KR20070058441A - 면역억제성 엑소솜 - Google Patents

면역억제성 엑소솜 Download PDF

Info

Publication number
KR20070058441A
KR20070058441A KR1020077002627A KR20077002627A KR20070058441A KR 20070058441 A KR20070058441 A KR 20070058441A KR 1020077002627 A KR1020077002627 A KR 1020077002627A KR 20077002627 A KR20077002627 A KR 20077002627A KR 20070058441 A KR20070058441 A KR 20070058441A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
exosomes
enhancer
exosome
serum
composition
Prior art date
Application number
KR1020077002627A
Other languages
English (en)
Inventor
파울 디. 로빈스
김선희
피터 웰링
Original Assignee
유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
오르토겐 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션, 오르토겐 아게 filed Critical 유니버시티 오브 피츠버그 오브 더 커먼웰쓰 시스템 오브 하이어 에듀케이션
Publication of KR20070058441A publication Critical patent/KR20070058441A/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0008—Antigens related to auto-immune diseases; Preparations to induce self-tolerance
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/15—Cells of the myeloid line, e.g. granulocytes, basophils, eosinophils, neutrophils, leucocytes, monocytes, macrophages or mast cells; Myeloid precursor cells; Antigen-presenting cells, e.g. dendritic cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/38—Antigens from snakes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/12—Keratolytics, e.g. wart or anti-corn preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/14—Drugs for dermatological disorders for baldness or alopecia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A61P21/04—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system for myasthenia gravis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/555—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by a specific combination antigen/adjuvant
    • A61K2039/55511—Organic adjuvants
    • A61K2039/55555—Liposomes; Vesicles, e.g. nanoparticles; Spheres, e.g. nanospheres; Polymers

Abstract

본 발명은 면역억제 반응을 매개하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 면역억제 활성을 가지는 엑소솜을 포함한다. 이러한 엑소솜은 수지상 세포 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포를 포함한 여러가지 다양한 세포 타입으로부터 유래될 수 있다. 엑소솜을 분리하기 전에 세포는 상기 엑소솜의 면역억제 활성을 증강시킬 수 있는 분자를 발현하도록 유전자 조작될 수 있으며/있거나 사이토카인 또는 사이토카인 저해제와 같이 엑소솜의 면역억제 활성을 증강시킬 수 있는 하나 이상의 물질에 노출될 수 있다. 또한, 본 발명은 부적합한 면역계의 활성화와 관련된 질병 및 장애를 치료하기 위한 엑소솜의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역억제성인 것으로 확인된 혈청에서 직접 분리한 엑소솜을 포함한다.
면억억제, 엑소솜

Description

면역억제성 엑소솜{IMMUNOSUPPRESSIVE EXOSOMES}
본 발명은 면역억제 반응을 매개하는 방법 및 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 면역억제 활성을 가지는 엑소솜을 포함한다. 이러한 엑소솜은 수지상 세포 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포(antigen presenting cell)를 포함하여, 여러가지 다양한 세포 타입에서 유래될 수 있다. 엑소솜을 분리하기 전에, 세포는 일반적으로 엑소솜의 면역억제 활성을 증강시킬 수 있는 분자를 발현하도록 조작될 수 있으며, 및/또는 엑소솜의 면역억제 활성을 증강시킬 수 있는 사이토카인 또는 사이토카인 저해제와 같은 하나 이상의 물질에 노출시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 면역 시스템의 부적절한 활성화와 관련있는 질환 및 장애 치료를 위한 상기 엑소솜의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 면역억제된 것으로 확인된 혈청으로부터 직접 분리한 엑소솜을 포함한다.
자가면역 장애는 자기-항원에 대한 허용성 상실, "자기" 항원(자가 항원)에 대한 림포구 반응 활성화 및 표적 기관의 병리학적 손상을 특징으로 한다. 자가면역 장애로는 류마티스 관절염, 골관절염, 알레르기, 전신성 루푸스 홍반증, 자가면역 질환 1형 당뇨병, 염증성 장애, 천식 등이 있다. 대부분의 경우, 자가면역성은 말초 허용성에 의해 저해될 수 있는데, 이는 항원 제시 세포(APC), 특히 수지상 세 포(DC) 및 작동 T 세포(effector T cell) 간의 일련의 다단계 상호작용이 수반되는 과정이다.
예컨대, 류마티스 관절염(RA)은 말단 가동 관절(distal diarthriodial joint)의 만성적인 염증을 특징으로 하는 쇠약성, 전신성 자가면역 질환이다. RA가 발병되면, 발병된 관절에서는 염증성 세포의 침윤 및 연골 및 뼈의 진행성 분해에 원인이되는 활막 과다증식증이 나타나며, 정상적인 관절 기능이 완전히 없어지게 된다. 최근, TNF-α 및 IL-β의 전-염증 활성을 조절하는 생물학적 물질이 신규한 항-관절염 약물로서 효과가 확인되었다(Evans and Robbins, J. Rheumatol. 21:779-782(1994); Robbins and Evans, Gene Ther. 3:187-189(1996); Evans and Robbins, Curr Opin Rheumatol. 8:230-234(1996); Evans et al., Arthritis Rheum. 42:1-16(1999); Ghivizzani et al., Clin Orthop. 379 (Suppl):S288-299(2000)).
더불어, 다양한 치료 물질의 유전자 전달이 관절염 동물 모델에서 효과적인 것으로 입증되었다. 특히, sTNF-α 수용체, IL-1Ra, sIL-1 수용체 타입 I 및 타입 II, IL-10, vIL-10 및 IL-4와 같은 다양한 치료 물질을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 국소 관절내 및 전신 주입으로, 마우스, 랫 및 토끼 관절염 모델들에서 현저한 항-관절염 효능을 볼 수 있었다 (Arend, Lancet. 341: 155-156(1993); Bandara et al., Proc Natl Acad Sci USA. 90:10764-10768(1993); Ghivizzani et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95: 4613-4618(1998); Mori et al., J. Immunol. 157:3178-3182(1996); Joosten et al., Arthritis Rheum. 39:797-809(1996); Kim et al., Arthritis Res. 2:293-302; Kim et al., J. Immunol. 164: 1576- 1581(2000)).
흥미롭게도, 이러한 치료 물질을 관절이나 발에 유전자 전달에 의해 국소 전달하면 반대쪽 무릎 또는 무처리 발에서도 치료 효과가 나타났다. 예컨대, vIL10, 엡스테인 바르 바이러스(Epstein Barr Virus) 코딩 IL-10 유전자를 발현하는 아데노바이러스 벡터를 관절내 주입하면, 질병 병리를 완화시켜, 백혈구 세포의 침윤을 감소되, 주입한 쪽 무릎 뿐만 아니라 반대쪽 무릎에서도 연골 대사가 향상된다(Lechman et al., J. Immunol. 163:2202-2208(1999)). 이러한 효과는 토끼의 무릎 관절염 모델에서 처음 관찰되어서 반대쪽 효과(contralateral effect)라고 한다. 이와 유사한 효과는 레트로바이러스 벡터, 리포좀을 주사하였을때에도 관찰되며, 심지어는 토끼, 랫 및 뮤라인 관절에 유전학적으로 변형된 활액 섬유모세포(synovial fibroblast)를 주입하였을때에도 관찰된다(Ghivizzani et al., Gene Ther. 4:977-982(1997); Ceponis et al., Arthritis Rheum. 44:1908-1916(2001); Kim et al. Mol Ther. 6:591-600(2002)).
이러한 최근 효과 분석에 따르면, 대식세포 및 수지상 세포(DC)와 같은 항원 제시 세포(APC)의 기능 변형이 말단 관절에 항원 특이 효과를 부여하는데 주된 역할을 하는 것으로 제시되고 있다(Whalen et al., Mol Ther. 4:543-550(2001); Kim et al., J. Immunol. 166:3499-3505(2001)). 특히, DC의 치료 기능은 배양중에 유전학적으로 변형시킨, 골수 유래 DC가 뮤라인 모델에서 발생된 관절염을 역위시키는데 효과적인 물질이라는 보고에 의해 더욱 입증되었다. 예컨대, 관절염이 발생된 마우스에 주입하여 IL-4 또는 FasL을 DC로 유전자 전달하면, 처리한 마우스의 반 이상이 처리후 적어도 2달내에 완치되기 시작하는, 현저한 관절염 퇴행이 이루어진다(Kim et al., J. Immunol. 166:3499-3505(2001); Kim et al., Mol Ther. 6:584-590(2002); Morita et al., J. Clin Invest. 107:1275-84).
수지상 세포는 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 수행하는 전문적인 APC이며, 다양한 기작에 의해 자가면역 반응을 증대 또는 감소시킬 수 있다. 면역억제성 분자를 발현하도록 유전학적으로 변형된 DC는 또한 외부 이식 거부반응 및 자가면역 장애를 완화하기 위한 매력적인 접근 방법으로 간주되고 있다(Lu et al., 1999, J. Leukoc. Biol. 66:293-296). 예컨대, 재조합 아데노바이러스(Ad) 벡터에 의해, DC에 세포독성 T 림프구 항원 4-면역글로불린(CTLA4Ig)이 전달되면, 동종이형 수여체에서의 이들 DC에 대한 허용성(tolerogenicity) 및 생존성이 촉진되는 것으로 확인되었다(Lu et al., 1999, Gene Ther. 6:554-563).
그러나, 이러한 방법에는 잠재적인 문제들이 있다. 예를 들면, 허용성은 반응 저하성의(hyporesponsive) 미성숙 DC의 투여에 의해 숙주에서 증강시킬 수 있지만, 바이러스계 벡터에 의한 DC의 형질전환은 성숙을 자극하여 면역자극 능력을 강화할 수 있다(Rea et al., 1999, J. Virol. 73:10245-10253). 그러므로, 이들의 질병 발병 속도를 늦추는 잠재적인 치료 효과에도 불구하고, 수지상 세포 던체를 투여하는 경우, 부적절한 결론에 이룰 수 있다.
30년간 DC를 포함한 여러가지 세포 타입에서의 소형 지질 소포체, 즉 엑소솜의 방출에 대한 연구가 진행되고 있다. 엑소솜은 처음에 5'뉴클레오티다제 활성과 트랜스페린 수용체를 함유하고 있는 소형 입자로 보고된 30 내지 100 nm 크기의 소 형 입자로, 엔도솜 구획으로부터 유래되며 종양 세포주(Culvenor et al., J. Cell Biochem. 20:127-138(1982)) 및 레티큘로사이트(Johnstone et al. J. Biol. Chem. 262:9412-9420(1987))에서 방출된다. 엑소솜은 내부 출아(inward budding) 또는 역 출아에 의해 제조되어, 세포질과 특정 막 조합 단백질의 노출된 세포외 도메인을 포함하는 입자가 형성된다(Stoorvogel et al., Traffic 3:321-330(2002)). 엑소솜은 세포자살체와 혈장 막 세딩(plasma membrane shedding)에 의해 형성되는 것으로 보이는 좀더 큰 마이크로소포체와 별개인 것으로 입증되었다. 많은 세포 타입들이 수지상 세포, 레티큘로사이트, T 림프구, B 세포, 혈소판, 상피 세포 및 종양 세포를 포함하는 엑소솜을 만드는 것으로 알려져 있다(Johnstone et al. Blood. 74:1844-1851(1989); Peters et al., Eur J. Immunol. 19:1469-1475(1989); Raposo et al., J. Exp Med. 183:1161-1172(1996); Heijnen et al., Blood 94:3791-3799(1999); Theiry et al., J. Cell. Biol. 147:599-610(1999); Wolfers et al., Nature Med. 7:297-303(2001); van Niel and Heyman, Am J. Physiol Gastrointest Liver Physiol. 283 :G251-255(2002)). 고순도의 DC 유래 엑소솜은 튜불린, 엑틴 및 특정 엑틴 결합성 단백질 뿐만 아니라 MHC 클래스 I과 II 항원, CD86, ICAM-1, lamp-2, αM-베타2 인테그린, 테트라스패닌(tetraspanin) CD9 및 CD63, 및 MFGE8/락트어드헤린(lactadherin)을 포함하는 것으로 확인되었다(Raposo et al., J. Exp Med. 183:1161-1172(1996); Theiry et al., J. Cell. Biol. 147:599-610(1999); Escola et al., J. Biol Chem. 273:20121-20127(1998); Thery et al., J. Immunol. 166:7309-7318(2001)).
종양 항원 펩티드를 펄스한(pulsed) DC 유래의, 표면에 종양 항원이 노출되어 있는 엑소솜은 DC 그 자체의 효과처럼 효율적으로 마우스에서 항-종양 반응을 자극하는데 효과적인 것으로 확인되었다(Zitvogel et al., Nature Med. 4:594-600(1998)). 종양 항원 펩티드-펄스한 DC 유래의 엑소솜을 이용한 임상 실험에서 최초로 긍정적인 결과가 보고되었다(Andre et al., Adv Exp Med Biol. 495:349-354(2001); Morse. et al., Proc. Am. Soc. Oncol. 21 A42, p. 11a(2002)). 엑소솜은 면역자극 능력이 있는 것으로 보이며, 항원 제시 세포를 감작하는 능력이 있다(Zitvogel et al. US20040028692).
또한, 엑소솜은 일부 면역억제 활성이 있는 것으로 입증되었다. 특정 T 세포 뿐만 아니라 흑색종 세포는, 특정 FasL을 표면에 포함하며 T 세포 자살을 촉진하여 종양 세포의 증식을 허용할 수 있는 엑소솜을 만든다(Andreola et al. J. Exp Med. 195:1303-1316(2002); Martinez-Lorenzo et al., J. Immunol. 163: 1274-1281(1999)). 또한, INF-γ 및 절단된 오발부민(digested ovalbumin) 존재하에 배양한 랫의 장 상피 세포에서 생성되는, 텔레로솜(tolerosome)이라고 하는 엑소솜 입자는, 주입 후 항원에 특이적인 허용을 유도할 수 있다(Karlsson et al., Eur. J. Immunol. 31:2892-2900(2001)).
Peche 등은 랫에서 이식 생존율을 지속시키는데 있어, 동종이형의 공여체에서 유래된 엑소솜이 랫의 이식 생존율을 연장시키는 것으로 보고하였다(Peche et al. Transplantation 76:1503-1510(2003)). 그러나, 저자는 항-공여체 MHC 클래스 II 동종이형 항체(alloantibody)의 생산이 증가되어, 동시적인 면역 자극 효과가 있는 것으로 추정하였다.
그러므로, 자가면역 질환 및 염증성 장애를 치료하는 안전하고 효과적인 방법의 개발이 필요한 실정이다. 본 발명은 이러한 질병 및 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다.
발명의 개요
본 발명은 면역억제 활성을 가지는 엑소솜 및 이러한 엑소솜의 생산 및 이용 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명의 엑소솜은 부적절한 면역 반응을 억제하기 위해 포유류 숙주에게 투여할 수 있다.
본 발명의 엑소솜은 비제한적으로 수지상 세포 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포를 포함하는 여러가지 다양한 세포로부터 유래될 수 있다. 엑소솜 제조를 위한 세포는 엑소솜을 수득하기 전에, 바람직하기로는, 유전자 조작되거나/되고, 비제한적으로, 사이토카인 또는 사이토카인 저해제와 같은 물질로 처리될 수 있다.
다양한 예로, 본 발명은 엑소솜 조성물 및 면역억제제로서의 이의 이용 방법을 제공한다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 질환 및 장애로는, 비제한적으로 알레르기, 천식, 관절염 및 상처 치료와 같은 염증 및 염증 관련 증상과, 비제한적으로 류마티스 관절염 및 당뇨병을 포함하는 자가면역 질환이 있다. 또한, 엑소솜의 면역억제 활성 측면에서, 본 발명은 엑소솜을 길항함으로써 면역 반응을 촉진시키는 방법, 예컨대 환자의 항-종양 면역성을 촉진시키는 방법을 제공한다.
발명의 상세한 설명
명확하게 하고 한정의 의도없이, 본 발명의 상세한 설명은 하기 하부 내용으로 나뉘어진다:
(i) 엑소솜 세포원;
(ii) 엑소솜을 수확하기 위한 세포 컨디셔닝;
(iii) 세포로부터 엑소솜 제조;
(iv) 혈청으로부터 엑소솜 제조;
(v) 엑소솜 함유 조성물;
(vi) 면역억제 방법; 및
(vii) 엑소솜 매개성 면역억제를 길항하는 방법.
5.1 엑소솜 세포원
본 발명의 엑소솜은 수지상 세포("DC") 및 대식세포와 같은 항원 제시 세포("APC")를 비제한적으로 포함하는, 여러가지 다양한 세포로부터 유래될 수 있으며, 예컨대 골수, 비장, 림프절 또는 흉선과 같은 조직이나, 또는 말초 혈액이나 그것의 혈청으로부터 수확할 수 있다. 본 발명의 범위는 피부의 랑게르한스 세포 또는 간의 쿠프퍼 세포와 같이 전문화된 항원 제시 세포를 더 포함하며, 이는 그것의 기관 조직으로부터 준비할 수 있다. 특히 APC와 DC 수확 방법은 당업계에 공지되어 있다.
전술한 구현예에 개시한 바와 같이, 엑소솜의 면역억제 활성은 MHC 클래스 II 항원 의존적적이며, 엑소솜 공여체 및 수여체가 서로 동종이형이기 보다는 유전적 동계일때 보다 높은 것으로 관찰되었다. 따라서, 공여체와 수여체의 관련성이 가장 높은 것이 바람직하다. 그러므로, 본 발명은 다른 종에서의 면역억제를 위해 포유류 종 유래 엑소솜을 사용하는 것을 포함하며, 바람직하기로는 공여체와 수여체의 종은 동일(또는, 예로 의도한 조직 이식에서의 고려 사항을 고려하여, 실질적으로 동일하거나 혼용가능하며)하고/하거나 바람직하기로는 공여체 및 수여체의 MHC 클래스 II 항원이 동일하고/하거나, 바람직하기로는, 공여체와 수용체는 동일(자기 유래의)하거나 혈통적으로 관련되어 있다(남자형제/여자형제; 여자형제/여자형제, 부모/어린아이). 이와 유사하게, 엑소솜의 면역억제 활성은 항원 특이적이므로, 본 발명의 구체적인 비제한예에서, 엑소솜 공여체는 항원으로 면역될 수 있으며, 반응은 수여체에서 억제된다.
5.2 엑소솜 수확을 위한 세포의 컨디셔닝
본 발명의 바람직한 비제한적인 예에서, APC는 이로부터 제조된 엑소솜의 면역억제 활성을 증강시키도록 컨디셔닝된다. 본원에서 "컨디셔닝"은 (i) APC의 생체내 또는 시험관내에서의 증강제 노출과 (ii) APC를 증강제를 발현하도록 유전자 조작하는 것을 포함한다.
증강제는 사이토카인, 사이토카인 길항제 및 NFκB일 수 있으며, TGF-β, IL-10, CTLA4-Ig, sCD4O-Ig, IL-4, IL-13, FasL, IL-1 수용체 길항 단백질("IRAP"), vIL-10, sICAM-1, sICAM-3, 및 TRAIL을 포함하나, 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 비제한적인 예로, 증강제는 IRAP, IL-lO, IL-4 또는 이들의 조합이다. 구체적으로 비제한적인 예로, 증강제가 예컨대 세포 배양시 APC에 투여되는 경우, IRAP 농도는 약 5 ㎍/㎖이거나, IL-10의 농도는 약 1000 U/㎖이거나, 또는 IL-4의 농도는 약 1000 U/㎖일 수 있다. 선택적으로, 특이적인 항원 또는 특이적인 항원 공급원이 공지된 경우, 이러한 특이적인 항원 또는 특이적인 항원 공급원(예, 고정 또는 약독화된 감염성 물질)을 무독성, 무-병원성인 함량으로 증강제로서 배양물에 첨가할 수 있다.
본 발명의 예로, APC는 증강제를 코딩하는 이종의 "증강 유전자"을 발현하도록 유전자 조작될 수 있다. 이러한 "증강 유전자"로는 APC에서 활성인 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된, TGF-β, IL-lO, CTLA4-Ig, sCD4O-Ig, IL-4, IL-13, FasL, IRAP, VIL-lO, sICAM-1, sICAM-3 및 TRAIL을 코딩하는 핵산이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 바람직한 예에서, 증강 유전자는 FasL, IL-10, IL-4 또는 IRAP이다. 증강 유전자의 산물은 (예, 막에 결합된) 엑소솜 표면이나, 엑소솜의 내부에서 발현될 수 있다. 대안적으로, APC는 비제한적으로 Dell과 같은 신생혈관 인자, 분류 시그널 또는 국재화 시그널을 코딩하는 증강 유전자를 발현하도록 조작할 수 있다. 증강 유전자는 형질감염, 형질전환, 전기충격, 미세주입 등을 포함하는 당업계에 공지된 방법으로 도입할 수 있다. 증강 유전자는 선택적으로 이의 도입을 용이하게 하기 위해 적정 발현 벡테어 병합할 수 있다. 본 발명의 비제한적인 예에서, 발현 벡터는 바이러스 벡터일 수 있다. 바이러스 벡터는 예컨대 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-조합 바이러스(AAV) 또는 헤르페스 심플렉스 바이러스(HSV) 벡터일 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 예로, 바이러스 벡터는 아데노 바이러스로부터 유래된다(Horwitz, M.S., "Adenoviridae and Their Replication, in Virology, 2nd edition, Fields et al., eds., Raven Press, New York, 1990). 재조합 아데노바이러스는 아데노바이러스 캐리어(carrier)에 이질적인 단백질에 대한 핵산 분자를 코딩하기 위한 발현 시스템을 사용하는 장점이 있으며, 그 예로는 분열 및 미분열 세포 모두에 대한 굴성(tropism), 잠재적인 병원성 최소, 벡터 원액을 제조하기 위한 고역가 복제능 및 거대 삽입체 수송 가능성이 있다(Berkner, K.L., 1992, Curr. Top. Micro Immunol, 158:39-66; Jolly D., 1994, Cancer Gene Therapy, 1:51-64).
본 발명의 구체적인 비제한적인 예로, 증강 유전자는 아데노바이러스 혈청형2(Ad2) 또는 혈청형 5(Ad5)에서 유래된 아데노바이러스 벡터내에 함유될 수 있으며, 이들은 실질적으로 결손된 E1 및 E3 영역을 가진다. 또한, 다른 아데노바이러스 혈청역 역시 아데노바이러스 벡터의 벡본으로 사용할 수 있으며, 그중에서도 Ad 6, Ad 9, Ad 12, Ad 15, Ad 17, Ad 19, Ad 20, Ad 22, Ad 26, Ad 27, Ad 28, Ad 30 및 Ad 39가 있다. 이러한 수많은 아데노바이러스 혈청형 중에서도 Ad2 및 Ad5가 바람직하다.
바이러스 벡터에 선택적으로 포함된 적정 프로모터 요소에 작동가능하게 연결된 증강 유전자를 포함하는 핵산은, 예컨대 리포좀, 미세입자 또는 미세캡슐내 캡슐화와 같은 전달 시스템을 통해, APC에 제공될 수 있다.
5.5 세포로부터 엑소솜 제조
세포로부터 엑소솜을 제조하는 방법은 당업계에 알려져 있으며, 예컨대 Raposo et al., J. Exp. Med. 183:1161(1996)을 참조한다.
본 발명의 구체적인 비제한적인 예로, 엑소솜은 바람직하기로는 하기와 같이 증강제에 의해 (배양 배지에서 또는 유전자 조작을 통해) 컨디셔닝된 APC 배양물로부터 제조할 수 있다. 배양 상층물을 수집하여, 300 g에서 5분간, 1,200 g로 20분간, 그리고 10,000 g로 30분간 연속하여 3번 원심분리하여, 세포와 파편을 제거할 수 있으며, 이후 100,000 g로 한시간동안 원심분리할 수 있다. 과잉의 혈청 단백질을 제거하기 위해, 엑소솜 펠렛을 PBS로 세정하여 100,000 g로 1시간 원심 분리한 다음, 얻어지는 펠렛은 PBS에 재현탁할 수 있다. 엑소솜은 마이크로 브래드포드 단백질 분석(Bio-Rad, CA)으로 정량할 수 있으며, 바람직하기로는 상기 분석으로 측정된 엑소솜의 1 mg 단백질에 해당되는 양을 20 ml의 PBS에 현탁할 수 있다. 전자 현미경으로 엑소솜의 완전성을 선택적으로 검증할 수 있으며(도 1A), FACS 분석으로 엑소솜을 선택적으로 표면 마커의 특징으로 특정화할 수 있다(하기 6 및 7장 참조).
5.4 혈청으로 엑소솜 제조
본 발명에 따라 면역억제로 사용할 수 있는 엑소솜은 적합한 개체의 혈청으로부터 수득할 수 있다. 바람직하기로는, 상기 개체는 혈청 유래 엑소솜의 해당 수여체이다(자기 투여). 엑소솜 공여체 및 수여체가 동일하지 않다면, 항원 특이성 및 엑소솜 매개성 면역억제 활성의 MHC 클래스 II 의존성으로 인해, 수여체와 공여체의 MHC 클래스 II 항원이 호환적(compatible)이며/이거나, 수여체에서 적절히 면역성이 억제된 항원에 노출된 적이 있는 공여체가 바람직하다.
엑소솜은 30-100 nm의 소형 입자이므로, 예컨대 비제한적으로 10분간 1500 g으로 원심분리하여 말초 혈액 샘플에서 거대 세포 요소들을 제거함으로써 혈청에서 회수할 수 있다.
바람직하기로는, 엑소솜은 순차적인 원심분리 단계로 보다 더 엄밀하게 정제한다. 예컨대, 비제한적으로, 세포 배양물 상층물로부터 엑소솜을 제조하는 전술한 방법 또는 등가의 방법을 사용할 수 있다. 이러한 방법은 바람직하기로는 실험용 초원심분리기 사용을 포함한다. 비제한적인 일예에서, 1200 g로 5분, 1,200 g로 20분 및 10,000 g로 30분간 3번 연속분리하고, 이후 100,000 g로 1시간 원심 분리하고, 얻어지는 펠렛을 PBS로 세정하여 PBS로 재현탁한 다음 100,000 g로 한시간 원심 분리하여 PBS에 재현탁함으로써, (표준 실험 기법을 이용하여 말초 혈액으로부터 수득한) 혈청으로부터 엑소솜을 분리할 수 있다.
본 발명의 바람직한 예로, 혈청 및 엑소솜을 수집하기 전에 말초 혈액을 비드 존재하에 배양하여, 사이토카인 생산을 자극할 수 있다. 이러한 목적으로 사용될 수 있는 비드로는, 0.5 내지 10 mm 또는 0.5 내지 5 mm의 직경의, 선택적으로, 림프구 증식을 자극하는 CrSO4와 같은 물질로 처리된 유리 또는 플라스틱 비드가 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다(Mignini et al., 2004, Preventive Med 39(4) 767-775; Rhee et al., 2002, Clin Exp Imniunol 127(3):463-469). 바람직한 비제한적인 본 발명의 일예로, 직경이 2.5 mm이고, 표면적이 21 mm2이고, 50% CrSO4(Merck, Germany)로 5분간 반응시켜 표면을 변형시킨 다음 pH가 증류수와 동일해질때까지 증류수로 세정하여, 세정액의 전도도가 0.3 μS 미만인, 의료 등급의 유리 비드를 사용할 수 있다. 처리된 비드는 마이크로타이터 플레이트, 원심분리 튜브 또는 시린지와 같은 적정 용기에 넣어, 멸균할 수 있다(예, 자동멸균 또는 감마 조사). 이후 말초 혈액을 비드-함유 용기에 넣어 37 ℃, 5 % C02로 예컨대 24시간동안 무균 인큐베이션할 수 있다. 이후 비드/혈액 현탁물을 예컨대 3500 rpm으로 10분간 원심분리하여 혈청을 수집할 수 있다. 전형적으로, 처음 총 말초 혈액의 20%를 회수할 수 있다. 수득되는 엑소솜 함유 혈청은 -20 ℃에 보관할 수 있다. 이러한 방법으로 오르토카인(Orthokine)® 혈청을 제조한다(미국 특허 6,759,188 및 6,713,246 참조).
본 발명의 관련된 구체적인 비제한적인 예로, IRAP를 비드와 인큐베이션하기 전에 또는 대안으로서 말초 혈액 샘플에 첨가할 수 있다. 예로, 말초 혈액 ml당 IRAP 5 ㎍을 첨가할 수 있다.
본 발명의 바람직한 비제한적인 예로, 선택적으로, 비드 및/또는 IRAP와 함께 인큐베이션한 말초 혈액에서 혈청을 수득하고, 형성된 혈액 요소를 제거하기 위해 (예, 10분간 3000-5000 g) 원심분리한 다음, 예컨대 100,000 g로 한시간동안 초원심분리함으로써, 엑소솜의 농축 조제물을 제조할 수 있다. 수득되는 펠렛은 생리 식염수에 재현탁한 다음, 바람직하게는 (예, 0.2 ㎛ 필터로 여과하여) 멸균화할 수 있다. 펠렛에 물질의 부피로 엑소솜의 농도를 결정한다. 바람직하기로는, 농도는 약 100 ml 혈청: 1 ml 엑소솜 농축물("100 X 농축물") 내지 2 ml 혈청: 1 ml 엑소솜 농축물("2X 농축물")이고, 바람직하기로는 약 50 ml 혈청: 1 ml 엑소솜 농축물("50X 농축물) 내지 5 ml 혈청: 1 ml 엑소솜 농축물("5X 농축물")이고, 바람직하기로는 약 10 ml 혈청: 1 ml 엑소솜 농축물("10X 농축물")이다.
5.5 엑소솜 함유 조성물
본 발명은 엑소솜이 적합한 약학 담체에 현탁된, 엑소솜 함유 조성물을 제공한다.
본 발명의 조성물은 엑소솜의 농도가 평균적인 개체 또는 해당 엑소솜 수여체의 혈청내 농도에 비해 농축된 것을 특징으로 할 수 있다. 비제한적인 예로, 혈청에 상대적인 농도는 약 100X-2X 이거나, 50X 내지 5X이거나, 또는 약 10X이다.
본 발명의 조성물은 전술한 바와 같이, 증강제로 처리한 APC 또는 말초 혈액으로부터 수득한 엑소솜을 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물은 초원심분리에 의해 제조된 엑소솜을 포함할 수 있다.
바람직한 비제한적인 일예로, 본 발명은 증강제로 컨디셔닝한 개체의 APC를 배양하고, 상기 컨디셔닝한 APC의 배양 배지로부터 엑소솜을 분리하여 제조한, 엑소솜을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
다른 바람직한 비제한적인 예로, 본 발명은 유리 비드와 함께 말초 혈액을 배양하는 단계, 말초 혈액에서 혈청을 수집하는 단계 및 초원심분리로 혈청으로부터 엑소솜을 분리하는 단계로 제조한, 엑소솜을 포함하는 약학 조성물을 제공하다.
다른 바람직한 비제한적인 예로, 본 발명은 증강제, 바람직하기로는 IRAP의 존재하에 유리 비드와 함께 말초 혈액을 배양하는 단계, 말초 혈액으로부터 혈청을 수집하는 단계 및 바람직하기로는 초원심분리에 의해 혈청으로부터 엑소솜을 분리하여 엑소솜 농축 조제물을 만드는 단계에 의해 제조한, 엑소솜을 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
5.6 면역억제 방법
본 발명은 개체에 유효량의 APC 유래 엑소솜을 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 개체에서 면역 반응을 감소, 저해 또는 방지하는 방법을 제공한다. 상기 감소/저해/방지는 임상적인 염증 증상(부기, 홍반, 열, 통증, 관절 운동성 제한(limited joint mobility), 발진, 염증성 신경병증, 수막염, 뇌염), 알레르기 또는 천식의 임상 증상(재채기, 가려움, 기침, 발진, 두드러기, 천명(wheezing)), 염증성 장 질환의 임상 증상(경련, 혈변 및/또는 점액성 변) 또는 CRP, ESR, WBC와 같은 임상 마커와 같은, 염증성 파라미터의 감소로 확인할 수 있다.
면역 반응을 감소, 저해 또는 방지하는 것이 바람직한 질병 및 장애로는, 비제한적으로, 관절염, 알레르기, 천신 또는 자가면역 질환이 있으며, 자가면역 질환으로는 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosis), 경피증, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 1형 당뇨병, 베네거 육아종증(Wegener's granulomatosis), 다발성 경화증, 크론 질환, 건선, 그레이브 질환, 복강부전증(celiac sprue), 원형 탈모증(alopecia areata), 중추신경계 혈관염(central nervous system vasculitis), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 굿패스투어 증후군(Goodpasture's syndrome), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 귈레인 바레 증후군(Guillan-Barre syndrome), 결절다발 동맥염(polyarteritis nodosa), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytic purpura), 거대세포 동맥염(giant cell arteritis), 원발성 담즙성 경변(primary biliary cirrhosis), 에디슨 질환(Addison's disease), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 타카야즈 동맥염(Takayazu's arteritis) 및 백반증이 있으나, 이로 한정되는 것은 아니다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 적절한 그외 증상으로는, 근위축증(muscular dystrophy)과 같은 질환과 사고 또는 의료인에 의해 생긴 연조직, 인대 또는 뼈 부상, 또는 비면역성 사건, 예컨대 심근 경색증을 수반하는 심근에 의해 손상된 조직과 같이, 염증이 적절한 치유를 방해할 수 있는 증상이 있다.
본 발명의 방법은 본 발명에 따라 제조된 유효량의 엑소솜을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 예를 들어, 엑소솜 조성물은 전술한 바와 같이 투여할 수 있다. 엑소솜은 모든 임상적인 경로로, 바람직하기로는 정맥내로, 근육내로, 동맥내로, 피하로, 척수강내로, 또는 국소 주입 또는 점적 주입(instillation)으로, 예컨대 수술중에 투여할 수 있다.
엑소솜의 투여 함량은 하기와 같거나 또는 임상적인 기준, 예컨대 개개별에 따라 결정할 수 있다. 특히, 비제한적인 예로, 약 5 내지 100 ㎍, 또는 약 50 ㎍의 단백질을 가지는 엑소솜을 환자 1 kg당 투여할 수 있다. "특정 함량의 단백질을 가지는 엑소솜"은 엑소솜 조제물내 단백질 함량을 (예, 상기 5.3장에 기재한 브래드포드 단백질 분석 또는 그외 단백질 정량의 표준 기법에 의해) 정량하고, 단백질 함량은 엑소솜의 투여량 인덱스로 사용함을 의미한다. 본 발명의 구체적이고 비제한적인 예에서, 인간 환자에게는 말초 혈액 약 20-50 ml, 약 50-100 ml, 약 100-200 ml, 약 200-300 ml, 약 300-400 ml, 또는 약 400-500 ml에서 수득한 혈청으로부터 유래된 양의 엑소솜을 투여할 수 있다. 본 발명의 다른 구체적이고 비제한적인 예에서, 인간 환자에게는 약 100 ㎍ 내지 5 mg의 단백질 또는 약 500 ㎍ 내지 2 mg의 단백질을 가지는 양의 엑소솜을 투여할 수 있다.
구체적이고 비제한적인 예에서, 본 발명은 항원 제시 세포의 배양물로부터 제조한 유효량의 엑소솜을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에게서 면역 반응을 저해하는 방법을 제공한다. 본원에서, "항원 제시 세포의 배양물"은 당업계에 공지된 방법에 의해 항원 제시 세포가 농화된(enrichment) 수집 세포 배양물이며, 예컨대, 배양물은 필수적으로 100% 순수한 것은 아니다.
5.7 엑소솜 매개 면역억제를 길항하는 방법
APC 유래 엑소솜은 면역억제적인 것으로 확인되었기에, 특정 조건하에서는 예컨대 숙주의 종양 또는 감염에 대한 면역 반응을 억제한다는 측면에서 부적정적인 효과를 나타낼 수 있다. 따라서, 본 발명은 면역 증가가 적합한 부위에 APC 유래 유효량의 엑소솜 저해제를 투여하는 단계를 포함하는 상기한 부적합한 면역억제를 저해하는 방법을 제공한다. 이러한 저해제는, 예컨대 엑소솜 조합 항원, 예컨대 트랜스페린 또는 도 1C, 2 및 4A에 도시한 임의의 표면 분자에 대한 항체일 수 있다.
도 1A-C. (A) 뮤라인 BM-DC 유래 엑소솜의 전재 TEM(whole mount transmission electron microscopy). Bar = 200 nm. (B) 여러가지 엑소솜 조합 단백질의 존재 확인을 위한 엑소솜 및 BMDC 용해물(lysate)의 웨스턴 블롯 분석. (C) MHC I 및 II, CD11c, CD80(B7.1), CD86(B7.2)의 발현에 대한 뮤라인 DC 유래 엑소솜의 유세포 분석.
도 2. 골수 수지상 세포("BMDC") 유래 엑소솜의 활성화된 세포의 형광 분류("FACS") 특정화.
도 3A-D. 생체내 DC 유래 엑소솜의 트래피킹(Trafficking). PKH67로 표지한 엑소솜을 정맥내 주입한 후 6시간 경과시, (A) MOMA-1+, (B) ER-TR9+ 대식세포 및 (C) CD11c+ DC는 비장내 내재화된 엑소솜을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. (D) 비장 DC 서브세트에 내재화된 표지 엑소솜은 다양한 시간대에 CD-8α 및 PKH67에 대한 FACS로 분석하였다.
도 4A-C. (A) 마우스 골수 DC 및 DC 유래 엑소솜의 유세포 측정 분석으로, 엑소솜은 Ad.대조군 및 Ad.FasL으로 형질전환된 골수 DC로부터 정제된 것이다. (B) FasL 발현을 보이는 DC 및 DC 유래의 엑소솜의 웨스턴 블롯. (C) DC 유래의 엑소솜 분획의 TEM
도 5. DC 및 FasL이 있는 엑소솜을 처리한 마우스 발바닥에서의 지연성 타입의 과민증(DTH) 억제를 나타내는 막대 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다.
도 6. 동종이형의 엑소솜 및 DC에 비해 유전적 동계의 엑소솜 및 DC가 마우스 발바닥에 대해 DTH 억제를 보이는 막대 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다.
도 7A-B. (A) Ad.Ψ5 또는 Ad.FasL이 감염된 엑소솜 및 DC를 천연형 또는 MHC I 결손 마우스에 주입하였을때, 마우스 발바닥에서의 DTH 반응을 나타낸 막대 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다. (B) Ad.Ψ5 또는 Ad.FasL을 감염시킨 엑소솜 및 DC를 이용하여 천연형 또는 MHC II 결손 마우스에 주입하였을때 마우스 발바닥에서의 DTH 반응을 나타낸 막대 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다.
도 8. 면역억제 엑소솜의 항원 특이성을 나타낸 막대 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다.
도 9A-B. (A) 천연형 또는 gld(FasL -/-) 마우스 중 어느 하나로부터 제조하고, 대조군 아데노바이러스(psi5) 또는 FasL을 발현하는 아데노바이러스(FasL)중 어느 하나를 감염시킨 다음, KLH를 발바닥에 주사하기 12시간 전에 미리 KLH로 면역화시킨 천연형 마우스의 발바닥에 주입한, DC 및 DC 유래 엑소솜의 DTH 억제 효과를 비교한 막대 그래프. (B) (A)에서 제조한 엑소솜을 다시 lpr(Fas -/-) 마우스에 주입하였을때의 DTH 억제 효과를 천연형과 비교하여 나타낸 막대 그래프.
도 1OA-B. (A) 콜라겐 유발성 관절염 뮤라인 모델에 FasL을 발현하는 DC를 주사하였을때의 질병 진행 억제를 나타내는 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다. (B) 콜라겐 유발성 관절염 뮤라인 모델에 FasL가 존재하는 엑소솜을 주사하였을때의 질병 진행 억제를 나타내는 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다.
도 11A-B. (A) 혼합 림프구 반응(MLR)에서 vIL-10을 발현하는 DC 첨가시 T 세포의 증식 억제를 나타내는 그래프. (B) 혼합 림프구 반응에서 Ad.vIL-10을 감염시킨 DC에서 분리한 엑소솜을 첨가하였을때의 T 세포 증식 억제를 나타내는 그래프.
도 12A-B. (A) Ad.vIL-10로 형질전환된 DC와 DC/vIL-10으로부터 유래된 엑소솜을 이용하여 마우스 발바닥의 DTH 반응 억제를 나타낸 그래프. (B) 재조합 뮤라인 IL-10을 처리한 BMCD와 재조합 뮤라인 IL-10이 처리된 DC 유래의 엑소솜을 이용하여 마우스 발바닥에서의 DTH 반응 억제를 나타낸 막대 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다.
도 13A-C. (A) Ad-vIL-10로 형질전환된 BM-DC 유래 무손상 또는 동결/해동 엑소솜의 전재 TEM. (B) Ad-vIL-10로 형질전환된 BM-DC 유래 무손상 또는 동결/해동 엑소솜의 Hsc 70 존재를 검출한 웨스턴 블롯. (C) Ad-vIL-10가 감염된 DC에서 분리한 막-교란성 엑소솜의 DTH 반응 억제 불능을 나타내는 막대 그래프.
도 14A-B. (A) Ad-vIL-10이 감염된 DC에서 분리한 MHC II-고갈 엑소솜의 면역억제 효과를 나타내는 막대 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다. (B) 재조합 IL-10이 처리된 DC에서 분리한 MHC II-고갈 엑소솜의 면역억제 효과를 나타내는 막대 그래프. "*"은 p<0.01에서의 유의성을 나타낸다.
도 15. 콜라겐 유발성 관절염 마우스 모델에 vIL-10을 발현하는 DC를 주사하였을때의 질병 진행 억제를 나타낸 그래프.
도 16A-C. 콜라겐 유발성 관절염 모델에서의 DC/IL-10 유래 엑소솜의 치료 효과 분석. (A) Ad.vIL-10이 감염되거나 또는 재조합 마우스 IL-10이 펄스된 DBA1 마우스의 골수 DC에서 엑소솜을 분리하고, CIA 마우스에 투여하였다. (B) 재조합 IL-10을 펄스한 DC 유래의 엑소솜을 두가지 군으로 나누고, CIA 마우스에 투여하기 전에 그중 하나를 동결 및 해동으로 이루어진 주기를 3번 실시하여, 막을 파괴하였다. (C) DC/rmIL-10 유래의 엑소솜을 재조합 마우스 IL-10을 직접 주사하였을때와 비교하여 CIA 마우스에서 테스트하였다. A-C에서, 소의 타입 II 콜라겐으로 면역화하고, LPS를 28일째에 제공한, DBA1 마우스에 정제한 엑소솜을 32일째에 정맥내 주사하였다. 누적치로 표시한 거시적 점수 체계로 주기적으로 마우스를 관찰하였으며, 가능한 최대값은 16이다.
도 17. 처리한 발바닥에 DC/mbmlL-4, DC/mbmlL-4로부터 제조한 엑소솜, DC/Psi5(대조군), DC/Psi5(대조군)로 제조한 엑소솜 또는 염수(대조군)를 주입한, 뮤라인 DTH 모델에서의 발바닥 부기 증가.
도 18. 처리한 발바닥에 DC/smlL-4, DC/smlL-4로부터 제조한 엑소솜(대조군), DC/Psi5(대조군), DC/Psi5로 제조한 엑소솜(대조군) 또는 염수(대조군)를 주입한, 뮤라인 DTH 모델에서의 발바닥 부기 증가.
도 19. 처리한 발바닥에 DC/mbmlL-4, DC/mbmlL-4로 제조한 엑소솜, DC/FasL, DC/FasL로 제조한 엑소솜, DC/Psi5(대조군) 또는 DC/Psi5로 제조한 엑소솜(대조군)을 주입한, 뮤라인 DTH 모델에서의 발바닥 부기 증가.
도 20. 천연형 또는 lpr(Fas -/-) 중 어느 하나로부터 DC를 수득하고, 가용성(smIL-4) 또는 막 결합(mbmIL-4) IL-4 중 어느 하나를 발현하도록 변형시켜 제조 한 엑소솜을 천연형 또는 gld(FasL -/-) 마우스에 주사한, 뮤라인 DTH 모델에서의 발 부기 증가
도 2lA-B. (A) 유전적 동계 또는 (b) 동종이형의 마우스로부터 유래된 막 결합 IL-4 증강된 DC로 제조한 엑소솜을 주사한 후, 뮤라인 DTH 모델에서의 발 부기 증가.
도 22. 천연형 또는 B7.1 및 B7.2 결손(KO) 마우스의 처리한 발(■)에, Ad.Psi5나 IL-4 유전자를 함유하는 아데노바이러스 벡터를 처리한 DC로 제조한 엑소솜을 주입한, 뮤라인 DTH 모델에서의 발 부기 증가를 나타낸 막대 그래프. 무처리한 발의 크기는 □로 나타낸다.
도 23. Ad.psi5 (대조군), Ad.mIL-4 또는 Ad.mbmlL-4로 감염된 DC로 제조한 엑소솜을 처리한, CIA 모델 마우스의 관절염 지수를 나타낸 그래프.
도 24A-B. DC/IL-4-유래 엑소솜을 먼저 처리한 마우스 또는 (B) 제1 개체 유래의 CD11C를 처리한 마우스에서의 DTH 반응
도 25. 염수, 무처리 DC로 제조한 엑소솜 또는 DC/IL-4로 제조한 엑소솜을 처리한 마우스에서의 고혈당증 발생율을 나타낸 그래프.
도 26. 무처리 전 혈청 및 비드를 처리한 전 혈청을 DTH 모델의 마우스에 투여한 지 48시간 후의 발바닥 부기를 나타낸 막대 그래프.
도 27. 혈청, 마이크로소포체 및 KLH 면역 마우스 유래 엑소솜을 이용하여 마우스 발바닥에서의 DTH 억제를 나타낸 막대 그래프.
도 28. 부스트한지 48시간 후에 부기를 측정한 것으로, 다양한 혈청 분획을 이용하여 마우스 발바닥에서의 DTH 억제를 표시한 막대 그래프.
도 29. 부스트한지 48시간 후에 부기를 측정하고 혈청은 KLH 및 OVA 면역 마우스에서 분리한 것으로, 다양한 혈청 분획을 이용하여 마우스 발바닥에서의 DTH 억제를 나타낸 막대 그래프.
도 30. 마우스 혈청에서 분리한 엑소솜의 전자 현미경사진.
도 31. 항-MHC 클래스 II가 있는 비드로 표지된 혈청 유래 엑소솜의 FACS 분석.
도 32. 뮤라인 DTH 모델(DTH는 KLH에 대한 것임)에서의 발 부기 증가를 나타낸 막대 그래프로, 처리한 발에 KLH-면역 마우스의 혈청에서 수집한 엑소솜(그룹 I), (b) 나이브(naive) 마우스 혈청에서 수집한 엑소솜(그룹 II), 또는 (c) 염수(그룹 III)를 주입하였다. 처리한 발은 ■로 나타내며, 반대쪽 발은 □로 나타낸다.
도 33. 뮤라인 DTH 모델(DTH는 KLH에 대한 것임)에서의 발 부기 증가를 나타낸 막대 그래프로, 처리한 발에 (a) KLH-면역 마우스의 혈청에서 수집한 엑소솜, (b) KLH-면역 마우스의 혈청에서 수집하고 항-MHCII 항체에 전 흡착시킨 엑소솜, (c) MHC 클래스 II 양성인 KLH 면역 마우스 혈청에서 수집한 엑소솜, (d) 항-IgG 항체가 미리 흡착된 엑소솜 고갈 대조군 또는 (e) 염수를 주입하였다.
도 34. (a) FasL 결손 gld(FasL -/-) 마우스의 혈청 유래 엑소솜을 천연형 수여체에 투여하거나, (b) 천연형 마우스의 혈청 유래 엑소솜을 천연형 수여체에 투여하거나, (c) gld 마우스의 혈청 유래 엑소솜을 lpr(Fas -/-) 수여체에 투여하 거나, (d) 천연형의 혈청 유래 엑소솜을 lpr 수여체에 투여하거나, 또는 (e) 염수를 대조군으로 투여한 경우에, 뮤라인 DTH 모델에서의 발 부기 증가를 나타낸 막대 그래프.
도 35. 엑소솜 공여 동물을 면역화한후 14일째에 수집한 혈청 유래 엑소솜을 처리하고, 수여체 동물을 면역화한 후 14일째에 투여한, 뮤라인 DTH 모델에서의 발 부기 DTH 증가를 나타낸 막대 그래프.
도 36. 3 그룹: Orthokine® 혈청 1그룹과 트리암시놀론 2그룹에 주사한 후 6번 측정한 VAS 통증을 나타낸 그래프.
도 37. 3그룹: Orthokine® 혈청 1그룹과 트리암시놀론 2그룹에 주사한 후 6번 측정한 SESaff(정동 통증 스케일) 통증을 나타낸 그래프.
도 38. 3그룹: Orthokine® 혈청 1그룹과 트리암시놀론 2그룹에 주사한 후 6번 측정한 SESsens(민감성 통증 스케일) 통증을 나타낸 그래프.
도 39. 3그룹: Orthokine® 혈청 1그룹과 트리암시놀론 2그룹에 주사한 후 4번 측정한 통증 오스웨스트리 스케일( pain Oswestry Score) 통증을 나타낸 그래프.
도 40A-F. Orthokine® 혈청 유래의 엑소솜 다량 함유 분획의 TEM(transmission electron micrograph)((B)는 여과한 혈청의 이미지임).
6. 실시예: 엑소솜 특정화-I
DC 유래 엑소솜의 면역 조절 기능을 확인하기 위해, GMCSF/IL-4에서 고밀도로 배양한 C57BL/6 마우스 골수 전구체로부터 DC를 제조하였다. 이후 DC에 의해 생산된 엑소솜은 분별 원심분리(differential centrifugation)로 배양 배지에서 분리하였고, 전자 현미경, 웨스턴 블롯 및 유세포기로 확인하였다.
6.1 재료 및 방법
마우스: 7-8 주령의 C57BL/6 (H-2Kb) 암컷 마우스 및 DBAI/LacJ (H-2Kq) 수컷 마우스를 Jackson Laboratory(Bar Harbor, ME)에서 구입하였다. 이들 동물은 피츠버그 생물공학 센터(Pittsburgh, PA)의 동물 실험동에서 무균 상태로 사육하였다.
골수 유래 DC의 준비 및 배양: Kim et al., J. Immunol. 166:3499-3505(2001)에 기재된 바에 따라 골수 유래 DC(BMDC)를 준비하였다. 간략하게 설명하면, 골수를 마우스 경골과 대퇴골에서 취하고, 나일론 메쉬를 통과시켜 작은 뼈 조각과 파편들을 제거하였다. 0일째에 혼입된 적혈구는 0.83 M NH4Cl 완충액으로 용해시켰고, 림프구는 Abs 칵테일(RA3-3A1/6.1, anti-B220; 2.43, anti-Lyt2; GK1.5, anti-L3T4; American Type Culture Collection, Manassas, VA) 및 토끼 보체(Accurate Chemical and Scientific, Westbury, NY)를 사용하여 고갈시켰다. 이후, 세포는 완전 배지(CM; 10% FBS, 50 μM 2-ME, 2 mM 글루타민, 0.1 mM 비필수 아미노산, 100 ㎍/ml 스트렙토마이신 및 100 lU/ml 페니실린이 함유된 RPMI 1640)에서 24시간 배양하여, 부착성 대식세포를 제거하였다. 무부착성 세포는 재조합 뮤라인 GM-CSF(1000 U/ml) 및 재조합 뮤라인 IL-4(1000 U/mI)가 함유된 신선한 CM에 1일째에 두었다. 4일간 세포를 배양하고, 5일째에 아데노바이러스 형질전환 또는 재조합 사이토카인 처리를 위해 수확하였다.
아데바이러스 감염시, 24웰 플레이트에 1 x 106 DC/웰로 두고, 총 1 ml의 혈청 결핍성 배지중에 각각의 재조합 아데노바이러스를 5 x 107 PFU로 첨가하였다. 37℃에서 24시간 배양한 후, 세포를 수집하여 PBS로 5회 세정하고, 신선한 배지를 첨가하였다. 감염된 DC와 엑소솜을 회수하고, 대규모 세정하여 동물에 주입하였다.
엑소솜 정제: 기존 방법(Raposo et al., J Exp Med. 183:1161-1172(1996))에 따라, 분별 원심분리한 7일째 BMDC 배양물의 세포 배양 상층액으로부터 엑소솜을 준비하였다. 간략하게 설명하면, 각 BMDC 배양물로부터 회수한 배양 상층액을 300 g (5 mm), 1,200 g(20 mm), 및 10,000 g (30 mm)로 3번 원심분리하여, 세포 및 파편을 제거하였고, 다시 100,000 g로 1시간 원심분리하였다. 과잉의 혈청 단백질을 제거하기 위해, 엑소솜 펠렛을 다량의 PBS로 세정하여 100,000 g에서 1시간 원심 분리한 다음, 이후 연구를 위해 PBS 120 ㎕에 재현탁하였다. 마이크로 브래드포드 단백질 분석(Bio-Rad, CA)으로 엑소솜을 정량하였다. 각 배치는 단백질 함량으로 표준화하였고, 1 ug을 PBS 20 ㎕에 현탁하여 마우스 생체내 연구에 사용하였다. MHC II 흡착을 위해, 세정한 항-마우스 MHC II 상자성 비드(Miltenyi Biotech) 100 ㎕을 미리 희석한 엑소솜(l ㎍/20 ㎕)과 함께 1시간동안 4 ℃에서 서서히 교반하면 서 인큐베이션하였다. 상자체를 분리한 후, 미세원심분리 튜브에 남아있지 않은 분획의 부피를 본래의 부피로 PBS로 조절하였다. 미리 희석한 엑소솜의 동결/해동은 드라이 아이스/에탄올 조에서 3번의 순간 동결로 수행하였고, 이후 37 ℃ 조에서 따뜻하게 하였다. 최종 엑소솜 조제물에 혼입되어 있는 IL-10 및 vIL-10의 농도를 IL-10 ELISA (Endogen)로 측정하였다.
전자 현미경: 분별 원심분리로 엑소솜을 분리하고, 10 ml을 Formvar/carbon 코팅 그리드에 로딩하여, 1% 포스포텅게스틱 산(phosphotungastic acid) 중성 수용액 10 ㎕로 음화 염색한 다음, JEOL- 1210 컴퓨터 조절성 고해상도의 120 kv 투과전자현미경으로 관찰하였다.
단백질 분석: 세포를 CLAP(키모트립신, 렙펩틴(leupeptin), 아프로티닌(aprotinin) 및 펩스타틴(pepstatin), 각 100 μM)가 보충된 10 mM 트리에탄올아민, 1 mM EDTA, 10 mM 아세트산, 250 mM 자당, pH 7.4 중에서 25-G 바늘을 60회 통과시켜 균질화함으로써, 전체 막으로부터 세포질을 분리시켰다. 이를 1,200 g에서 원심분리하여 핵과 세포 파편이 제거된 상층액을 수득하였다. 총 막은 1시간동안 100,000 g로 원심분리한여, 펠렛으로부터 회수하였다. 세포 용해물 lO ㎍ 또는 엑소솜 조제물을 5-20% 구배의 SDS-PAGE로 분리한 다음, 니트로셀룰로스로 이동시키고, 보강된 화학발광 검출 키트(Amersham)를 이용하여 웨스턴 블롯으로 검출하였다.
FACS 분석: FACScan(Becton Dickinson, Sunnyvale, CA)에 의해, 배양한 세포 대부분(60-95%)에서 CD 11b, CD 11c, CD80, CD86, 및 MHC 클래스 I와 클래스 II 발 현 표현형을 분석함으로써, DC를 결정하였다. 펠렛화한 엑소솜 30 ㎍을 최종 30-100 ㎕ 부피로 실온에서 15분간, 4 μm 직경의 알데하이드/설페이트 라텍스 비드(Interfacial Dynamics, Portland, OR) 10 ㎕과 인큐베이션한 후, 1 ml의 PBS 중에서 서서히 교반하면서, 2시간 더 인큐베이션하였다. 이를 100 mM 글리신 중에 30분간 인큐베이션하여, 반응을 중지시켰다. 엑소솜이 코팅된 비드는 FACS 세척 완충액 (PBS 중의 3% FCS 및 0.1% NaN3)으로 3번 세정하여, 500 ㎕의 FACS 세척 완충액에 재현탁하였다. 비드는 각 일차 항체와 1시간 두고, FITC-접합된 이차 항체와 적절한 시기에 인큐베이션한 다음, 세정하고, FACSCaliber (Becton Dickinson, San Diego, CA)로 분석하였다. 데이타 취득 및 분석은 Lysis II FACScan 소프트웨어(Becton Dickinson)로 수행하였다.
6.2 결과
전재전자현미경(whole mount transmission electron microscopy)을 이용한 엑소솜 펠렛의 초미세구조 분석으로, 40-90 nm 직경의 접시 형태의 엑소솜이 현저하게 많다는 것이 확인되었다(도 1A). 웨스턴 블롯 분석에서는, DC 유래 엑소솜이 엑소솜 조합 단백질 CD71 및 Hsp70에 양성인 것으로 확인되었으며(도 1B), Hsp90, 불변 체인(invariant chain) 및 칼넥신(calnexin)과 같이 엑소솜에서 발견되지 않은 단백질에 대해서는 음성인 것으로 확인되었다. 엑소솜 분획의 본래의 소포체 특성을 더욱 확인하기 위해, 동물의 대부분 세포에서 마커 단백질 eGFP를 구성적으로 발현하기 때문에, eGFP/C57 마우스의 BMDC로부터 엑소솜을 정제하였다. 엑소솜 이 매우 다량 함유된 분획을 웨스턴 블롯 분석한 결과, 전장의 eGFP가 유의적인 수준으로 확인되었으며, 이는 가용성 eGFP가 BMDC 유래 엑소솜의 루멘(lumen) 보호 환경내로 캡슐화됨을 의미한다.
DC 유래 엑소솜 분획은 표면 단백질에 대해 유세포기로 더 연구하였다. 100,000 xg 회전시켜 엑소솜을 회수한 다음, 라텍스 비드에 결합시켜 DC 조합성 뮤라인 백혈구 마커 단백질에 대한 여러가지 단일 클론 항체로 염색하였다. 엑소솜 표면은 MHC II에 대해 매우 높은 수준으로 양성을 나타내었으며, MHC I, CDl1C, CD80(B7.1) 및 CD86(B7.2)에 대해서는 보다 중간 정도의 양성 수준을 보였다(도 1C). 이를 종합하면, 이들 데이타는 기존에 개시된 바와 같이(Stoorvogel et al., Traffic. 3:321-330(2002); Raposo et al., J. Exp Med. 183:1161-1172(1996); Kleijmeer et al., Traffic. 2:124-137(2001)), DC 유래 엑소솜에 조합된 단백질 마커를 다수 포함하는 무손상 엑소솜을 농화(enrichment)할 수 있음을 의미한다.
7. 실시예: 엑소솜 특정화 - II
표면 항원: 도 2는 DC 유래 엑소솜의 표면 표현형을 나타내는 FACS 분석 결과이다. 엑소솜은 CD 11b(MHC 클래스 II 분석용) 또는 MHC 클래스 II (IAd) 항체로 코팅된 4.5μm 비드와 인큐베이션하였다. 비드는 엑소솜 크기를 증가시켜 FACS로 검출가능하게 하기 위해 사용하였다. 비드가 코팅된 엑소솜은 해당 단백질에 대한 PE mAb로 표지하였다. 골수 유래 엑소솜은 표 2에 나타낸 표면 항원 뿐만 아니라, CD11c, CD 14, CD54, MFG-E8, CD80, CD86 및 CD9에 대해 양성이었다. 엑소솜의 상 당 비율이 CD11a, CD11b 및 막 결합된 TNF-α에 양성이었으나, CD8-α, CD32, CD49d, CD25, CD40, CD107a(Lamp-1), CD95 및 트레일(Trail)에는 음성이었다. 흥미로운 점은, 엑소솜을 준비한 DC의 일부만 FasL 양성이었음에도 불구하고, 엑소솜의 99%가 FasL(CD178)에 양성이었다. 이러한 결과는, 특정 이론에 결부됨이 없이 FasL이 엑소솜으로 우선적으로 분류됨을 제시하며, 관찰되는 치료 효과를 부여하는데 필수적인 역할을 수행하는 것으로 보인다.
트래픽킹: 도 3A-D는 DC-유래 엑소솜의 생체내 트래픽킹을 나타낸다. BDMC-유래 엑소솜을 PKH67로 표지하여 마우스에 정맥내 주사한 다음, 주사 2시간 후부터 마우스를 분석하였다(Kim et al., J. Immunol. 166:3499-3505(2001)). 표지한 엑소솜은 MOMA- 1+ 대식세포, ER-TRP+ 대식세포 및 비장 변연부(splenic marginal zone)내 CD11c+ DC에서 검출되었다. CD11c+ DC에서, 엑소솜은 Lamp- 1+ 세포내 소포체(endocytic vesicle)와 조합되어 있는 것으로 확인되었다. 또한, 초기에 엑소솜은 CD8-α 네거티브 CD11c+ 세포에 의해 흡수되며, 시간 경과에 따라 표지된 엑소솜에 대해 양성인 CD8-α+ Dc 비율이 증가되었다. 24시간 후, 엑소솜은 T 세포 영역에서 CD11c+ DC 와 조합되어 있는 것으로 보였다. 또한, 엑소솜 양성 DC 분석으로 DC 성숙 마커(IAb, CD86 또는 CD54)를 상향 조절하지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 결과들은 DC 유래 엑소솜이 비장에서 발견되는 미성숙 DC 뿐만 아니라 대식세포에 효과적으로 내재화되며, DC 성숙을 유발하지 않고 DC의 성숙 능력에 영향을 미치지 않는다는 것을 시사한다. 따라서, 이러한 엑소솜 기능 연구 모델은, 비장 및 림프절내 항원 제시 세포 서브세트와 상호작용하여, T 세포 반응을 이후 억제함으로써, 조절성 T 세포 집단을 유발할 수 있다.
8. 실시예: DC/FasL 유래 엑소솜은 면역억제 활성을 갖는다.
"DC/'X""에서, 'X'는 FasL, IL-10, IL-4 등과 같은 물질이며, X를 발현하도록 조작된 수지상 세포 또는 수지상 세포로부터 엑소솜을 제조하기 전에 X에 노출된 DC를 나타낸다.
8.1 DC/FasL 유래 엑소솜은 외인성 FasL을 가진다.
하기 실시예들은 외부 유전자로 형질전환된 DC로부터 분리한 엑소솜에 유전자 산물이 존재함을 입증한다. 특히, DC가 FasL 유전자를 가지는 아데노바이러스 벡터로 형질전환되었을때, DC 유래 엑소솜은 FasL를 가진다.
8.1.1 재료 및 방법
DC 생산: 골수 유래 DC를 기존 문헌에 기재된 바에 따라(Whalen et al., Mol Ther. 4:543-550(2001); Kim et al., J. Immunol. 166:3499-3505(2001); Kim et al., MoI Ther. 6:584-590(2002)) 제조하였다. 간략하게는, 골수를 C57BL/6 마우스의 경골 및 대퇴부에서 채취하였다. 혼입된 적혈구는 용해하고, 림프구는 항체 칵테일(RA3- 3A1/6.1, anti-B220; 2.43, anti-Lyt2; GK1.5, anti-L3T4; 모두 ATCC, MD)로 고갈시켰다. 이후, 세포는 완전 배지(CM)에서 24시간 배양하여, 부착성 대식세포를 제거하였다. 비부착성 세포는 1000 U/ml의 mGM/CSF 및 mIL-4가 포함된 신선한 CM에 두었다. 세포를 4일간 배양한 다음, 수확하여 아데노바이러스 형질전 환를 수행하였다. 아데노바이러스 감염을 위해, 1 X lO6 DC를 5 X 107 PFU 바이러스와 총 부피 1 ml의 혈청 결핌성 배지중에 혼합하였다. 24시간 배양한 후, DC를 철저하게 PBS로 세정하고, 48시간 더 배양하였다. 8일째에, 엑소솜 정제 및 감염된 DC 회수를 위해 배양물 상층액을 수집하였다.
엑소솜 분리: 엑소솜은 기존 방법을 일부 수정하여 분리하였다(Raposo et al., J. Exp Med. 183:1161-1172(1996)). 모든 배양물 상층액을 300 g로 10 분, 1200 g로 20분 및 3000 g로 30 분간 원심분리하였다. 마지막 원심분리에서 수득한 상층액은 100,000 g로 1시간 초원심분리하였다. 엑소솜 펠렛을 염수로 세정하고 100,000 g로 1시간 원시분리한 다음, 염수에 재현탁하였다.
유세포기: DC의 표현형 분석을 위해, DC를 뮤라인 표면 분자(CD11b, CD11c, CD80, CD86, H-2Kb, I-Ab 및 적정 이소타입 대조군)에 대한 PE- 또는 FITC-접합된 단일클론 항체로 염색하였다.
FACS 분석에서, 엑소솜은 실온에서 최종 부피 20 ㎕에서 4 μm 직경의 알데하이드설페이트 라텍스 비드 5 ㎕와 함께 인큐베이션하였다. 이후, 각 비드/엑소솜 샘플에 소 혈청 알부민(BSA) 10 mg을 가하고, 15분 더 인큐베이션하였다. 염수 1 ml을 첨가하고, 서서히 교반하면서 75분간 인큐베이션하였다. 100 mM 글라이신으로 30분간 인큐베이션하여 반응을 중지시켰다. 엑소솜이 코팅된 비드를 항체로 염색하고, FACS 완충액(염수중의 3% FBS (fetal bovine serum) 및 0.1% NaN3)으로 2번 세정한 다음, 400 ㎕의 FACS 완충액에 재현탁하였다. DC와 엑소솜은 FACScan (Becton Dickenson, CA)으로 조사하였다.
전자현미경: 엑소솜을 분별 원심분리로 정제하고, 10 ml을 Formvar/carbon 코팅된 그리드에 주입한 다음, 1% 포스텅가스틱산 중성 수용액 10ml로 음화 염색하여, JEOL-1210 컴퓨터 조절성 고해상도 120 kv 투사전자현미경으로 관찰하였다. 골수 유래 DC가 분리되었다. 5일째에 분리한 DC의 절반에는 Ad.FasL를 감염시켰다. 엑소솜은 상기와 같이 분리하였다.
단백질 분석 및 웨스턴 블롯팅: 엑소솜 5 mg 및 DC 용해물을 12% 소듐 도데실 설페이트(SDS) 폴리아크릴아미드 겔 전기영동(PAGE)하였다. 단백질을 니트로셀룰로스 막(Amersham)으로 블롯팅하였다. 블록킹 후, 막을 항체와 반응시키고, 양고추냉이의 페록시다제와 접촉시킨 다음 보강된 화학발광제(Perkin Elmer Life Science)에 의해 X-레이 필름으로 검출하였다.
8.12 결과
Ad.eGFP 또는 Ad.FasL을 형질전환한 후 1일째에 세정한 후, 감염시킨 뮤라인 DC를 48시간 배양하고, 분별 원심 분리방법으로 상층액으로부터 엑소솜을 분리하였다. 106 뮤라인 골수 DC는 48시간동안 엑소솜 1-2 ㎍을 생산하였다. DC와 분리한 DC 유래 엑소솜은 라텍스-비드가 커플링된 항체와 인큐베이션하고 유세포기로 MHC 및 공동-자극 분자의 존재에 대해 분석하였다. 도 4A-C에 나타낸 바와 같이, Ad.eGFP 및 Ad.FasL로 형질전환한 DC 및 대조군을 형질전환한 DC로부터 유래된 엑소솜은, MHC 클래스 I 및 II 분자, CD11c 및 공동-자극 분자 CD80 및 CD86에 양성 이었다(도 4A). 또한, DC/FasL 및 DC/FasL 유래 엑소솜은 ~40 Kda 인간 FasL 트랜스유전자에 양성인 것으로, 항-FasL 항체를 이용한 웨스턴 분석으로 확인되었다(도 4B). 이러한 결과는, Ad/FasL을 형질전환한 DC 유래 엑소솜은 단백질 분해되지 않은 무손상 FasL 뿐만 아니라, MHC, 공동-자극 분자 및 CD11c를 포함함을 나타낸다. EM에 의한 엑소솜 분획 분석에서, 엑소솜의 특징인 접시 형태의 소포체가 상당수 확인되었다(도 4C).
8.2 FasL이 있는 엑소솜의 국소 투여는 발바닥 부기 분석에서 처리한 발과 반대쪽 발 모두에서 부기 관련 지연성 과민증("DTH")을 경감시킨다.
FasL를 발현하도록 유전학적으로 변형된 DC 및 변형된 DC 유래 엑소솜이 생체내에서 염증을 억제할 수 있는지를 조사하기 위해, DTH 마우스 모델을 활용하였다. 이 모델에서, 특정 항원, 키홀 림펫트 헤모시아닌(keyhole limpet hemocyanin)(KLH) 또는 오발부민(OVA)으로 마우스를 면역화한 다음, 뒷발 발바닥에 상기 특정 항원을 주입하여 면역화한지 10-14일 후에 Th1-매개성 염증 반응을 유발하였다.
8.2.1 재료 및 방법
골수로부터 분리한 다음, Ad.Ψ5 또는 Ad.FasL로 DC를 감염시켰다. 8.1장에 기재된 바와 같이, 엑소솜을 정제하였다.
DTH 모델에 엑소솜 투여: C57BL/6 마우스의 등 한곳에 프레운드 완전 보강제(FCA)에 1:1로 에멀젼화한 100 ㎍ 항원(KLH 또는 OVA)을 주사하여, 감작시켰다. 10일 후, 면역화된 마우스의 한쪽 뒷발 발바닥에 DC 100만개 또는 DC 유래 엑소솜 1 ㎍을 항원을 기회감염시키기 12시간 전에 주사하였다. 반대쪽 발바닥에는 DC 또는 엑소솜 대신에 동량의 염수를 주사하였다. 이후, 마우스의 양쪽 발바닥에 20 ㎕의 염수에 용해한 20 ㎍ 항원을 주사하여, 기회감염시켰다. 발바닥 부기는 기회 감염 후 24, 48 및 72시간 후에 측정하였다. 결과는 항원 부스트 주사 전 및 후 부기 차이(X 0.01 mm)로 나타내었다.
통계 분석: 결과는 Student's t-test 및 분산 분석(analysis of variance)으로 비교하였다.
8.2.2 결과
도 5에 나타낸 바와 같이, DC/FasL 또는 DC/FasL 유래 엑소솜의 전달로 처리한 발바닥 뿐만 아니라 무처리한 반대쪽 발바닥에서도 항원 투여 24, 48 및 72시간 후에 부기가 현저하게 억제되었다. 반면에, DC/Ψ5 또는 대조군 DC 유래 엑소솜을 주사한 경우에는 DTH 반응을 저해할 수 없었다. 이러한 결과는, 유전학적으로 변형된 FasL 발현 DC와 DC/FasL 유래 엑소솜이 처리 발바닥과 반대쪽 무처리 발바닥 모두에 대해 DTH 반응을 억제하는데 동일하게 효과가 있음을 의미한다.
반대쪽 효과는 여러가지 관절염 동물 모델에서 여러가지 다양한 치료 유전자의 생체내 및 생체외에서 관찰되었다(Kim et al., J. Immunol. 164:1576-1581(2000); Whalen et al., J. Immunol. 162:3625-3632(1999); Lechman et al., J. Immunol. 163:2202-2208(1999); Ghivizzani et al., Proc Natl Acad Sci USA. 95:4613-4618(1998); Kim et al., J. Immunol. 166:3499-3505(2001); Ijima et al., Hum Gene Ther. 12:1063-1077(2001); Kim et al., MoI Ther. 6:584- 590(2002); Smeets et al., Arthritis Rheum. 48:2949-2958(2002); Lechman et al., Gene Ther. 10:2029-2035(2003)).
8.3 FasL이 있는 유전적 동계 엑소솜에 의한 지연성 과민증 억제
8.3.1 재료 및 방법
DC 유래 엑소솜이 염증을 억제할 수 있는 기작을 조사하기 위해, 관찰된 효과가 MHC 의존적인지, 그리고 항원 특이적인지를 실험하였다. 엑소솜의 DTH 반응 억제 능력이 MHC 의존적인지를 측정하기 위해, 동종이형의 엑소솜이 생체내에서 DTH 반응을 억제할 수 있는지를 측정하였다. C57BL/6 (H-2b, I- Ab) 마우스의 DC를 유전적 동계 엑소솜의 공급원으로서 사용하였고, Balb/C (H-2d, I- Ad)의 DC는 동종이형 엑소솜의 공급원으로 사용하였다. 유전적 동계 및 동종이형의 DC 유래 엑소솜이 생체내에서 DTH를 억제하는 능력을 조사하기 위해, KLH-면역화한 마우스를 유전적 동계 및 동종이형의 엑소솜과 함께, 양쪽 뒷발에 항원을 주사하기 2시간 전에 양 뒷 발중 하나에 주사하였다. 발바닥의 부기는 48시간 후에 측정하였다.
8.3.2 결과
동종이형의 DC 유래 엑소솜은 DTH 반응을 억제할 수 없었다(도 6). 대조적으로, 유전적 동계 마우스 유래의 Ad.FasL-형질전환 DC 또는 DC/FasL 엑소솜중 어느 하나를 주사한 후, DTH 억제가 관찰되었다. 또한, 유전적 동계 DC/FasL 유래 엑소솜을 국소 처리하면 처리 및 무처리한 반대쪽 발 모두에서 발 부기를 감소시켰다. 또한, 생체내 실험 결과, Exo/FasL 효과는 FasL을 가지는 세포 막 주사로 세포 자살의 광범위한 전파 유발에 의한 것이 아님을 나타낸다.
8.4 FasL가 있는 엑소솜의 지연성 과민증 억제는 MHC 클래스 II 의존적이다.
8.4.1 재료 및 방법
DC 및 엑소솜에 의해 부여된 면역 조절 특성을 보다 더 연구하기 위해, MHC 클래스 I- 및 클래스 II- 결핍성 마우스에서 DC를 준비하고, Ad.FasL 또는 Ad.Ψ5를 감염시켰다. MHC 클래스 I- 및 클래스 II- 결핍성 마우스의 DC/FasL 또는 DC/Ψ5로부터 엑소솜을 분리하고, KLH-면역화한 마우스의 뒷발에 주사하였다.
8.4.2 결과
클래스 I 결핍성 마우스의 유전자 변형 DC 및 DC 유래의 엑소솜을 주사한 경우, 치료 효과 등급에 한계 효과(marginal effect)를 나타내었다(도 7). 그러나, 클래스 II 결핍성 마우스의 FasL 발현 DC 및 DC 유래의 엑소솜 둘다 주사시, 항-염증 치료 효과가 완전히 저지되었다(도 7B). 이러한 결과는 DC/FasL의 치료 효과는 MHC 클래스 I이 아닌 MHC 클래스 II 의존적임을 의미하며, 이는 CD4+ T 세포의 일차적인 DTH 반응 조절 기능과 부합된다(Ptak et al., J. Immunol. 146:469-475(1991)). 더불어, 이 결과는, DC와 유사하게 엑소솜 역시 클래스 I이 아닌 클래스 II가 DTH 반응 조절에 필요함을 의미한다.
8.5 지연성 과민 반응의 엑소솜 매개성 저해는 항원 특이적이다.
8.5.1 재료 및 방법
FasL이 있는 엑소솜이 면역 반응의 항원 의존적 억제를 부여할 수 있음을 입증하기 위해, 마우스를 KLH로 면역화하였다. DC를 준비하여 Ad.FasL 또는 Ad.eGFP를 감염시킨 후, KLH 또는 Ova 단백질 중 어느 하나를 펄스하였다. 여러가지 DC 배양물로부터 엑소솜을 준비하여, KLH를 주입하여 DTH 반응을 유발하기 바로 전에 면역화한 마우스에 주사하였고, 48시간 후에 측정하였다.
8.5.2 결과
도 8에 나타낸 바와 같이, Ad.FasL 감염시킨, KLH 펄스한 DC 유래 엑소솜은 주사한 발과 무처리 반대쪽 발 모두에서 염증을 감소시켰다. 대조적으로, Ova를 펄스한, FasL을 발현하는 DC 유래 엑소솜은 KLH 처리한 Ad.eGFP 감염된 DC 유래 엑소솜과 비슷하게 염증을 꽤 억제할 수 있었다. 이러한 결과는, FasL을 발현하는 DC 유래 엑소솜이 항원 특이적인 방식으로 감염을 억제할 수 있음을 제시한다.
8.6 FasL 결핍성 마우스의 수지상 세포 유래 엑소솜은 지연성 과민 반응을 억제할 수 없었다.
8.6.1 재료 및 방법
DC 및 DC 유래 엑소솜을 천연형 또는 gld(FasL -/-) 마우스에서 분리하여, 대조군 아데노바이러스 또는 FasL을 발현하는 아데노바이러스로 감염시켰다. DC 및 DC 유래 엑소솜을 이미 KLH로 면역화한 천연형 마우스의 등에 주사하고, 12시간 후에 KLH를 발바닥에 주사하였다. 항원 주사 후 발바닥 부기 정도를 측정하였다. 또한, 엑소솜 및 DC 작용에는 수여체 마우스에서 기능성 Fas의 존재가 필요함을 입증하기 위해, 천연형 및 gld(FasL -/- 마우스) 유래 엑소솜도 lpr(Fas-/-) 마우스의 등에 주사하였다.
gld (FasL -/-) 마우스의 DC 및 엑소솜은 주사한 발 및 반대쪽 발에서 DTH 반응을 억제하지 못하였지만, gld DC 및 DC 유래 엑소솜에 Ad.FasL(도 9A)를 형질 전환한 경우에는, 그 효과가 복구되었다. 또한, FasL 함유 엑소솜 뿐만 아니라 DC-FasL은 lpr(Fas -/-) 마우스에 효과가 없었다(도 9B).
8.7 FasL가 있는 엑소솜을 투여하면 콜라겐 유발성 관절염 모델의 질병 심각성이 완화된다.
DC/FasL 유래 엑소솜이 콜라겐 유발성 관절염을 치료할 수 있는지를 입증하기 위해, 엑소솜을 마우스 콜라겐 유발성 관절염 모델에 주사하였다.
8.7.1 재료 및 방법
7 내지 8주령의 DBA/1 lacJ(H-2q) 수컷 마우스를 Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME)에서 구입하여, 피츠버그대 생물공학 센터의 동물 실험동에 무균상태로 사육하였다. 0.05 M 아세트산 중의 2 mg/ml 농도의 II형 소 콜라겐(Chondrex)을 동량의 프레운드 완전 보강체(FCA)로 에멀젼화하여, 마우스 꼬리에 주사하였다.
0 내지 4의 수치 체계에 따라 마우스를 관찰하였다: 1, 홍반을 동반한 관절염 관찰; 2, 현저한 부기 및 발진; 3, 관절에서 발가락까지의 심각한 수준의 부기 및 발진; 4, 부기 최대 및 강직(ankylosis)성 변형(deformity). 육안으로 매긴 수치의 평균은 모든 발에 대한 누적 수치로서 나타내었고, 마우스당 최대값은 16이다(n=7).
DC를 Ad/FasL 또는 Ad/Ψ5로 감염시키고, 감염된 DC에서 엑소솜을 분리하여 II형 소 콜라겐으로 면역화한 DBA 1 마우스에 28일째에 정맥내 주사하였다.
8.7.2 결과
DC/FasL(도 10A) 및 FasL가 있는 엑소솜(도 10B)의 처리로 질병 발병을 지연 시키고 단회 처리 이후에 관절염 진행을 억제할 수 있었지만, Exo/Ψ5 대조군은 DC 대조군 및 염수 대조군에 비해 질병 퇴행에 중간정도의 효과를 나타내었다. 이러한 결과는, FasL 발현 DC로부터 유래된 엑소솜을 1회 주사하는 경우 콜라겐 유발성 관절염을 억제할 수 있음을 시사한다. 유사하게, 질병이 발병된 (28일째) 마우스에 Exo/FasL을 주사하는 경우, 역시 질병이 억제되었다.
9. 실시예: DC/IL-10 유래 엑소솜은 면역억제 활성을 갖는다.
9.1 IL-10이 있는 BMDC 유래 엑소솜의 시험관내 작용
BM-DC 유래 엑소솜의 T 세포 증식 억제 능력을 입증하기 위해, 혼합 백혈구 반응(MLR)에서 DC 유래 엑소솜 첨가 효과를 연구하였다. 잠재적인 면역억제 DC 유래 엑소솜의 공급원으로서, Epstein Barr 바이러스의 IL-10 유전자를 발현하는 아데노바이러스, 바이러스 IL-10(vIL-10)를 형질전환한 BMDC를 사용하였다. vIL-10을 관절내(Intra-articular)로 전달하는 경우, 토끼 항원 유발성 관절염(AIA) 및 뮤라인 콜라겐 유발성 관절염(CIA) 모델 둘다에서(5, 6) 염증이 억제되는 것으로 확인되었다. 대조군으로서, 루시퍼라제(Ad.Luc)를 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질전환된 BM-DC를 사용하였다.
9.1.1 재료 및 방법
벡터 구축 및 아데노바이러스 제조: 바이러스 IL-IO(Ad.vIL-10) 및 증강된 그린 형광 단백질(Ad.eGFP)을 발현하는 아데노바이러스를 구축하고, 증폭시킨 후, 기존의 표준 방법에 따라 역가를 측정하였다(Kim et al., Arthritis Res. 2:293-302(2000)). 간략하게는, DNA, 아데노바이러스-5 유래성, E1- 및 E3-결손 아데노 바이러스 벡본(psi5) 및 pAdlox, 아데노바이러스 셔틀 벡터를 공동 형질감염시킨 후, Cre 재조합효소를 발현하는 293 세포(CRE8 세포)에서의 상동성 재조합으로 재조합 아데노바이러스를 제조하였다. 삽입한 cDNA 서열은 인간 CMV 프로모터하에서 발현된다. 재조합 아데노바이러스는 CsCl 농도 구배 초원심분리로 정제하고, 멸균 바이러스 저장 완충액으로 투석하고, 분주하여 -8O ℃에 사용하기 전까지 보관하였다. CRE8 세포를 증식시켜, 10% 소태아 혈청이 첨가된 DMEM(Life Technologies, Gaithersburg, MD)에 유지시켰다.
혼합 백혈구 반응: 시험관내 마이크로 배양하기 위해, 둥근 바닥의 96웰 플레이트에서 BALB/c 마우스의 비장으로부터 T 세포를 정제하였다. 각 웰에 5 x 104 비장의 T 세포를 접종하고, 대조군인 C57BL/6 유래 DC 또는 유전적으로 변형된 C57BL/6 유래 DC(vIL-10, rIL-10 또는 루시퍼라제) 또는 이로부터 분리한 엑소솜 중 어느 하나를 가하였다. 5:1, 10: 1 , 20: 1 및 40: 1의 T 세포:DC 비로 DC를 T 세포에 첨가하였다. 배양 5일째에, 1 μCi의 3H-티미딘을 수확하기 16시간 전에 첨가하였다. 증식성 T 세포의 방사능 표지는 마이크로플레이트 Beta 카운터(Wallac, Truku, Finland)로 측정하였다.
9.1.2 결과
MLR에 첨가시, Ad.vIL-10로 형질전환된 DC는 3H 티미딘 병합으로 측정한 바에 따라 T 세포 증식을 거의 완벽하게 억제할 수 있었지만, 형질전환되지 않은 DC를 첨가한 경우에는 거의 또는 전혀 효과가 없었다(도 11A). Ad.vIL-10로 형질전 환된 BM-DC에서 분비된 엑소솜은 T 세포 증식을 4배수로 감소시켰다(도 11B). 이러한 결과는, 면역억제성 vIL-10을 발현하는 DC로부터 분리한 엑소솜이 T 세포 증식을 차단할 수 있으며, 비변형 BMDC 유래 엑소솜은 그 자체로도 일부 항-염증 특성을 가질 수 있음을 시사한다.
9.2 IL-10이 존재하는 엑소솜은 지연성 과민증 모델에서 염증을 억제한다.
BM-DC 유래 엑소솜의 생체내 항-염증 효과를 입증하기 위해, C57BL/6 마우스의 지연성 과민증 모델을 사용하였다. 이 모델은 기존에 뒷발 발바닥 한쪽에 Ad.vIL-10을 주사하면 주사한 쪽과 반대쪽 모두에서 염증이 억제되는 결과를 확인하는데 이용하였었다. 또한, DTH 모델에서 국조 Ad.vIL-10 전달 이후에 관찰된 반대쪽 효과가 내인성 APC에 의해 부여된다는 것이 입양 형질전환(adoptive transfer) 실험으로 입증되었다. 감작한 마우스 군의 우측 뒷발 발바닥에 무처리 또는 유전자 변형시킨 DC나, 또는 이들 세포의 배양 배지에서 유래한 엑소솜을 주사하였다. 반대쪽 발바닥에는 동일 부피의 염수를 주사하였다. 12시간 후에, 각 발바닥에 20 ㎍의 KLH을 감염시키고, 이후 24, 48 및 72 시간째에 발바닥 부기를 관찰하였다.
9.2.1 재료 및 방법
지연성 과민증: 0일에, 마우스에 프레운드 완전 보강체(Difco, Detroit, MI)에 1:1로 에멀젼화한 항원(OVA) 100 ㎍을 피하 주사하여, 마우스를 감작시켰다. 2주후, 감작시킨 마우스의 한쪽 뒷발에 1 x 106 처리 DC(50 ㎕의 PBS) 또는 각 DC 실 험군 유래 1 ㎍ 정제 엑소솜(50 ㎕의 PBS) 중 어느 하나를 주사하였다. DC 실험군은 Ad.루시퍼라제 50 moi로 형질전환된 DC와 Ad.vIL-10 50 moi로 형질전환된 DC를 포함한다. 반대쪽 발바닥에는 동일 부피의 염수를 주사하였다. 1일 후, 마우스 양쪽 뒷발 발바닥에 PBS 50 ㎕에 용해한 항원 20 ㎍을 감염시키고, 스프링식 캘리퍼(spring loaded caliper) (Dyer Co. Lancaster, PA)로 24시간, 48시간 및 72시간 후에 측정하였다. 결과는 부기로 인한 크기 차이로 나타내었다(mm x lO-2).
통계 분석: 모든 데이타는 마이크로소프트 엑셀 소프트 프로그램으로 분석하였다. 그룹 비교는 student's t test 및 ANOVA로 수행하였다.
9.2.2 결과
도 12에 나타낸 바와 같이, 염수 대조군 동물에서의 DTH 반응은 급성이었으며, 발 두께는 평균 2 mm 증가하였다. 그러나, Ad.vIL-10 형질전환 BM-DC를 1 x 106으로 주사한 마우스의 발바닥 부기가 50% 이상으로 감소하였다. 염증 감소(40%) 또한 이들 동일 모델의 염수 처리한 반대쪽 발바닥에서 관찰되었다. 흥미로운 점은, Ad.vIL-10 형질전환 BMDC 유래 분비성 엑소솜을 1 ㎍ 주사한 경우, 보다 보호적이었으며, 놀랍게도 염수 대조군 마우스에 비해 부기가 65%로 억제되었다. 나아가, Ad.vIL-10/엑소솜 처리한 관절의 반대쪽 발바닥에서도 현저한 감소가 관찰되었다(도 9A). Ad.Luc/DC, Ad.Luc/엑소솜, 무처리 DC 또는 무처리 DC 유래 엑소솜을 처리한 후 발바닥 부기는 현저하게 감소되지 않았다. 이러한 결과들은, Ad.vIL-10로 형질전환된 BMDC에서 유래한 엑소솜을 감작한 마우스에 국소 전달하였을때 처리 한 쪽과 처리하지 않은 반대쪽 발바닥 모두에서 DTH를 억제할 수 있음을 제시한다.
9.3 재조합 IL-10를 처리한 DC 유래 엑소솜은 면역을 억제한다.
9.3.1 재료 및 방법
상기에서 실시한 실험들을 통해 Ad.vIL-10 형질전환 DC에서 유래된 엑소솜이 면역억제성이 있는 것으로 제시되었지만, 소량의 Ad.vIL-10 또는 vIL-10 단백질이 엑소솜 조제물에 혼입되어 있을 수 있다. 아데노바이러스 감염이나 vIL-10 단백질 혼입물이 관찰된 효과에 기여하지 않는다는 것을 확인하기 위해, BM-DC 배양시에 24시간동안 재조합 뮤라인 IL-10을 1 ㎍/ml으로 처리하였고, 제조한 엑소솜을 지연성 과민증 C57BL/6 마우스 모델에 사용하여 실시예 9에 기재된 바와 같이 생체내 실험을 수행하였다(도 12B).
9.3.2 결과
재조합 뮤라인 IL-10을 처리한 DC에서 유래한 엑소솜은 기회감염 48시간 후에 강력한 면역억제 효과를 나타내어, 처리한 발의 부기가 6배 감소하였고, 무처리한 반대쪽 발의 부기는 3배 감소하였다. 이를 종합하면, 이러한 결과는 뮤라인 IL-10을 처리한 BMDC 유래의 엑소솜은 처리 및 무처리 반대쪽 발바닥 모두에서 DTH를 억제할 수 있으며, 사실상 아데노바이러스 혼입은 이러한 효과를 위한 메카니즘으로서 인정되지 않음을 의미한다. 또한, 재조합 IL-10 단백질은 ELISA로 엑소솜 제조물에서 검출되지 않는다는 점도 중요한 주지할 만한 일이다.
9.4 막 교란은 엑소솜의 면역억제력 소실을 야기한다.
9.4.1 재료 및 방법
농화된 100,000 X g 펠렛 분획에 존재하는 엑소솜이 DTH 모델에 치료 효과를 부여하는데 중요한지를 확인하기 위해, 효능에 있어 무손상 엑소솜 입자의 요건을 조사하였다.
DC 또는 Ad.루시퍼라제나 Ad.vIL-10으로 형질전환된 DC를 분리하여, 동결/해동을 4번 실시하였다. 이 조제물 5 ㎍을 SDS-PAGE 분석으로 분리시켜, Hsc 70에 대해 블롯을 수행하였다.
엑소솜이 DTH 반응을 억제하는데 무손상 막을 요건으로하는지를 테스트하기 위해, 무손상 또는 동결/해동시킨, Ad.vIL-10으로 형질전환된 DC 유래의 엑소솜 1 ㎍을 KLH 면역화된 마우스의 뒷발 한곳에 주사하였다(도 10C). 24시간 후, 각 발바닥을 KLH로 부스트 접종한 후 발바닥 부기 정도를 측정하였다.
9.4.2 결과
완전한 엑소솜을 동결/해동으로 이루어진 4번의 주기로 교란된다는 것은 전자 현미경으로 확인되었다(도 13A). 실제, 가용성, 엑소솜 조합 단백질 Hsc 70은 동결/해동 처리된 엑소솜 분획에서 검출되지 않았지만, 무처리 엑소솜에서는 조합되어 있었다(도 13B).
발바닥 부기의 감소는 무손상 exo/vIL-10 처리 군에서 관찰되었지만, 동결/해동 처리한 exo/vIL-10을 주사한 군에서는 발 부기 감소는 관찰되지 않았으며, 이는 염수를 처리한 대조군이나 대조군 DC 유래 엑소솜을 처리한 대조군과 유사하였다. 이러한 결과는, 여러회의 동결/해동이 엑소솜의 막 구조를 교란시키고, 따라 서, DTH 모델에서 엑소솜의 면역억제력을 소거시킴을 의미한다.
9.5 MHC 클래스 II 함유 엑소솜은 지연성 과민증 반응의 억제에 필수적이다.
하기 결과는 MHC 클래스 II 양성 엑소솜의 고갈이 DTH 반응 억제에 미치는 영향을 실험한 것이다.
9.5.1 재료 및 방법
Ad.vIL-10으로 형질전환된 BMDC를 감작된 마우스에 주사하기 전에 전처리를 위한 4가지 샘플로 나누었다(도 14A). 제1 엑소솜 샘플을 뮤라인 MHC II (Exo/vIL-10(MHC II IP))에 특이적인 상자성 비드에 흡착시키고, 제2 샘플은 DC 유래 엑소솜에는 없는 세포 표면 분자인 NKl.1(ExoML-lO(IP 대조군))에 특이적인 상자성 비드에 흡착시켰다. 제3 샘플은 여러번 동결/해동(Exo/vIL-10(F/T))를 수행하였고, 제4 샘플은 무처리한채 두었다. 엑소솜 샘플을 이후 마우스의 뒷발 한곳에 주사하고, 12시간 후부터 72시간 동안 양쪽 뒷발에서의 DTH 유발성 발바닥 부기를 측정하였다.
9.5.2 결과
대조군 DC 유래 엑소솜은 발바닥 부기에 효과가 없었지만, Ad.vIL-10/엑소솜은 처리 및 무처리 반대쪽 발바닥 모두에서 DTH 반응을 드라마틱하게 차단시킬 수 있었다. NK1.1 비드에 흡착시킨 엑소솜 조제물은 면역억제 활성을 나타내었다. 그러나, 클래스 II 비드에 흡착시킨 Ad.vIL-10/엑소솜 샘플은 생체내 활성을 거의 100% 저지하였다. 중요하게는, 실제 상자성 비드를 결합된 클래스 II 양성 엑소솜과 함께 주사하는 경우, 무흡착 Ad-vIL-10 엑소솜과 함께 처리한 경우에서 관찰되 는 결과와 유사한, 면역억제 활성을 나타내었다. 재조합 마우스 IL-10 단백질을 처리한 DC 유래의 엑소솜은 MHCII 고갈 이후에 유사한 DTH 반응 결과를 보였다(도 14B). 이러한 결과들은 서로 부합된다. 수차례의 동결/해동 과정을 수행한, Ad-vIL-10- 또는 재조합 IL-10-처리 DC로부터 유래한 엑소솜은 활성을 상실하였다(도 13C). 이러한 데이타는, 마우스에 엑소솜 분획 투여시 보여지는 생체내 항-염증 효과가 MHC 클래스 II 의존적임을 시사한다. MHC 클래스 II는 엑소솜 표면에 높은 수준으로 존재하므로, 마우스에서 보여지는 생체내 활성은 엑소솜 때문임을 제시한다. 나아가, 완전한 소포체 역시 요구된다. 이러한 생체내 항-염증 효과는 또한 구조적으로 무손상 MHC 클래스 II 양성 엑소솜에 특이적인 것으로 보이며, 실제 아데노바이러스 혼입은 상기 효과에 대한 기작에서 제외된다.
9.6 IL-10가 존재하는 엑소솜은 마우스에서 콜라겐 유발성 관절염을 억제한다.
9.6.1 재료 및 방법
소의 II형 콜라겐(Chondrex L.L.C., Redmond, WA)을 0.05 M 아세트산에 2 mg/ml 농도로 4 ℃에서 철야 교반하여 용해시키고, 동일 부피의 프레운드 완전 보강체(CFA) 중에 에멀젼화하였다. 마우스의 꼬리에 콜라겐 lOO ㎍을 경피 주사하여 면역화하였다. 일차 접종 후 21일째에, 프레운드 불완전 보강체(IFA) 중의 II형 콜라겐을 부스터 경피 접종하였다. 이후, 0 내지 4의 육안 수치 체계에 따라 이틀에 한번씩 마우스를 관찰하였다: 0 = 정상; 1 = 홍반을 동반한 관절염 검출; 2 = 현저한 부기 및 발진; 3 = 관절에서 발가락까지의 심각한 수준의 부기 및 발진; 4 = 부기 최대 및 강직(ankylosis)성 변형(deformity). 육안으로 매긴 수치의 평균은 모든 발에 대한 누적 수치로서 나타내었고, 마우스당 최대값은 16이다. 각 발의 두께는 스프링식 캘리퍼로 측정하였고, 각 마우스의 발 부기는 4개의 발 모두에서의 두께를 더하여 계산하였다. 생체내 실험은 그룹당 10마리의 마우스를 이용하여 실시하였고, 재현성을 위해 2회 반복하였다.
류마티스 관절염(RA)은 말단 가동관절(distal diarthroidial joint)의 만성적인 염증 및 진행성 연골 조직 파괴를 특징으로 하는 쇠약성 자가면역질환이다. 유사한 병리상태와 관절 염증은 소의 II형 콜라겐을 주사한 DBAl /lacJ(H-2kq) 주에서 유도할 수 있다. DC 및 DC 유래 엑소솜의 콜라겐 유발성 관절염 치료 능력을 조사하기 위해, DC를 Ad-vIL-10으로 형질전환하고, 엑소솜을 수득하여 소의 II 형 콜라겐으로 면역화한 DBAl 마우스에 정맥내 주사하였다. 주사는 질병 발병 개시 바로 직전인, 28일째에 수행하였다.
9.6.2 결과
DC/vIL-10나 DC/vIL-10 유래 엑소솜 중 어느 하나를 1회 주사하면 관절염의 발병을 지연할 수 있고 심각도를 낮출 수 있지만, 염수를 주사한 대조군에서는 정상적으로 질병이 진행되었다(도 15). 이러한 결과는, IL-10을 발현하는 DC로부터 유래된 엑소솜을 1회 주사하면, 유전자 변형된 DC를 주사한 경우와 상응하게, 자가면역성 염증 질환의 전신 치료 효과를 부여할 수 있음을 시사한다.
질병 예방 연구에서 DC 유래 엑소솜 분석과 더불어, DC-IL-10 유래 엑소솜을 CIA가 발병된 마우스에서 실험하였다. Ad.vIL-10-형질전환 또는 재조합 IL-10-처 리 DC에서 유래된 엑소솜을 질병이 있는 마우스에 정맥내 주사하였다(도 16A-C). exo-IL-10-처리군에서 질병 억제는 이전 연구에서 보여진 결과보다 낮았지만, Ad.vIL-10 형질전환 및 재조합 IL-10-처리 DC는 발생된 질병의 심각도를 감소시킬 수 있었다(도 16A). 또한, 엑소솜의 동결/해동 처리는 치료 효과를 방해하지만(도 16B), 재조합 IL-10의 직접 주사는 질병 경과에 효과가 없었다(도 16C).
10. 실시예: DC/IL-4 유래 엑소솜은 면역억제 활성을 갖는다.
10.1 DC/mbmIL-4 및 그로부터 제조된 엑소솜은 지연성 과민 반응을 억제한다.
수지상 세포를 IL-4(Ad.mbmIL-4)의 막 결합형을 가지고 있는 아데노바이러스 벡터나 또는 음성 대조군 바이러스(Ad.Psi5 또는 Ψ5)로 형질감염시켰다. 이들 DC 일부로, 엑소솜을 제조하였다. DC 및 엑소솜을 전술한 마우스 발바닥 DTH 모델에서 테스트하였다. 그 결과는 도 17에 나타낸다. DC/mbmIL-4 및 DC/mbmIL-4에서 제조한 엑소솜 모두 주사한 발과 그 반대쪽 발 모두에서 DTH 반응을 억제하였으며, 이는 증강제로서의 막 결합성 IL-4의 효능을 입증한다.
10.2 DC/smIL-4 및 그로부터 제조한 엑소솜은 지연성 과민반응을 억제한다.
수지상 세포를 IL-4 (Ad.sIL-4)의 가용성 형태를 가지고 있는 아데노바이러스 벡터 또는 음성대조군 바이러스(Ad.Psi5 or Ψ5) 중 어느 하나로 형질감염시켰다. 이들 DC 일부로, 엑소솜을 제조하였다. DC 및 엑소솜을 전술한 마우스 발바닥 DTH 모델에서 테스트하였다. 그 결과는 도 18에 나타낸다. DC/smIL-4 및 DC/smIL-4에서 제조한 엑소솜 모두 주사한 발과 그 반대쪽 발 모두에서 DTH 반응을 억제하였으며, 이는 증강제로서의 가용성 IL-4의 효능을 입증한다.
10.3 DC/mbmIL-4 및 그로부터 제조한 엑소솜 뿐만 아니라 DC/FasL 및 그로부터 제조한 엑소솜은 지연성 과민 반응을 효과적으로 저해하였다.
10.3.1 재료 및 방법
Ad.eGFP 대조군 벡터, Ad.FasL 또는 IL-4의 막 결합 형태를 가지고 있는 아데노바이러스 벡터(Ad.mbIL-4)를 감염시키거나, 감염시키지 않은 C57/BL6 골수 유래 DC에서, 엑소솜을 분리하였다. 정제한 엑소솜(총 단백질 1 ㎍)과 여러가지 DC 집락(5 x 105 cells)을 KLH에 대해 면역화된 마우스 오른쪽 발바닥에 주사하였다. 엑소솜 또는 DC 주사후 24시간이 지난 후, KLH 항원을 우측 및 좌측 발바닥에 주사하고, 48시간동안 처리한 발바닥과 그 반대쪽인 왼쪽 발바닥의 부기 정도를 측정하였다.
10.3.2 결과
FasL 또는 IL-4 변형된 DC에서 유래된 엑소솜 분획이 DTH 반응 저해에 효과적인지를 확인하기 위해, C57/BL6에서 DC를 분리하고, 아데노바이러스 감염에 의해 FasL 또는 IL-4를 발현하도록 유전자 변형하였다. 이 실험에서, IL-4에 융합된 CD28의 막-스패닝 부위를 함유하고 있는 IL-4의 막 결합 버전을 사용하였다(mbmIL-4). DC와 엑소솜 분획을 우측 뒷다리 발바닥에 주사하고, 24시간 후에 뒷다리 양쪽 발바닥 모두에 항원을 주사하였다. 흥미롭게도, DC와, Ad.FasL 및 Ad.mbmIL-4 감염된 DC로부터 유래된 엑소솜은 처리한 발 뿐만 아니라 반대쪽 발에서도 염증 반 응을 억제할 수 있었다(도 19). 이러한 결과는, 엑소솜과 그 모체인 DC가 항원 특이적인 메카니증을 통해 국소 주사후 전신성 면역억제를 부여할 수 있음을 시사한다. 특정 이론에 결부되지 않고, 엑소솜은 특이 항원을 프로세스하는 드레이닝 림프절(draining lymph node)내에서 항원 지세 세포와 생체내에서 상호작용할 수 있으며, 그 결과 항원 특이적으로 억제된다.
10.4 DC/IL-4 유래 엑소솜은 FasL과 Fas를 필요로 한다.
DC를 천연형 및 gld(FasL -/-) 마우스에서 분리하고, 가용성(smIL-4) 또는 막 결합성(mbmIL-4) 뮤라인 IL-4 중 어느 하나를 발현하도록 유전자 변형하였다. DC 집락과 DC 유래 엑소솜을 천연형 또는 lpr (Fas -/-) 마우스 중 어느 하나에 발바닥으로 주사하고, 항원을 발바닥에 주사한 후 발 부기에 대한 효과를 측정하였다.
DC/IL-4(막 결합형 또는 가용형 중 어느 하나)로부터 분리한 엑소솜은 DTH 반응을 억제하는데 수여체에서 FasL와 Fas를 필요로 한다(도 20).
10.5 유전적 동계가 엑소솜 면역억제에 필요하다.
도 21A-B에 나타낸 바와 같이, 동종이형이 아닌 유전적 동계의 DC/mbmIL-4에서 제조한 엑소솜만이 뮤라인 발바닥 모델에서 DTH 반응을 억제하는 것으로 관찰되었으며, 이는 엑소솜 매개성 면역억제에서의 MHC 클래스 II 항원의 역할과 부합된다.
10.6 DC/IL-4 유래 엑소솜은 B7.1과 B7.2을 필요로 한다.
10.6.1. 재료 및 방법
DC를 B7.1 및 B7.2 (KO)가 모두 결핍된 마우스로부터 분리하고, 대조군(Psi-5)이나 IL-4 발현성 아데노바이러스 벡터 중 어느 하나를 감염시켰다. 여러가지 DC 집락으로부터 엑소솜을 분리하여, KLH에 대해 면역화된 마우스의 한쪽 발에 (엑소솜 1 ㎍)을 주사하였다. 처리 및 무처리 발에서의 발 부기 정도를 측정하였다.
10.6.2 결과
도 22에 나타낸 바와 같이, 아데노바이러스 유전자 형질전환에 의해 IL-4를 발현하도록 변형된 천연형 DC로 부터 유래된 엑소솜은 DTH 반응을 억제할 수 있었지만, B7.1/B7.2 더블 GKO("KO") DC로부터 유래된 엑소솜은 DTH 반응에 효과가 없었다. 또한, B7 결핍성 DC는 B7 결핍성 DC 유래 엑소솜에서 관찰되는 결과와 유사하게, DTH 반응에 효과가 없었다. 당뇨병 억제를 위한 T 조절 세포의 유도에서 유사한 B7 요건이 Lohr et al., 2003, Nature Immunol. 4:664에 보고된 바 있다.
나아가, 면역억제성 DC 및 DC 유래 엑소솜은, 조절성 T 세포 집단으로 나타낼 수 있는 T 세포의 CD4+CD25+ 집단을 자극하는 것으로 관찰되고 있다.
10.7 DC/IL-4 유래 엑소솜은 콜라겐 유발성 동맥염 모델에서 관절염을 완화한다.
10.7.1 재료 및 방법
Ad.psi-5(대조군), Ad.mIL-4, 또는 Ad.mbmIL-4 중 어느 하나로 감염 또는 모의 감염시킨 DBAl 골수 유래 DC에서 엑소솜을 분리하였다. 엑소솜(총 단백질 1 ㎍)을 질병 발병 후(32일) DBA1 마우스에 정맥내 주사하였다. 각 발의 관절염 심각도를 한달간 각 처리군에서 관찰하였다(스케일 0-4, 최대값은 16).
10.7.2 결과
도 23에 나타낸 바와 같이, DC/IL-4, 특히 DC/mbmIL-4로부터 제조한 엑소솜을 처리한 경우, 질병(32일째에, 테스트한 동물 모두에서 질병 상태 신호를 보임)의 진행을 차단할 수 있었다. 처리한 마우스들 중 일부는 완치된 것으로 보였다.
11. 면역억제 활성의 입양전달(ADOPTIVE TRANSFER)
도 24A-B에 나타낸 바와 같이, 엑소솜 처리 마우스로부터 CD11C 세포의 입양전달은 DTH 반응을 차단할 수 있으며, 이는 CD11C 양성 세포가 면역억제성 엑소솜에 의한 조절에 표적임을 의미한다.
12. 뮤라인 당뇨병 모델에서의 엑소솜 매개의 고혈당 억제
12.1 재료 및 방법
Ad.IL-4를 감염시키거나 또는 감염시키지 않은 어린 NOD 마우스의 골수에서 DC를 수득하였다. DC 집단으로부터 엑소솜을 분리하고, 엑소솜 1 ㎍을 5-6주령의 NOD 마우스에 정맥내 주사하였과 대조군은 염수를 처리하였다 이후, 동물의 고혈당증을 관찰하였다.
12.2 결과
CIA 마우스 모델에서 관찰된 현저한 치료 효과를 토대로, DC의 면역억제력을 고혈당증 발병 차단 활성으로 테스트하였다. 어린 NOD 마우스(3-4주령)의 IL-4를 발현하도록 변형시킨, 골수 유래 DC를 정맥내 주사하면, 10주령에 투여하면 고혈당증이 되는 NOD 마우스의 비율을 낮추는 것으로 관찰되었다. 또한, NF-κB 저해제(이중 가닥의 NF-κB 데코이 올리고뉴클레오티드)를 처리한, 보다 미성숙 DC 표현 형(CD80, CD86 및 CD40 저)을 형성하는, NOD 마우스의 골수 유래 DC를 처리하면, NOD 마우스에서 고혈당증의 발병을 억제할 수 있는 것으로 확인되고 있다. 이러한 결과는 CIA 모델에서의 결과와 일치되게, FasL을 발현하는 유전자 변형 DC가 이자선염(insulitis) 초기 단계에 투여되는 경우에, NOD 마우스에서의 고혈당증 발병을 억제하는 것으로 확인되고 있다(J. Mountz). 따라서, IL-4 또는 FasL 중 어느 하나를 발현하는 변형된 면역억제성 DC, 또는 NF-κB 저해제로 처리된 DC는 질병을 예방 또는 회복시킬 수도 있다.
도 25에 나타낸 바와 같이, 전술한 실험들에서, Ad.Il-4 형질전환 DC로부터 유래된 엑소솜은 NOD 마우스에서의 고혈당 발병을 지연할 뿐만 아니라 발병 빈도를 낮출 수 있었다.
13. 실시예: 혈청으로부터 엑소솜 제조
13.1 혈청 적용은 DTH 반응을 억제한다.
13.1.1 재료 및 방법
C57BL6 마우스를 KLH를 경피 주사하여 면역화하였다 2주 후, 마우스에서 채혈하였다. 이를 10분간 1500 g로 원심분리하여 혈청을 분리하였다. 총 50 ㎕의 혈청을 KLH로 면역화시킨 마우스의 뒷발에 주사하고, 24시간 후에 뒷다리 양쪽에 KLH 항원을 부스트 주사하였다. 발바닥의 부기는 KLH 부스트 주사 후 48시간에 측정하였다.
13.1.2 결과
나이브 마우스 혈청을 24시간 동안 비드와 인큐베이션한 후 주사하였을때, 염수 처리한 대조군에 비해 부기가 일부 감소된 것으로 확인되었다(도 26, I 군). KLH 면역화된 마우스의 혈청을 비드와 인큐베이션하지 않고 주사한 경우, 염수 대조군에 비해 발바닥 부기가 가장 많이 감소되었다(도 26, II군). KLH 면역 마우스 혈청을 인간 및 마우스에서 분리할 수 있는 혈청 양에 적합한 소형 주사기인, Minikin과 같이, 또는 첨가하지 않고, 인큐베이션 한 후 이를 주사한 경우, 염수 처리 군에 비해 부기가 일부 감소되는 것으로 관찰되었다(도 26, III 및 IV 군 참조).
13.2 혈청 유래 엑소솜은 DTH 반응을 억제한다.
13.2.1 재료 및 방법
KLH를 경피 주사하여 마우스를 면역화하였다. 2주 후 채혈하여 4시간동안 냉장하였다. 이를 10분간 1500 g로 원심분리하여 혈청을 수득하였다. 분별 원심 분리로 엑소솜을 분리하였다. 수집한 혈청은 1500 g로 20분, 3000 g로 30분 원심분리하였다. 마지막 원심분리에서 수득한 상층액을 초원심분리기로 1시간동안 100,000 g로 다시 원심분리하였다. 엑소솜 펠렛은 염수로 세정하고, 1시간동안 100,000 g로 원심분리한 다음, 염수에 재현탁하였다.
염수 1 ㎕ 중의 엑소솜 1 ㎍을 KLH 면역 마우스의 뒷 발에 주사하였다. 다른 뒷 발에는 동량의 염수를 주사하였다. 24시간 후, 양쪽 뒷 발에 염수 50 ㎕ 중의 KLH 항원 20 ㎍을 주사하였다. KLH 부스트 접종 후 48시간 후에 발바닥의 부기를 측정하였다.
간략하게는, 각 BMDC 배양물로부터 회수한 배양 상층물을 3번의 연속 원심분 리, 300 g (5 분), 1,200 g(20분) 및 10,000 g (30분)하여, 세포와 파편을 제거하였고, 다시 1시간동안 100,000 g에서 원심분리하였다. 과잉의 혈청 단백질을 제거하기 위해, 엑소솜 펠렛을 다량의 PBS로 세정하여 100,000 g에서 한시간 원심분리한 다음, 최종적으로 이후 연구를 위해 PBS 120 ㎕에 재현탁하였다.
미세소포체를 수득하기 위해, 혈청을 3,000 g(20분) 및 10,000 g (30분) 스핀하고, 펠렛을 염수에 재현탁하였다. 초원심분리하여, 엑소솜 펠렛이 배제된 혈청의 상층액을 수득하였다. 상층액은 이후의 원심분리에 사용하지 않았다.
13.2.2 결과
혈청의 미세소포체, 혈청의 엑소솜 및 KLH 면역 마우스 유래 전체 혈청을 투여하면, 나이브 마우스 유래 혈청이나 염수 처리한 대조순을 DTH 마우스에 투여한 경우에 비해, 부기가 감소되었다(도 27). 엑소솜이 가장 현저하게 부기를 감소시켰으며, 전체 혈청을 사용하는 경우보다 상당히 감소되었다(도 27, II 군). KLH 면역 마우스 혈청의 엑소솜은 상층액, 동결/해동 엑소솜 및 KLH 면역 마우스 유래 초음파처리한 엑소솜에 비해, 보다 현저하게 부기를 감소시켰으며, 비-면역 마우스 및 염수 처리 대조군의 상층액 및 엑소솜에 비해 부기 감소 정도가 우수하였다(도 28). VII 군은 미-면역 마우스의 전체 혈청을 처리한 것이다. VIII 군은 염수를 처리한 대조군이다. KLH 면역 마우스의 혈액으로부터 유래된 엑소솜 투여시, OVA 면역 마우스의 혈청 유래 엑소솜에 비해 부기 감소 정도가 매우 우수하였다(도 29).
13.3 혈청 유래 엑소솜은 항원 특이적이며 MHC 클래스 II 의존적인 양상으로 지연성 과민 반응을 억제한다
도 30은 마우스 혈청으로부터 정제한 엑소솜의 전자 현미경사진이다 도 31은 항-MHC 클래스 II 항체를 가지고 있는 비드로 표지한, 혈청 유래 엑소솜의 FACS 분석 결과이다. 클래스 II 양성 엑소솜 모두 CD178(FasL)에 양성인 것으로 확인되었다.
도 32에 나타낸 바와 같이, KLH 면역 마우스의 혈청에서 제조한 엑소솜은 DTH 억제에 효과적이지만, 나이브 마우스 혈청으로 제조한 엑소솜은 그렇지 않아, 항원 특이성이 설명되었다. 도 33은 MHC 클래스 II 항원을 가지고있는 엑소솜이 고갈된 혈청 유래 엑소솜 조제물이 모든 면역억제 활성을 필수적으로 상실함을 나타낸다. 도 34는 혈청 유래 엑소솜의 면역억제 효과가 항원으로 면역화한 후 14일째에 피크를 이룸을 나타낸다.
14. 혈청 유래 엑소솜은 인간에게서 면역억제성을 나타낸다.
14.1 인터루킨-1 수용체 길항제-컨디셔닝한 혈청(ORTHOKINE®)은 요추 통증(LUMBAR RADICULAR PAIN)을 감소시킨다.
무작위 이중 맹검 연구를 수행하여 IL-1R 길항제 컨디셔닝한 혈청의 요추 통증 감소 효과를 84명의 환자를 대상으로 평가하였다. 데이타는 상기 커디셔닝한 혈청으로부터 유래된 엑소솜을 통증 감각 경감에 사용할 수 있음을 나타낸다.
14.1.1 재료 및 방법
비드 준비: 마이크로타이터 플레이트(24 및 48웰, Nunc, Denmark) 또는 60 ml 시린지(Perfusor Syringes, Becton Dickinson, USA) 중 어느 하나에서 혈액을 인큐베이션하였다. 상기 시린지에는 200개의 유리 비드가 함유되어 있다. 유리 비드의 직경은 2.5 mm이며, 표면적은 21 mm2이며, 의료용 등급이다. 비드를 멸균한 재증류수(double distilled water)로 세정하여, 전도도가 0.3 μS(Hanna Instruments, USA) 미만이 되게 하였다. 비드 표면은 5분간 50% v/v CrSO4(Merck, Germany)중에 인큐베이션하여 변형시켰다. 이후, 비드의 pH가 세정에 사용한 증류수의 pH와 동일해지고 전도도가 0.3 μS(Hanna Instruments, USA) 보다 낮아질때까지 반복 세정하였다. 마이크로타이터플레이트 또는 시린지에 비드를 충진하고, 자동멸균 또는 감마선 조사로 멸균하였다.
혈액 배양 기법: 모든 실험들에서, 비드가 충진되어 있는 용기(마이크로타이터플레이트 또는 60 ml 시린지)는 20세 내지 50세의 건강한 남성 또는 여성 공여체로부터 채혈한 신선한 전 혈액으로 채워져 있으며, 언급되어 있지 않는한 항-응고제가 포함되어 있지 않다. 전 혈액 배양은 멸균하, 층류 조건(laminar flow condition)(Kendro, Germany)에서 확립하였다. 인큐베이션은 24시간 동안 37 ℃에서 5% CO2(Kendro, Germany) 하에서 무균 상태로 수행하였다. 인큐베이션 후, 혈청을 수득하여 원심분리(3500 rpm, 10 분, Megafuge, Kendro, Germany)하였다. 초기 혈액 총 부피의 약 20%에 해당하는, 마이크로타이터플레이트에서 200 ml, 시린지에서 10 ml을 취하였다. 혈청은 -20 ℃에 보관하였다. 혈청은 이미 인터루킨-1 수용체 길항자(IL-1Ra) 뿐만 아니라 IL-4 및 IL-10(Meier et al., Inflam Res. 52:1- 4(2003))을 증가된 수준으로 함유하고 있는 것으로 확인되었다. 또한, 혈청은 오르토카인(Orthokine)®으로 상업적으로 알려져 있다.
환자에게 일주일에 3번씩 경막외 신경초(epidural perineural) 주사하였다. VAS(visual analog scale)(Joyce et al., Eur J Clin Pharmacol. 14:415-20(1975)), 오스웨스트리 통증 설문(Oswestry Pain Questionnaire)(Fairbank et al. Spine, 25:2940- 2953(2000)), SF-36(간단한 건강 조사)(Ware et al., Med. Care, 30:473-483(1992)) 및 표준 임상 실험을 포함하는 주관적 및 객관적 평가를 환자마다 6번(t1-t6) 실시하였다. 2 ml의 오르소카인(orthokine®)을 주사하였다. 한 그룹에는 IL1-Ra 컨디셔닝한 혈청(Orthokine®)을, 다른쪽에는 트리암시놀론 10 mg을, 나머지에는 트리암시놀론 5 mg을 제공하였다. 트리암시놀론은 염증, 알레르기, 관절염 및 천식 치료에 일반적으로 사용되는 스테로이드이다. 트리암시놀론은 요추통증을 감소시키는데 효과가 있는 것으로 확인되었다(무작위 이중맹검 염구, Kramer Eur Spine 1997).
14.1.2 결과
매 주사후에 통증(VAS)가 현저하게 감소하였다(p<0.01). 오르소카인®과 트리암시놀론 그룹간에 현저한 차이가 있었다(p<.001). 트리암시놀론 그룹에서 6주후에(t4) 통증이 증가하였지만, 오르소카인 그룹에서는 감소가 지속되었다(도 36). 트리암시놀론 5 mg과 10 mg 간에는 큰 차이가 없었다. SESaff(정동 통증 스케일)에서 t1 및 t4 사이에 유의한 차이가 있었지만, 그룹간에는 차이가 없었다(도 37). SESsens(민감성 통증 스케일)에서 t1 및 t4 사이에는 유의한 차이가 있었지만, 그룹간에는 차이가 없었다(도 38). 오스웨스트리 수치에서 t1 및 t4 사이에는 유의한 차이가 있었지만, 그룹간에는 차이가 없었다(도 39). 상기 3 그룹들 모두에서 유의적인 부작용은 관찰되지 않았다.
오르소카인® 그룹에서 관찰된 결과는 고농도 및 저농도의 트리암시놀론 그룹들에서 관찰된 결과보다 현저하게 우수하였다.
14.2 오르소카인® 혈청은 엑소솜을 함유한다.
14.2.1 재료 및 방법
엑소솜 분획을 실시에 16에 기재된 바와 같이 혈청 조제물로부터 준비하였다. 인간 혈액에서 혈청을 분리하였다. 혈청을 분별 원심분리하여 엑소솜을 농화하여, Formvar/카본 코팅된 크리드에 주입한 후, 1% 포스포텅게스틱 산 중성 수용액 10 ㎕으로 음화 염색하였고, JEOL-1210 컴퓨터 컨트롤드 고해상도 120 kv 투사 전자현미경으로 관찰하였다.
14.2.2 결과
도 40A-C는 농화된 오르소카인® 혈청중의 엑소솜의 존재를 명확하게 보인다.
14.3 오르소카인® 혈청으로부터 농축 엑소솜 제조
표면이 특이적으로 처리된 시린지(Orthokine® syringes)에 전 혈액을 인큐 베이션하여 엑소솜을 생성시켰다. 6-24시간동안 ER(endoplasmic reticulum)으로부터 소포체가 세포에서 방출되었다. 이러한 과정은 전 혈액 1 ml 당 5 ㎍ IL-1ra (IRAP)을 첨가하여 증강시킬 수 있다(실시예 A-D, 하기). 실시예 A-D에서, 인큐베이션한 후, 5000 g으로 10분간 원심분리하여 혈액 세포로부터 혈청을 분리하였다. 혈청은 엑소솜을 여러가지 함량으로 함유하고 있다. 소포체는 100,000 g로 한시간동안 이차 원심분리하여 농축시켰다. 혈청 20 ml을 원심분리한 다음, 원심분리 바이얼 하부의 약 1 ml의 펠렛을 취하고, 스크류 캡 바이얼로 여과(0.2 ㎛ 필터)하여 투입하였다. 1 ml의 엑소솜 용액을 나중에 환자에게 주사하였다. 때때로, 보다 많은 투여량을 1회 주사로 투여하였다(예, 농축 엑소솜 1 ml 분주물 5개).
14.4 인간에게 농축 엑소솜 처리
14.4.1 실시예 A
엑소솜 처리 전 상태: 환자는 22세의 남성으로, 약 10년간 소아 류마티스 관절염(엉치엉덩관절염(sacroiliitis), 고관절염(coxitis), 무릎관절염(gonarthritis)이 있는 타입 올리고-II, HLA-B27 양성)을 앓고 있다. 환자에게 1주일에 MTX 10 mg과 데코르틴 5 mg을 투여하였지만, 극심한 통증이 계속되었고 오른쪽 무릎이 부었으며, 부은 관절에 스테로이드를 주사하여도 개선되지 않았다.
실험에서, 엑소솜을 처리하기 전 환자의 혈압은 90/60 mm Hg이었고, 외전(abduction)이 50도로 어깨 운동성이 낮았다. 양 무릎은 심하게 부었으며, 10도 연장 결핍이 있었다(with an extension deficit of 10 degrees). 환자의 무릎 X-레이 연구들에서 삼출물이 확인되었지만, 연골 파괴 수준은 현저하지 않았으며, 엉 덩이 X-레이 연구에서 엉덩이 관절 성형술 처방이 필요한 IV 수준의 연골 파괴가 있었다. 혈액 테스트에서는 CRP 9.9 mg/dl; BSR 59; RF5CCP-AK 및 ANA 음성이었다. 적혈구 11.3 및 혈소판 511 OOO ㎕.
요약하면, 환자는 기존 치료법으로는 치료되지 않는 심각한 소아 관절염 증상을 나타내었다.
엑소솜 처리. 전술한 14.3에 개시된 바와 같이 자신의 말초 혈액으로부터 엑소솜을 준비하였다. 오른쪽 무릎이 매우 아프고, 부었으며, 일차 침범된 관절이었기에, 오른쪽 무릎 관절에 주사하기로 결정하였다. 치료 목표는 오른쪽 무릎의 부기와 통증을 가라앉히고, 다른 침범된 관절에서 치료 효과를 나타낸 것이다. 컨디셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농축 엑소솜 1 ml을 오른쪽 무릎 관절내에 주사하였고, 합병증은 없었다.
주사한 후 4주일 후에, 양쪽 무릎 모두에서 통증이 100% 감소되었고, 양쪽 무릎의 WOMAC 수치가 현저하게 낮아졌으며, 양쪽 어깨의 통증도 100% 경감되었다. CRP는 6 mg/dl로 낮아졌고, 오른쪽 무릎의 부기는 처리전 수치에 비해 3 cm 빠졌다. 환자는 결과에 매우 만족하였다.
농축 엑소솜을 일차 주사한 후 9주일째에, 컨대셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농축 엑소솜 1 ml을 오른쪽 무릎에 이차 주사하였고, 컨디셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농촉 엑소솜 1 ml을 왼쪽 언깨와 왼쪽 무릎에 각각 관절내 주사하였다. 오른쪽 무릎은 100% 개선되었고, 왼쪽 무릎은 70% 개선, 그리고 어깨는 80% 개선되었다.
이차 주사 후 4주일째에(일차 주사후 13주일째), 농축 엑소솜을 더 투여하였다.
투여후, 환자의 소아 류마티스 관절염은 각각의 류마티스 전문가의 평가로 검증된 바에 따르면, 소강되었다. 따라서, 농축 엑소솜 요법은 질병 진행을 완화하는 MTX 및 스테로이드 보다 효과적인 것으로 나타났다.
14.4.2 실시예 B
엑소솜 처리전 상태: 환자는 65세의 남성으로, 10년간 혈청반응 양성의 류마티스 관절염을 앓고 있다. 환자의 모친 역시 상기 질환을 앓았다. 환자는 심한 무릎 통증을 토로하였고, Kellgreen 이후의 연골 분해 등급 III- IV를 나타내었다. 진찰을 통해 MCP에 손 관절 통증, 통증성 어깨 운동 감소, 왼쪽 무릎에 삼출이 있으며, 양쪽 엉덩이 내부 회전성(inner rotation) 감소가 있는 것으로 확인되었다. 혈액 검사 결과, SR 28/65; CRP 0.8 mg/ml; RF 211 U/ml; ANA 음성, 백혈구 7900, 혈소판 353 000이었다. X-레이 검사에서는, 손의 RA 등급은 II이었고, 무릎 등급은 III - IV이었다. 환자는 엑소솜 요법 중에 지속적으로 골드 요법이 처방되었었다.
엑소솜 처리: 전술한 14.3에 개시된 바와 같이 자신의 말초 혈액으로부터 엑소솜을 준비하였다. 컨디셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농축 엑소솜 1 ml을 각각 양쪽 무릎에 관절내 주사하였고, 부작용은 없었다.
주사한 후 4주일 후에, 환자를 다시 진찰하였고, 전반적인 관찰 시기동안에 참을 수 있는 치료법(tolerated treatment)인 것으로 확인되었다. 환자의 증상은 치료전에 비해 98% 개선되었다. WOMAC 수치는 현저하게 개선된 결과를 보였다(50-80%). 부기는 처리하기 전에 비해 완전하게 가라앉아, 엑소솜 처리 후 관절의 직경이 -2 cm로 감소되었다.
4주일 후에, 왼쪽 무릎의 통증 재발율은 엑소솜을 처리하기 전의 상태에 비해 약 50% 개선되었고, 오른쪽 무릎은 약 30% 개선되었다. 컨디셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농축 엑소솜 1 ml을 양쪽 무릎에 각각 이차 관절내 주사하였다. 2주일 후에, 양쪽 무릎 각각에 컨디셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농축 엑소솜 1 ml을, 농축 엑소솜을 처리한 상태에 비해 양쪽 무릎 통증이 70% 개선되는 시기에 3차 주사하였고, 무릎이 개선되었다.
2달 후, 환자의 양쪽 무릎의 통증은 엑소솜 요법을 처리하기 전 상태에 비해 80% 개선되었다. WOMAC 수치는 처리전 값에 비해 현저하게 개선된 범위였다.
14.4.3 실시예 C.
엑소솜 처리 전 상태: 환자는 20살의 여성으로, 무릎 구축, 양쪽 엉덩이내 보형물(bilateral hip endoprothesis), 양쪽 외측 무릎 연골 분해(bilateral lateral knee cartilage), 골다공증 및 말초심근염(perimyocarditis)이 있는 소아(juvenile) Morbus Still(8년)을 앓고 있었다. 환자는 장기간 스테로이드 요법을 처방받았으며, 환자의 질병은 항 TNF, 스테로이드, MTX 및 이의 조합과 같은 치료법에 무반응인 것으로 간주되었다. 혈액 테스트에서, CRP 20 mg/ml, BSR 98이었고, 그외 다른 모든 파라미터에서 중증 면역 결핍이 확인되었다: 백혈구 증가증 22 900/nl, 혈소판 증가증 560 000/nl. 환자는 효과도 없고 반년간 혈액 파라미터가 거의 변화지 않아, 기존 요법을 중단하기로 결정하였다. CRP 값은 12.3 내지 11.5 mg/ml이며, 백혈구 증가증 22300/nl이었다. 농축 엑소솜 요법을 실시하는 동안 다른 화학 치료 요법은 사용하지 않았다.
엑소솜 처리: 전술한 14.3에 개시된 바와 같이 자신의 말초 혈액으로부터 엑소솜을 준비하였다. 컨디셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농축 엑소솜 1 ml을 각각 양쪽 무릎에 관절내 주사하였고, 합병증은 없었다.
2주일 후에 컨디셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농축 엑소솜 1 ml을 양쪽 어깨 각각에 관절내 주사하였고, 합병증은 없었다.
일차 주사 후 4주일째에, 치료전에 비해 환자의 왼쪽 어깨의 통증은 100%, 오른쪽 어깨는 70% 개선되었으며, 양쪽 무릎은 100% 개선되었다.
일차 주사후 8주째에, 컨디셔닝한 혈청 20 ml로 준비한 농축 엑소솜 1 ml을 오른쪽 어깨에 관절내 주사하였다.
일차 주사후 15주일째에, CRP는 12.3 mg/ml에서 8.3 mg/ml로 낮아졌고, 무릎이 80%, 어깨가 약 60% 개선된 것으로 환자가 기록하였다.
일차 주사후 16주째에, 농축 엑소솜을 양쪽 무릎에 관절내 주사하였다. 환자는, 무릎과 어깨가 80% 개선되었으며, 그외 관절도 50% 이상 개선되었다고 하였다. 또한, 농축 엑소솜 처리 이후의 개선된 점에서, 환자는 기존 요법을 재개하지 않겠다고 하였다. 엑소솜을 일차 주사한 후 7개월 후에, 환자에서 임상적인 효과가 일부 감퇴되어, 펙터 6에 의해 엑소솜의 투여량을 증가시키기로 결정하였다. 이 시기에, CRP은 8.6 mg/ml이었고, 백혈구는 22500/nl이었다. 엑소솜의 고투여 량, 즉 컨디셔닝한 혈청 100 ml로 준비한 농축 엑소솜 5 ml을 양쪽 어깨에 각각 관절내 주사하였다.
1주일 후에, 엑소솜을 다량 투여하기 전에 비해 80% 개선되었고, 어깨 외전 운동성은 약 30도로 개선되었으며, 무릎과 손은 50% 개선되었다. WOMAC 값은 어깨에 다량을 주사하였지만, 무릎의 경우 50% 이상으로 급격하게 개선되었다. CRP은 7.2 mg/dl로 백혈구는 18 800/ml로 감소되었다.
14.4.4 실시예 D.
엑소솜 처리 전 상태: 환자는 18년간 건초열 병력을 가진 49세 환자로, 잔디와 꽃가루에 알레르기가 있다.
엑소솜 처리: 전술한 14.3에 개시된 바와 같이 자신의 말초 혈액으로부터 엑소솜을 준비하였다. 컨디셔닝한 혈청 100 ml로 준비한 농축 엑소솜 5 ml을 피하 주사하였으며, 2주일 후에는 재채기와 눈과 코의 염증과 같은 건초열 증상이 현저하게 감소되었다. 재채기 빈도는 하루에 124회에서 0회로 감소하였다. 이러한 효과는 건초열 시즌에 지속되었다. 이러한 치료시 어떠한 부작용도 나타나지 않았다.
14.5 오르소카인® 혈청을 이용한 향후 임상 연구
전술한 14.1 및 Meier et al., Inflam Res. 52:1-4(2003)에 개시된 바와 같이 혈청을 준비하였다. 이러한 환자에서, 부가적인 외용 IL-1ra를 사용하지 않았고, 엑소솜을 농축하기 위해 100,000 g 원심분리 단계를 수행하지 않았다. 따라서, 덜 농축된 엑소솜 뿐만 아니라, 자기 사이토카인 및 성장 인자가 존재한다.
기존 요법으로 치료하거나 또는 치료하지 않은 류마티스 관절염 및 손 관절 변이가 있는 56명의 환자에게, 오르소카인 혈청(2ml/주사)을 일주일에 2번 다양한 병증의 RA 관절에 4-6회 주사하였다. 임상 치료는 4년간 지속하였다. 3달 후에 평균 통증 개선율은 치료전 수치에 비해 65.31 % SE 7.00이었다. 반응을 보이는 환자 비율은 68.8%이었으며, 3개월 후에 주사전 수치에 비해 병에 걸린 관절의 통증이 적어도 50% 개선되었다. 평균적으로, 이러한 수치는 치료후 시간 함수로 감소되었다. 병에 걸린 관절에 스테로이드를 병용 주사시 오르소카인 혈청 주사한 경우에 비해 3개월째에 유용하고 통계적으로 유의한 효과가 없었다. 부작용이 없었다.
본 발명은 명세서에 기재된 구체적인 예로 범위가 한정되는 것은 아니다. 실제, 당업자라면 전술한 설명 및 첨부된 도면으로부터 기재된 변형 뿐만 아니라 본 발명의 여러가지 변형이 명백할 것이다. 이러한 변형은 첨부된 청구범위에 속한다.
여러가지 공개문헌을 그 전체로서 원용에 의해 포함되는 것으로 언급된다.

Claims (46)

  1. 항원 제시 세포(antigen presenting cell)의 배양물로부터 준비한 유효량의 엑소솜을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 환자에게서 면역 반응을 저해하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 배양시 증강제에 노출되는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 증강제를 발현하도록 유전자 조작된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항 내지 3항중 어느 한항에 있어서, 상기 항원 제시 세포는 수지상 세포인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 2항 또는 3항에 있어서, 상기 증강제는 IL-4인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 증강제는 IL-4인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 2항 또는 3항에 있어서, 상기 증강제는 IL-10인 것을 특징으로 하는 방 법.
  8. 제 4항에 있어서, 상기 증강제는 IL-10인 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 3항에 있어서, 상기 증강제는 FasL인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 4항에 있어서, 상기 증강제는 FasL인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 관절염으로 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 1항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 상처의 염증인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 알레르기로서 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 1항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 천식으로 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제 1항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 1형 당뇨병으로 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 1항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 자가면역 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 17항에 있어서, 상기 자가면역 반응은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosis), 경피증, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 1형 당뇨병, 베네거 육아종증(Wegener's granulomatosis), 다발성 경화증, 크론 질환, 건선, 그레이브 질환, 복강부전증(celiac sprue), 원형 탈모증(alopecia areata), 중추신경계 혈관염(central nervous system vasculitis), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 굿패스투어 증후군(Goodpasture's syndrome), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 귈레인 바레 증후군(Guillan-Barre syndrome), 결절다발 동맥염(polyarteritis nodosa), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytic purpura), 거대세포 동맥염(giant cell arteritis), 원발성 담즙성 경변(primary biliary cirrhosis), 에디슨 질환(Addison's disease), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 타카야즈 동맥염(Takayazu's arteritis) 및 백반증으로 이루어진 군으로부터 선택된 자가면역 질환에서 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 혈청으로부터 준비한 유효량의 농축 엑소솜을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 치료가 필요한 환자의 면역 반응을 저해하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 혈청은 유리 비드의 존재하에 배양된 말초 혈액으로부터 준비되는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 20항에 있어서, 유리 비드 존재하에 배양하기 전에 말초 혈액에 증강제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 증강제는 인터루킨 1 수용체 길항제 단백질인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 관절염으로 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 관절염은 류마티스 관절염인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 상처의 염증인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 19항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 알레르기로서 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 19항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 천식으로 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 제 19항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 I형 당뇨병으로 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제 19항에 있어서, 상기 저해되는 면역 반응은 자가면역 반응인 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제 19항에 있어서, 상기 자가면역 반응은 류마티스 관절염, 소아 류마티스 관절염(juvenile rheumatoid arthritis), 전신성 홍반성 루푸스(systemic lupus erythematosis), 경피증, 쇼그렌 증후군(sjogren's syndrome), 1형 당뇨병, 베네거 육아종증(Wegener's granulomatosis), 다발성 경화증, 크론 질환, 건선, 그레이브 질환, 복강부전증(celiac sprue), 원형 탈모증(alopecia areata), 중추신경계 혈관염(central nervous system vasculitis), 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis), 중증 근무력증(myasthenia gravis), 굿패스투어 증후군(Goodpasture's syndrome), 자가면역성 용혈성 빈혈(autoimmune hemolytic anemia), 귈레인 바레 증후군(Guillan-Barre syndrome), 결절다발 동맥염(polyarteritis nodosa), 특발성 혈소판 감소성 자반증(idiopathic thrombocytic purpura), 거대세포 동맥염(giant cell arteritis), 원발성 담즙성 경변(primary biliary cirrhosis), 에디슨 질환(Addison's disease), 강직성 척추염(ankylosing spondylitis), 라이터 증후군(Reiter's syndrome), 타카야즈 동맥염(Takayazu's arteritis) 및 백반증으로 이루어진 군으로부터 선택된 자가면역 질환에서 나타나는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 증강제의 존재하에 항원 제시 세포를 배양하는 단계 및 배양 상층액으로부터 엑소솜을 수득하는 단계에 의해 제조된 엑소솜을 포함하는 조성물.
  32. 제 31항에 있어서, 상기 증강제는 사이토카인인 것을 특징으로 하는 조성물.
  33. 제 32항에 있어서, 상기 증강제는 인터루킨 4 및 인터루킨 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  34. 제 31항에 있어서, 상기 증강제는 사이토카인 저해제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  35. 제 34항에 있어서, 상기 증강제는 인터루킨-1 수용체 길항제 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  36. 제 31항에 있어서, 상기 증강제는 NFκB 저해제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  37. 증강제를 발현하도록 조작된 항원 제시 세포를 배양하는 단계 및 배양 상층액으로부터 엑소솜을 수득하는 단계에 의해 제조한 엑소솜을 포함하는 조성물.
  38. 제 37항에 있어서, 상기 증강제는 사이토카인인 것을 특징으로 하는 조성물.
  39. 제 38항에 있어서, 상기 증강제는 인터루킨 4 및 인터루킨 10으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  40. 제 37항에 있어서, 상기 증강제는 사이토카인 저해제인 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제 40항에 있어서, 상기 증강제는 인터루킨-1 수용체 길항제 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
  42. 제 37항에 있어서, 상기 증강제는 FasL인 것을 특징으로 하는 조성물.
  43. 혈청으로부터 엑소솜을 수득함으로써 준비한 엑소솜을 포함하는 조성물.
  44. 유리 비드와 함께 배양된 말초 혈액 샘플의 혈청으로부터 엑소솜을 수득함으로써 준비한 엑소솜을 포함하는 조성물.
  45. 제 44항에 있어서, 배양된 말초 혈액 샘플에 증강제가 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
  46. 제 45항에 있어서, 상기 증강제는 인터루킨 1 수용체 길항제 단백질인 것을 특징으로 하는 조성물.
KR1020077002627A 2004-07-01 2005-07-01 면역억제성 엑소솜 KR20070058441A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US58530204P 2004-07-01 2004-07-01
US60/585,302 2004-07-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20070058441A true KR20070058441A (ko) 2007-06-08

Family

ID=35784369

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020077002627A KR20070058441A (ko) 2004-07-01 2005-07-01 면역억제성 엑소솜

Country Status (9)

Country Link
US (1) US20060116321A1 (ko)
EP (1) EP1773381A4 (ko)
JP (1) JP2008505104A (ko)
KR (1) KR20070058441A (ko)
CN (1) CN101022824A (ko)
AU (1) AU2005262319A1 (ko)
BR (1) BRPI0512814A (ko)
CA (1) CA2572065A1 (ko)
WO (1) WO2006007529A2 (ko)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101686064B1 (ko) * 2015-09-21 2016-12-13 (주)프로스테믹스 면역 억제 및 항염증성 조성물
WO2018056481A1 (ko) * 2016-09-23 2018-03-29 ㈜프로스테믹스 면역 억제 및 항염증성 조성물
WO2019112229A3 (ko) * 2017-12-10 2019-08-01 주식회사 엑소코바이오 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트의 새로운 용도

Families Citing this family (78)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11660317B2 (en) 2004-11-08 2023-05-30 The Johns Hopkins University Compositions comprising cardiosphere-derived cells for use in cell therapy
US20060177515A1 (en) * 2005-02-09 2006-08-10 Reinhold Schmieding Method of producing autogenous or allogenic blood serum and related logistics
US20090148460A1 (en) * 2005-07-08 2009-06-11 Alain Delcayre Exosome ligands, their preparation and uses
ES2557411T3 (es) 2006-01-05 2016-01-25 The Ohio State University Research Foundation Métodos y composiciones basados en microARN para el diagnóstico y el tratamiento de cánceres sólidos
WO2007103572A2 (en) * 2006-03-09 2007-09-13 Aethlon Medical, Inc. Extracorporeal removal of microvesicular particles
WO2007109236A2 (en) 2006-03-20 2007-09-27 The Ohio State University Research Foundation Microrna fingerprints during human megakaryocytopoiesis
JP2010516786A (ja) * 2007-01-26 2010-05-20 ユニバーシティー オブ ルイヴィル リサーチ ファウンデーション，インコーポレーテッド ワクチンとしての使用のためのエキソソーム成分の改変
EP2142659A4 (en) * 2007-04-30 2010-06-09 Univ Ohio State Res Found METHOD FOR THE DISTINCTION OF PANCREATIC CANCER OF NORMAL IMMERSION SPECTRUM FUNCTIONS AND CHRONIC IMMERSION IMAGING IGNITION
ES2570359T3 (es) 2007-08-03 2016-05-18 Univ Ohio State Res Found Regiones ultraconservadas que codifican ARNnc
CN101861401B (zh) * 2007-10-11 2014-03-12 俄亥俄州立大学研究基金会 用于诊断和治疗食管腺癌的方法和组合物
DK2245199T3 (da) * 2008-02-01 2014-02-03 Gen Hospital Corp Anvendelse af mikrovesikler i diagnosticering, prognosticering og behandling af medicinske sygdomme og tilstande
EP2254586B1 (en) * 2008-02-22 2015-04-08 Agency For Science, Technology And Research (A*star) Mesenchymal stem cell particles
US20110034538A1 (en) * 2008-02-28 2011-02-10 The Ohio State University Research Foundation MicroRNA-Based Methods and Compositions for the Diagnosis, Prognosis and Treatment of Gastric Cancer
EP2730662A1 (en) * 2008-11-12 2014-05-14 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Methods and systems of using exosomes for determining phenotypes
WO2011109440A1 (en) 2010-03-01 2011-09-09 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings Biomarkers for theranostics
DK2416789T3 (en) 2009-04-07 2017-10-09 Velin-Pharma As Method and apparatus for treating diseases associated with inflammation or unwanted activation of the immune system
BRPI0900815A2 (pt) * 2009-04-23 2010-12-28 Sociedade Benef Israelita Bras Hospital Albert Einstein método para isolamento de exossomos a partir de soluções biológicas utilizando nanopartìculas de óxido de ferro
SG2014014617A (en) * 2009-07-16 2014-05-29 Gen Hospital Corp Nucleic acid analysis
EP2475989A4 (en) 2009-09-09 2013-02-27 Gen Hospital Corp USE OF MICROVESICLES IN THE ANALYSIS OF KRAS MUTATIONS
EP3461912B1 (en) 2009-09-09 2022-07-13 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in analyzing nucleic acid profiles
AU2010294197C9 (en) 2009-09-10 2018-09-13 Velin-Pharma A/S Method for the preparation of micro-RNA and its therapeutic application
CA2781547A1 (en) 2009-11-23 2011-05-26 The Ohio State University Materials and methods useful for affecting tumor cell growth, migration and invasion
DE202009017772U1 (de) 2009-12-10 2011-04-21 Orthogen Ag Kombinationspräparate mit Cytokin-Antagonist und Corticosteroid
US20170189475A9 (en) * 2009-12-10 2017-07-06 Orthogen Ag Combination preparation comprising a cytokine antagonist and corticosteroid
WO2011097480A1 (en) 2010-02-05 2011-08-11 University Of Louisville Research Foundation, Inc. Exosomal compositions and methods for the treatment of disease
WO2011106376A2 (en) * 2010-02-23 2011-09-01 The General Hospital Corporation Use of microvesicles in the treatment of medical conditions
EP2556172A4 (en) 2010-04-06 2013-10-30 Caris Life Sciences Luxembourg Holdings CIRCULATING BIOMARKERS FOR DISEASES
US20140045915A1 (en) 2010-08-31 2014-02-13 The General Hospital Corporation Cancer-related biological materials in microvesicles
JP5911874B2 (ja) * 2010-10-18 2016-04-27 エージェンシー フォー サイエンス，テクノロジー アンド リサーチ 発毛を促進又は増強するためのエキソソームの使用
EP2638057B1 (en) 2010-11-10 2019-03-06 Exosome Diagnostics, Inc. Method for isolation of nucleic acid containing particles and extraction of nucleic acids therefrom
ES2606146T3 (es) 2010-11-12 2017-03-22 The Ohio State University Research Foundation Métodos relacionados con microARN-21 y reparación de desapareamiento en cáncer colorrectal
CA2817982C (en) 2010-11-15 2020-06-30 The Regents Of The University Of Michigan Controlled release mucoadhesive systems
WO2012076193A1 (de) 2010-12-10 2012-06-14 Orthogen Ag Kombinationspräparate mit exosomen und corticosteroid
WO2012076194A1 (de) 2010-12-10 2012-06-14 Orthogen Ag Kombinationspräparate mit cytokin-antagonist und corticosteroid
SG183579A1 (en) * 2011-02-11 2012-09-27 Agency Science Tech & Res Methods of detecting therapeutic exosomes
ITRM20110403A1 (it) 2011-07-28 2013-01-29 Ospedale Pediatrico Bambino Gesu Microvescicole isolate da cellule mesenchimali come agenti immunosoppressori.
JP2014530612A (ja) 2011-10-14 2014-11-20 ジ・オハイオ・ステート・ユニバーシティ 卵巣がんに関する方法および材料
EP2790735A4 (en) * 2011-12-13 2015-12-09 Ohio State Innovation Foundation METHODS AND COMPOSITIONS RELATING TO MIR-21 AND MIR-29A, EXOSOME INHIBITION, AND CANCER METASTASIS
JP2015511121A (ja) 2012-01-20 2015-04-16 ジ・オハイオ・ステート・ユニバーシティ 浸潤性および予後に関する乳がんバイオマーカーシグネチャー
US11286463B2 (en) 2012-03-08 2022-03-29 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Reprogramming of aged adult stem cells
EP2687219A1 (en) * 2012-07-18 2014-01-22 Universität Duisburg-Essen Use of preparations comprising exosomes derived from mesenchymal stem cells (MSCs) in the prevention and therapy of inflammatory conditions
US9828603B2 (en) 2012-08-13 2017-11-28 Cedars Sinai Medical Center Exosomes and micro-ribonucleic acids for tissue regeneration
DE102012019088A1 (de) 2012-09-28 2014-04-03 Orthogen Ag Antibakterielle Arzneimittelpräparate
CN112795533A (zh) 2013-03-13 2021-05-14 迈阿密大学 从细胞培养上清液和生物流体分离并纯化微泡的方法
DK3369435T3 (da) 2013-07-18 2019-11-25 Xalud Therapeutics Inc Sammensætning til behandling af inflammatorisk ledsygdom
CR20160307A (es) 2013-12-20 2016-11-08 Advanced Regen Medical Tech Llc Composiciones para la restauración de células y métodos para la preparación y utilización de las mismas
US10772911B2 (en) 2013-12-20 2020-09-15 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Cell free compositions for cellular restoration and methods of making and using same
JP6862182B2 (ja) * 2014-01-14 2021-04-21 チョイ ウォンチョルＣＨＯＩ， Ｗｏｎ Ｃｈｅｏｌ ルテリアル、並びにその分離および培養方法
US10590384B2 (en) 2014-01-14 2020-03-17 Luterion Co., Ltd. Luterial and method for isolating and culturing the same
EP3998273A1 (en) * 2014-07-17 2022-05-18 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Methods for using exosomes to monitor transplanted organ status
CA2962444C (en) 2014-10-03 2023-09-05 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of muscular dystrophy
CN104673749B (zh) * 2015-02-12 2017-10-20 江苏大学 一种粒细胞样髓源性抑制细胞来源exosomes及其应用
TW201722443A (zh) * 2015-11-13 2017-07-01 奧爾托金公司 對老化相關病症有效之醫藥製劑
US11253551B2 (en) 2016-01-11 2022-02-22 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and exosomes secreted by such cells in the treatment of heart failure with preserved ejection fraction
WO2017160884A1 (en) 2016-03-14 2017-09-21 Capricor, Inc. Methods of treating ocular inflammation and chemical injuries of the eye with extracellular vesicles
WO2017190000A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Microrna compositions and methods of making and using same
WO2017210652A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Cedars-Sinai Medical Center Cdc-derived exosomes for treatment of ventricular tachyarrythmias
EP3254684B1 (en) * 2016-06-08 2019-10-23 Lysatpharma GmbH Human platelet lysate or fraction enriched in human platelet-derived extracellular vesicles, for use in medicine
EP4091622A1 (en) * 2016-08-16 2022-11-23 Henry Ford Health System Compositions for the treatment of chemotherapy-induced neuropathic pain
CR20190139A (es) * 2016-08-17 2019-06-03 Orthogen Ag Preparación farmacéutica anti envejecimiento
WO2018057542A1 (en) 2016-09-20 2018-03-29 Cedars-Sinai Medical Center Cardiosphere-derived cells and their extracellular vesicles to retard or reverse aging and age-related disorders
US20200046766A1 (en) 2016-10-13 2020-02-13 Vbc Holdings Llc Cancer stem cell exosomes
US20210024893A1 (en) 2016-10-13 2021-01-28 Vbc Holdings Llc Medical uses of exosomes
CN110072991A (zh) 2016-10-13 2019-07-30 Vbc控股有限责任公司 来源于发炎的细胞或组织的抗炎外泌体
CA3059910A1 (en) 2017-04-19 2018-10-25 Cedars-Sinai Medical Center Methods and compositions for treating skeletal muscular dystrophy
RU2019140867A (ru) * 2017-05-12 2021-06-15 Зе Джексон Лаборатори Nsg мыши, не имеющие mhc класса i и класса ii
WO2018226758A2 (en) * 2017-06-05 2018-12-13 The Regents Of The University Of California Methods for enhanced production and isolation of cell-derived vesicles and treatment of inflammation and neurological damage
US20200215120A1 (en) * 2017-07-06 2020-07-09 Children's National Medical Center Exosomes and methods of use thereof
US11712026B2 (en) 2017-10-18 2023-08-01 The Jackson Laboratory Murine-MHC-deficient HLA-transgenic nod-mouse models for T1D therapy development
US11660355B2 (en) 2017-12-20 2023-05-30 Cedars-Sinai Medical Center Engineered extracellular vesicles for enhanced tissue delivery
WO2019143847A1 (en) 2018-01-18 2019-07-25 Advanced ReGen Medical Technologies, LLC Therapeutic compositions and methods of making and using the same
CN110604813A (zh) * 2018-06-14 2019-12-24 深圳市人民医院 一种肿瘤细胞来源外泌体抗原在dc疫苗中的应用方法
EP3613424A1 (en) * 2018-08-23 2020-02-26 Orthogen AG Novel methods for the production of pharmaceutical agents
KR20220147107A (ko) * 2020-02-28 2022-11-02 도쿠리츠다이가쿠호징 가나자와다이가쿠 면역 제어법, 면역 제어용 핵산 조성물 및 그의 용도
WO2023081924A1 (en) * 2021-11-08 2023-05-11 Cornell University Olfactory extracellular vesicles and uses thereof
WO2023121578A1 (en) * 2021-12-24 2023-06-29 Kemal Tunc Tiryaki A method of isolating a high number of exosome extracts with high-activity from animal-derived cord blood or fetal animal or animal milk or other animal-derived fluids to allow high-activity exosome-liposome hybridization
CN114569792B (zh) * 2022-02-10 2023-01-20 北京鑫康辰医学科技发展有限公司 一种可防粘连的肌腱材料及其制备方法
CN116751745A (zh) * 2023-08-09 2023-09-15 北京圣美细胞生命科学工程研究院有限公司 一种组合免疫细胞外泌体多肽再生因子及其应用

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2766205B1 (fr) * 1997-07-16 2002-08-30 Inst Nat Sante Rech Med Nouveau procede de sensibilisation de cellules presentatrices d'antigene et nouveaux moyens pour la mise en oeuvre du procede
EP1427428B1 (en) * 2001-09-18 2006-05-24 Vasogen Ireland Limited Apoptosis-mimicking natural vesicles and use thereof in medical treatment

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101686064B1 (ko) * 2015-09-21 2016-12-13 (주)프로스테믹스 면역 억제 및 항염증성 조성물
WO2018056481A1 (ko) * 2016-09-23 2018-03-29 ㈜프로스테믹스 면역 억제 및 항염증성 조성물
WO2019112229A3 (ko) * 2017-12-10 2019-08-01 주식회사 엑소코바이오 줄기세포 유래의 엑소좀을 포함하는 엑소좀 키트의 새로운 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CN101022824A (zh) 2007-08-22
CA2572065A1 (en) 2006-01-19
WO2006007529A9 (en) 2006-04-27
US20060116321A1 (en) 2006-06-01
EP1773381A2 (en) 2007-04-18
WO2006007529A3 (en) 2006-08-31
AU2005262319A1 (en) 2006-01-19
WO2006007529A2 (en) 2006-01-19
JP2008505104A (ja) 2008-02-21
BRPI0512814A (pt) 2008-04-08
EP1773381A4 (en) 2008-07-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20070058441A (ko) 면역억제성 엑소솜
Kim et al. Exosomes derived from IL-10-treated dendritic cells can suppress inflammation and collagen-induced arthritis
Kim et al. Exosomes derived from genetically modified DC expressing FasL are anti-inflammatory and immunosuppressive
Kool et al. Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells
Shimizu et al. Tumor cells loaded with α-galactosylceramide induce innate NKT and NK cell-dependent resistance to tumor implantation in mice
US20190276803A1 (en) Method of culturing immune cells, kit for thereof, immune cell cultured medium obtained by same method, cosmetic composition and pharmaceutical composition comprising thereof
JP5898260B2 (ja) 併用療法におけるｃｄ８３の使用
Orteu et al. The pathophysiology of photosensitivity in lupus erythematosus
KR20090033328A (ko) 면역 특권 및 조절 전구 세포
US20140286906A1 (en) Use of igf-1 in the modulation of treg cell activity and the treatment and prevention of autoimmune disorders or diseases
Wang et al. Apoptotic vesicles ameliorate lupus and arthritis via phosphatidylserine-mediated modulation of T cell receptor signaling
KR20140116054A (ko) 다발성 경화증의 치료를 위한 ａｐｃ-매개 관용 유도
JP2021503276A (ja) 制御性ｔ細胞エピトープ
JP2021505611A (ja) 免疫疾患の予防または治療のためのｒｉｐｋ１阻害剤とｉｋｋ阻害剤の組み合わせ
EP3388514B1 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating regulatory t cell-mediated diseases
Pérez et al. The thymus in Chagas disease: molecular interactions involved in abnormal T-cell migration and differentiation
JP2001517208A (ja) 損傷した細胞ペプチドプロセッシングに関連する、例えばｂ７−１遺伝子で形質転換したｒｍａ−ｓ細胞上に発現される抗原またはエピトープの治療的応用
KR20060022232A (ko) 흉선 재활성화 이전에 수행되는 질병 예방법 및 면역방법
EP2889039B1 (en) Preparation for preventing or treating type i diabetes
Wang et al. Treatment with Cordyceps sinensis enriches Treg population in peripheral lymph nodes and delays type I diabetes development in NOD mice
JP2021516052A (ja) 胸腺組織に由来する制御性ｔ細胞を入手する方法および免疫系障害における細胞免疫療法としての前記細胞の使用
AU2018250926A1 (en) Methods to produce peptides, polypeptides or cells for modulating immunity
US9315558B2 (en) Use of interleukin 10 mRNA transfected macrophages in anti-inflammatory therapies
US20220323506A1 (en) Oligodendrocyte-derived Extracellular Vesicles for Therapy of Multiple Sclerosis
JP2013545453A (ja) 免疫変調剤およびそれらの使用

Legal Events

Date Code Title Description
N231 Notification of change of applicant
WITN Application deemed withdrawn, e.g. because no request for examination was filed or no examination fee was paid