. 시간별 cDNA 마이크로어레이 분석법의 도움으로, 본 발명자들은 가장 높은 조혈 잠재력을 보유한 최종 조혈 세포를 얻는데 가장 최적의 시간을 확인하였다. 조혈 세포를 생성하는데 충분한 것으로 이미 증명된 다른 기술은 인간 ES 세포를 기질 세포에 노출시키는 것이 필요한데, 이러한 노출은 ES 세포가 조혈 세포계의 세포로 우선적으로 분화하도록 한다. 이러한 과정들의 결과물은 어느 정도 순도가 있는, 주로 ES 세포 유래의 조혈 세포들의 배양물이다. 배상체를 이용한 접근법이 다른 종의 영양 공급 세포에 의한 오염물이 없을 뿐만 아니라, 제한된 무혈청 배지를 사용하여 수행할 수 있기 때문에 본 발명자들은 이 방법을 특히 선호한다. 상기 과정의 두 번째 주요한 부분에서, 거핵 세포의 형성을 특이적으로 촉진하고 이들 세포의 성숙을 촉진하는 성장 인자들을 함유하는 선택적인 거핵 세포 형성 배지에 상기 조혈 세포들을 이어서 노출시킨다. 최종적으로 시험관 내 혈소판 생성을 촉진하기 위해서 상기 성숙한 거핵 세포를 혈소판 형성 배지에 노출시킨다. 상기 모든 과정 동안 동물이나 인간 혈청 및 혈장을 배제할 수 있다.

혈소판은 염색체 유전 물질을 보유하고 있지 않기 때문에, hES 세포로부터 인간 용도의 생물학적 생성물을 생성시키기 위한 대표적인 표적이다. 혈소판은 모체 거핵 세포의 세포질 단편으로 인식되고 있다. 중요한 것은, 혈소판은 부착, 응집 및 과립 분비 등을 수행할 수 있는 세포 표면 인자들이 존재한다는 점이다. 거핵 세포에 의한 혈소판 성숙화 과정 및 혈소판 저장 과정은 알려진 바가 매우 적은 과정이므로, 인간 ES 세포 유래의 시험관 내 세포 배양물에서 생물학적으로 기능성이 있는 혈소판을 회수할 수 있는지 알려지지 않았다. 본 발명에서 이러한 세포 배양물에서 유용한 분량으로 혈소판을 회수할 수 있음을 개시한다.

중요하게도, 시험관 내 세포 배양물 상태로 인간 거핵 세포로부터 혈소판을 형성시키고 저장할 수 있음을 본 발명에서 증명하였다. 이 과정에 대한 주어진 구체적인 생물학적 제반 지식의 불명확성으로, 이전에는 이것이 배양중에 일어나거나 일어날 수 있는지 알지 못하였다. 본 발명에서는 상기 결과로 이것이 가능할 수 있고 가능하다는 것을 증명하였다.

본 발명의 방법은 배양 상태에서 정의상 비분화 상태인 hES 세포로부터 시작된다. hES 세포를 조혈 세포계의 세포가 우세한 세포 배양물로 분화하도록 유도할 수 있다는 것은 이미 증명되었다. 이러한 유도 분화를 이룰 수 있는 방법에 대해 문헌으로 2 종의 상이한 기술이 이미 공지되었으며, 다른 기술도 역시 효과가 있을 것이라는 점을 예측할 수 있다. 공지의 기술 중 하나는 3차 구조를 이루는 hES 세포의 응집물인, 배상체의 발생이 필요한데, 상기 구조는 줄기 세포가 개입(committed) 후손 세포계로 분화하는 것을 촉진시키는 듯 하다. 다양한 세포계의 분화 세포를 생성하는 이러한 배상체로부터, 이후 선택적인 프로토콜을 사용하여 얻으려는 세포계의 세포, 예컨대 조혈 세포계의 세포를 분리할 수 있다. 본 발명자에 의해 수행된 조혈 작용(hematopoiesis)에 대한 구체적인 시간별 분석을 통해서 본 발명자들에게 이들 조혈 전구체의 유전적 프로파일이 제공되었으며 동시에 본 발명자들은 최고의 수율을 생성하도록 우리의 프로토콜을 최적화하였다. 기타 문서로 증명된 기술은 인간 또는 인간 이외의 기질 세포와 hES 세포의 공동 배양을 포함한다. 이러한 기질 세포와의 공동 배양은 또한 hES 세포가 조혈 세포를 주로 생산하도록 유도하는 것으로 보이나, 최근 기술은 일부 배제해야하는 배양 조건을 기초로 하고 있다.

다양한 조혈 세포계의 세포 수율을 증가시키는 것으로 밝혀진, EB 방법의 중간 단계는 EB를 단편화(fragment)하는 것이다. EB의 특징 중 하나는 확산을 통해서 중심에 있는 세포들에 산소 및 영양분을 공급하는 배지의 능력을 능가할 정도로 EB가 크게 성장할 수 있다는 점이다. 그 결과 EB의 중심에 괴저부가 발생하며, 이는 또한 EB의 성장을 멈추게 하는 원인이 된다. 즉, EB를 물리적으로 조각으로 절단(chopping)하여, EB를 단편화하는 것으로, EB의 성장을 재개하여 보다 분화된 세포들을 얻을 수 있다는 것이 현재 밝혀졌다. 본 발명자들은, 상기 기술을 사용하여, 전반적인 과정을 통해 회수되는 혈액 세포의 수를 상당히 증가시켰다. 다양한 기계적 디바이스 및 시스템을 사용하여 EB의 단편화 또는 절단(chopping) 과정을 수행할 수 있다.

조혈 세포계의 세포들이 생산되면, 이후 상기 세포들이 우선적으로 거핵 세포를 생성하도록 배양한다. 이 과정은 절대적일 필요는 없으나, 거핵 세포에 우선적인 배양 조건인 것이 배양물 내 기타 혈액 산물 전구체 세포에 비해 거핵 세포의 비율이 증가된다. 미성숙 및 성숙한 거핵 세포의 생성에 호의적인 조건에는 혈소판 증식 인자(thrombopoietin)(TPO), 인터루킨 3(IL3), 인터루킨 6(IL6) 및 줄기 세포 인자와 함께 전구체 세포 배양물을 배양하는 것을 포함한다. 미성숙 거핵 세포는 bFGF(염기성 섬유아 세포 성장 인자)가 존재하면 더욱 팽창할 수 있다. 상기 방법으로 획득한 거핵 세포는 CD41, CD42a, CD42b, CD61, CD62P, CD38, 약(weak) CD45에 양성인 반면, HLA-DR, CD34, CD117에는 음성이다. 이러한 면역 표현형 프로파일은 정상적인 성숙 거핵 세포와 일치한다.유의한 CD45+ 집단이 없다는 것은 백혈구 오염이 전혀 없거나 있어도 매우 최소 단위로 존재함을 의미하는 것이다.

이후 거핵 세포에 의한 혈소판의 형성 및 방출을 배양 상태에서 일어나도록 할 수 있다. 생체 내에서 혈소판이 방출하는 정확한 기전은 완전하게 특징화되지 않은 반면, 세포 배양 상태에서 혈소판이 이들의 모체 거핵 세포구로부터 방출되도록 할 수 있다. 본 발명자들은 4 종의 인자들이 결정적인 잠재력이 있을 수 있다고 판단하였다. 이들 4 종의 인자들은 전단력(shearing force), 거핵 세포-내피 세포 상호작용, 혈장 인자 및 마지막으로 거핵 세포 내 분자 기전이다. 혈액의 전단력은 배양 용기의 물리적 조작, 예컨대 진동(shaking), 회전 또는 기타 유사 방식을 통해 촉진할 수 있다. 혈장 단백질 및 혈소판 수용체에 의해 작용하는 방출에서의 역할은 거핵 세포 자체에 의해 작용할 수 있으며, 또는 필요에 따라서, 각 인자들을 부가할 수 있다. 일부 선천적인 혈소판 비정상증 예컨대 베르나르 술리에르 질환 및 폰 빌레브란트 인자(VWF) 질환에서 거대 혈소판이 보고되었다. 본 발명자들은 우리의 배상체 유래 혈소판의 일부에서 이와 어느 정도 유사한 거대 혈소판을 관찰하였다. 혈장 인자 예컨대 VWF의 결핍에 의해 야기되는 프로혈소판으로부터 혈소판의 비효율적인 핀칭(pinching)에 기인하여, 이러한 현상이 관찰되면, 이 문제는 VWF 단독 또는 VWF를 포함하는 혈장을 첨가하여 처리할 수 있다. cGMP가 신생 거핵 세포로부터 혈소판이 형성되는 것을 촉진할 수 있다는 가설이 있어왔다. cGMP는 산화 질소로 활성화시킬 수 있다. 본 발명자들은 산화 질소 방출 화합물인 GNSO의 첨가를 통해서 거핵 세포를 2 시간 이내에 빠르게 작은 혈소판-유사 입자로 단편화할 수 있음을 확인하였다. 최종적으로, 이 과정의 부산물은 비교적 순수한 내피 세포이다. 본 발명자들은 또한 내피 세포가 혈소판이 저장(shedding)되는 것을 도울 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이들 모든 기술을 동원하여, 본 발명자들은 혈소판 형성의 효율성 및 규칙성(regularity)을 유의하게 증가시킬 수 있었다. 혈소판의 생물학적 기전을 이해하기 위해서, 본 발명자들은 혈장의 존재시 및 부재시 혈소판의 방출을 기록하기 위해서 3D 실시간 형광 현미경을 준비하였다. 본 발명자들은 프로혈소판의 3D 이미지를 기록할 수 있었으며 현재 이 과정을 보다 잘 모니터하기 위해 시간 경과에 따라 이를 수행중에 있다.

다음으로, 혈소판을 모아서 포장하게 된다. 12 일경 거핵 세포 분화의 마지막 단계에, 비-응집성 거핵 세포를 3 uM 기공 크기 필터를 구비한 멀티-웰 플레이트의 상층 웰로 옮기게 된다. 약하게 교반하는 GNSO 존재하의 배양기에서 배양을 수행하게 된다. 혈소판은 하층 챔버에서 수집되며, 필요하면 생리적 농도로 피브리노겐 및 VWF, 또는 인간 혈장이 존재할 수 있다. 이 시험관 내 시스템에서 분리한 혈소판을 연속 원심분리하여 정제하고 기증 혈소판으로 구연산염 완충액에 재현탁하게 된다. 수집한 혈소판을 저속(3000 g에서 30 분)에서 후속 원심분리하여 기타 찌꺼기들을 제거하고 적절한 크기의 필터를 통해서 여과하여 임의의 유핵 세포 제조물을 제거한다. 이렇게 생성된 혈소판 함유 산물은 임의의 적절한 농도로 농축된 혈소판으로 특징될 수 있다. 시험관 내에서 생성된 혈소판은 특정한 임상적 요구도에 부합하도록 혈청 또는 혈장 무함유 산물로 더 정제할 수 있다. 통상적인 공급원 유래의 기증 혈소판의 공통 문제점인, 박테리아 오염물을 감소시키기 위해 모든 용기는 멸균해야 한다.

따라서 시험관 내 세포 배양으로 생성된 혈소판은 종래 과학 또는 의학 분야에서 이용가능하던 것들과는 차별화되는데, 즉 이들 혈소판은 혈류에 노출된 적이 없다는 것이다. 유기체의 생체 내에서 생성된 혈소판은 혈장과 완전하게 분리될 수 없다. 그 결과, 최근 의학 용도의 포장된 혈소판은 소량의 백혈구 및 혈장 오염물도 함께 운반하여서, 일부 환자들에게 수혈 반응(transfusion reaction)을 야기할 수 있다. 인간 ES 세포로부터 분화하여 시험관 내 시스템에서 생성된 혈소판은 백혈구를 함유하지 않으며 혈청 또는 혈장에 전혀 노출되지 않게 된다. 시험관 내 시스템을 통해 생성된 혈소판은 성장 또는 분리 과정 시 피브리노겐 또는 VWF 등의 인자들을 첨가한 경우에만 이들 피브리노겐 또는 VWF 등의 인자를 보유하게 된다.

관련 문제점으로는 일부 면역글로불린이 자발적으로 혈소판에 부착된다는 점이다. 따라서 인간 기증자로부터 분리한 혈소판은 기증자에서 유래한 면역글로불린 분자를 필수적으로 함께 운반하게 되며, 이는 부작용에 대한 또 다른 가능한 기여 요인일 수 있다. ES 세포로부터 시험관 내에서 생성시킨 혈소판은 IgGs에 노출되지 않으며 따라서 면역글로불린을 함유하지 않게 된다. 비록 약하긴 하나, 혈소판 상에서도 "ABO" 혈액형 항체가 나타난다. 혈소판 수혈에서 때때로 ABO-형 반응이 나타나는 것이 혈소판에 의한 것인지 혈청 오염물에 의한 것인지 분명하지는 않다. Rh 인자는 혈소판에 존재하지 않는다. 따라서 상기 과정을 통해 생성된 혈소판은 통상의 분리 기술로 생성된 혈소판과 쉽게 구별될 뿐만 아니라 의료적으로나 과학적으로 보다 적용 가능성이 있다.

도 1은 본 발명에 따라 인간 배아 줄기(hES) 세포에서 혈소판을 생성시키는 방법을 나타내는 흐름도이다.

도 2(a)는 거핵 세포의 군집(colony) 형성을 시간에 따라 분석한 그래프이며, 도 2(b)는 거핵 세포 생성에 대한 성장 인자의 효과를 나타내는 그래프이다.

도 3(a) 및 도 3(b)는 다른 확대 배율로 관찰한 프로혈소판의 이미지를 나타내는 사진이다.

배상체 유래 조혈 전구체

배상체(EB) 형성은 생쥐 및 인간 ES 세포의 조혈 세포 분화를 연구하는데 사용되어 왔던 방법이다. 그러나, 생쥐 ES 세포와 다르게, 단일 세포 현탁물인 인간 ES 세포는 효율적으로 배상체를 형성하지는 못한다. 대신, 인간 ES 세포에서 배상체를 형성하기 위해서, 생쥐의 배아 섬유아 세포(MEFs) 상에서 배양한 인간 ES 세포의 완전한 군집들을 0.5 ㎎/㎖의 디파제로 5 분간 분해시켜서 소세포 집단(cluster)을 형성시켰다. 이들 세포 집단들을 혈청-함유 줄기 세포 배양 배지 (20 % FCS)에서 더 응집하도록 두었다. 배양 6 일후 배상체가 쉽게 구별할 수 있는 세포 덩어리를 형성하기 시작하며, 50 % 단일 세포들은 세포 덩어리에 참여하지 못하고 세포 사멸하였다. 배양 12 일 후, 상기 배상체는 요크 색(yolk sac)의 초기 배아 구조와 유사하였다. 배상체의 일부분을 취하고 이후 CD34 항체로 면역-표지화한 상기 부분을 통해서 요크 색의 조직학적 특징을 확인하였다. 세포들이 CD34 양성임을 확인하여서, 부착하지 않은 조혈 전구체 세포들이 소관(small vessels)의 관강 및 내피 세포 내층(lining)에 존재하고 있음을 확인하였다. 상기 배상체를 이후 37℃에서 트립신 분해(0.05% 트립신/0.53 mM EDTA)하였다. 일차 조혈 전구체 세포를 함유하는 대략 10⁵ 배상체-유래 세포를 메틸셀룰로스 배양 플레이트(Stem Cells Inc. 캐나다)에 플레이팅하고 10 내지 12일 동안 배양하였다. 그 후 적혈구 및 거핵 세포 집락 형성 단위(CFUs)를 이들의 천연 붉은색을 검출하거나 또는 모노클로날 항-CD41 또는 CD61 항체로 면역 표지화하여 검출하였다. 최종적인(definitive) 조혈 전구체 세포가 12일 째 마크로파지 및 과립구 집락이 형성되도록 할 수 있다. 이러한 활성은 일차 및 최종 조혈 작용의 첫 신호(wave)를 나타내는 것이다. 이제 본 발명자들은 동물 및 인간 혈청을 모두 함유하지 않은 무혈청 배상체 배양 시스템을 확립하였다.

배상체 -유래 거핵 세포 전구체의 시험관 내 팽창

배상체 형성 및 배양 12 일 후, 최종 세포 배양물을 37℃에서 30 분 콜라게나제(1 ㎎/㎖) 및 5 분 트립신 분해(0.05 % 트립신/0.53 mM EDTA)를 수행하여 단일 세포 현탁 배양물을 제조하였다. 조혈 작용을 방해할 수 있으므로 CD34+ 세포들을 기타 EB 세포들과 분리하였다. 거핵 세포구의 분화 및 증식을 특이적으로 촉진하도록 선택된 모든 인자들, 줄기 세포 인자(SCF), 인터루킨 6(IL6), 인터루킨 3(IL3), 혈소판 증식 인자(TPO) 존재하의 폴리-HEME 표면 상에서 CD34+ 세포들을 배양하였다. 10⁶ 출발 ES 세포 당 10⁶ CD41+ 거핵 세포의 수율을 얻었다(n = 6). 흥미롭게도, 콜라겐-계 반고체 매트릭스에 플레이팅했을 때, 이들 거핵 세포들은 프로혈소판을 의미하는, 비드-유사 구조를 갖는 매우 긴 돌기(processes)를 형성하였다. 이렇게 긴 구조는 거핵 세포를 생성하기 위한 시도에 인간 성인 조혈 모세포 또는 생쥐의 ES 세포를 사용했던 이전에는 보고된 바가 없었다. 방출된 혈소판으로 확인되는, 작은 CD41 양성 세포 단편들이 상기 거핵 세포들과 가깝게 존재하는 것으로 검출되었다. 유세포 분석기(flow cytometry)를 사용하여, 본 발명자들은 이들 거핵 세포들이 CD41, CD42a, CD42b, CD61, CD38, CD45(약함) 및 CD62P에는 양성이며, CD34, CD117, 및 HLA-DR에는 음성인 것을 확인하였다. 이러한 표현형 프로파일은 정상적인 인간 성숙 거핵 세포와 일치하는 것이다.

기질 세포층 상에서 인간 ES 세포로부터 거핵 세포를 분화시킴

OP9 기질 세포주는 생쥐의 조혈 작용을 지원하는데 사용되고 있는 신생 두개관 op/op 결함 생쥐로부터 확립된 세포주이다. 상기 op/op 생쥐는 마크로파지 집락-자극 인자(M-CSF)의 유전자 코팅 영역에 돌연변이를 보유하고 있다. OP 시스템을 사용하여 인간 ES 세포를 조혈 세포계로 분화시킨 결과는 배상체 형성을 통해 인간 ES 세포를 분화시키는 방법과 유사하지만, 일반적으로 기질 세포 방법은 보다 높은 수율로 성숙한 전구체 세포가 제공된다. 간략하게, 충분하게 증식한(confluent) OP9 기질 세포 상에 인간 ES 세포들을 접종하고 이어서 20 % 태아 소 혈청(FBS)이 보충된 알파-MEM 배지에서 배양한다. 6-웰 플레이트의 웰 당 10⁵ ES 세포 또는 10 ㎠ 배양 접시 내의 8×10⁵ 세포를 사용하여 분화를 시작하였다. 배양 6 일 후, 상기 ES 세포들은 조혈 전구 세포(progenitor)로 분화하며, 이는 세포 상에 CD34+ 세포 표면 마커들의 출현을 통해 알 수 있다. 거핵 세포로 분화를 위해서, 6 일에 세포들을 5분간 트립신으로 처리하고(37℃/5 % CO₂에서 0.05 % 트립신/0.53 mM EDTA), 10 ng/㎖ TPO를 함유한 동일한 배양 배지 내의 충분하게 증식한 새로운 OP9 세포로 계대하였다. 추가 배양 8일 후, 육안 검사를 통해 거핵 세포가 보이기 시작하였다. CD41 면역 염색을 통해 확인한 바에 따르면, 배양 상등액 내 약 30 %의 세포가 거핵 세포였다. 이들 거핵 세포들은 다핵성이었으나 배상체-유래 거핵 세포에서 관찰되었던 상당히 긴 돌기는 없었다. 이들 거핵 세포들은 성인 거핵 세포와 매우 유사한 최종 거핵 세포인 것으로 판단되었다. 재밌게도, 배양 중, 생쥐 시스템과 매우 다른 혈소판 형성에 대한 어떠한 징후도 없었다. OP9 세포는 거핵 세포구의 분화 및 증식을 촉진하고 지원할 수는 있으나, 혈소판 형성을 지원할 수는 없는 것으로 보인다. 이는 비록 거핵 세포의 분화 및 증식의 일부 기전이 유사하긴 하나, 생쥐와 인간에서 혈소판이 형성되는 기전은 다르다는 것을 나타내는 또 다른 징후이다.

거핵 세포의 증식, 성숙화, 및 정제

상기 방법들로 유도한 전구체 거핵 세포들이 성인 수용체 생쥐에서 증식하고 더 나아가 융화(engraft)할 수 있는 능력이 있는지 증명하였다. 과정의 다음 단계에서, 본 발명자들은 bFGF를 사용하여 미성숙 거핵 세포를 더 증식시켰으며 동시에 거핵 세포가 성숙하는 것을 정지시켰다. 각 거핵 세포가 2000 혈소판을 생성시킬 수 있고, 10⁶ 인간 ES 세포(하나의 6-웰 플레이트)가 10⁶ 거핵 세포구를 생성하며 이후 약 2×10⁹ 혈소판을 생성하는 것으로 추정되며, 이는 혈소판의 대략 1/20 단위를 의미하는 것이다(단위 당 > 5.5×10¹⁰ 혈소판). 이와 같이, 이렇게 추정된 효율성으로, 인간 혈소판 1 단위를 제조하기 위해서 인간 ES 세포의 20 T75 플라스크가 요구되었다. 이러한 수율성이 경제적으로 매력적일 수도 있고 그렇지 않을 수도 있으나, 한 명의 기술자가 이미 지원할 수 있는 범위인 것은 분명하다.

분화를 유도하기 위한 대안 기술

배상체 시스템은 세포의 대다수가 요크 색 세포라는 점으로 인해, 조혈 모세포를 제조하는 효율성이 기대했던 것보다 낮았다. 그러나, 상기 배상체 시스템은 생쥐의 단백질 오염물을 함유하지 않기 때문에 OP9-공동 배양 시스템보다 탁월하다. 본 발명자들의 데이타를 통해서, 우리는 조혈 세포계로의 분화는 기질 세포를 이용한 공동-배양 시스템과 대조하여 EB 시스템에서 여전히 최고로 수행할 수 있는 것으로 믿게 되었다. 최종 조혈 세포를 더 얻고 과정을 보다 효율적으로 만들기 위해서, 본 발명자들은 EB 배양을 지속하기로 계획하였다. 본 발명자들은 EB를 보다 작은 단편으로 기계적으로 단편화 또는 절개(dissect)하고자 하였으며 미세환경이 혈도(blood island) 분화를 계속적으로 지원하기를 바라면서 배양을 계속하였다. 분 발명자들의 예비 관찰 결과는 절개한 EB가 이러한 절개 과정 후에 생존하여 계속 성장할 수 있다는 것을 시사한다. 이는 EB 시스템에서 분화가 더 일어나도록 하고자 하는 첫 번째 시도가 될 것이다. 최종 혈도가 형성될 수 없더라도, 혈도 수의 유의한 증가를 이룰 수 있을 것이다. EB 배양물에 성장 인자 예컨대 VEGF 및 SCF 등을 부가하여 또한 시험할 수 있다.

개선된 혈소판 방출 및 성숙화

콜라겐 메트릭스, OP9, 및 폴리-HEME를 포함하는 다수의 시스템에서 혈소판 형성을 이미 관찰하였으나, 본 발명자들은 과정을 최적화할 수 있도록 혈소판 방출 기전을 더 이해하고자 원하였다. 혈소판 형성을 이루기 위해서, 본 발명자들은 TPO, 인간 혈장, 인간 동결 침전물(cryoprecipitate) 및 산화 질소 존재하에서 10³ ∼ 10⁴의 성숙한 거핵 세포들을 배양하였다. 상기 혈소판들은 항-CD41 항체로 표지화하고 유세포 분석기로 측정하였다. 혈소판의 형태는 전자 현미경 등을 포함하는 현미경으로 검사하였다. 전형적인 혈소판은 돌기나 다른 혈소판이 부착되지 않은 원반 모양이어야 한다. 보다 크거나 연결된 혈소판은 프로혈소판 형성만을 지원하는 비최적 조건임을 의미한다. 세포외 메트릭스 예컨대 피브리노겐 및 피브로넥틴이 거핵 세포 증식 및 성숙화를 촉진하는 것으로 알려졌다. 본 발명자들은 피브리노겐 및 피브로넥틴이 코팅된 플레이트를 사용하여 거핵 세포를 배양하고 거핵 세포 증식 및 분화에 대한 이들의 효과를 확인하였다

시험 혈소판

트롬빈, ADP, 및 콜라겐에 반응하여 혈소판 응집. 시험관 내에서 생성된 혈소판이 다른 자극제에 반응하여 응집하는 능력을 응집측정기(aggregometer)(Chrono-log Corporation, www.chronolog.com)를 사용하여 측정하였다. 혈소판을 상등액에서 수집하여 측정하였다. 10⁶/㎖의 혈소판을 PBS로 세척하고 인간 혈장에 재현탁하였다. 상이한 농도의 트롬빈, ADP, 및 콜라겐을 첨가하고 응집 동력학을 천연 인간 혈소판과 비교하였다. 본 발명자들은 생성된 "혈소판"을 시험하였고 성숙한 거핵 세포를 알파-과립 방출에 대한 간접 마커인 CD62P의 표면 발현을 통해서 0.5 U/㎖ 트롬빈으로 활성화시킬 수 있다. 본 발명자들은 다음의 방법을 통해서 혈소판 기능을 시험하는 과정 중이다.

고밀도 코어 과립 방출. 10⁶의 배양한 인간 혈소판의 분취물을 초기에 완충제 A(120 mmol/ℓ 글루탐산 나트륨, 5 mmol/ℓ 글루탐산 칼륨, 20 mmol/ℓ HEPES/NaOH, pH 7.4, 2.5 mmol/ℓ EDTA, 2.5 mmol/ℓ EGTA, 3.15 mmol/ℓ MaCl₂, 및 1 mmol/ℓ DTT) 내의 [³H]-5-HT(세로토닌)으로 표지화한다. 혈소판을 완충제 A로 세척하고 이어서 트롬빈 1 단위로 활성화한다. 샘플을 4 분간 얼음에 방치하여 반응을 종결하고, 이후 13,000 g에서 1 분간 원심 분리한다. 상등액을 회수하여 다음과 같이 분석한다. [³H]-5-HT 방출을 섬광 계측기로 측정한다. 또한 고밀도 코어 과립 방출의 동력학은 고밀도 코어 과립으로부터 ATP 분비 및 응집을 동시에 측정하는 발광-응집측정기(lumi-aggregometer)(Chrono-log Corporation)로 평가할 수 있다.

알파-과립 분비: 이의 분석은 파이코에리쓰린-접합된 항-CD62 항체 AC1.2 (Becton Dickinson)를 사용하여 유세포 분석기를 통해서 P-셀렉틴 발현을 측정하고 모니터하게 된다. 통상적으로, 고정 혈소판의 2.5 ㎕(10⁹/㎖)를 항체 용액의 97.5 ㎕에 첨가한다. 15 분 후에 샘플을 0.35 % BSA를 함유하는 Tyrode 완충액 1 ㎖로 희석하고 분석한다. P-셀렉틴 발현의 퍼센트 증가를 산출하고 인간 천연 혈소판과 비교한다.

용해소체(lysozome) 방출: 헥소사미니다제를 Holmsem 및 Cangelmaier가 기술한 바에 따라 측정한다. 구연산염-포스페이트 완충액(pH 4.5) 5 ㎖ 및 10 mmol/ℓ 기질(P-니트로페닐-N-아세틸-D-글루코사미니드) 2.5 ㎖을 혼합하여 96-웰 플레이트에 분취(100 ㎕)하고, 반응 상등액 5 ㎕를 첨가한다. 37℃에서 18 시간 동안 항온반응(incubation)시킨 후, 60 ㎕의 0.08 N NaOH를 첨가하여 반응을 종결시킨다. ELISA 플레이트 리더의 405-nm 필터로 흡광도를 읽는다.

이러한 시험을 사용하여 인간 배아 줄기 세포로부터 생성한 혈소판의 생물학적 활성을 확립하게 된다. 상기 시험관 내 혈소판 생성 시스템으로 생성된 혈소판은 인간 신체 내 정상 혈소판과 기능적으로 유사하다. 그러나, 시험관 내에서 생성 및 성숙하여 생성시킨 경우, 이러한 과정으로 생성시킨 혈소판이 적어도 생성되면서 인간 혈액에 노출된 적이 없다는 사실로 인해, 혈액에서 유래한 인간 혈소판과 쉽게 구별된다. 이러한 이유로, 상기 혈소판은 정상적인 혈청 인자, 예컨대 피브리 노겐, 응고 인자 V 및 VWF 등, 혈소판이 생체 내에서 혈류로 방출된 후 혈액에서 정상적으로 획득하게 되는 인자들이 부착되어 있지는 않을 것이다. 이는 혈소판 분리를 보조하도록 VWF가 부가되는 경우처럼, 상기 인자들이 배양물에 유의한 양으로 부가되지 않았다는 것이며, 물론, 환자들에게 배달된 후, 상기 혈소판은 수용체의 혈류로부터 이들 인자들을 신속하게 얻게 될 것이라는 사실은 당연한 것이다.

Claims (9)

1. (a) 인간 배아 줄기 세포를 조혈 세포계로 분화시키는 조건하에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 단계;

   (b) 상기 조혈 세포계의 세포를 거핵 세포로 배양하는 단계;

   (c) 상기 거핵 세포를 배양하여 혈소판을 생성하는 단계; 및

   (d) 상기 혈소판을 거핵 세포로부터 분리하여 회수하는 단계

   를 포함하는 인간 혈소판의 생성 방법.
2. 제1항에 있어서, 단계 (a)는 배상체의 형성을 촉진시키고, 이어서 상기 배상체로부터 조혈 세포를 선택적으로 회수하여 수행하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 단계 (a)는 인간 배아 줄기 세포와 기질 세포를 공동 배양하여 수행하는 방법.
4. 제1항에 있어서, 단계 (b)는 혈소판 증식인자(thrombopoietin), 인터루킨 3, 인터루킨 6, 인터루킨 11 및 줄기 세포 인자를 포함하는 배지에서 단계 (a)의 세포를 배양하여 수행하는 방법.
5. 제1항에 있어서, 거핵 세포는 CD41, CD42a, CD42b, CD61, CD38, CD45(약함) 에 대해 양성이나, CD34, CD117, 및 HLA-DR에 대해서는 음성인 방법.
6. 제1항의 방법에 따라 생성된 인간 혈소판.
7. 제8항에 있어서, 면역글로불린 분자를 함유하지 않는 인간 혈소판.
8. 혈액 응고를 개시하는 생물학적 활성을 보유하며, 혈액 항원 및 혈청 성분을 실질적으로 함유하지 않은, 시험관 내 배양으로 생성된 인간 혈소판.
9. 면역글로불린이 부착되지 않은 기능성 인간 혈소판을 포함하는 인간 혈소판의 분취물(aliquot).

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