KR20070058358A - 망간 산화물 나노입자를 포함하는 자기공명 영상제 - Google Patents

망간 산화물 나노입자를 포함하는 자기공명 영상제 Download PDF

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Abstract

망간 산화물 나노 입자를 포함하는 자기 공명 영상(MRI) 영상제에 관한 것이다. 보다 자세하게는 상기 망간 산화물 나노 입자는 중심 크기가 1 - 1000nm이며, 상기 망간 산화물은 MnOa (0<a≤5) 또는 MnMbOc(M은 Li, Na, Be, Ca, Ge, Mg, Ba, Sr, Ra을 포함하는 1, 2족 원소, 또는 Ga, In 등을 포함하는 13족 원소, 또는 Y, Ta, V, Cr, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Hg, 등을 포함하는 전이금속원소, 또는 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 등을 포함하는 란탄족 또는 악티늄 족 원소로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 금속원자, 0<b≤5, 0<c≤10)이고, 바람직하게는 MnM'dFeeOf (M'은 Li, Na, Be, Ca, Ge, Mg, Ba, Sr, Ra을 포함하는 1, 2족 원소, 또는 Ga, In 등을 포함하는 13족 원소, 또는 Y, Ta, V, Cr, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Hg, 등을 포함하는 전이금속원소, 또는 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 등을 포함하는 란탄족 또는 악티늄 족 원소로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종의 금속원자, 0<d≤5, 0<e≤5, 0<f≤15)이다. 또한, 상기 망간 산화물 입자에 수용성 리간드가 결합되어 이를 둘러싸고 있어 수용액에서 안정하고, 우수한 자기적 성질 및 자기 공명 영상 조영효과를 나타내는 나노입자이다. 또한, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자에 화학 및 생체 기능성 분자 등의 활성 물질이 결합되어 표적 특이성 및 세포 추적용 자기 공명 영상제로 사용될 수 있다.
망간 산화물 나노 입자

Description

망간 산화물 나노입자를 포함하는 자기공명 영상제{Magnetic Resonance Imaging Contrast Agents containing Water-Soluble Nanoparticles of Manganese Oxide or Manganese Metal Oxide}
도 1는 12 nm 크기의 디머켑토 숙신산으로 둘러싸인 망간페라이트 (MnFe2O4) 나노입자와 같은 크기의 산화철 (Fe3O4), 코발트 페라이트 (CoFe2O4), 니켈 페라이트 (NiFe2O4) 나노 입자의 자기 공명 영상 조영효과의 비교이다. 도 1의 (가)는 합성된 나노 입자의 전자현미경 분석이다. 도 1의 (나)는 합성된 나노 입자에 1.5 T 외부자기장의 인가하였을 때의 질량 자화율이다. (다)와 (라)는 각 나노 입자의 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명 조영 효과의 비교로 각 나노 입자의 T2 스핀-스핀 자기 공명 영상 결과 (다) 및 R2 (=1/T2) 이완계수이다. (마)는 다양한 리간드로 둘러싸인 망간페라이트 나노 입자와 산화철 나노 입자의 자기 공명 영상 조영효과의 비교로서, (1) 과 (2)는 각각 덱스트란으로 둘러싸인 망간페라이트 나노 입자와 산화철 나노 입자, (3) 과 (4)는 각각 3-카르복시프로필포스페이트으로 둘러싸인 망간페라이트 나노 입자와 산화철 나노 입자, (5) 와 (6)은 각각 디머켑토 숙신산로 둘러싸인 망간 페라이트 나노 입자와 산화철 나노 입자를 포함하는 수용액의 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명 영상 결과이다. 도 1의 (바)는 각각의 리간드로 둘러싸인 망간 페라이트 나노 입자와 같은 크기의 산화철 나노 입자의 R2 이완계수의 비교이다.
도 2는 여러 가지 크기의 망간 페라이트 및 산화철 나노 입자의 자기 공명 영상 조영효과의 비교이다. (가)는 6 nm, 9 nm, 12 nm 크기의 망간 페라이트 나노 입자의 전자 현미경 사진, (나)는 각 크기에 따른 망간 페라이트 나노 입자의 히스테리시스 곡선 (Hysteresis loops), (다)는 각 크기에 따른 망간 페라이트 나노 입자의 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명 영상 결과, (라) 는 각 크기에 따른 망간 페라이트 및 산화철 나노 입자의 R2 이완 계수의 비교이다.
도 3은 다양한 리간드로 둘러싸인 망간 페라이트 나노 입자의 콜로이드 안정성 평가이다. 도 3의 (가)는 6 nm, 9 nm, 12 nm 크기를 갖는 디메틸 머켑토 숙신산으로 둘러싸인 망간 페라이트 나노 입자의 아가로오즈 젤 전기 영동 사진이다. (나)~(자)는 여러 가지 리간드로 코팅된 망간 페라이트 나노 입자의 염 (NaCl) 용액 및 pH 변화에 따른 콜로이드 안정성 및 용해도 테스트이다.
도 4는 망간 페라이트 (12 nm)　-허셉틴 나노 하이브리드 입자의 제조과정 (가)과 합성된 나노하이브리드의 아가로오즈 젤 전기영동 상의 쿠마시 블루 단백질 염색 결과 (나)이다.
도 5는 망간 페라이트-허셉틴 하이브리드 나노 입자를 이용한 in vitro 유방암 자기 공명 영상 진단 감도의 평가이다. (가)는 사용된 암세포 (Bx-PC-3, MDA-MB-231, MCF-7, NIH3T6.7)의 상대적인 HER2/neu 유방암 마커 발현 정도이다. (나)는 망간 페라이트-허셉틴 하이브리드 나노 입자를 각각의 암세포에 처리한 후 얻은 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명 영상 결과이다. (다)는 대조군으로서 기존에 알려진 대표적인 분자 자기 공명 영상제인 cross-linked iron oxide (CLIO)를 각각의 암세 포에 투여한 후 얻은 자기 공명 영상 결과이다. (라)는 (나)와 (다)에서 제시된 자기 공명 영상 결과의 R2 이완 신호에 대한 그래프이다.
도 6은 망간 페라이트 나노 입자 및 망간 페라이트-허셉틴 나노 하이브리드 입자의 세포 독성 실험에 대한 결과를 나타낸것이다. (가,나)는 망간 페라이트 나노 입자를 각각 HeLa 및 HepG2 세포에 투여하였을 때의 세포 생존도를 나타낸 것이며, (다,라)는 망간페라이트-허셉틴 나노 하이브리드 입자를 각각 HeLa 및 HepG2 세포에 투여하였을 때의 세포 생존도를 나타낸 것이다.
도 7은 산화 망간 나노 입자의 전자 현미경 사진 (가)과 이 나노 입자의 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명 영상결과 (나)이다. 대조군으로는 나노 입자를 포함하지 않는 물이 사용되었다.
도 8은 산화 망간 나노 입자의 망간이온 방출에 의한 T1 스핀-격자 자기 공명 영상 결과이다. (가)는 표준물질로서 Mn2+ 이온의 T1 스핀-격자 자기 공명 영상 결과이며, (나)와 (다)는 각각 망간 페라이트 나노 입자 및 망간 산화물 나노 입자가 pH 2, 4, 7 수용액에 녹아 있을 때 망간 이온 방출에 의한 T1 스핀-격자 조영 효과를 나타낸 자기 공명 영상 결과이다. (라)와 (마)는 도 (나)와 (다)의 자기 공명 영상 결과로부터 얻은 R1 (=1/T1) 이완 신호에 대한 그래프이다.
도 9은 망간페라이트 (12 nm) -허셉틴 나노하이브리드 입자를 in vivo 상에서 작은 크기 (50mg, 2mm x 5mm x 5mm)의 유방암 조직 진단에 응용한 결과를 나타낸 것이다. (가-다)는 망간페라이트-허셉틴 나노하이브리드 입자를 허벅지 부분에 유방암 종양 세포를 갖고 있는 누드 마우스에 투여한 실험에서, 투여전 (가), 1시 간 (나) 및 2시간 (다) 후에 스캔한 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명 영상 결과이며, 상기 망간페라이트-허셉틴 나노하이브리드 입자 실험과 같은 조건하에서, (라-바)는 산화철-허셉틴 나노하이브리드 입자를 투여한 후에 얻어진 자기 공명 영상 결과이며, (사-자)는 CLIO-허셉틴 하이브리드 나노 입자를 투여한 후 얻어진 자기 공명 영상 결과이다. 그림에서 유방암 조직은 R2 스핀-스핀 자기 이완 신호를 컬러-코딩 (color-coding)하였으며, 붉은 색은 낮은 자기 공명 영상 신호 푸른 색은 강한 자기 공명 영상 신호를 나타낸다. (차)는 도면 (가-자)에서 나타낸 이미지에서 유방암 조직의 R2 자기 이완 신호의 변화 (ΔR2/R2control)를 그래프로 나타낸 것이다.
도 10는 111In으로 표지된 망간페라이트-허셉틴 나노하이브리드 입자를 벅지 부분에 유방암 종양 세포를 갖고 있는 누드마우스에 투여한 후, 2시간 후 (가) 및 24 시간 (나) 후에 얻은 감마카메라 이미지 이다. (다)는 투여 24 시간 후 누드 마우스를 희생시킨 후 각각 장기를 적출하여 감마카운터로 측정된 망간페라이트 나노 하이브리드 입자의 생체분포도 (biodistribution, %ID/g: percent injection dose per gram of organ)를 나타낸 표이다.
도 11은 망간 페라이트 나노 입자에 형광 염료 (FITC)를 결합시켜 얻은 자성-광학 이중 모드 나노 입자의 모식도 (가), 형광 성질의 광발광스펙트럼 분석 (photoluminescence spectrum) 및 형광 이미지 (나), 이중모드 나노 입자의 R2 스핀-스핀 이완 계수 및 자기 공명 영상 결과 (다)를 나타낸 것이다.
본 발명은 망간 산화물 나노입자를 포함하는 자기 공명 영상 (MRI) 영상제의 개발에 관한 것으로 보다 자세하게는 (1)그 중심이 1~1000nm 망간 산화물 나노입자로 이루어져 있고, 상기 나노입자는, MnOa (0<a≤5) 또는 MnMbOc(M은 M은 Li, Na, Be, Ca, Ge, Mg, Ba, Sr, Ra을 포함하는 1, 2족 원소, 또는 Ga, In 등을 포함하는 13족 원소, 또는 Y, Ta, V, Cr, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Hg, 등을 포함하는 전이금속원소, 또는 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 등을 포함하는 란탄족 또는 악티늄 족 원소로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 금속원자, 0<b≤5, 0<c≤10)이고, 바람직하게는 MnM'dFeeOf (M'은 M은 Li, Na, Be, Ca, Ge, Mg, Ba, Sr, Ra을 포함하는 1, 2족 원소, 또는 Ga, In 등을 포함하는 13족 원소, 또는 Y, Ta, V, Cr, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Hg, 등을 포함하는 전이금속원소, 또는 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 등을 포함하는 란탄족 또는 악티늄 족 원소로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종의 금속원자, 0<d≤5, 0<e≤5, 0<f≤15) 가장 바람직하게는 MnFe2O4이고, (2) 상기 나노 입자는 그 자체로 물에 녹거나 혹은 수용성 리간드에 의해 둘러싸여 있어서, 수용액에서 안정하며 우수한 자기적 성질을 나타내는 것을 특징으로 하는 수용성 망간 산화물 나노 입자를 포함하며 (3) 이러한 나노 입자에 화학 또는 생체 기능성 물질 등의 생체 활성 물질이 결합된 진단용 망간 산화물 나노 하이브리드 입자를 포함한다. 본 발명은 (4) 상기 (1-3)에서 명시한 나노 물질을 이용하여 자기 공명 영상제로서 개발하는 것에 관한 것이다.
나노기술은 물질을 원자, 분자 수준에서 조절 및 제어하는 기술로서 신물질, 신소자 창출에 적합하여 그 응용분야가 전자, 재료, 통신, 기계, 의약, 농업, 에너지, 환경 등 매우 다양하다.
현재 나노기술은 다양하게 발전하고 있으며 크게 세 가지 분야로 분류되어 있다. 첫째, 나노 소재로 극미세한 크기의 새로운 물질과 재료를 합성하는 기술에 관한 것이다. 둘째, 나노 소자로 나노 크기의 재료들을 조합하거나 배열하여 일정한 기능을 발휘하는 장치를 제조하는 기술에 관한 것이다. 셋째, 나노-바이오라 불리는 나노기술을 생명공학에 응용하는 기술에 관한 것이다.
나노-바이오 분야에서 자성 나노입자들은 생체 물질의 분리, 자기 공명 영상 진단 프로브, 거대자기저항센서를 포함한 바이오 센서, 마이크로 유체계 센서, 약물/유전자 전달, 자성 고온치료 등의 넓은 응용범위에 걸쳐 사용되고 있다.
특히 자성 나노 입자는 자기 공명 영상의 진단 프로브 (probe)로 사용될 수 있다. 외부에서 자기장을 주었을 때, 자성 나노 입자는 자화되어 나노 입자 주변의 물분자의 수소원자의 스핀-스핀 이완시간을 단축시켜 자기 공명 영상 신호를 증폭시키는 효과를 나타내는 효과를 나타내기 때문에, 이러한 조영효과를 이용하면 질병의 진단, 분자 및 세포 수준에서의 생명 현상의 관찰에 사용될 수 있다.
미국특허공보 US 6,274,121호는 산화철과 같은 금속을 포함한 상자기성 나노입자에 관한 것으로 상기 나노입자의 표면에 조직 특이적인 결합 물질, 진단 또는 약제학적으로 활성인 물질과 커플링(coupling)될 수 있는 결합 자리를 포함하는 무기 물질을 부착한 나노입자를 개시하고 있다.
미국특허공보 US 6,638,494호는 산화철과 같은 금속을 포함한 상자기성 나노입자에 관한 것으로 상기 나노입자의 표면에 특정한 카르복실산을 부착하여 중력 또는 자기장에서 나노입자가 응집 및 침전되는 것을 방지하는 방법을 개시하고 있다. 상기 특정한 카르복실산으로는 말레산, 타르타르산, 글루카르산과 같은 지방족 디카르복실산 또는 시트르산, 시클로헥산, 트리카르복실산과 같은 지방족 폴리디카르복실산이 이용되었다.
미국특허공보 US 5,746,999호는 산화철과 같은 금속을 포함한 상자기성 나노입자에 관한 것으로 상기 나노 입자의 표면에 실리카를 사용하여 코팅하고 덱스트란으로 부착시켜 체내 자기 공명 영상에 응용하였다.
미국특허공보 US 5,069,216 및 US 5,262,176호는 산화철과 같은 금속을 포함한 상자기성 나노입자로 이루어진 콜로이드에 관한 것으로 덱스트란과 같은 폴리사카라이드를 부착하여 수용화하였고 이를 이용하여 인체의 간 및 위 등의 장기를 자기 공명 영상을 사용하여 이미징하였다.
미국특허공개공보 US 2004/58457호는 단층(monolayer)으로 둘러싸인 기능성 나노입자에 관한 것으로 상기 단층에는 이기능성(bifunctional) 펩타이드가 부착되며 상기 펩타이드에는 DNA 및 RNA를 포함한 다양한 생폴리머(biopolymer)가 결합될 수 있다.
미국특허공보 US 5,336,506호는 암세포를 선택적으로 표지할 수 있는 폴릭산(folic acid)이 부착된 덱스트란 코팅된 산화철 자성 나노 입자에 대한 것으로 체외에서 자기 공명 영상을 이용하여 암세포를 진단하였다.
미국특허공보 US 4,770,183호는 덱스트란 및 BSA와 같은 단백질이 부착된 산화철 자성 나노 입자에 대한 것으로 이를 자기 공명 영상을 이용한 인체의 간 영상 및 체내 분포에 응용하였다.
대한민국특허출원 제 10-1998-0705262호는 녹말 코팅과 임의의 폴리알킬렌 옥사이드 코팅을 구비한 초상자성 철 산화물 코어 입자를 포함하는 입자와 이를 포함하는 MRI 조영제를 개시하고 있다.
이러한 자기 공명 영상의 영상제로 이용되는 자성 나노입자들이 본 용도에서 최적의 성능을 가지고 이용되기 위해서는,
1) 인가된 자기장에 민감하게 반응하는 높은 자화율을 가져야 하며,
2) 뛰어난 자기 공명 영상 조영 효과를 나타내어야 하며,
2) 생체 내 즉, 수용성 환경에서 안정적으로 운반 및 분산되어야 하며,
3) 생체 활성 물질과 쉽게 결합이 가능하여야 하며,
4) 낮은 독성및 높은 생체 친화력을 나타내어야 한다.
특히 3차원 영상, 고분해능 등 매우 뛰어난 생체 이미징 효과를 갖는 자기 공명 영상의 가장 취약점으로 여겨져 왔던 낮은 진단 감도를 해결하기 위해서는 뛰어난 자기적 성질 및 조영효과를 갖는 자성 나노 입자의 개발이 시급하다.
그러나 상기 선행 특허 및 기존에 알려진 CLIO, Feridex, Resovist 등의 대표적인 자기공명영상제를 포함한 기존의 산화철 나노 입자의 경우 그 자화율이 낮아 (60~90 emu/gFe), 이로 인해 낮은 자기 공명 영상 조영 효과 (예: 낮은 R2 이완 계수 (60 ~150 L·mol-1sec-1))를 갖는다. 이는 자기 공명 영상제로서의 저하된 신 호 증폭 효과를 나타내어 자기 공명 영상 진단에 있어 큰 문제점으로 지적되어 오고 있다.
이를 해결하기 위해 본 발명은 기존의 산화철 나노 입자의 문제점을 크게 극복하여, 자기적 성질 및 자기 공명 영상 조영 효과가 매우 우수하고, 수용액에서 안정성이 높아 자기 공명 영상 진단 효과를 획기적으로 개선시킨 새로운 개념의 자기 공명 영상제로서 수용성 망간 산화물 나노 입자를 제공하고자 한다.
이를 위해, 본 연구자들은 기존의 산화철 나노 입자를 사용하는 대신에 자기적 성질이 훨씬 우수하고, 수용액에서 안정성이 높으며, 생체 친화성이 좋고 생체 기능성 성분과의 결합이 용이한 수용성 망간 산화물 나노입자를 개발하였다. 또한 이러한 망간 산화물 나노입자에 화학 기능성 분자 및 생체 기능성 분자 (단백질, 항원, 항체, 펩타이드, 핵산, 효소 등)를 연결자 리간드를 통해 결합시킴으로써, 망간 산화물 나노 하이브리드 입자를 개발할 수 있었다. 이러한 수용성 망간 산화물 나노입자와 망간 산화물 나노 하이브리드 입자는 암세포 등의 생체 진단에 있어 획기적인 진단 감도의 증가를 보여주어, 자기 공명 영상에 있어 고감도 진단 사용이 가능하게 한다.
본 발명의 명세서에서 "망간 산화물 나노입자"는 산화망간(manganese oxide) 또는 망간금속산화물(manganese metal oxide)의 나노 입자를 의미한다. 본 명세서에서는 상기 산화망간 또는 망간금속산화물의 나노입자를 “망간 산화물 나노입자 ”로 통칭한다.
본 발명의 명세서에서 “망간 산화물 나노입자”는 나노 크기의 입자를 의미하는 것으로써, 그 직경이 1nm - 1000nm 범위 내에 있으며, 바람직하게는 2nm 내지 100nm 범위인 입자를 의미한다. 또한 물에 대한 용해도가 적어도 1㎍/ml 이상이 되고 물에 용해된 나노입자의 수화반경이 1000nm 이하의 범위를 갖는 입자를 의미한다.
본 발명에서 "수용성 망간 산화물 나노입자"는 상기 망간 산화물 나노 입자에 수용성 다작용기 리간드(multi-functional group ligand)가 결합되어 상기 나노 입자를 둘러싸고 있는 형태를 갖고 있거나, 또는 특별한 리간드와 결합하지 않고 그 자체로 수용액에서 안정적으로 용해 또는 분산될 수 있는 나노 입자를 의미한다.
본 발명에서 "수용성 망간 산화물 나노 하이브리드 입자"은 상기 수용성 망간 산화물 나노 입자가 화학 (예: 단분자, 고분자, 무기 지지체 등) 또는 생체 기능성 물질 (예: 세포, 단백질, 펩타이드, 항원, 유전자, 항체, 효소 등)과 결합되어 있는 물질을 의미한다.
본 발명에 따른 수용성 망간 산화물 나노입자는 다양한 양태로 제공될 수 있는데 어떠한 망간 산화물질과 다작용기 리간드를 선택하느냐에 따라 결정될 것이다.
본 발명의 망간 산화물질은 MnOa (0<a≤5) 또는 MnMbOc(M은 Li, Na, Be, Ca, Ge, Mg, Ba, Sr, Ra을 포함하는 1, 2족 원소, 또는 Ga, In 등을 포함하는 13족 원 소, 또는 Y, Ta, V, Cr, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Hg, 등을 포함하는 전이금속원소, 또는 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 등을 포함하는 란탄족 또는 악티늄 족 원소로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 금속원자, 0<b≤5, 0<c≤10)이고, 바람직하게는 MnM'dFeeOf (M'은 Li, Na, Be, Ca, Ge, Mg, Ba, Sr, Ra을 포함하는 1, 2족 원소, 또는 Ga, In 등을 포함하는 13족 원소, 또는 Y, Ta, V, Cr, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Hg, 등을 포함하는 전이금속원소, 또는 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 등을 포함하는 란탄족 또는 악티늄 족 원소로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종의 금속원자, 0<d≤5, 0<e≤5, 0<f≤15), 가장 바람직하게는 MnFe2O4이다.
본 발명의 명세서에서 "수용성 다작용기 리간드"는 (a) 부착영역(LI, adhesive region)을 포함할 수 있고, (b) 활성성분 결합영역(LⅡ, reactive region) 또는 (c) 교차 연결 영역(LⅢ, cross linking region)을 추가로 포함할 수 있다. 이하에서 수용성 다작용기 리간드를 보다 구체적으로 설명한다.
상기 "부착영역(LI)"은 나노입자와 부착할 수 있는 작용기(functional group)를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분으로서, 바람직하게는 이의 말단을 의미한다. 따라서 부착영역은 나노입자를 이루는 물질과 친화성이 높은 작용기를 포함하는 것이 바람직하다. 이 때 나노입자와 부착 영역과의 결합은 이온결합, 공유결합, 수소결합, 소수성결합, 또는 금속-리간드 배위결합으로 부착할 수 있다. 이에 따라 다작용기 리간드의 부착영역은 나노입자를 이루는 물질에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들어 이온결합, 공유결합, 수소결합, 금속-리간드 배위결합을 이용한 부착영역은 -COOH, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H, -N3, -NR3OH (R=CnH2n+1, 0≤n≤16) 또는 -OH를 포함할 수 있고, 소수성 결합을 이용한 부착 영역은 탄소수 2개 이상으로 이루어진 탄화수소 체인을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "활성성분 결합영역(LII)"은 활성성분과 부착할 수있는 작용기를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분으로서, 바람직하게는 상기 부착영역과 반대편에 위치한 말단을 의미한다. 상기 활성성분 결합영역의 작용기는 활성성분의 종류 및 이의 화학식에 따라 달라질 수 있다(표 1 참조). 본 발명에서 활성성분 결합영역은 -SH, -COOH, -NH2, -OH, -PO3H, -PO4H2, -SO3H, -SO4H -NR4+X- (R=CnH2n+1, 0≤n≤16)기를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "교차연결영역(LIII)"은 근접한 다작용기 리간드와 교차연결할 수 있는 작용기를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분, 바람직하게는 중심부를 의미한다. "교차연결"이란 한 다작용기 리간드가 근접하여 위치한 다른 다작용기 리간드와 분자간 인력(intermolecular interaction)으로 결합되는 것을 의미한다. 상기 분자간 인력은, 소수성 인력, 수소 결합, 공유 결합(예를 들어, 디설파이드 결합), 반데르 발스 결합, 이온 결합 등이 있지만, 이에 특별히 한정되지 않는다. 따라서, 교차연결할 수 있는 작용기는 목적으로하는 분자간 인력의 종류에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 교차연결영역은 예를 들면 -SH, -NH2, -COOH, -에폭시(epoxy), -에틸렌(ethylene), -아세틸렌(acetylene), -아자이드(azide), -PO3H, 또는 -SO3H 을 작용기로서 포함할 수 있다.
[표 1]
다작용기 리간드에 포함될 수 있는 활성성분 결합영역의 작용기의 예
Figure 112006089504073-PAT00001
(I: 다작용기 리간드의 활성성분 결합영역의 작용기, II: 활성성분, III: I과 II의 반응에 따른 결합예)
본 발명에서는 상기된 바와 같은 작용기를 본래 보유한 화합물을 수용성 다작용기 리간드로서 이용할 수도 있지만, 당업계에 공지된 화학반응을 통하여 상기된 바와 같은 작용기를 구비하도록 변형 또는 제조된 화합물을 다작용기 리간드로서 이용할 수도 있다.
본 발명에 따른 수용성 나노입자에 있어서 바람직한 다작용기 리간드의 한 가지 예는 디머켑토 숙신산이다. 디머켑토 숙신산은 본래 부착영역, 교차연결영역 및 활성성분 결합영역을 포함하고 있기 때문이다. 즉, 디머켑토 숙신산의 한쪽 -COOH는 디설파이드 결합으로 연결되는 역할을 하며 말단부의 COOH 및 SH는 활성성분과 결합하는 역할을 한다. 상기 디머켑토 숙신산 외에도 부착영역(LI)의 작용기로 -COOH를, 활성성분 결합영역(LIII)의 작용기로 -COOH 또는 -SH를 포함하는 화합물은 바람직한 다작용기 리간드로서 이용될 수 있다. 그러한 화합물의 예에는 디머켑토말레인산, 디머켑토펜타다이오닉산 등이 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 수용성 나노입자에 있어서 바람직한 다작용기 리간드의 다른 예는 단백질이다. 단백질은 펩타이드 보다 더 많은 아미노산, 즉 수백 내지 수십만 개의 아미노산으로 이루어진 폴리머로서, 양 말단에 -COOH와 -NH2 작용기를 보유하고 있을 뿐만 아니라 수십 개의 -COOH, -NH2, -SH, -OH, -CONH2 등을 포함하고 있다. 이로 인하여 단백질은 전술한 펩타이드처럼 그 구조에 따라 자연적으로 부착영역, 교차 연결 영역, 활성성분 결합영역을 구비할 수 있어 본 발명의 상전이 리간드로 유용하게 이용될 수 있다. 상전이 리간드로 바람직한 단백질의 대표적인 예로는 구조 단백질, 저장 단백질, 운반 단백질, 호르몬 단백질, 수용체 단백질, 수축 단백질, 방어 단백질, 효소 단백질 등이 있다. 보다 자세하게는 알부민, 항체, 항원, 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 S, 면역글로불린, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 안지포이어틴 (angiopoietin), 항암 단백질, 항생 단백질, 호르몬 길항 단백질, 인터루 킨(interleukin), 인터페론(interferon), 성장인자(growth factor) 단백질, 종양괴사인자(tumor necrosis factor) 단백질, 엔도톡신(endotoxin) 단백질, 림포톡신(lymphotoxin) 단백질, 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator), 유로키나제(urokinase), 스트렙토키나제(streptokinase), 프로테아제 저해제(protease inhibitor), 알킬 포스포콜린(alkyl phosphocholine), 계면활성제, 심혈관계 약물 단백질(cardiovascular pharmaceuticals), 신경계 약물(neuro pharmaceuticals) 단백질, 위장관계 약물 단백질(gastrointestinal pharmaceuticals) 등을 들 수 있다.
본 발명에 따른 수용성 나노입자에 있어서 바람직한 다작용기 리간드의 다른 예는 소수성(hydrophobic) 작용기와 친수성(hydrophilic) 작용기를 동시에 가지고 있는 양친성(amphiphilic) 리간드이다. 유기 용매상에서 합성된 나노 입자의 경우 그 표면에는 소수성의 긴 탄소 체인으로 이루어진 리간드가 존재하고 있다. 이때 부가되는 양친성 리간드에 존재하는 소수성 작용기와 나노입자 표면의 소수성 리간드가 분자간 인력에 의해 결합되어 나노 입자를 안정화 시키고 나노입자의 제일 바깥쪽에는 친수성 작용기가 드러나게 되어 결과적으로 수용성 나노 입자를 제조 할 수 있다. 여기서 분자간 인력은 소수성 결합, 수소 결합, 반데르발스 결합 등을 포함한다. 이때 나노 입자와 소수성 인력에 의해 결합되는 부분이 부착영역(LI)이며 이와 함께 유기화학적인 방법으로 교차 연결 영역(LII) 및 활성 성분 결합 영역(LIII)을 도입할 수 있다. 또한 수용액상에서의 안정도의 증가를 위해 이러한 여러개의 소수성 작용기와 친수성 작용기가 결합되어 있는 다중 양친성 리간드로 고 분자를 이용하거나 연결 분자를 이용하여 표면을 교차 연결 시켜 줄 수 있다. 이러한 상전이 리간드로 바람직한 양친성 리간드의 예로서 먼저 소수성 작용기에 포함되는 것은 탄소의 수가 2 이상 되는 체인으로 이루어지고 선형이거나 가지 친 구조를 가지고 있는 소수성 분자로서 더욱 바람직하게는 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 옥틸, 데실, 테트라데실, 핵사데실, 아이코실, 테트라코실, 도데실, 및 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 알킬작용기와 에티닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 올레일 등의 탄소-탄소 2중결합 및 프로파이닐, 이소프로파이닐, 부타이닐, 이소부타이닐, 옥타이닐, 데사이닐 등의 탄소-탄소 3중결합을 가지는 불포화된 탄소체인을 가지는 작용기 등을 들 수 있다. 또한 친수성 작용기에 포함되는 것은 -SH, -COOH, -NH2, -OH, -PO3H, -PO4H2, -SO3H, -SO4H -NR4+X- 등과 같이 특정 pH에서는 중성을 띠나 더 높거나 낮은 pH에서는 양전하 또는 음전하를 띠는 작용기들을 말한다. 이러한 바람직한 예로서 고분자 및 블록코폴리머등이 사용 될 수 있으며 여기서 사용되는 단위소는 아크릴릭산, 알킬아크릴릭산, 아타코닉산, 말레익산, 퓨마릭산, 아크릴아미도메틸프로페인슐폰산, 비닐술폰산, 비닐인산, 비닐락틱산, 스타이렌술폰산, 알릴암모늄, 아클릴로나이트릴, N-비닐피롤리돈, N-비닐포름애마이드 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 수용성 나노입자에 있어서 바람직한 다작용기 리간드의 다른 예는 펩타이드(peptide)이다. 펩타이드는 수개의 아미노산으로 이루어진 올리고머/폴리머로서, 아미노산은 양 말단에 -COOH와 -NH2 작용기를 보유하고 있기 때문에 펩타이드는 자연적으로 부착영역과 활성성분 결합영역을 구비하게 된다.
본 발명에서 이용되는 다작용기 리간드는 생분해성 고분자와 결합된 형태일 수 있다. 상기 생분해성 고분자의 예에는 덱스트란, 카르보덱스트란, 폴리사카라이드, 사이클로덱스트란, 풀루란, 셀룰로오즈, 녹말, 글리코겐, 카르보하이드레이트, 단당류, 이당류 및 올리고당류, 폴리포스파젠, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산, 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트, 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함된다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 상기 수용성 망간 산화물 나노입자의 활성성분 결합영역에 생체 기능성을 띠는 화학 기능성 분자 및 생체 기능성 물질을 결합시킨 수용성 망간 산화물 나노 하이브리드 입자를 제공한다.
본 발명에서 수용성 망간 산화물 나노 하이브리드 입자의 한 예로서 수용성 망간 산화물에 화학 기능성 분자가 결합된 형태이다. 화학기능성 분자에는 다양한 기능성 단분자, 고분자, 무기 지지체 등이 포함된다. 여기에서 단분자의 예로는 다양한 종류의 단분자로서 항암제, 항생제, 비타민, 폴산을 포함하는 약물, 지방산, 스테로이드, 호르몬, 퓨린, 피리미딘, 단당류, 이당류이 포함되지만 이에 한정되는 것은 아니다. 고분자의 예로는 덱스트란, 카르보덱스트란, 폴리사카라이드, 사이클로덱스트란, 풀루란, 셀룰로오즈, 녹말, 글리코겐, 카르보하이드레이트, 단당류, 이당류 및 올리고당류, 폴리포스파젠, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 및 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트, 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈 등이 포함된다. 무기 지지체의 예로는 실리카(SiO2), 티타니아(TiO2), 인듐틴옥사이드(ITO), 탄소 물질(나노튜브, 흑연, 플러렌 등), 반도체 기판(CdS, CdSe, CdTe, ZnO, ZnS, ZnSe, ZnTe, Si, GaAs, AlAs 등), 금속 기판 (Au, Pt, Ag, Cu 등)이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 나노 하이브리드 입자의 한 예는 수용성 망간 산화물 나노 입자와 생체 기능성 물질이 선택적으로 결합된 형태의 것이다. 생체 기능성 물질은 단백질, 펩타이드, DNA, RNA, 항원, 합텐(hapten), 아비딘(avidin), 스트렙타비딘(streptavidin), 뉴트라비딘 (neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin)과 같은 조직 특이적 결합 성분들(tissue-specific binding substances); 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨(interleukin), 인터페론(interferon), 성장 인자(growth factor), 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor), 엔도톡신(endotoxin), 림포톡신(lymphotoxin), 유로키나제(urokinase), 스트렙토키나제(streptokinase), 조직 플라스미노겐 활성제(tissue plasminogen activator), 프로테아제 저해제(protease inhibitor), 알킬 포스포콜린(alkyl phosphocholine), 계면활성제, 심혈관계 약물(cardiovascular pharmaceuticals), 위장관계 약물(gastrointestinal pharmaceuticals), 신경계 약물(neuro pharmaceuticals)과 같은 약제학적 활성성분, 가수 분해 효소, 산화-환원 효소, 분해 효소, 이성질화 효소, 합성효소 등의 생체활성 효소, 효소 공인자 (enzyme cofactor), 효소 억제제 (enzyme inhibitor) 등이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따라 형성된 수용성 망간 산화물 나노 하이브리드 입자는 기존의 산화철을 포함하는 자기 공명 영상제에 비교하여 우수한 자기 모멘트를 가지기 때문에 훨씬 더 높은 수준의 고감도 진단을 가능케 할 수 있다. 또한 기존의 사용되던 자기 공명 영상제에 비해 더 작은 양만 사용해도 원하는 정도의 신호 증가 효과를 가져 올수 있어 기존의 물질에 비해 체내 독성 및 부작용이 더 작은 영상제로 이용이 가능하다.
이하에서, 본 발명의 수용성 망간 산화물 나노입자의 제조방법에 대해서 구체적으로 설명한다.
본 발명에 따른 수용성 망간 산화물 나노 입자는 당업계에 알려진 기상(gas phase)에서의 나노 입자 합성법 또는 수용액, 유기용매, 또는 다용매계 등을 포함하는 액상 (liquid phase)에서의 나노 입자 합성법을 통해 얻어질 수 있다.
본 발명의 나노입자의 바람직한 제조방법의 하나의 예로서, (1) 수불용성 나노입자를 유기 용매에서 합성하는 단계, (2) 상기 수불용성 나노입자를 제1용매에 용해하고 수용성 다작용기 리간드를 제2용매에 용해하는 단계, (3) 상기 단계 (2)에 따른 두 용액을 혼합하여 수불용성 나노입자의 표면에 다작용기 리간드를 도입시키고 수용액에 용해하여 분리하는 단계를 거쳐서 제조할 수 있다.
상술한 제조방법의 단계 (1)은 수불용성 나노입자의 제조방법에 관한 것이 다. 본 발명에서는 한 예로서 표면 안정제를 포함하는 10 내지 600℃의 유기 용매에 나노입자 선구물질을 투입하고 목적한 수불용성 나노입자를 제조하기에 적합한 온도 및 시간을 유지해서 상기 나노입자 선구물질을 화학반응하여 나노입자를 성장시킨 다음 이로부터 형성된 수불용성 나노입자를 분리 및 정제하는 단계를 거쳐서 수불용성 나노입자를 제조할 수 있다.
상기 유기 용매로는 벤젠계 용매 (예를 들면 벤젠, 톨루엔, 할로벤젠 등), 탄화수소 용매 (예를 들면 옥탄, 노난, 데칸 등), 에테르계 용매 (예를 들면 벤질 에테르, 페닐 에테르, 탄화수소 에테르 등), 폴리머 용매, 이온성 액체 용매가 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 제조방법의 단계 (2)에서는 앞서 제조된 나노입자를 제 1 용매에 용해하는 한편 다작용기 리간드를 제 2 용매에 용해한다. 상기 제 1 용매로는 벤젠계 용매 (예를 들면 벤젠, 톨루엔, 할로벤젠 등), 탄화수소 용매 (예를 들면 펜탄, 헥산, 노난, 데칸 등), 에테르계 용매 (예를 들면 벤질 에테르, 페닐 에테르, 탄화수소 에테르 등), 할로 탄화수소 (예를 들면 염화메틸렌, 브롬화 메탄 등), 알코올류 (예를 들면 메탄올, 에탄올 등), 술폭사이드계 용매 (예, 디메틸술폭사이드 등), 아마이드계 용매 (예, 디메틸포름아마이드 등) 등이 이용될 수 있다. 상기 제 2 용매로는 전술한 제1 용매로서 이용될 수 있는 용매 외에도 물이 이용될 수 있다.
상기 제조방법의 단계 (3)에서는 상기 두 용액을 혼합하는데, 이 때에 수불용성 나노입자의 유기성 표면 안정제가 수용성 다작용기 리간드로 치환된다. 이와 같이 수용성 다작용기 리간드로 치환된 나노입자는 당업계에 공지된 방법을 이용하 여 분리할 수 있다. 일반적으로 수용성 나노입자는 침전물로서 생성되기 때문에 원심분리 또는 여과를 이용하여 분리하는 것이 바람직하다. 상기 분리 후에는 보다 안정하게 분산되어 있는 수용성 나노입자를 수득하기 위해서 적정(titration)하는 단계를 거쳐 pH를 5 내지 10으로 조절하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명의 수용성 나노입자는 다른 방법으로서 금속 선구물질의 수용액내의 화학반응을 통한 결정성장을 통해 합성될 수도 있다. 이 방법은 다작용기 리간드를 포함하는 수용액에 망간이온 선구물질을 첨가함으로서 수용성 망간 산화물 나노 입자를 합성하는 방법으로 기존의 공지된 수용성 나노 입자의 합성방법을 통해 이루어질 수 있다.
이하에서, 수용성 망간 산화물 나노 물질을 포함한 자기 공명 영상제를 이용한 응용에 대해서 구체적으로 설명한다.
수용성 망간 산화물 나노 입자는 기존의 산화철 나노 입자에 비해 훨씬 뛰어난 스핀-스핀 이완 자기 공명 영상 신호 증폭 효과 (R2 스핀-스핀 이완 계수: ~360 Lmol-1sec-1) 보여주므로 기존의 자기 공명 영상을 이용한 진단을 획기적으로 발전시켜 질병의 조기 진단 및 극소량의 생체 분자를 검출을 가능하게 한다. 일반적으로 암세포와 같은 병원체의 표면에는 특별하게 과발현되는 생물학적 표지자가 존재하고 있다. 그 이후에 당업계에 공지된 방법에 의해 이러한 생물학적 표지자와 선택적으로 결합이 가능한 항체를 얻을 수 있다. 또는 이미 알려진 물질을 사용할 수도 있다. 따라서 이와 같은 방법으로 얻은 항체와 같은 물질과 수용성 망간 산화물 나노입자를 앞에 설명한 방법대로 나노입자의 활성 성분 결합영역과 결합시킨다. 이렇게 합성된 하이브리드 입자는 따라서 선택적으로 암세포와 결합할 수 있게 된다. 이렇게 해서 암세포에 표지된 자성 입자는 자기 공명 영상 신호를 보이게 되어 진단이 가능하게 된다.
이 때 수용성 망간 산화물 나노 입자는 기존에 사용되어 오던 산화철을 포함하는 자성 나노 입자에 비해 훨씬 우수한 민감도를 가지고 있으므로 훨씬 고감도의 암진단을 가능케 한다. 따라서 훨씬 작은 크기의 암세포 진단을 통한 암의 조기진단을 가능케 할 수 있다.
또한, 본 발명에서 제시한 수용성 망간 산화물 나노 입자는 pH 변화 온도 변화 등의 외부 자극에 의해 망간 이온을 방출시킬 수 있다. 이렇게 방출된 망간 이온은 자기 공명영상에 있어 T1 스핀-격자 이완 시간을 증가시켜 T1 조영효과를 나타낼 수 있으므로 특정한 생체내 환경변화에 따른 망간 이온의 방출을 통해 자기 공명 영상 진단이 가능하다.
수용성 망간 산화물 나노 입자는 또한 다른 진단 프로브와 결합되어 이중 또는 다중 진단 프로브로 사용될 수 있다. 예를 들면, 수용성 망간 산화물에 T1 자기 공명 영상 진단 프로브를 결합시키면 T2 자기 공명 영상 및 T1자기 공명 영상 진단을 동시에 진행할 수 있으며, 광학 진단 프로브를 결합시키면 자기 공명 영상과 광학 이미징을 동시에 할 수 있으며, CT 진단 영상제를 결합시키면 자기 공명 영상과 CT 진단을 동시에 할 수 있다. 또한 방사선 동위원소와 결합시키면 자기 공명 영상과 PET, SPECT 진단을 동시에 할 수 있다.
[발명의 실시를 위한 형태]
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1 : 망간 페라이트 (MnFe2O4) 나노 입자와 산화철, 코발트 페라이트, 및 니켈 페라이트 나노 입자의 자기 공명 영상 효과 비교
본 명세서에서 개발된 망간 페라이트 나노 입자 (12 nm)가 기존의 산화철 및 다른금속 페라이트 나노 입자 보다 더 좋은 자기 공명 영상 조영 효과를 나타내는지 확인하기 위해, 같은 크기의 산화철, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트 나노 입자 (MFe2O4, M=Fe, Co, Ni)의 자화율 및 R2 스핀-스핀 이완 자기 공명 영상을 측정하였다.
우선 각각 나노 입자는 대한민국 특허 제10-0604976호 대한민국 제10-0652251, PCT KR2004/002509, 대한민국 특허 제 10-0604976호, PCT KR2004/003088, 대한 민국 특허 2006-0018921호 에 나타낸 방법에 따라 합성하였으며, 얻어진 나노 입자는 도면 1의 (가)에 나타내었듯이 모두 같은 크기의 균일한 12 nm 크기의 구형 형태이며, 그 표면은 디머켑토숙신산으로 코팅되어 있다.
얻어진 각각의 나노 입자의 자화율을 측정하기 위해 MPMS superconducting quantum interference device (SQUID) magnetometer를 사용하였으며, -5T에서 5T 범위의 외부 자기장 크기의 변화를 주며 관측하였다. 도면 1의 (나)에 나타내었듯 이, 망간 페라이트 나노 입자는 110 emu/g(Mn+Fe) (@1.5T)　으로 가장 높은 자기적 성질을 나타내는 반면, 산화철 나노 입자 및 코발트 페라이트, 니켈 페라이트 나노 입자는 이보다 낮은 자기적 성질을 나타낸다 (각각 101, 99, 85 emu/(g(M+Fe)). 이러한 결과는 스피넬 구조를 갖는 금속 페라이트 나노 입자에 각각 다른 d 오비탈 스핀 모멘트를 갖는 금속 이온 치환 효과에 기인한다.
이러한 나노 입자의 자기 공명 영상의 조영 효과를 보기 위하여 T2 스핀-스핀 이완 자기 공명 영상을 측정하였다. 이를 위해 micro-47 코일이 장착된 1.5 T(Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였다. 자기 공명 영상 결과는 Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) sequence를 이용하여 얻었다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156 x 156㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR = 400ms, 영상여기횟수 1, 영상획득시간 6 분. 도면 1의 (다)에 나타내었듯이 망간 페라이트 나노 입자가 가장 강한 자기 공명 영상 신호 (검은색)을 나타내었으며, 산화철, 코발트 페라이트, 니켈 페라이트의 자기 공명 영상 신호가 점점 옅은 회색으로 변하면서 감소함을 알 수 있다. 조영효과 비교의 척도인 R2 스핀-스핀 이완 계수의 경우 망간 페라이트 나노 입자의 경우 358 mM-1s-1 로 같은 크기를 갖고 있는 산화철을 포함한 다른 금속 페라이트 나노 입자에 비해 훨씬 증가된 값을 나타냄을 알 수 있었으며, 이는 당업계에서 현재까지 가장 좋은 분자 자기공명 영상제로 알려진 cross-linked iron oxide (CLIO) 산화철 나노 입자의 R2 계수 (68 mM-1s-1)의 약 5배 이상 증가된 값을 나타낸다 (도면 1(라)).
이러한 망간 페라이트 나노 입자의 우수한 자기 공명 조영 효과가 코팅된 리 간드에 상관없이 항상 나타나는지 확인하기 위해 다양한 다작용기 리간드로 코팅된 망간 페라이트 나노 입자와 산화철 나노 입자의 자기 공명 조영 효과를 비교하였다. 리간드로는 위에서 제시한 디머켑토숙신산에 추가하여 일반적으로 많이 사용되는 리간드인 3-카르복실프로필포스포닉산과 덱스트란을 사용하였다.
도 1 (마,바)에서 보여주듯이 다작용기 리간드의 종류에 상관없이 망간 페라이트 나노 입자가 항상 산화철 나노 입자에 비해 증가된 자기 공명 영상 신호 (검은색)를 보여주었다. 또한 R2-이완 시간 도표에서 보여주듯이 수용성 망간 산화물 나노 입자가 기존의 산화철 나노 입자에 비해 20 ~ 120 % 만큼 더 증가된 신호를 나타냄을 확인할 수 있었다.
자기 공명 영상 조영효과는 크기에 따라서도 크게 영향을 받기 때문에, 다양한 크기의 망간페라이트 나노 입자와 같은 크기의 산화철 나노 입자의 자기 공명 영상효과에 대한 비교를 진행하였다. 이를 위해 6, 9, 12 nm 크기의 망간 페라이트 나노 입자 및 산화철 나노 입자를 대한민국 특허 제10-0604976호 대한민국 특허 제10-0652251, PCT KR2004/002509, 대한민국 특허 제 10-0604976호, PCT KR2004/003088, 대한민국 특허 2006-0018921호에 나타낸 방법에 따라 합성하고 상기 제시된 Carr-Purcell-Meiboom-Gill (CPMG) sequence를 이용하여 자기 공명 영상을 측정하였다. 도면 2의 (가)에 합성된 나노 입자의 전자 현미경 사진을 나타내었다. 얻어진 망간 페라이트 나노 입자의 질량 자화율은 도면 2의 (나)에 나타내었듯이 그 크기가 증가함에 따라 증가함을 알수 있다. 이와 일치하게 망간페라이트 나노 입자의 크기가 증가함에 따라 자기 공명 이미지가 점점 검은색으로 변화하면서 신호가 증가함을 알 수 있으며 (도면 2(다), 측정된 R2 이완 계수 역시 증가함을 할 수 있다 (도면 2의 (라)). 같은 크기의 망간 페라이트 나노 입자와 산화철 나노 입자를 비교하였을 경우, 6, 9, 12 nm 의 모든 크기에서 망간 페라이트 나노 입자가 산화철 나노 입자보다 증가된 조영효과를 나타냄을 확인할 수 있다.
실시예 2: 다양한 다작용기 리간드로 둘러싸인 수용성 망간페라이트 나노 입자의 수용액상 콜로이드 안정성 확인
수용성 망간 페라이트 나노 입자의 수용액상 콜로이드 안정성을 확인하기 위해 아가로오즈 젤 전기 영동 분석 및 다양한 염농도 및 산도에서의 안정성 검사를 하였다. 각각의 다양한 리간드로 코팅된 망간페라이트 나노 입자는 대한민국 특허 제10-0604976호 대한민국 특허 제10-0652251, PCT KR2004/002509, 대한민국 특허 제 10-0604976호, PCT KR2004/003088, 대한민국 특허 2006-0018921호에 나타낸 방법에 따라 합성하였다. 도 2(가)에서 보여주듯이 디머켑토숙신산으로 리간드로 둘러싸인 나노 입자는 아가로오즈 젤에서 얇은 전기영동 밴드를 보이면서 (+)전극 쪽으로 이동하는 것으로 보아 수용액에서 뭉침 없이 균일한 크기로 잘 분산되어 있음을 확인할 수 있다 . 또한 다양한 종류의 수용성 리간드로 표면 안정화된 수용성 망간 페라이트 나노 입자에 대해 안정도 검사를 실시한 결과 (도 3(나-자)) 모든 종류의 나노 입자는 0.2M의 염농도 및 pH 5 ~ pH 9에서 안정하였으며 덱스트란, 하이프로멜로즈, 보바인혈청알부민, 휴먼혈청알부민, 뉴트라비딘으로 표면안정화된 나노 입자의 경우 1M의 염농도에서조차 안정함을 확인하였다. 이중 덱스트란, 보바 인혈청알부민, 휴먼혈청알부민으로 표면 안정화된 나노 입자는 아주 넒은 범위의 산도 (pH1 ~ pH 11)에서 매우 높은 콜로이드 안정성을 확인하였다. 또한 옥틸아민-폴리아크릴산 공중합체 고분자를 사용하여 소수성 결합을 통해 표면 안정화된 나노 입자의 경우에도 0.5M 염농도 및 pH 3~11의 범위에서 안정하였다. 이는 In vitro 또는 In vivo 실험에서의 염농도가 약 0.1M임을 감안할 때, 아주 높은 수용액성 콜로이드 안정성을 나타냄을 의미한다.
실시예 3 : 유방암 진단용 망간 페라이트-허셉틴(허셉틴) 나노하이브리드 입자의 제조
나노 하이브리드 제조 과정에 대한 요약도를 도 4(가)에 나타내었다. 허셉틴[(10mg/ml, in 10mM 인산완충용액, pH7.2) Genentech, Inc., South San Francisco, CA, USA] 100㎕를 취하여 에펜도르프 튜브에 담은 후, 0.2mg의 sulfo-SMCC [40(N-Maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylic acid 3-sulfo-N-hydroxy-succimide ester]를 첨가하여 실온에서 30분 동안 반응시켜 허셉틴의 리신 잔기를 말레이미드기로 치환시켰다. 과량의 sulfo-SMCC 분자들은 Sephadex G-25 column을 통해 제거한 후, 말레이드기로 치환된 허셉틴을 200㎕의 수용성 망간 페라이트 나노입자를 함유한 용액(10mM PB, pH 7.2, 2mg/ml)과 24시간 동안 실온에서 반응시켰다. 반응이 끝난 후 Sephacryl S-300 column을 통하여 반응하지 않은 허셉틴과 산화철 수용성 나노입자를 제거한 후 센트리콘 여과 키트(centricon filtration kit)를 이용하여 약 2mg/ml의 농도로 농축시키는 과정을 통해 망간 페라이트-허셉틴 나 노하이브리드 입자를 제조하였다. 제조된 나노 하이브리드 입자는 아가로오즈 전기영동 실험을 통해 분석하였다. 쿠마시 블루 (Coomassie Blue) 단백질 염색 결과 나노 하이브리드가 생성되었음을 확인할 수 있었다 (도 4(나)).
실시예 4 : 망간 페라이트-허셉틴 나노하이브리드 입자의 In Vitro에서의 종양 세포 선택성 확인 및 산화철 나노 하이브리드 입자와의 감도 비교
상기 실시예 3에서 제조된 망간 페라이트-허셉틴 나노하이브리드 입자의 유방암 표지 항원인 HER2/neu 항원에 대한 결합 특이성 및 효율을 분석하기 위하여 in vitro 자기 공명 영상 실험을 시행하였다.
HER2/neu 항원 미발현, 발현 및 과발현 세포주들에 대하여 망간페라이트-허셉틴 나노하이브리드 입자를 반응시키는 과정은 다음과 같았다. 먼저 상기 세포주들을 실온에서 0.25% 트립신/EDTA를 사용하여 분리하였다. 망간 페라이트-허셉틴 나노하이브리드 입자를 107 세포를 포함하는 50㎕ PBS 완충용액에 나노 입자 기준으로 2.5 nM 농도로 첨가하였다. 이것을 4℃에서 30분동안 반응시킨후 3번 세척해 주었다. 한편, 대조군으로 CLIO-허셉틴 나노하이브리드 입자를 이용하였다.
자기 공명 영상을 이용하여 망간 페라이트-허셉틴 나노하이브리드 입자의 항원 특이성을 분석하기 위해 각각의 세포들을 PCR용 튜브로 옮긴 후 원심분리하여 세포를 가라앉혔다. 각 세포주들의 항원 특이성에 따른 자기 공명 영상의 조영효과를 보기 위해 1.5 T(Intera; Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였으며, micro-47 코일을 이용하였다. Fast Field Echo(FFE) 펄스 열을 가지고 관상면의 영상을 얻었다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156 x 156㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR = 400ms, 영상여기횟수 1, 영상획득시간 6 분. 항원 특이성에 대한 자기 공명 영상 조영효과의 정량적 평가를 위해 T2 맵을 시행하였다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156 x 156㎛, 절편두께 0.6mm, TR = 4000ms, TE = 20, 40, 60, 80, 100, 120, 140, 160ms, 영상여기횟수 2, 영상획득시간 4분.
도 5의 결과는 망간 페라이트-허셉틴 나노 하이브리드가 HER2/neu 종양 마커를 감지하는 자기 공명 영상을 통해 결과를 나타낸다. 그림에서 알 수 있듯이 가장 낮은 HER2/neu를 발현하는 Bx-PC-3 세포의 경우 ~10% 영상 조영 증강 효과 (ΔR2/Rcontrol)를 보이며 종양 마커를 효과적으로 감지할 수 있었다 (도 5(가),(나)). 또한 더 많은 HER2/neu를 발현하는 세포 즉, MDA-MB-231, MCF-7, NIH3T6.7 세포에 경우에는 ~ 40 %, 70 %, 130 %의 조영 증강 효과를 나타냄을 알 수 있었다. (도 5(가),(나))
이와는 달리 대조군 CLIO-허셉틴 나노 하이브리드의 경우 가장 높은 HER2/neu 발현을 나타내는 NIH3T6.7 세포의 경우에만 ~ 10 %의 조영 증강 효과를 보여주었으며, 이보다 낮은 종양 마커 발현을 나타내는 세포에 대해서는 6% 이하의 미미한 조영 효과만을 나타내었다 (도 5(다)).
개발된 망간 페라이트-허셉틴 나노 하이브리드를 NIH3T6.7 세포에 투여한 경우와 CLIO-허셉틴 나노 하이브리드를 NIH3T6.7 세포에 투여한 경우의 R2 이완계수의 변화를 비교해 보았을 때 본 명세서에서 제시된 망간 페라이트-허셉틴 나노 하 이브리드를 사용하였을 때 약 13배 정도의 큰 R2 이완계수의 변화가 있음을 확인할 수 있다. 또한 망간 페라이트-허셉틴 나노 하이브리드를 투여한 Bx-PC-3 세포와 CLIO-허셉틴 나노 하이브리드를 투여한 NIH3T6.7 세포에서 거의 같은 조영증강 효과를 나타냄과, 두 세포의 HER2/neu 발현 비율이 1 (Bx-PC-3) : ~2300 (NIH3T6.7) 임을 감안할 때, 개발된 망간 페라이트-허셉틴 나노 하이브리드가 기존의 산화철-허셉틴 나노 하이브리드에 비해 유방암 마커의 약 2300 배의 검출 한계의 증가를 보여줌을 확인할 수 있었다 (도 5(라)).
실시예 5 : 망간 산화물의 세포 안정성 평가
이러한 나노 입자가 in vitro 및 in vivo에서 자기 공명 영상 진단제로 사용되기 위해서는 이러한 나노 입자의 안정성 평가 또한 중요하다. 따라서 실시예 1에서 합성된 디머켑토숙신산으로 코팅된 망간 페라이트 나노 입자 및 실시예 4에서 사용한 망간페라이트-허셉틴 하이브리드 나노 입자의 세포 독성 실험을 진행하였다. 도 6에 나타난 것과 같이 상기 두 나노 입자는 200 μg/ml까지의 실험 범위 농도에서 거의 ~100 % 의 세포 생존율을 보여주며 독성을 보이지 않음을 확인할 수 있었다.
실시예 6 : 산화 망간 (Mn3O4) 를 이용한 T2 자기 공명 영상 진단
수용성 산화 망간 나노 입자의 T2 자기 공명 영상 효과를 알아보기 위해 3 nm x 8 nm 크기의 산화 망간 나노 입자 용액의 T2 맵 자기 공명 영상 측정하였다. 산화 망간 나노 입자는 도면 6에서 보여주듯이 산화 망간 나노 입자는 대한민국 특허 제10-0604976호 대한민국 특허 제10-0652251, PCT KR2004/002509, 대한민국 특허 제 10-0604976호, PCT KR2004/003088, 대한민국 특허 2006-0018921호에 나타낸 방법에 따라 합성하였다. 얻어진 나노 입자의 전자현미경 사진을 도 7의 (가)에 나타내었다. 나노 입자가 함유되지 않는 수용액에 비해 T2 자기 공명 영상에 있어 큰 조영효과를 나타냄을 할 수 있었다 (도 7). 따라서 산화 망간 나노 입자는 T2 조영제로서 사용할 수 있음을 알 수 있다.
실시예 7 : 망간이온 방출 효과를 이용한 T1 자기 공명 영상 진단
망간 페라이트 및 산화 망간 나노 입자에 포함되어 있는 망간 이온 방출효과를 이용하여 T1 자기 공명 영상 진단이 가능한지 확인하기 위해 pH 변화에 따른 T1 자기 공명 영상을 측정하였다. 자기 공명 영상의 조영효과를 보기 위해 1.5 T(Intera Philips Medical Systems, Best, The Netherlands) 시스템을 사용하였으며, micro-47 코일을 이용하였다. Fast Field Echo(FFE) 펄스열을 가지고 관상면의 영상을 얻었다. 구체적인 파라미터는 다음과 같았다: 해상도 156 x 156㎛, 절편두께 0.6mm, TE = 20ms, TR = 400ms, 영상여기횟수 1, 영상획득시간 6분. 망간페라이트 나노 입자는 실시예 1에서 합성된 12 nm 크기의 나노 입자를 사용하였으며 산화망간 나노 입자는 실시예 6에서 합성된 나노 입자를 사용하였다.
도면 8(나)에 나타낸 것과 같이 망간페라이트 나노 입자의 경우 중성의 용액상에서 매우 약한 T1 조영효과가 있으나 (도 8 나(9)) 산성의 낮은 pH (pH = 2, 4) 용액에서는 망간페라이트 나노 입자에서 Mn2+이 방출되어 자기 공명 영상 결과에서 T1신호가 밝은색으로 변하는 조영효과를 나타낸다 (도 8 나(7,8)). 또한 도면 8(다)에 나타낸 것과 같이 중성의 용액에서는 산화망간이 전혀 T1 조영효과가 나타나지 않지만 (도 8 다(12)) 산성의 낮은 pH (pH = 2) 용액에서는 산화 망간 나노 입자에서 Mn2+이 방출되어 자기 공명 영상 결과에서 T1신호가 밝은색으로 변하는 조영효과를 나타낸다 (도 8 다(11,16)).
나노 입자가 용해되어 생긴 Mn2+에 대한 정량화를 위해 농도가 정해진 Mn2+ 이온을 포함하는 용액들에 대한 T1을 측정하여 검량선을 작성하였다 (도 8 (가)). 이를 바탕으로 도면 8(마) 에서 보인바와 같이 산화망간 나노입자의 경우 pH 4에서 150 μM의 Mn2+ 및 pH 2에서 200 μM의 Mn2+이온이 용액 속에 존재함을 알 수 있었다. 이와 마찬가지로 MnFe2O4 나노 입자의 경우에도 검량선을 이용하여 pH 2, pH 4에서 존재하는 Mn2+ 농도증가를 확인할 수 있었다 (도 8(라)).
따라서, 산화 망간 나노 입자는 특정한 위치에 주입한 후 외부 자극에 의해 Mn2+을 방출하여 T1 조영효과를 나타내는 진단 프로브로서 사용 할 수 있음을 확인할 수 있다.
실시예 8: 수용성 망간페라이트 나노 입자-허셉틴 하이브리드 시스템을 이용한 IN VIVO 고감도 암진단
수용성 망간 페라이트-허셉틴 나노하이브리드 시스템을 이용하여 in vivo MRI 상에서 작은 크기의 유방암 조직을 진단하는 데 성공하였다. 망간 페라이트 나 노입자-허셉틴 하이브리드 입자는 실시예 3에서 나타낸 대로 합성하였다. 이 물질은 Her2/neu 마커가 과발현된 NIH3T6.7 세포주가 이식된 후 3일이 지나 종양의 크기가 5mm x 5mm x 2mm로 자란 누드 마우스 (n=8)에 꼬리 정맥 주사를 통하여 20 mg/kg의 농도로 주사되었고 주사 후 1, 2, 8시간이 지난 후 자기 공명 영상을 측정하였다. 이와 함께 대조군으로서 CLIO-허셉틴 하이브리드 및 산화철(Fe3O4)-허셉틴 나노하이브리드를 이용하여 같은 실험을 수행하였다.
도 9에 나타낸 컬러 코딩된 자기 공명 영상 결과를 통해 망간페라이트-허셉틴 나노하이브리드 (도 9(가-다))는 산화철-허셉틴 나노하이브리드 (도 9(라-바)) 및 CLIO-허셉틴 나노하이브리드 (도 9(사-자))와 비교하였을 때 종양 부위에서 2시간이 지난 후 처음과 비교 하였을 때 색깔이 붉은색에서 푸른색으로 완전히 바뀌는 것을 알 수 있다. 이와 반면에 산화철-허셉틴 나노하이브리드의 경우 2시간이 지난 후 색이 붉은색에서 붉은색과 노란색이 혼합되어 있는 상태로 변화되었고, CLIO-허셉틴 나노하이브리드의 경우는 2시간이 지난 뒤에서 전혀 색의 변화가 없었다. 또한 각각의 물질에 대해 종양 부위의 MR R2 변화값(ΔR2/R2control)을 측정해 본 결과 도면 9(차)에서 보인대로 망간 페라이트-허셉틴 나노하이브리드의 경우 8시간 경과 후 35%의 R2 이완 계수의 변화가 관측된 반면 산화철-허셉틴 나노하이브리드 및 CLIO-허셉틴 나노하이브리드의 경우 각각 10%와 3%의 R2 이완 계수의 변화가 관찰되었다.
위의 결과를 통해 망간페라이트-허셉틴 하이브리드 입자를 자기 공명 영상 암진단 영상제로 사용하였을 경우 기존의 물질들 -산화철 및 CLIO-에 비해 더 우수 한 신호 증강 효과를 가져옴을 알 수 있었으며 이를 통해 작은 크기의 암진단에 성공하였다.
실시예 9: 방사성 동위원소 111In으로 표지된 망간 페라이트-허셉틴 나노 하이브리드입자의 IN VIVO 생체분포
망간페라이트-허셉틴 나노 하이브리드 입자에 방사성 동위원소인 111In을 붙여 in vivo 상에서의 체내 분포를 확인하였다. In vivo 실험에 사용한 쥐는 실시예 7에서 사용한 것과 같은 조건의 쥐 (n=3)를 사용하였다. 111In으로 표지된 망간 페라이트-허셉틴 나노 하이브리드 입자는 다음과 같은 방법으로 합성되었다. 먼저 10mg의 허셉틴을 1ml의 2.5mM pH 6.5의 소듐 아세테이트 버퍼에 녹인 후, 각각 1 mg의 DTPA(diethylenetriaminepentaacetate)와 sulfo-SMCC를 섞어 주었다. 1시간의 반응 뒤, 말레이미드 및 DTPA로 활성화된 허셉틴은 세파덱스G-25 컬럼을 통해 분리하였고, 즉시 4mg의 수용성 망간페라이트 나노입자와 섞어 반응시켰다. 4시간뒤, 반응 하지 않고 남아있는 허셉틴 및 나노 입자를 세파크릴S-300 컬럼으로 분리해준 뒤, 분리된 나노입자 용액에 3 mCi의 111InCl3를 섞어주어 반응 시켰다. 1시간의 반응 뒤 111In으로 표지된 망간 페라이트-허셉틴 나노 하이브리드 입자는 세파덱스G-25 컬럼을 사용하여 분리한 후 0.4 mg (M+Fe)의 물질을 바로 쥐의 꼬리 정맥 주사를 통해 생체 내로 투입하였다. 이후 g-카메라 및 g-카운터를 사용하여 생체 분포도를 조사하였다.
도면 10 (가,나)에서 나타난 바와 같이 2시간 경과 후 나노 하이브리드 입자 는 주로 간, 비장, 방광등에 분포하는 것을 알 수 있으며 꼬리 주사지점에도 강한 신호가 관찰되었다. 그러나 24시간 경과 후 꼬리 주사지점에서의 신호는 감소되었고 종양이 있는 부위에 신호가 감지되는 것을 확인하였다. 이를 바탕으로 이후 각각의 장기를 적출하여 g-카운터를 사용하여 생체 분포를 조사한 결과 도면 10(다)에 나타낸 대로 간, 비장, 근육에 각각 12.8±3.0, 8.7±3.2, 1.0±0.3의 신호를 보였으며 종양에서는 3.4±0.7 %ID/g의 생체 분포도를 관찰하였다.
실시예 11: 광학-MRI 이중모드 진단용 나노 하이브리드 시스템
광학적 성질과 자성을 동시에 가지는 진단용 프로브를 개발하기 위해 보바인혈청알부민으로 표면 안정화된 망간 페라이트 나노 입자에 형광 염료 (FITC)를 붙여 자성과 형광을 동시에 가지는 하이브리드 입자를 개발하였다 (도 11 가). 이를 위해 보바인 혈청 알부민에 존재하는 -NH2 의 몰비로 20배 정도 과량의 NHS-FITC를 넣어주어 10mM의 인산완충용액 (phosphate buffered saline)에서 상온에서 2시간동안 반응시켜 주었다. 이 후 반응하지 않고 남아있는 과량의 NHS-FITC들은 완충용액상에서 투석 (MWCO, ~2000)으로서 제거해 주었다. 결과, 도면 11에 보이는 대로 본 광학-자성 하이브리드 입자는 형광을 가지고 있으며 또한 자기 공명 영상 신호도 동시에 가짐을 확인하였다.
본 발명에 따른 수용성 망간 산화물 나노입자와 수용성 망간 산화물 나노 하이브리드 물질은 균일한 크기를 갖고 있으며, 수용액에서 특히 안정하고, 자기적 성질이 매우 우수하여, 기존의 산화철 나노 입자와 비교하여 자성성질을 현저히 증가 시켜 자기 공명 영상 감도를 획기적으로 증가 시키는 효과를 갖는다. 본 발명의 수용성 망간 산화물 나노 입자 혹은 그것들이 생체 물질과 결합된 나노 하이브리드 입자는 기존의 자기 공명 영상의 획기적인 개선 및 진단 치료 시스템 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (31)

  1. 수용성 망간 산화물 나노입자를 포함하는 자기 공명 영상제.
  2. 제1항에 있어서 상기 수용성 망간 산화물 나노 입자는 기상(gas phase)에서, 또는 수용액, 유기용매 및 다용매계 중 어느 하나의 액상 (liquid phase)에서 망간 선구 물질의 화학반응을 통해 결정화되어 얻어지는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자가 물에 대한 용해도가 1㎍/ml 이상이고 물에 용해된 나노입자의 수화반경이 1000nm 보다 크지 않는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  4. 제1항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자가 그 중심이 1 - 1000nm 크기의 망간 산화물로 이루어지고, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자는 MnOa (0<a≤5) 또는 MnMbOc(M은 M은 Li, Na, Be, Ca, Ge, Mg, Ba, Sr, Ra을 포함하는 1, 2족 원소, 또는 Ga, In 등을 포함하는 13족 원소, 또는 Y, Ta, V, Cr, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Hg, 등을 포함하는 전이금속원소, 또는 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 등을 포함하는 란탄족 또는 악티늄 족 원소로 이 루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 금속원자, 0<b≤5, 0<c≤10)인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  5. 제1항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자는 MnM'dFeeOf(M'은 Li, Na, Be, Ca, Ge, Mg, Ba, Sr, Ra을 포함하는 1, 2족 원소, 또는 Ga, In 등을 포함하는 13족 원소, 또는 Y, Ta, V, Cr, Co, Fe, Ni, Cu, Zn, Ag, Cd, Hg, 등을 포함하는 전이금속원소, 또는 La, Ce, Pr, Nd, Pm, Sm, Eu, Gd, Tb, Dy, Ho, Er, Tm, Yb 등을 포함하는 란탄족 또는 악티늄 족 원소로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 금속원자, 0<d≤5, 0<e≤5, 0<f≤15)인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  6. 제1항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자는 MngFehO4 (0<g≤4, 0<h≤4), MniFejZnkO4 (0<i≤4, 0<j≤4, 0<k≤4), MnxFeyCuzO4 (0<x≤4, 0<y≤4, 0<z≤4) 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  7. 제1항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자는 MnO, Mn2O3, MnO2, Mn3O4, Mn2O5 중 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  8. 제1항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자는 그 자체로 물에 녹거 나, 수용성 다작용기 리간드에 의해 코팅되는 것을 특징으로 하는 망간 산화물 나노입자 자기 공명 영상제.
  9. 제8항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자의 표면에 이온 결합, 공유 결합, 수소 결합, 소수성 결합 및 금속-리간드 배위 결합 중의 하나 이상의 결합에 의해 부착된 수용성 다작용기 리간드를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  10. 제9항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 수용성 망간 산화물 나노입자에 결합하는 부착영역(LI)을 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  11. 제10항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 활성성분을 결합시키기 위한 활성성분 결합 영역(LII), 또는 리간드 사이의 교차연결을 위한 교차연결영역(LIII), 또는 상기 활성 성분 결합 영역 (LII)과 교차연결 영역 (LIII)을 동시에 포함하는 활성 성분 결합 영역 (LII)-교차연결 영역 (LIII)을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  12. 제10항에 있어서, 상기 부착영역(LI)은 -COOH, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -PO4H, -SO3H, -SO4H, -OH 및 탄소 수 2개 이상의 탄화수소로 이루어진 그룹으로부 터 선택된 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  13. 제11항에 있어서, 상기 활성성분 결합영역(LII)은 -SH, -COOH, -NH2, -OH, -NR3 +X-, -N3, -SCOCH3, -SCN, 에폭시기, 술포네이트기, 니트레이트기, 포스포네이트기, 알데히드기, 하이드라존기, 알킨 및 알카인으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 1종 이상의 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  14. 제11항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 -SH, -COOH, -NH2 및 -OH 중 어느 하나 이상을 곁사슬로 갖는 아미노산을 하나 이상 포함하는 펩타이드인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  15. 제11항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 부착영역(LI)의 작용기로 -COOH기를, 활성성분 결합영역(LII)의 작용기로 -COOH기 또는 -SH기를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  16. 제11항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 부착영역(LI)의 작용기로 탄소수 2개 이상의 탄화수소 체인을, 활성 성분 결합영역(LII) 작용기로 -COOH, -SH, -NH2, -POxH (0<x≤4), -SOyH (0<x≤4), -NR4 +X- (R= CnHm 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl, Br), 또는 -OH를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  17. 제9항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 디머켑토숙신산, 디머켑토말레산 및 디머켑토펜타다이오닉산으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  18. 제9항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 덱스트란, 카르보덱스트란, 폴리사카라이드, 셀룰로오즈, 녹말, 글리코겐, 카르보하이드레이트, 단당류, 이당류, 올리고당류, 폴리포스파젠, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산, 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트, 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상을 포함하는 자기 공명 영상제.
  19. 제9항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 펩타이드류, 알부민류, 아비딘류, 항체류, 이차항체류, 시토크롬, 카세인, 미오신, 글리시닌, 케로틴, 콜라젠, 구형 단백질류, 및 경단백질류으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  20. 제11항 기재의 수용성 다작용기 리간드의 활성성분 결합영역(LII)에 활성성분이 결합된 형태인 수용성 망간 산화물 나노 하이브리드 입자를 포함하는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  21. 제20항에 있어서, 상기 활성 성분이 화학 기능성 단분자, 고분자, 무기지지체, 및 생체 기능성 물질로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  22. 제21항에 있어서, 상기 화학 기능성 단분자가 항암제, 항생제, 비타민, 폴산을 포함하는 약물, 지방산, 스테로이드, 호르몬, 퓨린, 피리미딘, 단당류, 이당류로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  23. 제21항에 있어서, 상기 고분자는 덱스트란, 카르보덱스트란, 다당류, 사이클로덱스트란, 풀루란, 셀룰로오즈, 녹말, 글리코겐, 카르보하이드레이트, 올리고당류, 폴리포스파젠, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산 및 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트, 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트, 폴리비닐피롤리돈으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  24. 제21항에 있어서, 상기 무기 지지체가 실리카(SiO2), 티타니아(TiO2), ITO(인듐주석산화물), 지르코니아(ZrO2) 및 비소화갈륨(GaAs), 실리콘(Si), 산화아연(ZnO), 황화아연(ZnS), 셀렌화아연(ZnSe) 텔루륨화아연(ZnTe), 황화카드뮴(CdS), 셀렌화카드뮴(CdSe), 텔루륨화카드뮴(CdTe), 황화납(PbS), 셀렌화납(PbSe), 텔루륨화납(PbTe)의 반도체로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  25. 제21항에 있어서, 상기 생체 기능성성분이 DNA, RNA의 핵산류, 펩타이드류, 항원류, 항체류, 합텐, 아비딘, 뉴트라비딘, 스트렙타비딘, 프로테인 A, 프로테인 G, 렉틴, 셀렉틴, 항암제, 항생제, 호르몬, 호르몬 길항제, 인터루킨, 인터페론, 성장 인자, 종양 괴사인자, 엔도톡신, 림포톡시, 유로키나제, 스트렙토키나제, 조직 플라스미노겐 활성제, 프로테아제 저해제, 알킬 포스포콜린, 계면활성제, 앱타머 (aptamer), 단백질 약물, 가수 분해 효소, 산화-환원 효소, 분해 효소, 이성질화 효소, 합성효소의 생체활성 효소, 효소 공인자 (enzyme cofactor), 효소 억제제 (enzyme inhibitor) 로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상 인것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  26. 제1항에 있어서, 상기 자기 공명 영상에서의 진단방법이 T2 스핀-스핀 이완 의 자기 공명 영상 진단방법인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  27. 제1항에 있어서, 상기 자기 공명 영상에서의 진단방법이 외부 자극 또는 생체 환경 변화에 의한 Mn2+방출에 의한 T1 스핀-격자 이완 자기 공명 영상 진단인 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  28. 제1항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자에 방사성 동위 원소 물질이 포함되는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  29. 제28항에 있어서, 단일광자방출컴퓨터단층촬영(SPECT, Single Positron Emission Computer Tomography) 또는 양전자 방출 단층촬영(PET, Positron Emission Tomography)에 사용되는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  30. 제1항에 있어서, 상기 수용성 망간 산화물 나노입자에 형광 물질이 포함되는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
  31. 제30항에 있어서, 광학 이미징(optical imaging and spectroscopy)에 사용되는 것을 특징으로 하는 자기 공명 영상제.
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