CN101018871A

CN101018871A - 用于分离核酸的可裂解固相

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Publication number: CN101018871A
Application number: CNA2004800439070A
Authority: CN
Inventors: H·阿哈万－塔夫帝; R·德西瓦; R·A·埃克霍尔特; W·C·冈拉克; R·S·汉德利; K·S·劳韦斯; M·D·桑迪森; W·谢
Original assignee: Lumigen Inc
Current assignee: Nexgen Diagnostics LLC
Priority date: 2004-07-15
Filing date: 2004-12-13
Publication date: 2007-08-15
Also published as: KR20070057768A; JP2008506385A; JP2008506386A; EP1781808A1; KR20070058433A; EP1781816A1; EP1781808A4; WO2006019388A2; CN101027411A; WO2006019387A1; CA2573905A1; AU2004322310A1; AU2004322309A1; EP1789578A4; JP2008506387A; IL180502A0; AU2005275484A1; CN101018870A; CA2573998A1; EP1789578A2

Abstract

公开了结合核酸的固相材料和它们的使用方法。所述材料特征在于可裂解连接体部分，其可以被裂解以释放结合的核酸。该固相材料包括固体支持部分，所述固体支持部分包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶性多糖的基质，用于吸引和结合核酸的核酸结合部分连接至所述固体支持部分，所述核酸结合部分(NAB)通过可裂解连接体部分被连接至固体支持部分。优选的核酸结合部分包括三元或四元基。所述材料可以是微粒、纤维、珠、膜、试管或微孔的形式，并可以进一步包括磁芯部分。使用该可裂解固体支持物结合核酸的方法以及它们在分离或纯化核酸的方法中的用途被公开。

Description

用于分离核酸的可裂解固相

发明领域

[0001]本发明涉及用于结合核酸的新型固相材料以及它们在分离和纯化核酸的方法中的应用。

背景技术

[0002]分子诊断学和分子生物学中的现代技术(包括反转录、克隆、限制性分析、扩增和序列分析)，要求在这些技术中使用的核酸基本上不含污染物和干扰物质。不期望的污染物包括大分子物质例如酶、其它类型的蛋白质、多糖、多核苷酸、寡核苷酸、核苷酸、脂类、低分子量酶抑制剂、或非目标核酸、酶辅因子、盐、离液剂、染料、金属盐、缓冲盐和有机溶剂。

[0003]获得用于分子生物学应用的基本上无污染物的目标核酸是困难的，原因在于目标核酸被发现于其中的复杂样品基质。此类样品包括例如来自组织的细胞、来自体液的细胞、血液、培养物中的细菌细胞、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、或从目标核酸扩增得到的溶液。样品基质经常含有显著量的污染物，在感兴趣的核酸被用于分子生物学或诊断技术之前所述污染物必须从所述核酸去除。

[0004]从上述细胞和组织产生的混合物中分离目标核酸的常规技术，需要使用有害化学品例如酚、氯仿以及溴化乙锭。酚/氯仿提取被用于此类步骤以从目标核酸和多种污染物的混合物中抽提掉污染物。可选地，根据本领域中熟知的方法，使用氯化铯-溴化乙锭梯度。参见例如Molecular Cloning，由Sambrook等编著(1989)，Cold Spring Harbor Press，pp.1.42-1.50。通常，在后面的方法之后，通过将乙醇或2-丙醇加入水相以沉淀核酸来沉淀保留在抽提的水相中的核酸物质。通常，通过离心从溶液中移出沉淀物，并且在水或缓冲溶液中重悬以作进一步使用之前，允许干燥所得到的沉淀物小球。

[0005]已经开发出更简单和更快的方法，其采用各种类型的固相，以从细胞裂解液或核酸和污染物的其它混合物中分离核酸。此类固相包括层析树脂、聚合物和各种形状和形式例如纤维的二氧化硅或玻璃基物质、过滤器以及包被的容器。当为小颗粒的形式时，有时提供磁芯，以帮助实现分离。

[0006]在分离核酸中使用的一种类型的固相包括设计用于高效液相色谱(HPLC)的多孔硅胶颗粒。用阴离子交换剂对多孔硅胶颗粒的表面进行官能化，以在某一盐和pH条件下与质粒DNA交换。参见，例如美国专利4,699,717和5,057,426。在含有高浓度盐的水溶液中洗脱结合到这些固相材料的质粒DNA。从那里洗脱的核酸溶液在其被用于下游过程之前必须被进一步处理，以除去盐。

[0007]其它硅基固相材料包括可控孔度玻璃(CPG)、包埋有二氧化硅颗粒的滤器、硅胶颗粒、硅藻土、玻璃纤维或上述的混合物。在存在离液剂例如碘化钠(NaI)、硫氰酸胍或氯化胍的情况下，在含有核酸的样品中，每一硅基固相材料可逆地结合核酸。此类固相结合并保持核酸物质，同时该固相经受离心或真空过滤以从残余样品成分中分离出基质和结合于其上的核酸物质。然后，通过用水或低盐洗脱缓冲液洗脱，从固相释放出该核酸物质。商业上可得的用于核酸分离的硅基固相材料包括例如Wizard^TM DNA纯化系统产品(Promega，Madison，WI)、QiaPrep^TM DNA分离系统(Qiagen，Santa Clarita，CA)、High Pure(Roche)以及GFXMicro Plasmid Kit(Amersham)。

[0008]颗粒形式的聚合树脂也被广泛用于核酸的分离和纯化。在欧洲专利申请公开第EP 1243694A1中公开了含有季铵首基(head group)的羧酸盐改性的聚合颗粒(Bangs，Agencourt)聚合物。该聚合物是具有共价连接的线型非交联聚合物的惰性载体颗粒。该类型的聚合固相一般是指触角树脂(tentacle resin)。线型聚合物掺入四烷基季铵基团。该烷基集团被指定为甲基或乙基基团(第4栏，第52-55行)。较长的烷基被认为是不期望的。

[0009]基于阴离子交换原理的其它用于结合核酸的固相材料目前正在使用中。这些包括具有DEAE首基(Qiagen)和二氧化硅-NucleoBond AX(BD，Roche-Genopure)的硅基材料，这基于在EP0496822B1 中描述的层析载体。具有聚合的三烷基铵基团的聚合物树脂被描述于EP 1243649(GeneScan)。用于DNA分离的羧基改性聚合物可以从众多的供应商获得。在高盐条件下核酸被吸引，而在低离子强度条件下核酸被释放。

[0010]磁响应性颗粒也已经被开发用作核酸分离中的固相。设计用于核酸分离的若干种不同类型的磁响应性颗粒在本领域中是已知的，并且可以从若干来源商业获得。可逆地直接结合核酸材料的磁性颗粒包括MagneSil^TM颗粒(Promega)。也已知，磁性颗粒通过共价连接的抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白可逆地结合mRNA，其中抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白具有用于与mRNA的聚腺苷酸尾杂交的连接的寡dT尾。

[0011]已知多种类型的磁响应性硅基颗粒被用作核酸结合分离法中的固相。一个这样的颗粒类型是磁响应性玻璃珠，优选具有受控孔尺寸的磁响应性玻璃珠，其作为Magnetic Porous Glass(MPG)颗粒可以从CPG，Inc.(Lincon Park，NJ)获得；或者在美国专利第4,395,271、4,233,169、或4,297,337号中描述的多孔磁玻璃颗粒。在核酸的结合和分离中有用的磁性颗粒的另一类型是通过将磁性材料掺入聚合的二氧化硅化合物基质中而产生的。(德国专利DE4307262A1)

[0012]具有可诱导磁性性质的颗粒或珠包括小颗粒的过渡金属，例如铁、镍、铜、钴和锰，以形成金属氧化物，在磁体存在下可以使该金属氧化物具有暂时的磁性。这些颗粒被称为顺磁性的或超顺磁性的。为形成顺磁或超顺磁珠，已用在水中相对稳定的聚合物包被金属氧化物。美国专利4,554,088公开了顺磁颗粒，其包括被高分子硅烷包被包围的金属氧化物芯。美国专利5,356,713公开了可磁化的微球体，其包括被疏水乙烯基芳族单体外壳包围的可磁化颗粒芯。美国专利5,395,688公开了已经用混合的顺磁金属氧化物-聚合物层包被的聚合物芯。另一种方法采用聚合物芯以吸收金属氧化物，例如诸如在美国专利第4,774,265号中。包含用顺磁金属氧化物颗粒层包被的聚合芯颗粒的磁性颗粒被公开于美国专利5,091,206中。然后，用另外的聚合层进一步包被该颗粒，以保护金属氧化物层并提供反应性包被。美国专利5,866,099公开了在用于配位金属盐并俘获混合的金属氧化物颗粒的蛋白存在的情况下，通过两种金属盐的混合物共沉淀制备磁性颗粒。许多示例性金属盐对被描述。美国专利5,411,730描述了相似的方法，其中沉淀的混合的金属氧化物颗粒被俘获在葡聚糖——一种寡糖中。

[0013]用于不可逆地捕获DNA和RNA的氧化铝(氧化铝(alumina oxide))颗粒被公开于美国专利6,291,166中。用于固相扩增法例如PCR的结合的核酸是可得的。

发明概述

[0014]本发明的另一个目标是提供固相材料，其包括用于结合核酸的可裂解连接体(cleavable linker)。进一步的目标是提供包含共价连接的核酸结合基团的此类可裂解固相材料。本发明的另一个目标是提供从固相材料结合和释放核酸的方法。本发明的另一个目标是提供使用本发明的固相材料分离和纯化核酸的方法。本发明的进一步的目标是提供结合核酸并在最常使用的洗脱条件下抵抗核酸释放的固相材料。提供含有共价连接的三元或四元基(ternary or quaternary oniumgroups)的此类固相材料是进一步的目标。本发明的另一个目标是提供使用本发明的组合物结合核酸并释放该核酸的固相材料。本发明的另一个目标是提供用于从固相材料释放结合的核酸的此类试剂组合物。

附图简述

[0015]图1A描绘了可裂解核酸结合颗粒的示意图。图1B描绘了结合核酸分子的可裂解固体支持物。

[0016]图2显示了使用可裂解核酸结合颗粒结合和释放核酸。

[0017]图3是PCR扩增的pUC18质粒DNA样品的凝胶图，其已被吸收在10mg可裂解的聚合物珠上，并在扩增前从洗涤过的珠洗脱。

[0018]图4是通过使用实施例13和19的可裂解的珠从细胞裂解液分离而获得的pUC18 DNA的凝胶图。

[0019]图5是使用本发明的可裂解固体支持物从人血样中分离的DNA的凝胶图。

[0020]图6是结合至本发明的具有三丁基-磷(，phosphonium)基团的可裂解固体支持物并通过Wittig反应释放的DNA的斑点印迹图。

发明详述

[0021]申请人已开发出用于从含有核酸的溶液和样品中捕捉和结合核酸的新型固相材料。该固相材料可以是颗粒、微粒、纤维、珠、膜和其它支持物的形式，例如试管和微孔。新型材料的一个限定性特征是存在可裂解的连接体部分。该材料进一步包括允许捕捉和紧密结合不同长度的核酸分子的核酸结合基团。固相材料与切断可裂解连接体的试剂的反应使得结合的核酸从固相释放。可控地释放结合的核酸分子的新方法形成本发明的又一部份，如同用于从该固相材料释放或洗脱结合的核酸分子的试剂组合物构成本发明的一部分一样。

定义

[0022]烷基——含有1-20个碳原子的支链、直链或环状烃基团，其可以用除了H以外的1个或多个取代基取代。本文中所使用的低级烷基是指那些含有高达8个碳的烷基基团。

[0023]芳烷基——用芳基取代的烷基基团。

[0024]芳基——含有1至5个碳环芳香环的含芳香环的基团，其可以用除了H以外的1个或多个取代基取代。

[0025]磁性颗粒——颗粒、微粒或珠，其对外部的磁场有响应。该颗粒本身可以是磁性的、顺磁性的或超顺磁性的。如当使用铁磁材料时，其可以被吸引到外部磁体或施用的磁场。颗粒可以具有固体芯部分，该固体芯部分是磁响应性的，并且被一层或多层非磁响应性层包围。可选地，磁响应性部分可以是周围的层或者可以是分散在非磁响应性核芯内的颗粒。

[0026]寡聚物、寡核苷酸——如本文所使用的，将是指含有磷酸二酯核苷酸间键和5′-端单磷酸酯基团的化合物。核苷酸可以是正常发生的核糖核苷酸A、C、G和U或脱氧核糖核苷酸dA、dC、dG和dT。

[0027]多核苷酸——多核苷酸可以是DNA、RNA或合成的DNA类似物例如PNA。任何这三种类型的链组成的双链杂合子也可以在本术语的范围内。

[0028]引物——指用于定向连接位位点并且为起始连接过程所必需的寡核苷酸。引物的长度足以稳定地与模板杂交，并且代表模板中的独特序列。引物的长度通常为约15-30个碱基。含有可检测标记或允许固相捕获的标记的标记的引物在如本文中所使用的术语的范围内。

[0029]模板、试验多核苷酸以及靶被互换使用并且是指其长度将被复制的核酸。

[0030]样品——含有或疑似含有核酸的流体。可以用在本发明的方法中的典型的样品包括体液，例如血液、血浆、血清、尿、精液、唾液、细胞裂解液、组织提取液和类似物。其它类型的样品包括溶剂、海水、工业水样、食物样品和环境样品例如土壤或水、植物材料、原核生物、真核生物来源的细胞、细菌、质粒和病毒。

[0031]固相材料——具有可以将核酸分子吸引至其上的表面的材料。材料可以是微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式。

[0032]取代的——是指用非氢基团置换基团上的至少一个氢原子。应该注意到的是，关于取代的基团，其意图是可以存在多点取代，除非明确另外指出。

[0033]申请人已经开发出固相材料，其结合核酸并具有可以被裂解以释放结合的核酸的可裂解连接体部分。该材料可以是微粒、纤维、珠、膜以及其它支持物例如试管和微孔的形式，它们具有足够的表面积以允许进行有效结合。微粒形式的本发明的固相材料可以进一步包括磁芯部分。通常，颗粒以及磁响应性微粒在本发明中是优选的。

[0034]本发明的固相核酸结合材料包括限定其大小、形状、孔隙率和机械性能的基质，和共价连接的核酸结合基团。三种最常用类型的基质是二氧化硅或玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖。固相可以进一步包括磁响应性部分。

[0035]聚合物是一种或多种烯键式不饱和单体单元的均聚物或共聚物，并且可以是交联的或非交联的。优选的聚合物是聚烯烃包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多种取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物，其中丙烯酸单体在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。

[0036]包含在本发明的固相结合材料中的核酸结合基团吸引并结合具有各种长度和碱基组成或碱基顺序的核酸、多核苷酸和寡核苷酸。核酸结合基团包括羧基、胺和三元或四元基。胺基团可以是NH₂、烷基胺以及二烷基胺基团。三元或四元基包括三烷基季铵基团(-QR₃ ⁺)，磷基(-QR₃ ⁺)包括三烷基磷或三芳基磷或混合的烷基芳基磷基、以及三元锍基(ternary sulfonium)(-QR₂ ⁺)。固相可以含有一种以上类型的核酸结合基团，如本文中所述。含有其中R基团是具有至少4个碳的烷基的三元或四元基-QR₂ ⁺或-QR₃ ⁺的固相材料在结合核酸中特别有效，但少如1个碳的烷基基团也如芳基那样有用。此类固相材料以高的韧度保持结合的核酸，并在现有技术中已知用于洗脱的大多数条件下抵抗核酸的除去和洗脱。已知的高和低离子强度的洗脱条件对于除去结合的核酸是无效的。不同于含有DEAE和PEI基团的传统阴离子交换树脂，三元或四元固相材料保持正电荷，无论反应介质的pH如何。

[0037]在本发明的一方面，提供了包括固体支持部分(solid support portion)的固相，所述固体支持部分包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶性多糖的基质，在其表面上连接有核酸结合部分，用于吸引和结合核酸，所述核酸结合部分(nucleic acid binding portion，NAB)由可裂解的连接体部分连接到固体支持部分。

或

[0038]在一个实施方式中，NAB是其中Q为S原子的式QR₂ ⁺X^-的三元基或其中Q为N或P原子的式QR₃ ⁺X^-的四元基，R选自烷基、芳烷基和芳基而X为阴离子。当Q是氮原子时，R基团可以每一个都含有4-20个碳原子。当Q是硫或磷原子时，R基团可以具有1-20个碳原子。

或

[0039]根据本发明，优选的固相来源于商业可得的聚苯乙烯型聚合物例如被称为Merrifield树脂(交联的)的那些类型。在这些聚合物中，一定百分比的苯乙烯单元含有反应性基团，通常为氯甲基或羟甲基，作为共价连接的工具。通过与硫化物(R₂S)或三元胺或膦反应，置换一些氯，产生本发明的固相材料。当所有的反应性氯甲基基团已经被转化成三元或四元基时，根据本定义制备的聚合物可以用下面的式(1)描绘。对于所有此类基团，不必须都被转化，使得本发明的聚合固相将经常含有基和氯甲基基团的混合物。

在上式中，m、n和o表示聚合物中每一单体单元的摩尔百分比，并可以取值为：m从0.1％至100％、n从0至99％、以及o从0至10％。更优选地，m从1％至20％、n从80至99％、以及o从0至10％。

[0040]在另一个实施方式中，根据本发明的固相来源于商业可得的交联的Merrifield树脂，其一定百分比的苯乙烯单元含有反应性氯乙酰基或氯丙酰基，用于共价连接。从这些起始聚合物制备的本发明的三元或四元聚合物具有下式：

其中Q、R、X、m、n和o如上定义。

[0041]许多其它本领域已知的聚合树脂可以被用作制备本发明的固相材料中的固体基质。聚合树脂可以从商业供应商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)和NovaBiochem获得。该树脂通常基于具有反应性官能团的交联的聚合颗粒。用在如Advanced ChemTech 2002 Catalog，pp.105-140中所述的固体支持的肽合成中的许多合适的聚合树脂是合适的原材料。具有反应性NH₂、NH-NH₂、OH、SH、CHO、COOH、CO₂CH＝CH₂、NCO、Cl、Br、SO₂CH＝CH₂、SO₂Cl、SO₂NH₂、酰基咪唑、肟(C＝N-OH)、琥珀酰亚胺酯基团的聚合物每一个都是商业可得的，用于制备本发明的聚合固相。如在下面的多个例子所示，提供将前体聚合树脂共价接合到三元或四元基的方法有时是必需或期望的。这将通常包括选自亚烷基、亚芳基或亚芳烷基(aralkylene)基团的1-20个原子的链或环基团。该链或环还可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黄原酸酯、脲、亚胺、肟、亚砜和硫酮形式的羰基基团。

[0042]具有二氧化硅、玻璃或多糖支持物作为固体基质的本发明的固相材料将通过二价基团的共价连接来官能化，所述二价基团将核酸结合基团和可裂解连接体部分连接到固相基质。该二价基团通常为有机基团，或者为低分子量基团或者为聚合基团。该二价基团也可以是有机硅烷。对包被微粒表面有用的合适的硅烷包括对-氨丙基-三甲氧基硅烷、N-2-氨基-乙基-3-氨丙基甲氧基-硅烷、(H₂NCH₂NHCH₂CH₂NHCH₂Si(OCH₃)₃、三乙氧基硅烷和三甲氧基硅烷。制备这些微粒的方法公开在美国专利第4,628,037、4,554,088、4,672,040、4,695,393和4,698,302号中，其教导被引入于此作为参考。具有共价结合的有机连接体基团的二氧化硅颗粒材料是已知并商业可得的。描述了许多此类材料的一个来源是Silicycle(Quebec City，Canada)。通过亚烷基或其它连接体结合于多种反应性官能团的二氧化硅颗粒被描述于产品目录中，该目录致力于用于固相合成的硅基材料。所描述的代表性官能团包括胺、碳二亚胺、碳酸酯、二氯三嗪、异氰酸酯、马来酰亚胺、酐、羧酸、羧酸酯、硫醇、硫脲、硫氰酸酯、磺酰氯、磺酸以及磺酰肼基团。这些物质的任何一种可以用来提供用于三元或四元基的连接的固体基质，如上所述。

[0043]如本文所使用，磁性微粒是可以被磁场吸引和操作的颗粒。用在本发明的方法中的磁性颗粒包括磁性金属氧化物芯，其通常被吸附性结合或共价结合的层包围，核酸结合层通过选择的偶联化学术被共价结合到所述层，从而用三元锍、季铵或四元磷官能团包被微粒的表面。磁性金属氧化物芯优选是氧化铁，其中铁是Fe²⁺和Fe³⁺的混合物。无硅烷包被的上述含有氧化铁芯的磁性微粒也可以被用于本发明的方法中。如美国4,654,267所述，磁性颗粒也可以通过在多孔聚合物存在下沉淀金属颗粒以捕获磁响应性金属颗粒而形成。可制备的磁性金属氧化物从而包括Fe₃O₄、MnFe₂O₄、NiFe₂O₄和CoFe₂O₄。其它磁性颗粒也可以如美国5,411,730所述通过在寡糖葡聚糖存在下沉淀金属氧化物颗粒以捕获磁响应性金属颗粒而形成。前述的美国专利5,091,206公开了另一种磁性颗粒。该颗粒包括用顺磁性金属氧化物颗粒层包被的聚合芯颗粒，以及另外的聚合层以保护金属氧化物层并提供反应性包被层。含有氯甲基化的Merrifield树脂的磁铁矿(四氧化三铁锈层，magnetite)的制备被描述于出版物(Tetrahedron Lett.，40(1999)，8137-8140)中。

[0044]商业可得的磁性二氧化硅或磁性聚合颗粒可以被用作制备根据本发明的可裂解磁性颗粒中的原材料。具有表面羧基基团的聚合颗粒的合适类型已知为商品名SeraMag^TM(Seradyn)和BioMag^TM(Polysciences and Bangs Laboratories)。二氧化硅磁性颗粒的合适类型已知为商品名MagneSil^TM(Promega)。二氧化硅磁性颗粒也可以从Chemicell GmbH(Berlin)获得。

其它可裂解固体支持物

[0045]在另一个实施方式中，提供了固相材料，所述固相材料包含选自二氧化硅或玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖的固相基质，并具有用于将基连接到固相的可裂解连接体基团。基具有其中Q为S原子的式QR₂ ⁺X^-，或者其中Q为N或P原子的式QR₃ ⁺X^-，R选自具有1-20个碳原子的烷基、芳烷基和芳基，X为阴离子。可裂解连接体起着两个功能，1)物理连接基质和三元或四元基，和2)提供断裂固体支持基质和吸引核酸的四元基之间的连接的方式，从而从该固相基质释放结合的核酸。该连接体可以是形成二价、三价或多价基团的任何原子集合(grouping)，假如其包含可以被特定化学试剂、酶试剂或光化学反应裂解的可裂解部分。该裂解剂或反应必须在断裂可裂解连接的过程期间足以保护核酸，以便核酸对于下游过程是有用的。

[0046]聚合物是一种或多种烯键式不饱和单体单元的均聚物或共聚物，并且可以是交联的或非交联的。优选的聚合物是聚烯烃包括聚苯乙烯以及聚丙烯酸型聚合物。后者包括多种取代的丙烯酸、酰胺和酯的聚合物，其中丙烯酸单体在2-或3-碳上可以含有或可以不含有烷基取代基。

[0047]许多其它本领域已知的聚合树脂可以被用作制备本发明的固相材料中的固体基质。聚合树脂可以从商业供应商例如Advanced ChemTech(Louisville，KY)获得。该树脂通常基于具有反应性官能团的交联的聚合颗粒。用在如AdvancedChemTech 2002 Catalog，pp.105-140中所述的固体支持的肽合成中的许多合适的聚合树脂是合适的原材料。具有反应性NH₂、NH-NH₂、OH、SH、CHO、COOH、CO₂CH＝CH₂、NCO、Cl、Br、SO₂CH＝CH₂、SO₂Cl、SO₂NH₂、酰基咪唑、肟(C＝N-OH)、琥珀酰亚胺酯基团的聚合物每一个都是商业可得的，用于制备本发明的聚合固相。

[0048]如在下面的多个例子中所示，提供将前体聚合树脂共价结合到可裂解连接体部分或将该可裂解连接部分结合到四元基的工具有时是必需或期望的。在这些情况下，连接体基团也可以包括一个或多个连接部分。后者将通常包括选自亚烷基、亚芳基或亚芳烷基(aralkylene)基团的、1-20个原子的链或环基团。该链或环还可以含有O、S或N原子以及以酮、酯、硫代酸酯、酰胺、氨基甲酸乙酯、碳酸酯、黄原酸酯、脲、亚胺、肟、亚砜和硫酮形式的羰基基团。

[0049]可裂解连接体部分优选选自直链、支链和环的有机基团，并包括1至100个原子并更优选1至约50个原子。该原子优选选自C、H、B、N、O、S、Si、P、卤素和碱金属。示例性的连接体基团是通过水解裂解的水解可裂解基团。羧酸酯和羧酸酐、硫代酸酯、碳酸酯、硫代碳酸酯、氨基甲酸乙酯、二酰亚胺、磺酰胺和磺酰亚胺是代表性的，磺酸酯也是代表性。连接体基团的另一个示例性类别是经受还原性裂解的那些基团。一个代表性基团是含有二硫(S-S)键的有机基团，所述二硫键通过硫醇例如乙硫醇、巯基乙醇和DTT被裂解。另一个代表性基团是含有过氧化物(O-O)键的有机基团。过氧化物键可以通过硫醇、胺和膦裂解。

尽管许多特定结构图为方便起见仅表示四元基，但应当理解，类似的四元锍基也同样欲被表示。

[0050]示例性的光化学可裂解连接体基团包括下式

的硝基取代的芳族醚和酯，其中R_d为H、烷基或苯基，并且更具体地

邻硝基苄基酯根据熟知的反应

通过紫外光被裂解。

[0051]示例性的可酶切连接体基团包括通过酯酶和水解酶裂解的酯、通过蛋白酶和肽酶裂解的酰胺和肽、通过糖苷酶裂解的糖苷基。

[0052]具有包含可裂解的1，2-二氧杂环丁烷(dioxetane)部分的连接体基团的固相材料也在发明的核酸结合材料的范围之内。此类材料包含可以由化学剂或酶试剂引发成片段的二氧杂环丁烷部分。除去保护基以产生氧阴离子，促进二氧杂环丁烷环的分解。根据熟知的方法，通过裂解过氧化物的O-O键以及C-C键而发生断裂。

可选地，连接的基可以被结合到芳基Ar，如在：

或结合到可裂解的基团Y，如在：

进一步可选地，与固相和三元或四元基的连接被颠倒。

[0053]在前述的从固相裂解三元或四元基的示例性反应中，基团A表示稳定取代基。合适的基团选自烷基、环烷基、聚环烷基、聚环烯基、芳基、芳氧基和烷氧基。Ar代表芳环基团。优选的芳环基团是苯基和萘基。芳环可以包含另外的取代基，具体而言，是卤素、烷氧基和胺基。Y基团是通过化学剂或酶可去除的基团或原子。合适的OY基团包括OH、其中R³选自烷基和芳基基团的OSiR³ ₃、羧基、磷酸盐、硫酸盐以及糖苷基。许多可引发的二氧杂环丁烷结构在本领域中是熟知的并且已经是大量专利的主题。公开于美国5,707,559中的螺金刚烷基(spiroadamantyl)-稳定的二氧杂环丁烷是一个例子，如美国5,578,253中所公开的含有烷基或环烷基取代基的其它二氧杂环丁烷也是合适的。许多其它不同取代的二氧杂环丁烷被描述于专利文献中；一旦被连接到固相以及核酸结合基团，这些中的任何一个也将是适合的。另外的示例性可裂解二氧杂环丁烷结构在美国专利6,036,892、66,218,135、6,228,653、5,603,868、6,107,036、4,952,707、6,140,495、6,355,441和6,461,876中找到。

[0054]要求来自前述的螺金刚烷基、烷基或环烷基的连接取代基将二氧杂环丁烷连接体连接到固相或三元或四元基。具有连接基团的二氧杂环丁烷被公开在美国5,770,743中，并作为用于将二氧杂环丁烷共价结合到固相和基的连接部分，举例说明了可利用的键合化学类型。示例性的可裂解二氧杂环丁烷连接体和其裂解被如下描绘。

保护基Y的去除引发了二氧杂环丁烷环的断裂，并从而分开固体基质和基。在碱性反应条件下，所得到的芳基酯经受进一步水解。

[0055]具有包含多电子的C-C双键的连接体基团的固相材料也在发明的核酸结合材料的范围内，所述多电子的C-C双键可以转化成不稳定的1，2-二氧杂环丁烷部分。在该双键上的至少一个取代基(A′)通过O、S或N原子被连接到双键上。多电子双键与单态氧的反应产生不稳定的1，2-二氧杂环丁烷基团。该二氧杂环丁烷环在环境温度下自发断裂，如上所述，以产生两个羰基片段。

[0056]具有可裂解连接体基团的另一组固相材料具有乙烯酮二硫缩醛(ketenedithioacetal)作为可裂解部分，如在PCT公布WO 03/053934中所公开。乙烯酮二硫缩醛经受通过与过氧化物酶和过氧化氢的酶氧化导致的氧化性裂解。

可裂解部分具有所示的结构，包括在9，10-二氢化吖啶(acridan)环上具有取代基的类似物，其中R_a和R_b每一个都是有机基团，该有机基团除了满足基团中原子的化合价所需的必要数目的H原子之外含有1至约50个非氢原子，并且其中R_a和R_b可以被接合在一起而形成环。基团R_a和R_b可以包含1至约50个选自C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子。R_c是有机基团，除了满足基团中原子的化合价所需的必要数目的H原子之外，含有1至50个选自C、N、O、S、P、Si和卤素原子的非氢原子。更优选地，R_c含有1至20个非氢原子。有机基团R_c优选选自烷基、取代的烷基、芳基、取代的芳基、芳烷基和取代的芳烷基。R_c更优选的基团包括取代的或未取代的C₁-C₄烷基基团、取代或未取代的苯基或萘基、以及取代或未取代的苄基基团。当被取代时，示例性的取代基包括而不限于烷氧基、芳氧基、羟基、卤素、氨基、取代的氨基、羧基、烷氧羰基、羰酰胺(carboxamide)、氰基、磺酸酯和磷酸酯基团。一个优选的R_c基团为用至少一个赋予水溶性的基团取代的烷基或杂烷基基团。

[0057]具有乙烯酮二硫缩醛可裂解连接体基团的固相材料具有下式中的任何一个：

或

以及类似的结构，其中固体基质和基结合到可裂解连接体部分的次序被从示出的次序颠倒过来。

[0058]具有可裂解连接体基团的另一组固相材料具有亚烷基作为可裂解部分，所述亚烷基具有至少一个结合到三烷基或三芳基磷基的碳原子。

这组的材料通过与酮或醛的Wittig反应是可裂解的。在有机溶剂中季磷化合物(季化合物)与强碱的反应使结合到磷的碳原子脱质子化，产生磷叶立德(phosphorus ylide)。该叶立德与含羰基化合物例如酮或醛的反应形成双键和氧化膦。在该过程中磷基和固相之间的连接断裂。优选地，将固相结合到磷原子的碳原子(α碳)以这样的方式被取代：任何结合的质子比磷原子上的R基团上的任何质子更具有酸性。然后，叶立德形成和链碎裂被指引至正确的部位。在优选的实施方式中，在经历叶立德形成的碳原子上的其它取代基中的一个是苯基或取代的苯基。当季磷基为三芳基磷基例如三苯基磷基时，对α质子增强的酸度的要求不再重要(moot)。

[0059]本发明进一步的方面包括使用可裂解固相结合材料分离和纯化核酸的方法。在一个实施方式中，提供了从样品分离核酸的方法，包括：

a)提供固相，所述固相包括：

包含基质的固体支持部分，所述基质选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖，

用于吸引和结合核酸的核酸结合部分，和

可裂解连接体部分；

b)混合固相和含有核酸的样品，以将核酸结合到固相上；

c)从所述固相分离所述样品；

d)裂解所述可裂解连接体；和

e)从固相释放所述核酸。

[0060]在优选的实施方式中，核酸结合部分是连接于基质表面的式QR₂ ⁺X^-或QR3⁺X^-的四元基，其中四元基选自三元锍基、季铵和磷基，其中R选自C₁-C₂₀烷基、芳烷基和芳基，而X是阴离子。

[0061]从固相分离样品的步骤可以通过下列方法完成，例如过滤、重力沉降、倾析、磁力分离、离心、真空吸气、当例如使液体通过多孔膜或过滤毡片(hlter mat)时过压空气或其它气体。该样品中除了核酸之外的组分在该步骤被除去。就其它组分的除去不完全而言，可以进行另外的洗涤，以帮助它们完全被去除。

[0062]裂解可裂解连接体的步骤，包括用裂解剂处理在其上结合有核酸的固相一段时间，该时间足以断裂可裂解连接体部分中的共价键但不破坏核酸。裂解剂的选择由可裂解连接体的性质决定。当可裂解连接体是水解可裂解的基团时，裂解剂是水或低级醇或它们的混合物。裂解剂优选包含当加入到水中提高pH的碱。优选的碱选自氢氧化物盐和醇盐或者包含无机酸或过氧化氢。示例性的碱包括LiOH、NaOH、KOH、NH₄OH、NaOCH₃、KOCH₃和KOt-Bu。当可裂解连接体是还原性可裂解基团例如二硫化物或过氧化物基团时，裂解剂是选自硫醇、胺和膦的还原剂。示例性的还原剂包括乙硫醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、三烷基胺和三苯基膦。光化学可裂解连接体基团要求使用光作为裂解剂，典型为紫外区或可见区的光。如上所述的酶促可裂解连接体基团通过选自酯酶、水解酶、蛋白酶、肽酶、过氧化物酶和糖苷酶的酶裂解。

[0063]当可裂解连接体基团是可引发的二氧杂环丁烷时，裂解剂起作用，以裂解如上所解释的引发OY基团中的O-Y键。裂解O-Y键使二氧杂环丁烷环基团不稳定，并通过C-C和O-O键的断裂导致二氧杂环丁烷碎裂成两部分。当OY基团是OH时，裂解剂是有机或无机碱。当OY基团是OSiR³ ₃时——其中R³选自烷基或芳基，裂解剂是氟化物离子。当OY基团被结合到羰基基团上时，如酯中的羰基，裂解剂是酯酶或者是水解该酯的化学水解剂。此类化学水解剂选自水或低级醇或它们的混合物。裂解剂优选包含选自氢氧化物盐和醇盐的碱，或者包含无机酸或过氧化氢。当OY基团是磷酸盐时，裂解剂是磷酸酯酶。当OY基团是硫酸盐时，裂解剂是硫酸酯酶。当OY基团是糖苷基例如糖苷或半乳糖苷的部分时，裂解剂是相应的糖苷酶。

[0064]当可裂解连接体是用至少一个O、S或N原子取代的多电子C-C双键时，裂解剂是单态氧。该双键基团与单态氧的反应产生不稳定的1，2-二氧杂环丁烷基团，其在环境温度或以上温度下自发碎裂。根据单态氧化领域中已知的方法，单态氧可以通过染料增感作用或通过热分解亚磷酸三苯酯臭氧化物或蒽内过氧化物(anthracene endoperoxide)而产生。

[0065]当可裂解连接体是如上所述的乙烯酮二硫缩醛时，裂解剂是过氧化物酶和过氧化氢。

[0066]当可裂解连接体是至少一个碳原子结合到三烷基或三芳基磷基的亚烷基基团时，通过与酮或醛的Wittig反应进行裂解。Wittig反应是熟知的反应，通过该反应，在有机溶剂中用强碱对季化合物脱质子化而产生磷叶立德。该叶立德与羰基化合物例如酮或醛的反应形成双键和氧化膦。在磷基和α碳之间的连接如下所示被断裂。优选地，α碳用基团取代，该基团使得结合的质子比磷原子上的R基团上的任何质子都更具有酸性。然后，叶立德形成和C-P键碎裂被指引至正确的部位。α碳上优选的取代基是苯基或取代的苯基、亚烷基、炔基或羰基。当季磷基为三芳基磷基例如三苯基磷基时，对α质子增强的酸度的要求不再重要。

[0067]优选的形成叶立德的碱是醇盐和氢化物盐，尤其是碱金属盐。优选的用于与叶立德反应的羰基化合物是脂族和芳族醛和脂族和芳族酮。更优选地，羰基化合物不具有降低反应速率的大基团。丙酮是最优选的。优选的溶剂是非质子有机溶剂，其可以溶解反应物而不消耗碱，包括THF、二乙醚、对二烷、DMF和DMSO。

[0068]裂解后从固相释放核酸的步骤包括，用溶解和充分保护释放的核酸的溶液洗脱。该溶液可以是试剂组合物，其包括含水缓冲液，具有7-9的pH、0.1-3M金属卤化物或醋酸盐以及1-50％的亲水有机助溶剂。更优选地，该亲水有机溶剂占约1-20％。金属卤化物盐包括碱金属盐、碱土金属盐。优选的盐是乙酸钠、NaCl、KCl和MgCl₂。亲水有机助溶剂是水溶性有机溶剂，并包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、乙二醇、丙二醇、丙三醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和对二烷。释放捕获的核酸的步骤可以是在裂解步骤之后或者与其同时发生。在后一种情况中，裂解剂也可以作为洗脱溶液起作用。

[0069]用于裂解后从固相释放核酸的试剂可以可选地是强碱水溶液。浓度为至少10-4M的碱金属氢氧化物或氢氧化铝的溶液对于从裂解的固相洗脱核酸是有效的。

[0070]用于裂解后从固相释放核酸的试剂可以可选地是纯水或pH在约8至10之间的碱性缓冲液。此类碱性缓冲液的使用可以在可达100℃的温度下进行，以提高裂解的速率。中度碱性pH的缓冲液是有用的，尤其是当核酸是RNA时。在非常高的pH，尤其在高温下，RNA的延长的接触导致其降解。

[0071]裂解反应和释放(洗脱)步骤每一个都可以在室温下进行，但水的凝固点以上和水的沸点以下的任何温度都可以被使用。洗脱温度对于本分离核酸的方法的成功似乎并不是关键的。优选环境温度，但水的凝固点以上和水的沸点以下的任何温度都可以被使用。在一些情况下，升高的温度可以增加洗脱速率。释放或洗脱步骤可以进行一次，或者如果必要的话可以被重复1次或多次，以提高所释放核酸的量。

[0072]通过使用单独且不同的溶液来完成每一步骤，裂解反应和洗脱步骤可以作为连续的步骤实施。可选地，裂解和洗脱步骤可以在同一步骤中一起进行。当裂解反应条件采用了与洗脱的核酸的下游用途相容的试剂时，后者——同时发生的方法是优选的。例子是使用中度碱性的反应缓冲液以及甚至更强的氢氧化钠碱性溶液的裂解反应。前者——连续的方法在这样的情况下可以是期望的：其中裂解反应的试剂或溶剂的存在与核酸是不相容或是不期望的。该情况的例子是Wittig释放化学术。当裂解反应条件基本上不释放DNA到溶液中时，使用单独的裂解和洗脱溶液是可能的。

[0073]该方法可以进一步包括这样的步骤：用洗涤液洗涤具有结合到其上的、捕获的核酸的固相，以从固相中除去样品的其它组分。这些不期望的物质包括酶、其它类型的蛋白质、多糖、较低分子量的物质例如脂和酶抑制剂。通过上述的方法捕获在本发明的固相上的核酸，可以以捕获的形式用在杂交反应中，以杂交到标记或未标记的互补核酸。杂交反应在诊断测试中是有用的，用于检测捕获的核酸的存在或数量。杂交反应在固相核酸扩增过程中也是有用的。

[0074]对于结合和储存结合的核酸，固相核酸结合载体也是有用的。因此，提供了从样品捕获核酸的方法，包括从样品分离核酸的方法，包括：

a)提供固相，该固相包括：

包括基质的固体支持部分，所述基质选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物以及不溶的多糖，

用于吸引和结合核酸的核酸结合部分，和

可裂解连接体部分；和

b)混合所述固相和含有所述核酸的样品，以将所述核酸结合至固相上。

[0075]在优选的实施方式中，核酸结合部分或者是式QR₂ ⁺X^-的三元基——其中Q为S且R选自C₁-C₂₀烷基、芳烷基和芳基，或者是连接于基质表面上的式QR₃ ⁺X^-的季基，其中所述季基选自其中R选自C₄-C₂₀烷基、芳烷基和芳基的季铵基，以及其中R选自C₁-C₂₀烷基、芳烷基和芳基的季磷基，并且其中X是阴离子。

无裂解释放

[0076]已发现，结合至本发明的固体支持物上的核酸可以被制备，以通过与某些试剂组合物接触而释放所述核酸，其中，所述固体支持物具有作为可裂解连接体的亚烷基，所述亚烷基的至少一个碳原子或者结合到三烷基或三芳基磷基(即，借助这些固体支持物，通过与酮或醛的Wittig反应而实现裂解)，或者结合到三烷基铵基团。由于通过与现有技术中已知的、用于洗脱结合的核酸的许多其它试剂和组合物接触，并未从这些固相结合材料除去结合的核酸，该结果是意料之外的。

[0077]在本发明的另一个方面中，然后，提供了从样品分离核酸的方法，包括：

a)提供固相，该固相包括：

选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶的多糖的基质，和

结合至所述基质表面上的基，所述基选自其中R选自C₁-C₂₀烷基、芳烷基和芳基的式QR₂ ⁺X^-的三元锍基，其中R选自C₄-C₂₀烷基、芳烷基和芳基的式NR₃ ⁺X^-的季铵基，以及其中R选自C₁-C₂₀烷基、芳烷基和芳基的季基PR₃ ⁺X^-，并且其中X是阴离子；

b)混合所述固相和含有所述核酸的样品，以将所述核酸结合到所述固相上；

c)从所述固相分离所述样品；和

d)通过接触所述固相和试剂组合物从所述固相释放所述核酸，所述试剂组合

物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3M金属卤化物盐或醋酸盐以及1-50％的亲水性有机助溶剂。

[0078]从固相分离样品的步骤可以通过下列方法完成：例如过滤、重力沉降、倾析、磁力分离、离心、真空吸气、对空气或其它气体过压处理以使液体通过多孔膜或过滤毡片。该样品中除了核酸之外的组分在该步骤被除去。如果其它组分的除去是不完全的，可以进行另外的洗涤，以帮助它们的完全去除。

[0079]通过用试剂组合物洗脱，从固体支持物释放出结合至固体支持物的、捕获的核酸。该试剂组合物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3 M金属卤化物盐或醋酸盐以及1-50％的亲水性有机助溶剂。更优选地，该亲水性有机溶剂占约1-20％。金属卤化物盐包括碱金属盐和碱土金属盐。优选的盐是乙酸钠、NaCl、KCl和MgCl₂。亲水性有机助溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和对二烷。

[0080]洗脱组合物有利地允许在随后的下游过程中直接使用洗脱的核酸，而不需要在使用前蒸发溶剂或沉淀核酸。

[0081]通过用现有技术中已知的许多试剂和组合物进行洗涤以洗脱结合的核酸，令人惊奇地，结合的核酸并未从上面本发明的固相结合材料除去。固相材料对其有抗性的洗脱液包括下面的列表。该列表包括高pH、高离子强度和低离子强度条件。

去离子水H₂O

1M磷酸盐缓冲液，pH 6.7

0.1％十二烷基硫酸钠

0.1％十二烷基磷酸钠

3M乙酸钾，pH 5.5

TE(三羟甲基氨基甲烷(Tris)EDTA)缓冲液

50mM Tris，pH 8.5+1.25M NaCl

0.3M NaOH+1M NaCl

1M NaOH或

1M NaOH+1M H₂O₂

[0082]当使用如上所述的试剂组合物洗脱核酸时，洗脱温度对于本分离核酸的方法的成功似乎不是关键的。优选环境温度，但水的凝固点以上和水的沸点以下的任何温度都可以使用。在一些情况下，升高的温度可以增加洗脱的速率。

[0083]在本发明的另一方面，提供了从固相材料释放或洗脱结合的核酸分子的新的试剂组合物。本发明的组合物包括水溶液，具有7-9的pH、0.1-3 M金属卤化物盐或醋酸盐以及1-50％的亲水性有机助溶剂。更优选地，有机溶剂占约1-20％。亲水性有机助溶剂包括甲醇、乙醇、正丙醇、2-丙醇、叔丁醇、2-巯基乙醇、二硫苏糖醇、糠醇、2，2，2-三氟乙醇、丙酮、THF和对二烷。

[0084]这些试剂组合物的重要优势是它们与许多下游的分子生物学过程相容。在很多情况下，洗脱入如上所述的试剂组合物的核酸可以在进一步的过程中被直接使用。扩增反应例如PCR、美国专利5,998,175中描述的多寡聚体连接(Ligation ofMultiple Oligomers，LMO)、以及LCR可以采用此类核酸洗脱液。通过常规技术、尤其是从细菌培养物或从血样中分离的核酸，采用沉淀步骤。加入高体积百分比的低分子量醇，以从水溶液中沉淀核酸。然后，在使用前，沉淀的物质必须被分离、收集并重溶于合适的介质中。通过使用上述的试剂组合物，从本发明的固相结合材料洗脱核酸，这些步骤可以被免除。

[0085]样品——通过本发明的方法可以从其中分离核酸——包括含有一种或更多的核酸以及任选地含有其它物质的水溶液。代表性的例子包括核酸、扩增反应产物以及测序反应产物的水溶液。从细菌培养物、体液、血液和血液组分、组织提取物、植物材料以及环境样品得到的材料在使用前同样地被置于含水的溶液——优选缓冲的溶液中。

[0086]固相核酸捕获的方法可以被用于许多用途。如下面的具体例子所示，可以捕获和释放单链和双链核酸。可以捕获和释放DNA、RNA和PNA。第一用途是从细菌培养物中纯化质粒DNA。质粒DNA被用作克隆载体，以将含有具体基因或基因片段的重组DNA片段导入宿主，用于克隆。

[0087]第二用途是纯化PCR或其它扩增反应的扩增产物。这些反应可以是在交替的高温和低温之间进行热循环，例如LMO或PCR，或者它们可以在单一的温度下进行，例如核酸序列基扩增法(nucleic acid sequence-based amplication，NASBA)。所述反应可以使用各种扩增试剂和酶，包括DNA连接酶、RNA聚合酶和/或逆转录酶。可以使用本发明的方法纯化的多核苷酸扩增反应混合物包括：多寡聚体连接(LMO)、自动维持序列扩增(3SR)、链置换扩增(SDA)、“支链”DNA扩增(“branched chain”DNA amplication)、连接酶链反应(LCR)、QB复制酶扩增(QBreplicase amplication，QBR)、连接激活转录(“gation activated transcription，LAT)、核酸序列基扩增(NASBA)、修复链反应(repair chain reaction，RCR)、循环探针反应(CRP)和滚环扩增(RCA)。

[0088]第三用途是测序反应净化(sequencing reaction cleanup)。双脱氧终止测序反应产生多核苷酸序列梯度，所述序列梯度由用dNTPs和四种反应混合物的每一种中的一种ddNTP的混合物延伸引物而产生。标记每一种中的ddNTP，通常用不同的荧光染料标记。反应混合物包含过量的dNTPs和标记的ddNTP、聚合酶和辅因子例如ATP。序列分析之前除去在后的物质是有利的。

[0089]第四用途是从全血中分离DNA。用通常使用的技术从白细胞提取DNA。通常，处理血液，以选择性溶解红细胞，并且在沉淀或离心步骤之后，单独溶解完整的白细胞以暴露核酸内容物。消化蛋白质，并且得到的DNA用固相分离，随后用于序列多态性的测定、序列分析、RFLP分析、突变检测或其它类型的诊断试验。

[0090]第五用途是从DNA和RNA的混合物中分离DNA。涉及强碱性洗脱条件的本发明的方法，尤其是使用高温的那些方法，可以降解或破坏存在的RNA同时保持DNA的完整性。涉及强碱性裂解反应的方法将类似地起作用。

[0091]另外的用途包括从其它样品——土壤、植物、细菌和废水中提取核酸物质，以及为了存档的目的对核酸材料进行长期保存。

[0092]本发明的可裂解固体支持物的另一个优势是从支持物释放的核酸被包含于溶液中，所述溶液与许多下游的分子生物学方法相容。在许多情况下，或者被洗脱到包含裂解剂的溶液——当固相包含可裂解连接体时——中，或者被洗脱到上述的试剂组合物中的核酸，可以被直接用于进一步的过程中。这些过程包括使用聚合酶和连接酶的核酸扩增反应。典型的扩增反应是PCR、美国专利5,998,175中描述的多寡聚体连接(LMO)、以及LCR。已经发现，使用含有释放的核酸的溶液与酶促反应或其它反应相容，并基本上不干扰酶促反应和其它反应。其它的下游过程被如上描述，并包括核酸杂交试验、突变检测和序列分析。

[0093]因此，本发明的又一方面包括使用可裂解固相结合材料分离和纯化核酸的方法。在一个实施方式中，提供了从样品分离核酸的方法，包括：

a)提供固相，其包括：

用于吸引和结合核酸的核酸结合部分，和

可裂解连接体部分；

b)混合所述固相和含有核酸的样品，以将核酸结合到固相上；

c)从所述固相分离所述样品；

d)裂解所述可裂解连接体；

e)从所述固相释放所述核酸，进入溶液；和

f)进一步包括在下游过程中直接使用含有所述释放的核酸的溶液。在核酸扩增反应中直接使用含有所释放的核酸的溶液是优选的实践，由此，使用聚合酶或连接酶介导的反应，核酸或它们的片段的数量得以扩增。

[0094]下面的实施例被呈现，目的在于更充分地描述本发明的各个方面，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。

实施例

[0095]当存在于下面的实施例中时，结构图旨在仅仅说明固相材料的可裂解部分。所述图不代表固相材料的完整定义。

实施例1.含三丁基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。

[0096]在氩填塞(argon pad)下，在200mL CH₂Cl₂/DMF(50/50)中，搅拌Merrifield肽树脂(Merrifield peptide resin)(Sigma，1.1meq/g，20.0g)，其为交联的氯甲基化聚苯乙烯。加入过量的三丁基膦(48.1g，10当量)，并在室温下搅拌浆液7天。过滤该浆液，并用200mL CH₂Cl₂洗涤所得到的固体2次。在真空下干燥树脂(21.5g)。元素分析：观察到的(Found)P 2.52％，Cl3.08％；期望的(Expected)P2.79％，Cl 3.19％：P/Cl比率为0.94。

实施例2.含三辛基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。

[0097]在氩填塞下，在200mL CH₂Cl₂/DMF(50/50)中，搅拌Merrifield肽树脂(Sigma，1.1meq/g，20.0g)。加入过量的三辛基膦(92.4g，10当量)，并在室温下搅拌浆液7天。过滤该浆液并用200mL CH₂Cl₂洗涤所得到的固体3次。在真空下干燥树脂(21.3g)。元素分析：观察到的P 2.28％，Cl 2.77％；期望的P 2.77％，Cl 2.42％：P/Cl比率为0.94。

实施例3.含三甲基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。

[0098]在氩填塞下，在50mL CH₂Cl₂中，搅拌Merrifield肽树脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入1.0M在THF中的三甲基膦(Aldrich，12mL)溶液，并在室温下搅拌浆液7天。加入另外的100mL CH₂Cl₂和1.2mL在THF中的1.0M三甲基膦溶液，并搅拌该浆液3天。过滤该浆液，并用125mL CH₂Cl₂洗涤所得到的固体，随后用375mL甲醇洗涤。在真空下干燥树脂(5g)。在使用前将该树脂研磨成细粉。

实施例4.含三苯基磷基的聚苯乙烯聚合物的合成。

[0099]在氩填塞下，在40mL CH₂Cl₂中，搅拌Merrifield肽树脂(ICNBiomedical，1.6meq/g，5.0g)。加入三苯基膦(Aldrich，3.2g)，并在室温下搅拌浆液5天。过滤该浆液，并依次用CH₂Cl₂、MeOH和CH₂Cl₂洗涤所得到的固体。在真空下干燥树脂(5.4g)。

实施例5.含三丁基铵基团的聚苯乙烯聚合物的合成。

[0100]在氩填塞下，在150mL CH₂Cl₂中，搅拌Merrifield肽树脂(Aldrich，1.43meq/g，25.1g)。加入过量的三丁基胺(25.6g，4当量)，并在室温下搅拌浆液8天。过滤该浆液，并用250mL CH₂Cl₂洗涤所得到的固体2次。在真空下干燥树脂(28.9g)。元素分析：观察到的N 1.18％，Cl 3.40％；期望的N 1.58％，Cl 4.01％：N/Cl比率为0.88。

实施例6.含2-(三丁基磷)乙酰基基团的聚苯乙烯聚合物的合成。

[0101]在氩填塞下，将氯乙酰基聚苯乙烯珠(Advanced Chemtech，3.0g，3.4meq/g)加入到50mL CH₂Cl₂中的三丁基膦(4.1g，2当量)的溶液中。搅拌浆液1周。过滤该浆液，并依次用CH₂Cl₂(4×25mL)、MeOH(2×25mL)和丙酮(4×25mL)洗涤所得到的固体。然后，风干该树脂。

实施例7.具有含聚乙烯基苯基三丁基磷基团的聚合物层的磁性颗粒的合成

[0102]在玻璃瓶中，将磁性Merrifield肽树脂(Chemicell，SiMag Chloromethyl，100mg)加至2mL CH₂Cl₂中。加入三丁基膦(80μL)，并在室温下摇动浆液3天。在该瓶下放置磁体，并用移液管除去上清液。用2mL CH₂Cl₂洗涤固体4次(洗涤液也通过磁体/移液管步骤除去)。风干该树脂(93mg)。

实施例8-Br.含三丁基磷基团和溴化物阴离子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0103]用35mL SOCl₂回流聚甲基丙烯酸树脂4小时，以形成酰基氯。在氩下，在冰水浴中，于100mL CH₂Cl₂中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(4.8g)和三乙胺(11.1g)。加入3-溴丙醇(9.0g)并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用40mL CH₂Cl₂洗涤该树脂3次。风干该树脂(8.7g)。

[0104]在氩下，于100mL CH₂Cl₂中，重悬并搅拌该树脂(8.5g)。加入三丁基膦(16.2g)并搅拌该浆液7天。过滤该浆液，并用100mL CH₂Cl₂洗涤该树脂3次。然后，风干该树脂(5.0g)。

实施例 8-Cl.含三丁基磷基团和氯化物阴离子的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0105]在氩下，在冰水浴中，于100mL CH₂Cl₂中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(12.2g)和三乙胺(23.2g)。加入3-氯丙醇(12.8g)并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用100mL CH₂Cl₂洗涤该树脂3次。风干该树脂(12.8g)。

[0106]在氩下，于100mL CH₂Cl₂中，重悬并搅拌该树脂(12.8g)。加入三丁基膦(27.8g)并搅拌该浆液7天。过滤该浆液，并用2×100mL CH₂Cl₂和2×100mLMeOH洗涤该树脂。然后，风干该树脂(9.8g)。

实施例8-S.含三丁基磷基团和烷基硫酯(alkylthioester)键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0107]在氩下，在冰水浴中，于20mL CH₂Cl₂中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(3.6g)和三乙胺(8.9g)。加入稀释于20mL CH₂Cl₂的3-巯基-1-丙醇(5.8g)并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用CH₂Cl₂、水和甲醇洗涤该树脂。风干该树脂(3.5g)。

[0108]在氩下，于100mL干燥的乙腈中，重悬并搅拌该树脂(4.3g)。加入四溴化碳(14.9g)和三苯基膦(11.8g)。回流该混合物5小时。过滤该浆液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后，风干该树脂(4.2g)。

[0109]在氩下，于40mL CH₂Cl₂中，重悬并搅拌该树脂(4.2g)。加入三丁基膦(6.7g)并搅拌该浆液8天。过滤该浆液，并用90mL CH₂Cl₂以及随后用50mLMeOH洗涤该树脂。然后，风干该树脂(4.0g)。

实施例9.含三丁基磷基团和酯键的聚乙烯基苯基聚合物的合成。

[0110]在氩下，在冰水浴中，于50mL乙腈中，搅拌聚苯乙烯丙烯酸羟甲酯树脂(polystyrene hydroxymethylacrylate resin)(5.0g)。在氩下搅拌三丁基膦(2.1g)和4.0M HCl(2.5mL)15分钟。在1小时内，以4等份将此溶液加入到该树脂浆液中。除去冰水浴并在室温下搅拌浆液3小时。过滤浆液，并用50mL乙腈随后用2个50mL份的CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后，风干该树脂(6.24g)。

实施例10.含三丁基磷基团和酯键的聚乙烯基苯基聚合物的合成。

[0111]在氩下，在冰水浴中，于100mL CH₂Cl₂中搅拌羟甲基化聚苯乙烯(Aldrich，2.0meq/g，5.0g)和三乙胺(2.3g)。加入氯乙酰氯(1.9g)并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤浆液，并用40mL CH₂Cl₂洗涤该树脂3次。风干该树脂(5.8g)。

[0112]在氩下于100mL CH₂Cl₂中，重悬并搅拌该树脂(5.8g)。加入三丁基膦(3.2g)并搅拌该浆液7天。过滤该浆液，并用100mL CH₂Cl₂洗涤该树脂2次。然后，风干该树脂(5.9g)。

实施例11.含三丁基磷基团和2个酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成

[0113]在氩下，在冰水浴中，于50mLCH₂Cl₂中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂和吡啶。加入四氟氢醌(2.7g)并除去冰水浴。在室温下搅拌浆液43小时。过滤浆液，并依次用CH₂Cl₂、水、MeOH和CH₂Cl₂洗涤该树脂。风干该树脂(1.3g)。

[0114]在氩下，在冰水浴中，于30mL CH₂Cl₂中搅拌该树脂和三乙胺(662mg)。加入4-溴丁酰氯(1.12g)并除去冰水浴。在室温下搅拌该浆液2天。过滤该浆液，并依次用CH2Cl2、水、MeOH和CH₂Cl₂洗涤该树脂。风干该树脂(1.3g)。

[0115]在氩下于18mL CH₂Cl₂中重悬并搅拌该树脂。加入三丁基膦(4.7g)并搅拌该浆液10天。过滤该浆液并依次用CH₂Cl₂、MeOH和CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后风干该树脂(1.3g)。

实施例12.含三丁基磷基团和酯键的可光裂解的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0116]在氩下，在冰水浴中，于25mL CH₂Cl₂中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(2.0g)和三乙胺(4.2g)。在100mL CH₂Cl₂中稀释[4，5-双(4-溴-1-丁氧基)-2-硝基苯基]-苯基甲醇(16.7g)并将其加入。除去冰水浴，并在室温下过夜搅拌浆液。过滤浆液，并用100mL CH₂Cl₂洗涤该树脂2次。风干该树脂(2.5g)。

[0117]在氩下于50mL CH₂Cl₂中，重悬并搅拌该树脂(2.5g)。加入三丁基膦(4.0g)并搅拌该浆液7天。过滤该浆液，并用50mL CH₂Cl₂洗涤该树脂2次。然后，风干该树脂(2.4g)。

实施例13.含三丁基磷基团和芳基硫酯(arylthioester)键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0118]在氩下，在冰水浴中，于25mL CH₂Cl₂中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(2.7g)和三乙胺(8.6g)。加入稀释于20mL CH₂Cl₂中的2-巯基苄醇(5.0g)，并除去冰水浴。在室温下搅拌浆液2天。用50mL CH₂Cl₂稀释浆液，并在6000rpm下离心10分钟。丢弃上清。用100mL MeOH洗涤该树脂3次(在6000rpm下离心每一洗涤液10分钟)。在最后一次洗涤后，过滤该树脂并风干(4.2g)。

[0119]在氩下于100mL干乙腈中，重悬并搅拌该树脂(3.4g)。加入四溴化碳(10.2g)和三苯基膦(8.0g)。回流该混合物4小时。过滤该浆液，并用125mL乙腈、250mL MeOH和250mL CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后风干该树脂(2.8g)。

[0120]在氩下于40mL CH₂Cl₂中，重悬并搅拌该树脂(2.8g)。加入三丁基膦(4.0g)并搅拌浆液8天。过滤该浆液，并用50mL CH₂Cl₂随后用125mL MeOH洗涤该树脂。然后风干该树脂(2.7g)。

实施例14.含三甲基磷基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0121]在氩下于100mL CH₂Cl₂中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巯基苄醇(9.3g)并在室温下搅拌浆液5天。过滤该浆液，并用300mL CH2Cl2、500mL水和200mL MeOH洗涤该树脂。风干该树脂(5.8g)。

[0122]在氩下于100mL干燥的乙腈中，重悬并搅拌该树脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)。回流该混合物4小时。过滤该浆液，并用100mL乙腈、200mL CH₂Cl₂、200mL MeOH和200mL CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后，风干该树脂(4.8g)。

[0123]在氩下于30mL CH₂Cl₂中，重悬并搅拌该树脂(1.04g)。加入于THF中的1.0M三甲基膦溶液(7.3mL)，并搅拌浆液10天。过滤该浆液，并用100mLCH₂Cl₂、100mL THF、50mL MeOH和100mL CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后风干该树脂(1.10g)。

实施例15.含三辛基磷基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0124]在氩下于100mL CH₂Cl₂中，搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(5.1g)和三乙胺(12.3g)。加入2-巯基苄醇(9.3g)并在室温下搅拌浆液5天。过滤该浆液，并用300mL CH₂Cl₂、500mL水和200mL MeOH洗涤该树脂。风干该树脂(5.8g)。

[0125]在氩下于100mL干燥的乙腈中，重悬并搅拌该树脂(4.8g)。加入四溴化碳(14.3g)和三苯基膦(11.3g)。回流该混合物4小时。过滤该浆液，并用100mL乙腈、200mL CH₂Cl₂、200mL MeOH和200mL CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后，风干该树脂(4.8g)。

[0126]在氩下于30mL CH₂Cl₂中，重悬并搅拌该树脂(1.68g)。加入三辛基膦(4.4g)并搅拌浆液10天。过滤该浆液，并用100mL CH₂Cl₂、100mL THF、50mLMeOH和100mL CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后风干该树脂(1.67g)。

实施例16.用聚甲基丙烯酸酯连接体官能化的、并含有三丁基磷基团和芳基硫酯键的磁性二氧化硅颗粒的合成

[0127]将磁性的羧酸官能化的二氧化硅颗粒(Chemicell，SiMag-TCL，1.0meq/g，0.6g)置于6mL亚硫酰氯中并回流3小时。减压下除去过量的亚硫酰氯。在氩下，在冰水浴中，将树脂重悬于40mL CH₂Cl₂中。加入三乙胺(1.2g)。加入2-巯基苄醇(0.7g)并除去冰水浴。在室温下过夜摇动该浆液。过滤该浆液，并用35mL MeOH以5000rpm离心树脂10分钟。弃上清液。橙黄色的树脂被风干(335mg)。

[0128]在氩下于45mL干燥的乙腈中重悬该树脂(335mg)。加入四溴化碳(2.0g)和三苯基膦(1.6g)。回流混合物3小时。以5000rpm离心该树脂10分钟，并丢弃上清。用50mL乙腈以5000rpm离心该树脂10分钟，2次，并丢弃上清。然后，风干该树脂(328mg)。

[0129]在氩下于40mL CH₂Cl₂中重悬该树脂(328mg)。加入三丁基膦(280mg)并摇动浆液10天。通过在瓶的外部放置磁体沉降磁性树脂，并倾析上清。用30mLCH₂Cl₂洗涤该树脂3次，随后用25mL MeOH洗涤3次。然后，风干该树脂(328mg)。

实施例17.含有三丁基磷基团和芳基硫酯键的磁性聚合甲基丙烯酸酯颗粒的合成。

[0130]Sera-Mag^TM磁性羧酸酯微粒(Seradyn)被用于形成可裂解磁性颗粒。Sera-Mag颗粒包括聚苯乙烯-丙烯酸聚合物芯，其被用专用聚合物包封的磁铁矿包覆层包围。羧酸酯基团在表面上是可及的。颗粒(0.52meq/g，0.50g)被悬浮于15mL水和25mL 0.1M MES缓冲液中(pH 4.0)。在加入126mg EDC(1-[3-二甲氨基]丙基)-3-乙基碳二亚胺氢氯化物)和110mg 2-巯基苄醇之前，对该反应混合物超声处理5分钟。摇动该反应混合物7天。过滤该反应混合物。用50mL水和100mLMeOH洗涤该树脂。风干该树脂(0.53g)。

[0131]在氩下于20mL干燥的乙腈中重悬该树脂(0.53g)。加入四溴化碳(174mg)和三苯基膦(138mg)。在65℃下超声处理该混合物5小时。将反应混合物置于大磁体上并倾析上清。用乙腈洗涤该树脂4次，用磁体沉淀该树脂，并丢弃洗涤液。将该树脂重悬于MeOH中并摇动过夜。用MeOH洗涤该树脂4次，用磁体沉淀该树脂，并丢弃洗涤液。然后，风干该树脂(0.52g)。

[0132]将该树脂(0.52g)重悬于10mL乙腈中。加入三丁基膦(106mg)并摇动该反应7天。用磁体沉淀该磁性树脂并倾析上清。用乙腈洗涤该树脂4次并用MeOH洗涤4次。然后，风干该树脂(0.51g)。

实施例18.含三丁基磷基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0133]在氩下，在冰水浴中，于30mL CH₂Cl₂中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(0.6g)和三乙胺(1.5g)。加入稀释于20mL CH₂Cl₂中的4-巯基苄醇(1.0g)并除去冰水浴。在室温下搅拌浆液2天。过滤该浆液，并用50mL CH₂Cl₂、100mL水、50mLMeOH和25mL CH₂Cl₂洗涤该树脂。风干该树脂(0.7g)。

[0134]在氩下于20mL干燥的乙腈中重悬该树脂(0.6g)。加入四溴化碳(1.8g)和三苯基膦(1.4g)。回流该混合物3小时。过滤该浆液，并用乙腈、MeOH和CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后，风干该树脂(0.6g)。

[0135]在氩下于15mL CH₂Cl₂中重悬并搅拌该树脂(0.6g)。加入三丁基膦(0.85g)并搅拌浆液6天。过滤该浆液，并用75mL CH₂Cl₂随后用150mL MeOH洗涤该树脂。然后，风干该树脂(0.6g)。

实施例19.含三丁基磷基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0136]在氩下，于100mL CH₂Cl₂中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(0.71g)和三乙胺(2.2g)。加入4-羟基苯基4-溴硫代丁酸酯(2.55g)并在室温下搅拌浆液5天。过滤该浆液，并用CH₂Cl₂和己烷洗涤。风干该树脂(0.85g)。

[0137]在氩下于20mL CH₂Cl₂中重悬并搅拌该树脂(0.85g)。加入三丁基膦(2.7g)并搅拌浆液3天。过滤该浆液，并用CH₂Cl₂和己烷洗涤该树脂。然后，风干该树脂。

实施例20.含三丁基磷基团和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0138]在氩下，于20mL CH₂Cl₂中搅拌聚甲基丙烯酰氯树脂(1.0g)和吡啶(1.9mL)。加入1，4-苯二硫醇(1.85g)并在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用CH₂Cl₂和己烷洗涤。风干该树脂(1.08g)。

[0139]在氩下于20mL CH2Cl2中搅拌该树脂(1.08g)和三乙胺(3.0mL)。加入4-溴丁酰氯(1.8mL)并搅拌反应混合物2天。过滤该浆液并用CH₂Cl₂洗涤。风干该树脂(1.10g)。

[0140]在氩下于30mL CH₂Cl₂中重悬并搅拌该树脂(1.10g)。加入三丁基膦(4.0g)并搅拌浆液5天。过滤该浆液并用CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后，风干该树脂(1.0g)。

实施例21.含三丁基磷基团的交联的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物的合成。

[0141]在30mL亚硫酰氯中回流TentaGel S COOH珠(Advanced Chemtech，3.0g)——交联的聚苯乙烯聚乙二醇琥珀酸酯共聚物90分钟。在减压下除去残余的亚硫酰氯。该树脂重悬于30mL氯仿中并再浓缩。

[0142]在氩下，在冰水浴中，于60mL CH₂Cl₂中搅拌该树脂和三乙胺(0.14g)。加入2-巯基苄醇(0.11g)并除去冰水浴。在室温下搅拌浆液2天。过滤该浆液，并用CH₂Cl₂、水、MeOH和CH₂Cl₂洗涤该树脂。过滤并风干该树脂(2.9g)。

[0143]在氩下于60mL干燥的乙腈中重悬并搅拌该树脂(2.8g)。加入四溴化碳(0.36g)和三苯基膦(0.29g)。回流该混合物4小时。过滤该浆液，并用乙腈、MeOH和CH₂Cl₂洗涤该树脂。然后，风干该树脂(2.8g)。

[0144]在氩下于50mL CH₂Cl₂中重悬并搅拌该树脂(2.7g)。加入三丁基膦(0.21g)并搅拌浆液6天。过滤该浆液，并用50mLCH₂Cl₂随后用175mL MeOH洗涤该树脂。然后，风干该树脂(2.8g)。

实施例22.含有琥珀酸酯连接的三丁基磷基团和硫酯键的可控多孔玻璃珠的合成。

[0145]将Millipore LCAA玻璃(1.0g，38.5微摩尔/克)悬浮于10mL干燥的吡啶中。加入琥珀酸酐(40mg)并在室温下摇动反应混合物4天。用20mL MeOH稀释该反应混合物，并过滤该混合物。用20mL MeOH洗涤固体5次，并用20mLCH₂Cl₂洗涤5次。风干该固体(1.0g)。

[0146]将该固体(0.50g)悬浮于10mL干燥的CH₂Cl₂中。加入二环己基碳二亚胺(10mg)和2-巯基苄醇，并在室温下摇动反应混合物6天。用CH₂Cl₂稀释该反应混合物并过滤该混合物。用MeOH洗涤固体3次并用CH₂Cl₂洗涤3次。风干该固体(0.50g)。

[0147]在氩下于10mL干燥的乙腈中重悬该固体(400mg)。加入4-溴化碳(14mg)和三苯基膦(11mg)。回流该混合物3小时。过滤该混合物，并用50mL MeOH洗涤固体5次，以及用50mL CH₂Cl₂洗涤5次。风干该固体(360mg)。

[0148]在氩下于10mL CH₂Cl₂中重悬该固体(300mg)。加入三丁基膦(5滴)并摇动反应混合物5天。用CH₂Cl₂稀释该反应混合物并过滤。用50mL CH₂Cl₂洗涤该固体5次并风干(300mg)。

实施例23.含吖啶酯(acridinium ester)基团的聚乙烯基苄基聚合物的合成。

[0149]在氩下，在冰水浴中，于40mL CH₂Cl₂中搅拌吖啶9-羧酸氯化物(Acridine 9-carboxylic acid chloride)(1.25g)和三乙胺(1.3g)。加入羟基苯硫酚树脂(Polymer Laboratories，1.67meq/g，3.0g)，并除去冰水浴。在室温下过夜搅拌浆液。过滤该浆液，并用200mL CH₂Cl₂洗涤该树脂3次。风干该树脂(4.4g)。

[0150]在氩下于40mL CH₂Cl₂中搅拌该树脂(4.3g)。加入三氟甲基磺酸甲酯(methyl triflate)(6.1g)并搅拌反应混合物2天。过滤该浆液并用200mL CH₂Cl₂和1LMeOH洗涤该树脂。真空干燥该树脂(4.7g)。

实施例24.含910-二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛(acridan ketene dithioacetal)基团的聚乙烯基苄基聚合物的合成。

[0151]在氩下，在-78℃下，于20mL无水THF中搅拌N-苯基9，10-二氢化吖啶(0.62g)。加入丁基锂(2.5M，在己烷中，0.93mL)并于-78℃搅拌反应混合物2小时。加入二硫化碳(0.16mL)并于-78℃搅拌反应混合物1小时。将反应混合物温热至室温。加入Merrifield’s肽树脂(1.6meq/g，1.0g)并在室温下过夜搅拌该混合物。过滤该混合物。用10mL丙酮洗涤树脂5次，用10mL水洗涤3次以及用10mL丙酮洗涤2次。风干该树脂(1.21g)。

[0152]在氩下于20mL无水DMF中搅拌该树脂(1.21g)和NaH(60％，在油中，0.003g)4小时。加入1，3-二溴丙烷(0.07mL)并搅拌混合物3天。过滤该混合物。用10mL丙酮洗涤树脂3次，用10mL水洗涤5次以及用10mL丙酮洗涤5次。风干该树脂(1.22g)。

[0153]在氩下于20mL DMF中重悬并搅拌该树脂(1.22g)。加入三丁基膦(1.18g)并搅拌浆液7天。过滤该浆液并用20mL CH₂Cl₂洗涤该树脂4次以及用20mL丙酮洗涤4次。然后，风干该树脂(1.07g)。

实施例25.从可水解裂解颗粒结合并洗脱DNA的一般步聚

[0154]在管中用500μLTHF漂洗10mg珠样品。离心内容物并除去液体。用200μL水重复漂洗过程。将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL含水NaOH于37℃温育5分钟洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于分析。

实施例26.荧光测定步骤

[0155]通过荧光测定，使用PicoGreen对DNA进行染色而分析上清液和洗脱剂中DNA含量。简要地，将10μL含有或疑似含有DNA的溶液等分试样与190μL荧光DNA“染色”液温育。荧光染色剂为在0.1M tris，pH 7.5，1mM EDTA中以1∶400稀释的PicoGreen(Molecular Probes)。在温育样品至少15分钟后，在微量板荧光分析仪(microplate fluorometer)(Fluoroskan，LabSystems)中测量荧光。滤片组为480nm和535nm。含有已知量的相同DNA的阳性对照以及阴性对照被同时进行。

实施例27.从可裂解珠结合和释放DNA

[0156]通过荧光测定，便用PicoGreen(Molecular Probes)对DNA进行染色而分析上清液和洗脱剂中DNA含量。结果通过与用原始的2μg DNA溶液的等分试样获得的值相比较来表示。对结合步骤的洗涤液和上清液的分析确定了被珠捕获的DNA的百分比。

实施例#的珠 [NaOH](M) 结合％释放％

11 0.005 36 33

13 1 100 100

14 1 36 100

15 1 100 100

18 1 100 78

19 0.1 100 100

20 0.05 100 79

21 1 100 77

22 1 100 72

实施例28.洗脱时间和温度对于从可裂解颗粒洗脱DNA的效应

[0157]根据实施例25的方案处理实施例13的珠。在室温下或者37℃，将DNA结合珠与1M NaOH温育1、5或10分钟的时间期间，并通过荧光测定释放的DNA分数。

洗脱时间室温 37℃

1分钟 80％ 100％

5 90 90

10 90 120

实施例29.使用离心柱从可裂解珠结合和释放DNA

[0158]将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL离心柱(Costar)中的20mg珠。在温育2分钟后，离心该柱30秒并收集上清。用2×200μL水洗涤珠并丢弃洗涤液。通过下述步骤洗脱DNA：用200μL0.5M NaOH于37℃洗涤珠1分钟、离心30秒并收集洗脱液，用于荧光和凝胶电泳分析。直接使用洗脱液而不需要沉淀DNA，通过PCR扩增洗脱的DNA。

实施例30.从实施例13的可裂解珠结合并释放的质粒DNA的PCR扩增

[0159]在0.5M NaOH中的前一实施例的洗脱的DNA(1μL)经受用1对引物进行的PCR扩增，其产生285bp的扩增子。PCR反应混合物含有下表中所列出的组分。

组分体积(μL)

10×PCR缓冲液 10

引物1 8

引物2 8

2.5mM dNTPs 8

50mM MgCl₂ 5

Taq DNA聚合酶 0.5

模板 1或2

去离子水 59.5或58.5

[0160]阴性对照用1或2μL 0.5M NaOH或1μL水替换反应混合物中的模板。进一步的反应使用1μL以1∶10稀释于水中的模板。反应混合物经受22个循环：94℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，1分钟。反应产物在1％琼脂糖凝胶上跑胶。

图3说明了从珠洗脱的DNA是完整的。

实施例31.用实施例13的三丁基磷珠结合不同长度的寡核苷酸并用1M NaOH释放。

[0161]对从20个碱基至2.7kb的不同大小的寡核苷酸进行实施例25的结合和释放方案。用200μL 1M NaOH于37℃裂解该珠5分钟。使用ssDNA的荧光染色剂——OliGreen荧光测定DNA的量。

寡核苷酸大小(nt) 洗脱％

20 61

30 65

50 64

68 48

181 47

424 52

753 70

2.7kb 51

[0162]在室温下，使用30分钟的珠反应，重复进行试验以裂解聚合物，产生了如下结果。

寡核苷酸大小(nt) 洗脱％

20 73

30 113

50 97

68 109

实施例32.从实施例16的磁性可裂解珠结合和释放DNA

[0163]将2μL线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg可裂解磁珠，并轻轻摇动该混合物20分钟。磁分离该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠与2×200μL 0.5M NaOH于37℃温育5分钟来洗脱DNA。离心该混合物并移出洗涤液，用于荧光分析。所有的DNA都结合于该珠。第一洗脱液含有92％的结合DNA；第二洗脱液含有13％。

实施例33.从实施例17的磁性可裂解珠结合和释放DNA

[0164]按照相同的步骤，实施例17的可裂解磁珠被用于结合和释放2μg的线性化pUC18 DNA。对结合步骤中的上清液的分析揭示了DNA被完全结合。在从珠释放后对洗脱液的分析表明完整的DNA被洗脱。

实施例34.实施例16的磁珠的结合容量

[0165]下表中列出的各种量的DNA被结合于实施例16的可裂解磁珠，并如上所述用0.5M NaOH洗脱。荧光测定上清液和洗脱液，以评价结合容量和释放不同量的DNA的能力。

输入DNA的量结合％洗脱％

2 100 83

4 100 83

6 100 84

10 100 90

14 100 100

实施例35.用较小的洗脱体积释放结合于实施例13的可裂解珠上的DNA

[0166]将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL离心柱(Costar)中的10mg珠。在温育5分钟后，离心该柱1分钟并收集上清。用2×200μL水洗涤珠并丢弃洗涤液。如下洗脱DNA 3次：通过每次用40μL 0.5M NaOH于37℃洗涤珠5分钟、离心30秒、并在每一次洗脱后收集洗脱液用于荧光和凝胶电泳分析。所有起始DNA都被结合。发现洗脱液分别含有65％、22％和9％。

实施例36.将大体积中的DNA结合至实施例16的可裂解磁珠上并用小洗脱体积释放。

[0167]将2μg线性化pUC18 DNA在1mL、2mL或10mL水中的溶液加至10mg实施例16的可裂解磁珠，并如上所述用200μL 0.5M NaOH于37℃洗脱5分钟。将来自1mL和2mL结合反应的上清液浓缩至大约(ca.)100μL，用于分析。所有三个操作的洗脱液同样被荧光测定。上清液不含DNA。所有洗脱液含有＞80％的起始DNA。

实施例37.用实施例13的聚合物珠分离细菌培养物的DNA。

[0168]使大肠杆菌(E.coli)培养物过夜生长。在4℃下以6000×g离心50mL的部分15分钟，以沉淀细胞。该沉淀被重悬于4mL 50mM tris，pH 8.0，10mMEDTA中，其含有100μg/mL RNase A。然后，将4mL含有1％SDS的0.2M NaOH溶液加至该混合物，其被轻轻混合并在室温下保持4分钟。接下来，加入4mL冷却至4℃、pH 5.5的3M KOAc，混合该溶液并使其保持10分钟，以沉淀SDS。过滤出沉淀物并收集滤液。

[0169]混合以1∶10稀释于水(200μL)中的裂解物和10mg实施例13的珠，并温育20分钟。纯化的pUC18溶液——在细胞裂解液中为0.33μg/μL——也被制备，并结合于10mg相同的珠上。结合后，离心该珠并除去上清。用2×200μL水洗涤珠样品，然后用200μL 5mM NaOH于37℃洗脱5分钟。凝胶电泳显示出质粒DNA从裂解物回收，其与结合于磁珠并释放的质粒对照或在游离的溶液中的质粒对照匹配。结果示于图4中。

实施例38.用实施例19的聚合物珠分离细菌培养物的DNA

[0170]根据上述的相同方案，使用实施例19的珠，分离前一实施例的细胞裂解物中的DNA。结果在实施例37中。结果示于图4中。

实施例39.从不同的pH 溶液将DNA结合至实施例13的珠上，显示出在宽范围的pH内的有效捕获。

[0171]制备pH跨度为4.5至9.0的缓冲液。具有pH 4.5至6.5的缓冲液为10mM乙酸盐缓冲液。具有pH 7.0至9.0的缓冲液为10mM tris乙酸盐缓冲液。在室温下，将2μg线性化pUC18 DNA在200μL每一缓冲液中的溶液加至10mg实施例13的可裂解珠30-45秒。在每一缓冲液中，平行运行阴性对照溶液，其不含DNA。在将珠样品离心后除去上清，并用UV和荧光分析。

缓冲液pH 结合％(通过UV) 结合％(通过荧光)

4.5 56 73

5.0 64 68

5.5 58 64

6.0 61 71

6.5 57 74

7.0 49 61

7.5 44 60

8.0 45 55

8.5 37 39

9.0 31 33

单独地，发现在pH 8.0下使用20mg珠结合5分钟导致100％的DNA捕获。

实施例40.通过使用不同碱性溶液进行水解，从可裂解珠释放DNA

[0172]将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg实施例13、18、19和20的可裂解珠，并用200μL下面列出的不同浓度的NaOH溶液于37℃洗脱5分钟。实施例13的珠也被用KOH和NH₄OH溶液裂解。通过凝胶测定所有试验的洗脱液。所测试的所有水解条件都导致裂解和DNA的释放。

碱浓度(M)

NaOH 0.005

`` 0.01

`` 0.05

`` 0.1

`` 0.5

`` 1.0

KOH 0.5

NH₄OH 0.5

`` 1.0

实施例41.从实施例8-Br和8-S的可裂解珠结合和释放DNA

[0173]在管中用500μL THF漂洗两种中珠中的每一种的25mg样品。离心内容物并除去液体。用500μL水重复该漂洗过程。将16μg线性化pUC18 DNA在500μL水中的溶液加至所述珠，并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清。用2×500μL水漂洗所述珠并丢弃水。通过将所述珠与500μL 1M NaOH于37℃温育16小时而洗脱DNA。离心该混合物并除去洗脱液，用于进行荧光分析。上清不含有DNA，所有DNA都被结合。发现洗脱液含有18％(8-Br)和12％(8-S)。

实施例42.从实施例13的可裂解珠洗脱的DNA在LMO扩增中的使用

[0174]将在200μL水中的、含有0.1或1μg pUC18 DNA的溶液加至先前用400μLTHF洗涤、然后用水洗涤2次的10mg珠。在温育30分钟之后，离心样品管30秒并收集上清。用2×400μL水洗涤所述珠并丢弃洗涤液。通过在室温下用100μL 1M NaOH洗涤所述珠15分钟、离心30秒并收集洗脱液而洗脱DNA。用40μL 1M乙酸中和每一洗脱液的80μL的部分。

[0175]如美国专利5,998,175所述，使用本发明的聚合珠分离的质粒DNA通过LMO进行扩增，其直接使用洗脱液而未沉淀DNA。简要地，通过热循环方案，使用一对引物和一组跨越68个碱基区域的八聚体，扩增68 bp的区域。将一组12个八聚体-5′-磷酸盐(每条链6个)、引物和模板(1μL)溶解在Ampligase缓冲液中。用50μL矿物油覆盖反应管并加热至94℃5分钟。在约2分钟之后，将100UAmpligase加入每一管中。样品被循环35次：94℃，30秒； 55℃，30秒；35℃，30秒。扩增反应物的凝胶电泳揭示了具有期望分子量的条带。

实施例43.使用实施例13的可裂解珠从全血分离人基因组DNA

[0176]通过标准方案制备的来自16个人血样(1-3mL)的沉淀的白细胞被悬浮于100μL的裂解缓冲液中，该裂解缓冲液含有pH 8.0的0.2M tris、0.1M EDTA、1％SDS。将蛋白酶K(10μg)加入每一管并将管于55℃温育4小时。将3M KOAc(100μL)加至每一管中并通过轻轻翻转混合管。在13,000rpm下离心所述管。除去上清并用水以1∶2稀释。在室温下使溶液中的DNA结合至10mg珠20分钟。在结合后，离心所述珠并除去上清。用2×200μL水洗涤所述珠样品，然后用200μL5mM NaOH于37℃洗脱5分钟。通过琼脂糖凝胶电泳分析每一洗脱液样品。图5显示了高分子量DNA从所有样品的回收。

实施例44.通过酶促反应在实施例24的9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛聚合物上结合和释放DNA。

[0177]在管中用500μLTHF漂洗60mg珠样品。离心内容物并除去液体。用400μL水重复漂洗过程。将2μg线性化pUC18 DNA在250μL水中的溶液加至珠并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。

[0178]通过用HRP和过氧化物酶促氧化9，10-二氢化吖啶连接体部分来洗脱DNA。组合物含有14飞摩尔(fmol)的HRP，在pH 8.0的0.025M tris、4mM对羟基肉桂酸、2.5mM过氧化脲、0.1％Tween-20、0.5mM EDTA中。平行运行缺乏HRP的对照组合物。所述珠与组合物的反应在室温下进行1小时。通过荧光测定和通过凝胶电泳分析溶液的DNA含量。对上清液的分析显示了DNA的100％结合。对洗脱液的分析显示了在酶促反应中结合的DNA的52％被洗脱；在对照中无DNA被洗脱。

实施例45.实施例23的吖啶酯聚合物上的DNA的结合和释放。

[0179]在管中用1mLTHF漂洗100mg珠样品。离心内容物并除去液体。用2×1mL水重复漂洗过程。将75μgpUC18 DNA在586μL水中的溶液加至珠，并在室温下轻轻摇动该混合物2小时。平行进行不含DNA的阴性对照珠样品。离心该混合物并收集上清。用2×1mL水漂洗该珠并丢弃水。对上清液的紫外分析显示了所述珠已结合了10％的DNA。通过与200μL含有1M过氧化脲的1M NaOH在室温下反应30分钟而洗脱DNA。从洗脱液分离珠并用1M乙酸中和洗脱液。通过斑点印迹对中和的洗脱液的分析，显示了小量的DNA被释放。阴性对照显示无信号。

实施例46.DNA结合至实施例9的聚合物珠

[0180]在管中用1mL THF漂洗100mg珠样品。离心内容物并除去液体。用1mL水重复漂洗过程两次。将80μg pUC18 DNA在1 mL水中的溶液加至珠，并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清，用于UV分析。该上清液含有66μgDNA。因此结合容量被测定为0.14μg/mg。

实施例47.从实施例13的可裂解珠结合和释放RNA

[0181]在2个管中，使2μg荧光素酶(Luciferase)RNA结合至10mg珠。1×反转录酶缓冲液(50mM tris-HCl，pH 8.5，8mM MgCl₂，30mM KCl，1mM DTT)被用于洗脱。将一个管在94℃下加热5分钟，而另一个管在94℃下加热30分钟。在1％琼脂糖凝胶上对洗脱液和对照跑胶，并用SYBR Green^TM染色。5分钟的加热显示了～50％的RNA从所述珠洗脱，但30分钟的加热似乎使RNA变性。

实施例48.用不同的裂解/洗脱缓冲液从实施例13的可裂解珠结合和释放RNA。

[0182]在3个管中，使1μgLuciferase RNA结合至10mg珠。任一个管中，3M乙酸钾被用于在室温下洗脱RNA 30分钟。在另一个管中，1×反转录酶缓冲液(RT)被用于在94℃下洗脱1分钟。第三管具有RNA提取缓冲液并被加热至94℃1分钟。RNA提取缓冲液由pH 8.8的10mM tris-HCl、0.14M NaCl、1.5M MgCl₂、0.5％NP-40、1mM DTT组成。在1％琼脂糖凝胶上对所有洗脱液和对照跑胶，并用SYBR Green^TM染色。3M乙酸钾未产生可识别的RNA。1×反转录酶缓冲液和RNA提取缓冲液都显示出条带，该条带被估计包含相应于大约50％洗脱的RNA。

实施例49.从实施例13的可裂解珠结合和释放RNA，并通过化学发光印迹试验检测。

[0183]在4个管中，使1μg Luciferase RNA结合至10mg珠。2个管使用1×反转录酶缓冲液进行洗脱，而另2个管使用RNA提取缓冲液。将每一种类的缓冲液的一个管加热至94℃ 1分钟。其它两个管被加热至94℃5分钟。在1％琼脂糖凝胶上对所有洗脱液和对照跑胶，并用SYBR Green染色。使用任一种缓冲液，加热1分钟的洗脱液比加热5分钟的洗脱液都含有更多的RNA。RNA提取缓冲液比1×RT缓冲液洗脱出更多的RNA。采用过夜的毛细转移，将RNA转移至尼龙膜。然后，用HF-1生物素标记的引物过夜杂交RNA。用抗生物素HRP以及作为化学发光底物的Lumigen PS-3进行检测。5分钟的暴露验证了凝胶结果。

实施例50.在不同混度下从实施例13的可裂解珠结合和释放RNA。

[0184]在6个管中，使1μg Luciferase RNA结合至10mg珠。RNA提取缓冲液被用于在若干个不同的温度下洗脱RNA 5分钟：40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃。在1％琼脂糖凝胶上对所有洗脱液和对照进行跑胶，并用SYBR Green染色。所有的温度似乎都100％洗脱。

实施例51.用实施例1的三丁基磷珠结合线性化的pU C18DNA，并用不同的洗脱组合物释放。

[0185]在管中用500μLTHF漂洗10mg珠样品。离心内容物并除去液体。用200μL水重复漂洗过程。将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至珠，并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL下表所述的各种试剂组合物在室温下温育20分钟而洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于如实施例26所述的荧光分析。

缓冲液盐有机溶剂洗脱％

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％糠醇 58

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％聚蔗糖 19

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％HOCH2CH2SH 52

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％DTT 52

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％丙三醇 15

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％2-丙醇 50

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％乙醇 37

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％CF₃CH₂OH 38

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％丙酮 42

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％THF 41

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 15％对二烷 33

实施例52.

[0186]用下表描述的试剂组合物重复实施例51的结合和释放方案。检测改变DTT或2-巯基乙醇的浓度的效应。

缓冲液盐有机溶剂洗脱％

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 0.1％DTT 0

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 1％DTT 0

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 3％DTT 36

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 4％DTT 41

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 0.1％HOCH₂CH₂SH 0

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 1％HOCH₂CH₂SH 0

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 3％HOCH₂CH₂SH 39

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 4％HOCH₂CH₂SH 38

实施例53.

[0187]用下表描述的试剂组合物重复实施例51的结合和释放方案。检测改变盐NaCl和KCl的浓度的效应。

缓冲液盐有机溶剂洗脱％

50mM tris，pH 8.5 0.1M NaCl 5％DTT 1

50mM tris，pH 8.5 0.25M NaCl 5％DTT 0

50mM tris，pH 8.5 0.5M NaCl 5％DTT 27

50mM tris，pH 8.5 0.75M NaCl 5％DTT 29

50mM tris，pH 8.5 1.0M NaCl 5％DTT 29

50mM tris，pH 8.5 1.25M NaCl 5％DTT 26

50mM tris，pH 8.5 0.75M KCl 5％DTT 64

50mM tris，pH 8.5 1.25M KCl 5％DTT 60

实施例54.

[0188]用下表描述的试剂组合物重复实施例51的结合和释放方案。洗脱珠60分钟。

缓冲液盐有机溶剂洗脱％

50mM tris，pH 8.5 0.1M NaCl 0％2-丙醇 3

50mM tris，pH 8.5 0.1M NaCl 15％2-丙醇 68

50mM tris，pH 8.5 0.25M NaCl 30％2-丙醇 64

50mM tris，pH 8.5 0.5M NaCl 50％2-丙醇 4

实施例55.

[0189]用下表描述的试剂组合物重复实施例51的结合和释放方案。评价相对效应。

缓冲液盐有机溶剂

50mM tris，pH 8.5 1.0M乙酸钠 15％2-丙醇 ++

50mM tris，pH 8.5 1.5M乙酸钠 15％2-丙醇 ++

50mM tris，pH 8.5 1.25M乙酸钠 15％2-丙醇 ++

50mM tris，pH 8.5 0.75M乙酸钠 15％2-丙醇 +

50mM tris，pH 8.5 0.5M乙酸钠 15％2-丙醇 +

50mM tris，pH 8.5 0.1M乙酸钠 15％2-丙醇 +

实施例56.

[0190]用实施例1的三丁基磷珠结合不同长度的寡核苷酸并用试剂组合物释放。

[0191]对范围为20碱基至2.7kb的不同大小的寡核苷酸进行实施例51的结合和释放方案。洗脱组合物是pH 8.5的50mM tris、0.75M NaCl、5％DTT。使用ssDNA的荧光染色剂——OliGreen，荧光测定DNA的量。

寡核苷酸大小(nt) 洗脱％

20 39

30 43

50 36

68 34

181 33

424 33

753 32

2.7kb 20

实施例57.用实施例1的三丁基磷珠结合线性化pUC18 DNA并用不同洗脱体积释放。

[0192]将2μg线性化的pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至在2mL离心柱(Costar)中的10mg珠。在温育20分钟后，离心该柱并收集上清。用2×200μL水洗涤所述珠并丢弃洗液。如下洗脱DNA：通过用5×200μL的50mM tris，pH 8.5、0.75M NaCl、5％DTT在室温下洗涤所述珠5分钟，离心并收集洗脱液，用于在每次洗脱后进行荧光和凝胶电泳分析。

[0193]以类似的方式，用5×40μL相同的缓冲液洗脱含有结合DNA的珠。

洗脱百分比

200μL洗脱液 40μL洗脱液

洗脱1 63 47

洗脱2 10 11

洗脱3 5.5 10

洗脱4 3.5 5

洗脱5 2.1 4

总量 84 77

实施例58.用实施例5的三丁基铵珠结合和释放核酸。

[0194]将2μg线性化pUC18 DNA在200μL水中的溶液加至10mg的珠中，并轻轻摇动该混合物30分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、0.75M NaCl、5％DTT于室温下温育30分钟洗脱DNA。离心该混合物并移出洗脱液，用于荧光分析，如

实施例26中所述。DNA结合为50％，洗脱为结合部分的69％。

实施例59.用实施例7的磁性三丁基磷珠结合和释放核酸。

[0195]在管中用500μLTHF漂洗10mg珠样品。磁法分离内容物并除去液体。用200μL水重复漂洗过程。将在200μL水中的2μg线性化pUC18 DNA的溶液加至所述珠中，并轻轻摇动该混合物20分钟。磁分离该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇于室温下温育30分钟而洗脱DNA。磁分离该混合物并移出洗脱液，用于荧光分析，如实施例26中所述。DNA结合为100％，洗脱为18％。

实施例60.实施例1的三丁基磷珠结合线性化的pUC18 DNA，并用不同的洗脱温度释放。

[0196]将在200μL水中的2μg线性化pUC18 DNA的溶液加至10mg的珠中，并轻轻摇动该混合物30分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。通过将该珠和200μL的50mM tris，pH 8.5、1.25M NaCl、15％2-丙醇在不同温度下温育5分钟而洗脱DNA：37℃、46℃、65℃和94℃。离心该混合物并移出洗脱液，用于荧光分析，如实施例26中所述。在所有温度下，DNA结合为100％，洗脱为结合部分的约65-70％。

实施例61.对从实施例1的珠结合并释放的质粒DNA的PCR扩增。

[0197]在实施例51的步骤之后，在0.5M NaOH中1μL洗脱的质粒DNA，用跨度为285碱基区的一对引物进行PCR扩增。PCR反应混合物含有下表所列的组分。

组分体积(μL)

10×PCR缓冲液 10

引物1(1.5 pmol/μL) 8

引物2(1.5 pmol/μL) 8

2.5mM dNTPs 8

50mM MgCl₂ 5

Taq DNA聚合酶 0.5

模板 1或2

去离子水 59.5或58.5

阴性对照用1或2μL 0.5M NaOH或1μL水替换反应混合物中的模板。进一步的反应使用1μL以1∶10稀释于水中的模板。反应混合物经受22个循环：94℃，1分钟；60℃，1分钟；72℃，1分钟。反应产物在1％琼脂糖凝胶上跑胶，其证明了从所述珠洗脱的DNA是完整的。

实旆例62.用实施例1的三丁基磷珠结合核酸并用Wittig反应释放。

[0198]将在200μL水中的2μg pUC18 DNA的溶液加至10mg实施例1的珠中，并轻轻摇动该混合物20分钟。离心该混合物并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃水。将珠用5×400μl DMF洗涤。将DMF(300μL)中的NaOt-Bu饱和溶液和20μL丙酮与所述珠一起摇动20分钟。离心该混合物并除去液体。用3×400μL DMF洗涤所述珠，在最后一次洗涤后除去液体。通过将该珠和200μL 10mMtris，pH 8.5一起摇动5分钟并收集溶液而洗脱DNA。用新鲜的几份缓冲液重复该过程2次。

实施例63.对Wittig释放的DNA的斑点印迹分析。

[0199]在Wittig反应后，在尼龙膜上通过斑点印迹分析实施例62的三种洗脱液的部分(1μL)。UV交联施用于膜上的DNA，并用2×SSC缓冲液漂洗。用5mL DigEasy HybTM缓冲液(Roche)于37℃预杂交该膜1.5小时。在Dig Easy Hyb缓冲液中，于37℃下，过夜杂交地高辛标记的30mer探针。在2％BM封闭液(Boehringer-Mannheim)中，用地高辛HRP偶联物(1∶1 0,000稀释)捕获杂交的探针1小时。通过用Lumigen PS-3润湿该膜并暴露于X线胶片，来检测HRP标记。用从结合步骤获得的洗脱的样品和上清液平行分析含有10、5和2.5ng DNA的标准物。图6证明，在第一次洗脱中大部分结合的DNA被除去，在第二次和第三次洗脱中越来越少的量被除去。对上清液的分析(未示出)证明了，所有的DNA都被结合到所述珠上。其中释放的DNA在100℃被洗脱的类似实验得到类似的结果。

实施例64.反应时间对实施例62的方案中释放的DNA的除去的影响。

[0200]通过改变与丙酮的Wittig反应中的反应时间，进行实施例62的方案。在单独的试验中，使用10分钟、20分钟、30分钟和60分钟的反应时间。如实施例W2所描述的斑点印迹分析证明了，不论反应时间如何，都得到相同的结果。

实施例65.用实施例3的三苯基磷珠结合核酸并通过Wittig反应释放。

[0201]根据实施例62所描述的一般性方法，实施例3的珠被用于结合DNA并通过Wittig释放。通过UV对结合步骤的上清进行的分析显示，78％的DNA被捕获。相比于三丁基磷珠的＞0.2μg/mg，结合容量为0.156μg/mg。类似于三丁基磷珠，大部分DNA在第一次洗脱中被从珠除去。

实施例66.用实施例4的三苯基磷珠结合核酸并通过Wittig反应释放。

[0202]根据实施例62所描述的一般性方法，实施例4的珠被用于结合25mg珠上的17μgDNA并通过Wittig反应释放。通过UV对结合步骤的上清进行的分析显示，14％的DNA被捕获。结合容量为0.095μg/mg。类似于三丁基磷珠，大部分DNA在第一次洗脱中被从珠除去。

实施例67.用实施例7的磁性三丁基磷珠结合核酸并通过Wittig反应释放。

[0203]按照实施例62的方案，其具有下面的改变。所有的分离步骤被磁性进行。有机溶剂和洗涤液用THF代替DMF。THF/NaOt-Bu溶液的体积为250μL。在tris缓冲液中，用3个15分钟洗涤来洗脱释放的DNA。用PicoGreen通过荧光试验来分析洗脱液和上清液。对上清液的分析显示100％结合到颗粒。荧光分析发现，在第一次洗脱中32％被洗脱。随后的洗脱液包含太少的DNA，以至于用该方法无法检测。为了比较，实施例1的非磁性珠显示在第一次洗脱中的31％DNA，并且在随后的洗脱中DNA太少而无法检测。

实施例68.从实施例16的可裂解珠洗脱的DNA直接用于LMO扩增。

[0204]将在200μL 10mM pH 8.5的tris中的、包含分离自人全血的4μg基因组DNA的溶液加到20mg珠中。在温育5分钟后，离心该样品管30秒并收集上清。用2×200μL水漂洗该珠并丢弃洗液。通过如下洗脱DNA：用100μL的0.5MNH4OH在37℃下洗涤所述珠5分钟，离心30秒并收集洗脱液。

[0205]如美国专利5,998,175中所述，使用本发明的聚合物珠分离的DNA通过LMO进行扩增，而无需中和或进一步的样品预处理。简而言之，使用一对引物以及一组2种八聚体和2种十聚体，通过热循环步骤，制备对应于Factor V基因的片段的扩增子，其具有51个碱基的链和48个碱基互补，所述引物之一用6-FAM进行5′-标记。在Taq连接酶缓冲液中溶解引物和模板(1μL)。用40μL矿物油覆盖反应管，并加热至94℃5分钟。然后，将20U Taq DNA连接酶加至每一管。对样品循环40次：94℃30秒；55℃30秒；38℃30秒。

[0206]对扩增反应物进行化学发光杂交测定。野生型扩增子的捕获探针被固定于微量培养板孔中，并被用于杂交含有FAM标记的扩增产物。抗FITC-碱性磷酸酶偶联物被结合，并用Lumi-Phos Plus检测。通过LMO、杂交和检测步骤，对每一基因型的血样DNA以及水空白进行平行运行。选择已知对照中DNA的量，以与50％回收的珠处理样品中的量相等。该样品以前被分型为纯合子野生型。

样本信号(RLU)

样品 24.7

纯合子野生型 87.3

杂合子 47.1

纯合子突变体 0.20

空白 0.30

实施例69.含有二甲基锍基和芳基硫酯键的聚甲基丙烯酸酯聚合物的合成。

[0207]在氩下，在室温下，于100mL CH₂Cl₂中，搅拌如上所述制备的聚甲基丙烯酰氯树脂(2.96g)、5.07g 4-(甲硫基)苯硫酚和三乙胺(8.8mL)5天。过滤出该固体，并用100mL CH₂Cl₂和100mL水洗涤，然后在125mL甲醇中搅拌若干天。过滤并干燥所产生的3.76g硫酯产物。

[0208]将100mL CH₂Cl₂中的2.89g部分的固体与4.1mL三氟甲基磺酸甲酯一起搅拌7天。过滤该固体，并依次用200mL CH₂Cl₂、300mL甲醇和300mLCH₂Cl₂洗涤，然后风干。

实施例70.使用具有二甲基锍基的可裂解珠结合和释放DNA。

[0209]将在200μL 10mM pH为8的tris中的2μg线性化pUC18 DNA的溶液加至实施例69的10mg珠样品中，并轻轻摇动该混合物5分钟。离心该混合物并收集上清液。用2×200μL水漂洗所述珠并丢弃水。通过与200μL 0.5M NaOH于37℃温育所述珠5分钟而洗脱DNA。离心该混合物并除去洗脱液，用于荧光分析。该上清液不含有DNA。洗脱液含有100％初始结合的DNA。

实施例71.使用具有二甲基锍基的可裂解珠结合和释放DNA。

[0210]通过与200μL 50mM pH 8.5的tris、0.75 NaCl、5％DTT于37℃温育5分钟，洗脱如实施例70所述的结合至珠的DNA。离心该混合物并除去洗脱液，用于荧光分析。该上清液不含有DNA。洗脱液含有初始结合的DNA的37％。

[0211]前述的说明书和实施例仅仅是说明性的并且不被理解为限制性的。应该认识到，可以对未具体公开的具体化合物和方法作出改变，而不背离本发明的精神和范围。本发明的范围仅受所附权利要求的限定。

Claims

1.用于结合核酸的固相，包括：

固体支持部分，包括选自二氧化硅、玻璃、不溶的合成聚合物和不溶性多糖的基质，其表面上连接；

可裂解连接体部分，其连接至所述固体支持部分，和

用于吸引和结合核酸的核酸结合部分，其连接至所述可裂解连接体部分。

2.权利要求1所述的固相，其中所述核酸结合部分选自：其中R选自C₁-C₂₀烷基、芳烷基和芳基的式QR₂ ⁺X^-的三元锍基，其中R选自C₄-C₂₀烷基、芳烷基和芳基的式NR₃ ⁺X^-的季铵基，以及其中R选自C₁-C₂₀烷基、芳烷基和芳基的季磷基PR₃ ⁺X^-，并且其中X是阴离子。

3.权利要求2所述的固相，其中所述核酸结合部分是季铵基并且所述每一个R基团都包含4-20个碳原子。

4.权利要求2所述的固相，其中所述核酸结合部分是季磷基并且所述每一个R基团都包含1-20个碳原子。

5.权利要求4所述的固相，其中所述每一个R基团为丁基。

6.权利要求1所述的固相，其中所述固体支持部分包括不溶的合成聚合物。

7.权利要求1所述的固相，其中所述固体支持部分包括玻璃基质。

8.权利要求1所述的固相，其中所述固体支持部分包括二氧化硅基质。

9.权利要求1所述的固相，其中所述可裂解连接体部分进一步包括一个或更多个连接部分。

10.权利要求1所述的固相，进一步包括磁响应性部分。

11.权利要求1所述的固相，其中所述可裂解连接体部分被水解性裂解。

12.权利要求11所述的固相，其中所述可水解性裂解的连接体部分是酯或硫酯基团。

13.权利要求1所述的固相，其中所述可裂解连接体部分被还原性裂解。

14.权利要求1所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括可引发的二氧杂环丁烷环。

15.权利要求1所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括多电子烯烃，所述多电子烯烃通过转化成热不稳定性二氧杂环丁烷而被裂解。

16.权利要求1所述的固相，其中所述可裂解连接体部分被酶促裂解。

17.权利要求16所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛，所述9，10-二氢化吖啶乙烯酮二硫缩醛通过与过氧化物酶和过氧化物反应而被裂解。

18.权利要求16所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括酯，所述酯通过水解酶或酯酶被裂解。

19.权利要求16所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括酰胺，所述酰胺通过蛋白酶被裂解。

20.权利要求16所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括肽，所述肽通过肽酶被裂解。

21.权利要求16所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括糖苷，所述糖苷通过糖苷酶被裂解。

22.权利要求12所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括具有式：

的硫酯，其中Q为P或N，而R为1-20个碳的烷基。

23.权利要求22所述的固相，其中所述可裂解连接体部分包括具有式：

的硫酯。

24.权利要求1所述的固相，其中所述可裂解连接体部分是至少一个碳原子结合至三烷基磷或三芳基磷核酸结合部分的亚烷基，并且利用与酮或醛的Wittig反应可被裂解。

25.权利要求24所述固相，其中所述可裂解连接体部分具有式

26.权利要求2所述的固相，其中所述固相的核酸结合部分是式SR₂ ⁺X^-的三元锍基，其中R选自C₁-C₂₀烷基、芳烷基和芳基，并且其中X是阴离子。