KR20070054485A - 식중독균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머 - Google Patents

식중독균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식중독균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머 및 이들 압타머를 이용한 식중독균의 동정 및 정량 분석방법에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 포도상구균으로부터 선택되는 적어도 하나의 식중독균에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 18에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥핵산 압타머가 제공된다. 아울러 본 발명에 따라, 서열번호 1 내지 서열번호 18에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥핵산 압타머의 상기 식중독균에 대한 특이적인 결합을 검출하여 상기 식중독균을 동정하고 정량하는 것을 특징으로 하는, 단일가닥핵산 압타머를 이용한 식중독균의 동정 및 정량 분석방법이 제공된다.

Description

식중독균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머{Single-Stranded Nucleic Acid Aptamer Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen}
도1 내지 도6은 본 발명에 따른 압타머들과 식중독균들의 반응성을 보여주는 도면.
(기술분야)
본 발명은 식중독균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머(aptamer)에 관한 것이며, 보다 상세하게는 대표적인 식중독균인 대장균(E. coli), 살모넬라균(S. typhimurium, 예 ATCC 14028), 리스테리아균(L. monocytogenes) 및 포도상구균(Staphylococcus aureus) 등에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머 및 이들 압타머를 이용한 식중독균의 동정 및 정량 분석방법에 관한 것이다.
(배경기술)
특정물질의 동정하고 그 정량적 변화를 분석할 수 있는 리간드는 물리학 및 생화학의 발달에 따라 계속적으로 발전하고 있으나, 유지비, 용이성, 정확도, 민감 도, 검사시간 및 자동화 등에 관련하여 보다 효율적인 리간드의 개발에 대한 요구는 계속되고 있다.
특정물질을 분석하는 방법은 그 자체가 궁극적인 목표가 아니라 전체 과정의 일부분이지만 미생물 및 바이러스 동정, 세포, 단백질, 유기물질 분석 등에 매우 유용하며, 의학, 수의학, 환경공학, 식품공학, 농업 등에 광범위하게 응용되고 있다.
식중독균들(식품병원균)은 부패한 채소, 농수산물, 각종 저장식품, 식품제조공정을 통하여 인체에 감염되면 72시간 정도 경과 후 식중독을 일으킬 수 있으므로, 식품의 안전성을 제고하고 보건위생환경을 개선하는 측면에서 이들 식중독균을 보다 신속하고 정확하게 검출할 수 있는 기술을 개발하는 것에 관심이 높다. 그러나 지금까지 식중독균에 대한 효율적인 신속 검출법은 이상적인 리간드가 없어 어려움을 겪고 있다.
식중독균에 대한 신속 검출법으로 생물발광과 미생물대사결과의 반응산물을 이용하는 방법은 상대적으로 선택성이 결여되어 있으므로 단지 식중독균에 대한 일반적인 지표로만 활용될 수 있을 뿐이고, 부가적으로 선택성이 높은 면역학적 방법과 핵산중합을 사용하여 명확한 동정을 해야 하는 추가적인 단계가 필요하고 특별한 장비 및 실험시설이 있어야 하는 문제점이 있으며, 아울러 효소면역측정과 면역형광측정의 경우는 사용하는 항체의 불안전성으로 인해 물질의 보관 및 유통에 문제가 있으며 또한 항체는 식중독균의 세포벽에 의한 선택성 및 감도에 대한 단점이 있다.
널리 알려진 바와 같이 핵산은 뉴클레오티드가 공유결합으로 연결된 선형적인 다합체로서, 뉴클레오티드는 작은 유기화합물로서 인산, 당 및 퓨린(아데닌 혹은 구아닌) 혹은 피리미딘(사이토신, 티미딘, 우라실)으로 이루어져 있다.
핵산은 단일가닥이나 이중가닥으로 존재하는데, 단일가닥은 특정한 물리적인 조건에서 뉴클레오티드들 간의 수소결합 및 상호작용에 의해 결합하여 독특한 입체구조를 형성하는데, 이런 구조는 단일가닥의 염기서열에 의해 결정된다.
일반적으로 DNA와 RNA와 같은 핵산들은 세포구조 및 효소 등의 활성을 가진 단백질들을 발현하기 위한 정보의 저장체이나, 1982년에 RNA가 특정한 구조를 형성함으로써 효소로서의 활성도 갖고 있다는 보고가 나온 후로 핵산이 구조적인 특성과 그에 따른 특정 기능에 대한 많은 보고가 있다. 핵산은 4개의 염기의 반복으로 구성되어 높은 다양성을 유지하여 많은 입체구조를 형성하며 이런 입체구조는 특정물질과 상호작용을 하여 복합체를 형성하여 안정화된다.
핵산이 단백질을 포함하는 특정물질에 대하여 하나의 리간드(ligand)로서 작용할 수 있는 바, 다양한 염기순서로 배열된 단일가닥핵산이 조합된 라이브러리로부터 일정한 선별과정과 염기서열결정을 통하여 높은 결합력과 특이성으로 특정물질과 결합하는 핵산들을 선별되고 있다.
특정물질과 결합하는 핵산을 선별하는 방법을 셀렉스(SELEX, Systematic Evolution of Ligand by Exponential enrichment)라 하고, 이렇게 선별된 산물인 핵산을 통상적으로 압타머라고 칭한다(Tuerk C. and Gold L.; Science, 249, pp505-510, 1990). 이런 SELEX를 통하여 자연 상태에서 핵산과 결합할 수 있는 단 백질뿐만 아니라 핵산과 결합하고 있지 않은 단백질을 비롯한 여러 생체분자와도 매우 높은 친화력으로 결합할 수 있는 분자들이 선별되고 있다.
본 발명의 목적은, 식중독균과 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머를 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은, 식중독균과 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머와 상기 식중독균의 특이적인 결합을 검출하여 상기 식중독균을 동정하고 정량하는 분석방법을 제공함으로써, 보다 신속하고 정확하게 식중독균을 검출할 수 있도록 하고자 하는 것이다.
본 발명에 따라 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 포도상구균으로부터 선택되는 적어도 하나의 식중독균에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 18에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥핵산 압타머가 제공된다.
본 발명에 따라 식중독균에 대한 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머와 상기 식중독균과의 특이적인 결합을 검출하여 상기 식중독균을 동정하고 정량하는 것을 특징으로 하는 식중독균의 동정 및 정량 분석방법이 제공된다. 바람직하게 상기 식중독균은 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 포도상구균으로부터 선택되는 적어도 하나의 식중독균이고, 상기 압타머는 서열번호 1 내지 서열번호 18에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥핵산이다.
SELEX 표준방법(Bock LC et al.; Nature, 355(6360), pp564-6, 1992)을 통해 선별된 본 발명에 따른 압타머는, 표적 식중독균과 특이적 결합을 할 수 있는 구조를 보유한 단일가닥핵산들로서, 이를 위해 핵산의 이차구조를 모델링하는 MFOLD 프로그램을 사용하여 이차구조 및 구조체 자유에너지를 확인한 후 가장 안정도가 높은 이차구조를 갖는 단일가닥핵산을 선별한다.
본 발명에 따른 압타머들의 표지물질로는 방사성 동위원소, 플로레신(Fluorescein), Cy3 또는 Cy5 등과 같은 형광물질 또는 바이오틴 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 형광물질을 사용한다.
바람직하게 본 발명에 따른 압타머와 표적 식중독균과의 특이적 결합반응은, 상기 압타머가 표적 식중독균과 잘 결합할 수 있는 염의 조성과 비특이적 결합을 방지하는 요소가 포함된 반응용액(분석시약) 중에서 실행한다.
바람직하게 상기 반응용액으로서는, (1) pH에 대한 완충작용을 위한 트리스·염산(pH 7.4) 20 내지 100mM(바람직하게는 50mM), (2) 단일가닥핵산의 이차구조안정화를 위한 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘의 각각 1mM 내지 200mM(바람직하게는 5mM 염화칼륨, 100mM 염화나트륨, 1mM 염화마그네슘), (3) 세균번식저해를 위한 소듐아지드 0.05 내지 0.2%(바람직하게는 0.1%), 및 (4) 비특이적 결합 저해를 위한 우혈청알부민 0.1 내지 0.3%(바람직하게는 0.2%)을 포함하는 용액을 사용하며, 상기 소듐아지드는 포함되지 않을 수도 있다. 반응온도는 SELEX 수행온도보다는 낮은 온도에서 수행하는 것이 이상적이며, 바람직하게는 20 내지 30℃의 온도에서 반응을 수행한다.
본 발명에 따른 단일가닥핵산 압타머의 비특이적인 결합을 방지하기 위해 단백질을 과량으로 처리할 수 있으며, 그리고 표적 식중독균과 단일가닥핵산 압타머들의 복합체 및 미결합된 압타머들은 막 여과법 혹은 원심 분리법 등으로 분리할 수 있다.
본 발명에 따른 압타머와 식중독균 복합체는 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 결합정도가 결정되며 이로부터 특정물질을 동정하여 정량할 수 있다. 본 발명의 압타머와 식중독균의 특이적 결합력은 복합체의 결합정도를 변화시킨다. 따라서 결합정도를 분석하여 식중독균의 종류 및 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다.
본 발명에 따른 압타머를 이용한 식중독균의 동정 및 정량 분석방법에는 상기 압타머에 표지하는 물질의 종류에 따라 핵산정량법이나 형광측정법 등을 선택하여 사용할 수 있고, 본 분석방법에 의하면, 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 포도상구균 등을 포함하는 식중독균을 동정하고 그 량을 분석할 수 있게 된다.
본 발명에 따라, 상기 식중독균에 특이적으로 결합하는 본 발명의 압타머를 포함하는 0.2% 상기 반응용액(분석시약)과, Cy-5가 부착된 FW-프라이머 및 RE-프라이머를 포함하는, 식중독균 동정 및 정량분석을 위한 분석키트도 제공된다.
본 발명의 압타머와 식중독균의 반응결과의 표지물질을 탐색하는 방법은 핵산정량법 또는 형광측정법을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 핵산정량법을 사용할 수 있 있다.
이하, 첨부도면과 실시예를 통해 본 발명을 보다 상세히 설명한다. 이하의 구체적인 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하는 것일 뿐, 본 발명의 범위를 제 한하는 것으로 의도되지 아니한다.
실시예 1: 식중독균에 특이적인 단일가닥핵산의 선별
표적물질인 식중독균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산의 선별은 셀렉스(SELEX) 표준방법으로 수행하였다(Bock LC et al.; Nature, 355(6360), pp564-6, 1992). 즉, 아래와 같은 무작위의 염기서열을 가진 단일가닥의 DNA 올리고뉴클레오티드를 이용하여 PCR(Polymerase Chain Reactio)을 통해 이중가닥의 DNA를 제조한 후, 생체외 전사를 통하여 단일가닥의 RNA 라이브러리를 제조하였다.
5'-GGG AGA GCG GAA GCG TGC TGG GCC N40 CAT AAC CCA GAG GTC GAT GGA TCC CCC C-3'
여기에서 밑줄 친 염기배열은 핵산 라이브러리의 고정된 부위이며 N40은 각 위치에 A, G, T, C등의 염기들이 같은 농도로 존재함을 의미한다.
PCR시에 이용되는 FW 프라이머(5'-GGG GGA ATT CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA GCG GAA GCG TGC TGG G- 3')는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 5' 말단과 염기결합을 할 수 있고 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머아제를 위한 프로모터 염기서열을 포함하고 있다. PCR의 RE 프라이머(5'-GGG GGG ATC CAT CGA CCT CTG GGT TAT G-3')는 위의 염기배열의 밑줄 친 염기들의 3' 말단과 염기결합을 할 수 있다. 그리고 FW와 RE 프라이머는 이후의 클로닝을 위해 각각 EcoRI과 BamHI등의 제한효소 절단 염기서열을 함유하고 있다.
핵산 라이브러리를 페놀 추출법 및 에탄올 침전 등을 통하여 정제한 후 UV 스펙트로미터를 이용하여 정제된 핵산의 양 및 그 순수도를 검색하였다.
상기에서 합성된 단일가닥핵산을 1회는 1015 염기서열/1㎖의 농도로, 다음 회부터는 200 pmol/200㎕의 농도로 선택버퍼(50 mM Tris·Cl (pH 7.4), 5 mM KCl, 100 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 0.1% NaN3)에서 80℃에서 10분간 가열한 후, 얼음에 10분간 방치하였다. 사용한 단일가닥핵산의 5배의 효모 tRNA(yeast tRNA, Life Technologies사) 및 0.2% BSA(bovine serum albumin, Merck사)을 첨가하여 반응용액을 준비하였다. 단일가닥핵산을 106개의 대장균 DH-5α(Amershambiosciences 사)가 있는 선택버퍼에서 첨가하여 37℃에서 30분간 반응시켰다.
대장균과 결합하는 단일가닥핵산은 원심분리하여 분리한 후, 1㎖ 선택버퍼(0.2% BSA 포함)로 세척하였다. 용액I(선택버퍼, 10mM EDTA)을 상기 반응물에 처리하여 단일가닥핵산을 분리한 후, 페놀 추출 및 에탄올 침전으로 단일가닥핵산을 완전히 분리하여 위에서 열거한 프라이머로 이용하여 증폭함으로써 다음 선택 과정을 위한 핵산을 제조, 정제하였다.
같은 과정의 선택 과정을 여러 번 더 반복한 후 처음보다 낮은 농도의 표적과 반응을 시키거나 세척 과정을 더욱 여러 번 수행하여 표적 식중독균과 매우 특이적으로 그리고 높은 친화력을 가진 단일가닥핵산을 분리 및 추출하였다.
최종 18회를 수행한 후, 최종 분리된 단일가닥핵산을 FW-프라이머 및 RE-프라이머를 이용하여 PCR를 수행하여 이중가닥핵산을 합성하였다. 이 PCR 산물을 T- 벡터에 클로닝하여 염기서열을 결정하였다.
실시예 2: 선별된 단일가닥핵산 압타머와 표적 식중독균의 특이적 반응
실시예1에서 선별된 단일가닥핵산의 DNA 주형, 1x 전사버퍼, 10 mM DTT, 500 μM ATP, GTP, CTP, (UTP: Biotin-UTP= 2:1), 20U RNase 인히비터, T7 RNA 중합효소를 혼합한 후 37℃에서 3시간 동안 전사시켜 바이오틴으로 표지된 RNA를 합성하였다. 1U DNase I를 37℃에서 20분간 처리하여 남아 있는 DNA 주형을 분해한 다음, 전사된 RNA를 페놀추출과 에탄올 침전으로 정제하였다.
이렇게 준비된 본 발명에 따른 RNA 단일가닥핵산 압타머와 표적 식중독균을 30분간 반응시킨 후, 원심분리 하여 표적-핵산 복합체를 분리하였다.
복합체는 95℃에 5분간 처리하고 4℃에서 5,000xg로 5분간 원심분리한 후, 상징액을 수확하였다. 이를 3% 아가로스 젤에 전기 영동하여 반응정도를 측정하였으며 그 결과는 도1 내지 도6과 같다.
이상과 같은 일련의 방법으로 표적 식중독균과 높은 결합력이 있는 본 발명에 따른 단일가닥핵산 압타머를 18개 선별하였으며, 이들 본 발명에 따른 단일가닥핵산 압타머의 염기서열은 서열번호 1 내지 서열번호 18의 염기서열과 같다.
도1 내지 도6을 참조하여 선별된 18개의 본 발명에 따른 압타머의 식중독균과의 특이적인 결합을 설명한다.
도1을 참조하면, #454(서열번호 1)의 압타머의 결합력은 대장균과는 중간, 살모넬라균 및 포도상구균과는 낮고, 리스테리아균과는 매우 낮다. #578(서열번호 2)의 압타머는 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균과는 낮고, 리스테리아균과는 매우 낮다. #605(서열번호 3)의 압타머는 대장균과는 중간이고, 살모넬라균 및 포도상구균과는 낮고, 리스테리아균과는 매우 낮다.
도2를 참조하면, #607(서열번호 4)의 압타머는 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균과는 낮고, 리스테리아균과는 매우 낮다. #648(서열번호 5)의 압타머는 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균과는 중간이고 리스테리아균과는 매우 낮다. #917(서열번호 6)의 압타머는 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균과는 중간, 리스테리아균은 매우 낮다.
도3을 참조하면, #297(서열번호 7)의 압타머는 대장균 및 살모넬라균과는 높고, 포도상구균과는 중간이고, 리스테리아균은 매우 낮다. #309(서열번호 8)의 압타머는 살모넬라균과 높고, 포도상구균과는 중간이며, 대장균 및 리스테리아균과는 낮다. #316(서열번호 9)의 압타머는 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균과는 높고, 리스테리아균과는 낮다.
도4를 참조하면, #323(서열번호 10)의 압타머는 살모넬라균과는 매우 높고 대장균 및 포도상구균과는 높고, 리스테리아균과는 낮다. #379(서열번호 11)의 압타머는 살모넬라균과는 매우 높고, 대장균 및 포도상구균과는 높고, 리스테리아균과는 낮다. #407(서열번호 12)의 압타머는 살모넬라균과는 매우 높고, 포도상구균과는 중간이고, 리스테리아균과는 낮고, 대장균과는 매우 낮다.
도5를 참조하면, #952(서열번호 13)의 압타머는 대장균과는 높고, 살모넬라균 및 포도상구균과는 중간, 리스테리아균과는 낮다. #261(서열번호 14)의 압타머는 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균과는 높고, 리스테리아균과는 낮다. #270(서열번호 15)의 압타머는 살모넬라균은 높고 대장균 및 포도상구균과는 중간, 리스테리아균과는 낮다.
도6을 참조하면, #091(서열번호 16)의 압타머는 대장균 및 살모넬라균과는 중간이고 포도상구균 및 리스테리아균과는 낮다. #144(서열번호 17)의 압타머는 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균과는 중간, 리스테리아균과는 낮다. 그리고 #235(서열번호 18)의 압타머는 대장균, 살모넬라균 및 포도상구균과는 중간, 리스테리아균과는 낮다.
이상에서 식중독균에 대한 압타머의 결합력을 나타냄에 있어서 '매우 높다'는 15 이상, '높다'는 12 내외, '중간'은 6 내외, '낮다'는 3 내외, '매우 낮다'는 1-2 정도를 대략적으로 표현한 것이다.
밴드의 존재 및 밀도는 표적 식중독균과 본 발명의 압타머가 형성하는 복합체에 따라 다양하게 표시된다. 상기 복합체는 이들 간의 특이성 및 결합력에 따라 밴드형성 유무가 결정되며 이로부터 표적을 동정할 수 있다.
또한, 과량의 단일가닥핵산 압타머가 존재하는 경우에는 표적 식중독균의 양에 따라 복합체의 양이 결정되고, 이는 밴드밀도에 영향을 준다. 따라서 밴드 존재 및 밀도를 분석하여 특정 식중독균의 종류 및 정량적인 변화를 확인할 수 있게 된다.
이상에서 설명한 본 발명에 따른 식중독균에 특이적으로 결합하는 단일가닥핵산 압타머 및 이를 이용한 식중독균의 동정 및 정량 분석방법에 의하면, 시료로부터 식중독을 일으키는 대표적인 세균인 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 포도상구균 등을 신속하고 정확하게 탐색 및 분석할 수 있으며, 따라서 본 발명은 식품 안전성의 제고와 보건위생환경개선에 기여할 수 있을 것으로 기대된다.
<110> GENOPROT CO., LTD. KIM, Sung-chun <120> Single-Stranded Nucleic Acid Aptamer Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <160> 18 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 1 cgcaguuugc gcgcguucca aguucucuca ucacggaaua 40 <210> 2 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 2 acacugcgug cuuacgacuu cuggucccau cauucggcua 40 <210> 3 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 3 aguucgauga gggugacacc gccaggagug uuugcuagac 40 <210> 4 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 4 acccgucgau aaugacugaa cuuccucuau cuuaaagggg 40 <210> 5 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 5 ggguaagggg auguuucugg gauucaagcg ccugauucug 40 <210> 6 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 6 ucuguauuug uacgcaccga agauaagaga gggaguggau 40 <210> 7 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 7 caugggcggg ccgcggucua uucgggauua uugcggaucc 40 <210> 8 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 8 ucagggugug aaguucuucc gcgcuagugg cuuguauguu 40 <210> 9 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 9 gucgggguug caaggcgucg uagcguguau uugugauggu 40 <210> 10 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 10 gcguaugggc gggucauuag gacaauuuaa ccacucgcga 40 <210> 11 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 11 auugucugug ugacuagucg gucuagugug ggggagaaga 40 <210> 12 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 12 uuaccacuga guuaauuugu acggucugcg guguacuuua 40 <210> 13 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 13 gcuaucaaua uuauagaggc ggucggggua gugucaucgu 40 <210> 14 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 14 uaggagagcg ggagcugaga acuuagaggc gccgauacac 40 <210> 15 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 15 gacguauuac aguuaaguug gcgccauucg auuucugauc 40 <210> 16 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 16 auaccagcuu auucaauuau accagcuuau ucaauuuugu 40 <210> 17 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 17 ccguaagucc ggucuuccuu gcugagucgc ccuuucaggu 40 <210> 18 <211> 40 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RNA Specifically Binding to Foods-Borne Pathogen <400> 18 uuggugggga gggccaguua ggucuaauuu ccgacgcgca 40

Claims (3)

  1. 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 포도상구균으로부터 선택되는 적어도 하나의 식중독균에 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 18에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥핵산 압타머.
  2. 대장균, 살모넬라균, 리스테리아균 및 포도상구균으로부터 선택되는 적어도 하나의 식중독균에 대하여 특이적으로 결합하는 서열번호 1 내지 서열번호 18에 기재된 염기서열 중 적어도 하나의 염기서열을 가지는 단일가닥핵산 압타머의 상기 식중독균에 대한 특이적인 결합을 검출하여 상기 식중독균을 동정하고 정량하는 것을 특징으로 하는, 단일가닥핵산 압타머를 이용한 식중독균의 동정 및 정량 분석방법.
  3. 제2항에 있어서, 상기 선별된 압타머와 상기 식중독균과의 결합반응에는, (1) pH에 대한 완충작용을 위한 트리스·염산(pH 7.4) 20 내지 100mM, (2) 상기 압타머의 이차구조안정화를 위한 염화칼륨, 염화나트륨, 염화마그네슘의 각각 1mM 내지 200mM, (3) 세균번식저해를 위한 소듐아지드 0.05 내지 0.2%, 및 (4) 비특이적 결합 저해를 위한 우혈청알부민 0.1 내지 0.3%을 포함하는 반응용액이 사용되는 것을 특징으로 하는, 단일가닥핵산 압타머를 이용한 식중독균의 동정 및 정량 분석방법.
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