KR100803289B1 - 한약재를 이용한 불임증 치료용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 한약재를 이용한 불임증 치료용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게 녹용, 복분자, 산수유, 인삼, 산약, 복령, 지황, 목단피 및 택사로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 한약재 추출물이 고환의 상대적 및 절대적 무게를 증가시키고, 부고환의 정자 개수 및 운동성을 증가시키고, 남성 생식기를 발육시키고 기능을 유지시켜주는 테스토스테론의 농도를 증가시키고, 과산화지질 생성을 감소시킬 뿐만 아니라 정자형성과 관련된 CREM(cAMP-responsive element modulator) 유전자의 발현율을 증가시키고, CREM 단백질의 발현율 또한 현저하게 증가시키므로, 남성 불임 치료용 조성물 또는 고환 기능 증진용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

남성 불임증, 한약재

Description

한약재를 이용한 불임증 치료용 조성물{A COMPOSITION COMPRISING MEDICAL HERBS FOR INFERTILITY}

도 1 ~ 도 5는 본 발명의 일 실시예에 따른 녹용 추출물, 복분자 추출물, 산수유 추출물, 인삼 추출물 및 육미지황탕이 혈청 테스토스테론 수준에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 6 ~ 도 10은 본 발명의 일 실시예에 따른 녹용 추출물, 복분자 추출물, 산수유 추출물, 인삼 추출물 및 육미지황탕이 지질 과산화에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 11 ~ 도 15는 본 발명의 일 실시예에 따른 녹용 추출물, 복분자 추출물, 산수유 추출물, 인삼 추출물 및 육미지황탕이 CREM 유전자 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 16 ~ 도 20은 본 발명의 일 실시예에 따른 녹용 추출물, 복분자 추출물, 산수유 추출물, 인삼 추출물 및 육미지황탕이 CREM 단백질 발현에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

본 발명은 한약재 추출물을 포함하는 불임증 치료용 조성물 및 고환 기능 증진용 조성물에 관한 것이다.

불임증은 건강한 부부가 일정기간(보통 1년간) 정상적인 성생활을 하고 있음에도 임신이 성립되지 않는 상태로 정의되며, 현재 신혼부부 가운데 6 쌍의 부부 중 1 쌍의 부부 정도가 불임상태에 있다고 한다. 일반적인 경우 결혼 후 1년 내에 85%정도가 임신을 하게 되며, 임신 가능성은 결혼 1개월 내에 25%, 6개월 내에 70%, 1년 내에 85%정도 된다. 남녀의 가임능력은 남녀 모두 24세에 최고가 되며, 이후 매 5년마다 임신을 하는데에는 2배의 기간이 더 필요하며 35세 이후부터 가임능력은 급격히 저하된다.

불임은 남녀 모두에게 또는 남자나 여자 쪽에 원인이 있는 경우로 분류되며 남자 쪽에 불임의 원인이 있을 때를 남성불임증, 여자 쪽에 불임의 원인이 있을 때를 여성불임증이라 한다. 통계적으로 남성불임증 또는 여성불임증이 합하여 70%, 남성 및 여성불임이 복합하여 20% 가량이고, 그밖에 원인불명 요인이 10~15% 정도 된다고 하나, 연구 결과 약 50%가 남성에 문제가 있는 것으로 나타나고 있다[Shah K, Sivapalan G, Gibbons NJ, Tempest HG, Griffin DK, The genetic basis of infertility, Reproduction, 2003;126:13-25].

불임 가운데 남성불임의 원인은 여러 가지가 있다. 첫 번째로, 수정관의 손상, 물리적 외상 또는 감염과 같은 기관 상의 문제를 들 수 있으며, 두 번째로, 비만, 정신적 문제, 연령, 활동성, 식이습관 또는 흡연과 같은 생활습관의 문제를 들 수 있으며, 세 번째로, 확실히 규명할 수 있는 유전적 결함이 있으며, 네 번째로, 원인불명이 있다[Griffin DK, Finch KA, The genetic and cytogenetic basis of male infertility, Human Fertility, 2005;8(1):19-26].

정자(sperm)는 생식을 위해 정소의 체세포가 특정한 형태로 변형된 반수체(半數體)의 염색체인 웅성생식세포를 의미하며, 정자형성과정(Spermatogenesis)을 거처 고환에서 생성된다. 정자형성과정은 이배체 생식세포가 반수체 정자로 분화되는 복잡한 과정으로, 고환 내에서 생식원세포가 몇 번 세포분열을 해서 많은 정원세포가 되고, 이것이 다시 세포분열해서 각각 제1차 정모세포(精母細胞)가 된다. 이 세포는 성숙분열 또는 감수분열이라는 세포분열을 하는데, 대부분에서는 제1회 분열에서 염색체가 반수체로 반감된 2개의 제2차 정모세포가 된다. 다시 이 반수체 세포가 제2회의 정상분열을 해서 각각 2개의 정세포가 되어 결국 4개의 정세포가 생긴다. 즉, 유사분열을 거치는 증식기 및 정모세포가 감소 분열을 거치는 감수분열기를 거처 최종적으로 정자형성이 이루어지게 된다. 이 과정 중에는 다중적 생화학적 및 구조학적 변화와 관련되어 있고 유전자 배열의 활성화가 필요하며, 시상하부-뇌하수체 축에 의해 엄격하게 관리되며 여러 가지 호르몬의 공동작용이 필요하다.

사람의 정자는 원형질막에서 활성 산소종(ROS)를 생성되고 불포화 지방산의 과산화 작용이 시작되는데, 이것이 남성불임증의 원인으로 중요하게 인식된다. 정자 원형질막 내의 높은 다불포화 지방산 함량 및 낮은 세포질 내 ROS 제거 효소 농도로 인해 발생하여, 정자는 ROS에 유도된 손상에 매우 민감하다. 연구자들은 ROS 생성으로 인한 산화 스트레스를 정자 기능의 결함 및 불임과 연관시켰다[Sharma RK, Agarwal A. Role of reactive oxygen species in maleinfertility, Urology, 1996;48:835-50]. ROS는 세포 지질, 단백질 및 DNA에 영향을 미치며, 정자 DNA에 대한 산화 스트레스는 정상적 배아줄기세포의 발달과 밀접한 관련이 있을 수 있다[Wang X, Sharma RK, Sikka SC, Thomas AJ Jr, Falcone T, Agarwal A, Oxidative stress is associated with increased apoptosis leading to spermatozoa DNA damage in patients with male factor infertility, Fertil Steril, 2003b;80(3):531-5].

한편, cAMP-반응 인자 결합(cAMP-responsive elements; CREs) 단백질의 전사 인자인 CREM(cAMP-responsive element modulator)는 남성 생식세포의 분화와 세포자살 간을 조절하는 조절 스위치로서 발현된다[Sassone-Corsi P, CREM: a master-switch regulating the balance between differentiation and apoptosis in male germ cells, Mol . Reprod . Dev ., 2000;56:228-9]. 이것은 회문식 공감서열(palindromic consensus sequence)인 TGACGTCA로 구성되는 CREs 유전자를 타겟으로 한다. 일부 정세포-특정 유전자는 CRE을 포함하며, 이는 CREM 전사인자에 대한 결 합자리 역할을 한다. 상기 분화 과정에서 중요한 역할을 하는 cAMP-신호 경로에 대한 최근 연구에 의해서 CREM 전사인자가 고환 내 cAMP-의존 유전자에서 조절 스위치로서 작용함을 알아냈다[Nantel F, Monaco L, Foulkes NS, Masquilier D, LeMeur M, Henriksen K, Dierich A, Parvinen M, Sassone-Corsi P, Spermiogenesis deficiency and germ cell apoptosis in CREM-mutant mice, Nature, 1996;380:159-62]. CREM은 고환 내에서 대체 프로모터, 부착 억제물질(splicing repressor) 및 CREM 전사 활성자로 작용하는 cAMP-관련 전사인자이다[Behr R, Weinbauer GF, CREM activator and repressor isoforms in human testis: sequence variations and inaccurate splicing during impaired spermatogenesis, Mol Hum Reprod ., 2000;6(11):967-72]. 따라서, 몇몇 CREM 억제물질 전사인자를 포함하고 있는 성인의 고환에서의 변형된 전사 부착(transcript splicing)은 정자형성의 손상과 관련이 있다. 또한, 반수체 정세포에서는 CREM이 유전자 발현에 관여하며, 원형 정세포의 성숙 정지증(arrest of round spermatid maturation)을 보이는 불임 남성은 CREM 단백질 및 CREM mRNA가 급속하게 감소하거나 매우 부족한 것으로 나타난다.

이에, 본 발명자들은 불임 치료 효과가 있는 성분을 한약재에서 탐색하던 중, 녹용, 복분자, 산수유, 인삼, 숙지황, 복령, 산약, 목단피 및 택사 추출물이 고환의 기능을 증진시키고, 정자의 수 및 운동성을 개선하고, 산화 스트레스에 대한 항산화 효과가 있을 뿐 아니라 혈청 테스토스테론 농도, CREM 유전자 및 단백질 발현을 증가시킴을 확인함으로써 남성 불임 치료용 조성물 또는 고환 기능 증진용 조 성물에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 한약재 추출물을 포함하는 불임증 치료용 조성물을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 한약재 추출물을 포함하는 고환 기능 증진용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 한약재 추출물을 포함하는 불임증 치료용 조성물 및 고환 기능 증진용 조성물을 제공하며, 상기 한약재는 녹용, 복분자, 산수유, 인삼, 숙지황, 산약, 복령, 목단피 및 택사로 이루어진 군으로부터 하나 이상 선택할 수 있다. 상기 한약재로서 산수유, 숙지황, 산약, 복령, 목단피 및 택사가 선택될 경우, 바람직하게 육미지황탕으로 제조하여 사용할 수 있다.

이하, 본 발명에 관하여 상세히 설명한다.

녹용(Cervi Parvum Corun)은 사슴과(Cervidae)에 속하는 매화록(Cervus Nippon Temminck Var. Mantcharicus Swinhoe), 마록(Cervus elaphus L.) 또는 기타 종속의 골질화가 안된 어린뿔을 채취하여 건조한 것으로, 동의보감 등의 문헌에 녹용은 강장작용, 보기혈작용, 진통작용, 생장발육촉진작용, 심부전증 치료작용 및 기능항진작용 등이 있으며, 피로회복, 신체활력 증강 및 신장의 이뇨기능 강화효과 등 많은 효능이 있는 것으로 알려져 있다. 녹용은 아미노산, 폴리펩티드, 미량 원소, 탄수화물, 헥소스아민, 무코폴리사카라이드, 우론산, 시알산, 프로스타글란딘, 당지질, 인지질, 핵산, 하이포잔틴, 콜레스테롤, 콜레스트-5-엔-3,7디올 및 콜레스테롤 에스테르를 포함하고 있는 것으로 알려져 있다. 녹용은 토끼에서 빈혈을 개선하고, 녹용의 폴리사카라이드 및 라이소포스파티딜콜린은 각각 항위염 및 저혈압 증상에 효과가 있다[Wang BX, Zhao XH, Qi SB, Kaneko S, Hattori M, Namba T, Nomura Y, Effects of repeated administration of deer antler (Rokujo) extract on biochemical changes related to aging in senescence-accelerated mice, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 1988b;36:2587-92]. 또한, 항염증 효과가 있어 경추부염좌(whiplash) 및 스트레스 치료에 유용하게 사용되며, 항노화제, 관절염 치료제로 사용될 수 있다.

복분자(Rubi Fructus)는 복분자딸기(Rubus coreanus MIQ., R. oldhamii MIQ., R. idaeus LINNE var. concolor NAKAI, 및 R. phoenicolasius MAXIM.,)의 열매를 건조한 것으로, 허약체질, 정액루(spermatorrhea), 유뇨(enuresis), 천식(asthma) 및 알레르기성 질환에 사용되며, 건위제(stomachic) 및 강장제로 이용된다. 복분자는 비타민 C뿐만 아니라 안토시아닌(Anthocyanin) 및 엘라지탄닌(Ellagitannin)의 두 그룹으로 구성되는 항산화 물질을 포함한다. 안토시아닌은 딸기 열매 및 포도에서 주로 발견되는 폴리페놀로, 심장질환 및 특정 암에 대한 보호 효과가 있으며, 엘라지탄닌은 차, 많은 약용식물 및 일부 과일에서 발견되는 엘 라지산(ellagic acid) 유도체의 복합체이다. 안토시아닌 및 폴리페놀은 시험관 내에서 화학적으로 생성된 슈퍼옥사이드 라디칼에 대해 항라디칼 활성을 나타낼 뿐 아니라 잔탄 옥시다아제(xanthine oxidase)를 억제하는 것으로 알려져 있다.

산수유(Corni fructus)는 산수유나무(Cornus officinalis Sieb. et Zucc.)의 열매로 한의학에서 강장제로 사용되고 있으며, 간 및 신장을 보호한다. 산수유의 주요 성분은 사포닌, 페놀산(갈릭산, 탄닌산 및 우르솔산) 및 로가닌(loganin)을 포함한다. 산수유는 혈압강화, 식균작용이 있으므로 항알레르겐, 수렴제 및 이뇨제로서 알레르기, 천식, 배뇨장애, 허약체질, 신장증, 식은땀, 정액루, 포도상구균 감염 및 현기증에 사용될 수 있다.

인삼(Panax ginseng C.A. Meyer)은 쌍떡잎식물 산형화목 드릅나무과의 여러해살이풀로, 그의 뿌리는 동양에서 약용으로 사용된지 2000년이 되었고, 현재 전세계적으로 사용되고 있다. 인삼 뿌리는 진세노사이드(ginsenosides), 폴리아세틸렌(polyacetylenes) 및 산성 폴리사카라이드 등의 다양한 약학적 성분을 포함한다. 인삼의 활성은 진생 사포닌으로도 불리는 진세노사이드에 의해 나타나며, 과학자들은 인삼 뿌리로부터 38 종의 진세노사이드를 분리하였고, 진세노사이드의 80% 이상이 진세노사이드 Rb1, Rb2, Rc, Re 및 Rg1로 이루어져 있음을 알아내었다. 인삼은 심장보호제뿐 아니라 헬리코박터 파일로리 관련 위 점막세포 손상에 대한 위보호제로서 작용한다. 또한, 인삼은 페놀계 화합물의 좋은 공급원이며, 항산화제를 다량 함유하고 있어 노화가 진행됨에 따라 증가하는 산화제 생성 및 산화적 단백질 손상을 억제하고, 항알레르기 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

육미지황탕(六味地黃丸)은 전통적인 한약재 조성물의 하나로서, 숙지황, 산약, 산수유의 세 가지 강장용 약용식물 및 복령, 목단피, 택사의 세 가지 배출용 약용식물로 구성된다. 육미지황탕은 신장 및 간을 보하고 강하게 만들며, 등 하부의 통증, 어지럼증, 정액루, 식은땀, 현기증, 귀울림, 귀먹음 등의 치료에 사용된다. 최근, 육미지황탕이 기억력 증진, 항산화제 작용 및 항당뇨 작용이 있음이 보고되었고, 노쇠(senescence)가 촉진된 마우스 모델에서 시상하부-뇌하수체-난소 축추(hypothalamus-pituitary-ovary axis)를 조절하는 작용이 있는 것으로 밝혀졌다[Ma et al., Study on effect and mechanism of liuwei dihuang decoction in modulating hypothalamus-pituitary-ovary axis in senescence accelerated mice model, Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi 2004;24:325-30].

상기 본 발명에서 사용되는 녹용, 복분자, 산수유, 인삼, 숙지황, 산약, 복령, 목단피 또는 택사의 추출물은 당 업계에 공지된 방법에 의해 추출용매로서 물, C₁ ~ C₄ 알코올 또는 이들의 혼합용매를 사용하여 깨끗하게 세척 및 건조된 각각의 한약재로부터 가열, 증기 추출법 등의 추출법으로 추출할 수 있다. 바람직하게 본 발명에서는 용매로서 물을 사용하여 1 ~ 5시간 끊이는 열수 추출법을 이용한다.

본 발명의 일 실시형태로서 상기 한약재 가운데 산수유, 숙지황, 산약, 복령, 목단피 및 택사를 선택하여 추출물을 제조할 시 육미지황탕의 형태로 사용할 수 있으며, 이때 산수유 16 중량부, 숙지황 32 중량부, 산약 16 중량부, 복령 12 중량부, 목단피 12 중량부 및 택사 12 중량부로 혼합하여 사용하는 것이 바람직하다.

상기 방법에 의해 제조된 한약재 추출물들을 랫트에 투여하면, 고환의 상대적 및 절대적 무게를 증가시키고, 부고환의 정자 개수 및 운동성을 증가시키고, 남성 생식기를 발육시키고 기능을 유지시켜주는 테스토스테론의 농도를 증가시고, 과산화지질 생성을 감소시킨다. 또한, 정자형성과 관련된 CREM(cAMP-responsive element modulator) 유전자의 발현율을 증가시키고, CREM 단백질의 발현율 또한 현저하게 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 의한 각각의 한약재 추출물들은 생식기능과 관련하여 고환의 성장을 촉진하며 정자의 특성을 개선하고 산화스트레스에 대한 항산화 효과가 인정되었을 뿐 아니라 혈중 테스토스테론 농도와 CREM 유전자 및 단백질의 발현을 현저하게 개선하는 기전을 통하여 남성불임에 효과가 있어 남성 불임 치료용 조성물 또는 고환 기능 증진용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물일 수 있으며, 경구 또는 비경구 어느 수단으로라도 투여할 수 있다. 투여 제형에는 특별한 제한은 없지만, 환자의 연령, 성별 또는 질환의 경중뿐만 아니라 제형에 따라 결정될 것이다.

경구용의 제제로는 예를 들면, 정제, 환제, 산제, 과립제, 시럽제, 액제, 현탁제, 에멀션 또는 캅셀제의 형태로 사용될 수 있다. 비경구용의 제제로는, 주사제, 경직장용제제, 경피용제제 등을 들 수 있고, 정맥내, 피하근육내, 복강내 등의 투여경로로 투여될 수 있다. 경구투여가 일반적으로 바람직하다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분에 통상적으로 사용되는 약학적으로 허용되는 부형제, 붕해제, 결합제, 윤활제, 용해제, 보존제, 안정제, 완충제, 코팅제 등과 혼합함으로써 원하는 투여형태로 만들 수 있다.

상기에서 정제 제형을 위해서 당 업계에서 공지된 다양한 담체를 사용할 수 있다. 전형적인 담체의 예로는 락토오스, 사카로오스, 염화 나트륨, 글루코오스, 우레아, 스타치, 칼슘 카르보네이트, 카올린, 결정 셀룰로오스 및 규산과 같은 부형제; 물, 에탄올, 프로판올, 단미시럽, 글루코오스 용액, 스타치 용액, 젤라틴 용액, 카르복시메틸셀룰로오스, 쉘락, 메틸 셀룰로오스, 포타슘 포스페이트 및 폴리비닐 피롤리돈 슈거 등과 같은 결합제; 드라이 스타치, 소듐 알기네이트, 아거 파우더, 나미나란 파우더, 소듐 바이카르보네이트, 칼슘 카르보네이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르, 소듐 라우릴 술페이트, 스테아르산 모노글리세라이드, 스타치 및 락토오스와 같은 붕해제; 사카로오스, 스테아린, 카카오 버터 및 수소화 오일과 같은 붕해보조제; 4급 암모늄염 및 소듐 라우릴 술페이트와 같은 흡수 촉진제; 글리세린 및 전분과 같은 습윤제; 전분, 락토오스, 카올린, 벤토나이트 및 콜로이드 규산과 같은 흡수제; 정제 탈크, 스테아레이트, 붕산 파우더 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제를 포함한다. 필요하다면, 정제를 코팅(예컨대, 슈거코팅, 젤라틴코팅, 장용코팅 또는 필름코팅)할 수 있고, 정제를 이층정 또는 다층정으로 형성할 수 있다.

환제 제형을 위해서, 당 업계에서 공지된 다양한 담체를 사용할 수 있다. 그 예로는, 글루코오스, 락토오스, 스타치, 카카오 오일, 수소화 식물유, 카올린 및 탈크와 같은 부형제; 아라비아 검 분말, 트라가칸트 파우더, 젤라틴 및 에탄올과 같은 결합제; 및 라미나란 아거와 같은 붕해제를 포함한다.

주사제로 제형화할 경우에는, 혈액과 등장인 멸균액 또는 현탁액이 바람직하다. 액제, 에멀션 또는 현탁액 제형을 위해서, 당 업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 희석제를 사용할 수 있다. 그 예로는, 물, 에틸 알콜, 프로필렌 글리콜, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 프로폭실화 이소스테아릴 알콜 및 폴리옥시에틸렌 솔비탄 지방산 에스테르를 포함한다. 이러한 경우에, 염화 나트륨, 글루코오스 또는 글리세린을 등장액으로 제조하기에 충분한 양 또는 통상의 용해 보조제, 완충제, 스무딩제 등을 가하기에 충분한 양으로 포함할 수 있다. 또한, 발색제, 보존제, 아로마 화학제, 향미제, 감미제 또는 그 외의 약제를 필요하다면 가할 수 있다.

본 발명의 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 일반적으로 체중 ㎏당 500 ~ 1,000 ㎎의 양을 매일 또는 격일 투여하거나 1일 1 ~ 4회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나 성별, 체중, 연령 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 조성물은 남성 불임증의 치료 또는 고환 기능 증진을 목적으로 건강식품일 수 있다. 본 발명에 따른 한약재 추출물들을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 한약재 추출물들을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분 의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시에는 본 발명에 따른 한약재 추출물들은 원료에 대하여 0.01 ~ 10 중량부, 바람직하게는 0.05 ~ 1 중량부의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.

상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

본 발명의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 디사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 0.01 ~ 0.04 g, 바람직하게는 약 0.02 ~ 0.03 g 이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0.01 ~ 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 녹용 추출물의 제조

사슴의 뿔인 녹용은 영웅 한약사(한국)에서 구입하여 사용하였다. 건조된 녹용 300 g을 물 6 ℓ에 넣고 100℃에서 2시간 끊인 후, 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 여과물은 감압 조건하에서 동결건조하여 71.66 g (24%)의 추출물 분말을 얻어 4℃에서 보관하였다. 실험에 사용하기 전, 건조된 추출물을 증류수에 녹이고 실온에서 2분간 격렬하게 섞었다.

< 실시예 2> 인삼 추출물의 제조

고려인삼의 뿌리인 인삼은 원광 한약사(한국)에서 구입하여 사용하였다. 건조된 인삼 300 g을 6 ℓ의 물에 넣고 100℃에서 2시간 끊인 후, 여과하고 감압 조건 하에서 농축하였다. 농축된 여과물을 감압 조건하에서 동결 건조하여 76.60 g(26%)의 추출물 분말을 얻어 4℃에서 보관하였다. 실험에 사용하기 전에 건조된 추출물은 증류수에 녹여 실온에서 2분 동안 격렬하게 섞었다.

< 실시예 3> 산수유 추출물의 제조

산수유나무의 열매인 산수유는 원광 한약사(한국)에서 구입하여 사용하였다. 건조된 산수유 300 g을 6 ℓ의 물에 넣고 100℃에서 2시간 끊인 후, 여과하고 감압 조건 하에서 농축하였다. 농축된 여과물을 감압 조건하에서 동결 건조하여 96.0 g(32%)의 추출물 분말을 얻어 4℃에서 보관하였다. 실험에 사용하기 전에 건조된 추출물은 증류수에 녹여 실온에서 2분 동안 격렬하게 섞었다.

< 실시예 4> 복분자 추출물의 제조

복분자딸기의 열매인 복분자는 원광 한약사(한국)에서 구입하여 사용하였다. 건조된 복분자 300 g을 6 ℓ의 물에 넣고 100℃에서 2시간 끊인 후, 여과하고 감압 조건 하에서 농축하였다. 농축된 여과물을 감압 조건하에서 동결 건조하여 57.30 g(19%)의 추출물 분말을 얻어 4℃에서 보관하였다. 실험에 사용하기 전에 건조된 추출물은 증류수에 녹여 실온에서 2분 동안 격렬하게 섞었다.

< 실시예 5> 육미지황탕 조성물 및 추출물의 제조

육미지황탕을 제조하기 위하여 숙지황, 산약, 산수유, 복령, 목단피 및 택사를 원광 한약사(한국)에서 구입하여 사용하였다. 건조된 숙지황 32 g, 산약 16 g, 산수유 16 g, 복령 12 g, 목단피 12 g, 택사 12 g (총 300 g)을 6 ℓ의 물에 넣고 100℃에서 2시간 끊인 후, 여과하고 감압 조건하에서 농축하였다. 농축된 여과물을 감압 조건하에서 동결 건조하여 84.70 g(28.23%)의 추출물 분말을 얻어 4℃에서 보관하였다. 실험에 사용하기 전에 건조된 추출물은 증류수에 녹여 실온에서 2분 동안 격렬하게 섞었다.

< 실험예 1> 실험동물 및 시료의 준비

<1-1> 실험동물, 그의 혈청 및 고환의 준비

8주된 수컷 위스타 랫트 (Wistar rats)를 SLC 사(일본)에서 구입하여 특정 병원체 부재 환경에서 12/12시간 명/암 조건으로 경희대학교에 있는 실험동물 관리 및 사용 센터에서 사육하였다. 실험동물의 관리 및 실험 방법은 “실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침”[Department of Health, Education, and Welfare, NIH publication # 78-23, 1996]을 따랐다. 실험동물은 표준 설치류 사료(퓨리나, 한국) 및 물을 자유롭게 섭취하도록 하였다.

각 한약재들의 처리기간이 끝나면, 랫트들을 펜토바비탈 소듐(50 mg/kg)을 복강내 주사하여 마취시켰다. 고환을 적출(testis)하여 접합 조직을 제거하고 실험예 2에서 무게를 측정하였으며, 적출된 부고환은 실험예 3의 정자 분석에 사용하 였다. 혈청은 심장천자(cardiac puncture)를 통해 혈액으로부터 분리하였고, 하기 실험예 4의 혈청 테스토스테론 정량 분석 및 실험예 5의 간 생화학 실험을 위하여 급속냉동기에 보관하였다. 또한, 상기 실험 시료들은 실험예 6, 7 및 8의 지질 과산화의 측정, RT-PCR 및 웨스턴 블로팅 분석을 위해 냉동 보관하였다.

<1-2> 녹용 추출물, 인삼 추출물, 산수유 추출물 또는 복분자 추출물의 처리

랫트들이 환경에 적응하는 7일 이후에, 랫트(n = 8)에 녹용 추출물, 인삼 추출물, 산수유 추출물 또는 복분자 추출물을 56일 동안 1.0 g/kg/day로 경구투여하였다. 대조군으로서 랫트(n = 8)에 동일한 투여량으로 담체를 경구투여하였다.

<1-3> 육미지황탕의 처리

랫트들을 일주일간 환경에 적응시킨 후에, 랫트들을 세 군으로 나누었다; 정상군(담체 처리, n = 8), 대조군(항암제로서 장시 사용 시 불임의 부작용이 수반되는 시클로포스파미드(CYP)만 처리, n = 8), 및 육미지황탕 처리군 (CYP 및 육미지황탕 처리, n = 8). 육미지황탕 처리군에서 처음 7일 동안 CYP를 20 mg/kg/day로 경구투여했으며, 그 후 56일 동안 육미지황탕을 1.0 g/kg/day로 계속 경구투여하였다.

<1-4> 통계 분석

본 연구에서 얻은 모든 정량적 데이터는 통계적으로 분석하였다. 결과는 평 균 ± 표준편차(S.D.)로 나타내었다. 대조군과 실험군과의 통계 차이는 스튜던츠 t-테스트를 이용하여 실시하였다. 처리 평균들 간의 차이는 p < 0.05에서 유의성이 있는 것으로 간주하였다. p 값 < 0.05, < 0.01, 및 < 0.001에서의 통계 차이는 표 또는 도면에 표시하였다.

< 실험예 2> 렛트 체중 및 고환 무게 측정

상기 실시예에서 제조한 한약재 추출물들이 랫트의 체중 및 고환 무게에 미치는 영향을 알아보기 위하여, 한약재 추출물을 투여한 랫트의 위관영양량(gavage volume)을 조절하고 랫트의 체중을 매주 측정하였고, 적출한 고환의 무게를 측정하였다.

측정결과, 모든 실험군에서 실험기간 중 사멸하거나 부작용이 관찰되는 랫트는 없었다. 각 실험군에 대한 구체적인 결과는 표 1 ~ 표 5에 나타내었다.

구분	대조군	녹용 추출물 처리군
체중(g)	420.50 ± 26.87	413.00 ± 19.24
절대적 고환 무게(g)	1.49 ± 0.17	1.64 ± 0.09*
상대적 고환 무게(%)	0.35 ± 0.05	0.40 ± 0.02*

(^*: p < 0.05)

표 1에 나타난 바와 같이, 상기 녹용 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 체중의 변화가 나타났다. 또한, 녹용 추출물 처리군의 절대적 및 상대적 고환 무게는 대조군에 비하여 약간, 그러나 유의적으로 증가하였다.

구분	대조군	복분자 추출물 처리군
체중(g)	402.50 ± 23.13	394.38 ± 26.73
절대적 고환 무게(g)	1.51 ± 0.07	1.58 ± 0.09*
상대적 고환 무게(%)	0.38 ± 0.03	0.40 ± 0.02*

(^*: p < 0.05)

표 2에 나타난 바와 같이, 상기 복분자 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 체중의 변화가 나타났다. 또한, 복분자 추출물 처리군의 절대적 및 상대적 고환 무게는 대조군에 비하여 약간, 그러나 유의적으로 증가하였다.

구분	대조군	산수유 추출물 처리군
체중(g)	402.50 ± 23.13	405.43 ± 29.00
절대적 고환 무게(g)	1.43 ± 0.05	1.63 ± 0.09**
상대적 고환 무게(%)	0.37 ± 0.02	0.39 ± 0.01*

(^*: p < 0.05, ^**: p < 0.01)

표 3에 나타난 바와 같이, 상기 산수유 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 체중의 변화가 나타났다. 또한, 산수유 추출물 처리군의 절대적 및 상대적 고환 무게는 대조군에 비하여 약간, 그러나 유의적으로 증가하였다.

구분	대조군	인삼 추출물 처리군
체중(g)	402.50 ± 23.13	413.71 ± 21.49
절대적 고환 무게(g)	1.51 ± 0.07	1.56 ± 0.04*
상대적 고환 무게(%)	0.37 ± 0.02	0.40 ± 0.02*

(^*: p < 0.05)

표 4에 나타난 바와 같이, 상기 인삼 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 체중의 변화가 나타났다. 또한, 인삼 추출물 처리군의 절대적 및 상대적 고환 무게는 대조군에 비하여 약간, 그러나 유의적으로 증가하였다.

구분	정상군	대조군	육미지황탕 처리군
체중(g)	402.86 ± 15.20	384.86 ± 16.87#	383.50 ± 14.48
절대적 고환 무게(g)	1.54 ± 0.11	1.43 ± 0.06#	1.53 ± 0.08*
상대적 고환 무게(%)	0.39 ± 0.02	0.37 ± 0.01#	0.40 ± 0.01***

(^#: 유의적 차이(p < 0.05)의 평균, ^*: p < 0.05, ^***: p < 0.001).)

표 5에 나타난 바와 같이, 상기 CYP만을 처리한 대조군에서는 정상군과 비교하여 체중이 다소 감소하였고, 육미지황탕 처리군에서는 대조군과 비교하여 체중에 변화가 거의 없었다. 또한, 대조군의 절대적 및 상대적 고환 무게는 정상군과 비교하여 다소 감소하였고, 육미지황탕 처리군에서는 대조군과 비교하여 다소 증가하는 것으로 나타났다. 특히, 육미지황탕 처리군의 고환의 상대적 무게는 정상 수치 이상이었다.

따라서, 본 발명에서 사용한 한약재 처리군 모두에서 랫트들의 체중에 큰 변화를 미치지 않으며, 절대적 및 상대적 고환 무게는 증가시키는 것으로 나타났다.

< 실험예 3> 부고환의 정자 분석

상기 실시예에서 제조한 한약재 추출물들이 부고환 정자의 개수 및 운동성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같이 실험하였다.

정자 개수를 측정하기 위하여 랫트들로부터 얻은 부고환 전체를 0.5% BSA를 포함하는 M199 배지에서 잘게 잘라 37℃에서 5분 동안 배양하였다. 정자 농도는 혈구계수기(Neubauer, Germany)를 이용하여 산출하였다. 정자 운동성의 측정을 위하여, 절개된 부고환으로부터 정자들을 회수하고 37℃ 조건에서 0.5% BSA를 포함하는 M199 배지에서 5분 동안 움직이게 하였다. 정자들의 움직임이 관찰되면 운동성이 있는 것으로 판단하였다. 정자들의 총 개수 및 운동성이 있는 정자들의 개수를 혈구계수기를 이용하여 측정하고 백분율로 환산하였다.

실험결과는 표 6 ~ 표 10에 나타내었다.

구분	대조군	녹용 추출물 처리군
정자 개수(×107)	7.93 ± 2.01	10.63 ± 1.09**
정자 운동성(%)	55.28 ± 6.89	61.85 ± 4.91*

(^*: p < 0.05, ^**: p < 0.01)

표 6에 나타난 바와 같이, 상기 녹용 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 정자 개수가 34.05% 유의적으로 증가하였고, 정자 운동성 또한 11.88% 유의적으로 증가하였다.

구분	대조군	복분자 추출물 처리군
정자 개수(×107)	3.90 ± 1.03	6.19 ± 1.57**
정자 운동성(%)	60.39 ± 17.82	82.89 ± 17.28*

(^*: p < 0.05, ^**: p < 0.01)

표 7에 나타난 바와 같이, 상기 복분자 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 정자 개수가 58.72% 유의적으로 증가하였고, 정자 운동성 또한 37.26% 유의적으로 증가하였다.

구분	대조군	산수유 추출물 처리군
정자 개수(×107)	3.90 ± 1.03	5.73 ± 1.41**
정자 운동성(%)	64.31 ± 6.22	79.79 ± 10.35*

(^*: p < 0.05, ^**: p < 0.01)

표 8에 나타난 바와 같이, 상기 산수유 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 정자 개수가 46.92% 유의적으로 증가하였고, 정자 운동성 또한 24.07% 유의적으로 증가하였다.

구분	대조군	인삼 추출물 처리군
정자 개수(×107)	3.90 ± 1.03	6.15 ± 1.62**
정자 운동성(%)	62.61 ± 17.76	76.68 ± 21.12*

(^*: p < 0.05, ^**: p < 0.01)

표 9에 나타난 바와 같이, 상기 인삼 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 정자 개수가 57.69% 유의적으로 증가하였고, 정자 운동성 또한 22.47% 유의적으로 증가하였다.

구분	정상군	대조군	육미지황탕 처리군
정자 개수(×107)	7.52 ± 0.62	6.76 ± 0.52#	9.54 ± 1.42**
정자 운동성(%)	61.52 ± 7.96	52.26 ± 9.06#	63.21 ± 6.57*

(^#: 유의적 차이(p < 0.05)의 평균, ^*: p < 0.05, ^***: p < 0.001).)

표 10에 나타난 바와 같이, 정자 개수는 CYP만을 처리한 대조군에서 정상군과 비교하여 10.11% 감소하는 것으로 나타났고, 육미지황탕 처리군의 정자 개수는 9.54 ± 1.42 (×10⁷)로 대조군과 비교하여 41.12% 증가하였다. 또한, 정자 운동성은 정자 개수와 유사한 경향으로 나타나, 대조군에서 정상군과 비교하여 15.05% 감소하였고, 육미지황탕 처리군의 정자 운동성은 63.21 ± 6.57%로 대조군과 비교하여 20.95% 증가하였다.

따라서, 본 발명에서 사용한 한약재 처리군 모두에서 정자의 개수 및 운동성을 증가시키는 것으로 나타났다.

< 실험예 4> 호르몬 분석

상기 실시예에서 제조한 한약재 추출물들이 남성호르몬 생합성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 하기와 같이 혈청 테스토스테론 농도를 측정하였다.

혈청 테스토스테론을 위한 방사성면역분석(RIA)은 제조사의 방법을 조금 변형시킨 방법으로 코트-A-카운트 토탈 테스토스테론 키트(Coat-A-Count total testosterone kit)를 이용하여 수행하였다. 코트-A-카운트 방법은 폴리프로필렌 관의 벽에 고정된 테스토스테론-특정 항체를 기본으로 한 고형상 방사성면역분석법이다. ¹²⁵I-표식된 테스토스테론은 실험 시료의 테스토스테론과 한정된 시간에 항체 부위에 대해 경쟁하도록 하였다. 관은 꺼내서 감마 카운터(Cobra; Hewlett packard, USA)에서 계수하였다. 실험 시료에 존재하는 테스토스테론의 양은 검량선으로부터 계산하였다. 모든 시료는 3회 실험하였고, 테스토스테론 표준 시료는 각각의 분석에서 2회 실험하였다.

결과는 도 1 ~ 도 5에 나타내었다.

도 1에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 녹용 추출물 처리군과 대조군의 혈청 테스토스테론 수준은 각각 5.55 ± 2.56 nmol/L (160.00 ± 73.89 ng/dL) 및 11.15 ± 4.62 nmol/L (321.71 ± 133.37 ng/dL)로 나타났다. 따라서, 녹용 추출물을 56일 처리함으로써 대조군에 비하여 혈청 내 테스토스테론의 농도가 100.90% 증가하여 고환의 기능을 강화시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 복분자 추출물 처리군과 대조군의 혈청 테스토스테론 수준은 각각 3.27 ± 1.44 nmol/L (94.43 ± 41.41 ng/dL) 및 6.76 ± 4.15 nmol/L (195.00 ± 119.58 ng/dL)로 나타났다. 따라서, 복분자 추출물을 56일 처리함으로써 대조군에 비하여 혈청 내 테스토스테론의 농도가 106.72% 증가하여 고환의 기능을 강화시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 산수유 추출물 처리군과 대조군의 혈청 테스토스테론 수준은 각각 3.65 ± 1.14 nmol/L (105.17 ± 33.00 ng/dL) 및 5.35 ± 1.27 nmol/L (154.25 ± 36.74 ng/dL)로 나타났다. 따라서, 산수유 추출물을 56일 처리함으로써 대조군에 비하여 혈청 내 테스토스테론의 농도가 46.58% 증가하여 고환의 기능을 강화시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 인삼 추출물 처리군과 대조군의 혈청 테스토스테론 수준은 각각 3.65 ± 1.14 nmol/L (105.17 ± 33.00 ng/dL) 및 5.14 ± 1.55 nmol/L (148.20 ± 44.66 ng/dL)로 나타났다. 따라서, 인삼 추출물을 56일 처리함으로써 대조군에 비하여 혈청 내 테스토스테론의 농도가 38.08% 증가하여 고환의 기능을 강화시킬 수 있음을 확인하였다.

또한, 도 5에 나타난 바와 같이, 정상군, CYP만을 처리한 대조군 및 육미지황탕 처리군의 혈청 테스토스테론 농도는 각각 6.96 ± 3.69 nmol/L (200.67 ± 106.52 ng/dL), 3.11 ± 0.49 nmol/L (98.86 ± 27.10 ng/dL) 및 3.62 ± 1.22 nmol/L (118.22 ± 27.71 ng/dL)로 나타났다. 따라서, 대조군에서의 혈청 테스토스테론 농도는 정상군과 비교하여 55.32% 감소하였으며(p < 0.05), 육미지황탕 처리군에서는 대조군과 비교하여 16.40% 증가하여 고환의 기능을 강화시킬 수 있음을 확인하였다.

< 실험예 5> 간의 생화학적 실험

상기 실시예에서 제조한 한약재 추출물들이 간 독성을 나타내는지 여부를 알아보기 위하여, 간 효소인 AST(Aspartate aminotransferase) 및 ALT(Alanine Aminotransferase) 농도를 상업적으로 판매하는 키트로 측정하였다. 이때 임상 화학 자동 분석기(clinical chemistry automatic analyzer, ADVIA 1650; Bayer Diagnostics, USA)를 사용하였다.

결과는 표 11 ~ 표 15에 나타내었다.

구분	대조군	녹용 추출물
AST(IU/L)	142.50 ± 40.90	124.86 ± 16.45
ALT(IU/L)	64.50 ± 8.55	70.20 ± 3.27

표 11에 나타난 바와 같이, 상기 대조군 및 녹용 추출물 처리군의 AST 농도가 각각 142.50 ± 40.90 및 124.86 ± 16.45 IU/L로 나타났으며, ALT 농도는 각각 64.50 ± 8.55 및 70.20 ± 3.27 IU/L로 나타났다. 따라서, 녹용 추출물이 AST 농도를 12.42% 감소시키고, ALT 농도를 8.84% 증가시킴을 확인할 수 있었다.

구분	대조군	복분자 추출물
AST(IU/L)	134.38 ± 41.09	102.88 ± 13.16*
ALT(IU/L)	77.25 ± 17.19	63.50 ± 6.99*

(^*: p<0.05)

표 12에 나타난 바와 같이, 상기 대조군 및 복분자 추출물 처리군의 AST 농도가 각각 134.38 ± 41.09 및 102.88 ± 13.16 IU/L로 나타났으며, ALT 농도는 각각 77.25 ± 17.19 및 63.50 ± 6.99 IU/L로 나타났다. 따라서, 복분자 추출물이 AST 농도를 23.44% 감소시키고, ALT 농도를 17.80% 감소시킴을 확인할 수 있었다.

구분	대조군	산수유 추출물
AST(IU/L)	128.16 ± 22.09	113.60 ± 14.98
ALT(IU/L)	75.67 ± 15.54	67.33 ± 12.99

표 13에 나타난 바와 같이, 상기 대조군 및 산수유 추출물 처리군의 AST 농도가 각각 128.16 ± 22.09 및 113.60 ± 14.98 IU/L로 나타났으며, ALT 농도는 각각 75.67 ± 15.54 및 67.33 ± 12.99 IU/L로 나타났다. 따라서, 산수유 추출물이 AST 농도를 11.36% 감소시키고, ALT 농도를 11.02% 감소시킴을 확인할 수 있었다.

구분	대조군	인삼 추출물
AST(IU/L)	128.16 ± 22.09	113.60 ± 14.98
ALT(IU/L)	77.25 ± 17.19	62.00 ± 7.46*

(^*: p<0.05)

표 14에 나타난 바와 같이, 상기 대조군 및 인삼 추출물 처리군의 AST 농도가 각각 128.16 ± 22.09 및 113.60 ± 14.98 IU/L로 나타났으며, ALT 농도는 각각 77.25 ± 17.19 및 62.00 ± 7.46 IU/L로 나타났다. 따라서, 인삼 추출물이 AST 농도를 16.40% 감소시키고, ALT 농도를 19.74% 감소시킴을 확인할 수 있었다.

구분	정상군	대조군	육미지황탕
AST(IU/L)	111.50 ± 17.29	119.25 ± 8.46	107.00 ± 2.83*
ALT(IU/L)	67.75 ± 4.57	70.00 ± 4.69	69.00 ± 7.81

(^*: p<0.05)

표 15에 나타난 바와 같이, 정상군, 대조군 및 육미지황탕 처리군의 혈청 내 AST 농도는 각각 111.50 ± 17.29, 119.25 ± 8.46 및 107.00 ± 2.83 IU/L로 나타났으며, ALT 농도는 각각 67.75 ± 4.57, 70.00 ± 4.69 및 69.00 ± 7.81 IU/L로 나타났다. CYP를 처리한 7일 동안은 AST 및 ALT 수치가 증가하여 간 독성이 유의적으로 나타났으며, 육미지황탕이 상기 두 수치를 낮추었고 이 가운데 AST의 농도는 대조군과 비교하여 10.27% 유의적으로 감소하였다.

따라서, 본 발명에서 사용한 한약재들은 간 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.

< 실험예 6> 지질 과산화의 측정

상기 실시예에서 제조한 한약재 추출물들이 지질 과산화에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 하기와 같이 TBA에 의해 흡광광도법을 하였다.

상기 실험예 1에서 랫트로부터 적출한 고환 시료의 무게를 재고 균질화하였다. 균질화된 시료는 조직 무게의 4배의 차가운 0.01M 소듐 포스페이트 완충용액(pH 7.4)에 넣고 4℃에서 10분 동안 12,000 g에서 원심분리하였다. 상층액 0.2 ㎖을 TBA 시약(20% 아세트산 1.5 ㎖, 0.8% TBA 1.5 ㎖, 8.1% SDS 0.2 ㎖, 0.1M PPB 0.6 ㎖, pH 7.5)에 넣었다. 상기 혼합물을 90℃에서 1시간 동안 배양하고, 식힌 후 n-부탄올 및 피리딘(15:1; v/v)의 혼합물 4 ㎖을 첨가하고, 15분 동안 1,500 g에서 원심분리하였다. 상층의 흡광도를 마이크로플래이트 리더(Molecular Devices, USA)를 이용하여 532 nm에서 측정하였다. TBA 반응 물질(TBARs)의 농도는 양이 알려진 MDA로 작성한 검량선으로부터 계산하였다. MDA 값은 단백질 g 당 nmol로 표시하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법에 의해 측정하였다 (Bradford, 1976).

측정결과는 도 6 ~ 도 10에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 대조군의 MDA 농도는 녹용 추출물 처리군에 비하여 높았다(각각 1.56 ± 0.27 및 1.02 ± 0.13 nmoles/mg 단백질; p < 0.05). 따라서, 녹용 추출물이 지질 과산화물(LPO) 생성을 34.62% 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

또한, 도 7에 나타난 바와 같이, 대조군의 MDA 농도는 복분자 추출물 처리군에 비하여 높았다(각각 2.34 ± 0.50 및 1.06 ± 0.54 nmoles/mg 단백질; p < 0.05). 따라서, 복분자 추출물이 지질 과산화물 생성을 54.70% 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

또한, 도 8에 나타난 바와 같이, 대조군의 MDA 농도는 산수유 추출물 처리군에 비하여 높았다(각각 2.14 ± 0.37 및 0.97 ± 0.40 nmoles/mg 단백질; p < 0.05). 따라서, 산수유 추출물이 지질 과산화물 생성을 54.67% 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

또한, 도 9에 나타난 바와 같이, 대조군의 MDA 농도는 인삼 추출물 처리군에 비하여 높았다(각각 2.14 ± 0.37 및 0.88 ± 0.27 nmoles/mg 단백질; p < 0.05). 따라서, 인삼 추출물이 지질 과산화물 생성을 58.88% 유의적으로 감소시킴을 확인할 수 있었다.

또한, 도 10에 나타난 바와 같이, 대조군의 MDA 농도는 정상군의 MDA 농도보다 유의적으로 증가하였다(1.57 ± 0.12 및 0.99 ± 0.15 nmoles/mg 단백질; p < 0.001). 육미지황탕 처리군의 MDA 농도는 0.48 ± 0.07 nmoles/mg 단백질이고 대조군과 비교하여 69.43%가 유의적으로(p < 0.001) 감소하여 육미지황탕이 CYP에 의해 유도된 지질 과산화물 생성을 유의적으로 억제함을 확인하였다.

< 실험예 7> CREM 유전자 발현에 미치는 영향

<7-1> 랫트 고환으로부터의 총 RNA 분리

상기 실시예에서 제조한 한약재 추출물들이 고환 내 정자형태형성에 관여하는 유전자 CREM(cAMP-responsive element modulator) 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 하기와 같이 랫트의 고환으로부터 RNA를 분리하였다.

총 RNA 분리 시약인 페노졸(Fenozol total RNA isolation reagent)(Active & Motif, USA) 800 ㎕을 고환 조직 시료 0.1 g에 첨가하여 균질화하고 50℃에서 5분 동안 배양하였다. 클로로포름 200 ㎕를 상기에 넣고 실온에서 10분 동안 12,000 g에서 원심분리하였다. 상층액을 새 튜브에 옮기고 아이소프로판올 400 ㎕을 첨가하였다. 상기 상층액은 실온에서 10분 동안 배양하고 4℃에서 15분 동안 12,000 g에서 원심분리하였다. 다음으로 RNA 덩어리는 70% 에탄올로 세척, 공기 중에서 건조, (diethyl pyrocarbonate)-처리된 물에 현탁시켰다. 총 RNA 시료는 변성 포름알데하이드/아가로스/에티디움 브로마이드 겔 전기영동으로 분석하였다. RNA의 정량은 흡광광도계(Molecular Devices, USA)로 260 nm에서 측정되었다.

<7-2> cDNA 합성 및 PCR -증폭

상기 <7-1>에서 얻은 RNA 및 PCR 코어 키트(PCR Core kit)(Bioquest, 한국)를 이용하여 CREM 유전자 발현 정도를 측정하였다.

총 RNA 2 ㎍, MMLV 역전사효소(MMLV reverse transcriptase)(프로메가, USA) 및 올리고 dT 프라이머(프로메가, USA)를 이용하여 42℃에서 1시간 동안 첫 번째 가닥 cDNA을 합성하였다. 다음으로, 5 ㎕의 cDNA를 2.5 ㎕의 10× PCR 완충용액, 1 ㎕의 25 mM MgCl₂, 1 ㎕의 2.5 mM dNTP, 0.5 ㎕의 중합효소(1U), 1 ㎕의 CREM 또는 자체대조군(internal control)으로서의 랫트 β-액틴의 프라이머(4 pmol) 및 DEPC-H₂O 혼합용액을 최종 부피가 25 ㎕가 되도록 첨가하였다. 상기 혼합용액을 95℃에서 5분 동안 가열하고, 95℃에서 1.5분 동안 열 변성 및 52 ~ 56℃에서 1분 동안 프라이머 결합, 72℃에서 1.5분 동안 프라이머 신장시키는 과정을 35회 반복하였다. 사용한 CREM 프라이머의 서열은 순방향 5'-GATTGAAGAAGAAAAATCAGA-3' (엑손 B) 및 역방향 5'-TTGACATATTCTTTCTTCTT-3' (엑손 H)이었으며, 랫트 β-액틴 프라이머의 서열은 5'-AGGCATCCTGACCCTGAAGAT-3' 및 5'-TCTTCATGAGGTAGTCTGTCAG-3'였다. PCR-산물은 1.5% 아가로오스 겔 상에서 분리, i-MAX 겔 이미지 분석 시스템 (CoreBioSystem, 한국)을 이용하여 에티디움 브로마이드에 의해 가시화하였고 Alpha Easy™ FC 소프트웨어(Alpha Innotech, USA)를 이용하여 분석하였다. 통계적 분석을 위하여 적어도 3회의 실험을 실시하였다.

결과는 도 11 ~ 도 15에 나타내었다.

모든 한약재의 경우에서 일반적인 동물의 총 RNA 시료에서 나타나는 0.5 ~ 12 kb에서의 옅은 얼룩, 약 4.5~ 및 1.9 kb에서의 각각 밝은 26S 및 18S rRNA 밴드가 나타났다. 상기 밴드들의 강도의 비는 1.5 ~ 2.5:1 범위가 되었다.

도 11 ~ 도 15에 나타난 바와 같이, CREM 단편은 416 bp에서 나타났고, β-액틴은 자체대조군으로서 증폭되었다. 녹용 추출물, 복분자 추출물, 산수유 추출물 및 인삼 추출물 처리군 모두에서 대조군와 비교하여 CREM mRNA 수준이 유의적으로(p < 0.05) 증가하였고, 구체적으로 상기 각 한약재 추출물 처리군에서 CREM 유전자의 상대적 발현은 대조군에 대해서 각각 115.30%, 189.90%, 132.36% 및 174.91%로 나타났다.

또한, 육미지황탕의 경우, CYP를 처리한 군에서는 정상군과 비교하여 CREM mRNA 수준이 유의적으로(p < 0.01) 감소하였고, 육미지황탕 처리군에서는 CYP로 인해 감소된 mRNA 수준을 정상 수준까지 유의성있게(p < 0.01) 회복시켰다. CYP 처리군 및 육미지황탕 처리군의 CREM 유전자 발현은 정상군에 대해서 각각 68.44 및 104.96% 로 나타났다.

따라서, 본 발명의 한약재 추출물들은 고환에서의 정자생성을 향상시킴을 확인할 수 있었다.

< 실험예 8> CREM 단백질 발현에 미치는 영향 측정

상기 실시예에서 제조한 한약재 추출물들이 CREM 단백질 발현에 미치는 영향을 측정하기 위하여, 하기와 같이 웨스턴 블럿팅 분석을 하였다.

단백질은 핵 추출 키트(Active & Motif, USA)를 이용하여 제조자의 방법을 약간 변형한 방법에 따라 균질화된 고환으로부터 분리하였다. 단백질 농도는 브래드포드 방법으로 측정하였으며, SDS-PAGE 및 웨스턴 블로팅 분석은 기존의 방법대로 수행하였다. 단백질 추출을 위한 시료는 RNA 추출에 사용한 동일한 고환의 절반을 사용하였다. 단백질 추출물 50 ㎍을 SDS-PAGE에 의해 10% 트리스-글리신 겔로 전기영동하고, 25 mM 트리스 및 250 mM 20% 메탄올을 포함하는 글리신(pH 8.3)을 이용하여 니트로셀룰로오스 맴브레인(Schleicher & Schuell, 독일)으로 전기적으로 이동시켰다. 이동은 일정 전압 120 mA로 1시간 동안 실시하였다. 이동 후, 실온에서 1시간 동안 맴브레인은 5% 탈지 분유를 녹인 0.05% 트윈을 포함하는 인산 완충용액(PBS-T)에서 블로킹시키고 PBS-T의 CREM-1에 대한 일차 항체(1:200)와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 배양 후, 상기 맴브레인을 1×PBS로 3회 헹구고 결합된 염소 항-토끼 IgG(conjugated goat anti-rabbit IgG) (시그마 화학사, USA)와 함께 실온에서 1시간 동안 배양하고, 1×PBS로 3회 헹궜다. 항원은 씨피코 CBB 염색 키트(SeePico CBB stain kit)로 가시화하였다.

결과는 도 16 ~ 도 20에 나타내었다.

도 16 ~ 도 20에 나타난 바와 같이, CREM-면역반응성 밴드는 분자량 약 35 KDa에서 나타났다. 녹용 추출물, 복분자 추출물, 산수유 추출물 또는 인삼 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 CREM-면역반응성 밴드의 발현이 유의성 있게(p < 0.01) 증가하였다. 구체적으로, 상기 녹용 추출물, 복분자 추출물, 산수유 추출물 또는 인삼 추출물 처리군에서는 대조군과 비교하여 CREM 단백질 발현이 각각 144.25%, 112.88%, 13.36%, 108.38%로 증가하여 상기 실험예 7의 결과를 재확인할 수 있었다.

또한, 육미지황탕의 경우, CYP만을 처리하였을 때는 정상군과 비교하여 CREM-면역반응성 밴드의 발현이 유의적으로 감소하였다(p < 0.05). 그러나 육미지황탕을 56일 처리한 후에는 CYP에 의해 감소했던 CREM 단백질이 정상 수준까지 유의적으로 증가하였다(p < 0.05). 구체적으로, CYP 및 육미지황탕을 처리한 군에서 CREM 단백질의 상대적 발현은 각각 정상군에 대해 77.97& 및 102.10%로 나타나 RT-PCR 분석을 통한 결과와 같은 경향을 나타내었다.

하기에 본 발명의 조성물을 위한 제제예를 예시한다.

제제예 1: 약학적 제제의 제조

1-1: 산제의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 2 g

유당 1 g

상기의 성분을 혼합한 후, 기밀포에 충진하여 산제를 제조하였다.

1-2: 정제의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.

1-3: 캡슐제의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 100 ㎎

옥수수전분 100 ㎎

유 당 100 ㎎

스테아린산 마그네슘 2 ㎎

상기의 성분을 혼합한 후, 통상의 캡슐제의 제조방법에 따라서 젤라틴 캡슐에 충전하여 캡슐제를 제조하였다.

1-4: 주사액제의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 10 ㎍/㎖

묽은 염산 BP pH 3.5로 될 때까지

주사용 염화나트륨 BP 최대 1㎖

적당한 용적의 주사용 염화나트륨 BP 중에 본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물을 용해시키고, 생성된 용액의 pH를 묽은 염산 BP를 사용하여 pH 3.5로 조절하고, 주사용 염화나트륨 BP를 사용하여 용적을 조절하고 충분히 혼합하였다. 용액을 투명 유리로 된 5 ㎖ 타입 I 앰플 중에 충전시키고, 유리를 용해시킴으로써 공기의 상부 격자하에 봉입시키고, 120 ℃에서 15 분 이상 오토클래이브시켜 살균하여 주사액제를 제조하였다.

제제예 2: 식품의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물을 포함하는 식품들을 다음과 같이 제조하였다.

2-1: 밀가루 식품의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 0.1 ~ 10.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 통상의 방법으로 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-2: 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 0.1 ~ 1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

2-3: 그라운드 비프(ground beef)의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 10 중량부를 그라운드 비프에 첨가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 그라운드 비프를 제조하였다.

2-4: 유제품(dairy products)의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 0.1 ~ 1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 통상의 방법으로 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

2-5: 선식의 제조

현미, 보리, 찹쌀, 율무를 공지의 방법으로 알파화시켜 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

검정콩, 검정깨, 들깨도 공지의 방법으로 쪄서 건조시킨 것을 배전한 후 분쇄기로 입도 60 메쉬의 분말로 제조하였다.

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물을 진공 농축기에서 감압, 농축하고, 분무, 열풍건조기로 건조하여 얻은 건조물을 분쇄기로 입도 60 메쉬로 분쇄하여 건조분말을 얻었다.

상기에서 제조한 곡물류, 종실류 및 본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물의 건조분말을 다음의 비율로 배합하여 통상의 방법으로 제조하였다.

곡물류(현미 30 중량부, 율무 15 중량부, 보리 20 중량부),

종실류(들깨 7 중량부, 검정콩 8 중량부, 검정깨 7 중량부),

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물의 건조분말(1 중량부),

영지(0.5 중량부),

지황(0.5 중량부)

제제예 3: 음료의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물을 포함하는 음료를 다음과 같이 제조하였다.

3-1: 건강음료의 제조

액상과당(0.5%), 올리고당(2%), 설탕(2%), 식염(0.5%), 물(75%)과 같은 부재료와 본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물을 균질하게 배합하여 순간 살균을 한 후, 이를 유리병, 패트병 등 소포장 용기에 포장하여 건강음료를 제조하였다.

3-2: 야채쥬스의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 0.5 g을 토마토 또는 당근 등의 야채의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

3-3: 과일쥬스의 제조

본 발명의 실시예 1 ~ 5 중 어느 하나의 추출물 또는 조성물 0.1 g을 사과 또는 포도 등의 과일의 쥬스 1,000 ㎖에 가하여 통상의 방법으로 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

본 발명의 추출물 또는 조성물은 고환의 절대 무게를 증가시키고, 부고환의 정자 개수 및 운동성을 증가시키고, 남성 생식기를 발육시키고 기능을 유지시켜주 는 테스토스테론의 농도를 증가시고, 과산화지질 생성을 감소시킬 뿐만 아니라 정자형성과 관련된 CREM(cAMP-responsive element modulator) 유전자의 발현율을 증가시키고, CREM 단백질의 발현율 또한 현저하게 증가시킨다. 따라서, 본 발명에 의한 각각의 한약재 추출물들은 생식기능과 관련하여 고환의 성장을 촉진하며 정자의 특성을 개선하고 산화스트레스에 대한 항산화 효과가 인정되었을 뿐 아니라 혈중 테스토스테론 농도와 CREM 유전자 및 단백질의 발현을 현저하게 개선하는 기전을 통하여 남성불임에 효과가 있어 남성 불임 치료용 조성물 또는 고환 기능 증진용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.

Claims (8)

1. 산수유, 숙지황, 산약, 복령, 목단피 및 택사로 이루어진 혼합한약재의 추출물을 포함하는 남성 불임치료용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 산수유, 숙지황, 산약, 복령, 목단피 및 택사의 혼합한약재 추출물은 산수유 16 중량부, 숙지황 32 중량부, 산약 16 중량부, 복령 12 중량부, 목단피 12 중량부 및 택사 12 중량부의 추출물인 것을 특징으로 하는 남성 불임치료용 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ ~ C₄ 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것임을 특징으로 하는 남성 불임치료용 조성물.
4. 제 2항에 있어서, 상기 추출물은 물, C₁ ~ C₄ 알코올 또는 이들의 혼합용매로 추출된 것임을 특징으로 하는 남성 불임치료용 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 물로 추출된 것임을 특징으로 하는 남성 불임치료용 조성물.
6. 제 2항에 있어서, 상기 추출물은 물로 추출된 것임을 특징으로 하는 남성 불임치료용 조성물.
7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적 조성물인 것을 특징으로 하는 남성 불임치료용 조성물.
8. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서의 혼합한약재의 추출물을 포함하는 것을 특징으로 하는 남성 불임 예방 및 개선용 건강식품.

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