KR101178511B1 - 아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물 - Google Patents

아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 아연-함유 자성 나노 입자(바람직하게는, 타겟물질에 대해 결합 친화도를 가지는 결합제(binding agent)가 표면에 결합되어 있는 아연-함유 자성 나노 입자) 또는 이의 클러스터를 포함하는 아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에서 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자는 포화 자화율이 매우 높기 때문에, 이를 이용하는 본 발명의 자성 분리용 조성물은 크게 개선된 분리 효율을 갖는다. 본 발명에서 타겟물질에 결합하는 결합제의 종류를 달리하여 아연-함유 자성 나노 입자를 제조하면 다양한 타겟물질을 높은 효율로 분리 및/또는 검출할 수 있는 경제적인 시스템을 디자인할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 일반적인 검출 과정에서 요구되는 복잡한 pre-인리치먼트, 정제 또는 처리 과정 등이 필요 없다.

Description

아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물{Zinc-Containing Magnetic Nanoparticle-Based Compositions for Magnetic Separation}
본 발명은 아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물에 관한 것이다.
자성 나노 입자는 매우 다양한 응용 범위를 가지고 있는 것으로 밝혀졌다. 특히 바이오 의료 산업에 있어 자성을 이용한 다양한 응용 분야가 최근 개발됨에 따라 자성 나노 입자에 대한 관심이 더욱 증폭되고 있다. 이러한 응용 범위는 자기 공명 영상 조영제(MRI), 자성을 이용한 물질 분리, 자성을 이용한 약물 전달, 자성을 이용한 물질 센서 및 고주파 자기장 열 치료 등이 있다.
최근까지 다양한 자성 나노 입자들이 개발되고 이들 응용에 사용이 되고 있는데, 현재 이용되고 있는 대부분의 자성 나노 입자는 산화철 나노 입자들이다. 산화철 나노 입자는 다양한 합성 방법이 개발되어 있어, 손쉬운 합성이 가능하고 합성에 드는 비용이 상대적으로 저렴하다. 또한 산화철은 인체에 독성이 매우 낮은 것으로 알려져 있어 MRI 조영제 등으로 현재 상용화되어 시판되는 산화철 나노 입자들도 존재하고 있다. 이러한 장점에도 불구하고 산화철 나노 입자가 가지는 단점은 나노 입자 자체의 포화 자화율이 낮다는 것이다(Ms = 110 emu/g). 낮은 포화 자화율은 상기 여러 응용들에 있어 그 성능 및 감도를 저하 시킨다.
아래의 표는 여러 가지 응용 기술의 성능의 상관관계를 나타내는 공식들이다.
자기 공명 영상
Figure 112010041003395-pat00001
 R2: 자기 공명 영상 이완율
m: 자화율
g: 양성자의 자이로마그네틱 비율
M: 입자의 몰농도
r: 입자의 반지름
자성 분리
Figure 112010041003395-pat00002
 v: 자성 분리 속도
m: 자화율
B: 자기 유도
h: 용액의 점성도
e 0 : 진공 유전율
거대 자기저항 (GMR) 센서
Figure 112010041003395-pat00003
 DV: 측정 전압
m: 자화율
Vdc: 휘트스톤 회로 전압
r: 입자 반지름
w: 잔류 GMR 폭
L: 잔류 GMR 길이
자기 이완 센서
Figure 112010041003395-pat00004
 R2: 자기 공명 영상 이완율
m: 자화율,
r: 입자 반지름,
L(x): 랑게빈 함수,
NA: 아보가드로 수,
Ca: 입자 농도,
D: 물 확산 계수
고주파 자기장 열방출
Figure 112010041003395-pat00005
 SLP: 열방출 효율
m: 자화율
Ku: 자기 비등방성도
s: 입자 크기 분포도
위의 표를 살펴보면 모든 응용 기술의 성능은 자화율(μ) 값에 정비례 또는 제곱에 비례하고 있다. 이 자화율(μ)은 일정한 자기장 하에서 입자가 갖는 자기 모멘트를 의미하며 높은 자기장에서 이 값이 포화 된 것이 자성 나노 입자의 포화 자화율(Ms)을 의미한다. 따라서 높은 포화 자화율(Ms)을 갖는 나노 입자는 응용 기술의 성능을 크게 향상 시킬 수 있기 때문에 그 개발이 대단히 중요하다.
현재까지 당업계에서 개발된 자성 나노 입자 중 포화 자화율이 큰 입자들은 다음과 같다:
(a) MnFe2O4 나노 입자(Lee et al. Nature Medicine, 13:95(2007))
기존의 산화철 나노 입자에서 Fe2+ 이온을 Mn2+로 치환 시킨 것으로 12 nm의 크기를 갖는 MnFe2O4 입자의 경우 125 emu/g의 포화 자화율을 갖는다.
(b) FeCo 나노 입자(Seo et al. Nature Materials, 5:971(2006))
철과 코발트의 합금으로 만든 자성 나노 입자로서 215 emu/g의 포화 자화율을 갖는다.
(c) Zn0.4Fe2.6O4 나노 입자(Jang et al. Angewandte Chemie International Edition, 48:1234(2009))
산화철 나노 입자에서 Zn2+ 이온을 일부 도핑하여, Fe2+ 이온을 치환하여 제조한 나노 입자로 161 emu/g의 포화 자화율을 갖는다.
상기 문헌에서는 개발된 나노 입자를 MRI 조영제로 이용하였을 때 기존의 산화철 기반의 조영제에 비해 그 조영효과가 크게는 수십 배까지 향상될 수 있음을 보여, 암 진단 등에 있어 현재 기술보다 월등히 우수한 조기 진단이 가능함을 시사하였다. 특히 상기 Zn0.4Fe2.6O4 나노 입자는 FeCo와는 달리 독성이 적은 아연이 포함되어 있는 산화철을 사용하여 생체 및 바이오 실험에 있어 매우 우수한 응용 가능성을 나타낸다. 이는 상기 표 1에서 나타낸 것처럼, 나노 입자의 자화율이 조영 효과의 증강에 매우 중요함을 나타낸다. 이와 마찬가지로, 여러 다른 응용 분야, 자성 분리, 자기 저항 센서, 자기 이완 센서, 및 고주파 자기장 열방출 등에 있어서도 높은 자화율을 갖는 입자가 사용되었을 때, 그 성능이 크게 개선 될 수 있을 것이다.
나노 입자의 자화율을 증가시키고, 응용에 있어서 성능을 증가시키는 또 다른 방법으로 나노 입자들의 클러스터를 사용할 수도 있다. 클러스터란 단일 나노 입자들이 수개에서 수천개들이 모여 있는 뭉치로, 이 경우 단일 나노 입자에 비해서 총 자화율이 크게 증가함이 알려져 있다. 이는 자화율이 입자의 부피에 비례하기 때문인데 각각의 입자들이 가지고 있는 자화율(μ)과 전체 자화율(M)은 M = μㆍV의 관계에 있다. 따라서 단일 나노 입자 대신 이의 클러스터를 사용하였을 때에도 상기 응용들의 성능이 증가 될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문, 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 보다 향상된 분리 효율로 타겟 물질을 분리할 수 있는 자성 분리용 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 자성 분리용 조성물에 이용되는 자성 나노 입자로서 큰 포화 자화율을 가지는 아연-함유 자성 나노 입자 또는 이의 클러스터를 자성 분리용 조성물에 적용하는 경우에는 상술한 목적을 달성할 수 있는 자성 분리용 조성물을 제공할 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 시료 내 타겟 물질의 분리 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위, 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 하기 일반식 1 또는 2의 아연-함유 자성 나노 입자 또는 이의 클러스터를 포함하는 아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물을 제공한다:
일반식 1
ZnfMa-fOb (0<f<8, 0<a≤16, 0<b≤8, 0<f/(a-f)<10, M은 자성을 띠는 금속 원자 또는 이들의 합금);
일반식 2
ZngMc-gM’dOe (0<g<8, 0<c≤16, 0<d≤16, 0<e≤8, 0<g/{(c-g)+d}<10, M은 자성을 띠는 금속 원자 또는 이들의 합금이고; M’은 1족 원소, 2족 원소, 12족 원소, 13족 원소, 14족 원소, 15족 원소, 전이 금속 원소, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 원소).
본 발명자들은 보다 향상된 분리 효율로 타겟 물질을 분리할 수 있는 자성 분리용 조성물을 개발하고자 노력하였다. 그 결과, 자성 분리용 조성물에 이용되는 자성 나노 입자로서 큰 포화 자화율을 가지는 아연-함유 자성 나노 입자 또는 이의 클러스터를 자성 분리용 조성물에 적용하는 경우에는 상술한 목적을 달성할 수 있는 자성 분리용 조성물을 제공할 수 있음을 확인하였다.
본 발명의 자성 분리용 조성물에서 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자는 하기 일반식 1 또는 2로 표시된다:
일반식 1
ZnfMa-fOb (0<f<8, 0<a≤16, 0<b≤8, 0<f/(a-f)<10, M은 자성을 띠는 금속 원자 또는 이들의 합금)
일반식 2
ZngMc-gM’dOe (0<g<8, 0<c≤16, 0<d≤16, 0<e≤8, 0<g/{(c-g)+d}<10, M은 자성을 띠는 금속 원자 또는 이들의 합금이고; M’은 1족 원소, 2족 원소, 12족 원소, 13족 원소, 14족 원소, 15족 원소, 전이 금속 원소, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소로 구성된 군으로부터 선택되는 원소)
일반식 1 및 2의 아연-함유 자성 나노 입자는 포화 자화율이 높기 때문에, 자기장이 적용되는 자성 분리용 조성물에서 향상된 분리효율을 나타낼 수 있다.
일반식 1 및 2에서, M은 바람직하게는 전이 금속, 란탄족 또는 악티늄 금속; 보다 바람직하게는 Ba, Mn, Co, Ni 및 Fe로 구성된 군으로부터 선택되는 전이 금속 또는 Gd, Er, Ho, Dy, Tb, Sm 및 Nd로 구성된 군으로부터 선택되는 란탄족 금속; 가장 바람직하게는 Mn, Co, Ni, Fe, Gd, Er, Ho, Dy, Tb, Sm 또는 Nd, 또는 이들의 합금이다.
일반식 2에서, M’은 바람직하게는 Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra, Ge, Ga, In, Si, Ge, Bi, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 원소이다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 자성 분리용 조성물에 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자는 다음 일반식 3으로 표시된다:
일반식 3
ZnkM”h-kFeiOj (0<k<8, 0<h≤16, 0<i≤8, 0<j≤8, 0<k/{(h-k)+i}<10, M”은 자성을 띠는 금속 원자 또는 이들의 합금)
일반식 3에서, M”은 바람직하게는 전이 금속, 란탄족 또는 악티늄 금속; 보다 바람직하게는 Ba, Mn, Co, Ni 및 Fe로 구성된 군으로부터 선택되는 전이 금속 또는 Gd, Er, Ho, Dy, Tb, Sm 및 Nd로 구성된 군으로부터 선택되는 란탄족 금속; 가장 바람직하게는 Mn, Co, Ni, Fe, Gd, Er, Ho, Dy, Tb, Sm 또는 Nd, 또는 이들의 합금이다.
보다 바람직하게는, 본 발명의 자성 분리용 조성물에 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자는 다음 일반식 4 또는 5로 표시된다:
일반식 4
ZnqFel-qOm (0<q<8,0<l≤8, 0<m≤8, 0<q/(l-q)<10)
일반식 5
ZnrMnn-rFeoOp (0<r<8, 0<n≤8, 0<o≤8, 0<p≤8, 0<r/{(n-r)+o}<10)
본 발명의 아연-함유 자성 나노 입자는 아연과 다른 금속의 함유 비율이 화학양론적으로 바람직하게는 0.001 <‘아연/(총 금속-아연)’< 10, 보다 바람직하게는 0.01 <‘아연/(총 금속-아연)’ < 1, 가장 바람직하게는 0.03 <‘아연/(총 금속-아연)’< 0.5이다. 아연이 상기 범위로 포함될 때 높은 포화 자화율을 가질 수 있으며, 결국 자성 분리용 조성물의 분리효율을 크게 향상시킬 수 있다.
본 발명의 클러스터는 상기 아연 함유 자성 나노 입자가 바람직하게는 2~10000개, 보다 바람직하게는 2~1000개, 가장 바람직하게는 2~100개가 뭉쳐 있는 것을 말한다. 이러한 클러스터에서 각 단일 나노 입자들은 분자간의 인력에 의해서 서로 붙어 있거나, 또는 담체의 존재 하에 그 안에 존재하게 된다.
본 발명에서 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자 또는 이의 클러스터의 표면에는 타겟물질에 대해 결합 친화도를 가지는 결합제(binding agent)가 표면에 결합되어 있을 수도 있고 없을 수도 있다. 아연-함유 자성 나노 입자에 포함 되어 있는 금속 원소에 분리대상의 물질이 직접 결합될 수 있다. 예컨대, 아연-함유 자성 나노 입자에 니켈이 포함되어 있는 경우, 니켈은 단백질 또는 펩타이드의 히스티딘 잔기와 직접 결할 수 있으며 이러한 특성을 이용하여 단백질을 분리할 수 있다. 또한, 아연-함유 자성 나노 입자가 기체-선택적 금속을 포함하는 경우에는 추가적인 결합제 없이도 기체를 분리할 수 있다. 상기 기체-선택적 금속은 Pt, Pd, Au, Ag, Nb, Ir, Rh, Ru 및 이들의 합금을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 수소-선택적 금속은 Pt, Pd, Au, Ag 및 이들의 합금을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자 또는 이의 클러스터의 표면에는 타겟물질에 대해 결합 친화도를 가지는 결합제(binding agent)가 표면에 결합되어 있다. 상기 결합제는 아연-함유 자성 나노 입자의 표면에 직접 또는 간접적으로, 공유 또는 비공유 방식으로 결합된다.
예를 들어, 결합제는 아연-함유 자성 나노 입자의 표면에 직접적인 공유 또는 비공유 방식, 예컨대 이온결합, 정전기적 결합, 소수성 결합, 수소 결합, 공유결합, 친수성 결합, 또는 반데르 발스 결합에 의해 결합될 수 있다. 또한, 결합제는 중간 매개체(intervening agent)를 통하여 간접적으로 아연-함유 자성 나노 입자의 표면에 결합될 수 있다.
본 명세서에서 “타겟물질”은 분리(또는 분리와 검출, 또는 분리, 검출 및 정량)하고자 하는 시료 내 물질을 의미한다. 타겟물질은 핵산분자(DNA 또는 RNA), 단백질, 펩타이드, 항원, 당, 지질, 세균, 바이러스, 세포, 유기 화합물, 무기화합물, 금속 및 무기이온을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 시료는 생물학적 시료, 화학적 시료 및 환경 시료를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 생물학적 시료는 예컨대 혈액, 혈장, 혈청, 바이러스, 세균, 조직, 세포, 림프, 골수액, 타액, 우유, 소변, 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액을 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 용어 “결합제”는 분리하고자 하는 타겟물질에 대하여 특이적 결합능을 가지는 물질을 의미한다. 결합제는 분리하고자 하는 물질에 대하여 결합 친화성이 있는 물질이면 어떠한 것도 가능하다. 결합제의 비-제한적 예는 핵산분자(DNA 또는 RNA), 단백질, 항체, 항원, 앱타머(RNA, DNA 및 펩타이드 앱타머), 수용체, 호르몬, 스트렙타비딘, 아비딘, 바이오틴, 렉틴, 리간드, 아고니스트, 안타고니스트, 효소, 조효소, 무기이온, 효소보조인자, 당, 지질, 효소기질, 합텐(hapten), 뉴트라비딘(neutravidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 셀렉틴 (selectin), 칼슘 설페이트, 기체 결합제(예: Pt, Pd, Au, Ag, Nb, Ir, Rh 및 Ru)를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 결합제는 아연-함유 자성 나노 입자 또는 이의 클러스터의 표면에 중간 매개체를 통하여 결합된다.
상기 중간 매개체는 당업계에 공지된 다양한 링커 및 나노 입자 표면 코팅 물질을 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자 또는 이의 클러스터의 표면은 나노 입자의 수용화를 위한 수용성 다작용기 리간드가 코팅되어 있고, 이 수용성 다작용기 리간드를 통하여 결합체가 나노 입자에 결합된다.
본 발명의 명세서에서 ‘수용성 다작용기 리간드’는 아연이 함유된 나노 입자 또는 이의 클러스터와 결합하여 나노 입자의 수용화 및 안정화에 기여하며, 타겟물질에 특이적으로 결합하는 결합제의 결합을 가능하게 하는 리간드이다.
수용성 다작용기 리간드는 (a) 부착영역 (LI, adhesive region)을 포함하고, (b) 결합제 결합영역 (LⅡ, binding region), (c) 교차 연결 영역 (LⅢ, cross linking region), 또는 상기 결합제 결합영역 (LⅡ)과 교차연결 영역 (LⅢ)을 동시에 포함하는 결합제 결합영역-교차 연결 영역 (LⅡ-LⅢ)을 추가로 포함할 수 있다. 이하에서 수용성 다작용기 리간드를 보다 구체적으로 설명한다.
상기 "부착영역 (LI)"은 나노 입자와 부착할 수 있는 작용기 (functional group)를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분으로서, 바람직하게는 다작용기 리간드의 말단을 의미한다. 따라서 부착영역은 나노 입자의 표면과 결합력이 높은 작용기를 포함하는 것이 바람직하다. 이 때 나노 입자와 부착 영역과의 결합은 이온결합, 공유결합, 수소결합, 소수성결합, 또는 금속-리간드 배위결합으로 부착할 수 있다. 이에 따라 다작용기 리간드의 부착영역은 나노 입자를 이루는 물질에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 예를 들어 이온결합, 공유결합, 수소결합, 금속-리간드 배위결합을 이용한 부착영역은 -COOH, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -OPO4H2, -SO3H, -OSO3H, -N3, -NR3OH (R = CnH2n+1,0≤n≤16), OH, -SS-, -NO2, -CHO, -COX (X = F, Cl, Br, I), -COOCO-, -CONH-, 또는 -CN을 포함할 수 있고, 소수성 결합을 이용한 부착 영역은 탄소수 2개 이상으로 이루어진 탄화수소 체인을 포함할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "결합제 결합영역 (LII)"은 타겟물질에 특이적으로 결합하는 결합제와 결합할 수 있는 작용기를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분으로서, 바람직하게는 상기 부착영역과 반대편에 위치한 말단을 의미한다. 상기 결합제 결합영역의 작용기는 결합제의 종류 및 이의 화학식에 따라 달라질 수 있다(표 2 참조). 본 발명에서 결합제 결합영역은 -SH, -CHO, -COOH, -NH2, -OH, -PO3H, -OPO4H2, -SO3H, -OSO3H, -NR3 +X- (R = CnHm, 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl, Br), -N3, -SCOCH3, -SCN, -NCS, -NCO, -CN, -F, -Cl, -I, -Br, 에폭시기, 술포네이트기, 니트레이트기, 포스포네이트기, 알데히드기, 하이드라존기, -C=C-, 또는 -C≡C-를 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 "교차연결영역 (LⅢ)"은 근접한 다작용기 리간드와 교차연결할 수 있는 작용기를 포함하는 다작용기 리간드의 일부분, 바람직하게는 중심부에 부착된 곁사슬을 의미한다. "교차연결"이란 한 다작용기 리간드가 근접하여 위치한 다른 다작용기 리간드와 분자간 인력 (intermolecular interaction)으로 결합되는 것을 의미한다. 상기 분자 간 인력은, 소수성 인력, 수소 결합, 공유 결합 (예를 들어, 디설파이드 결합), 반데르발스 결합, 이온 결합 등이 있지만, 이에 특별히 한정되지 않는다. 따라서 교차연결 할 수 있는 작용기는 목적으로 하는 분자간 인력의 종류에 따라 다양하게 선택될 수 있다. 교차연결영역은 예를 들면 -SH, -CHO, -COOH, -NH2, -OH, -PO3H, -OPO4H2, -SO3H, -OSO3H, -NR3 +X- (R = CnHm 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl, Br), NR4 +X- (R = CnHm 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl, Br), -N3, -SCOCH3, -SCN, -NCS,-NCO, -CN, -F, -Cl, -I, -Br, 에폭시기, -ONO2, -PO (OH)2, -C = NNH2, -C=C-, 또는 -C≡C-를 작용기로서 포함할 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
다작용기 리간드에 포함될 수 있는 결합제 결합영역의 작용기의 예.
I II III
R-NH2 R’-COOH R-NHCO-R’
R-SH R’-SH R-SS-R’
R-OH R’-(에폭시기) R-OCH2CH(OH)-R’
R-NH2 R’-(에폭시기) R-NHCH2CH(OH)-R’
R-SH R’-(에폭시기) R-SCH2CH(OH)-R’
R-NH2 R’-COH R-N=CH-R’
R-NH2 R’-NCO R-NHCONH-R’
R-NH2 R’-NCS R-NHCSNH-R’
R-SH R’-COCH3 R-COCH2S-R’
R-SH R’-O(C=O)X R-S(C=O)O-R’
R-(아지리딘기) R’-SH R-CH2CH(NH2)CH2S-R’
R-CH=CH2 R’-SH R-CH2CH2S-R’
R-OH R’-NCO R-NHCOO-R’
R-SH R’-COCH2X R-SCH2CO-R’
R-NH2 R’-CON3 R-NHCO-R’
R-COOH R’-COOH R-(C=O)O(C=O-R’) + H2O
R-SH R’-X R-S-R’
R-NH2 R’CH2C(NH2+)OCH3 R-NHC(NH2+)CH2-R’
R-OP(O2-)OH R’-NH2 R-OP(O2-)-NH-R’
R-CONHNH2 R’-COH R-CONHN=CH-R’
R-NH2 R’-SH R-NHCO(CH2)2SS-R’
(I: 다작용기 리간드의 결합제 결합영역의 작용기, II: 결합제, III: I과 II의 반응에 의한 결합 예)
본 발명에서는 상기의 작용기를 본래 보유한 화합물을 수용성 다작용기 리간드로서 이용할 수도 있지만, 당업계에 공지된 화학반응을 통하여 상기의 작용기를 구비하도록 변형 또는 제조된 화합물을 다작용기 리간드로서 이용할 수도 있다.
본 발명의 바람직한 다작용기 리간드는 단분자, 고분자, 탄수화물, 단백질, 펩타이드, 핵산, 지질, 또는 양친성 리간드를 포함한다.
본 발명에 따른 수용성 나노 입자에 있어서 바람직한 다작용기 리간드의 예는 단분자로 상기 앞에서 언급된 작용기를 포함하는 단분자이며, 바람직하게는 디머켑토 숙신산 (dimercaptosuccinic acid)이다. 디머켑토 숙신산은 본래 부착영역, 교차연결 영역 및 결합제 결합 영역을 포함하고 있기 때문이다. 즉, 디머켑토 숙신산의 한쪽 -COOH는 자성 나노 입자에 결합되며 말단부의 -COOH 및 -SH는 결합제와 결합하는 역할을 한다. 또한, -SH의 경우 주변의 다른 -SH와 다이설파이드 결합을 이룸으로써 교차 연결 영역으로 작용이 가능하다. 상기 디머켑토 숙신산 외에도 부착 영역의 작용기로 -COOH, 결합제 결합영역의 작용기로 -COOH, -NH2, 또는 -SH를 포함하는 화합물은 모두 바람직한 다작용기 리간드로서 이용될 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 수용성 다작용기 리간드의 다른 예는 폴리포스파젠, 폴리락타이드, 폴리락티드-코-글리콜라이드, 폴리카프로락톤, 폴리안하이드라이드, 폴리말릭산, 폴리말릭산의 유도체, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리하이드로옥시부틸레이트, 폴리카르보네이트, 폴리오르소에스테르, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리-L-라이신, 폴리글리콜라이드, 폴리메틸메타아크릴레이트 및 폴리비닐피롤리돈으로 구성된 군으로부터 1종 이상의 고분자이나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 아연이 함유된 수용성 금속 산화물 나노 입자에 있어서 바람직한 다작용기 리간드의 다른 예는 펩타이드 (peptide)이다. 펩타이드는 아미노산으로 이루어진 올리고머/폴리머로서, 아미노산은 양 말단에 -COOH 또는 -NH2작용기를 보유하고 있기 때문에 펩타이드는 자연적으로 부착영역과 결합제 결합영역을 구비하게 된다. 또한 특히 곁사슬로 -SH, -COOH, -NH2또는 -OH 중 어느 하나 이상을 곁사슬로 갖는 아미노산을 하나 이상 포함하는 펩타이드는 바람직한 수용성 다작용기 리간드로 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 수용성 나노 입자에 있어서 바람직한 다작용기 리간드의 다른 예는 단백질이다. 단백질은 펩타이드 보다 더 많은 아미노산, 즉 수백 내지 수십만 개의 아미노산으로 이루어진 폴리머로서, 양 말단에 -COOH와 -NH2작용기를 보유하고 있을 뿐만 아니라 수십 개의 -COOH, -NH2, -SH, -OH, -CONH2등을 포함하고 있다. 이로 인하여 단백질은 전술한 펩타이드처럼 그 구조에 따라 자연적으로 부착영역, 교차 연결 영역, 결합제 결합영역을 구비할 수 있어 본 발명의 상전이 리간드로 유용하게 이용될 수 있다. 상전이 리간드로 바람직한 단백질의 대표적인 예로는 구조 단백질, 저장 단백질, 운반 단백질, 호르몬 단백질, 수용체 단백질, 수축 단백질, 방어 단백질, 효소 단백질 등이 있다. 보다 자세하게는 알부민, 항체, 항원, 아비딘(avidin), 시토크롬, 카세인, 미오신, 글리시닌, 케로틴, 콜라젠, 구형 단백질, 경단백질, 스트렙타비딘(streptavidin), 프로테인 A, 프로테인 G, 프로테인 S, 면역글로불린, 렉틴(lectin), 셀렉틴(selectin), 안지포이어틴 (angiopoietin), 항암 단백질, 항생 단백질, 호르몬 길항 단백질, 인터루킨 (interleukin), 인터페론 (interferon), 성장인자 (growth factor) 단백질, 종양괴사인자 (tumor necrosis factor) 단백질, 엔도톡신 (endotoxin) 단백질, 림포톡신 (lymphotoxin) 단백질, 조직 플라스미노겐 활성제 (tissue plasminogen activator), 유로키나제 (urokinase), 스트렙토키나제 (streptokinase), 프로테아제 저해제 (protease inhibitor), 심혈관계 약물 단백질 (cardiovascular protein drug), 신경계 약물 (neuro pharmaceuticals) 단백질, 위장관계 약물 단백질(gastrointestinal protein drug) 등을 들 수 있다.
본 발명에서 바람직한 수용성 다작용기 리간드의 또 다른 양태는 핵산이다. 핵산은 다수의 뉴클레오타이드로 이루어진 올리고머로서, 양 말단에 PO4 -와 -OH 작용기를 보유하고 있기 때문에 자연적으로 부착영역 및 결합제 결합영역 (LI-LIII)을 구비하거나, 부착영역 및 교차연결영역 (LI-LII)을 구비하므로 수용성 다작용기 리간드로 유용하게 이용될 수 있다. 핵산은 경우에 따라 3' 말단 또는 5' 말단에 -SH, -NH2, -COOH, -OH의 작용기를 갖도록 변형되는 것이 적합하다.
본 발명에 따른 수용성 나노 입자에 있어서 바람직한 다작용기 리간드의 다른 예는 소수성 (hydrophobic) 작용기와 친수성 (hydrophilic) 작용기를 동시에 가지고 있는 양친성 (amphiphilic) 리간드이다. 유기 용매 상에서 합성된 나노 입자의 경우 그 표면에는 소수성의 긴 탄소 체인으로 이루어진 리간드가 존재하고 있다. 이때 부가되는 양친성 리간드에 존재하는 소수성 작용기와 나노 입자 표면의 소수성 리간드가 분자간 인력에 의해 결합되어 나노 입자를 안정화 시키고 나노 입자의 제일 바깥쪽에는 친수성 작용기가 드러나게 되어 결과적으로 수용성 나노 입자를 제조 할 수 있다. 여기서 분자간 인력은 소수성 결합, 수소 결합, 반데르발스 결합 등을 포함한다. 이때 나노 입자와 소수성 인력에 의해 결합되는 부분이 부착 영역 (LI)이며 이와 함께 유기화학적인 방법으로 결합제 결합영역 (LII) 또는 교차 연결 영역 (LIII)을 도입할 수 있다. 또한 수용액상에서의 안정도의 증가를 위해 여러 개의 소수성 작용기와 친수성 작용기를 갖고 있는 고분자 다중 양친성 리간드를 이용하거나, 혹은 연결 분자를 이용하여 양친성 리간드를 서로 교차 연결 시켜 줄 수 있다. 이러한 상전이 리간드로 바람직한 양친성 리간드의 예로서, 먼저 소수성 작용기에 포함되는 것은 탄소의 수가 2 이상 되는 체인으로 이루어지고 선형이거나 가지 친 구조를 가지고 있는 소수성 분자로서 더욱 바람직하게는 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, 이소부틸, t-부틸, 옥틸, 데실, 테트라데실, 헥사데실, 아이코실, 테트라코실, 도데실, 또는 시클로펜틸, 시클로헥실 등의 알킬작용기와 에티닐, 프로페닐, 이소프로페닐, 부테닐, 이소부테닐, 옥테닐, 데세닐, 올레일 등의 탄소-탄소 2중 결합 또는 프로파이닐, 이소프로파이닐, 부타이닐, 이소부타이닐, 옥타이닐, 데사이닐 등의 탄소-탄소 3중 결합을 가지는 불포화된 탄소체인을 가지는 작용기 등을 들 수 있다. 또한 친수성 작용기에 포함되는 것은 -SH, -COOH, -NH2, -OH, -PO3H, -OPO4H2, -SO3H, -OSO3H-NR3 +X- 등과 같이 특정 pH에서는 중성을 띠나 더 높거나 낮은 pH에서는 양전하 또는 음전하를 띠는 작용기들을 말한다. 또한 친수성 그룹으로서 고분자 또는 블록코폴리머등이 사용 될 수 있으며 여기서 사용되는 단위소는, 에틸글라이콜, 아크릴릭산, 알킬아크릴릭산, 아타코닉산, 말레익산, 퓨마릭산, 아크릴아미도메틸프로페인술폰산, 비닐술폰산, 비닐인산, 비닐락틱산, 스타이렌술폰산, 알릴암모늄, 아클릴로나이트릴, N-비닐피롤리돈, N-비닐포름아마이드 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
바람직한 수용성 다작용기 리간드의 다른 예는 탄수화물을 포함한다. 더 바람직한 예는 글루코오스, 만노오스, 퓨코오즈, N-아세틸글루코민, N-아세틸갈락토사민, N-아세틸뉴라민산, 과당, 자일로스, 솔비톨, 자당, 말토오즈, 글리코알데히드, 디하이드록시아세톤, 에리드로우즈, 에리드루로즈, 아라비노우즈, 자이루로우즈, 젖당, 트레할로우즈, 멜리보우즈, 셀로비오즈, 라피노우즈, 멜레지토우즈, 말토리오즈, 스타치오즈, 스트로도우즈, 자이란, 아라반, 헥소산, 프록탄, 갈락탄, 만난, 아가로펙틴, 알긴산, 가라지난, 헤미셀룰로오즈, 하이프로멜로스, 아밀로즈, 디옥시 아세톤, 글리세린알데히드, 키틴, 아가로오즈, 덱스트란, 리보즈, 리부로오즈, 갈락토즈, 카르복시 메틸셀룰로오스 또는 글리코겐 덱스트란, 카르보덱스트란, 폴리사카라이드, 사이클로덱스트린, 카르보메틸 덱스트란, 풀루란, 셀룰로오즈, 녹말, 글리코겐 등을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명에서 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자는 다작용기 유기 리간드로 표면 코팅 되어 있고 타겟물질에 대해 결합 친화도를 가지는 결합제가 결합제 결합 영역 (LⅡ)을 통하여 결합되어 있다.
상기 아연-함유 나노 입자는 다양한 방법을 통하여 합성할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 아연-함유 나노 입자는 당업계에 공지된 기상(gas phase)에서의 나노 입자 합성법 또는 수용액, 유기용액, 또는 다용액계 등을 포함하는 액상 (liquid phase)에서의 나노 입자 합성법을 통해 얻어질 수 있다.
예컨대, 수용성 다작용기 리간드로 코팅된 아연-함유 나노 입자는 수용액 상에서 화학반응을 통하여 합성할 수 있다. 이 방법은 다작용기 리간드를 포함하는 반응 용액에 아연 이온 선구 물질을 첨가함으로써 아연이 함유된 수용성 금속 산화물 나노 입자를 합성하는 방법으로 기존의 공지된 수용성 나노 입자의 합성 방법 (공침법, 솔-젤법, 미셀법 등)을 통해 이루어질 수 있다.
상기 나노 입자 선구 물질은 금속 니트레이트 계열의 화합물, 금속 설페이트 계열의 화합물, 금속 아세틸아세토네이트 계열의 화합물, 금속 플루오르아세토아세테이트 계열의 화합물, 금속 할라이드 계열의 화합물, 금속 퍼클로로레이트 계열의 화합물, 금속 알킬옥사이드 계열의 화합물, 금속 썰파메이트 계열의 화합물, 금속 스티어레이트, 금속 알콕싸이드 계열의 화합물 또는 유기 금속 계열의 화합물이 이용될 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 반응 용매로는 벤젠계 용매, 탄화수소 용매, 에테르계 용매, 폴리머 용매, 이온성 액체 용매, 할로겐 탄화수소, 알킬아민, 알킬산, 알콜류, 술폴사이드계 용매, 물 등이 이용될 수 있으며 바람직하게는, 벤젠, 톨루엔, 할로벤젠, 옥탄, 노난, 데칸, 벤질 에테르, 페닐 에테르, 탄화수소 에테르, 폴리머 용매, DEG(Diethylene glycol), 물, 이온성 액체 용매가 이용될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
전술한 방법을 통해 합성된 아연이 함유된 금속 산화물 나노 입자는 매우 균일한 크기 분포 (δ < 10%) 및 매우 높은 결정성을 갖게 된다. 또한 상기 방법을 이용하면 나노 입자의 아연 함유율이 정밀하게 조절될 수 있다. 즉, 반응시 아연과 다른 금속 선구 물질의 혼합 비율을 변화시키면, 나노 입자 내의 아연 함유 비율을 화학 양론비로 0.001 < ‘아연/(총 금속-아연)’ < 10까지 조절이 가능하다.
본 발명에 이용되는 나노 입자는 바람직하게는 1-1000 nm, 보다 바람직하게는 1-800 nm, 보다 더 바람직하게는 2-100 nm, 가장 바람직하게는 10-50 nm의 크기를 갖는다.
본 발명에 이용되는 나노 입자 클러스터는 바람직하게는 1-1000 nm, 보다 바람직하게는 1-800 nm, 보다 더 바람직하게는 2-100 nm, 가장 바람직하게는 10-50 nm의 크기를 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 나노 입자는 100-200 emu/g의 포화자화율 값을 가지며, 보다 바람직하게는 120-200 emu/g의 포화자화율 값을 갖는다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물은 자기장 생성 수단을 추가적으로 포함한다. 자기장 생성 수단은 당업계에서 통상적으로 이용되는 자석, 예컨대 영구자석 및 전자석을 포함한다. 상기 영구 자석 및 전자석은 분리하고자 하는 시스템에서 따라 그 형태가 변형이 가능하며, 자석의 특정 표면에서 바람직하게 10-10000 mT, 보다 바람직하게는 100-5000 mT, 가장 바람직하게는 200-1000 mT의 자기장 세기를 갖는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 시료 내 타겟 물질의 분리 방법을 제공한다:
(a) 타겟물질에 대해 결합 친화도를 가지는 결합제(binding agent)가 표면에 결합되어 있는 하기 일반식 1 또는 2의 아연-함유 자성 나노 입자 또는 이의 클러스터를 상기 시료 내 타겟 물질과 접촉시켜 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체를 형성시키는 단계;
일반식 1
ZnfMa-fOb (0<f<8, 0<a≤16, 0<b≤8, 0<f/(a-f)<10, M은 자성을 띠는 금속 원자 또는 이들의 합금);
일반식 2
ZngMc-gM’dOe (0<g<8, 0<c≤16, 0<d≤16, 0<e≤8, 0<g/{(c-g)+d}<10, M은 자성을 띠는 금속 원자 또는 이들의 합금이고; M’은 1족 원소, 2족 원소, 12족 원소, 13족 원소, 14족 원소, 15족 원소, 전이 금속 원소, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 원소); 그리고,
(b) 상기 시료에 자기장을 인가하여 상기 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체를 시료 내의 다른 성분으로부터 분리하는 단계.
본 발명의 방법은 기본적으로 상술한 본 발명의 자성 분리용 조성물을 이용하여 실시되는 것으로서, 이 둘 사이에 공통된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여, 그 기재를 생략한다.
시료에 자기장을 인가하면 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체가 시료 내의 다른 성분으로부터 분리된다. 이렇게 분리된 상기 복합체는 다양한 방식(파이펫팅, 드레이닝, 스키밍, 푸어링 등)으로 시료 내의 다른 성분으로부터 제거될 수 있으며, 이에 의해 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체만으로 이루어진 시료 농축액을 얻을 수 있다. 예를 들어, 시료가 있는 반응용기에 아연-함유 자성 나노 입자를 첨가 및 혼합하고 반응용기의 한 부분에 자기장을 인가하면 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체가 반응용기의 한 부분으로 분리된다. 이어, 자기장의 인가된 상태에서 상기 시료를 파이펫팅 하면 반응용기에는 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체만 잔존하게 된다. 그런 다음, 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체를 세척하고 적합한 용매로 현탁하면 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체만으로 이루어진 시료 농축액을 얻을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 분리 방법은 검출 또는 정량 과정과 조합된다. 이 경우, 본 발명의 방법은 단계 (c) 상기 시료 내 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체의 형성을 검출하는 단계를 추가적으로 포함한다.
시료 내 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체의 형성을 검출하는 것은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시할 수 있다.
예를 들어, 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체가 있는 시료의 흡광도 변화를 측정하여 복합체 형성 여부를 검출할 수 있다.
또한, 아연-함유 자성 나노 입자에 시그널 생성 표지가 결합되어 있는 경우에는 이로부터 나오는 시그널을 검출함으로써 복합체 형성 여부를 검출할 수 있다.
상기 시그널 생성 표지는 화학적 표지(예컨대, 바이오틴), 효소 표지(예컨대, 알칼린 포스파타아제, 퍼옥시다아제, β-갈락토시다아제 및 β-글루코시다아제), 방사능 표지(예컨대, I125 및 C14), 형광 표지, 발광 표지, 화학발광(chemiluminescent) 표지, FRET(fluorescence resonance energy transfer) 표지 및 중금속 표지(예컨대, 금)를 포함하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 형광 표지의 비제한적인 예는 플루오로세인, 로다민, 루시퍼 엘로우, B-파이토에리쓰린, 9-아크리딘이소티오시아네이트, 루시퍼 엘로우 VS, 4-아세트아미도-4'-이소티오-시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산, 7-다이에틸아미노-3-(4'-이소티오시아토페닐)-4-메틸쿠마린, 석시니미딜-파이렌부티레이트, 4-아세트아미도-4'-이소티오시아나토스틸벤-2,2'-다이설폰산 유도체, LC™-Red 640, LC™-Red 705, Cy5, Cy5.5, 리사민, 이소티오시아네이트, 에리쓰로신 이소티오시아네이트, 다이에틸렌트리아민 펜타아세테이트, 1-다이메틸아미노나프틸-5-설포네이트, 1-아닐리노-8-나프탈렌 설포네이트, 2-p-토우이디닐-6-나프탈렌 설포네이트, 3-페닐-7-이소시아나토쿠마린, 9-이소티오시아나토아크리딘, 아크리딘 오렌지, N-(p-(2-벤족사조일릴)페닐)멜레이미드, 벤족사디아졸, 스틸벤, 파이렌 및 이들의 유도체를 포함한다.
상기 표지가 결합된 아연-함유 자성 나노 입자-타겟 물질 복합체의 형성의 검출은 형광측정기, 스펙트로포토미터, 색상 검출(colorimetric detection) 또는 방사능 검출 등의 방식으로 실시할 수 있다.
본 발명은 시료 내의 특정 타겟물질의 분리, 농축 및 검출에 이용될 수 있다. 본 발명에서 타겟물질에 결합하는 결합제의 종류를 달리하여 아연-함유 자성 나노 입자를 제조하면 다양한 타겟물질을 높은 효율로 분리 및/또는 검출할 수 있는 경제적인 시스템을 디자인할 수 있다. 또한, 본 발명에 따르면, 일반적인 검출 과정에서 요구되는 복잡한 pre-인리치먼트, 정제 또는 처리 과정 등이 필요 없다.
본 발명의 나노 입자는 크기가 작고 포화 자화율이 매우 크기 때문에, 생물학적 시료(일반적으로, 수용액 시료)에 빨리 분포되며(브라운 확산에 의해 수용액 시료에 있는 타겟물질과 컨택할 수 있는 기회가 많아짐) 반면 자기장을 인가한 경우에는 빠르게 수집/분리되는 장점이 있다.
이에, 본 발명은 다양한 응용분야를 갖는다: 첫 번째, 본 발명은 진단에 이용될 수 있다. 본 발명의 아연-포함 자성 나노 입자를 생물학적 시료에 적용하여 시료 내의 질병-관련 물질(예컨대, 단백질, 항원, 핵산분자, 바이러스, 박테리아, 탄수화물 및 지질)을 분리/검출할 수 있다. 두 번째, 본 발명은 화합물 생산 공정에 적용되어 최종 산물의 분리에 이용될 수 있다. 세 번째, 본 발명은 수 탈염(water desalination)에 이용될 수 있다. 예컨대, 특정 염 또는 이온 또는 금속을 선택적으로 제거할 수 있도록 킬레이트제/컴플렉싱제로 변형된 아연-포함 자성 나노 입자를 이용하는 경우에는 수 탈염 또는 담수화 공정에 이용될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 아연-함유 자성 나노 입자를 이용한다.
(b) 본 발명에서 이용되는 아연-함유 자성 나노 입자는 포화 자화율이 매우 높기 때문에, 이를 이용하는 본 발명의 자성 분리용 조성물은 크게 개선된 분리 효율을 갖는다.
(c) 본 발명에서 타겟물질에 결합하는 결합제의 종류를 달리하여 아연-함유 자성 나노 입자를 제조하면 다양한 타겟물질을 높은 효율로 분리 및/또는 검출할 수 있는 경제적인 시스템을 디자인할 수 있다.
(d) 또한, 본 발명에 따르면, 일반적인 검출 과정에서 요구되는 복잡한 pre-인리치먼트, 정제 또는 처리 과정 등이 필요 없다.
도 1a는 합성된 Zn0.4Fe2.6O4 나노 입자의 전자 현미경 사진이다.
도 1b는 합성된 Zn0.4Fe2.6O4 나노 입자의 고해상도 전자 현미경 사진이다. 도 1b의 내부그림은 고해상도 전자현미경 사진의 FFA(fast fourier transformation) 이미지이다.
도 1c는 합성된 Zn0.4Fe2.6O4 나노 입자의 X-선 회절 패턴이다.
도 2는 (패널 가) 합성된 아연이 포함된 망간 페라이트 나노 입자(ZnxMn1-xFe2O4) 및 (패널 나) 산화철 나노 입자(ZnxFe3-xO4)에 대한 전자 현미경 사진이다. 아연의 포함율(x)은 0에서 0.8까지 조절 가능하다.
도 3은 아연이 포함된 자성 나노 입자 및 아연이 포함되지 않은 여러 종류의 자성 나노 입자들의 포화 자화율을 분석한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 4는 아연이 포함된 나노 입자의 클러스터이다. 본 클러스터는 폴리스티렌-폴리아크릴산 공중합 고분자로 이루어진 마이셀에 아연이 포함된 나노 입자가 포접되어 만들어 진 것이다.
도 5는 외부 자기장 생성 수단으로 사용된 NdFeB 자석의 표면에서부터의 자기장의 세기를 측정한 것이다.
도 6는 아연-포함 자성 나노 입자를 이용한 자성 분리용 조성물의 원리를 보여주는 모식도이다. 타겟물질이 들어 있는 용액에 이 물질과 선택적으로 결합하는 결합제가 부착되어 있는 자성 나노 입자를 혼합하면 분리하고자 하는 물질과 자성 나노 입자가 결합하고 이를 자석으로 끌어당겨 분리해 낼 수 있다.
도 7는 아연-포함 자성 나노 입자(Zn0.4Fe2.6O4) 및 포함되지 않은 자성 나노 입자(Fe3O4)를 이용한 형광 물질(로다민) 분리 비교 시험 결과이다. (가) 자성 분리 시간에 따른 형광 물질(로다민)의 흡광도 그래프, (나) 자성 분리 시간에 따른 형광물질의 분리율에 대한 그래프.
도 8은 아연-포함 자성 나노 입자(Zn0.4Fe2.6O4) 및 포함되지 않은 자성 나노 입자(Fe3O4)를 이용하여 외부 자기장 세기 변화에 따른 자성 분리 비교 시험 결과이다.
도 9는 아연-비포함 산화철 나노 입자 및 아연-포함 나노 입자를 이용한 항체의 분리 결과이다.
도 10은 아연이 함유된 나노 입자 및 산화철 나노 입자를 이용한 시간에 따라 분리된 세포의 양(패널 A) 및 아연이 함유된 나노 입자 및 산화철 나노 입자의 세포 분리 효율(패널 B)을 비교한 결과이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 자성 분리용 조성물에 사용되는 ZnxM1-xFe2O4(M = Fe 또는 Mn, x = 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.8)의 조성 및 15 nm의 코어 크기를 가지고 디머캡토숙신산으로 코팅된 아연이 포함된 페라이트 나노 입자의 합성
본 명세서에서 기술된 아연이 포함된 금속 산화물 나노 입자의 예로 식 ZnxM1-xFe2O4 (M = Fe 또는 Mn, x = 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.8)의 조성을 갖고 15 nm의 코어 크기를 갖는 아연이 포함된 페라이트 나노 입자는 대한민국 특허 제10-0604975호, 제10-0652251, 제10-0713745, PCT/KR2004/002509, 대한민국 특허 제 10-0604975호, PCT/KR2004/003088, PCT/KR2007/001001, 대한민국 특허출원 2006-0018921호에 나타난 방법들을 기반으로 합성되었다. 나노 입자의 선구물질인 ZnCl2(Aldrich, USA), FeCl2(Aldrich, USA) 또는 MnCl2(Aldrich, USA) 그리고 Fe(acac)3 (Aldrich, USA)을 20 mmol의 올레산(Aldrich, USA) 및 20 mmol의 올레일아민(Aldrich, USA)을 포함하는 트리옥틸아민 용액에 첨가하였다. 이어, 아르곤 (Ar) 대기 하에서 200 ℃에서 반응시키고 다시 300℃에서 반응시켜 열분해 하여, 15 nm ZnxM1-xFe2O4 (M = Fe 또는 Mn, x = 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.8) 나노 입자를 합성하였다. 아연의 포함 비율을 x = 0.1-0.8까지 조절하기 위해서는 선구 물질인 ZnCl2 또는 FeCl2의 비율을 조절하여 같은 방법으로 반응 시켰다. 이렇게 만들어진 아연이 포함된 페라이트 나노 입자를 과량의 에탄올로 침전시키고 분리한 뒤 나노 입자는 다시 톨루엔으로 재분산시켜 콜로이드 용액 상태로 제조하였다. 그런 다음, 20 mg/ml로 톨루엔 상에 분산되어 있는 나노 입자에 과량의 디머캡토숙신산(Aldrich, USA)이 녹아 있는 DMSO 용액을 넣어주고 2 시간 동안 반응시킨 뒤 나노 입자를 원심 분리하여 분리해낸 뒤 물에 분산시켰다. 도 1 (가) 및 도 2는 전술한 방법으로 합성된 ZnxM1-xFe2O4 (M = Fe 또는 Mn, x = 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.8) 나노 입자로서 15 nm 크기의 균일한 구형 형태를 가지고 있다(크기 분포도 s < 10%). 또한 고분해능 전자 현미경 (도 1 (나)) 및 X-선 회절 패턴 (도 1 (다))을 통해 분석된 나노 입자는 스피넬 구조로서 높은 결정성을 가지고 있음을 알 수 있다. 아연의 포함량은 Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectroscopy (ICP-AES, OPTIMA-3000, Perkin Elmer) 및 Energy Dispersive X-ray(EDAX, Gatan)를 통해 분석되었다.
실시예 2: 자성 분리용 조성물에 사용되는 식 Zn0.4M0.6Fe2O4 (M = Fe 또는 Mn)의 조성 및 6, 9, 12 nm의 코어 크기를 가지고 디머캡토숙신산으로 코팅된 아연이 포함된 페라이트 나노 입자의 합성
10 mmol의 올레산 및 30 mmol의 올레일아민을 포함하는 트리옥틸아민 용액에 ZnCl2, FeCl2 또는 MnCl2 그리고 Fe(acac)3 을 3시간동안 180oC 및 250oC에서 열분해 시켜 6 nm Zn0.4M0.6Fe2O4(M = Fe 또는 Mn) 나노 입자를 합성하였다. 9 nm 및 12 nm와 같이 다른 크기를 갖는 나노 입자를 합성하기 위해서는 같은 양의 선구 물질을 올레산 및 올레일아민의 비율이 변화된 트리옥틸아민 용액에 넣고 동일한 방법으로 가열하여 반응시킨 뒤 침전시켜 얻었다. 이어, 20 mg/ml로 톨루엔상에 분산되어 있는 나노 입자에 과량의 디머캡토숙신산이 녹아 있는 DMSO 용액을 넣어주고 2 시간 동안 반응시킨 뒤 나노 입자를 원심 분리하여 분리해낸 뒤 물에 분산시켰다. 이러한 방법으로 합성된 나노 입자는 균일한 크기의 구형의 형태를 가지고 있으며 아연의 포함량은 ICP-MS 및 EDAX를 통해 분석되었다.
실시예 3: 자성 분리용 조성물에 사용되는 식 ZnxM1-xFe2O4 (M = Co 또는 Ni, x = 0.3, 0.4)의 조성 및 12 nm의 코어 크기를 가지고 디머캡토숙신산으로 코팅된 아연이 포함된 페라이트 계열 나노 입자의 합성
본 명세서에서 기술된 아연이 포함된 금속 산화물 나노 입자의 예로 식 ZnxM1-xFe2O4 (M = Co 또는 Ni, x = 0.3, 0.4)의 조성을 갖고 12 nm의 코어 크기를 갖는 아연이 포함된 페라이트 나노 입자를 다음과 같은 방법으로 합성하였다. 20 mmol의 올레산 및 올레일아민을 포함하는 트리옥틸아민 용액에 ZnCl2, CoCl2 또는 NiCl2, 그리고 Fe(acac)3을 2 시간동안 200oC 및 300oC에서 열분해 시켜 12 nm Zn0.3M0.7Fe2O4(M = Co 또는 Ni) 나노 입자를 합성하였다. 아연의 포함 비율을 조절하기 위해서는 선구 물질인 ZnCl2, CoCl2 또는 NiCl2의 비율을 조절하여 같은 방법으로 반응 시킨다. 그런 다음, 20 mg/ml로 톨루엔상에 분산되어 있는 나노 입자에 과량의 디머캡토숙신산이 녹아 있는 DMSO 용액을 넣어주고 2 시간 동안 반응시킨 뒤 나노 입자를 원심 분리하여 분리해낸 뒤 물에 분산시켰다. 이러한 방법으로 합성된 나노 입자는 균일한 크기의 구형의 형태를 가지고 있으며 아연의 포함량은 ICP-MS 및 EDAX를 통해 분석되었다.
실시예 4: 자성 분리용 조성물에 사용되는 식 ZnxMyOz (M = Mn, Co, Ni)의 조성을 가지고 테트라메틸암모늄하이드록사이드 (tetramethylammoniumhydroxide (TMAOH))으로 코팅된 아연이 포함된 산화물 나노 입자의 합성
본 명세서에서 기술된 아연이 포함된 금속 산화물 나노 입자의 예로 식 ZnxMyOz(M = Mn, Co, 또는 Ni)의 조성을 가지고 아연이 포함된 산화망간 나노 입자를 다음과 같은 방법으로 합성하였다. 0.5 mmol의 올레산 및 6.5 mmol의 올레일아민을 포함하는 트리옥틸아민 용액에 ZnCl2 및 MCl2 (M = Mn, Co, 또는 Ni)을 1시간 동안 270oC에서 열분해 시켜 ZnxMyOz(M = Mn, Co, 또는 Ni) 나노 입자를 합성하였다. 이렇게 합성된 50 mg/ml의 농도로 1 ml의 톨루엔에 분산되어 있는 아연이 포함되어 있는 산화물 나노 입자를 과량의 에탄올을 사용하여 침전시킨 뒤, TMAOH 용액 5 ml에 재분산 시켜 수용액에 분산시켰다. 합성된 나노 입자는 Zn0.4Mn2.6O4, Zn0.2Co0.8O, Zn0.2Ni0.8O의 조성을 가지고 있으며 코어의 크기는 각 6, 7 및 10 nm이다. 아연의 포함량은 ICP-MS 및 EDAX를 통해 분석하였다.
실시예 5: 아연이 포함된 나노 입자와 포함되지 않은 나노 입자와의 포화 자화율의 비교
아연이 포함된 나노 입자가 어느 정도의 포화 자화율 향상을 가져오는지 비교하기 위해, 기존에 상업적으로 이용되는 산화철 나노 입자인 CLIO(cross-linked iron oxide) 및 FeridexTM(Taejoon Co Ltd.), 그리고 아연이 포함되지 않도록 합성된 여러 페라이트 나노 입자와 상온에서 포화 자화율을 측정하였다. CLIO는 Weissleder et al. Journal of Magnetic Resonance in Medicine 29:599(1993)에 명시된 방법에 따라 합성하였다. 여러 페라이트 나노 입자는 대한민국 특허 제10-0604975호, 제10-0652251, 제10-0713745, PCT/KR2004/002509, 대한민국 특허 제 10-0604975호, PCT/KR2004/003088, PCT/KR2007/001001, 대한민국 특허출원 2006-0018921호에 명시된 방법을 통하여 합성하였으며, Zn이 포함된 금속 산화물 나노 입자는 실시예 1에 의해 합성되었다. 이들의 포화 자화율은 Superconducting Quantum Interference Device(SQUID) Magnetometer(MPMS-XL, Quantum Design)를 이용하여 상온에서 측정하였다. 실험 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 아연이 포함된 나노 입자는 포함되지 않은 나노 입자와 비교하여 월등히 높은 포화 자화율을 갖는 것을 확인하였다. 특히 기존에 상업적으로 이용된 나노 입자와 비교하면, CLIO의 경우 64 emu/g, Feridex의 경우 82 emu/g를 보인 반면 아연이 포함된 나노 입자는 Zn0.4Fe2.6O4이 161 emu/g, Zn0.4Mn0.6Fe2O4이 175 emu/g의 값을 보였다. 또한 이 값은 아연이 포함되지 않은 Fe3O4 및 MnFe2O4 나노 입자에 비해 각각 47 및 61 emu/g만큼 증가된 값이다.
따라서 자성 나노 입자의 센서 응용에 있어 포화 자화율은 센서의 감도에 제곱에 비례하므로, 증가된 포화 자화율을 갖는 아연이 포함된 나노 입자는 기존의 센서의 감도를 크게 향상 시킬 수 있을 것으로 예상된다.
실시예 6: 아연이 포함된 나노 입자를 이용한 나노 입자 클러스터의 제조
본 명세서에서 기술된 아연이 포함된 나노 입자를 이용한 나노 입자 클러스터의 하나의 예로, 폴리스티렌-폴리아크릴산 공중합 고분자에 의해 만들어진 마이셀에 포접된 자성 나노 입자 클러스터를 제조하였다. 사용된 고분자 및 클러스터의 기본적인 제조 방법은 Taton et al. Nano Leters 5:1987(2005) 방법에 의해 합성하였다. 먼저 대한민국 특허 제10-0604975호, 제10-0652251, 제10-0713745, PCT/KR2004/002509, 대한민국 특허 제 10-0604975호, PCT/KR2004/003088, PCT/KR2007/001001, 대한민국 특허출원 2006-0018921호에 의해 만들어진 올레산 및 올레일 아민이 코팅된 아연이 함유된 나노 입자를 준비하였다. 그 후 폴리스티렌-폴리아크릴산 공중합 고분자를 0.1 mg/ml의 농도로 디메틸포름아미드(DMF, Aldrich)에 녹이고, 테트라하이드로퓨란(THF, Aldrich)를 50%의 농도가 되도록 추가로 넣어주었다. 그 후 용액을 빠르게 저어 주면서 0.1 mg/ml 농도가 되도록 나노 입자를 서서히 넣어주고, 마지막으로 물을 5 ml/hr의 속도로 40 ml를 넣어주었다. 이렇게 만들어진 아연이 함유된 나노 입자가 포접된 고분자 마이셀은 원심분리를 통해서 분리되었으며, 농축되었다. 이 마이셀은 표면에는 카르복실산이 노출되어 있어 수용액상에서 안정화 시키는 동시에 이 작용기를 이용하여 추후, 항체와 같은 결합제를 붙일 수 있는 역할을 한다. 또한 본 마이셀의 용액상의 안정도 및 분산도를 높이기 위해서 교차 결합을 하였다. 이를 위해 5 mM 농도의 EDC(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide, Sigma) 및 2 mM 농도의 sulfo-NHS(N-hydroxysulfosuccinimide, Sigma), 5 mM 농도의 2,2'-(ethylenedioxy)bis(ethylamine)(Aldrich)이 교차 연결자로 사용되었다. 이렇게 합성된 마이셀은 도 4에 나타낸 것과 같이, 약 120 nm 의 전체 크기를 가지며, 안에는 약 15개 정도의 아연이 함유된 나노 입자를 포함하고 있다. 이렇게 합성된 나노 입자의 클러스터는 그 앞서 명세서에 기술된 것처럼, 증가된 자화율을 가질 것으로 예상되며, 자성 분리용 조성물의 분리 효율을 크게 향상 시킬 수 있다.
실시예 7: 외부 자기장 생성 수단으로 사용된 NdFeB 자석의 자기장 측정
본 발명의 자성 분리용 조성물에서는 외부 자기장 생성 수단으로 기존의 알려진 강자성 자석 중의 하나인 NdFeB 자석을 사용하였다. 일반적으로 자석의 자기장은 표면에서 멀어질수록 감소하므로, 거리에 따른 자기장 세기를 측정하여 자성 분리가 가능한 적정 자기장을 찾고자 하였다. 측정한 결과를 도 5에 나타내었다. 자기장은 Kanetec TM-601 테슬라 미터를 사용해서 측정하였다. 측정 결과, 자기장 세기는 거리에 일차식으로 반비례 하였으며, 기울기(=dB/dx)는 4.7 T/m 이었다.
실시예 8: 아연이 포함된 나노 입자 및 아연이 포함되지 않은 나노 입자를 이용한 자성 분리 효율 비교
아연이 포함된 나노 입자가 아연이 포함되지 않은 나노 입자와 비교하여, 자성 분리용 조성물의 효율을 훨씬 향상 시킬 수 있음을 아래와 같이 입증하였다. 자성 분리용 조성물이라 함은 도 6에 보인 것과 같은 작동 원리를 갖는다. 분리하고자 하는 물질이 들어 있는 용액에 이 물질과 선택적으로 결합하는 결합제가 부착되어 있는 자성 나노 입자를 혼합하면 분리하고자 하는 물질과 자성 나노 입자가 결합하고 이를 자석으로 끌어당겨 분리해 낼 수 있다. 우선, 아연이 포함된 나노 입자 및 포함되지 않은 나노 입자는 각각 실시예 1 및 대한민국 특허 제10-0604975호, 제10-0652251, 제10-0713745, PCT/KR2004/002509, 대한민국 특허 제10-0604975호, PCT/KR2004/003088, PCT/KR2007/001001, 대한민국 특허출원2006-0018921호에 명시된 방법을 통하여 합성하였다. 또한 각각의 나노 입자는 실시예 4에 명시된 방법을 통하여 TMAOH를 이용하여 표면 개질하여 수용화 하였다. 이후 이 나노 입자는 대한민국 특허 등록 제0604976호, 제0652251호, 제0713745호에 명시된 방법을 통하여 소혈청알부민(BSA)로 코팅하였다. 분리하고자 하는 물질은 간단한 예로서 형광 염료(rhodamine, 로다민, Pierce)를 사용하였다. 즉, 로다민이 존재하는 수용액(100 nM)에 BSA로 코팅된 아연을 포함하는 나노 입자(Zn0.4Fe2.6O4) 및 아연을 포함하지 않는 나노 입자(Fe3O4)를 각각 동일한 양(0.1 mg/ml)을 넣어 주었다. 이 로다민의 한쪽 끝에는 N-hydrosuccinimide기가 존재하여 BSA로 코팅된 나노 입자의 표면에 존재하는 라이신 등의 아미노산의 일차 아민기와 선택적으로 반응하여 결합한다. 이렇게 서로 결합된 로다민 및 아연이 포함된/포함되지 않은 나노 입자는 동일한 자석을 사용하여 당겨서 분리 속도 및 효율을 비교하였다(도 7). 도 7의 (가)는 로다민의 흡수 파장(580 nm)을 시간에 따라 모니터링 하면서 그 흡광도를 측정한 그래프이다. 즉 자성을 이용하여 분리가 시작되면 용액 속에 존재하는 로다민 분자가 시간에 따라 점점 줄어들게 되면서 그 흡광도는 점점 작아지게 된다. 그래프에서 보이는 대로 아연이 포함된 나노 입자를 사용한 경우 4분 정도에 거의 모든 로다민이 모두 분리되어 흡광도가 거의 0.2 수준에 도달하였음을 알 수 있다. 반면에 아연이 포함되지 않은 나노 입자를 사용한 경우 6분 까지 거의 흡광도의 변화가 없고, 10분 째에 이르러서야 흡광도가 약 0.12 수준으로 감소하며, 50분이 지나서야 흡광도가 거의 0.2 수준에 도달하였다. 도 7의 (나)는 (가) 그래프를 분리율(%)로 나타낸 그래프이다. 마찬가지로 아연이 함유된 나노 입자를 사용하였을 경우 4분 만에 90% 이상의 분리율을 보인 반면에, 아연이 함유되지 않은 나노 입자를 사용하였을 경우에는 10분이 지나도록 20% 정도의 분리율 밖에 보이지 못하며, 50분이 되어서야 90% 이상의 분리율을 보이게 된다. 이러한 결과는 아연이 함유된 나노 입자를 사용하였을 때 자성 분리 시간을 월등히 단축 시킬 수 있다는 것을 의미한다.
실시예 9: 아연이 포함된 나노 입자 및 아연이 포함되지 않은 나노 입자의 외부 자기장 세기 변화에 따른 자성 분리 효율 비교
외부 자기장의 세기 변화에 따른 아연이 포함된 나노 입자와 포함되지 않은 나노 입자의 자성 분리 효율을 비교하였다. 자기장의 세기 조절은 실시예 7에서 관찰된 결과를 바탕으로 자석 분리 시스템과 자석과의 거리를 조절함으로서 이루어졌다. 자석 분리 시스템은 MACS 컬럼(Miltenyi Biotech, Germany)을 사용하였고 아연이 포함된 나노 입자와 포함되지 않은 나노 입자는 실시예 1 및 대한민국 특허 제10-0604975호, 제10-0652251, 제10-0713745, PCT/KR2004/002509, 대한민국 특허 제10-0604975호, PCT/KR2004/003088, PCT/KR2007/001001, 대한민국 특허출원2006-0018921호에 명시된 방법을 통하여 합성하였다.
MACS 컬럼에 외부에서 자기장을 가해 준채로, 상기 아연이 함유된 자성 나노 입자 및 아연이 함유되지 않은 자성 나노 입자를 0.2 mg/ml의 농도로 집어넣어 주었다. 이 때 자성 나노 입자는 외부 자기장에 의해 MACS 컬럼안에 잡혀 있게 되며, 외부 자기장을 제거해 주면, 컬럼 안에 잡혀 있던 나노 입자가 빠져 나오게 된다. 이 때 어떤 나노 입자를 사용하느냐에 따라 나노 입자의 자화율이 달라지므로, 컬럼안에 잡혀 있는 나노 입자의 양이 달라진다. 잡혀 있는 나노 입자는 흡광 광동계를 이용하여 정량되었다.
도 8은 아연이 함유된 나노 입자(Zn0.4Fe2.6O4) 및 아연이 함유되지 않은 나노 입자(Fe3O4)를 사용하여 비교 실험한 결과이다. 그래프에 보이는 대로, 외부 자기장이 매우 강할 때는(300 mT) 분리된 자성 나노 입자의 양이 비슷하였다. 그러나 외부 자기장이 점차로 작아짐에 따라, 아연이 함유된 나노 입자 및 함유되지 않은 나노 입자의 분리된 양이 차이가 생긴다. 즉, 150 및 100 mT의 외부 자기장 하에서는 아연이 함유된 나노 입자의 경우가 함유되지 않은 나노 입자에 비해서 각 17% 및 22% 더 많은 양의 나노 입자가 컬럼안에 잡혀서 분리되었다. 그러나 이보다 외부 자기장이 더 줄어들게 되면 분리된 양의 차이는 점차 줄어들게 되며, 외부 자기장이 존재하지 않을 경우에 분리되지 않는 것은 아연이 포함된 나노 입자나 포함되지 않거나 같다. 본 실험 결과는 아연이 함유된 나노 입자는 상대적으로 작은 외부 자기장을 사용하여도 기존보다 우수한 분리 효율을 보임을 의미한다.
실시예 10: 외부 자기장 존재 하에 항체 단백질(Anti-Mouse IgG-FITC)에 대한 아연이 포함된 나노입자 및 아연이 포함 되지 않은 나노입자의 자성 분리 효율 비교 및 정량
외부 자기장 존재 하에 아연이 포함된 나노입자와 아연이 포함되지 않은 나노입자의 자성세기 차이를 이용하여 항체 단백질을 분리하였고 그 효율을 비교하였다. 자석 분리 시스템은 MACS컬럼(Miltenyi Biotech, Germany)을 사용하였다.
아연이 포함되지 않은 나노입자는 Fe3O4, 아연이 포함된 나노입자는 Zn0.4Fe2.6O4 이다. 두 경우 모두 지름 15 nm 크기의 입자를 사용하였고, 각각의 나노입자 표면에 디머캡토숙신산(DMSA) 처리 후 Protein A(Sigma)를 붙여주었다. 상기 나노 입자의 합성은 실시예 1의 방법을 이용하여 합성하였다. Protein A를 나노 입자의 표면에 붙이기 위해 Protein A를 sulfo-SMCC(Sulfosuccinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate, Pierce)와 30분간 반응 시킨 뒤 나노 입자와 섞어주었다. 나노입자 표면에 Protein A가 잘 붙었는지에 대한 여부는 전기영동법을 통해 확인하였다. 분리하고자 하는 대상이 되는 단백질은 염소 Anti-Mouse IgG-FITC(Sigma)이다. 외부에서 자기장을 걸어준 상태에서 각각의 MACS 컬럼에 상기 합성된 아연이 함유된 자성 나노입자(0.08 mg/ml)와 함유되지 않은 자성 나노입자(0.08 mg/ml)를 넣고, 여기에 형광염료가 붙어있는 항체 단백질(0.01 M Anti-Mouse IgG-FITC 1 ml)을 각각 넣어주면 나노입자 표면에 코팅되어 있는 Protein A와 항체 단백질 사이의 특정 반응에 의해 항체 단백질이 나노입자 표면에 결합하게 된다. 자성 나노입자는 외부 자기장에 의해 MACS칼럼 안에 잡혀 있게 되며, 외부 자기장을 제거해 주면 컬럼 안에 잡혀있던 나노입자가 빠져 나오게 되는데 이 때 어떤 나노입자를 사용하느냐에 따라 나노입자의 자화율이 달라지므로, 컬럼 안에 잡혀 있는 나노입자의 양은 달라진다. 이 때, 잡혀있는 나노입자 표면에는 형광 염료를 포함하는 항체 단백질이 결합되어 있으므로, 형광 신호세기를 측정함으로써 분리된 나노입자의 양을 역으로 알아 낼 수 있게 된다. 그리고 결과적으로 두 나노입자의 자성 값 차이를 통해 항체 단백질에 대한 분리 효율정도를 비교할 수 있게 된다.
도 9는 아연이 함유된 나노 입자(Zn0.4Fe2.6O4) 및 아연이 함유되지 않은 나노 입자(Fe3O4)를 사용하여 비교 실험한 결과이다. 그래프에 보이는 대로, MACS 컬럼으로 분리 후 아연이 함유된 자석 나노입자의 경우에서 더 높은 세기의 형광 신호가 측정 되었음을 확인 할 수 있다. 이는 항체에 결합되어 있는 형광 물질로 인해 나타나는 것으로, 아연이 함유된 자성 나노입자가 그렇지 않은 나노입자에 비해 자화율이 높아 더 큰 자성 값을 띠어 MACS 컬럼에 더 많은 양이 잡혀서 나타난 결과이다. 자성 나노입자에는 형광 염료인 FITC를 포함하는 항체 단백질이 붙어있으므로, 자성 나노입자의 양이 많을수록 관측되는 형광의 세기도 더 크다. FITC는 495nm 파장의 빛을 흡수하여 521nm 파장에서 가장 강한 세기의 형광을 방출하는 물질적 특성을 지닌다. 따라서, 521nm 에서의 형광세기를 기준으로 각 자성 나노입자의 항체 단백질에 대한 분리효율 차이를 계산 해보았을 때 아연 함유 나노입자의 경우가 아연을 함유하지 않는 나노입자의 경우보다 약 4.71배 많은 양의 항체 단백질을 분리해 냄을 확인 할 수 있다(MACS 컬럼으로 분리 후 521nm에서의 아연이 함유된 나노입자와 함유되지 않은 나노입자의 형광 신호 값은 각각 10.00au, 2.13au). 이 때 항체에 붙어 있는 형광 물질의 양을 고려하면(약 50 분자/항체) 아연이 함유되어 있는 나노입자의 경우, 약 3 μg의 항체가 분리되었음을 알 수 있다. 본 실험의 결과는 아연이 함유된 나노입자를 사용할 경우 우수한 분리 효율을 얻을 수 있고 정량화가 가능함을 나타낸다.
실시예 11: 외부 자기장 존재 하에 세포(U87MG, 뇌종양 세포)에 대한 아연이 포함된 나노입자 및 아연이 포함 되지 않은 나노입자의 자성 분리 효율 비교
외부 자기장 존재 하에 아연이 포함된 나노입자와 아연이 포함되지 않은 나노입자의 자성세기 차이를 이용하여 세포를 분리하고 그 효율을 비교하였다. 외부 자기장은 NdFeB 영구자석을 이용하여 부가하였다.
우선 세포 U87MG(뇌종양 세포, ATCC)에 결합될 수 있도록 아연이 포함된 나노입자와 포함되지 않은 나노입자 표면 각각에 디머캡토숙신산(DMSA)으로 코팅 처리 한 후 항체 단백질을 붙여주었다. 항체 단백질은 시중에 Erbitux라고 알려져 있는 Cetuximab(Merck)을 사용하였는데 이 항체 단백질은 U87MG 세포의 표면에 있는 EGFR 수용체와 결합이 가능하다. 나노 입자와 항체와의 결합을 위해 상기 실시예 10에 나타낸 방법처럼 먼저 항체 단백질을 sulfo-SMCC(Pierce)를 이용하여 활성화 시키고 여기에 DMSA로 코팅되어 있는 나노 입자를 섞어 주어 만들었다. 이렇게 Cetuximab이 붙어있는 각각의 나노입자들을 PBS 완충용액에 분산되어 있는 세포와 상온에서 1시간 반응 시켜 준 후 외부 자기장을 가해 주었다. 반응 후에는 나노입자 표면에 붙어있는 Cetuximab 항체가 세포와 결합하여 결국 세포 표면에 나노입자가 붙어있는 형태가 되므로 여기에 외부 자기장을 가해 줄 경우 세포가 자기장 방향으로 끌려가게 된다. 따라서, 반응용액 중 자석과 적당히 떨어진 일정 부분에서 시간별로 샘플을 채취하여 세포의 수를 관측했을 때, 외부자기장을 가해 주기 전에는 반응용액 전체에 골고루 세포가 퍼져 있었지만 외부자기장을 가해준 후에는 그 부분의 세포들이 자석으로 딸려 가기 때문에 관측되는 세포의 수가 시간에 지남에 따라 감소하게 된다. 실제 실험은 가로 5cm, 세로 5cm, 높이 1cm의 NdFeB 자석을 세워 놓고 그 옆에 아연이 함유 되어있는 나노입자 및 함유 되어 있지 않은 나노입자의 반응용액을 바이알에 담아 위치시킨 후 자석과 가장 멀리 떨어진 바이알의 일정 부분에서 시간별로 용액을 채취하였다. 반응용액을 채취하는 시간 간격은 0, 0.5, 1, 2.5, 5, 10, 15, 60분으로 하였다. 시간별로 30μl씩 반응용액을 채취 하였고, 세포의 수를 세기 위해 헤마사이토미터와 트리판블루스테인 0.4%를 이용하였다.
도 10은 상기 방법을 이용하여 아연이 함유된 나노 입자(Zn0.4Fe2.6O4) 및 아연이 함유되지 않은 나노 입자(Fe3O4)를 사용하여 세포 분리에 대한 비교실험을 한 결과이다. 아연이 포함된 자성 나노입자의 경우가 포함되지 않은 경우 보다 자화율이 더 크기 때문에 세포를 자석 쪽으로 더 강하고 빠르게 끌고 가므로, 용액 내 원래의 위치에서 자석 근처의 영역으로 분리된 세포의 수가 시간이 지남에 따라 더 빠르게 증가함을 확인 할 수 있다(도 10의 패널 A).
도 10의 패널 B는 외부 자기장을 걸어 준 지 5분이 되는 시점에서, 각 경우의 분리된 세포의 수를 이용하여 계산한 세포 분리 효율 값이다. 분리 전 세포 수에 대한 분리 후 세포 수의 비율로 세포 분리 효율을 계산하였다. 아연이 함유된 자석 나노입자의 경우가 그렇지 않은 자석 나노입자의 경우보다 세포를 분리하는데 있어서 약 2.9배의 높은 효율을 보임을 확인 할 수 있으며 이때 분리된 세포의 양은 헤마사이토미터를 이용해서 정량이 가능하다.
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 이들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (18)

  1. 하기 일반식 1 또는 2의 아연-함유 자성 나노 입자 2~1000개들이 하나의 입자로 뭉쳐져 있는 클러스터를 포함하는 아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물:
    일반식 1
    ZnfMa-fOb (0<f<8, 0<a≤16, 0<b≤8, 0<f/(a-f)<10, M은 자성을 띠는 금속 원자 또는 상기 금속 원자들의 합금);
    일반식 2
    ZngMc-gM’dOe (0<g<8, 0<c≤16, 0<d≤16, 0<e≤8, 0<g/{(c-g)+d}<10, M은 자성을 띠는 금속 원자 또는 상기 금속 원자들의 합금이고; M’은 1족 원소, 2족 원소, 12족 원소, 13족 원소, 14족 원소, 15족 원소, 전이 금속 원소, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 원소).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 아연-함유 자성 나노 입자-기반 자성 분리용 조성물은 자기장 생성 수단을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 일반식 2의 M’은 Li, Na, K, Rb, Cs, Be, Mg, Ca, Sr, Ba, Ra, Ge, Ga, Bi, In, Si, Ge, Ti, V, Cr, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Y, Zr, Nb, Mo, Tc, Ru, Rh, Pd, Ag, Cd, Hf, Ta, W, Re, Os, Ir, Pt, Au, Hg, 란탄족 원소 및 악티늄족 원소로 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 원소인 것을 특징으로 자성 분리용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 아연-함유 자성 나노 입자는 다음 일반식 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물:
    일반식 3
    ZnkM”h-kFeiOj (0<k<8, 0<h≤16, 0<i≤8, 0<j≤8, 0<k/{(h-k)+i}<10, M”은 자성을 띠는 금속 원자 또는 상기 금속 원자들의 합금)
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 아연-함유 자성 나노 입자는 다음 일반식 4 또는 5로 표시되는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물:
    일반식 4
    ZnqFel-qOm (0<q<8,0<l≤8, 0<m≤8, 0<q/(l-q)<10)
    일반식 5
    ZnrMnn-rFeoOp (0<r<8, 0<n≤8, 0<o≤8, 0<p≤8, 0<r/{(n-r)+o}<10)
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 아연-함유 자성 나노 입자에서 아연과 다른 금속의 비율이 화학양론적으로 0.001 < 아연/(총 금속물질-아연)< 10인 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  7. 삭제
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 아연-함유 자성 나노 입자의 클러스터는, 상기 아연 함유 자성 나노 입자들이 서로 인력에 의해 결합되어 있거나, 유무기 담체로 둘러싸여 있는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  9. 제 1 항에 있어서, 상기 아연-함유 자성 나노 입자는 타겟물질에 대해 결합 친화도를 가지는 결합제(binding agent)가 표면에 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 아연-함유 자성 나노 입자 클러스터의 표면은 나노 입자의 수용화를 위한 수용성 다작용기 리간드가 코팅되어 있는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 유기 리간드는 무기질 나노 입자 표면에 결합하는 부착영역(LI)을 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 부착영역은 나노 입자 표면에 이온 결합, 공유 결합, 수소 결합 및 배위 결합에서 구성된 군으로부터 선택되는 1종 이상의 결합에 의해 결합되는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  13. 제 10 항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 분석물(analyte)에 대해 결합 친화도를 가지는 결합제(binding agent)를 결합시키기 위한 결합제 결합 영역(LⅡ), 또는 수용성 다작용기 리간드 사이의 교차연결을 위한 교차연결영역(LⅢ), 또는 상기 결합제 결합 영역(LⅡ)과 교차연결 영역(LⅢ)을 동시에 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  14. 제 11 항에 있어서, 상기 부착영역(LI)은 -CHO, -COOH, -NH2, -SH, -CONH2, -PO3H, -OPO4H, -SO3H, -OSO3H, -N3, -NR3OH(R=CnH2n+1, 0≤n≤16), -OH, -SS-, -NO2, -CHO, -COX(X = F, Cl, Br, I), -COOCO-, -CONH-, -CN 및 탄소 수 2개 이상의 탄화수소로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  15. 제 13 항에 있어서, 상기 결합제 결합 영역(LⅡ)은 -CHO, -SH, -COOH, -NH2, -OH, -PO3H, -PO4H2, -SO3H, -OSO3H, -NR3 +X-(R= CnHm 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl, 또는 Br), NR4 +X-(R= CnHm 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl, Br), -N3, -SCOCH3, -SCN, -NCS, -NCO, -CN, -F, -Cl, -I, -Br, 에폭시기, -ONO2, -PO(OH)2, -C=NNH2, -HC=CH- 및 -C=C-으로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  16. 제 13 항에 있어서, 상기 교차연결영역(LⅢ)은 -SH, -CHO, -COOH, -NH2, -OH, -PO3H, -PO4H2, -SO3H, -OSO3H, -NR3 +X-(R= CnHm 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl, or Br), NR4 +X-(R= CnHm 0≤n≤16, 0≤m≤34, X = OH, Cl, Br), -N3, -SCOCH3, -SCN, -NCS, -NCO, -CN, -F, -Cl, -I, -Br, 에폭시기, -ONO2, -PO(OH)2, -C=NNH2, -HC=CH- 및 -C=C-로 구성된 군으로부터 선택되는 작용기를 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  17. 제 10 항에 있어서, 상기 수용성 다작용기 리간드는 화학 단분자, 고분자, 양친성 리간드, 탄수화물, 펩타이드, 단백질, 핵산 또는 지질을 포함하는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
  18. 제 10 항에 있어서, 상기 아연-함유 자성 나노 입자 클러스터는 수용성 다작용기 유기 리간드로 표면 코팅 되어 있고 타겟물질에 대해 결합 친화도를 가지는 결합제(binding agent)가 결합제 결합 영역(LⅡ)을 통하여 결합되어 있는 것을 특징으로 하는 자성 분리용 조성물.
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