KR20070057766A

KR20070057766A - 고상 결합 물질로부터 핵산을 방출하는 조성물 및 방법

Info

Publication number: KR20070057766A
Application number: KR1020077000914A
Authority: KR
Inventors: 하셈 아카반-타프티; 레누카 데실바; 사라다 시리푸라푸; 리차드 핸드레이
Original assignee: 루미젠, 인코포레이티드
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2005-06-30
Publication date: 2007-06-07
Also published as: KR20070057768A; JP2008506385A; JP2008506386A; EP1781808A1; KR20070058433A; EP1781816A1; EP1781808A4; WO2006019388A2; CN101027411A; WO2006019387A1; CA2573905A1; AU2004322310A1; AU2004322309A1; EP1789578A4; JP2008506387A; IL180502A0; AU2005275484A1; CN101018870A; CA2573998A1; EP1789578A2

Abstract

핵산을 분리하는 방법을 개시한다. 상기 방법은 핵산을 고상 결합 물질에 결합하는 단계와 새로운 시약 조성물로 용리함으로써 상기 결합된 핵산을 고상으로부터 방출하는 단계를 포함한다. 조성물들은 높은 이온 강도 버퍼 또는 첨가된 친수성 유기 공용매 또는 그 양자 모두를 특징으로 한다. 본 발명의 방법 및 조성물과 사용될 수 있는 바람직한 고상 물질은 4급 오늄 핵산 결합 부위를 포함한다.

핵산, 고상 결합 물질, 4급 오늄, 버퍼, 친수성 유기 공용매, 수성 아민 버퍼 용액.

Description

고상 결합 물질로부터 핵산을 방출하는 조성물 및 방법{COMPOSITIONS AND METHODS FOR RELEASING NUCLEIC ACIDS FROM SOLID PHASE BINDING MATERIALS}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 본 출원인들이 함께 출원하여 출원계속중인, 2003년 11월 17일에 출원한 미국특허출원번호 10/714,763 및 2003년 11월 17일에 출원한 미국특허출원번호 10/715,284의 일부 계속 출원(continuation-in-part)이다.

본 발명은 핵산을 결합, 분리 또는 정제하는 데 사용되는 고상 물질에 결합된 핵산을 방출하는 새로운 조성물의 사용에 관한 것이다.

분자 진단이나, 분자 생물학에서의 새로운 기법(역전사, 복제, 제한 분석, 증폭 및 서열 분석을 포함하는)은 이러한 기법들에서 사용되는 핵산이 오염 물질이나 방해물이 실질적으로 없을 것을 필요로 한다. 바람직하지 않은 오염 물질은 예컨대 효소, 기타 형태의 단백질, 다당류(polysaccharides), 폴리뉴클레오티드(polynucleotides), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotides), 뉴클레오티드, 지방질(lipid), 저분자량 효소 억제제 또는 비대상(non-target) 핵산과 같은 거대 분자 물질, 효소 보조 인자, 염, 카오트로프(chaotropes), 염료(dyes), 금속 염, 완충 염 및 유기 용제를 포함한다.

대상 핵산이 발견되는 표본 소지가 복잡하기 때문에 분자 생물학 용도로 오염 물질이 실질적으로 없는 대상 핵산을 얻는 것은 쉽지 않다. 그러한 표본은 예컨대, 조직의 세포, 체액의 세포, 혈액, 배양물의 박테리아 세포, 아가로스 겔, 폴리아크릴아미드 겔 또는 표적 핵산의 증폭 결과 용액을 포함한다. 표본 소지들은 흔히, 핵산을 분자 생물학 또는 진단 기법에 사용할 수 있기 전에 그 관심 핵산으로부터 제거해야 하는 오염 물질들을 상당량 포함한다.

전술한 바와 같이 세포나 조직으로부터 생산되는 소지로부터 대상 핵산을 분리하는 종래의 기술은 페놀, 클로로포름 및 에티듐 브로마이드(ethidium bromide)와 같은 위험한 화학 물질들의 사용을 필요로 한다. 다양한 오염물질들과 대상 핵산의 혼합물로부터 오염물질들을 뽑아내기 위해 그러한 절차에서 페놀/클로로포름 추출물이 사용된다. 선택적으로, 세슘 클로라이드-에티듐 브로마이드 구배가 본 발명 관련 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 사용된다. 예컨대, Molecular Cloning, ed. by Sambrook et al. (1989), Clod Spring Harbor Press, pp. 1.42-1.50을 참조하라. 후자의 방법은 일반적으로 뒤이어, 추출된 수성상(aqueous phase)에 에탄올 또는 2-프로판올을 첨가하여 핵산을 침전시킴으로써 수성상에 잔류하는 핵산 물질의 침전이 이루어진다. 상기 침전물은 일반적으로 원심 분리에 의해 용액으로부터 제거되고, 결과적으로 얻어진 침전물 펠리트는 후속 과정에서 사용되기 위해 건조된 후 물이나 완충 용액에 현탁된다.

세포 용해물이나 핵산 및 오염물질의 기타 혼합물들로부터 핵산을 분리하기 위해 다양한 유형의 고상을 사용하는 더 간단하고 신속한 방법이 개발되었다. 그러 한 고상들은 예컨대 섬유상, 필터 및 코팅된 컨테이너와 같은 다양한 형태와 형상의 크로마토그래피 수지들, 고분자들 및 실리카나 유리계 물질들을 포함한다. 작은 입자의 형태일 때는, 때로는 분리 수행을 보조하기 위해 자기 코어(magnetic core)가 제공된다.

핵산 분리에 사용되는 고상 중 한 유형은 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography: HPLC)에 사용되도록 설계된 다공성 실리카겔 입자들을 포함한다. 상기 다공성 실리카겔 입자들의 표면은 특정 염과 pH 조건 하에서 플라스미드 DNA와 교환하는 음이온-교환기로 기능화되었다. 예컨대, 미국특허번호 4,699,717 및 5,057,426을 보라. 이러한 고상 물질들에 결합된 플라스미드 DNA는 고농도의 염을 함유하는 수성 용액에서 용리(elute)된다. 거기서부터 용리된 핵산 용액은 다운스트림 공정들에서 사용되기 전에 염의 제거 처리가 더 이루어져야 한다.

다른 실리카계 고상 물질들은 조절 다공성 유리(controlled pore glass: CPG), 실리카 입자들이 박힌 필터, 실리카겔 입자, 규조토, 유리 섬유 또는 이들의 혼합물들을 포함한다. 각 실리카계 고상 물질들은 요오드화 나트륨(NaI), 구아니디늄 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate) 또는 구아니디늄 클로라이드(guanidinium chloride)와 같은 카오트로픽 시약이 있는 핵산을 함유한 표본에서 핵산을 가역적으로 결합한다. 그러한 고상은, 잔류 표본 성분으로부터 소지와 그것에 결합된 핵산 물질을 분리하기 위해 그 고상이 원심 분리나 진공 여과를 거칠 때 핵산 물질을 결합하고 유지한다. 핵산 물질은 그 후 물이나 저염 용리 버퍼로 용리 함으로써 고상으로부터 유리된다. 상업적으로 입수 가능한 핵산 분리용 실리카계 고상 물질은 예컨대, Wizard^TM DNA purification systems products (Promega, Madison, WI), the QiaPrep^TM DNA isolation systems (Qiagen, Santa Clarita, CA), High Pure (Roche), 및 GFX Micro Plasmid Kit, (Amersham)을 포함한다.

입자 형태의 고분자 수지들도 핵산의 분리 및 정제를 위해 광범위하게 사용된다. 카르복시산염-수정 고분자(carboxylate-modified polymer) 입자들(Bangs, Agencourt)이 알려져 있다. 4급(quaternary) 암모늄 헤드기들(ammonium head groups)을 가지는 고분자들이 유럽특허출원공개번호 EP 1243649A1에서 개시되었다. 상기 고분자들은 공유 결합으로 부착된 선형 비가교결합 고분자들을 가지는 불활성 캐리어 입자들이다. 이러한 유형의 고분자 고상은 통상 촉수 수지(tentacle resin)이라고 불린다. 상기 선형 고분자들은 4급 테트라알킬암모늄기(quaternary tetraalkylammonium group)들을 함유한다. 상기 알킬기들은 특히, 메틸 또는 에틸기(4열, 52-55 줄)이다. 더 긴 알킬기들은 바람직하지 않은 것으로 판단된다.

음이온 교환 이론에 기초한 핵산 결합을 위한 기타 고상 물질들이 현재 사용되고 있다. 이들은 유럽특허공개번호 EP 0496822 B1에 설명된 크로마토그래피 서포트(chromatographic support)에 기초한 silica-NucleoBond AX (Becton Dickinson, Roche-Genopure) 및 DEAE 헤드기(Qiagen)를 가지는 실리카계 물질을 포함한다. 고분자-트리알킬암모늄기(polymeric-tricakylammonium group)들을 가지는 고분자 수지들이 유럽특허공개번호 EP 1243649 (GeneScan)에 개시되었다. DNA 분리를 위한 카르복실-수정 고분자들이 다양한 공급자들로부터 입수 가능하다. 핵산은 고염 조건에서 끌어당겨지고, 저이온강도 조건에서 방출된다. 양이온 트리메틸아민 형식(cationic trimethylamine exterior)을 가지는 고분자 미세캐리어 비드(polymeric microcarrier bead)가 미국특허번호 U.S. 6,214,618에서 개시되었다. 상기 비드는 비교적 큰 직경을 가지며 배양에서 세포 부착 및 증식을 위한 서포트로 유용하다.

트리부틸포스포늄 헤드기를 가지는 고분자 비드는 3상계에서 상 전이 촉매로 사용되도록 기술되었다. 상기 비드는 가교결합된 폴리스티렌으로부터 준비되었다. (J. Chem. Soc. Perkin Trans. Ⅱ, 1827-1830, (1983)). 알킬렌 체인 및 알킬렌 에테르 체인을 통하여 가교결합된 폴리스티렌 수지에 연결된 펜던트 트리알킬포스포늄기를 가지는 고분자 비드도 기술되었다(Tomoi, et al. , Makromolekulare Chemie, 187(2), 357-65 (1986) ; Tomoi, et al. , Reactive Polymers, Ion Exchangers, Sorbents, 3(4), 341- 9 (1985)). 가교결합된 폴리스티렌 수지에 기초한 혼합 4급 암모늄/포스포늄 불용성 고분자들이 촉매 및 살생물제(biocide)로 개시되었다(Davidescu, et al. , Chem. Bull. Techn. Univ. Timisoara, 40(54), 63-72 (1995); Parvulescu, et al, . Reactive & Functional Polymers, 33(2,3) , 329-36 (1997)).

자기 반응성 입자들 또한 핵산 분리에 있어서 고상으로 사용되도록 개발되었다. 핵산 분리를 위해 설계된 몇 가지 다른 유형의 자기 반응성 입자들이 본 발명 관련 기술 분야에서 공지되었고, 몇몇 공급원으로부터 상업적으로 입수 가능하다. 핵산 물질들을 직접 가역적으로 결합하는 자기 입자들은 MagneSil^TM 입자(Promega)들을 포함한다. 자기 입자들은 mRNA의 폴리 A 테일과의 혼성(hybridization)을 위해 부착된 올리고(oligo) dT 테일(tail)을 가지는, 공유 결합으로 부착된 아비딘(avidin) 또는 스트렙타비딘(streptavidin)을 통해 mRNA를 가역적으로 결합하는 것으로도 알려져 있다.

다양한 유형의 자기 반응성 실리카계 입자들이 핵산 결합 분리 방법에서 고상으로 사용되는 것으로 알려져 있다. 그러한 입자 유형 중 하나는 미국특허번호 4,395,271; 4,233,169; 또는 4,297,337에 설명된 다공성 자기 유리 입자들; 또는 자기 반응성 유리 비드, 바람직하게는 CPG, Inc. (Lincoln Park, NJ)의 Magnetic Porous Glass (MPG)로 사용 가능한 조절된 다공성 크기를 가지는 자기 반응성 유리이다. 핵산 부착 및 분리에 유용한 다른 유형의 자기 입자는 자기 물질들을 고분자 이산화 규소 화합물의 소지 내에 혼합함으로써 생산된다. (독일특허번호 DE 4307262 A1) 4급 암모늄기를 가지는 셀룰로오스 소지 내에 박힌 산화철 나노입자들을 포함하는 자기 입자들은 Cortex Biochem (San Leandro, CA)에 의해 MagaCell-Q^TM으로 상업적으로 생산된다.

유도성 자기 성질들을 가지는 입자나 비드는 철, 니켈, 구리, 코발트 및 망간과 같은 전이 금속의 작은 입자들을 포함하여 자석이 존재하면 일시 자성(transitory magnetic properties)을 가지도록 야기될 수 있는 금속 산화물을 형성한다. 이러한 입자들은 상자성 또는 초상자성(superparamagnetic)으로 불린다. 상자성 또는 초상자성 비드를 형성하기 위해, 금속 산화물들은 물에서 비교적 안정한 고분자로 코팅되었다. 미국특허번호 4,554,088는 고분자 실란(polymeric silane)으로 둘러싸여진 금속 산화물 코어를 포함하는 상자성 입자들을 개시한다. 미국특허번호 5,356,713는 소수성 비닐방향족 단량체(hydrophobic vinylaromatic monomer)의 외피로 둘러싸여진 자화 가능 입자들의 코어로 구성된 자화 가능 마이크로스피어(microsphere)를 개시한다. 미국특허번호 5,395,688는 혼합 상자성 금속 산화물-중합체 층으로 코팅된 고분자 코어를 개시한다. 다른 방법은 예컨대 미국특허번호 4,774,265에서와 같이 금속 산화물을 흡착하기 위해 고분자 코어를 이용한다. 상자성 금속 산화물 입자층으로 코팅된 고분자 코어 입자를 포함하는 자기 입자가 미국특허번호 5,091,206에 개시되었다. 상기 입자는 그 후 금속 산화물을 보호하고 반작용 코팅을 제공하기 위해 추가 고분자층으로 더 코팅된다. 미국특허번호 5,866,099는 금속 염을 조화시키고 혼합된 금속 산화물 입자를 포착하기 위해 단백질의 존재 하에서 두 가지 금속 염들의 혼합물들의 공동 침전에 의한 자기 입자의 준비를 개시한다. 수많은 예시적인 금속 염 쌍들이 설명되었다. 미국특허번호 5,411,730은 침전된 혼합 금속염 입자들이 덱스트런, 올리고당에 포착되는 유사한 공정을 설명한다.

DNA와 RNA의 비가역적 포획을 위한 알루미나(산화 알루미늄) 입자들이 미국특허번호 6,291,166에 개시되었다. 결합된 핵산은 PCR과 같은 고상 증폭 방법에서 사용될 수 있다.

이러한 고상 물질들에 결합된 DNA는 고농도의 염을 함유한 수용액에서 용리 된다. 거기서 용리된 핵산 용액은 다운스트림 공정들에서 사용될 수 있기 전에 염 제거 처리가 더 이루어져야 한다. 반면, 실라카계 물질에 결합된 핵산은 물이나 저염 용리 버퍼로 용리함으로써 고상으로부터 유리된다. 미국특허번호 5,792,651은 핵산의 세포 내 트랜스펙션(transfection) 능력을 향상시키는 핵산의 크로마토그래프 분리를 위한 조성물을 설명한다. 상기 조성물은 버퍼 물질들과 선택적 염들 및 2-프로판올을 함유하는 수용액을 포함한다.

자기 미세 입자 코어들을 함유하는 아가로스 또는 셀룰로스 입자들을 포함하는 다른 자기 고상 물질들이 고농도의 염들 및 폴리알킬렌 글리콜(polyalkylene glycol)을 함유하는 조성물들로 처리시 핵산들을 결합하고 유지하는 것으로 보고되었다(예컨대, 미국특허번호 5,898,071 및 국제특허공개번호 WO02066993). 핵산은 그 후에 물이나 저이온 강도 버퍼로 처리함으로써 방출된다.

본 발명은 본 발명의 고상 핵산 결합 물질 및 시약을 사용하여 핵산을 분리하는 방법을 제공한다. 본 발명은 본 발명의 시약 조성물들을 사용하여 고상 물질들로부터 핵산을 결합하고 방출하는 방법도 제공한다.

본 발명은 알칼리성 아민 버퍼들 및 친수성 유기 용제들을 함유하고 선택적으로 염들을 함유하는 본 발명의 시약 조성물들에 의해 결합된 핵산을 방출함으로써 고상 핵산 결합 물질들을 이용하여 핵산을 분리하는 방법도 제공한다.

본 발명은 고상 물질들로부터 결합된 핵산을 방출하기 위한 시약 조성물들도 제공한다. 본 발명의 조성물들은 양이온성, 음이온성 또는 중성 표면들을 구비한 것들을 포함하여, 결합된 핵산들을 현 절단성 고상 물질들 및 기타 종래의 고상 물질들 양자 모두로부터 방출하거나 용리하는 기능을 한다.

(정의)

알킬(alkyl) - 본 명세서에서 8 개까지의 탄소를 함유하는 알킬기를 언급하는 H. Lower 알킬을 제외하고 하나 이상의 치환기들로 치환될 수 있는 1-20 개의 탄소를 함유하는, 분기된, 직선형(straight) 체인 또는 환식(cyclic) 탄화수소기.

아랄킬(aralkyl) - 아릴기로 치환된 알킬기.

아릴(aryl) - 1-5 개의 탄소 환식(carbocyclic) 방향족 링을 함유하고, 이는 H를 제외한 하나 이상의 치환기들로 치환될 수 있는 방향족 고리-포함기.

자기 입자 - 외부 자기장에 반응하는 입자, 미세 입자 또는 비드. 상기 입자는 그 자체로 자성, 상자성 또는 초상자성을 가질 수 있다. 강자성 물질을 사용할 때처럼 자기장이 가해지거나 외부 자석에 끌어 당겨질 수 있다. 입자들은 하나 이상의 비자기반응층으로 둘러싸인, 자기 반응성 고체 코어 부분을 가질 수 있다. 선택적으로, 상기 자기 반응성 부분은 비자기반응 코어 둘레의 층이거나, 비자기반응 코어 내에 증착된 입자들일 수 있다.

올리고머(oligomer), 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) - 본 명세서에서는 포스포디에스테르 인터뉴클레오티드 링키지(phosphodiester internucleotide linkage)와 5'-말단 단인산염기(5'-terminal monophosphate group)를 함유하는 화합물을 지칭한다. 상기 뉴클레오티드는 통상 발생하는 리보뉴클레오티드 A, C, G 및 U 또는 디옥시리보뉴클레오티드, dA, dC, dG 및 dT 일 수 있다.

폴리뉴클레오티드(polynucleotide) - 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 또는 PNA와 같은 합성 DNA 상사형(analog)일 수 있다. 이러한 임의의 세 유형의 체인들의 이중 가닥 혼성물(hybrid)도 본 용어의 범위 내에 속한다.

프라이머(primer) - 리게이션(ligation) 위치를 인도하는 올리고뉴클레오티드를 지칭하며, 리게이션 작용을 시작하도록 요구된다. 프라이머는 템플리트(template)에 안정적으로 혼성화(hybridize)하고 그 템플리트 내에서의 고유 서열(sequence)을 나타내기에 충분한 길이를 갖는다. 프라이머는 통상 길이에 15-30 염기(base)들을 가진다. 검출 가능한 표지들 또는 고상 포획을 가능하게 하는 표지들을 함유한 표지된 프라이머(labeled primer)들은 본 명세서에서 사용된 본 용어의 범위 내에 속한다.

방출하다(release), 용리하다(elute) - 용액이나 조성물과 접촉함으로써 고상 물질의 다공성들이나 표면에 결합된 물질의 실질적 부분을 제거하는 것을 지칭한다.

표본 - 핵산을 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 용액. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 대표적인 표본은 혈액(blood), 혈장(plasma), 혈청(serum), 소변(urine), 정액(semen), 체액(saliva), 세포 용해물(cell lysates), 조직 추출물(tissue extracts) 등을 포함한다. 다른 유형의 표본은 용매, 해수, 산업수 표본, 플랜트 물질, 원핵 생물로부터 발생한 세포, 진핵 생물, 박테리아, 플라스미드, 바이러스 및 토양이나 물과 같은 환경 표본 및 음식 표본을 포함한다.

고상 물질 - 핵산 분자들을 끌어 당길 수 있는 표면을 가진 물질. 물질들은 미세 입자(microparticles), 섬유상(fibers), 비드(beads), 멤브레인(membranes), 및 예컨대 테스트 튜브 및 마이크로웰(microwell)과 같은 기타 서포트(support)의 형태일 수 있다.

치환되다 - 비수소기에 의해 기(group)의 적어도 하나의 수소 원자를 교체하는 것을 지칭한다. 치환된 기와 관련하여, 그렇지 않았다면 명확히 지적되었을, 다양한 항목의 치환이 존재할 수 있도록 의도되었다는 것을 이해하여야 한다.

템플리트, 테스트 폴리튜클레오티드 및 타겟은 상호 교체 가능하게 사용되며, 그 길이가 복제될 핵산을 지칭한다.

핵산은 다양한 표본 유형으로부터 다양한 기법에 의해 추출되고 분리되며 그렇지 않다면 정제된다. 이러한 기법들 중 다수는 핵산에 다소 끌리는 물질의 표면에 대한 선택적인 흡착에 의존한다. 다른, 덜 강하게 결합된 성분들을 제거하는 세척 후에, 고상은 결합된 핵산(들)을 제거하거나 용리하기 위해 용액으로 처리된다. 본 발명자들은 고상 결합 물질들에 결합된 핵산을 용리하는 데 유용한 새로운 시약 조성물을 개발했다. 본 조성물이 유용한 고상 결합 물질들은 이하에서, 그리고 본 명세서에 참조로서 결합된, 본 발명자들의 함께 계류중인 미국특허출원번호 10/714,763 및 10/715,284에서 설명된 4급 및 3급 오늄(onium) 염 타입 물질들뿐만 아니라, 종래의 실리카계 물질들, 카르복시기, 아미노기 및 하이드록시기와 같은 기능화 실리카 담당(bearing) 공유 결합으로 부착된 표면 작용기들, 탄수화물(carbohydrate)계 물질들, 및 고분자 물질들을 포함한다.

본 발명의 조성물 및 방법과 함께 사용될 핵산 결합을 위한 고상 물질들은 입자, 미세 입자, 섬유상, 비드, 멤브레인, 및 테스트 튜브 및 마이크로웰과 같은 기타 서포트의 형태일 수 있다. 상기 물질들은 다양한 길이의 핵산 분자들의 포획 및 결합을 가능하게 하는 핵산 결합 표면을 더 포함한다. 표면이란 고상 물질의 외표면뿐만 아니라 고상 물질 내의 임의의 접근 가능한 기공 영역의 표면도 함께 나타낸다.

본 조성물은 중성 내지 알칼리 pH의 버퍼 수용액 군(family)을 포함한다. 일군은 7 내지 9의 pH를 가지며, 아민의 농도가 적어도 0.1 M, 바람직하게는 적어도 0.4 M, 더욱 바람직하게는 적어도 1 M 인 아민 버퍼의 수용액을 포함한다. 이 유형의 버퍼 용액들은 용리 효율을 달성하기 위해 버퍼 성분들에 의존하여, NaCl이나 KCl과 같은 기타 첨가 염들은 함유하지 않는다. 버퍼 성분들처럼 유용한 아민들은 지방족 아민(aliphatic amines), 지방족 아미노 알콜(aliphatic amino alcohols) 및 술폰화 지방족 아민(sulfonated aliphatic amines)을 포함한다. 대표적인 아민은 디에틸아민(diethylamine), 트리에틸아민(triethylamine), 이미다졸(imidazole), 아미노산(amino acids) (예컨대, 글리신(glycine), 글리실글리신(glycylglycine), N-(카바모일메틸)이미노디아세트산(N-(Carbamoylmethyl)iminodiacetic acid: ADA))을 포함한다.

대표적인 아미노 알콜 화합물은 트리스(히드록시메틸)아미노메탄(tris(hydroxymethyl)aminomethane: TRIS), 트리스(히드록시메틸)메틸아미노프로판(tris(hydroxy-methyl)methylaminopropane: Bis-TRIS) , 2-메틸-2-아미노-1-프로판올(2-methyl-2-amino-l-propanol: AMP), 2-아미노-2-메틸-1,3-프로판디올(2-amino-2-methy1-1,3-propanediol: AMPD), 에탄올아민(ethanolamine), 디에탄올아민(diethanolamine), 및 트리에탄올아민(triethanolamine)을 포함한다.

대표적인 술폰화 지방족 아민은 3-N-모폴리노프로판술폰산(3-N-morpholinopropanesulfonic acid: MOPS), 3-N-(트리스히드록시메틸)메틸아미노프로판술폰산(3-N-(trishydroxy-methyl)methylaminopropanesulfonic acid: TAPS), 3-N-(트리스히드록시메틸)메틸아미노-2-히드록시프로판술폰산(3-N-(tris-hydroxymethyl)methylamino-2-hydroxypropanesulfonic acid: TAPSO), N-2-히드록시에틸피페라진-N'-2-에탄술폰산(N-2-hydroxyethylpiperazine-N'-2-ethanesulfonic acid: HEPES), 1,4-피페라진비스(에탄술폰산)(1,4-piperazinebis(ethanesulfonic acid: PIPES), 4-모폴리노에탄술폰산(4-morpholinoethanesulfonic acid: MES), 2-(트리스-(히드록시메틸)메틸아미노)에탄술폰산(2-(tris-(hydroxymethyl)methylamino)ethanesulfonic acid: TES), N,N-비스(2-히드록시에틸)-2-아미노에탄-술폰산(N,N-bis(2-hydroxyethyl)-2-aminoethane-sulfonic acid: BES), N-씨클로헥실-2-아미노에탄-술폰산(N-cyclohexyl-2-aminoethane-sulfonic acid: CHES), 2-(카바모일메틸아미노)-에탄술폰산(2-(Carbam-oylmethylamino)-ethanesulfonic acid: ACES), N,N-비스(2-히드록시-에틸)글리신(N,N-bis(2-hydroxy-ethyl)glycine: bicine), 3-(씨클로헥실아미노)-1-프로판술폰산(3-(Cyclohexylamino)-1-propanesulfonic acid: CAPS), N-(2-히드록시에틸)피페라진-N'-(2-히드록시프로판술폰산)(N-(2-Hydroxy-ethyl)piperazine-N'-(2-hydroxypropanesulfonic acid): HEPPSO), 피페라진-N,N'-비스(2-히드록시프로판-술폰산)(Piperazine-N,N'-bis(2-hydroxypropane-sulfonic acid): POPSO), 및 N-트리스(히드록시메틸)-메틸글리신(N-tris(hydroxymethyl)-methylglycine: tricine)을 포함한다.

바람직한 조성물에서, 버퍼는 0.1-50 %의 친수성 유기 공용매(co-solvent)를, 더욱 바람직하게는 1-20 %의 용매를 더 포함한다. 친수성 유기 용매에 대한 언급은 물 또는 수성 용액에서의 용해도가 적어도 0.1 %, 바람직하게는 적어도 1 %, 더욱 바람직하게는 적어도 10 %인 유기 화합물을 포함하는 것을 의미한다. 대표적인 친수성 유기 공용매는 C₁-C₄ 알콜, 에틸렌 글리콜(ethylene glycol), 프로필렌 글리콜(propylene glycol), 글리세롤(glycerol), 수용성 메르캅탄(mercaptans), 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol), 디티오트레이톨(dithiothreitol), 퍼퓨릴 알콜(furfuryl alcohol), 2,2,2-트리플루오르에탄올(2,2,2-trifluoroethanol), 아세톤, THF, 및 p-디옥산(p-dioxane)을 포함한다. 바람직한 일실시예는 2-메르캅토에탄올(2-mercaptoethanol) 또는 디티오트레이톨(dithiothreitol)을 함유하는 조성물을 친수성 유기 공용매로 사용한다.

다른 기의 조성들은 7-9의 pH를 가지고 아민의 농도가 적어도 0.01 M인 아민 버퍼 수용액과, 0.1-3 M 농도의 적어도 하나의 1가 또는 2가 할라이드(halide) 염 또는 아세테이트 염을 포함한다. 대표적 염들은 NH4의 할라이드 및 아세테이트 염과 금속 Li, Na, K, Rb, Cs, Ca, Mg, 및 Zn를 포함한다. 바람직한 할라이드는 염화물이다. 버퍼와 염을 합한 농도는 적어도 0.1 M 이다. PCR 버퍼 20X 농도로 판매되는, 이 유형의 대표적인 버퍼는 0.4 M의 트리스-염산(tris-HCl), pH 8.4, 1 M의 KCl 및 0.05 M의 MgCl2를 함유한다. 이 조성물 그룹의 구성원들은 선택적으로 0.01-50 %의 친수성 유기 공용매를 더 포함할 수 있다. 대표적인 친수성 유기 공용매는 C₁-C₄ 알콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 수용성 메르캅탄, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 퍼퓨릴 알콜, 2,2,2-트리플루오르에탄올, 아세톤, THF, 및 p-디옥산을 포함한다. 바람직한 일실시예는 2-메르캅토에탄올 또는 디티오트레이톨을 함유한 조성물을 친수성 유기 공용매로 사용한다. 다른 바람직한 실시예에서, 친수성 유기 공용매의 양은 조성의 0.1-50 %이다. 더욱 바람직하게는 친수성 유기 공용매의 양은 용매의 1-20 %이다.

새로운 조성물의 이점은 용리된 핵산 용액을 핵산의 제1 침전 및 수집을 필요로 하지 않고 직접 많은 다운스트림 분자 생물학 공정들에 사용하는 능력이다. 표본로부터 핵산을 분리하거나 정제하는 공정의 일부로서 결합된 핵산을 용리하거나 방출하기 위해 상기 조성물을 사용하는 방법도 또한 본 발명의 또 다른 부분을 형성하며 이하에서 더욱 상세히 설명된다.

개시된 모든 조성물들은 핵산을 결합하기 위한 4급 오늄기를 가지는 고상 물질들로부터 결합된 핵산을 제거하는 데 효과적인 것으로 밝혀졌다. 그러한 고상 물질들을 사용하여 핵산을 분리하는 방법에 있어 이러한 조성물을 사용하는 것은 본 발명의 일 태양을 구성한다.

다른 공지 핵산 결합 서포트에 결합된 핵산도, 약 7-9의 pH를 가지며, 완충 성분이 적어도 0.1 M, 바람직하게는 적어도 0.4 M 농도로 존재하고, 선택적으로 친수성 유기 공용매가 0.1-50 % 함유된 완충 용액을 포함하는, 본 발명에 따른 새로운 시약 조성물에 접촉시킴으로써 이러한 고체 서포트로부터 방출될 수 있다는 것도 밝혀졌다.

본 발명의 일 실시 태양에 따른, 표본로부터 핵산을 분리하는 방법은:

a) 실리카, 유리, 불용성 합성 고분자 및 불용성 다당류 중에서 선택된 소지를 포함하는 고상을 제공하는 단계;

b) 상기 핵산을 상기 고상에 결합시키기 위해 핵산을 함유하는 상기 표본과 상기 고상을 화합(combine)시키는 단계;

c) 상기 표본을 상기 고상으로부터 분리하는 단계; 및

d) 상기 조성물을 7-9의 pH를 가지는 버퍼 수용액을 포함하는 시약 조성물과 접촉시킴으로써 상기 고상으로부터 상기 핵산을 방출하는 단계를 포함하고,

상기 버퍼의 농도는 적어도 0.1 M이고, 친수성 유기 고용매는 0.1-50 % 인 것을 특징으로 한다.

종래의 고상 물질들 중에서 본 용리 조성물들과 함께 사용할 수 있는 것들은 실리카 입자들, 멤브레인을 포함하는 실리카-코팅 표면들, 아민-기능화 및 카복시-기능화 실리카와 같은 표면 기능화를 가지는 실리카, 핵산 정제 분야에서 공지된 입자들 및 합성 고분자 비드들, 아가로스 또는 셀룰로오스 입자들, 및 아가로스 또는 셀룰로오스-코팅 실리카 입자들이다. 전술한 임의의 물질로 코팅된 자기 입자들은 유사하게 기능하며, 본 조성물들 및 방법들과 함께 사용될 수 있다.

본 발명에 다른 조성물들은 소지의 표면에 부착된 QR₂ ⁺X^- 또는 QR₃ ⁺X^- 식의 4급 오늄기를 가지는 고상 결합 물질들과 함께 특별한 실익을 제공하는데, 상기 4급 오늄기는 3급 술포늄(ternary sulfonium)기, 4급 암모늄, 및 포스포늄기 중에서 선택되고, R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기 중에서 선택되고, 그리고 X는 음이온이다. 바람직하게는, 상기 오늄기는 4급 포스포늄기 ⁺PR₃X^- 중에서 선택되는데, R은 상기 정의된 바와 같다.

본 발명의 또 다른 태양에 따른, 표본로부터 핵산을 분리하는 방법은:

a) 실리카, 유리, 불용성 합성 고분자, 및 불용성 다당류 중에서 선택된 소지, 그리고 식 QR₂ ⁺X^-을 가지며 여기서 R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택된 3급 술포늄기, 식 NR₃ ⁺X^-를 가지며 여기서 R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되는 4급 암모늄기, 및 식 PR₃ ⁺X^-를 가지며 여기서 R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기 중에서 선택되는 4급 포스포늄기 중에서 선택된 상기 소지의 표면에 부착된 오늄기를 포함하는 고상을 제공하는 단계를 포함하고, 여기서 X는 음이온이고;

b) 상기 핵산을 상기 고상에 결합하기 위해 상기 고상을 핵산을 함유한 표본과 화합시키는 단계;

c) 상기 표본을 상기 고상으로부터 분리하는 단계; 및

d) 상기 고상을 7-9의 pH, 0.1-3 M의 금속 할라이드 염 또는 아세테이트 염 및 0.1-50 %의 친수성 유기 공용매를 가지는 수용액을 포함하는 시약조성물과 접촉시킴으로써 상기 핵산을 상기 고상으로부터 방출하는 단계를 포함한다.

대표적 염들은 NH4의 할라이드 및 아세테이트 염들과 금속 Li, Na, K, Rb, Cs, Ca, Mg, 및 Zn를 포함한다. 바람직한 할라이드는 염화물이다.

대표적인 친수성 유기 공용매는 C₁-C₄ 알콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 수용성 메르캅탄, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 퍼퓨릴 알콜, 2,2,2-트리플루오르에탄올, 아세톤, THF, 및 p-디옥산을 포함한다. 바람직한 방법에서, 고상 위의 오늄기는 4급 포스포늄기 ⁺PR₃X^-로부터 선택되고, 여기서 R은 상기 정의된 바와 같다.

상기 함께 계류중인 미국출원번호 10/714,763 및 10/715,284에서 개시된 것처럼, 본 출원인들은 핵산을 결합하고 절단될 수 있는 절단성 링커(linker) 부위를 구비하여 결합된 핵산을 방출하는 고상 물질들을 개발했다. 이러한 절단성 고상 물질들도 링커기를 절단하지 않고 본 발명에 따른 조성물과의 접촉을 통해 거기에 결합된 핵산의 용리를 허용한다. 상기 물질들은 효율적 결합이 가능하도록 하기 위해 충분한 표면적을 가지는 미세 입자, 섬유상, 비드, 멤브레인 및 테스트 튜브 및 마이크로웰과 같은 기타 서포트의 형태일 수 있다. 미세 입자 형태의 본 발명에 따른 방법에 유용한 고상 물질들은 자기 코어 부위를 더 포함할 수 있다. 본 발명에서는 일반적으로 입자들 및 자기 반응성 미세 입자들이 바람직하다.

본 발명에 따른 방법에서 유용한 모든 고상 핵산 결합 물질들은 그 크기, 형상, 다공성률(porosity), 및 기계적 성질을 한정하는 소지와, 공유 결합으로 연결된 핵산 결합기들을 포함한다. 세 가지 가장 일반적인 소지 종류들은 실리카 또는 유리, 불용성 합성 고분자들, 및 불용성 다당류들이다. 고상은 자기 반응성 부위를 더 포함할 수 있다.

중합체들은 하나 이상의 에틸렌-불포화된(ethylenically unsaturated) 단량체 유닛들의 혼성 고분자(copolymer)나 호모폴리머(homopolymers)이고, 가교결합 또는 비가교결합 될 수 있다. 바람직한 고분자들은 폴리아크릴(polyacrylic)-타입 고분자들 및 폴리스티렌을 포함하는 폴리올레핀(polyolefin)들이다. 전자는 다양한 치환된 아크릴산(acrylic acid), 아미드 및 에스테르의 고분자들을 포함하는데, 상기 아크릴 단량체(acrylic monomer)는 2- 또는 3-탄소의 알킬 치환기들을 가질 수도 있고 가지지 않을 수도 있다.

본 발명에 따른 방법에서 유용한 절단성 및 비절단성 고상 결합 물질들에 함유된 핵산 결합기들은 다양한 길이 및 염기 조성이나 서열의 핵산, 폴리뉴클레오티드 및 올리고-뉴클레오티드를 끌어당겨 결합한다. 핵산 결합기들은 카르복실(carboxyl), 아민 및 3급 또는 4급 오늄기들을 포함한다. 아민기들은 NH2, 알킬아민(alkylamine) 및 디알킬아민(dialkylamine)기일 수 있다. 3급 또는 4급 오늄기들은 4급 트리알킬암모늄(trialkylammonium)기(-QR₃ ⁺), 트리알킬포스포늄(trialkylphosphonium)이나 트리아릴포스포늄(triarylphosphonium) 또는 혼합된 알킬 아릴 포스포늄기를 포함하는 포스포늄기(-QR₃ ⁺), 및 3급 술포늄기(-QR₂ ⁺)를 포함한다. 고상은 본 명세서에서 설명된 것처럼 하나 이상의 핵산 결합기를 함유할 수 있다. 3급 또는 4급 오늄기들 -QR₂ ⁺ 또는 -QR₃ ⁺을 함유하며, 여기서 R기는 적어도 네 개의 탄소의 알킬인 고상 물질들이 결합 핵산에서 특히 효과적이지만, 한 개의 탄소처럼 작은 탄소의 작은 알킬기들도 아릴기처럼 유용하다. 그러한 고상 물질들은 결합된 핵산을 단단하게 유지하며 종래 기술에서 공지된 용리에 사용된 대부분의 조건에서 핵산의 제거나 용리에 견뎌낸다. 대부분의 공지된 저이온강도 및 고이온강도 양자 모두의 용리 조건들은 결합된 핵산을 제거하지 못한다. DEAE 및 PEI기들을 함유하는 종래의 음이온-교환 수지와 달리, 3급 또는 4급 오늄 고상 물질들은 반응 배지(reaction medium)의 pH에 관계없이 양전하 대전 상태를 유지한다.

절단성 고상 물질들은 핵산을 끌어당겨 결합하는 핵산 결합 부위가 표면에 부착되는 실리카, 유리, 불용성 합성 고분자 및 불용성 다당류에서 선택된 소지를 포함하는 고체 서포트 부위를 포함하는데, 상기 핵산 결합 부위(nucleic acid binding portion: NAB)는 절단성 링커 부위에 의해 고체 서포트 부위에 연결된다.

일 실시예에서, NAB는 식 QR₂ ⁺X^-(여기서, Q는 S 원자)의 3급 오늄기 또는 식 QR₃ ⁺X^-(여기서, Q는 N 또는 P 원자)의 4급 오늄기인데, 여기서 R은 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되고, X는 음이온이다. Q가 질소 원자이면, R기는 각각 4-20 탄소 원자들을 함유한다. Q가 황 도는 인 원자이면, R기는 1-20 탄소 원자들을 가질 수 있다.

바람직한 절단성 고상은 Merrifield 수지(가교결합된)라고 불리는 종류와 같은 상업적으로 입수 가능한 폴리스티렌 타입 고분자들로부터 유도된다. 이러한 고분자들에서, 스티렌 유닛의 비율은 반응기(reactive group), 일반적으로 클로로메틸(chloromethyl) 또는 히드록시메틸(hydroxymethyl)기를 공유 결합 부착 방법으로 함유한다. 황화물(R₂S)이나 3급 아민 또는 포스핀(phosphine)과의 반응에 의해 몇몇 염소들을 교체함으로써 본 발명에 다른 고상 물질들을 생산된다. 이 정의에 따라 준비된 고분자는, 모든 반응성 클로로메틸기들이 3급 또는 4급 오늄기들로 변환되었을 때 아래 식 (1)에 의해 도시될 수 있다. 그러한 모든 기들이, 본 발명에 따른 고분자 고상들이 흔히 오늄기와 클로로메틸기의 혼합물을 함유하도록 변환될 필요는 없다.

상기 식에서, m, n 및 o는 고분자에서 각 단량체 유닛의 몰분율을 나타내며, m은 0.1 내지 100 %, n은 0 내지 99 %, 그리고 o는 0 내지 10 %의 값을 가질 수 있다. 더욱 바람직하게는, m은 1 내지 20 %, n은 80 내지 99 %, 그리고 o는 0 내지 10 %이다.

또 다른 실시예에서, 절단성 고상은 공유 결합 부착을 위한 반응성 클로로아세틸 또는 클로로프로피오닐(chloropropionyl)기를 함유하는 일정 비율의 스티렌 유닛을 가지는 상업적으로 입수 가능한 가교결합된 Merrifield 수지로부터 유도된다. 이러한 개시 고분자들로부터 준비되는 본 발명에 따른 3급 또는 4급 오늄 고분자들은 아래 식을 가진다:

여기서, Q, R, X, m, n, 및 o는 상기 정의된 바와 같다.

무수한 다른 공지된 고분자 수지들도 절단성 고상 물질들을 준비하는 데 고체 소지로 사용될 수 있다. 고분자 수지들은 Advanced ChemTech (Louisville, KY) 및 NovaBiochem과 같은 상업적 공급자들로부터 입수 가능하다. 상기 수지들은 일반적으로 반응성 작용기(reactive funtional group)를 가지는 가교결합된 고분자 입자에 기초한다. Advanced ChemTech 2002 Catalog, pp. 105-140에 설명된 것과 같은 고상 지지 펩타이드 합성에 사용되는 많은 적절한 고분자 수지들이 적당한 개시 물질들이다. 반응성 NH₂, NH-NH₂, OH, SH, CHO, COOH, CO₂CH=CH₂, NCO, Cl, Br, SO₂CH=CH₂, SO₂Cl, SO₂NH₂, 아실이미다졸(acylimidazole), 옥심(C=N-OH) , 숙신이미드 에스테르(succinimide ester)기들을 가지는 고분자들은 본 발명에 따른 고분자 고상들의 준비에 사용되기 위해 각각 상업적으로 입수 가능하다. 이하의 무수한 실시예들에서 보는 것처럼, 전구체 고분자 수지를 3급 도는 4급 오늄기에 공유 결합으로 결합시키는 수단을 제공하는 것이 때로는 필수적이고 바람직하다. 이것은 일반적으로 알킬렌(alkylene), 아릴렌(arylene) 또는 아랄킬렌(aralkylene)기들에서 선택된 1-20 원자들의 체인이나 링 기를 포함한다. 상기 체인이나 링은 또한 0, S, 또는 N 원자들 및 케톤, 에스테르, 티오에스테르(thioesters), 아미드, 우레탄, 탄산염(carbonates), 크산토겐산염(xanthates), 요소(ureas), 이민(imines), 옥심(oximes), 술폭시드(sulfoxides) 및 티오케톤(thioketones) 형태의 카보닐(carbonyl)기들도 함유할 수 있다.

본 명세서에 사용된 것처럼, 자기 미세 입자들은 자기장에 의해 끌어 당겨지고 조작될 수 있는 입자들이다. 본 발명에 다른 방법에서 사용되는 자기 미세 입자들은 자기 금속 산화물 코어를 포함하는데, 이는 일반적으로, 선택된 결합 화학을 통해 핵산 결합층이 공유적으로 결합되고, 따라서 미세 입자들의 표면을 3급 술포늄(sulfonium), 4급 암모늄 또는 4급 포스포늄 작용기들로 코팅하는 흡착 또는 공유적 결합층으로 둘러싸여 있다. 상기 자기 금속 산화물 코어는 바람직하게는 산화철인데, 여기서 철은 Fe² ⁺ 및 Fe³ ⁺의 혼합물이다. 전술한 바와 같이, 실란막(silane coat)이 없이 산화철 코어를 포함하는 자기 미세 입자들도 본 발명에 따른 방법에 사용될 수 있다. 자기 입자들은, 자기 반응성 금속 입자들을 포착하기 위해 다공성 고분자의 존재 하에서 금속 입자들을 침전시킴으로써 미국특허번호 4,654,267에 설명된 것과 같이 형성될 수도 있다. 바람직한 자기 금속 산화물은 따라서 Fe₃O₄, MnFe₂O₄, NiFe₂O₄, 및 CoFe₂O₄를 포함한다. 다른 자기 입자들도 자기 반응성 금속 입자들을 포착하기 위해 올리고당 덱스트란(oligosaccharide dextran)의 존재 하에서 금속 산화물 입자들을 침전시킴으로써 미국특허번호 5,411,730에 설명된 바와 같이 형성될 수 있다. 그러나 또 다른 종류의 자기 입자가 상기 미국특허번호 5,091,206에 개시되었다. 상기 입자는 상자성 금속 산화물 입자층 및 상기 금속 산화물 층을 보호하고 반응성 코팅을 제공하기 위해 추가 고분자 층으로 코팅된 고분자 코어 입자를 포함한다. 염화메틸화된(chloromethylated) Merrifield 수지를 함유하는 마그네타이트를 준비하는 것이 간행물(Tetrahedron Lett., 40 (1999), 8137-8140)에서 설명되었다.

상업적으로 입수 가능한 자기 실리카 또는 자기 고분자 입자들이 본 발명에 따른 절단성 자기 입자들을 준비하는 데 있어 개시 물질로 사용될 수 있다. 표면 카르복시기들을 가지는 적절한 유형의 고분자 입자들이 상표명 SeraMag^TM(Seradyn) 및 BioMag^TM(Polysciences and Bangs Laboratories)으로 알려져 있다. 적당한 유형의 실리카 자기 입자들이 상표명 MagneSil^TM(Promega)으로 알려져 있다. 표면에 카복시 또는 아미노기들을 가지는 실리카 자기 입자들이 Chemicell GmbH (Berlin)로부터 입수 가능하다.

절단성 링커 부위는 바람직하게는 곧은 체인들, 분기된 체인들 및 링들로부터 선택된 유기기(organic group)이고 1-100 원자들을 포함하며, 더욱 바람직하게는 1 내지 약 50 원자들을 포함한다. 상기 원자들은 바람직하게는 C, H, B, N, O, S, Si, P, 할로겐 및 알칼리 금속들로부터 선택된다. 대표적인 링커기는 가수분해에 의해 쪼개지는 가수분해 절단기이다. 술포네이트 에스테르(sulfonate esters)처럼, 카르복실릭 에스테르(carboxylic esters) 및 무수물(anhydrides), 티오에스테르(thioesters), 탄산염 에스테르(carbonate esters), 티오카보네이트 에스테르(thiocarbonate esters), 우레탄, 이미드, 술폰아미드(sulfonamides), 및 술폰이미드(sulfonimides)가 대표적이다. 또 다른 대표적인 종류의 링커기들은 환원 절단되는 기들이다. 대표적인 한 기는 에탄티올(ethanethiol), 메르캅토에탄올(mercaptoethanol), 및 DTT와 같은 티올에 의해 절단되는 이황화 결합(S-S)을 함유하는 유기기이다. 또 다른 대표적인 기는 과산화물 결합(O-O)을 함유하는 유기기이다. 과산화물 결합(peroxide bond)들은 티올, 아민 및 포스핀에 의해 절단될 수 있다.

많은 상기 상세 구조 도면들이 편의상 4급 오늄기만을 나타내고 있지만, 유사한 3급 술포늄기도 마찬가지로 나타내려는 의도라는 것을 이해하여야 한다.

대표적인 광화학 절단성 링커(photochemicalIy cleavable linker)기들은 하기 식의 니트로-치환 방향족 에테르 및 에스테르를 포함한다.

여기서, R_d는 H, 알킬 또는 페닐이며, 더욱 상세하게는

오르토-니트로벤질 에스테르(ortho-nitrobenzyl esters)는 공지된 반응에 따른 자외선 광에 의해 절단된다

대표적인 효소 절단성 링커(enzymatically cleavable linker)기는 에스테라아제(esterases)와 가수분해 효소(hydrolases)에 의해 절단되는 에스테르, 프로테아제(proteases) 및 펩티다아제(peptidases)에 의해 절단되는 아미드 및 펩티드, 글리코시다아제(glycosidases)에 의해 절단되는 글리코시드(glycoside)기를 포함한다.

절단성 1,2-디옥스에탄(1,2-dioxetane) 모이어티(moiety)를 포함하는 링커기를 가지는 고상 물질들도 본 발명의 핵산 결합 물질의 범위에 속한다. 그러한 물질들은 화학제나 효소제에 의해 단편(fragment)으로 유발될 수 있는 디옥스에탄 모이어티를 함유한다. 산소 음이온을 발생시키기 위한 보호기의 제거는 디옥스에탄 링의 분해를 촉진한다. 공지의 과정을 통해 C-C 결합뿐 아니라 과산화 O-O 결합이 절단됨으로써 분열이 발생한다.

선택적으로, 연결된 오늄기는 아릴기 Ar이나 절단기 Y에 부착될 수 있다. 또 다른 선택으로, 고상 및 3급 또는 4급 오늄기에 대한 링키지는 나타낸 방위로부터 역으로 될 수도 있다.

전술한 대표적 반응들에서, 기 A는 알킬(alkyl), 씨클로알킬(cycloalkyl), 폴리씨클로알킬(polycycloalkyl), 폴리씨클로알케닐(polycycloalkenyl), 아릴(aryl), 아릴옥시(aryloxy) 및 알콕시(alkoxy)기들로부터 선택된 치환기를 안정제시키는 것을 나타낸다. Ar은 아릴 링 기를 나타낸다. 바람직한 아릴 링 기들은 페닐 및 나프틸(naphthyl)기들이다. 아릴 링은 추가 치환기들, 특히 할로겐, 알콕시 및 아민기들을 함유할 수 있다. Y기는 화학제나 효소에 의해 제거될 수 있는 기나 원자이다. 적당한 OY기는 OH, OSiR³ ₃, 카르복시기, 인산염, 황산염, 및 글리코시드기를 포함하며, 상기 R3는 알킬 및 아릴기들에서 선택된다. 수많은 유발 가능한 디옥스에탄 구조들이 본 기술 분야에서 널리 공지되어 있고, 많은 특허들의 주제가 되어 왔다. 대표적인 절단성 디옥스에탄 링커 및 그 절단이 이하에 도시된다.

보호기 Y의 제거는 디옥스에탄 링의 분열을 유발하고, 따라서 고체 소지와 오늄기들을 분리한다. 알칼리 반응 조건에서 결과적인 아릴 에스테르는 나아가 가수분해된다.

불안정 1,2-디옥스에탄 모이어티로 변환될 수 있는 전자-풍부 C-C 이중 결합을 포함하는 링커기를 가지는 고상 물질들은 또 다른 기의 절단성 핵산 결합 물질이다. 이중 결합의 치환기들 중 적어도 하나(A')는 O, S 또는 N 원자에 의해 이중 결합에 부착된다. 전자-풍부 이중 결합의 일중항(singlet) 산소와의 반응은 상온에서 자발적으로 분열하여 두 개의 카보닐 단편을 생성하는 불안정 1,2-디옥스에탄 링 기를 생성한다.

절단성 링커 기를 가지는 또 다른 기의 고상 물질들은 국제공개번호 WO 03/053934에 개시된 것처럼 절단성 모이어티로 케텐 디티오아세탈(ketene dithioacetal)을 가진다. 케텐 디티오아세탈들은 과산화효소와 과산화수소로 효소 산화시킴으로써 산화 절단(oxidative cleavage)된다.

절단성 모이어티는 도시된 구조를 가지며, 아크리단(acridan) 링에 치환을 한 상사형을 포함하는데, R_a, R_b 및 R_c는 각각, C, N, 0, S, P, Si 및 할로겐 원자들로부터 선택된 1 내지 약 50 비수소 원자들을 함유하는 유기기들이고, R_a와 R_b는 함께 결합하여 링을 형성한다.

케텐 디티오아세탈 절단성 링커기를 가지는 고상 물질들은 하기 임의의 구조식을 가질 수 있다.

또한, 절단성 링커에 대한 고체 소지와 오늄기들의 순서가 도시된 것들과 반대로 되는 유사 구조들도 가질 수 있다.

절단성 링커기를 가지는 또 다른 기의 고상 물질들은 절단성 모이어티로 트리알킬(trialkyl)이나 트리아릴포스포늄(triarylphosphonium)기에 결합된 적어도 하나의 탄소 원자의 알킬렌(alkylene)기를 가진다.

이 기의 물질들은 케톤이나 알데히드와의 Wittig 반응에 의해 절단될 수 있다. 3급 포스포늄 화합물이 유기 용매에서 강염기와 반응하면 인에 결합된 탄소 원자에서 양자가 이탈되고 인 일리드(phosphorus ylide)가 생성된다. 일리드가 케톤이나 알데히트와 같은 화합물을 함유하는 카보닐과 반응하면 이중 결합 및 포스핀 산화물이 형성된다. 포스포늄기와 고상간의 연결은 상기 과정에서 끊어진다.

본 발명의 또 다른 태양은 절단성 고상 결합 물질들을 사용하여 핵산을 분리하고 정제하는 방법을 포함한다. 일 실시예에서는:

a) 실리카, 유리, 불용성 합성 고분자, 및 불용성 다당류로부터 선택된 소지를 포함하는 고체 서포트 부위,

핵산을 끌어당겨 결합하는 핵산 결합 부위,

및 절단성 링커 부위를 포함하는 고상을 제공하는 단계;

b) 핵산을 고상에 결합하기 위해 상기 고상을 핵산을 함유하는 표본과 결합하는 단계;

c) 상기 표본을 고상으로부터 분리하는 단계;

d) 선택적으로, 상기 절단성 링커를 절단하는 단계; 및

e) 상기 고상을 7-9의 pH, 0.1-3 M의 금속 할라이드 염 또는 아세테이트 염, 그리고 0.1-50 %의 친수성 유기 공용매를 가지는 수용액을 포함하는 시약 조성물과 접촉시킴으로써 상기 핵산을 상기 고상으로부터 방출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 표본로부터 핵산을 분리하는 방법이 제공된다.

절단성 링커를 가지는 고상의 바람직한 일 실시예에서, 핵산 결합 부위는 소지의 표면에 부착된 QR₂ ⁺X^- 또는 QR₃ ⁺X^- 식의 4급 오늄기인데, 상기 4급 오늄기는 3급 설포늄기, 4급 암모늄, 및 포스포늄기에서 선택되며, 상기 R은 C₁-C_2O 알킬, 아랄킬 및 아릴기에서 선택되고, 상기 X는 음이온이다.

고상으로부터 표본을 분리하는 단계는 예컨대 여과, 중력 집진, 경사 분리(decantation), 자기 분리, 원심 분리, 진공 흡인, 필터 매트나 다공성 멤브레인을 통해 액체를 밀어내는 것과 같은 공기 또는 기타 가스의 과압(overpressure)에 의해 수행될 수 있다. 핵산을 제외한 표본 성분들이 이 단계에서 제거된다. 다른 성분들의 제거가 완전하지 않은 정도까지는 완전한 제거를 돕기 위해 추가 세척이 실시될 수 있다.

절단성 링커를 절단하는 단계는 절단성 링커 부위의 공유 결합을 깨뜨리되 핵산은 파괴하지 않을 정도의 충분한 시간 동안 그에 결합된 핵산을 가지는 고상을 절단제(cleaving agent)로 처리하는 것을 포함한다. 절단제의 선택은 절단성 링커의 성질에 따라 결정된다. 절단성 링커가 가수 분해 절단기라면, 절단제는 물이나 저알콜 또는 그 혼합물이다. 절단제는 바람직하게는 물에 첨가되면 pH를 상승시키는 염기를 함유한다.

절단성 링커가 이황화기나 과산화기와 같은 환원 절단기라면 절단제는 티올, 아민 및 포스핀 중에서 선택된 환원제이다. 대표적인 환원제는 에탄티올(ethanethiol), 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 트리알킬아민 및 트리페닐포스핀(triphenylphosphine)을 포함한다.

광화학적 절단 링커기들은 절단제로 빛의 사용을 필요로 하며, 일반적으로는 자외선 영역이나 가시 영역의 빛의 사용을 필요로 한다.

전술한 효소적 절단 링커기들은 에스테라아제, 가수 분해 효소, 프로테아제, 펩티다아제, 과산화 효소 및 글리코시다아제 중에서 선택된 효소들에 의해 절단된다.

절단성 링커기가 유발 가능한 디옥스에탄이면, 절단제는 전술한 바와 같이 유발 OY기에서 O-Y 결합을 절단하도록 작용한다. O-Y 결합의 절단은 디옥스에탄 링 기를 불안정하게 만들어 C-C 및 O-O 결합을 파열시킴으로써 디옥스에탄 링을 두 부위로 분열시킨다. 유발제는 유기 또는 무기 염기, 불화물 이온, 효소, 에스테르 가수 분해를 위한 화학제, 및 과산화수소를 포함한다.

절단성 링커가 적어도 하나의 O, S, 또는 N 원자로 치환된 전자-풍부 C-C 이중결합이면, 절단제는 일중항 산소이다. 이중 결합 기가 일중항 산소와 반응하면 상온 이상에서 자발적으로 분열되는 불안정한 1,2-디옥스에탄기가 생성된다. 일중항 산소는 일중항 산소화 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 트리페닐포스파이트 오조나이드(triphenylphosphite ozonide)나 안트라센 엔도페록시드(anthracene endoperoxides)의 열분해에 의해, 또는 염료 증감화(dye-sensitization)에 의해 생성될 수 있다.

절단성 링커가 전술한 바와 같이 케텐 디티오아세탈이라면, 절단제는 과산화 효소(peroxidase enzyme) 및 과산화수소이다.

절단성 링커가 케톤이나 알데하이드와의 Wittig 반응에 의해 절단될 때, 일리드를 형성하기 위한 바람직한 염기는 알콕시드 염(alkoxide salt)과 수소화물 염(hydride salt), 특히 알칼리 금속 염이다. 일리드와의 반응을 위한 바람직한 카보닐 화합물은 지방족 및 방향족 알데히드와 지방족 및 방향족 케톤이다. 아세톤이 가장 바람직하다. 바람직한 용매는 반응물을 용해시킬 수 있고 THF, 디에틸 에테르, p-디옥산, DMF 및 DMSO를 포함하는 염기를 소비하지 않는 비양자성 유기 용매이다.

특히 놀라운 것은 절단성 링커로 트리알킬 또는 트리아릴포스포늄기 중 어느 하나(즉, 케톤이나 알데히드와의 Wittig 반응에 의해 절단이 이루어지는 곳의 고체 서포트)에 결합된 혹은 트리알킬암모늄기에 결합된 적어도 하나의 탄소 원자의 알킬렌기를 가지는 본 발명에 따른 고체 서포트에 결합된 핵산은 본 발명에 따른 새로운 시약 조성물들과 접촉함으로써 핵산을 방출하도록 만들어질 수 있다는 발견이었다. 결합된 핵산은 예컨대,

탈이온 물 H2O

1 M 인산염 버퍼, pH 6.7

0.1 % 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate)

0.1 % 소듐 도데실 포스페이트(sodium dodecyl phosphate)

3 M 포타슘 아세테이트(potassium acetate), pH 5.5

TE(트리스 EDTA) 버퍼

50 mM 트리스, pH 8.5 + 1.25 M NaCl

0.3 M NaOH + 1 M NaCl

1 M NaOH 또는

1 M NaOH + 1 M H₂O₂

와 같은 결합된 핵산을 용리하기 위해 본 발명 분야에서 공지된 수많은 다른 시약들 및 조성물들과 접촉해도 이러한 고상 결합 물질들로부터 제거되지 않기 때문에 이 결과는 기대하지 않은 것이었다.

본 발명의 방법에서 절단 후에 고상으로부터 핵산을 방출하는 단계는 방출된 핵산을 용해하고 충분히 보존하는 용액으로 용리하는 단계를 포함한다. 상기 용액은 7-9의 pH, 0.1-3 M 금속 할라이드 또는 아세테이트 염 및 0.1-50 %의 친수성 유기 공용매를 가지는 버퍼 수용액을 포함하는 시약 조성물이다. 선택적으로 상기 용액은 약 7-9의 pH를 가지며, 버퍼 성분이 적어도 0.1 M의 농도로 존재하고, 0.1-50 %의 친수성 유기 공용매를 더 포함하는 버퍼 용액을 포함할 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 친수성 유기 용매는 약 1-20 % 포함한다. 금속 할라이드 염은 알칼리 금속 염, 알칼리토 염을 포함한다. 바람직한 염은 아세트산 나트륨(sodium acetate), NaCl, KCl, 및 MgCl₂이다. 친수성 유기 공용매는 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 2-프로판올, t-부탄올, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 퍼퓨릴 알콜, 2,2,2-트리플루오르에탄올, 아세톤, THF 및 p-디옥산을 포함한다. 포착된 핵산을 방출하는 단계는 절단 단계 이후 또는 동시에 이루어질 수 있다. 후자의 경우에는 절단제가 용리 용액으로서도 기능할 수 있다.

절단 반응 및 방출(용리) 단계들은 각각 실온에서 수행될 수 있지만, 물의 어는점과 끓는점 사이의 임의의 온도가 사용될 수 있다. 용리 온도가 본 핵산 분리 방법의 성공 여부에 결정적인 것으로 나타나지는 않았다. 상온이 바람직하지만, 물의 어는점과 끓는점 사이의 임의의 온도가 사용될 수 있다. 온도를 올리면 몇몇 경우에서 용리 속도가 증가하거나 염이나 친수성 유기 공용매를 더 적은 양 함유하는 조성물의 이용이 가능할 수 있다. 상기 방출 또는 용리 단계는 한번 실시될 수도 있고, 필요하다면 방출된 핵산의 양을 증가시키기 위해 한번 이상 반복될 수도 있다.

절단 반응 및 용리 단계들은 각 단계를 수행하기 위해 별도의 그리고 구분된 용액들을 사용하여 순차적 단계들로 실시될 수 있다. 선택적으로, 절단 및 용리 단계들은 동일 단계에서 함께 실시될 수도 있다. 절단 반응 조건들이 용리된 핵산의 다운스트림 사용과 양립될 수 있는 시약을 이용한다면 후자의 동시 실시 방법이 바람직하다. 예들은 적당한 알칼리성 반응 버퍼와 심지어 수산화 나트륨의 강한 알칼리 용액을 사용하는 절단 반응들이다. 절단 반응을 위한 시약이나 용매의 존재가 핵산과 양립될 수 없거나 바람직하지 않은 경우에는 전자의 순차적 방법이 바람직할 수 있다. 이 경우의 예가 Wittig 방출 화학이다. 절단 반응 조건이 용액 속으로 DNA를 실질적으로 방출하지 않으면 절단 및 용리를 위한 별도 용액을 사용이 가능해진다.

상기 방법은, 고상으로부터 표본의 다른 성분들을 제거하기 위해 그에 결합된 핵산을 포획한 고상을 세척 용액으로 세척하는 단계를 더 포함한다. 이러한 바람직하지 않은 물질들은 효소, 기타 타입의 단백질, 다당류, 예컨대 지방질 및 효소 억제제와 같은 저분자량의 물질들을 포함한다. 상기 방법에 의해 본 발명의 고상에 포획된 핵산은 표지된 또는 표지되지 않은 상보 핵산에 혼성하기 위한 혼성화 반응에서 포획된 형태로 사용될 수 있다. 혼성화 반응은 포획된 핵산의 존재나 양을 검출하기 위한 지단 테스트에서 유용하다. 혼성화 반응은 고상 핵산 증폭 공정에서도 유용하다.

용리 조성물은 유리하게도, 미리 용매를 증발시키거나 핵산을 침전시킬 필요 없이 용리된 핵산을 후속하는 다운스트림 공정에서 직접 사용할 수 있도록 한다.

핵산을 용리하기 위해 전술한 바와 같이 본 발명의 시약 조성을 사용할 때, 용리 온도가 본 핵산 분리 방법의 성공 여부에 결정적인 것으로 나타나지는 않았다. 상온이 바람직하지만, 물의 어는점과 끓는점 사이의 임의의 온도가 사용될 수 있다. 온도를 상승시키면 몇몇 경우에 용리 속도가 증가할 수 있다. 또한, 다양한 핵산들이 다양한 수단으로 용리된다는 것을 이해해야 한다.

( 다운스트림 사용)

이러한 시약 조성물의 중요한 이점은 많은 다운스트림 분자 생물학 공정들과 양립한다는 것이다. 전술한 바와 같이 시약 조성물로 용리된 핵산은 많은 경우에 후속 공정에서 직접 사용될 수 있다. PCR, 미국특허번호 5,998,175에서 설명된 Ligation of Multiple Oligomers (LMO), 및 LCR과 같은 증폭 반응들이 그러한 핵산 용리액을 사용할 수 있다. 종래의 기법으로, 특히 박테리아 세포 배양이나 혈액 표본로부터 분리된 핵산은 침전 단계를 사용한다. 핵산을 침전시키기 위해 저분자량 알콜이 수용액으로부터 높은 부피 비율로 첨가된다. 침전된 물질들은 사용 전에 분리, 수집되고 적당한 매질에 재용해되어야 한다. 이러한 단계들은 전술한 시약 조성을 사용하여 본 발명의 고상 결합 물질들로부터 핵산을 용리시킴으로써 달성될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라 핵산이 분리될 수 있는 표본들은 하나 이상의 핵산과, 선택적으로 다른 물질들을 함유하는 수용액을 포함한다. 대표적인 예는 핵산, 증폭 반응 산물, 및 서열화 반응 산물(sequencing reaction products)을 포함한다. 박테리아 배양물, 체액, 혈액 및 혈액 성분, 조직 추출물, 플랜트 물질, 및 환경 표본로부터 얻어진 물질들을 사용 전에 수용액, 바람직하게는 버퍼 용액에 마찬가지로 위치시킨다.

고상 핵산 포획 방법은 수많은 용도에 적용될 수 있다. 아래의 특정 예들에서 보여지는 것처럼, 단일 가닥 및 이중 가닥의 핵산이 포획되고 방출될 수 있다. DNA, RNA, 및 PNA가 포획되고 방출될 수 있다. 첫 번째 용도는 박테리아 배양물로부터 플라스미드 DNA를 정제할 때 나타난다. 플라스미드 DNA는 특정 유전자나 유전자 단편을 함유하는 재조합 DNA의 조각을 복제를 위한 숙주로 이송하는 클로닝 벡터(cloning vector)로 사용된다.

두 번째 용도는 증복 반응으로부터 증폭 산물을 정제할 때 나타난다. 이러한 반응들은 LMO나 PCR과 같이 교호하는 고온과 저온 사이에서 열순환되거나, 또는 핵산 예컨대 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA)과 같이 단일 온도에서 수행될 수 있다. 상기 반응들은 DNA 리가아제(ligases), RNA 폴리머라아제(polymerases) 및/또는 역전사효소(reverse transcriptases)를 포함하는 다양한 증폭 시약 및 효소들을 사용할 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하여 정제될 수 있는 폴리뉴클레오티드 증폭 반응 혼합물들은: 복수 올리고머의 결찰(ligation of multiple oligomers: LMO) , 자립 서열 복사(self-sustained sequence replication: 3SR), 가닥-전치 증폭(strand-displacement amplification: SDA) , "분기 체인" DNA 증폭, 리가아제 체인 반응(ligase chain reaction: LCR), QB 리플리카아제 증폭(QB replicase amplification: QBR), 결찰 활성화 전사(ligation activated transcription: LAT), 핵산 서열-기반 증폭(nucleic acid sequence-based amplification: NASBA), 교정 체인 반응(repair chain reaction: RCR) , 순환 탐침 반응(cycling probe reaction: CPR), 및 회전환 증폭(rolling circle amplification: RCA)을 포함한다.

세 번째 용도는 서열화 반응 세정(sequencing reaction cleanup)에 있다. 디디옥시 종결 서열화 반응(dideoxy terminated sequencing reaction)은 dTNP들과 네 개의 반응 혼합물들마다 하나의 ddNTP의 혼합물로 프라이머를 연장함으로써 귀결되는 폴리뉴클레오티드의 래더(ladder)를 생산한다. 각각에서의 ddNTP는 일반적으로 서로 다른 형광 염료(fluorescent dye)로 표지된다. 반응 혼합물들은 과잉 dNTP들 및 표지된 ddNTP, 폴리머라아제 효소 및 ATP와 같은 보조인자들을 함유한다. 후자 물질들은 서열 분석 전에 제거하는 것이 바람직하다.

네 번째 용도는 전체 혈액으로부터 DNA를 분리할 때 나타난다. DNA는 통상 사용되는 기법으로 백혈구로부터 추출된다. 혈액은 일반적으로 적혈구를 선택적으로 용해(lyse)하도록 처리되고 침전 또는 원심분리 단계 후에, 손상 받지 않은 백혈구들은 별도로 용해되어 핵산 함량을 드러낸다. 단백질들은 소화되고 얻어진 DNA는 고상과 분리되고 그 후 서열 다형성의 측정, 서열 분석, RFLP 분석, 돌연변이 검출 또는 다른 타입의 진단 분석(diagnostic assay)을 위해 사용된다.

다섯 번째 용도는 DNA와 RNA의 혼합물로부터 DNA를 분리할 때 나타난다. 강한 알칼리 용리 조건, 특히 높은 온도 조건을 포함하는 본 발명의 방법은 DNA를 손상되지 않도록 할 때 RNA를 감성(degrade)하거나 파괴할 수 있다. 강한 알칼리 절단 반응을 포함하는 방법들도 유사하게 작용한다.

추가적인 용도들은 기타 표본들 - 토양, 플랜트, 박테리아, 및 폐수로부터 핵산 물질을 추출하는 것과 핵산을 기록 목적으로 장시간 보관하는 것을 포함한다.

따라서 본 발명의 또 다른 태양은 고상 결합 물질들을 사용하여 핵산을 분리하고 정제하는 방법을 포함한다. 일 실시예에 따르면:

a) 실리카, 유리, 불용성 합성 고분자들, 및 불용성 다당류들로부터 선택된 소지를 포함하는 고체 서포트 부위,

핵산을 끌어당겨 결합하는 핵산 결합 부위를 포함하는 고상을 제공하는 단계;

b) 상기 핵산을 상기 고상에 결합하기 위해 핵산을 함유하는 표본과 고상을 화합시키는 단계;

c) 상기 고상으로부터 상기 표본을 분리하는 단계;

d) 상기 고상을 7-9의 pH를 가지는 버퍼 수용액을 포함하는 시약 조성물과 접촉시킴으로써 상기 핵산을 상기 고상으로부터 용액으로 방출하는 단계를 포함하고, 버퍼의 농도는 적어도 0.1 M이고, 친수성 유기 공용매는 0.1-50 %이고; 그리고

e) 상기 방출된 핵산을 함유하는 용액을 다운스트림 공정에서 직접 사용하는 단계를 포함하는, 표본로부터 핵산을 분리하는 방법이 제공된다.

상기 방출된 핵산을 함유하는 용액을 핵산 증폭 반응에서 직접 사용하고 그로써 폴리머라아제 또는 리가아제-중재 반응을 이용하여 핵산이나 핵산 조각의 양이 증폭되는 것이 바람직하다.

하기 실시예들에 첨부된 구조도들은 고상 물질들의 절단성 링커 부위만을 도해한다. 첨부된 구조도들이 고상 물질을 완전히 정의하는 것은 아니다.

예 1. 트리부틸포스포늄기를 함유하는 폴리스티렌 고분자의 합성.

가교결합된 클로로메틸화 폴리스티렌인 Merrifield 펩티드 수지(Sigma, 1.1 meq/g, 20.0 g)를 아르곤 패드 하의 CH₂C1₂/DMF (50/50) 200 mL 내에서 교반했다. 과잉 트리부틸포스핀(48.1 g, 10 당량)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 7일간 교반했다. 슬러리를 여과했고 결과 고체를 CH₂Cl₂ 200 mL로 2회 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(21.5 g). 기본 분석 : 검출 P 2.52 %, Cl 3.08 %; 예상 P 2.79 %, Cl 3.19 %: P/Cl 비율은 0.94.

예 2. 트리옥틸포스포늄( trioctylphosphonium )기를 함유하는 폴리스티렌 고분자의 합성.

Merrifield 펩티드 수지(Sigma, 1.1 meq/g, 20.0 g)를 아르곤 패드 하의 CH₂C1₂/DMF (50/50) 200 mL 내에서 교반했다. 과잉 트리옥틸포스핀(92.4 g, 10 당량)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 7일간 교반했다. 슬러리를 여과했고 결과 고체 를 CH₂Cl₂ 200 mL로 3회 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(21.3 g). 기본 분석 : 검출 P 2.28 %, Cl 2.77 %; 예상 P 2.77 %, Cl 2.42 %: P/Cl 비율은 0.94.

예 3. 트리메틸포스포늄( trimethylphosphonium )기를 함유하는 폴리스티렌 고분자의 합성.

Merrifield 펩티드 수지(ICN Biomedical, 1.6 meq/g, 5.0 g)를 아르곤 패드 하의 CH₂C1₂ 50 mL 내에서 교반했다. THF 내 1.0 M 트리메틸 포스핀 용액(Aldrich, 12 mL)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 7일간 교반했다. 추가 CH₂Cl₂ 100 mL와 THF 내 1.0 M 트리메틸포스핀 용액 1.2 mL를 첨가하고 슬러리를 3일간 교반했다. 슬러리를 여과했고 결과 고체를 CH₂Cl₂ 125 mL와 뒤이어 메탄올 375 mL로 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(5 g). 사용 전에 수지를 미세 분말로 분쇄했다.

예 4. 트리페닐포스포늄( triphenylphosphonium )기를 함유하는 폴리스티렌 고분자의 합성.

Merrifield 펩티드 수지(ICN Biomedical, 1.6 meq/g, 5.0 g)를 아르곤 패드 하의 CH₂C1₂ 40 mL 내에서 교반했다. 트리페닐 포스핀(Aldrich, 3.2 g)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 5일간 교반했다. 슬러리를 여과했고 결과 고체를 순차적으로 CH₂Cl₂, MeOH, 및 CH₂Cl₂로 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(5.4 g).

예 5. 트리부틸암모늄(tributylammonium)기를 함유하는 폴리스티렌 고분자의 합성.

Merrifield 펩티드 수지(Aldrich, 1.43 meq/g, 25.1 g)를 아르곤 패드 하의 CH₂C1₂ 150 mL 내에서 교반했다. 과잉 트리부틸 아민(25.6 g, 4 당량)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 8일간 교반했다. 슬러리를 여과했고 결과 고체를 CH₂Cl₂ 250 mL로 2회 세척했다. 수지를 진공 하에서 건조시켰다(28.9 g). 기본 분석 : 검출 N 1.18 %, Cl 3.40 %; 예상 N 1.58 %, Cl 4.01 %: N/Cl 비율은 0.88.

예 6. 2-( 트리부틸포스포늄 ) 아세틸기를 함유하는 폴리스티렌 고분자의 합성.

아르곤 패드 하의 CH₂Cl₂ 50 mL 내의 트리부틸 포스핀 용액(4.1 g, 2 당량)에 클로로아세틸 폴리스티렌 비드(Advanced Chemtech, 3.0 g, 3.4 meq/g)를 첨가했다. 슬러리를 1주일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 결과 고체를 순차적으로 CH₂Cl₂ (4 x 25 mL) , MeOH (2 x 25 mL) , 및 아세톤(4 x 25 mL)으로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다.

예 7. 폴리비닐벤질 트리부틸포스포늄( polyvinylbenzyl tributylphosphonium )기를 함유하는 고분자 층을 가지는 자기 입자의 합성.

유리 비알(vial) 내의 CH₂Cl₂ 2mL에 자기 Merrifield 펩티드 수지(Chemicell, SiMag Chloromethyl, 100 mg)를 첨가했다. 트리부틸포스핀(80μL)를 첨가하고 슬러리를 실온에서 3일간 흔들어 섞었다. 자석을 비알의 아래에 배치하고 상층액(supernatant)을 피펫으로 제거했다. 고체를 CH₂Cl₂ 2mL로 4회 세척했다(세척액(washes)도 자석/피펫 절차로 제거했다). 수지를 공기 건조시켰다(93 mg).

예 8- Br . 트리부틸포스포늄기와 브롬화물( bromide ) 음이온을 함유하는 폴리메타크릴레이트 ( polymethacrylate ) 고분자의 합성.

폴리메타크릴산(polymethacrylic acid) 수지를 SOCl₂ 35 mL로 4시간 동안 환류시켜 산 염화물(acid chloride)을 형성했다. 폴리메타크릴로일 염화물(polymethacryloyl chloride) 수지(4.8 g) 및 트리에틸아민(11.1 g)을 아르곤 하의 얼음물 욕조 내의 CH₂Cl₂ 100 mL 내에서 교반했다. 3-브로모프로판올(3-Bromopropanol)(9.0 g)을 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 밤새 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 40 mL로 3회 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(8.7 g).

수지(8.5 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 100 mL에서 교반했다. 트리부틸 포스핀(16.2 g)을 첨가하고 슬러리를 7일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 100 mL로 3회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(5.0 g).

예 8- Cl . 트리부틸포스포늄기와 염화물 음이온을 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자의 합성.

폴리메타크릴로일 염화물(polymethacryloyl chloride) 수지(12.2 g) 및 트리에틸아민(23.2 g)을 아르곤 하의 얼음물 욕조 내의 CH₂Cl₂ 100 mL 내에서 교반했다. 3-클로로프로판올(3-Chloropropanol)(12.8 g)을 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 밤새 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 100 mL로 3회 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(12.8 g).

수지(12.8 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 100 mL에서 교반했다. 트리부틸 포스핀(27.8 g)을 첨가하고 슬러리를 7일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 2 x 100 mL와 MeOH 2 x 100 mL로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(9.8 g).

예 8-S. 트리부틸포스포늄기 와 알킬티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타 크릴레이트 고분자의 합성.

폴리메타크릴로일 염화물 수지(3.6 g) 및 트리에틸아민(8.9 g)을 아르곤 하의 얼음물 욕조 내의 CH₂Cl₂ 20 mL에서 교반했다. CH₂Cl₂ 20 mL에서 희석된 3-메르캅토-l-프로판올(5.8 g)을 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 밤새 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂, 물 및 메탄올로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(3.5 g).

수지(4.3 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 건조 아세토니트릴(acetonitrile) 100 mL에서 교반했다. 카본 테트라브로마이드(14.9 g) 및 트리페닐 포스핀(11.8 g) 을 첨가했다. 혼합물을 5시간 동안 환류시켰다. 슬러리를 여과하고 수지를 아세토니트릴 125 mL, MeOH 250 mL, 및 CH₂Cl₂ 250 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(4.2 g).

수지(4.2 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 40 mL에서 교반했다. 트리부틸 포스핀(6.7 g)을 첨가하고 슬러리를 8일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 90 mL와 뒤이어 MeOH 50 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(4.0 g).

예 9. 트리부틸포스포늄기와 에스테르 링키지를 함유하는 폴리비닐벤질 고분자의 합성.

폴리스티렌 히드록시메틸 아크릴레이트(polystyrene hydroxymethyl acrylate) 수지(5.0 g)를 아르곤 하 얼음물 욕조 내의 아세토니트릴 50 mL에서 교반했다. 트리부틸 포스핀(2.1 g) 및 4.0 M 염산(2.5 mL)을 아르곤 하에서 15 분간 교반했다. 이 용액을 똑같이 네 부분으로 나누어 수지 슬러리에 1 시간에 걸쳐 첨가하였다. 얼음물 욕조를 제거하고 슬러리를 실온에서 3 시간 동안 교반했다. 수지를 여과하고 아세토니트릴 50 mL와 뒤이어 두 개의 CH₂Cl₂ 50 mL 부분으로 세척했 다. 그 후 수지를 공기 건조 했다(6.24 g).

예 10. 트리부틸포스포늄기와 에스테르 링키지를 함유하는 폴리비닐벤질 고분자의 합성.

히드로메틸화 폴리스티렌(hydroxymethylated polystyrene)(Aldrich, 2.0 meq/g, 5.0 g) 및 트리에틸아민(2.3 g)을 아르곤 하의 얼음물 욕조 내의 CH₂Cl₂ 100 mL에서 교반했다. 클로로아세틸 염화물(1.9 g)을 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 밤새 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 40 mL로 3회 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(5.8 g).

수지(5.8 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 100 mL에서 교반했다. 트리부틸 포스핀(3.2 g)을 첨가하고 슬러리를 7 일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 100 mL로 2회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(5.9 g).

예 11. 트리부틸포스포늄기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자의 합성.

폴리메타크릴로일 염화물 수지(2.7 g) 및 트리에틸아민(8.6 g)을 아르곤 하의 얼음물 욕조 내의 CH₂Cl₂ 25 mL에서 교반했다. CH₂Cl₂ 20 mL에서 희석된 2-메르캅토벤질 알콜(5.0 g)을 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 2 일 동안 교반했다. 슬러리를 CH₂Cl₂ 50 mL로 희석하고 10 분간 6000 rpm으로 원심분리했다. 상층액은 제거했다. 수지를 MeOH 100 mL로 3회 세척했다(각 세척은 10 분간 6000 rpm에서 원심분리하였다). 마지막 세척 후에 수지를 여과하고 공기 건조시켰다(4.2 g).

수지(3.4 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 건조 아세토니트릴 100 mL에서 교반했다. 카본 테트라브로마이드(10.2 g) 및 트리페닐 포스핀(8.0 g)을 첨가했다. 혼합물을 4시간 동안 환류시켰다. 슬러리를 여과하고 수지를 아세토니트릴 125 mL, MeOH 250 mL, 및 CH₂Cl₂ 250 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(2.8 g).

수지(2.8 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 40 mL에서 교반했다. 트리부틸 포스핀(4.0 g)을 첨가하고 슬러리를 8일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 50 mL와 뒤이어 MeOH 125 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(2.7 g).

예 12. 트리메틸포스포늄기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자의 합성.

폴리메타크릴로일 염화물 수지(5.1 g) 및 트리에틸아민(12.3 g)을 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 100 mL에서 교반했다. 2-메르캅토벤질 알콜(9.3 g)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 5 일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 300 mL, 물 500 mL 및 MeOH 200 mL로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(5.8 g).

수지(4.8 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 건조 아세토니트릴 100 mL에서 교반했다. 카본 테트라브로마이드(14.3 g) 및 트리페닐 포스핀(11.3 g)을 첨가했다. 혼합물을 4시간 동안 환류시켰다. 슬러리를 여과하고 수지를 아세토니트릴 100 mL, CH₂Cl₂ 200 mL, MeOH 200 mL 및 CH₂Cl₂ 200 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(4.8 g).

수지(1.04 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 30 mL에서 교반했다. THF 내 1.0 M 트리메틸 포스핀 용액(7.3 mL)을 첨가하고 슬러리를 10일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 100 mL, THF 100 mL, MeOH 50 mL 및 CH₂Cl₂ 100 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(1.1 g).

예 13. 트리옥틸포스포늄(trioctylphosphonium)기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자의 합성.

수지(1.68 g)를 재현탁하고 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 30 mL에서 교반했다. 트리옥틸(trioctyl) 포시핀(4.4 g)을 첨가하고 슬러리를 10일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 100 mL, THF 100 mL, MeOH 50 mL 및 CH₂Cl₂ 100 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(1.67 g).

예 14. 폴리메타크릴레이트 링커로 기능화되고 트리부틸포스포늄기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 자기 실리카 입자의 합성.

자기 카르복시산-기능화 실리카(magnetic carboxylic acid-functionalized silica) 입자들(Chemicell, SiMAG-TCL, 1.0 meq/g, 0.6 g)을 티오닐 클로라이드(thionyl chloride) 6 mL에 넣고 3 시간 동안 환류시켰다. 감압 하에 과잉 티오닐 클로라이드를 제거했다. 수지를 아르곤 하의 얼음물 욕조의 CH₂Cl₂ 40 mL에서 재현탁했다. 트리에틸아민(1.2 g)을 첨가했다. 2-메르캅토벤질 알콜(0.7 g)을 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 밤새 흔들어 섞었다. 슬러리를 여과하고 수지를 5000 rpm에서 10 분간 MeOH 35 mL로 2회 원심분리했다. 상층액들은 제거했다. 치자색(orange-yellow) 수지를 공기 건조시켰다(335 mg).

수지(335 mg)를 아르곤 하의 건조 아세토니트릴 45 mL에서 재현탁했다. 카본 테트라브로마이드(2.0 g) 및 트리페닐포스핀(1.6 g)을 첨가했다. 혼합물을 3 시간 동안 환류시켰다. 수지를 5000 rpm에서 10 분간 원심분리하고 상층액은 제거했다. 수지를 5000 rpm에서 10 분간 아세토니트릴 50 mL로 두 차례 원심분리하고 상층액은 제거했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(328 mg).

수지(328 mg)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 40 mL에서 재현탁했다. 트리부틸포스핀(280 mg)을 첨가하고 슬러리를 10 일 동안 흔들어 섞었다. 플라스크의 외부에 자석을 배치함으로써 자기 수지를 가라앉히고 상층액은 옮겨 따랐다. 수지를 CH₂Cl₂ 30 mL로 3회 세척했고, 뒤이어 MeOH 25 mL로 3회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(328 mg).

예 15. 트리부틸포스포늄기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 자기 고분자 메타크릴레이트 입자들의 합성.

절단성 자기 입자들을 형성하기 위해 Sera-Mag™ Magnetic Carboxylate Microparticles(Seradyn)를 사용하였다. Sera-Mag 입자들은 독점 고분자들로 캡슐화된 마그네타이트 코팅으로 싸여진 폴리스티렌-아크릴산(polystyrene-acrylic acid) 고분자 코어를 포함한다. 카르복시산염 기(carboxylate group)들은 표면에서 접근 가능하다. 입자들(0.52 meq/g, 0.50 g)을 물 15 mL와 0.1 M MES 버퍼(pH 4.0) 25 mL에서 현탁했다. EDC(1-[3-(디메틸아미노)프로필]-3-에틸 카르보디이미드 히드로클로라이드) 126 mg 및 2-메르캅토벤질 알콜 110 mg을 첨가하기 전에 반응 혼합물을 5 분간 고주파 분해(sonicate)했다. 반응 혼합물을 7 일 동안 흔들어 섞었다. 반응 혼합물을 여과했다. 수지를 물 50 mL와 MeOH 100 mL로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(0.53 g).

수지(0.53 g)를 아르곤 하의 건조 아세토니트릴 20 mL에서 재현탁했다. 카본 테트라브로마이드(174 mg) 및 트리페닐 포스핀(138 mg)을 첨가했다. 혼합물을 65 ℃에서 5 시간 동안 고주파 분해했다. 반응 혼합물을 대형 자석 위에 두고 상층액을 옮겨 따랐다. 수지를 아세토니트릴로 4회 세척하고, 자석으로 침전시킨 후 세척액을 제거했다. 수지를 MeOH에 재현탁하고 밤새 흔들어 섞었다. 수지를 MeOH로 4회 세척하고, 자석으로 침전시킨 후 세척액을 제거했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(0.52 g).

수지(0.52 g)를 아세토니트릴 10 mL에서 재현탁했다. 트리부틸포스핀(106 mg)을 첨가하고 7 일 동안 흔들어 섞었다. 자석으로 자기 수지를 침전시키고 상층액은 옮겨 따랐다. 수지를 아세토니트릴로 4회, MeOH로 4회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(0.51 g).

예 16. 트리부틸포스포늄기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자의 합성.

폴리메타크릴로일 염화물 수지(0.6 g) 및 트리에틸아민(1.5 g)을 아르곤 하의 얼음물 욕조 내의 CH₂Cl₂ 30 mL에서 교반했다. CH₂Cl₂ 20 mL에 희석된 4-메르캅토벤질 알콜(1.0 g)을 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 2 일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 CH₂Cl₂ 50 mL, 물 100 mL, MeOH 50 mL, 및 CH₂Cl₂ 25 mL로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(0.7 g).

수지(0.6 g)를 아르곤 하의 건조 아세토니트릴 20 mL에서 재현탁하고 교반했 다. 카본 테트라브로마이드(1.8 g) 및 트리페닐포스핀(1.4 g)을 첨가했다. 혼합물을 3 시간 동안 환류시켰다. 슬러리를 여과하고 수지를 아세토니트릴, MeOH, 및 CH₂Cl₂로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(0.6 g).

수지(0.6 g)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 15 mL에 재현탁하고 교반했다. 트리부틸포스핀(0.85 g)을 첨가하고 슬러리를 6 일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 75 mL와 뒤이어 MeOH 150 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(0.6 g).

예 17. 트리부틸포스포늄기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자의 합성.

폴리메타크릴로일 염화물 수지(0.71 g) 및 트리에틸아민(2.2 g)을 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 100 mL에서 교반했다. 4-히드록시페닐 4-브로모티오부티레이트(4-hydroxyphenyl 4-bromothiobutyrate)(2.55 g)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 5 일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 CH₂Cl₂ 및 헥산(hexanes)으로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(0.85 g).

수지(0.85 g)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 20 mL에서 재현탁하고 교반했다. 트리부 틸포스핀(2.7 g)을 첨가하고 슬러리를 3 일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂와 헥산으로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다.

예 18. 트리부틸포스포늄기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자의 합성.

폴리메타크릴로일 염화물 수지(1.0 g) 및 피리딘(pyridine)(1.9 mL)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 20 mL에서 교반했다. 1,4-벤젠 디티올(1.85 g)을 첨가하고 슬러리를 실온에서 밤새 교반했다. 슬러리를 여과하고 CH₂Cl₂와 헥산으로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(1.08 g).

수지(1.08 g)와 트리에틸아민(3.0 mL)을 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 20 mL에서 교반했다. 4-브로모부티릴 염화물(4-bromobutyryl chloride)(1.8 mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 2 일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 CH₂Cl₂로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(1.10 g).

수지(1.10 g)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 30 mL에서 재현탁하고 교반했다. 트리부틸포스핀(4.0 g)을 첨가하고 슬러리를 5 일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(1.0 g).

예 19. 트리부틸포스포늄기를 함유하는 가교결합된 폴리스티렌 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트(succinate) 혼성 고분자의 합성.

가교결합된 폴리스티렌 폴리에틸렌 글리콜 숙시네이트 혼성 고분자인 TentaGel S COOH 비드(Advanced Chemtech, 3.0 g)를 염화 티오닐 30 mL에서 90 분간 환류시켰다. 감압 하에서 잔류 염화 티오닐을 제거하였다. 수지를 클로로포름 30 mL에서 재현탁하고 재농축하였다.

수지와 트리에틸아민(0.14 g)을 아르곤 하의 얼음물 욕조 내의 CH₂Cl₂ 60 mL에서 교반했다. 2-메르캅토벤질 알콜(0.11 g)을 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 2 일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂, 물, MeOH 및 CH₂Cl₂에서 세척했다. 수지를 여과하고 공기 건조시켰다(2.9 g).

수지(2.8 g)를 아르곤 하의 건조 아세토니트릴 60 mL에서 재현탁하고 교반했다. 카본 테트라브로마이드(0.36 g)와 트리페닐포스핀(0.29 g)을 첨가했다. 혼합물을 4 시간 동안 환류시켰다. 슬러리를 여과하고 수지를 아세토니트릴, MeOH, 및 CH₂Cl₂로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(2.8 g).

수지(2.7 g)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 50 mL에서 재현탁하고 교반했다. 트리부틸포스핀(0.21 g)을 첨가하고 슬러리를 6 일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지 를 CH₂Cl₂ 50 mL와 뒤이어 MeOH 175 mL로 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(2.8 g).

예 20. 숙시네이트-연결 트리부틸포스포늄기와 티오에스테르 링키지를 함유하는 제어 다공성 유리 비드의 합성.

Millipore LCAA 유리(1.0 g, 38.5 μmole/gram)을 건조 피리딘 10 mL에서 현탁했다. 숙신 무수 화합물(succinic anhydride)(40 mg)을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 4 일간 흔들어 섞었다. 반응 혼합물을 MeOH 20 mL로 희석하고 혼합물을 여과했다. 고체를 MeOH 20 mL로 5회, CH₂Cl₂ 20 mL로 5회 세척했다. 고체를 공기 건조시켰다(1.0 g).

고체(0.50 g)를 건조 CH₂Cl₂ 10 mL에서 현탁했다. 디씨클로헥실카보디이미드(dicyclohexylcarbodiimide)(10 mg)와 2-메르캅토벤질 알콜을 첨가하고 반응 혼합물을 실온에서 6 일간 흔들어 섞었다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂로 희석하고 혼합물을 여과했다. 고체를 MeOH로 3회, CH₂Cl₂로 3회 세척했다. 고체를 공기 건조시켰다(0.50 g).

고체(400 mg)를 아르곤 하의 건조 아세토니트릴 10 mL에서 재현탁했다. 카본 테트라브로마이드(14 mg)와 트리페닐포스핀(11 mg)을 첨가했다. 혼합물을 3 시간 동안 환류시켰다. 혼합물을 여과하고 고체를 MeOH 50 mL에서 5회, CH₂Cl₂ 50 mL에서 5회 세척했다. 고체를 공기 건조시켰다(360 mg).

고체(300 mg)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 10 mL에서 재현탁했다. 트리부틸포스핀(5 drops)을 첨가하고 반응 혼합물을 5 일간 흔들어 섞었다. 반응 혼합물을 CH₂Cl₂로 희석하고 여과했다. 고체를 CH₂Cl₂ 50 mL에서 5회 세척하고 공기 건조시켰다(300 mg).

예 21. 아크리디늄 에스테르( acridinium ester) 기를 함유하는 폴리비닐벤질 고분자의 합성.

아크리딘(acridine) 9-카르복시산 염화물(1.25 g)과 트리에틸아민(1.3 g)을 아르곤 하의 얼음물 욕조 내의 CH₂Cl₂ 40 mL에서 교반했다. 히드록시티오페놀(hydroxythiophenol) 수지(Polymer Laboratories, 1.67 meq/g, 3.0 g)를 첨가하고 얼음물 욕조를 제거했다. 슬러리를 실온에서 밤새 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 200 mL로 3회 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(4.4 g).

수지(4.3 g)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 40 mL에서 교반했다. 메틸 트리플레이트(methyl triflate)(6.1 g)를 첨가하고 반응 혼합물을 2 일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 200 mL와 MeOH 1 L로 세척했다. 수지를 진공 건조시켰다(4.7 g).

예 22. 아크리단 케텐 디티오아세탈( acridan ketene dithioacetal) 기를 함유하는 폴리비닐벤질 고분자의 합성.

N-페닐 아크리단(N-phenyl acridan)(0.62 g)을 아르곤 하 -78 ℃의 무수(anhydrous) THF 20 mL에서 교반했다. 부틸 리튬(헥산 내 2.5 M, 0.93 mL)을 첨가하고 반응 혼합물을 -78 ℃에서 2 시간 동안 교반했다. 이황화 탄소(0.16 mL)를 첨가하고 반응 혼합물을 -78 ℃에서 1 시간 동안 교반했다. 반응 혼합물을 실온으로 가열했다. Merrifield 펩티드 수지(1.6 meq/g, 1.0 g)를 첨가하고 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 혼합물을 여과했다. 수지를 아세톤 10 mL로 5회, 물 10 mL로 3회, 그리고 아세톤 10 mL로 2회 세척했다. 수지를 공기 건조시켰다(1.21 g).

수지(1.21 g)와 NaH(기름 내 60%, 0.003 g)를 아르곤 하 무수 DMF 20 mL에서 4 시간 동안 교반했다. 1,3-디브로모프로판(1,3-dibromopropane)(0.07 mL)을 첨가하고 혼합물을 3 일간 교반했다. 혼합물을 여과했다. 수지를 아세톤 10 mL로 3회, 물 10 mL로 5회, 그리고 아세톤 10 mL로 5회 세척했다. 수지를 공기 건조시켰 다(1.22 g).

수지(1.22 g)를 아르곤 하의 DMF 20 mL에 재현탁하고 교반했다. 트리부틸포스핀(1.18 g)을 첨가하고 슬러리를 7일 동안 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 CH₂Cl₂ 20 mL로 4회, 그리고 아세톤 20 mL로 4회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켰다(1.07 g).

예 23. 가수 분해 절단성 입자들로부터 DNA를 결합하고 용리하는 일반적 절차

10 mg의 비드 표본을 튜브 내에서 THF 500 μL로 세정했다. 내용물을 원심분리하고 액체를 제거했다. 물 200 μL로 세정 과정을 반복했다. 물 200 μL 내의 선형화(linearized) pUC18 DNA 2 μg의 용액을 비드에 첨가하고 혼합물을 20 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운(spin down)하고 상층액을 모았다. 비드를 물 2 x 200 μL로 세정하고 물을 버렸다. 비드를 aq. NaOH 200 μL로 37 ℃에서 5 분간 배양함으로써 DNA를 용리했다. 혼합물을 스핀다운하고 분석을 위해 용리액을 제거했다.

예 24. 형광 분석 시험 프로토콜(f luorescent assay protocol )

DNA를 착색하기 위해 PicoGreen^TM을 사용하여 형광 분석 시험으로 상층액과 용리액의 DNA 함량을 분석했다. 간단히 말해서, DNA를 함유하거나 함유하는 것으로 의심되는 용액의 분취액(aliquot) 10 μL를 형광 DNA "개시(starting)" 용액 190 μL로 배양했다. 형광 착색제는 0.1 M 트리스(tris), pH 7.5, 1 mM EDTA 내의 1:400 희석된 PicoGreen(Molecular Probes)이었다. 적어도 5 분간 표본을 배양한 후 마이크로플레이트(microplate) 형광 측정기(Fluoroskan, Labsystems)로 형광성을 측정했다. 필터 세트는 480 nm 및 535 nm 였다. 알려진 양의 동일 DNA를 함유하는 포지티브 제어와 네거티브 제어가 동시에 이루어졌다.

예 25. 폭넓은 pH 범위에 걸쳐 효과적인 포획을 보여주는 다양한 pH 용액으로부터의 예 11의 비드에 대한 DNA의 결합.

4.5에서 9.0까지 pH 범위가 미치는 버퍼를 준비했다. 4.5 내지 6.5의 pH 를 가지는 버퍼는 10 mM 아세테이트 버퍼였다. 7.0 내지 9.0의 pH를 가지는 버퍼는 10 mM 트리스 아세테이트 버퍼였다. 예 11의 절단성 비드 10 mg에 각 버퍼 200 μL 내의 선형화 pUC18 DNA 2 μg의 용액을 실온에서 30-45 초 동안 첨가했다. 각 버퍼 속에 DNA가 없는 네거티브 제어 용액들을 동시에 흘려넣었다. 비드 표본들을 스핀다운 한 후 상층액을 제거하고 UV 및 형광법(fluorescence)으로 분석했다.

버퍼 pH 결합 % (UV) 결합 % (형광법)

4.5 56 73

5.0 64 68

5.5 58 64

6.0 61 71

6.5 57 74

7.0 49 61

7.5 44 60

8.0 45 55

8.5 37 39

9.0 31 33

별도로, pH 8.0에서 20 mg의 비드를 사용하여 5 분간 결합하면 DNA가 100 % 포획되는 것으로 나타났다.

예 26. LMO 증폭에서 예 11의 절단성 비드로부터 용리된 DNA의 사용.

앞서 400 μL의 THF와 뒤이어 물로 2회 세척된 10 mg의 비드에 200 μL의 물 속에 0.1 또는 1 μg의 pUC18 DNA를 함유하는 용액을 첨가했다. 30 분간 배양한 후 표본 튜브를 30 초간 스핀다운하고 상층액을 모았다. 비드를 2 x 400 μL의 물로 세척하고 세척액을 버렸다. 상기 비드를 실온에서 15 분간 1 M NaOH 100 μL로 세척하고 30 초간 스핀한 후 용리액을 모음으로써 DNA를 용리했다. 각 용리액의 80 μL 부분을 1 M 아세트산 40 μL로 중화했다.

본 발명의 고분자 비드를 사용하여 분리된 플라스미드 DNA는 DNA 침전 없이 용리액을 직접 사용하여 미국특허번호 5,998,175에 설명된 것처럼 LMO에 의해 증폭되었다. 간단히 말해서, 68 염기 영역에 뻗치는 한 세트의 옥타머(octamer)와 한 쌍의 프라이머를 사용하여 열순환 프로토콜에 의해 68 bp 영역이 증폭되었다. 옥타머-5'-인산염 (가닥당 여섯개) 12개 세트, 프라이머 및 템플리트(1 μL)가 Ampligase 버퍼에 용해되었다. 반응 튜브에 50 μL의 석유를 씌우고 94 ℃에서 5 분간 가열되었다. 약 2 분 후에 100 U의 Ampligase를 각 튜브에 첨가했다. 표본들을 94 ℃에서 30 초간; 55 ℃에서 30 초간; 35 ℃에서 30 초간 35회 순환시켰다. 증폭 반응의 겔 전기영동(gel electrophoresis)은 예상 분자량의 밴드(band)를 보여주었다.

예 27. 예 9의 고분자 비드에 대한 DNA의 결합.

100 mg의 비드 표본을 튜브 내에서 1 mL의 THF로 세정했다. 내용물을 원심분리하고 액체를 제거했다. 1 mL의 물로 세정 과정을 2회 반복했다. 1 mL의 물 속의 80 μg pUC18 DNA 용액을 비드에 첨가하고 혼합물을 20 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운하고 UV 분석을 위해 상층액을 모았다. 상층액은 66 μg의 DNA를 함유하고 있었다. 따라서 결합 용량(binding capacity)은 0.14 μg/mg인 것으로 측정되었다.

예 28. 예 11의 절단성 비드로부터 RNA의 결합과 방출.

두 개의 튜브에서, 2 μg의 Luciferase RNA를 10 mg의 비드에 결합시켰다. 용리를 위해 1x 역전사 효소 버퍼(50 mM 트리스-HCl, pH 8.5, 8 mM MgCl₂, 30 mM KCl, 1 mM DTT (0.015%))를 사용했다. 한 튜브는 94 ℃에서 5 분간 가열되었고 다른 한 튜브는 94 ℃에서 30 분간 가열되었다. 용리액과 컨트롤(control)이 1 % 아가로스 겔에서 흘렀고 SYBR Green^TM으로 착색되었다. 5 분의 가열은 비드로부터 ~50% RNA 용리를 보여주었지만 30 분의 가열은 RNA를 변성시키는 것으로 생각되었다.

예 29. 다양한 절단/용리 버퍼로 예 11의 절단성 비드로부터의 RNA의 결합과 방출.

세 개의 튜브에서, 1 μg의 Luciferase RNA를 10 mg의 비드에 결합시켰다. 한 튜브에서는, RNA를 용리하기 위해 실온에서 30 분간 3M 포타슘 아세테이트를 사용하였다. 다른 하나의 튜브에서는, 용리를 위해 94 ℃에서 1 분간 1x 역전사 효소(RT)를 사용하였다. 세 번째 튜브는 RNA 추출 버퍼를 가졌으며 94 ℃로 1 분간 가열되었다. RNA 추출 버퍼는 10 mM 트리스-HCl, pH 8.8, 0.14 M NaCl, 1.5 M MgCl₂, 0.5% NP-40, 1 mM DTT로 구성되어 있다. 모든 용리액과 컨트롤이 1% 아가로스 겔에서 흘렀고 SYBR Green^TM으로 착색되었다. 3M 포타슘 아세테이트는 식별 가능한 RNA를 생산하지 않았다. 1x 역전사 버퍼 및 RNA 추출 버퍼는 모두 약 50%의 용리에 상당하는 RNA를 함유하는 것으로 추정되는 밴드를 보여주었다.

예 30. 예 11의 절단성 비드로부터의 RNA의 결합과 방출, 그리고 화학발광 블롯 시험분석( chemiluminescent blot assay )에 의한 검출.

네 개의 튜브에서, 1 μg의 Luciferase RNA를 10 mg의 비드에 결합시켰다. 두 개의 튜브는 용리를 위해 1x 역전사 버퍼를 사용했고 다른 두 개는 RNA 추출 버퍼를 사용했다. 각 버퍼 종류 중 한 튜브는 94 ℃로 1 분간 가열되었다. 다른 두 개의 튜브는 94 ℃로 5 분간 가열되었다. 모든 용리액과 컨트롤이 1% 아가로스 겔에서 흘렀고 SYBR Green으로 착색되었다. 1 분 가열된 용리액은 어느 버퍼를 사용하든 5 분간 가열된 것에 비해 더욱 많은 RMA를 함유하고 있었다. RNA 추출 버퍼는 1x RT 버퍼보다 더 많은 RNA를 용리했다. RNA는 밤새 모세관 이송에 의해 나일론 멤브레인으로 옮겨졌다. RNA는 그 후 밤새 HF-1 비오틴 표지 프라이머(biotin labeled primer)와 혼성화되었다. 안티-비오틴(anti-biotin) HRP와 Lumigen PS-3를 광화학 기질(substrate)로 하여 검출을 실시했다. 5 분 노출로 겔 결과가 입증되었다.

예 31. 다양한 온도에서 예 11의 절단성 비드로부터의 RNA의 결합과 방출

여섯 개의 튜브에서, 1 μg의 Luciferase RNA를 10 mg의 비드에 결합시켰다. RNA를 용리하기 위해 몇 가지 다른 온도들, 즉 40 ℃, 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃, 및 90 ℃에서 5 분간 RNA 추출 버퍼를 사용했다. 모든 용리액과 컨트롤이 1% 아가로스 겔에서 흘렀고 SYBR Green으로 착색되었다. 모든 온도들이 100 % 용리하는 것으로 나타났다.

예 32. 예 1의 트리부틸포스포늄 비드에 의한 선형화 pUC18 DNA의 결합과 다양한 용리 조성물에 의한 방출.

10 mg의 비드 표본을 튜브에서 500 μL의 THF로 세정했다. 내용물을 원심분리하고 액체를 제거했다. 200 μL의 물로 세정 과정을 반복했다. 200 μL의 물 내의 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 비드에 첨가하고 혼합물을 20 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운하고 상층액을 모았다. 비드를 2 x 200 μL의 물로 세정하고 물은 버렸다. 실온에서 20 분간 아래 표에 설명된 200 μL의 다양한 시약 조성물로 비드를 배양함으로써 DNA를 용리했다. 예 24에 설명된 것과 같이 형광 분석을 위해 혼합물을 스핀다운하고 용리액을 제거했다.

버퍼 염 유기 용매 용리 %

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % 퍼퓨릴 알콜 58

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % 피콜(ficoll) 19

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % HOCH₂CH₂SH 52

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % DTT 52

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % 글리세롤 15

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % 2-프로판올 50

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % 에탄올 37

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % CF₃CH₂OH 38

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % 아세톤 42

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % THF 41

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 15 % p-디옥산 33

예 33. 예 32의 결합 및 방출 프로토콜은 아래 표에 설명된 시약 조성물로 이어진다. DTT나 2-메르캅토에탄올 중 어느 것의 농도 변화의 효과가 조사되었다.

버퍼 염 유기 용매 용리 %

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 0.1 % DTT 0

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 1 % DTT 0

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 3 % DTT 36

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 4 % DTT 41

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 0.1 % HOCH₂CH₂SH 0

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 1 % HOCH₂CH₂SH 0

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 3 % HOCH₂CH₂SH 39

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 4 % HOCH₂CH₂SH 38

예 34. 예 32의 결합 및 방출 프로토콜은 아래 표에 설명된 시약 조성물로 이어진다. 염 NaCl 및 KCl의 농도 변화의 효과가 조사되었다.

버퍼 염 유기 용매 용리 %

50mM 트리스, pH 8.5 0.1 M NaCl 5 % DTT 1

50mM 트리스, pH 8.5 0.25 M NaCl 5 % DTT 0

50mM 트리스, pH 8.5 0.5 M NaCl 5 % DTT 27

50mM 트리스, pH 8.5 0.75 M NaCl 5 % DTT 29

50mM 트리스, pH 8.5 1.0 M NaCl 5 % DTT 29

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 5 % DTT 26

50mM 트리스, pH 8.5 0.75 M NaCl 5 % DTT 64

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 5 % DTT 60

예 35. 예32의 결합 및 방출 프로토콜은 아래 표에 설명된 시약 조성물로 이어딘다. 비드는 60 분간 용리되었다.

버퍼 염 유기 용매 용리 %

50mM 트리스, pH 8.5 0.1 M NaCl 0 % 2-프로판올 3

50mM 트리스, pH 8.5 0.1 M NaCl 15 % 2-프로판올 68

50mM 트리스, pH 8.5 0.25 M NaCl 30 % 2-프로판올 64

50mM 트리스, pH 8.5 0.5 M NaCl 50 % 2-프로판올 4

예 36. 예 32의 결합 및 방출 프로토콜은 아래 표에 설명된 시약 조성물로 이어진다. 상대적인 효과성이 평가되었다.

버퍼 염 유기 용매

50mM 트리스, pH 8.5 1.0 M Na 아세테이트 15 % 2-프로판올 ++

50mM 트리스, pH 8.5 1.5 M Na 아세테이트 15 % 2-프로판올 ++

50mM 트리스, pH 8.5 1.25 M Na 아세테이트 15 % 2-프로판올 ++

50mM 트리스, pH 8.5 0.75 M Na 아세테이트 15 % 2-프로판올 +

50mM 트리스, pH 8.5 0.5 M Na 아세테이트 15 % 2-프로판올 +

50mM 트리스, pH 8.5 0.1 M Na 아세테이트 15 % 2-프로판올 +

예 37. 예 1의 트리부틸포스포늄 비드를 가지는 다양한 길이의 올리고뉴클레오티드의 결합 및 시약 조성물에 의한 방출.

20 염기 내지 2.7 kb에 이르는 다양한 크기의 올리고뉴클레오티드에서 예 32의 결합 및 방출 프로토콜이 실시되었다. 용리 조성은 50 mM 트리스, pH 8.5, 0.75 M NaCl, 5 % DTT였다. DNA의 양이 ssDNA를 위한 형광 착색제인 OliGreen^TM을 사용하여 형광 측정법에 의해 측정되었다.

올리고뉴클레오티드 크기 (nt) 용리 %

20 39

30 43

50 36

68 34

181 33

424 33

753 32

2.7 kb 20

예 38. 예 1의 트리부틸포스포늄 비드에 의한 선형화 pUC18 DNA의 결합 그리고 다양한 용리 부피로 방출.

2 mL 스핀 칼럼(Costar) 내에서 10 mg의 비드에 200 μL의 물 속 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 첨가했다. 20 분간의 배양 후에 칼럼을 스핀다운하고 상층액을 모았다. 2 x 200 μL의 물로 비드를 세척하고 세척액을 버렸다. 실온에서 5 분간 5 x 200 μL의 50 mM 트리스, pH 8.5, 0.75 M NaCl, 5 % DTT로 비드를 세척함으로써 DNA를 용리하고 스핀하며 각 용리 후의 형광 측정 및 겔 전기 영동에 의한 분석을 위해 용리액을 모았다.

유사한 방식으로, 결합된 DNA를 함유하는 비드들을 동일한 용리 버퍼 5 x 40 μL로 용리하였다.

용리율

200 μL 용리 40 μL 용리

용리 1 63 47

용리 2 10 11

용리 3 5.5 10

용리 4 3.5 5

용리 5 2.1 4

합계 84 77

예 39. 예 5의 트리부틸암모늄 비드에 의한 핵산의 결합 및 방출.

200 μL의 물 속 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 10 mg의 비드에 첨가하고 혼합물을 30 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운 하고 상층액을 모았다. 2 x 200 μL의 물로 비드를 세정하고 물은 버렸다. 실온에서 30 분간 200 μL의 50 mM 트리스, pH 8.5, 0.75 M NaCl, 5 % DTT로 비드를 배양함으로써 DNA를 용리했다. 예 26에 설명된 것과 같이 형광 측정 분석을 하기 위해 혼합물을 스핀다운하고 용리액을 제거했다. DNA 결합은 50 % 였고, 용리는 결합 부분의 69 % 였다.

예 40. 예 7의 자기 트리부틸포스포늄 비드에 의한 핵산의 결합 및 방출

10 mg의 비드 표본을 튜브에서 500 μL의 THF로 세정했다. 내용물을 자기적으로 분리하고 액체를 제거했다. 200 μL의 물로 세정 과정을 반복했다. 200 μL의 물 속 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 비드에 첨가하고 혼합물을 20 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 자기적으로 분리하고 상층액을 모았다. 비드를 2 x 200 μL의 물로 세정하고 물은 버렸다. 실온에서 30 분간 200 μL의 50 mM 트리스, pH 8.5, 1.25 M NaCl, 15 % 2-프로판올로 비드를 배양함으로써 DNA를 용리했다. 예 26에 설명된 것과 같이 형광 분석을 위해 혼합물을 자기적으로 분리하고 용리액을 제거했다. DNA 결합은 100 % 였고, 용리는 18 % 였다.

예 41. 예 1의 트리부틸포스포늄 비드에 의한 선형화 pUC18 DNA의 결합 및 다양한 용리 온도로 방출.

200 μL의 물 속 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 10 mg의 비드에 첨가하고 혼합물을 30 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운하고 상층액을 모았다. 비드를 2 x 200 μL의 물로 세정하고 물은 버렸다. 37 ℃, 46 ℃, 65 ℃, 및 94 ℃의 다양한 온도에서 5 분간 200 μL의 50 mM 트리스, pH 8.5, 1.25 M NaCl, 15 % 2-프로판올로 비드를 배양함으로써 DNA를 용리했다. 예 26에 설명된 것과 같이 형광 분석을 위해 혼합물을 스핀다운하고 용리액을 제거했다. DNA 결합은 100 % ~ 65-70 %의 결합 DNA가 모든 온도에서 용리되었다.

예 42. 트리부틸포스포늄기와 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자의 합성.

전술한 바와 같이 준비된 폴리메타크릴로일 염화물 수지(2.96 g), 5.07 g의 4-(메틸티오)티오페놀(4-(methylthio)thiophenol) 및 트리에틸아민(8.8 mL)을 아르곤 하의 실온에서 5일 동안 100 mL의 CH₂Cl₂에서 교반했다. 고체를 여과하고 CH₂Cl₂ 100 mL와 물 100 mL로 세척한 후 125 mL의 메탄올에서 수일간 교반했다. 여과 및 건조는 티오에스테르 산물의 3.76 g을 산출했다.

CH₂Cl₂ 100 mL 내의 고체의 2.89 g 부분을 4.1 mL의 메틸 트리플레이트와 함께 7 일간 교반했다. 고체를 여과하고 200 mL의 CH₂Cl₂, 300 mL의 메탄올 및 300 mL의 CH₂Cl₂ 으로 순차적으로 세척한 후 공기 건조시켰다.

예 43. 디메틸술포늄기를 가지는 절단성 비드를 이용한 DNA의 결합 및 방출.

200 μL의 10 mM 트리스, pH 8 속의 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 예 42의 비드 표본 10 mg에 첨가하고 혼합물을 5 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운하고 상층액을 모았다. 비드를 2 x 200 μL의 물로 세정하고 물은 버렸다. 37 ℃에서 5 분간 200 μL의 50 mM 트리스, pH 8.5, 0.75 M NaCl, 5 % DTT로 배양함으로써 DNA를 용리했다. 형광 분석을 위해 혼합물을 스핀다운하고 용리액을 제거했다. 상층액은 DNA를 함유하지 않았다. 용래액은 초기의 결합된 DNA의 37 %를 함유하였다.

예 44. 예 1의 트리부틸포스포늄 비드에 의한 선형화 pUC18 DNA의 결합 및 다양한 용리 조성물에 의한 방출.

10 mg의 비드 표본을 200 μL의 물로 세정했다. 200 μL의 물 속의 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 비드 10 mg에 첨가하고 혼합물을 25 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운하고 상층액을 모았다. 비드를 2 x 200 μL의 물로 세정하고 물은 버렸다. 실온에서 25 분간 아래 표에 설명된 200 μL의 다양한 시약 조성물로 비드를 배양함으로써 DNA를 용리했다. 형광 측정과 겔 전기영동에 의한 분석을 위해 혼합물을 스핀다운하고 용리액을 제거했다.

버퍼 [MgCl2] 유기용매 용리%

50 mM 트리스, pH 8.5 2.0 M 5% DTT 7.3

50 mM 트리스, pH 8.5 1.5 M 5% DTT 10.3

50 mM 트리스, pH 8.5 1.25 M 5% DTT 11.5

50 mM 트리스, pH 8.5 1.0 M 5% DTT 13.3

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M 5% DTT 17.6

50 mM 트리스, pH 8.5 0.5 M 5% DTT 23.7

50 mM 트리스, pH 8.5 0.25 M 5% DTT 32.5

예 45. 예 1의 트리부틸포스포늄 비드에 의한 선형화 pUC18 DNA의 결합 및 Na, K 또는 Mg 이온을 함유하는 다양한 용리 조성물에 의한 방출.

버퍼 [염] 유기 용매 용리 %

50 mM 트리스, pH 8.5 1.25 M NaCl 5% DTT 53.6

50 mM 트리스, pH 8.5 1.25 M KCl 5% DTT 60.0

50 mM 트리스, pH 8.5 1.25 M MgCl₂ 5% DTT 11.5

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M NaCl 5% DTT 67.8

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M KCl 5% DTT 64.4

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M MgCl₂ 5% DTT 17.6

50 mM 트리스, pH 8.5 0.1 M MgCl₂ 5% DTT 25.6

50 mM 트리스, pH 8.5 none 5% DTT 미검출

50 mM 트리스, pH 8.5 none none 미검출

예 46. 예 1의 트리부틸포스포늄 비드에 의한 선형화 pUC18 DNA의 결합과 다양한 이온들을 함유하는 다양한 용리 조성물에 의한 방출.

10 mg의 비드 표본을 200 μL의 물로 세정했다. 200 μL의 물 속의 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 비드 10 mg에 첨가하고 혼합물을 25 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운하고 상층액을 모았다. 비드를 2 x 200 μL의 물로 세정하고 물은 버렸다. 실온에서 30 분간 아래 표에 설명된 200 μL의 다양한 시약 조성물로 비드를 배양함으로써 DNA를 용리했다. 겔 전기영동에 의한 분석을 위해 혼합물을 스핀다운하고 용리액을 제거했다.

버퍼 [염] 유기 용매 용리 %

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M LiCl 5% DTT 77.0

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M CaCl₂ 5% DTT 76.3

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M CsCl 5% DTT 73.9

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M ZnCl₂ 5% DTT 47.2

50 mM 트리스, pH 8.5 0.75 M NH₄Cl 5% DTT 49.6

50 mM 트리스, pH 8.5 0.1 M LiCl 5% DTT 미검출

50 mM 트리스, pH 8.5 0.1 M CaCl₂ 5% DTT 62.3

50 mM 트리스, pH 8.5 0.1 M CsCl 5% DTT 미검출

50 mM 트리스, pH 8.5 0.1 M ZnCl₂ 5% DTT 미검출

50 mM 트리스, pH 8.5 0.1 M NH₄Cl 5% DTT 미검출

예 47. PCR 에서 직접 사용되는 버퍼 조성물에 의한 예 52의 절단성 자기 트리부틸포스포늄 비드로부터의 결합된 pUC18 DNA 의 방출.

예 52의 자기 포스포늄 비드 표본 10 mg을 400 μL의 THF와 뒤이어 2 x 100 μL의 물로 세정했다. 200 μL의 용해물 내의 비절단 pUC18 DNA 2 μg 용액을 10 mg의 비드에 첨가하고 혼합물을 5 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 용해물 버퍼는 S1, S2, S3의 세 가지 버퍼의 1:1:1 혼합물을 포함하는데, 여기서 S1은 50 mM 트리스, pH 8.0, 10 mM EDTA이고; S2는 1 % SDS를 함유하는 0.2 M NaOH 용액이고; S3는 0.3 M KOAc, 0.2 M HCl이다. 혼합물을 자기적으로 분리하고 상층액을 모았다. 비드를 2 x 200 μL의 물로 세정하고 물은 버렸다. 37 ℃에서 5 분간 400 mM 트리스-HCl, pH 8.4, I M KCl 및 50 mM MgCl₂를 함유하는 농축 버퍼 200 μL로 비드를 배양함으로써 DNA를 용리했다. 형광 분석을 통해 100 %의 플라스미드 DNA가 비드에 결 합되고 41 %가 용리된다는 것이 밝혀졌다.

DNA를 함유하는 용리액을 물과의 비율 1:10 및 1:20의 다양한 비율로 희석하고 PCR은 94 ℃ - 1 분, 60 ℃ - 1 분, 72 ℃ - 1 분의 30 사이클을 사용하여 증폭했다. 1:10 및 1:20 희석물은 PCR에 의해 성공적으로 증폭되었다.

예 48. 다양한 버퍼 조성물을 사용한 예 1의 고분자 비드에 의한 박테리아 배양물로부터의 플라스미드 DNA의 분리.

E. coli 배양물을 밤새 성장시켰다. 세포를 펠렛화하기 위해 4 ℃에서 15 분간 20 mL 부분을 6000 x g에서 원심분리했다. 펠렛을 100 μg/mL RNase A를 함유하는 4 mL의 50 mM 트리스, pH 8.0, 10 mM EDTA에 재현탁했다. 그 후, 부드럽게 섞여서 실온에서 4 분간 유지된 혼합물에, 1 % SDS를 함유하는 4 mL의 0.2 M NaOH 용액을 첨가했다. 그런 다음, 0.2 M HCl을 함유하는 4 mL의 0.3 M KOAc를 4 ℃로 냉각하여 첨가하고, 용액을 혼합하고 SDS를 침전시키기 위해 10 분간 정지시켜 두었다. 침전물을 여과하고 여과액을 모았다.

용해물(200 μL)을 예 1의 비드 10 mg으로 혼합하고 5 분간 배양했다. 결합 후에, 비드를 스핀다운하고 상층액을 제거했다. 비드 표본을 물 2 x 200 μL로 세척하고 그 후 표에 설명된 것과 같은 조성물로 용리했다.

버퍼 유기 용매 수율(μg)

1.25 M 트리스, pH 8.5 15 % 2-프로판올 3.5

1.25 M 트리스, pH 8.5 5 % DTT 2.1

0.05 M 트리스, pH 8.5, 5 % DTT 1.5

(+ 0.1 M MgCl₂)

예 49. 디메틸포스포늄기를 함유하는 폴리스티렌 고분자의 합성.

Merrifield 펩티드 수지(Sigma, 1.1 meq/g, 2.0 g)와 소듐 티오메틸레이트(2.24 g, 10 당량)를 60 mL의 anh. DMF와 함께 250 mL 플라스크에 첨가했다. 혼합물을 아르곤 하에 두고 실온에서 15 일간 교반했다. 슬러리를 여과하고 결과 고체를 50 mL의 DMF, 200 mL의 물, 200 mL의 메탄올, 및 200 mL의 CH₂Cl₂로 세척했다. 수지를 공기 건조 했다(2.12 g).

CH₂Cl₂ 100 mL 내의 티오메틸화 고분자(thiomethylated polymer)(0.637 g)를 아르곤 하에 두고 1.6 mL의 메틸 트리플레이트(methyl triflate)와 반응시켰다. 13 일간 교반한 후, 혼합물을 여과하고 고체를 200 mL의 CH₂Cl₂, 200 mL의 메탄올 및 200 mL의 CH₂Cl₂로 세척했다. 공기 건조를 통해 2.09 g의 백색 고체가 남았다.

예 50. 다양한 버퍼 조성물을 사용한 예 49의 고분자 비드에 결합된 pUC18 DNA의 방출.

예 49의 술포늄 비드 표본 10 mg을 300 μL의 THF와 뒤이어 2 x 100 μL의 물로 세정했다. 200 μL의 물 속의 2 μg의 선형화 pUC18 DNA 용액을 비드 10 mg에 첨가하고 혼합물을 15 분간 부드럽게 흔들어 섞었다. 혼합물을 스핀다운하고 상층액을 제거했다. 비드를 2 x 200 μL의 물로 세정하고 물은 제거했다. 실온에서 15 분간 아래 버퍼 200 μL으로 비드를 배양함으로써 DNA를 용리했다. 형광 분석 시험을 통해 100 %의 플라스미드 DNA가 비드에 결합되었고 56 %가 용리되었음을 밝혀냈다.

버퍼 유기 용매 염 용리 %

50 mM 트리스. pH 8.5, 5 % DTT 0.75 M NaCl 56

예 51. 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸-티오벤조에이트(4'- hydroxyphenyl 4- chloromethyl - thiobenzoate )의 합성

3 L 플라스크를 100.9 g의 4-클로로메틸-벤조산(4-chloromethyl-benzoic acid)와 1.2 L의 티오닐 염화물(thionyl chloride)로 채웠다. 4 시간 동안 반응을 환류시키고, 그 후 티오닐 염화물을 감압 하에 제거했다. CH₂Cl₂를 첨가하고 감압하에 증발시킴으로써 잔류 티오닐 염화물을 제거했다.

113.1 g의 4-클로로메틸벤조산 염화물(4-chloromethylbenzoic acid chloride)을 함유하는 3 L 플라스크를 98.17 g의 4-히드록시-티오페놀(4-hydroxy-thiophenol)과 1.5 L의 CH₂Cl₂로 채웠다. 아르곤을 내부로 퍼지(purge)하고 67.75 mL의 피리딘을 첨가했다. 밤새 교반한 후, 반응 혼합물을 1 L의 CH₂Cl₂로 희석하고 5 L의 물로 추출했다. 물 층을 CH₂Cl₂로 되돌아 추출했다. 결합된 CH₂Cl₂ 용액을 황 산 나트륨 위로 건조하고 고체로 농축했다. 고체를 500 mL의 CH₂Cl₂로 세척하고, 여과 및 공기 건조시켰다. ¹H NMR (아세톤-d₆) : δ 4.809 (s, 2H), 6.946-6.968 (d, 2H), 7.323-7.346 (d, 2H), 7.643-7.664 (d, 2H), 8.004-8.025 (d, 2H).

예 52. 폴리메타크릴레이트 링커로 기능화되고 트리부틸포스포늄기와 절단성 아릴티오에스테르 링커를 함유하는 자기 실리카 입자의 합성.

자기 카르복시산-기능화 실리카 입자들(Chemicell, SiMAG-TCL, 1.0 meq/g, 1.5 g)을 20 mL의 티오닐 염화물에 두고 4 시간 동안 환류시켰다. 과잉 티오닐 염화물을 감압하에 제거했다. 25 mL의 CHCl3에 수지를 재현탁하고 현탁액을 초음파로 분산시켰다. 용매를 증발시키고 초음파 세척 처리를 반복했다. 뒤에 사용하기 위해 입자들을 진공 건조했다.

산 염화물 기능화 입자들을 388 mg의 디이소프로필에틸아민(diisopropylethylamine)과 함께 38 mL의 CH₂Cl₂에 현탁했다. 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸-티오벤조에이트(4'-hydroxyphenyl 4-chloromethyl-thiobenzoate)(524 mg)를 첨가하고 밀봉된 반응 플라스크를 밤새 진동 교반기(shaker) 위에 두었다. 입자들을 50 mL의 플라스틱 튜브로 옮기고 일부 CH₂Cl₂, CH₃OH, 1:1 CH₂C1₂/CH₃OH, 및 그 후 CH₂Cl₂로 자기 분리에 의해 세척했다. 미반응한 용해성 개시 물질들을 제거하기 위해 세척 용액을 TLC로 관찰했다. 사용 전에 고체를 공기 건조시켰다.

수지(1.233 g)를 아르곤 하의 20 mL의 CH₂Cl₂에 현탁했다. 트리부틸포스핀(395 mg)을 첨가하고 슬러리를 7 일간 흔들어 섞었다. 입자들을 50 mL의 플라스틱 튜브로 옮기고 40 mL의 CH₂Cl₂로 4회, 그리고 뒤이어 40 mL의 MeOH로 4회, 그리고40 mL의 CH₂Cl₂로 4회 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켜 1.17 g의 밝은 갈색 고체를 얻었다.

예 53. 트리부틸포스포늄기와 절단성 아릴티오에스테르 링키지를 함유하는 폴리메타크릴레이트 고분자 입자의 합성.

2.45 g의 디이소프로필에틸아민을 함유하는 75 mL의 CH₂Cl₂에 폴리(메타크릴로일 염화물) 입자들을 두었다. 트리에틸아민(1.2 g)을 첨가했다. 4'-히드록시페닐 4-클로로메틸티오벤조에이트(4.5 g)를 첨가하고 밀봉된 반응 혼합물을 실온에서 밤새 교반했다. 슬러리를 여과하고 수지를 10 mL의 CH₂Cl₂, 200 mL의 아세톤, 200 mL의 MeOH, 2 x 100 mL의 1:1 THF/CH₂Cl₂, 250 mL의 THF, 250 mL의 CH₂Cl₂, 250 mL의 헥산으로 세척했다. 뒤에 사용하기 위해 수지를 공기 건조시켰다.

수지(1.525 g)를 아르곤 하의 CH₂Cl₂ 25 mL에 현탁했다. 트리부틸포스핀(1.7 g)을 첨가하고 슬러리를 4 일간 교반했다. 수지를 여과하고 CH₂Cl₂ 225 mL로 4회 세척하고 뒤이어 헥산 175 mL로 세척했다. 그 후 수지를 공기 건조시켜 고체 1.68 g을 얻었다.

유사한 방식으로, 트리메틸포스포늄기를 함유하는 고분자 입자들도 준비했다.

예 54. 버퍼 조성물에 의한 예 53의 절단성 트리부틸포스포늄 비드로부터 결합된 pUC18 DNA의 방출.

예 49에 설명된 프로토콜에 따라 예 56의 입자들에 플라스미드 DNA가 결합되었다. 37 ℃에서 5 분간 5 % DTT를 함유하는 100 μL의 1.25 M 트리스, pH 8.5 버퍼에서 상기 입자들을 배양함으로써 DNA를 용리했다.

형광 분석 시험을 통해 100 %의 플라스미드 DNA가 비드에 결합되고 55 %가 용리되는 것이 밝혀졌다.

Claims

a) 고상 결합 물질을 제공하는 단계;

b) 핵산을 상기 고상 결합 물질에 결합하기 위해 상기 핵산을 함유하는 표본과 고상을 화합하는 단계;

c) 상기 고상 결합 물질로부터 상기 표본을 분리하는 단계; 및

d) 아민의 농도가 적어도 0.01 M인 7-9의 pH, 0.1-3 M의 일가 또는 이가 할리이드 염 또는 아세테이트 염, 및 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 수용성 메르캅탄, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 퍼퓨릴 알콜, 2,2,2-트리플루오르에탄올, 아세톤, THF, 및 p-디옥산으로 구성된 군에서 선택되는 0.01-50 %의 친수성 유기 공용매를 가지는 수성 아민 버퍼 용액을 포함하는 조성물로 용리함으로써 상기 고상으로부터 상기 핵산을 방출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 합성 DNA 상사체(analog)로 구성된 군에서 선택되는 핵산을 표본로부터 분리하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 고상은 실리카, 유리, 불용성 합성 고분자, 및 불용성 다당류로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 고상은 4급 포스포늄기 PR₃ ⁺X^-를 포함하는 핵산 결합 부위를 가지며, 상기 R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기들로 구성된 군에서 선택되고, 상기 X는 음이온인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 고상은 SR₂ ⁺X^-의 식을 가지는 3급 술포늄기를 포함하는 핵산 결합 부위를 가지며, 상기 R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기들로 구성된 군에서 선택되고, 상기 X는 음이온인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 고상은 4급 암모늄기 NR₃ ⁺X^-를 포함하는 핵산 결합 부위를 가지며, 상기 R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기들로 구성된 군에서 선택되고, 상기 X는 음이온인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 고상 물질은 자기 코어 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 염은 NH₄, Li, Na, K, Rb, Cs, Ca, Mg와 Zn의 아세테이트 염 및 할라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제7항에 있어서,

상기 염은 적어도 0.1 M의 농도로 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 친수성 유기 공용매는 2-메르캅토에탄올 및 디티오트레이톨에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 아민은 지방족 아민, 지방족 아미노산, 지방족 아미노 알콜 및 술폰화 지방족 아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 핵산은 인간 게놈 DNA이고 상기 표본은 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 핵산은 플라스미드 DNA이고 상기 표본은 세포 배양물(cell culture)인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서,

상기 고상은 고체 서포트(support) 부위를 상기 핵산 결합 부위에 연결하는 절단성(cleavable) 링커(linker) 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
a) 고상 결합 물질을 제공하는 단계;

b) 상기 고상 결합 물질에 핵산을 결합하기 위해 핵산을 함유하는 표본과 고상을 결합하는 단계;

c) 상기 고상 결합 물질로부터 상기 표본을 분리하는 단계; 및

d) 아민의 농도가 적어도 0.1 M인 7-9의 pH와, C₁-C₄ 알콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 수용성 메르캅탄, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 퍼퓨릴 알콜, 2,2,2-트리플루오르에탄올, 아세톤, THF, 및 p-디옥산으로 구성된 군에서 선택되는 0-50 %의 친수성 유기 공용매를 가지는 수성 아민 버퍼 용액을 포함하는 조성물로 용리함으로써 상기 고상으로부터 상기 핵산을 방출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 합성 DNA 상사체(analog)로 구성된 군에서 선택되는 핵산을 표본로부터 분리하는 방법.
제14항에 있어서,

상기 버퍼의 농도는 적어도 0.4 M인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,

상기 버퍼의 농도는 적어도 1 M인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,

상기 아민은 지방족 아민, 지방족 아미노산, 지방족 아미노 알콜 및 술폰화 지방족 아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,

상기 친수성 유기 공용매는 2-메르캅토에탄올 및 디티오트레이톨에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,

상기 고상은

C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기로 구성된 군에서 선택되는 R을 포함하는 식 PR₃ ⁺X^-를 가지는 4급 포스포늄기,

C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기로 구성된 군에서 선택되는 R을 포함하는 식 SR₂ ⁺X^-를 가지는 3급 술포늄기, 및

C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기로 구성된 군에서 선택되는 R을 포함하는 식 NR₃ ⁺X^-를 가지는 4급 암모늄기로 구성된 군에서 선택되는, 상기 X는 음이온인, 4급 오늄기를 포함하는 핵산 결합 부위를 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,

상기 고상 물질은 자기 코어 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,

상기 핵산은 인간 게놈 DNA이고 상기 표본은 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서,

상기 핵산은 플라스미드 DNA이고 상기 표본은 세포 배양물인 것을 특징으로 하는 방법.
a) R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기로 구성된 군에서 선택되고, X는 음이 온인, 4급 포스포늄기 PR₃ ⁺X^-, 또는 R은 C₁-C₂₀ 알킬, 아랄킬 및 아릴기로 구성된 군에서 선택되고, X는 음이온인 3급 술포늄기 SR₂ ⁺X^- 중 어느 것을 포함하는 핵산 결합 부위를 가지는 고상 결합 물질을 제공하는 단계;

b) 핵산을 상기 고상 결합 물질에 결합하기 위해 상기 핵산을 함유하는 표본과 고상을 화합하는 단계;

c) 상기 표본을 상기 고상으로부터 분리하는 단계; 및

d) 아민의 농도가 적어도 0.01 M인 7-9의 pH, 0.1-3 M의 일가 또는 이가 할라이드 염 또는 아세테이트 염, 및 C₁-C₄ 알콜, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤, 수용성 메르캅탄, 2-메르캅토에탄올, 디티오트레이톨, 퍼퓨릴 알콜, 2,2,2-트리플루오르에탄올, 아세톤, THF, 및 p-디옥산으로 구성된 군에서 선택되는 0.01-50 %의 친수성 유기 공용매를 가지는 수성 아민 버퍼 용액을 포함하는 조성물로 용리함으로써 상기 고상으로부터 상기 핵산을 방출하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는, 올리고뉴클레오티드, DNA, RNA 또는 합성 DNA 상사체(analog)로 구성되는 군에서 선택되는 핵산을 표본로부터 분리하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 고상 물질은 자기 코어 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 아민은 지방족 아민, 지방족 아미노산, 지방족 아미노 알콜 및 술폰화 지방족 아민으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 염은 NH₄, Li, Na, K, Rb, Cs, Ca, Mg와 Zn의 아세테이트 염 및 할라이드에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 친수성 유기 공용매는 2-메르캅토에탄올 및 디티오트레이톨에서 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
제27항에 있어서,

상기 친수성 유기 공용매의 농도는 적어도 1 %인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 핵산은 인간 게놈 DNA이고 상기 표본은 체액인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 핵산은 플라스미드 DNA이고 상기 표본은 세포 배양물인 것을 특징으로 하는 방법.
제23항에 있어서,

상기 고상은 고체 서포트 부위를 상기 핵산 결합 부위에 연결하는 절단성 링커 부위를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.