KR20070028640A - 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호제와 뇌경색 및 뇌졸중예방 또는 치료제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호제와 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제에 관한 것으로서, 본 발명의 안토시아닌은 뇌세포 보호 효과를 나타내어, 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제로 이용할 수 있다.

Description

안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호제와 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제{Agent for the protection of brain cell and Agent for the prevention or treatment of cerebral infarction and stroke comprising anthocyanin}

도 1은 뇌경색 모델에서의 안토시아닌의 효과를 나타낸 것으로서, 도 1의 A는 뇌경색 모델에서 뇌경색이 진행되는 것을 나타낸 대조군이며,

도 1의 B는 안토시아닌을 투여한 뇌경색 모델의 뇌경색 부위가 감소되었음을 나타내는 것이고, 도 1의 C는 뇌의 오른쪽 반구와 경색이 일어난 부위의 범위를 측정하여 %로 표시한 그래프이고,

도 2는 뇌경색부위와 정상부위의 조직검사(H&E 염색) 사진으로서, 도 2의 A는 뇌경색이 일으키지 않은 왼쪽 뇌반구의 조직검사 결과이며, 도 2의 B는 뇌경색이 일어난 오른쪽 뇌반구의 조직검사 결과이고,

도 3은 뇌경색이 일어난 부위(빗금친 부위)의 경계부분을 확대하여 나타낸 것으로서, 도 3의 A는 결찰(Middle Cerebral Artery occlusion, 이하 'MCAo'로 칭함) 수술을 시행한 대조군의 그림이며, 도 3의 B는 MCAo 수술을 한 동물에 안토시아닌을 투여한 군이고, 도 3의 C는 뇌경색이 일어나지 않은 반대쪽 뇌반구를 관찰한 그림이며, 도 3의 D는 각 항체로 염색된 세포들의 수를 측정한 결과이다.

도 4는 안토시아닌의 뇌세포보호 효과를 나타낸 것으로서, 도 4의 A는 안토시아닌을 투여한 군의 웨스턴 블랏 결과이며, 도 4의 B는 도 4의 A 결과를 그래프로 나타낸 것이다.

본 발명은 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호제와 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제에 관한 것이다.

안정한 상태로 존재하던 산소가 효소, 환원대사, 화학약품, 공해물질, 광화학 반응과 같은 환경적 및 생화학적 요인 등에 의해 수퍼옥사이드 음이온 라디칼(superoxide anion radical, O₂ ^{' -}), 히드록실 라디칼(hydroxyl radical, OH^'-), 과산화수소(hydrogen peroxide, H₂O₂), 일중항산소(singlet oxygen, ¹O₂)등과 같이 반응성이 큰 활성산소(Reactive oxygen speicies, 이하 'ROS'로 칭함)로 전환되면 인체의 세포구성 성분인 단백질, 지질 및 DNA 등을 비가역적으로 파괴할 수 있다.

이러한 ROS의 작용은 체내 방어기구인 SOD(superoxide dismutase), 카탈라제(catalase), 퍼옥시다제(peroxidase)등의 항산화성 효소 및 비타민 C, 비타민 E등 과 같은 항산화 물질의 작용에 의하여 최소화될 수 있다. 그러나, 이러한 생체 방어력에 이상이 생기거나 과도한 ROS에 노출될 경우에는 잔여 또는 과잉의 활성 산소가 생체에 치명적인 산소독성을 일으키고, 세포 구성 성분인 지질, 단백질, 당, DNA 등에 대하여 비선택적, 비가역적인 파괴를 유도하여 노화는 물론 암을 비롯하여 뇌졸중, 파키슨병과 같은 뇌질환, 심장질환, 허혈, 동맥경화, 피부질환, 소화기질환, 염증, 류마티스, 자가면역 질환등의 각종 질병을 일으킨다고 알려져 있다(Cross, C. E. et al, Ann. Intern. med., 1987, 107:526-45, Adelman, R. et al., Proc.Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85(8): 2706-8, Moran Benhar et al., EMBO reports, 2002, 3(5):420-425). 현재, ROS와 산화적 스트레스가 세포내 신호전달과정에서 미치는 영향이 분자수준에서 많이 연구되고 있으며, 그 결과 ROS가 각종 스트레스, 염증성 싸이토카인들, 성장인자들의 자극으로 인해 세포내 여러 가지 신호전달 체계에 관여한다고 알려진 MAPK(Mitogen-activated protein kinase), 특히 JNKs(c-Jun N-terminal kinases)를 자극함으로써 여러 경로를 거쳐 염증반응, 세포예정사, 세포 괴사, 성장, 분화 등의 세포생물학적 반응을 일으키는 것으로 알려져 있다. 또한, JNKs와 그 하류의 DNA-결합 전사 인자(binding transcription factor)인 p53은 신경 세포 손상과 세포사멸에 관여하는 것으로 알려져 있다(Moran Benhar et al., EMBO reports, 2002, vol.3(5):420-425).

뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하고 있는 혈관이 막히거나 터져 그 부분의 뇌가 손상되어 나타나는 신경학적 증상으로서, 크게 허혈성 뇌졸중(ischemic stroke)과 출혈성 뇌졸중(hemorrhagic stroke) 2가지로 구분된다. 허혈성 뇌졸중은 뇌조직으로 가는 혈액 공급의 감소 혹은 차단으로 뇌조직이 허혈상태가 되어 발생하며, 출혈성 뇌졸중은 혈관이 터져 뇌조직으로 출혈이 발생되어 나타나며, 허혈성 뇌졸중이 전체 뇌졸중 환자의 약 80% 정도를 차지하는 것으로 알려져 있다. 허혈성 뇌졸중이 발병하면 혈액의 흐름이 일시적으로 끊어짐으로써 세포가 산소와 영양분을 얻을 수 없게 되나, 뇌졸중으로부터 회복되는 과정으로 혈액의 흐름이 복구되는데 이를 재산소화 과정이라 부른다. 재산소화는 세포에 산소와 영양분을 공급한다는 점에서 회복과정에 필수적이기는 하나, 이 과정에서 과도한 산소 화합물, 즉 ROS가 생성되고 또한 염증반응이 수반되면서 뇌경색이 일어나는 부위가 넓어지는 것으로 알려져 있다.

안토시아닌(Anthocyanin)은 식물체에 존재하는 수용성 색소 배당체(glucoside)로서, 천연물 중 가장 불안정한 화합물에 속하여 빛, 온도 및 기타 화합물과의 공존에 의해 쉽게 파괴되는 성질을 가진 물질이다. 흔히 식물체 액포에 존재하며, 세포액의 산성농도, 색소화합물의 화학적 구조, 여러 금속이온들과의 결합 상태에 의해 자색, 적색, 청색 등의 색상을 나타내는 천연 색소이고, 안토시아닌은 어글리콘(aglycone) 및 글리코시드(glycoside)로 구성된다.

안토시아닌은 장관에서의 흡수도 매우 용이하다고 알려져 있으며 강력한 항산화(antioxidant) 효과를 가지고 있어 간과 심장의 허혈성 경색이나 폐에서 급성염증 등의 동물 모델에서 세포 및 조직의 보호 효과를 보인 것으로 보고되고 있다 (Takanori Tsuda et al., Archives of biochemistry and biophysics, 1999, 368(2):361-366; Amorini A.M. et al, Free Radic. Res. 2003, 37(4):453-460). 이와 같이 안토시아닌은 뛰어난 ROS의 제거 효과와 항염증 효과를 각종 질병모델에서 나타냄에도 불구하고, 세포병리학적으로 ROS 및 염증반응 등이 주로 관계되어 있는 뇌졸중 모델에 대한 연구는 매우 미미하며, 아직까지 뇌세포 손상기전의 복잡성 등으로 뇌졸중으로 발생하는 뇌신경 세포의 손상을 보호해 줄 수 있는 치료제가 개발되어 있지 못한 실정이다.

이에, 본 발명자들은 뇌졸중 동물모델을 제작하여 안토시아닌의 투여 후 뇌경색 진행에서의 안토시아닌의 효과를 확인한 다음, 뇌세포에서 염증반응과 세포사멸에 관계된 신호전달 체계의 바이오 마커, JNK와 p53의 발현정도 측정을 통해 상기 안토시아닌이 뇌세포 보호 및 뇌졸중 또는 뇌경색 예방, 치료제로서 이용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 안토시아닌의 뇌세포 보호 효과를 확인함으로써, 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제 및 뇌세포 보호제로서의 새로운 용도를 제공하는 것이다.

상기 본 발명의 목적을 달성하기 위하여,

본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호제를 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제를 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호용 건강 기능 식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방용 건강 기능 식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 하기 화학식 1의 구조를 가지는 1 종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호제를 제공한다. 또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제를 제공한다.

상기 화학식 1에서 R₁ 내지 R₇은 서로 독립적이고, -H, -OH, -OCH₃ 이며(표 1 참조), 더불어 R₄, R₅는 당(글루코스, 갈락토스, 만노스, 자일로스 등)이 포함될 수 있다.

R 그룹이 -H, -OH, -OCH₃로 구성되는 것을 안토시아니딘(어글루콘)이라 하며, R 그룹 중 R₄, R₅가 당(글루코스, 갈락토스, 만노스, 자일로스 등)으로 구성되는 것을 안토시아닌이라 하는데 흔히 두 가지 모두를 안토시아닌으로 통칭하여 명명한다.

<표 1> 대표적인 안토시아니딘

구체적으로, 각 분자 구조 중 R 그룹에서 하이드록실(hydroxyl)기의 갯수와 특정 하이드록실기의 메틸(methyl)화에 의해 보통 6종의 안토시아니딘, 즉 시아니딘(cyanidin), 델피니딘(delphinidin), 말비딘(malvidin), 펠라르고니딘(pelargonidin), 페오니딘(peonidin), 페튜니딘(petunidin)으로 구분되고(표 1 참조), 안토시아니딘의 특정 R 그룹에 당이 결합된 안토시아닌, 즉 시아닌(cyanin), 델피닌(delphinin), 말빈(malvin), 펠라르고닌(pelargonin), 페오닌(peonin), 페튜닌(petunin)으로 구분된다. 본 발명에 따른 안토시아닌은 상기 기재된 안토시아닌으로부터 선택되는 것이 바람직하며, 화학식 2 내지 화학식 5로 기재되는 시아니딘-3-삼부비오시드-5-글루코시드(Cyanidin 3-sambubioside-5-glucoside), 시아니딘 3,5-디글루코시드(Cyanidin 3,5-diglucoside), 시아니딘 3-삼부비오시드(Cyanidin 3-sambubioside), 시아니딘 3-글루코시드(Cyanidin 3-glucoside)로 구성되는 군으로부터 선택되는 것이 더욱 바람직하다.

안토시아닌은 딸기, 체리, 검은 콩, 검은 깨, 포도, 흑미, 가지, 블랙베리(black berry), 아로니아(chokeberry), 빌베리(bilberry), 블루베리(blue berry), 레드 커런트(red currant) 엘더베리(elderberry) 및 블랙 커런트(black currant)등으로부터 추출하여 사용하거나, 시판되고 있는 안토시아닌 함유 제품 (Medox(MedPalett Pharmaceuticals AS, Norway), San Red No. 5F(San-Ei Gen F.F.I. Inc., Japan), Rubini(Artemis International, USA) 또는 cyanidin, Cyanidin 3-glucoside 및 cyanidin 3,5-diglucoside(Indofine chemical company Inc., USA)등)을 사용할 수 있다.

안토시아닌 추출은 물을 이용한 추출과 알콜 및 산을 첨가한 알콜류를 이용하여 추출한다. 물로 추출할 경우 불용성 물질을 여과지로 여과하고, 실리카겔 역상 컬럼 크로마토그래피법으로 고순도의 수수한 안토시아닌 성분을 분리 정제할 수 있으며, 산 가수분해를 통해 당 성분과 염산이 제거된 순수한 안토시아니딘을 분리할 수 있다. 또한, 알콜 및 산을 첨가한 알콜류를 이용할 경우 이온 컬럼 크로마토그래피법, 분취 박층 크로마토그래피법, 분취 고속 액체 크로마토그래피법, 액체 분배 추출법, 침전법 등을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 더불어, 안토시아닌을 안정화하기 위하여 시트르산(citric acid) 및 헤미셀룰로스(hemicelluloses)등이 포함될 수 있다.

상기 안토시아닌을 뇌졸중 모델에 300 mg/kg의 농도로 MCAo 수술 하루 전과 30분 전에 경구 투여하여 뇌경색의 진행 여부를 확인한 결과, 뇌경색이 일어나지 않은 뇌세포는 건강한 모양을 보여주는 반면, 뇌경색이 일어난 뇌세포들은 핵과 세포질의 응축으로 크기가 작아졌으며 세포사멸로 보여지는 모양을 나타내었다(도 1 및 도 2 참조).

또한, MCAo 수술을 시행한 쥐의 안토시아닌 미투여 대조군(도 3의 A 참조)과 MCAo 수술을 시행한 쥐의 안토시아닌 투여군(도 3의 B 참조)의 뇌경색이 일어난 부위를 면역염색한 결과 p-JNK와 p53 항체에 의해 염색된 세포들이 관찰되었는데, 안토시아닌 미투여 대조군의 p-JNK와 p53 항체로 염색된 세포들은 염색된 정도가 선명하였으나 안토시아닌 투여군에서는 염색된 정도가 현저하게 흐려진 것을 관찰할 수 있며, 뇌경색이 일어나지 않은 대조군(도 3의 C 참조)에서는 염색된 세포들이 관찰되지 않았다. 더불어, 정상 뇌피질, MCAo 수술을 시행한 뇌피질, 안토시아닌을 투여한 후 MCAo 수술을 시행한 쥐의 뇌피질을 이미지 분석 프로그램(Image J, ver 1.34n, NIH)을 사용하여 웨스턴 블랏 결과를 분석한 결과, MCAo 수술을 시행한 군(대조군 및 안토시아닌 투여군) 모두에서 p-JNK와 p53의 양이 증가하였으나 안토시아닌을 투여한 군에서는 MCAo 수술만을 시행한 군에 비하여 p-JNK와 p53의 발현양이 감소된 것이 관찰되었다(도 4 참조). 이로써, 높은 농도의 안토시아닌의 경구 투여가 통계적으로 유의하게 뇌경색의 증상을 개선시키는 뇌세포 보호 효과를 나타냄을 증명하였다.

또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호용 약학적 조성물을 제공한다. 더불어, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명의 뇌경색 및 뇌졸중 치료용 약학적 조성물 및 뇌세포 보호용 약학적 조성물은 임상투여시에 경구 또는 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제 의 형태로 사용될 수 있다.

본 발명의 보호제, 치료제 및 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여를 위하여 제제화하는 경우 통상적으로 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다. 경구 투여를 위한 제제에는 정제, 환제, 산제, 트로키, 엘릭시르, 서스펜션, 시럽, 웨이퍼, 과립제, 캡슐제 등이 있으며, 이러한 제제는 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose), 락토스(lactose), 만니톨, 아밀로펙틴, 셀룰로스 유도체, 젤라틴 등이 사용된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 또 다른 적합한 성분, 붕해제 및 윤활제, 예를 들면 칼슘 스테아레이트, 나트륨 스테아릴 푸마레이트, 폴리에틸렌 글리콜 왁스, 마그네슘 스테아레이트, 탈크등도 사용될 수 있다.

비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결 건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성 용제, 현탁 용제로는 프로필렌 글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸 올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 치료용 조성물 및 뇌세포 보호제는 임상 투여시에 비경구로 투여, 예를 들면, 정맥주사, 근육주사, 또는 병소에의 직접주입이 가능하며, 레밍턴 문헌(Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 참조하여 각 질환의 정도, 종류 또는 유효성분에 따라 일반적인 의약품 제제의 형태로 제조될 수 있다.

본 발명의 안토시아닌을 포함하는 조성물의 투여량은 투여대상, 투여방법, 증상에 따라 결정되지만, 1일에 체중당 50mg 내지 500mg, 바람직하게는 75mg 내지 300mg의 양으로 투여되도록 하며, 일반적으로 투여 회수는 1일 2회 이상이 바람직하나 증상 정도에 따라 투여 회수 또한 조절될 수 있다. 그러나, 상기 투여량은 변화시킬 필요가 있으며, 특히 치료할 개체의 체질 특이성 및 체중, 질병의 종류 및 심도, 제형의 성질, 의약품 투여의 성질, 및 투여기간 또는 간격을 고려해서 변화시킬 수 있으며 또한, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하며, 환자의 상태 및 질환의 발병 정도에 따라 변할 수 있다.

나아가, 본 발명의 치료용 조성물은 뇌경색 및 뇌졸중 관련된 질환의 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.

본 발명의 안토시아닌은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다

또한, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호용 건강 기능 식품을 제공한다. 더불어, 본 발명은 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방용 건강 기능 식품을 제공한다. 상기 건강 기능 식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등의 형태로 제조, 가공하거나 통상의 식품, 즉 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디 류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등에 안토시아닌을 첨가하여 제조할 수 있다. 상기와 같이 식품 또는 음료에 첨가하는 경우 본 발명의 안토시아닌은 전체 식품 중량의 0.1 내지 15 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100㎖ 기준으로 0.1~30g, 바람직하게는 1~10g의 비율로 가할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 안토시아닌의 뇌경색 억제능 확인 1

<1-1> 뇌졸중 동물모델 제작 및 조성물 투여

체중이 250-300g에 도달한 쥐(Sprague-Dawley rat, 오리엔트(주))를 이용하여 뇌졸중 모델을 제작하였다.

수컷 쥐에 소듐 펜토바비탈(sodium pentobarbital)을 50mg/kg 농도로 복강투여하여 마취시키고, 쥐 머리의 오른쪽 눈과 귀 사이를 절개하고 해골과 뇌막을 조심스레 제거하여 중뇌 동맥(middle cerebral artery)과 양쪽 경동맥을 노출시켜 미세 동맥 결찰용 클립을 이용하여 말단(distal) 부위를 1시간 동안 결찰한 후 클립을 제거하여 24시간 동안 혈액을 재관류시켜 뇌졸중 모델(Middle Cerebral Artery occlusion-MCAo/reperfusion model)을 제작했다. 수술중에는 적외선램프를 이용하여 체온을 37℃로 유지하였다.

상기 쥐에 30 mg/ml의 농도가 되도록 안토시아닌을 멸균증류수에 녹인 다음 이를 300 mg/kg(쥐의 체중)의 양으로 상기 MCAo 수술 하루 전과 30분 전에 경구투여하였다. 본 실시예에서는 안토시아닌은 7% 페오닌(페오니딘 포함), 80% 시아닌(시아니딘 포함), 15% 델피닌(델피니딘 포함) 및 3% 말빈(말비딘 포함)으로 구성된다(MedPalett Pharmaceuticals AS, Norway).

<1-2> 뇌경색 범위 측정

상기 쥐의 뇌경색 범위를 측정하기 위해 소듐 펜토바비탈(sodium pentobarbital)로 다시 마취하여 적출한 뇌를 주형(brain matrix)에 넣어 2mm의 두께로 잘라 6개의 조각으로 나누었다. 2,3,5-TTC(triphenyltetrazolium chloride)를 생리식염수에 2%가 되도록 만든 후, 상기 조직을 넣고 37℃에서 30분 동안 반응시킨 후 디지털카메라를 이용하여 사진을 찍고 분석 프로그램(TINA 2.0 program, KAIST)을 이용하여 그 범위를 측정하였다. 도 1에서 붉은색 부분은 정상부위이고 흰색 부분이 경색이 일어난 부위이다. 도 1의 A는 안토시아닌을 첨가하지 않은(vehicle) 대조군이고, 도 1의 B는 300mg/kg 안토시아닌을 첨가한 군이다.

그 결과, 안토시아닌을 투여한 쥐의 뇌경색 부위가 통계적으로 유의하게 감소하였음을 나타내었다(도 1의 C 참조).

<1-3> 뇌경색 부위의 조직학적 관찰

뇌경색 부위에서 조직학적 소견을 관찰하기 위해서 먼저 10 U/ml 헤파린이 포함되어있는 살린(saline) 용액으로 혈액을 제거한 후 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)를 심장으로 관류시켜 뇌를 고정하였다. 고정한 뇌를 파라핀에 담가 굳힌 후 마이크로톰(microtome, Leica microsystems)을 이용하여 4 μm로 잘라 슬라이드에 붙이고 자일렌(xylene)과 에탄올에 차례로 담궈 탈파라핀시켜 염색을 준비하였다. 상기 준비된 조직으로 헤마톡실린 및 에오신(Haematoxylin & Eosin, 이하 H&E로 칭함) 염색을 하였다. 헤마톡실린에 약 1분간 담궜던 조직을 흐르는 물에 충분히 세척하고 에오신에 약 30초간 담궜다가 에탄올로 세척하고 커버슬라이드를 덮어 염색된 세포들을 관찰하였다.

H&E 염색하여 뇌경색이 일어나지 않은 왼쪽 뇌 반구(도 2의 A 참조)와 뇌경색이 일어난 오른쪽 뇌 반구(도 2의 B 참조)를 비교한 결과, 왼쪽 뇌 반구의 세포는 건강한 모양을 보여주는 반면, 뇌경색이 일어난 오른쪽 뇌 반구의 세포들은 핵과 세포질의 응축으로 크기가 작아졌으며 세포사멸로 보여지는 모양을 나타내었다.

<1-4> 면역화학염색 분석

안토시아닌의 투여가 세포사멸에 관계된 신호전달체계에 관여하는지 알아보기 위해 면역화학염색법과 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다.

면역화학염색은 상기 실시예 1-3의 방법으로 탈파라핀시킨 뇌조직을 메탄올에 3% 과산화수소수를 함유한 과산화효소 소광 용액(peroxidase quenching solution)을 10분간 처리 후, PBS로 충분히 씻어내고, 염색 키트(Histostain®-plus bulk kit, Zymed laboratories, USA)를 사용하여 시행하였다. 먼저 시약 A 처리 후 phospho-JNK 항체와 p53 항체(Santacruz biotechnology, USA)를 1:250으로 희석하여 PBS에 희석하여 4℃에서 하루 동안 반응시킨 다음, 키트의 시약 B와 C를 차례로 20분씩 처리한 후 발색 시약 키트(DAB(3,3'-Diaminobenzidine tetrahydrochloride)-plus kit)(Zymed laboratories, USA)를 이용하여 약 3-5분간 발색시키고 커버 슬라이드를 덮어 면역염색된 세포들을 현미경으로 관찰하였다.

도 3에서 상부 그림은 뇌경색이 일어난 부위를 빗금으로 표시한 것이고, 중간 사진은 p-JNK 항체를 이용하여 염색한 결과이며, 제일 하부 사진은 p53 항체를 이용하여 염색한 결과를 나타낸다. 도 3의 C는 대조군으로서 뇌경색이 일어나지 않은 반대쪽 뇌반구를 염색한 것이다. 상기 도 3에서 나타내었듯이, MCAo 수술을 시행한 쥐의 안토시아닌 미투여 대조군(도 3의 A 참조)과 MCAo 수술을 시행한 쥐의 안토시아닌 투여군(도 3의 B 참조)의 뇌경색이 일어난 부위에서 p-JNK와 p53 항체로 염색된 세포들이 관찰되었으며 그 부위는 TTC 염색시 뇌경색이 일어난 부위와 유사한 정도의 범위로 관찰되었다. 또한, 안토시아닌 미투여 대조군의 p-JNK와 p53 항체로 염색된 세포들은 염색된 정도가 선명하였으나 안토시아닌 투여군에서는 염색된 정도가 현저하게 흐려진 것을 관찰할 수 있었다. 그러나, 뇌경색이 일어나지 않은 대조군(도 3의 C 참조)에서는 염색된 세포들이 관찰되지 않았다.

또한, 상기에서 각 항체로 염색된 세포들의 수를 입체 분석 프로그램(Stereo Investigator®, Microbrightfield, USA)을 이용하여 측정하였다. 먼저, 뇌경색 부위를 지정한 후, 현미경 400배에서 5625μm²의 카운팅 프레임(counting frame)을 이용하여 무작위로 세포수를 세고 분획(fractionator) 방법을 사용하여 통계적으로 세포 수를 측정하였다. 도 3의 D 그래프에서 알 수 있듯이 안토시아닌을 투여한 군에서 염색된 세포들의 수가 현저히 감소된 것이 측정되었다. 이는 안토시아닌이 p-JNK와 p53의 세포 사멸 경로에 관여하여 세포 사멸을 억제 또는 차단함을 나타내는 결과이다.

<1-5> 웨스턴 블랏 (Western blot) 분석

웨스턴 블랏 분석을 위해 뇌의 피질 부위를 재빠르게 적출하여 -80℃에 보관하였다가 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitor, Complete Mini, Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 포함한 차가운 RIPA 용해 버퍼(upstate biotechnology, USA)와 함께 균질기에서 분쇄하여 균질화시켰다. 균질화된 시료를 브래드포드(Bradford) 정량법을 이용하여 같은 양으로 정량하고, SDS 샘플 버퍼(50mM Tris-HCL(pH 6.8), 100mM DTT, 2% SDS, 0.1% bromophenol blue, 10% glycerol)에 넣어 100℃에서 5분간 끓여 10% SDS-PAGE에서 단백질을 분리한 다음, 상기 분리된 단백질을 PVDF 막으로 이동시켰다. PVDF 막을 5% 탈지분유를 녹인 TBS 버퍼(0.02M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH 7.4)에 1시간 동안 반응시킨 다음, p-JNK와 p53 항체를 1:250의 비율로 같은 버퍼에 섞어 4℃에서 하루 동안 반응시켰다. 그런 다음, 상기 막을 0.05% tween20가 들어있는 TBS 버퍼(TBS-T)로 씻은 후, HRP(horseradish peroxidase)가 붙어있는 IgG 항체(Calbiochem, USA)에 1시간 동안 반응시키고 화학 발광키트를 이용하여 필름에 감광시켜 웨스턴 블랏 분석을 수행하였다(도 4 참조).

도 4의 A에서 첫번째 줄은 쥐의 정상 뇌피질, 두 번째 줄은 MCAo 수술을 한 뇌피질, 세 번째 줄은 안토시아닌을 투여한 후 MCAo 수술을 시행한 뇌피질의 결과이며, β-튜불린(tubulin)은 단백질이 같은 양이 전기영동된 것을 확인하기 위한 대조군으로 이용하였다.

이미지 분석 프로그램(Image J, ver 1.34n, NIH)을 사용하여 상기 웨스턴 블랏 결과를 분석한 결과, 안토시아닌을 투여한 군에서는 MCAo 수술만을 시행한 군에 비하여 p-JNK와 p53의 발현양이 감소된 것이 관찰되었다.

상기 결과들로 미루어보아, 높은 농도의 안토시아닌의 경구투여가 뇌경색의 증상을 통계적으로 유의하게 개선시키는 뇌세포보호 효과를 나타내었는데, 이는 안토시아닌이 염증반응 및 세포사멸과 관계된 세포내 신호전달경로 중 하나인 p-JNK 및 p53 경로에 관여하는 것을 나타내는 것이다.

< 실시예 2~10> 안토시아닌의 뇌경색 억제능 확인 2

실시예 2 내지 실시예 10은 하기의 표 2와 같은 구성비로 이루어진 안토시아닌을 사용하여 상기 실시예 1의 방법에 따라 안토시아닌이 뇌세포 보호 효과 및 뇌경색 및 뇌졸중 억제 효과가 있는지를 확인하였다. 또한, 실시예들에 사용된 안토시아닌은 표 2에 나타낸 안토시아닌의 어글리콘이 포함된 것이며, MedPalett Pharmaceuticals AS(Norway), San-Ei Gen F.F.I. Inc.(Japan), Artemis International(USA) 및 Indofine chemical company Inc.(USA)로 부터 구매하여 사용되었다.

<표 2> 각 실시예에서 사용된 안토시아닌

	시아닌	델피닌	페오닌	펠라르고닌	말빈	페튜닌
실시예 2	100%
실시예 3	70%	7%	5.5%	2%	0.5%
실시예 4	50%	25%	10%		10%	5%
실시예 5	45%	35%		20%
실시예 6	60%		20%	20%
실시예 7	30%	35%			25%
실시예 8	60%		40%
실시예 9	55%	40%			5%
실시예 10	85%		15%

상기 실시예 2 내지 실시예 10을 통하여, 실시예 1에 의한 결과와 같이 안토시아닌의 투여가 통계적으로 유의하게 뇌경색의 증상을 개선시키는 뇌세포 보호 효과를 나타냄을 확인할 수 있었다.

< 제제예 1> 제제의 제조

<1-1> 산제의 제조

본 발명의 실시예 1에 따른 안토시아닌 2g

유당 1g

상기의 성분을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

<1-2> 정제의 제조

본 발명의 실시예 1에 따른 안토시아닌 100㎎

옥수수전분 100㎎

유 당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

<1-3> 캡슐제의 제조

본 발명의 실시예 1에 따른 안토시아닌 100㎎

옥수수전분 100㎎

유당 100㎎

스테아린산 마그네슘 2㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

<1-4> 주사액제의 제조

본 발명의 실시예 1에 따른 안토시아닌 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명에 따른 안토시아닌을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120℃에서 15분 이상 오토클래이브(autoclave)시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

< 제제예 2> 식품의 제조

본 발명의 안토시아닌을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

<2-1> 밀가루 식품의 제조

본 발명의 실시예 1에 따른 안토시아닌 0.1 ∼ 5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

<2-2> 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 실시예 1에 따른 안토시아닌 0.1 ∼ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

< 제제예 3> 음료의 제조

<3-1> 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 본 발명의 실시예 1에 따른 안토시아닌(20%)을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

<3-2> 과일쥬스의 제조

본 발명에 따른 안토시아닌(Rubini) 0.5 g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명은 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호제, 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제는 뇌세포 보호 효과를 나타내어 뇌경색 및 뇌졸중의 증상을 개선시키므로 뇌졸중 및 뇌경색 예방 및 치료제 개발 등에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (10)

1. 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호제.

   <화학식 1>

   

   상기 화학식 1에서, R₁ 내지 R₇은 서로 독립적이며, -H, -OH, -OCH₃ 이며, 더불어 R₄, R₅는 당(글루코스, 갈락토스, 만노스, 자일로스 등)이 포함될 수 있다.
2. 제 1항에 있어서, 안토시아닌은 시아니딘(cyanidin), 델피니딘(delphinidin), 말비딘(malvidin), 펠라르고니딘(pelargonidin), 페오니딘(peonidin), 페튜니딘(petunidin)으로 구성되는 안토시아니딘으로부터 선택되는 것 을 특징으로하는 뇌세포 보호제.
3. 제 1항에 있어서, 안토시아닌은 시아닌(cyanin), 델피닌(delphinin), 말빈(malvin), 펠라르고닌(pelargonin), 페오닌(peonin), 페튜닌(petunin)으로 구성되는 안토시아닌으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌세포 보호제.
4. 제 3항에 있어서, 시아닌은 화학식 2 내지 화학식 5로 기재되는 시아니딘-3-삼부비오시드-5-글루코시드(Cyanidin 3-sambubioside-5-glucoside), 시아니딘 3,5-디글루코시드(Cyanidin 3,5-diglucoside), 시아니딘 3-삼부비오시드(Cyanidin 3-sambubioside), 시아니딘 3-글루코시드(Cyanidin 3-glucoside)로 구성되는 군으로 부터 선택되는 것을 특징으로 하는 뇌세포 보호제.

   <화학식 2>

   

   <화학식 3>

   

   <화학식 4>

   

   <화학식 5>

   
5. 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료제.
6. 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호용 약학적 조성물.
7. 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
8. 제 6항 또는 제 7항에 있어서, 안토시아닌을 1일당 50mg/체중 내지 500mg/체중의 용량으로 투여하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
9. 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌세포 보호용 건강 기능 식품.
10. 화학식 1의 구조를 가지는 1종 이상의 안토시아닌을 포함하는 뇌경색 및 뇌졸중 예방용 건강 기능 식품.

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