KR20070010175A - 온화한 가티올분해 조건하에서 방출될 수 있는 폴리머콘쥬게이트 - Google Patents

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KR20070010175A
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사무엘 잘립스키
파람지트 서브라모니
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알자 코포레이션
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Abstract

약물 또는 단백질 같은 아민- 또는 히드록실-함유 화합물로부터 유도된 리간드에 연결된 폴리에틸렌글리콜과 같은 지질 또는 친수성 폴리머를 포함하는 화학식(I)의 콘쥬게이트는 보관 조건 하에서는 안정하고, 온화한 가티올분해 조건에서는 절단 가능하여 원하지 않는 부산물의 형성 없이 본래의 형태의 아민- 또는 히드록실-함유 화합물을 재생성할 수 있다.
Figure 112006083378863-PCT00019
콘쥬게이트, 지질, 단백질, 가티올분해

Description

온화한 가티올분해 조건하에서 방출될 수 있는 폴리머 콘쥬게이트 {Polymer Conjugate Releasable Under Mild Thiolytic Conditions}
본 발명은 약물이나 단백질과 같은 아민- 또는 히드록실-함유 화합물로부터 유도된 리간드에 절단 가능하게 연결된 폴리에틸렌 글리콜과 같은 지질 또는 친수성 폴리머를 포함하는 콘쥬게이트에 관한 것이다. 콘쥬게이트는 온화한 가티올분해 조건에서 절단 가능하여, 아민- 또는 히드록실-함유 화합물을 이것의 본래 형태로 재생성한다.
[인용 문헌]
Figure 112006083378863-PCT00001
Figure 112006083378863-PCT00002
폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 친수성 폴리머는 기질의 면역원성을 감소시키고, 그리고/또는 이것의 혈액 순환 유효기간을 개선하기 위하여, 폴리펩티드, 약물 및 리포솜과 같은 다양한 기질의 변형에 사용되어 왔다. 예를 들면, 비경구 투여된 단백질은 면역원성일 수 있고, 생체 내에서 신속하게 분해될 수 있다. 그 결과 환자 내부에서 치료적으로 유용한 혈중 단백질 수준을 달성하기 어려울 수 있다. PEG의 단백질에의 콘쥬게이션은 이런 어려움을 극복하는 접근으로 설명되었다. Davis et al.,은 미국 특허 번호 4,179,337에서 PEG를 효소 및 인슐린과 같은 단백 질에 콘쥬게이트하여, 여전히 상당한 정도의 생리적 활성을 유지하면서 보다 적은 면역원성을 갖는 PEG-단백질 콘쥬게이트의 형성을 개시한다. Veronese et al. (Applied Biochem . and Biotech, 11: 141-152(1985))은 페닐 클로로포르메이트로 폴리에틸렌 글리콜을 활성화하여, 리보뉴클리아제 및 수퍼옥사이드 디스뮤타제를 변형하는 것을 개시한다. Katre et al.은 미국 특허 번호 4,766,106 및 4,917,888에서 폴리머 콘쥬게이션에 의해 단백질을 용해하는 것을 개시한다. 미국 특허 번호 4,902,502 (Nitecki et al.)와 PCT 공개 공보 번호 WO90/13540(Enzon Inc.)은 재조합체 단백질에 PEG 및 다른 폴리머가 콘쥬게이션하여, 면역원성을 감소시키고 반감기를 증가하는 것을 기재한다.
PEG는 리포솜의 혈액 순환 유효 기간을 개선시키는 데 사용하는 것으로 또한 기재되어 있다(미국 특허 번호 5,103,556). PEG는 세망내피 시스템에 의한 인식 및 제거로부터, 리포솜을 마스크 또는 보호하기 위하여, 지질의 극성 머리 기에 공유결합되어 있다.
단백질과 같이 생물학적으로 활성인 분자의 폴리머로 변형은 종종 분자의 활성을 감소시키기 때문에, 절단 가능한 연결을 갖는 단백질-폴리머 콘쥬게이트가 사용되었다. Garman(미국 특허 번호 4,935,465)은 가역의 연결을 통하여 단백질에 연결된 수용성 폴리머로 변형된 단백질을 기재한다. 방출할 수 있는 PEG 사슬을 갖는 리포솜 또한 기재되었고, pH의 변화와 같은 적합한 자극에 노출시 PEG 사슬은 리포솜으로부터 방출될 수 있다(WO 98/16201)
어떠한 경우, 리포솜 또는 분자로부터 폴리머의 방출은 분자 또는 지질의 구 조에 있어서 변화를 초래한다. 화학적으로 변형된 이들 구조는 생체내에서 예측 불가능한 잠재적인 부정적 효과를 가질 수 있다.
PEG-약물 콘쥬게이트의 절단으로 약물이 방출되는 콘쥬게이션 전략은 미국 특허 번호 6,342,244 및 6,214,330에 기재되어 있다. 전자는 티오퀴논메티드와 같은 부산물의 방출과 함께 디티오벤질 부분의 절단을 기재한다. 후자는 쿠마린과 같은 부산물의 방출과 함께 가수분해에 불안정한 아릴 에테르의 절단을 기재한다.
일반적으로, 보관 조건에서는 연결기가 안정하나 생체 내에서는 절단 가능하여 원하지 않는 부산물의 형성 없이 콘쥬게이트 분자를 원래 형태로 방출하는, 절단 가능한 콘쥬게이트를 제공하는 것이 바람직하다.
[발명의 개요]
따라서, 본 발명의 목적은 공유 결합이지만, 가역적으로 친수성 폴리머에 연결된 리간드를 갖는 콘쥬게이트를 제공하는 것이다. 리간드는 아민- 또는 히드록시-함유 화합물로부터 유도된다. 연결의 절단시 리간드는 이것의 본래 형태로 재생성된다.
한 측면에서 본 발명은 하기의 일반 구조식 I을 갖는 콘쥬게이트를 포함한다:
Figure 112006083378863-PCT00003
여기서 R1X는 아민- 또는 히드록실-함유 리간드로, X는 산소, 1차 질소 또는 2차 질소이고;
M은 cis-CRb=CRc-, -CRbRd-, 및 -CRbRd-CRcRe-로부터 선택되는데, 여기서 Rb,Rc, Rd, 및 Re의 각각은 H, 메틸, 치환된 메틸, 플루오로, 및 클로로로부터 독립적으로 선택되고, 메틸은 히드록실, 플루오로, 또는 클로로로 치환될 수 있고;
D-모양 구조는, M 및 이황화기 S-S가 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 부착된 5- 또는 6-원 고리를 나타내고;
Ra는 고리 상의 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로, 할로겐 및 또 다른 접합 고리부터 선택되는 하나 이상의 치환체를 나타내는데, R은 C1-C6 히드로카빌이며, 이것은 더 나아가 할로겐으로 치환될 수 있고; 그리고
L은 선형 또는 가지형 C1-C6 알킬기이며, 더 나아가 아릴 또는 아랄킬로 치환될 수 있는데;
여기서 L 및 Ra는 함께 고리를 형성할 수 있고;
그리고 여기서 콘쥬게이트는 L에, Ra에, 또는 5- 또는 6-원 고리에 붙은 지질 또는 친수성 폴리머를 더 포함한다.
콘쥬게이트는 L 또는 Ra에 붙은 친수성 폴리머를 전형적으로 포함한다. 선택된 구체예에서, L 및 Ra는 고리를 형성하지 않는다.
친수성 폴리머는, 예를 들면, 폴리비닐피롤리돈, 폴리비닐메틸에테르. 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리(히드록시프로필)옥사졸린, 폴리(히드록시프로필)메타크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸아크릴아미드, 폴리(히드록시프로필)메타크릴레이트, 폴리(히드록시에틸)아크릴레이트, 히드록시메틸 셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리아스파트아미드, 및 이것들의 공중합체일 수 있으며; 바람직한 친수성 폴리머는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리에테르이다.
바람직하게는 5- 또는 6-원 고리는 방향족 고리이고, 보다 바람직하게는 벤젠 고리이다. 한 구체예에서, M은 cis-CRb=CRc-이고, 콘쥬게이트는 하기 구조식 Ia를 갖는다:
Figure 112006083378863-PCT00004
이 구체예에서, Rb 및 Rc의 각각은 바람직하게는 수소이다. 바람직하게는 친수성 폴리머가 L에 붙으며 Ra에는 붙지 않는다.
Ra는 예를 들면 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로, 플루오로, 클로로로부터 선택되는 단일 치환체일 수 있는데, R은 C1-C6 히드로카빌이고 이것은 더 나아가 할로겐으로 치환될 수 있다. 바람직하게는, Ra는 수소, 또는 R, OR, C(O)OR, C(O)OH, 시아노, 니트로, 플루오로, 및 클로로로부터 선택되는 단일 치환체이고, R은 메틸 또는 에틸이다. 선택된 구체예에서, Ra는 수소이다.
바람직하게는, L은 CR3R4-CR5CR6 구조를 가지어 -CR3R4는 이황화기에 붙고, R3 및 R4는 H, 알킬, 아릴 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택되고, R5 및 R6은 H 및 메틸로부터 독립적으로 선택된다. 바람직하게는, R3 및 R4의 각각은 수소, 메틸, 에틸, 및 프로필로부터 독립적으로 선택된다. 보다 바람직하게는, R4는 수소이고 R3은 수소, 메틸, 에틸 및 프로필로 구성된 군으로부터 선택된다. 선택된 구체예에서, R4는 수소이고, R3은 CH3, C2H5 및 C3H8로 구성된 군으로부터 선택된다.
위 구조식 I의 한 구체예에서, L 및 Ra는 cis-1,2 및 오르쏘 배향으로 5- 또는 6-원 고리에 붙으며, L 및 Ra는 함께 또 다른 5- 내지 7-소 고리를 형성한다. 이런 구체예에서, 친수성 폴리머는 5- 또는 6- 원 고리(즉, "D 모양 구조"로, 바람직하게는 벤젠 고리)에 붙을 수 있거나, L 및 Ra에 의해 형성된 또 다른 5- 내지 7-원 고리에 붙을 수 있다.
R1X에 의해 표시되는 리간드는 전형적으로 지질, 또는 생물학적으로 활성인 화합물이다. 선택된 구체예에서, 리간드는 아민-함유 리간드이며, 이것은 예를 들면 폴리펩티드, 아민-함유 약물, 또는 아민-함유 지질일 수 있다. 아민-함유 지질은 바람직하게는 이중 탄화수소 꼬리 부분을 갖는 인지질이다. 리간드가 폴리펩티드로부터 유도될 때 폴리펩티드는 예를 들면 효소 또는 사이토카인일 수 있다.
연관된 측면에서, 본 발명은 아민- 또는 히드록실-함유 분자가 하기 구조식 II를 갖는 화합물과 반응하여 얻을 수 있는 콘쥬게이트를 제공하는 것이다;
Figure 112006083378863-PCT00005
여기서
Z는 히드록실 또는 아미노기에 의해 대체될 수 있는 이탈기이고;
M은 cis-CRb=CRc-, -CRbRd-, 및 -CRbRd-CRcRe-로부터 선택되고, 여기서 Rb, Rc, Rd 및 Re의 각각은 H, 메틸, 치환된 메틸, 플루오로, 및 클로로로부터 독립적으로 선택되고, 메틸은 히드록실, 플루오로, 또는 클로로로 치환될 수 있으며;
D-모양 구조는 M 및 이황화기 S-S가 cis--1,2 또는 오르쏘 배향으로 붙은 5- 또는 6-원 고리를 나타내고;
Ra는 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로, 할로겐, 및 또 다른 접합 고리로부터 선택되는 고리 상의 치환체를 표시하고, R은 C1-C6 히드로카빌이고 이것은 더 나아가 할로겐으로 치환될 수 있으며; 그리고
L은 선형 또는 가지형 C1-C6 알킬기이며, 더 나아가 아릴 또는 아랄킬로 치환될 수 있는데;
여기서 L 및 Ra는 함께 고리를 형성할 수 있고;
그리고 여기서 화합물은 L에, Ra에, 또는 5 또는 6-원 고리에 붙은 지질 또는 친수성 폴리머를 더 포함한다.
구조식 II의 바람직한 구체예는 즉 변수 M, L, 과 Ra, 및 지질 또는 친수성 폴리머에 대해서는 위의 구조식 I에 관한 기재와 대응한다. 예를 들면, 한 구체예에서 화합물은 구조식 IIa를 가지며, 5- 또는 6-원 고리는 벤젠 고리이고 M은 cis-CRb=CRc-이다.
Figure 112006083378863-PCT00006
이탈기 Z는 클로라이드, 파라-니트로페놀, 오르쏘-니트로페놀, N-히드록시테트라히드로프탈이미드, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시글루타르이미드, N-히드록시노보넨-2,3-디카르복시이미드, 1-히드록시벤조트리아졸, 3-히드록시피리딘, 4-히드록시피리딘, 2-히드록시피리딘, 1-히드록시-6-트리플루오로메틸 벤조트리아졸, 이미다졸, 트리아졸, N-메틸이미다졸, 펜타플루오로페놀, 트리플루오로페놀, 및 트리클로로페놀로 구성된 군으로부터 바람직하게 선택된다.
다른 측면에서, 본 발명은, 상술한 바와 같은 구조식 I을 갖는 콘쥬게이트를 혈류에 투여함으로써 아민- 또는 히드록실-함유 분자 R2XH를 혈류에 투여하기 위한 방법을 제공하며, 이로써 콘쥬게이트의 생체 내 가티올 분해반응을 통하여 분자 R2XH가 콘쥬게이트로부터 방출된다. 콘쥬게이트의 바람직한 구체예는 상술한 바와 같다. 이 방법은 절단 반응에 의하여 방출되는 형광 부분의 검출을 통하여 분자의 방출을 모니터하는 단계를 더 포함할 수 있다.
그 이상의 측면에서, 본 발명은 친수성 폴리머 사슬의 표면 코팅을 가지고, 상술한 구조식 I을 갖는 지질-폴리머 콘쥬게이트를 포함하는 리포솜을 제공하는데, 여기서 R1X는 아민- 또는 히드록실-함유 지질, 바람직하게는 인지질을 나타낸다. 구조식 I 내에서 다른 변수들의 바람직한 구체예는 상술한 바와 같다. 리포솜은 포획된 치료 제제를 포함할 수 있다. 연관된 측면에서, 본 발명은 이 리포솜을 포함하고, 친수성 폴리머와 안정적으로 연결된 소포-형성 지질을 더 포함하는 리포솜 조성물을 제공한다. 바람직하게는 친수성 폴리머에 연결된 지질의 전체 몰 퍼센트는 1% 내지 20%이다. 리포솜 조성물의 바람직한 구체예에서, 소포-형성 지질과 안정적으연결된 친수성 폴리머는 구조식 I의 콘쥬게이트에 함유된 것들보다 더 짧다.
또한 상술한 콘쥬게이트와, 염수, 완충액 및 이와 유사한 것과 같이 약학적으로 허용되는 담체를 함유하는 조성물이 또한 제공된다.
본 발명에 관한 하기의 상세한 설명을 첨부되는 도면과 함께 읽을 때, 본 발명의 이들 목적과 다른 목적 및 특징이 보다 충분히 이해될 것이다.
도 1은 본 발명의 한 구체예에 따라, 디티오시나밀(DTC)이 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG) 부분 및 아민-함유 리간드에 연결된 콘쥬게이트를 보여준다.
도 2는 mPEG-DTC-NHS 에스테르 콘쥬게이트의 합성을 위한 합성 반응도를 나타낸다.
도 3은 도 1의 mPEG-DTC-단백질 콘쥬게이트의 가티올 분해 및 그 결과 생성물을 보여주며, 그리고
도 4는 본 발명의 다른 콘쥬게이트의 가티올 분해 및 그 결과 생성물을 보여준다.
[발명의 상세한 설명]
I. 정의
본원에서 사용되는 "폴리펩티드"는 특정한 길이에 관한 제한이 없는 아미노산 폴리머이다. 이에 따라 예를 들면, 펩티드, 올리고펩티드, 단백질, 및 효소라는 용어들은 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 이 용어는 또한 예를 들면 해당, 아세틸화, 인산화 등과 같은 폴리펩티드의 후-발현 변형체를 포함한다.
본원에서 사용되는 "친수성 폴리머"는 물에 용해될 수 있는 부분을 갖는 폴리머를 지칭하며, 이것은 실온에서 폴리머가 어느 정도의 수 용해도를 갖도록 한다. 대표적인 친수성 폴리머는 폴리비닐피로리돈, 폴리비닐메틸에테르, 폴리메틸옥사졸린, 폴리에틸옥사졸린, 폴리히드록시프로필옥사졸린, 폴리히드록시프로필-메타 크릴아미드, 폴리메타크릴아미드, 폴리디메틸-아크릴아미드, 폴리히드록시프로필 메타크릴레이트, 폴리히드록시에틸아크릴레이트, 히드록시메틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 폴리에틸렌글리콜, 폴리아스파르트아미드, 상기 인용된 폴리머들의 공중합체, 및 폴리에틸렌옥사이드-폴리프로필렌옥사이드 공중합체를 포함한다. 많은 이들 폴리머의 특징과 반응들은 미국 특허 번호 5,395,619 및 5,631,018에 개시된다.
"반응성 기능기를 포함하는 폴리머", 또는 "붙기 위한 연결을 포함하는 폴리머"는, 다른 화합물과 반응하여 공유결합성 연결을 형성하기 위하여 말단 부분이 전형적으로(하지만 반드시 그러하지는 아니하다) 변형된 폴리머를 지칭한다. 폴리머를 기능화하여 이러한 반응성 기능기를 갖도록 하기에 효과적인 반응도는 당업자에 의하여 용이하게 결정될 수 있고, 그리고/또는 예를 들면 미국 특허 번호 5,613,018; Zalipsky et al., Eur . Polymer. J. 19(12):1177-1183(1983); 또는 Zalipsky et al., Bioconj . Chem . 4(4):296-299(1993)에서 개시되었다.
본원에서 사용되는 "알킬"은 어떤 탄소 원자로부터 수소 원자를 제거함으로써 알칸으로부터 유도된 기를 지칭하며, 화학식CnH2n +1을 갖는다. 가지 없는 알칸의 말단 탄소 원자에서 수소 원자의 제거에 의하여 유도되는 기는 노르말 알킬(n-알킬)기의 하위 부류를 형성한다: H[CH2]n. RCH2-, R2CH-(R은 H가 아님), 및 R3C-(은 H가 아님)기는 각각 1차, 2차 및 3차 알킬기를 의미한다.
"저급 알킬"은 1-6, 보다 바람직하게는 1-4의 탄소 원자를 갖는 알킬기를 지 칭한다.
"히드로카빌"은 탄소 및 수소; 즉, 알킬, 알켄일, 일킨일, 시클로알킬, 시클로알켄일, 및 비-헤테로 고리 아릴로 구성된 군을 포함한다.
"아릴"은 단일 고리(예를 들면, 페닐), 두 축합 고리(예를 들면, 나프틸) 또는 세 축합 고리(예를 들면, 안트라실 또는 페난트릴)를 갖는, 치환되거나 치환되지 않은 1가의 방향족 라디칼을 지칭한다. 이 용어는 일반적으로 헤테로아릴기를 포함하는데, 이것은 하나 이상의 질소, 산소, 또는 황 원자를 고리에 가지는, 예를 들면 푸릴, 피롤, 피리딜, 및 인돌과 같은 방향족 고리기이다. "치환된"이라는 용어는 아릴기에서 하나 이상의 고리 수소가 불소, 염소 또는 브롬과 같은 할로겐화물로 대치되거나; 하나 또는 두개의 탄소 원자를 함유하는 저급 알킬기로 대치되거나; 또는 니트로, 아미노, 메틸아미노, 디메틸아미노, 메톡시, 할로메톡시, 할로메틸, 또는 할로에틸로 대치된 것을 지칭한다.
"아랄킬"은 아릴기로 더 치환된 저급 알킬(바람직하게는 C1-C4, 보다 바람직하게는 C1-C2) 치환체를 지칭하며,그 예로는 벤질 및 페네틸이 있다.
"지방족 이황화" 연결 또는 결합은 R'-S-S-R" 형태의 연결을 지칭하고, R' 및 R"의 각각은 선형 또는 가지형의 알킬 사슬이고, 이것은 더 치환될 수 있다.
본원에서 사용된 "안정한" 연결은 본원에 기재된 이황 연결보다 생체 내에서 뚜렷하게 더 안정한 기능기를 포함하는 연결을 지칭한다. 예들은 아미드, 에테르 및 아민을 포함하나, 여기에 한정되지 않는다.
"소포-형성 지질"은 소수성 및 극성 머리 기 부분을 가지는 지방족 지질을 지칭하는데, 이것은 인 지질에 의해 예시되는 것과 같이 물에서 이중층 소포를 자발적으로 형성하거나 또는 안정적으로 지질 이중층에 포함되고, 소수성 부분은 이중층 멤브레인 내부의 소수성 영역과 접촉하고, 극성 머리 부분은 멤브레인 외부의 극성 표면을 향한다. 이런 소포-형성 지질은 하나 또는 두개의 소수성 아실 탄화수소 사슬 또는 스테로이드 기를 전형적으로 포함하며, 아민, 산, 에스테르, 알데히드 또는 알콜과 같이 화학적으로 반응성 기를 극성 머리 기에 함유할 수 있다. 예들은 포스파티딜 콜린(PC), 포스파티딜 에탄올아민(PE), 포스파티드 산(PA), 포스파티딜 이노시톨(PI), 및 스핑고미엘린(SM)을 포함하며, 두 탄화수소 사슬은 전형적으로 약 14-22 탄소원자 사이의 길이이고 다양한 불포화도를 갖는다. 다른 소포-형성 지질은 세레브로시드 및 강글리오시드와 같은 당 지질, 및 콜레스테롤과 같은 스테롤을 포함한다.
II. 본 발명의 보관 안정성의, 생체 내 절단가능 콘쥬게이트
A 구조
본 발명은 생물학적으로 활성인 분자 또는 리포솜의 지질 구성 요소와 같은 분자가 생체 내 절단 가능 연결을 통하여 또 다른 부분과 연결되어 있는 콘쥬게이트를 제공한다. 붙는 부분은 전형적으로 분자의 약리학적 특성을 향상시키기 위해 제공되는데, 예를 들면 면역원성을 감소시키고 그리고/혹은 투여 후 몸 안에서의 용해도 또는 순환 시간을 향상시킨다. 연결은 다음에 생체 내에서 절단되어 분자를 이것의 생물학적으로 활성인 원래의 형태로 방출한다.
종종 콘쥬게이트는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)에 연결된 단백질, 또는 다른 아민- 또는 히드록실-함유 분자를 포함한다. 하지만, 예를 들면 향상된 위장 및 BBB 수송을 위한 지질-단백질 또는 지질-약물 콘쥬게이트나, 표면-변형된 리포솜에서 사용하기 위한 지질-폴리머 콘쥬게이트 등과 같이 적합한 기능기를 함유하는 어떠한 두 가지 분자 사이에서 궁극적으로 콘쥬게이트가 형성될 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 하기와 같이 지질 또는 폴리머에 연결되는 일반적인 구조식 I을 갖는 이황화기-함유 콘쥬게이트를 제공한다:
Figure 112006083378863-PCT00007
구조식 I에서, 분자(예를 들면 R1XH 또는 R1XH2)로부터 유도되고 콘쥬게이트의 분해에 따라 방출되는 R1X는 아민- 또는 히드록실-함유 리간드를 나타내는데, X는 산소, 일차 질소 또는 이차 질소이다. 분자는 단백질, 폴리펩티드 또는 작은 분자 약물 화합물과 같이 생물학적으로 활성인 화합물일 수 있다. 대안으로, 리간드는 아민 함유 기질, 예를 들면 이중 탄화수소 꼬리 부분을 갖는 포스파티딜 에탄올아민과 같은 인지질로부터 전형적으로 유도될 수 있다.
식 I에서 "D" 모양 구조는 5- 또는 6-원 고리를 나타낸다. 고리는 예를 들면 시클로헥산, 시클로펜탄, 또는 테트라히드로푸란, 테트라히드로피란, 피페리딘, 피롤리딘같은 헤테로고리, 또는 모르폴린과 같은 헤테로고리 같이 포화될 수 있다. 대안으로, 고리는 예를 들면 시클로헥센과 같이 불포화될 수 있다. 바람직하게, 고리는 예를 들면 벤젠, 나프탈렌, 또는 안트라센과 같은 방향족 고리이거나, 보다 바람직하게는 벤젠이다. 또한 헤테로방향족 고리가 포함될 수 있는데, 하나 이상의 고리 원자(S-S 및 M기가 붙은 원소는 제외함)가 질소, 산소 또는 황으로 교체된다. 바람직한 단일 고리 시스템은 피리딘, 피리미딘, 2,4-이미다졸, -티아졸, 및 -옥사졸, 및 2,5-피롤, -푸란, 및 -티오펜을 포함한다. 바람직하게는, 고리는 탄소환 고리이고, 가장 바람직하게는 고리가 벤젠 고리이다.
M 기 및 이황화기(-S-S-)는 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 5- 또는 6-원 고리에 붙는다. M 자체는 cis-CRb=CRc-, -CRbRd-및 -CRbRd-CRcRe- 로부터 선택되고, Rb, Rc, Rd, 및 Re의 각각은 H, 메틸, 치환된 메틸, 플루오로, 및 클로로로부터 독립적으로 선택되고, 메틸은 히드록실, 플루오로, 또는 클로로로 치환될 수 있다. 바람직하게는 Rb, Rc, Rd, 및 Re의 각각은 H, 및 메틸로부터 독립적으로 선택되고; 한 구체예에서 Rb, Rc, Rd,및 Re의 각각은 H이다.
바람직한 구체예에서, 고리는 벤젠 고리이고 M은 cis-CRb=CRc-가 되어, 하기 구조식 Ia를 얻는다:
Figure 112006083378863-PCT00008
구조식 I 및 Ia를 참조하면, Ra는 5- 또는 6-원 고리 상의 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로, 할로겐 및 또 다른 접합 고리로부터 선택되는 하나 이상의 치환체를 나타내며, 여기서 R은 C1-C6 히드로카빌, 바람직하게 C1-C4 히드로 카빌이고 더 나아가 할로겐으로 치환될 수 있다. 할로겐은 바람직하게는 플루오로 또는 클로로이고, R은 바람직하게는 0 내지 2개의 할로겐 치환체를 포함한다.
바람직하게는, 접합 고리가 존재하는 경우 5 내지 7개의 고리 원자를 함유하며, 바람직하게는 5 또는 6개의 고리 원자를 함유한다. 어떤 안정한 접합 고리 시스템도 포함될 수 있다. 예들은 나프탈렌, 2,6- 또는 2,7-벤지미다졸, -벤조티아졸, 및 -벤족사졸, 2,4- 또는 2,6-인돌, 퀴놀린, 및 5-고리 또는 6-고리 상에서 하나 이상의 비-접합 탄소 원자가 질소로 치환된 유사체를 포함하지만, 여기에 한정되지 않는다. 선택된 구체예에서, Ra는 위에서 기재된 바와 같이 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로 및 할로겐으 로부터 선택되는 단일 치환체이며, R은 위에서 정의된 것과 같다. 그 이상의 구체예에서, Ra는 수소, 또는 R, OR, C(O)OR, 시아노, 니트로, 카르복실, 플루오로, 및 클로로로부터 선택되는 단일 치환체이며, R은 메틸 또는 에틸이다. 한 구체예에서, Ra는 수소이다.
L은 선형 또는 가지형 C1-C6 알킬기를 나타내고, 아릴로 더 치환될 수 있다. 바람직하게는, L은 -CR3R4-CR5R6- 구조를 가지게 되어, -CR3R4는 이황화기에 붙게 되는데, 여기서 R3 및 R4는 H, 알킬, 아릴, 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택되고, R5 및 R6는 H 및 메틸로부터 독립적으로 선택된다.
구조식 I에서, L 및 Ra는 함께 고리, 바람직하게는 5 내지 7 원 고리를 형성한다. 이 경우에, Ra 및 이황화기(-S-S-)는 바람직하게 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 5- 또는 6- 원 고리(Ia에서 벤젠 고리)에 붙을 수 있다.
콘쥬게이트는 L에, Ra에, 또는 구조식 I에서의 5- 또는 6- 원 고리에 붙는 지질 또는 친수성 폴리머를 더 포함할 수 있는데, 즉, 이것은 리간드 R1X가 콘쥬게이트될 부분이다. 붙을 가능성 있는 부위의 예는 아래 구조(i-iv)에서 주어지며, 지질 또는 친수성 폴리머는 R2로 명시된다. 예를 들면, 아래 구조(i)처럼, 지질 또는 친수성 폴리머는 L의 말단에 붙을 수 있거나, 직접(예를 들면 구조(ii)) 또는 치환체 Ra를 통하여(예를 들면 구조(iv)) 5- 또는 6- 원 고리에 붙을 수 있다. Ra 및 L 그 자체들이 연결되어 고리를 형성하고, R2가 (전형적으로는 Ra 또는 L에 붙음으로써) 이 고리에 부착되는 구체예도 또한 포함된다.
선택되는 구체예에서(예를 들면 (i) 및(ii)), Ra 및 L은 고리를 형성하지 않는다. 더 이상의 구체예에서, R2는 L의 말단부에 붙는다.(아래 구조(i))
Figure 112006083378863-PCT00009
L이 Ra에 연결되어 고리를 형성하는지 여부는, 콘쥬게이트가 절단시에 두 개 또는 세 개의 단편(이 중 하나는 초기 형태인 분자 R1XH 또는 R1XH2)을 생성하는지를 결정한다. 위 구조에서 보이는 것과 같이 파동선은 궁극적인 절단위치를 나타내는데, 구조식(i-ii)는 절단시 세 개의 단편을 만들고, 콘쥬게이트(iii-iv)는 절단 시 두 개의 단편을 생성한다. 본 발명의 이러한 관점은 아래에서 더 상세히 기술하 기로 한다.
또한 아래에서 더 논의되는 것과 같이, 이황화기와 인접하는 위치에서 L의 치환의 변형(예를 들면, L= -CR3R4-CR5R6-일 때, R3 및/또는 R4의 다양함)은 콘쥬게이트의 절단의 속도를 조절하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 더 신속한 절단의 속도를 달성하기 위하여, R3 및 R4는 수소가 된다. 더 느린 절단의 속도는 R3 및 R4 중 하나 또는 둘 다에 대하여 알킬, 아랄킬 또는 아릴기를 선택함으로써 이황화물을 입체 장애하여 달성될 수 있다. 바람직하게는, R3 및 R4는 수소, 및 저급(C1 내지 C6) 알킬로부터 독립적으로 선택된다. 선택된 구체예에서, R3 및 R4의 각각은 수소, 메틸, 에틸 및 프로필로부터 독립적으로 선택된다.
지질 또는 친수성 폴리머는, 아미드, 에스테르, 카바메이트, 또는 이것들의 황 유사체와 같이 안정한 연결을 통하여 구조식 I에 전형적으로 연결되는데, 아미드 및 카바메이트가 바람직하다. 이런 연결을 통한 콘쥬게이션의 방법은 당 업계에 잘 알려져 있다. 이런 기를 통하여 PEG를 다양한 부분에 연결하기 위한 방법은 예를 들면 Zalipsky et al.,1999, 2001; Zalipsky, 2002; Robert et al., 2002; Molineux, 2002, 2003; Harris et al., 2003; 및 다른 자료에 기재되어 있다.
친수성 폴리머 또는 지질은 또한 전형적으로 이것의 자유 말단부에 붙는 표적 부분을 포함한다. 이런 표적 부분은 본 출원인의 미국 특허 번호 6,660,525에 기재된 내용을 포함하고, 이것은 본원에 참조로 포함된다. 표적 부분에 대한 제한 되지 않는 예는 상피성 암종 및 골수 줄기 세포를 표적하기 위한 항체, 엽산; 간 세포를 표적하기 위한 피리독실 포스페이트, 갈락토스; 간 세포 및 혈관 상피 세포를 표적하기 위한 아포리포단백질; 뇌 상피 세포를 표적하기 위한 트란스페린; 종양 상피 세포를 표적하기 위한 VEGF; 혈관 내피 세포를 표적하기 위한 VCAM-1 또는 ICAM-1; 호중구 및 백혈구를 표적하기 위한 Mac-1; CD4+ 림프구를 표적하기 위한 HIV GP120/41 또는 HIV GP120 C4 도메인 펩토머; 활성 혈소판을 표적하기 위한 파이브로넥틴; 및 죽상 경화반에서 내피 세포 및 평활근 세포를 표적하기 위한 오스테오폰틴을 포함한다.
폴리펩티드 리간드와 같이 다양한 기능성 곁 기를 가지는 어떠한 리간드에 대하여, 다중 폴리머 R2가 리간드에 콘쥬게이트될 수 있다. 이것들은 위에서 나타난 다중 구조식I 단독 또는 생체 내에서 보다 안정한 연결기와의 결합을 통하여 콘쥬게이트 될 수 있다. 폴리머의 분자량의 선택은 리간드에 붙은 폴리머 사슬의 수에 의존하는데, 붙은 폴리머 사슬의 수가 적을 때 더 큰 분자량 폴리머가 종종 선택되며, 그 반대도 가능하다.
도 1은 본 발명에 다른 대표적 콘쥬게이트의 구조식을 나타낸다. 콘쥬게이트는 상기 구조식 Ia의 구체예이며, Ra-Rc의 각각은 수소이다. 따라서 콘쥬게이트는 디티오시나메이트(DTC) 구조를 바탕으로 한다.
이 콘쥬게이트에서 R2는 친수성 폴리머 메톡시-폴리에틸렌 글리콜(mPEG)이 고, 화학식 CH3O(CH2CH2O)n에 의하여 표시될 수 있는데, 여기서 n은 바람직하게는 약 10 내지 약 2300이고, 약 440 달톤 내지 약 100,000 달톤의 분자량에 해당한다. 폴리머의 분자량의 선택은 붙는 리간드의 선택에 어느 정도 의존한다. 리포솜에 사용하기 위하여 리간드가 아민-함유 지질로부터 유도되는 구체예에서는, PEG 분자량의 바람직한 범위는 약 750 내지 약 10,000 달톤이고, 보다 바람직하게는 약 2,000 내지 약 5,000 달톤이다. 리간드가 아민-함유 폴리펩티드로부터 유도되는 구체예에서는, PEG 분자량의 바람직한 범위는 약 2,000 내지 약 40,000 달톤이고, 보다 바람직하게는 약 2,000 내지 약 20,000 달톤이다. R2는 다양한 친수성 폴리머뿐만 아니라 지질로부터 선택될 수 있다는 것이 인식될 수 있을 것이다. 대표적인 폴리머는 위에서 언급된다.
이 콘쥬게이트에서 L은 -CR3R4-CR5R6-인데, 여기서 R4-R6는 수소이고 R3는 다양하다. 위에서 기재한 것과 같이, R3는 수소, 알킬, 아릴, 또는 아랄킬일 수 있다. 이 콘쥬게이트에서 XR1은 예를 들면 약물 또는 단백질과 같이 일차 아민-함유 분자이다. 우레탄(카바메이트)기를 통하여 mPEG는 L의 말단부에 붙는다.
B. 합성
도 2는 아래의 실시예 1-6에서 또한 기재되는, 대표적인 PEG-단백질 콘쥬게이트의 합성을 위한 대표적인 방법을 예시한다. 반응도는 유기 합성 및 생 컨쥬게이션 화학의 당업자에 의하여 용이하게 변형될 수 있는데, 예를 들면 상이한 분자 R1 또는 폴리머 R2의 치환에 의해서, 혹은 연결기 및/또는 고리에 대한 다양한 치환에 의해서다.
위에 기재된 것과 같이, 바람직한 구체예에서 이황화기가 붙는 고리는 벤젠 고리이고, M은 cis-올레핀을 포함한다. 이 구체예에 따르면, 공개된 과정(Panetta 및 Rapoport, 1982)에 따라 오르쏘에스테르-치환 알킨의 티오페놀에의 첨가에 의하여 cis-메르갑토신남 산을 합성할 수 있다. 아래 실시예 1에 기재된 것과 같이, 이 과정을 사용하여 cis-메르캅토신남 산(2)을 티오페놀(1) 및 트리에틸 오르쏘프로피오레이트로부터 제조하였다.
도 2에서 연결기가 붙는 것은 또 다른 콘쥬게이션에 유용한 기능기, 이 경우에는 아미노기를 원단부에 가지는 알칸 티올과의 반응에 의하여 달성된다. 예시된 시약, 2-메르캅토프로필아민 염산염(3, R=CH3)은 대응하는 아미노 알코올로부터 Owen의 방법(1967)에 따라 제조될 수 있다. 다양한 R 기를 갖는 유사한 아미노알킬티올 유도체는 비슷한 방식으로 제조될 수 있다.
혼합 이황화물(4)은 디에틸 아지도카르복실레이트와 같은 활성제와의 아미노알칸티올의 반응과, 이어서 방향족 티올과의 반응을 통하여 형성할 수 있으며, 예를 들면 Mukaiyama et al., Tetrohedron Letters 56: 5907-5908(1968)의 방법에 따른다. 대안으로, S.J. Brois et al., J. Am. Chem. Soc. 92: 7629-31(1970)에 기재된 바와 같이, 염화 메톡시카르보닐술페닐을 사용하여 아미노알칸티올의 활성화된 이황화물을 형성할 수 있다. 활성화된 이황화물은 방향족 티올과 반응시켜 이황 화물(4)을 형성할 수 있다. (Zalipsky et al., 1999, 참조)
다음에 R2 부분의 부착을 위해, 이 경우에는 우레탄(카바메이트) 연결을 통하여 PEG의 부착을 위해, L의 말단 아미노기를 사용할 수 있다. 공개된 다양한 프로토콜에 따라, 이것은 mPEG-클로로포르메이트와의 반응에 의하여 달성될 수 있다. (예를 들면, Zalipsky 및 Melon-Rudolph, in "Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications", J.M. Harris & S. Zalipsky, eds., Amer. Chem. Soc., 워싱턴 DC, pp. 318-341(1997) 참조). Zalipsky et al., Biotechnol . Appl . Biochem. 15:100(1992)에 따라, 중합체 클로로포르메이트는 무수 mPEG-OH 용액의 포스겐화에 의하여 생성될 수 있다. 대안으로, 알려진 방법에 따라 (예를 들면 H.C. Chiu et al., Bioconjugate Chem . 4: 290-295(1993); Zalipsky et al., 1992; 및 Zalipsky and Melon-Rudolph, 1997 참조; 둘 다 위에서 인용됨) 연결은 PEG-숙신이미딜카르보네이트 및 말단 아민의 반응에 의하여 형성될 수 있다.
다음에 단백질(또는 예를 들면 아민- 또는 히드록실-함유 약물과 같이 콘쥬게이트될 다른 분자)을 표준 방법에 따라 자유 카르복실기에 콘쥬게이트시킨다. 예를 들면, 카르보디이미드-매개 에스테르화 과정을 사용하여 산을 이것의 N-히드록시 숙신이미드 에스테르(5)로 전환할 수 있다. (예를 들면 G.W. Anderson et al., J. Amer . Chem . Soc. 86: 1839(1964) 참조). 대안으로, 시약 O-(N-숙신이미딜)-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트로 이것을 달성할 수 있다.(R. Knorr et al., Tetrahedron Lett. 30(15):1927-30(1989); M. Wilchek et al., Bioconjugate Chem . 5: 491(1994))
단백질의 아미노기를 N-히드록시숙신이미드 에스테르와 반응시키기 위한 수 많은 일반 프로토콜이 있다. 대표적인 과정에 대하여, 예를 들면 Zalipsky et al., Biotechnol. Appl . Biochem . 15:100(1992) 또는 H. C. Chiu et al., Bioconjugate Chem. 4:290 (1993)을 참조한다.
이런 반응들의 다양한 매개 변수들, 예를 들면 NHS 시약의 양, 단백질 상의 아미노기의 수, 반응 완충액의 pH, 온도, 및 반응 지속 시간에 따라, 다양한 PEG화 정도를 갖는 단백질-폴리머 콘쥬게이트 종의 범위를 얻을 수 있다. 필요하다면, 일반식(mPEG)n-단백질의 콘쥬게이트 혼합물이 다양한 크로마토그래피 기술에 의하여 분별될 수 있다. 1:1 콘쥬게이트(즉, n=1)는 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 분리하는 것이 때로는 가능하다.
위의 합성과 관련하여, 본 발명은 아민-, 히드록시- 또는 카르복실-함유 화합물을 하기 일반 구조식 II를 갖는 화합물과 반응시켜 얻을 수 있는 콘쥬게이트를 포함하는 조성물을 또한 포함하는데:
Figure 112006083378863-PCT00010
상기 식에서 M, Ra 및 L은 상술한 것과 같으며, Z는 이탈기이고, 그리고 화합물은 L에, Ra에, 혹은 상술한 바와 같이 D-모양 구조식으로 나타나는 5- 또는 6-원 고리에 붙은 지질 또는 친수성 폴리머를 더 포함한다.
이탈기 Z는 DSPE, 폴리펩티드, 또는 아민-함유 약물 같은 아민- 또는 히드록시-함유 리간드 화합물과의 반응에 의해 교체될 수 있다. 이탈기는 리간드 화합물에서 치환기의 반응성에 따라 선택된다. 적합한 이탈기는 염소, p-니트로페놀, o-니트로페놀, N-히드록시테트라히드로프탈이미드, N-히드록시숙신이미드, N-히드록시-글루타르이미드, N-히드록시노르보르넨-2,3-디카르복시이미드, 1-히드록시벤조트리아졸, 3-히드록시피리딘, 4-히드록시피리딘, 2-히드록시피리딘, 1-히드록시-6-트리플루오로메틸벤조트리아졸, 이미다졸, 트리아졸, N-메틸-이미다졸, 펜타플루오로페놀, 트리플루오로페놀, 및 트리클로로페놀을 포함한다. 전형적으로 이런 반응은 리간드에 에스테르 또는 아미드 연결을 형성한다.
C. 콘쥬게이트의 절단
상술한 바와 같이, 콘쥬게이트의 절단은 이황화 연결기의 절단에 의하여 시작된다. 이것은 생체 내에서 가티올분해 메카니즘에 의하여 일어나며, 시스테인 또는 글루타티온 같은 내인성 시약에 의하여 시작된다. 절단의 속도는 이황화기와 인접한 연결기의 구조를 변화시킴으로써 조절될 수 있고, 절단 속도는 하기 방법을 사용하여 시험관 내에서 측정될 수 있다.
절단 반응은 콘쥬게이트의 구조에 따라, 초기에 두 개 또는 세 개의 절단 생 성물을 초기에 만들 수 있다. 예를 들면, 도 3은 세-단편 절단 반응에서 도 1의 mPEG-DTC-(NH-리간드) 콘쥬게이트의 가티올분해 메카니즘을 보여준다. 오르쏘-디티오신나밀 부분의 이황화물은 가티올분해로 절단될 수 있는데, 예를 들면 시스테인(예시한 것) 또는 자연적으로 발생하는 다른 환원제의 존재하에 절단된다. 외인성 환원제 또한 투여될 수 있어, 콘쥬게이트의 절단 및 분해에 충분한 가티올분해 조건을 인위적으로 유도하거나, 또는 절단을 가속할 수 있다.
도 3에서 나타낸 것과 같이, 5- 또는 6-원 고리 (여기에서는 벤젠 고리)상에 생성된 티올기는 고리-폐쇄 반응에서 아미드 부분으로부터 아민-함유 리간드를 교체한다. 아민-함유 화합물은 자연적이고 변형되지 않은 형태로 재생성된다. 이 경우 R2 또는 mPEG는 L에 붙은 상태로 남는데, 이것은 이제 티올-함유 절단 시약인 시스테인에 콘쥬게이트된다. 콘쥬게이트의 치환에 의존하여, 고리 폐쇄 반응에서 생성되고 형성된 제 3의 요소는 알려진 안정한 화합물인 티오쿠마린, 또는 이것의 유도체이다.
도 4는 L 및 Ra가 연결되어 두-단편 절단을 발생시키는 구체예에서 콘쥬게이티의 절단을 설명한다. 도 1C의 구체예에서, 콘쥬게이트는 디티오신나밀기 상에서 다시 구성된다. 위의 구조 (iv)에서와 같이, R2는 방향족 고리에 붙는다. 예를 들면, 도 1에서와 같이 R2는 카바메이트를 통하여 연결된 PEG일 수 있다
대안으로, 위의 구조 (iii)에서와 같이 R2는 L-Ra 고리에 붙을 수 있다. 절 단시 콘쥬게이트 분자는 비슷한 메카니즘을 통하여 이것의 본래 형태(예를 들면 R1NH2)로 다시 방출된다. 제 2 단편은 절단 시약의 잔류물(도 4에서 시스테인으로 나타남) 및 폴리머 둘 다에 또는 다른 기 R2에 붙는 티오쿠마린 유도체이다.
생물학적으로 연관된 조건하에서 콘쥬게이트의 가티올분해는 시스테인, 글루타티온, 또는 알부민과 같이 생리학적으로 존재하는 티올과의 인큐베이션에 의하여 증명될 수 있다.(Zalipsky et al., Proceed. Int'l . Symp . Control Rel . Bioact . Mater. 28: 73(2001) 참조). 자유 단백질 또는 다른 방출 분자의 생성은 SDS-PAGE에 의하여 모니터할 수 있다. 시간에 따라 소멸하는 콘쥬게이트 종의 농도를 관찰하거나, 또는 나타나는 자유 단백질(또는 다른 방출 분자)을 측정함으로써 절단의 속도를 모니터할 수 있다. 일반적으로 티오쿠마린 유도체는 발색하는 것으로 보고되고 있기 때문에, 방출된 티오쿠마린 또는 이것의 유도체는 또한 일반적으로는 쉽게 검출될 수 있다. 티오쿠마린의 방출 속도는 형광 분광법에 의하여 관찰될 수 있다.
만약 콘쥬게이트 분자가 콘쥬게이트된 형태로 생물학적으로 비활성이라면, 생물학적 활성의 회복을 관찰함으로써 절단을 모니터할 수 있다. (예를 들면 Zalipsky et al., "Reversible PEGylation: Thiolytic regeneration of active protein from its polymer conjugates". in PEPTIDES: THE WAVE OF THE FUTURE, M. Lebl, R.A. Houghton, eds., Amer. Peptide Soc., 2001, p. 953; R.B. Greenwald et al., Bioconjugate Chem. 14:395(2003) 참조). 이황화 연결기에 인접한 R기의 크기를, 예를 들면, 메틸에서 이소프로필, t-부틸 등과 같이 증가함으로써 가티올 분해의 속도는 상당히 감소될 수 있다.
본 발명의 콘쥬게이트는 환원제 없이 보관되었을 때의 안정성과, 티올과 같이 적합한 환원제가 있을 때 약학적으로 유용한 속도로 절단되는 이점을 제공한다. 특히 보관 안정성은 Greenwald et al.의 미국 특허 번호 6,214,340에 기재된 절단 가능한 페닐 에스테르를 기초한 콘쥬게이트의 보관 안정성보다 월등하다. 이런 에스테르는 일반적으로 알킬 에스테르보다 더 큰 속도로 가수분해한다.(예를 들면 Quick et al., 1978; Blay et al., 1988; 3월, 1992 참조). 이런 가수분해는 주위 보관 조건 하에서 일어날 수 있으며, 이 조건하에서 환원성 절단은 훨씬 덜 일어난다.
III. 대상 콘쥬게이트의 대표적 용도
A. 본 발명의 mPEG-지질 콘쥬게이트를 포함하는 리포좀 조성물
한 구체예에서, 아민-함유 리간드 화합물은 아민-함유 지질이다. 본원에 기재된 것과 같이 지질은 수불용성 분자를 의미하고, 적어도 약 여덟 탄소 원자를 전형적으로 함유하는 적어도 하나의 탄화 수소 사슬("꼬리")을 가지며, 보다 바람직하게는 약 8-24 탄소 원자를 함유하는 아실 탄화수소 사슬을 가진다. 바람직한 지질은 아민-함유 극성 머리 기 및 아실 사슬을 갖는 지질이다. 대표적인 지질은 스테아로일아민 같은 단일 아실 사슬 또는 두 아실 사슬을 갖는 인지질이다. 아민-함유 머리 기를 갖는 바람직한 인지질은 포스파티딜에탄올아민 및 포스파티딜세린을 포함한다. 지질 꼬리는 약 12 내지 약 24 탄소 원자를 가지며, 전체가 포화되거나 또는 부분적으로 불포화될 수 있다. 하나의 바람직한 지질은 디스테아로일포스파티딜에탄올아민(DSPE)이다; 하지만 당업자는 본 명세서에 포함되는 크게 다양한 지질을 인식할 수 있을 것이다. 지질은 자연적으로 아민기를 포함할 수 있거나, 아민기를 포함하도록 유도체로 형성될 수 있다는 것 또한 인식될 것이다. 예를 들면 콜레스테롤아민과 같이, 상술한 탄화수소 사슬을 포함하지 않는 다른 지질 부분 역시 적합할 것이다.
한 구체예에서, 본 발명의 콘쥬게이트는 리포솜으로 조제된다. 리포솜은 다양한 치료 목적을 위하여 사용되는 폐쇄 지질 소낭이며, 특히 전신성 투여에 의하여 표적 영역 또는 세포로 치료제를 운반하기 위하여 사용된다. 특히 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 같은 친수성 폴리머 사슬의 표면 코팅을 갖는 리포솜은 약물 담체로서 바람직한데, 이들 리포솜은 폴리머 코팅이 결여된 리포솜보다 연장된 혈액 순환 유효 기간을 제공하기 때문이다. 폴리머 코팅에서 폴리머 사슬은 리포솜을 보호하고, 리포솜에 수용매화된 폴리머 사슬의 "경직 브러쉬"를 형성한다. 이리하여, 폴리머는 혈액 단백질에 대한 장벽으로 작용하며, 단백질의 결합과, 대식세포 및 세망내피 시스템의 다른 세포에 의한 섭취 및 제거를 위한 리포솜의 인식을 방지한다.
폴리머 사슬의 표면 코팅을 갖는 리포솜은, 지질 혼합물에서 약 1 내지 약 20 몰 퍼센트의 지질-폴리머 콘쥬게이트를 포함함으로써 전형적으로 제조된다. 지질-폴리머 콘쥬게이트의 실제 양은 폴리머의 분자량에 따라 더 높거나 또는 더 낮을 수 있다.
다양한 구체예에서, 상기한 1 내지 20 몰 퍼센트의 지질의 폴리머 사슬은 본 원에서 개시하는 절단 가능 연결 구조를 통하여, 또는 바람직한 구체예에서는 생체 내에서 보다 안정한 연결기와의 이런 연결의 조합에 의하여 지질에 부착된다. 이 경우, 더 높은 분자량 폴리머 사슬은 본원에서 개시하는 절단 가능 연결 구조를 통하여 바람직하게 연결되며, 짧은 폴리머 사슬은 보다 안정한 연결기에 의해서 연결된다.
다른 구체예에서, 폴리머 사슬의 일부 또는 전부는 상기와 같이 자유 말단부에서 표적부분을 함유한다.
바람직하게는, (구조식 I을 위한 L의 정의에서) R3 및/또는 R4는 수소가 아닌 본 발명의 폴리머-지질 콘쥬게이트를 함유하는 리포솜은 폴리머 및 지질이 지방족 이황화 결합에 의하여 연결된 폴리머-지질 콘쥬게이트를 함유하는 리포솜보다 더 긴 혈액 순환 유효 기간을 갖는다.
중요하게는 본 발명의 폴리머-지질 콘쥬게이트의 절단은 변형되지 않은 형태로 원래의 지질의 재생성을 일으킨다. 인위적이고, 변형된 지질은 생체 내에서 원하지 않는 효과를 가지기 때문에 이것은 바람직하다. 동시에, 환원제 없이 보관될 때 콘쥬게이트는 안정하다.
B. 폴리펩티드 콘쥬게이트
또 다른 구체예에서, 본 발명은 상술한 콘쥬게이트를 포함하며, 아민-함유 리간드 화합물은 폴리펩티드이다. 본 발명의 폴리머-폴리펩티드 콘쥬게이트의 제조를 위한 바람직한 합성 반응도에서, 도 2에서 5로 표시한 것과 같은 mPEG-DTC-이탈 기 화합물은 실시예 1-5에서 기재된 것과 같은 합성 경로에 따라 제조한다. 예를 들면 이탈기는 나타나는 바와 같이 N-히드록시 숙신이미드, 니트로페닐 카르보네이트 또는 상술된 다른 것들 중 어떤 하나일 수 있다. 이황화기와 인접한 R 기는 H, CH3 C2H5, 등 일 수 있고 이황화기 절단의 원하는 속도에 따라 선택된다. 다음에, mPEG-DTC-NHS 화합물 5, 또는 그 대응체는 폴리펩티드에서 아민 부분과 연결되어, 우레탄(카바메이트) 연결을 형성한다.
PEG와 같은 폴리머 사슬의 폴리펩티드에의 부착은 폴리펩티드의 효소적인, 또는 예를 들면 수용체 결합과 같은 다른 생물학적 활성을 종종 감퇴시킨다. 하지만, 폴리펩티드의 폴리머 변형은 증가된 폴리펩티드의 혈액 순환 유효 기간이라는 이점을 제공한다. 본 발명에서 폴리머-폴리펩티드 콘쥬게이트는 피험체에게 투여된다. 콘쥬게이트가 순환함에 따라, 혈액 시스테인 및 다른 생체 내 티올 같은 생리학적 환원 조건에의 노출은 폴리펩티드로부터 친수성 폴리머 사슬의 절단을 개시한다. 폴리머 사슬이 폴리펩티드로부터 방출됨에 따라, 폴리펩티드의 생물학적 활성은 점차 회복된다. 이러한 방식으로, 폴리펩티드는 초기에 생물학적 분배에 대하여 충분한 혈액 순환 유효 기간을 가질 수 있고, 폴리머 사슬이 절단됨에 따라 시간경과에 따라 폴리펩티드의 완전한 생물학적 활성을 회복한다.
폴리머 사슬의 전부 또는 일부는 상술한 바와 같이 자유 말단부에 표적 부분을 함유할 수 있다.
다양한 구체예에서 폴리머 사슬은 본원에서 개시된 절단 가능 연결 구조 또 는 이러한 연결의 생체 내 보다 안정한 연결기와의 조합을 통하여 폴리펩티드에 부착된다. 후자에 따른 접근은 가역적 연결에 의하여 생물학적 활성을 위하여 필수적인 PEG 사슬의 폴리펩티드의 아미노기에의 연결을 허용하고, 펩티드 활성에 대하여 필수적이지 않은 아미노기에의 연결은 보다 안정한 결합에 의하여 허용된다.
상술한 친수성 폴리머의 어떤 것이라도 사용하기 위하여 고려될 수 있다는 것이 인식될 것이다. 바람직한 구체예에서, 폴리머는 폴리알킬렌 글리콜, 바람직하게는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)이다. 폴리펩티드, 폴리펩티드 상의 반응성 아민의 수, 및 폴리머-변형 콘쥬게이트의 원하는 크기에 따라 폴리머의 분자량은 선택된다.
사용하기 위하여 고려되는 폴리펩티드는 제한되지 않으며, 자연-발생적 또는 유전자 재조합으로 생성되는 폴리펩티드일 수 있다. 작은-인간 재조합 폴리 펩티드가 바람직할 수 있으며, 10-30KDa 범위의 폴리펩티드가 바람직하다. 대표적 폴리펩티드는 종양 괴사 인자(TNF)와 같은 시토킨, 인터류킨 및 인터페론, 에리트로포이에틴(EPO), 과립구 군락 촉진인자(GCSF), 효소 등을 포함한다. 바이러스성의 폴리펩티드가 또한 고려되며, 바이러스의 표면은 변형되어 본원에서 기술된 바와 같이 절단 가능 연결부를 통하여 연결된 하나 이상의 폴리머 사슬을 포함한다. 세포 트랜스펙션을 위한 유전자 함유 바이러스의 변형은 바이러스의 순환시간을 연장시키고 이것의 면역원성을 감소시켜, 이로써 외인성 유전자의 전달이 개선된다.
C. 아민-함유 약물 콘쥬게이트
본 발명의 또 다른 구체예에서, 위 구조식 I의 아민-함유 리간드는 아민-함 유 약물로부터 유도된다. 예를 들면 PEG로 치료 약물을 변형하는 것은 약물의 혈액 순환 유효기간을 개선시키고, 어떠한 면역원성을 감소시키는 데 효과적이다.
특정 약물을 제공하기 위해서 필요한 변형과 함께, 콘쥬게이트는 상술한 반응도 중 어떠한 것에 따라서도 제조된다. 크게 다양한 치료 약물은 반응성 아민 부분을 가지고, 본 발명은 이런 약물 중 어떠한 것도 제한 없이 고려한다. 예들은 미토마이신 C, 블레오마이신, 독소루비신 및 시프로플록사신을 포함한다.
하기 실시예는 본원에 기재된 발명을 더 설명하며, 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 결코 아니다.
실시예 1: cis- 메르캅토신남 산(2)의 제조(도 2를 참조)
이 화합물은 J. A. Panetta 및 H. Rapoport(J. Org . Chem. 47: 2626-2628(1982))에 의해 공개된 과정에 따라 하기와 같이 합성될 수 있다.
10ml의 p-시멘 중의 새롭게 증류된 티오페놀(1; 도 2를 참조)(2.0g, 18mmol), 트리에틸오르쏘프로피올레이트(H. Stetter et al., Synthesis 207(1973)의 과정에 따라 제조됨)(3.27g, 19mmol) 및 피발산(1.6g, 15mmol)의 용액을 26 시간동안 환류하면서 가열하였다. 용매를 제거하고, 헥산/에테르(9/1)를 용리액으로 잔류물을 실리카 겔 상에서 크로마토그래피하여, 옅은 노란 액체인 에틸 2-메르캅토신나메이트 2.79g을 수득하였다 (75% 수율): IR 3000, 1720, 1600, 1495, 1440 cm-1: NMR δ7.65(d, 1H), 7.1-7.45(m, 4H), 5.55(d, 1H), 4.05(q, 2H), 1.15(t, 3H); MS C11H12O2S m/e 에 대한 계산값 208.0558(M+), 측정값 208.0560.
합성된 상기 에틸 2-메르캅토신나메이트(1g, 5.4mmol)를 10ml의 95% 에탄올에 용해하고, KOH(0.75g, 13.4 mmol)를 첨가하였다. 2시간 동안 환류하면서 반응 혼합물을 가열하였고, 다음 25℃로 냉각하고 5% 수성 HCl로 산성화 하였다. 수성 상을 에테르(3x20ml)로 추출하고, 합한 유기 부분을 물(20ml)과 염수(20ml)로 세정하고, 무수 황산나트륨 상에서 건조한 후, 농축하여 0.85g(87%)의 결정성 신남산 2를 수득하였다. M.p. 128-129℃; UV λmax=250nm(ε=7350M-1.cm-1), 및 275(9700); NMR δ 7.8(d, 1H), 7.15-7.45(m, 4H), 5.5(d, 1H); C9H8O2S에 대한 분석 계산값: C, 60.0; H, 4.5, 측정값: C, 60.2; H 4.6.
실시예 2: 2- 메르캅토프로필아민 염산염(3, R= CH 3 )의 제조
이 화합물은 예를 들면 T. C Owen, J. Chem. Soc. C 1373-1376 (1967)에 기재된 과정에 따라 대응하는 아미노 알콜로부터 제조할 수 있다. 간략하게 말하면, 황산을 사용하여 화합물을 아미노알킬 설페이트로 에스테르화하고, 이어서 이황화탄소 및 알칼리를 사용하여 티아졸리딘에티온으로 고리화한 후, 이것을 다음에 가수분해하여 생성물을 수득한다. 다양한 R 치환체를 갖는 유사한 아미노알칸티올 유도체를 유사한 방식으로 제조할 수 있다.
디티오신남산 ( DTC ) 연결부의 형성:
실시예 3: 혼합 이황화물 2-아미노프로필- 디티오신남산(4)의 합성
T. Mukaiyama et. al., Tehtrahedron Letters 56: 5907-5908(1968)에 기재된 과정에 따라 2-메르캅토프로필아민 염산염(3)(실시예 2)를 디에틸아지도카르복실레이트와 반응시키고, 이어서 cis-메르캅토신남산(2)(실시예 1)과 반응시켜 혼합 이황화물(4)을 제공한다. 대안으로, S. J. Brois et al., J. Am. Chem . Soc . 92: 7629-31 (1970)에 기재된 바와 같이 (3)을 염화 메톡시카르보닐술페닐과 반응시켜 2-(메톡시카르보닐디티오)프로필아민 염산염를 형성하고, 이어서 메르캅토신남산(2)과 반응시켜 혼합 이황화물(4)을 형성할 수 있다 (S. Zalipsky et al., Bioconjugate Chem. 10:703-7(1999) 참조).
실시예 4: mPEG-우레탄-연결 디티오신남산(mPEG-DTC, 5a)의 합성
2-아미노프로필디술파닐신남산(4)(실시예 3)과 mPEG-클로로포름산염의 반응에 의해서 이 변형을 달성할 수 있다. 예로써 S. Zalipsky 및 S. Menon-Rudolph in Poly(ethylene glycol): Chemistry and Biological Applications, J.M. Harris & S. Zalipsky, eds., Amer. Chem. Soc., 워싱턴 DC, 1997, 페이지 318-341을 참조한다. S. Zalipsky et al., Biotechnol . Appl . Biochem . 15: 100-114(1992)에 따라, 무수 mPEG-OH 용액의 포스겐화에 의해 mPEG 클로로포름산염을 쉽게 생성할 수 있다.
대안으로, H.-C. Chiu et al., Bioconjugate Chem . 4:290-295(1993); 위에서 인용된 Zalipsky et al.,(1992l); 또는 위에서 인용된 Zalipsky et al.,(1997)의 과정에 따라, 2-아미노프로필디술파닐신남산(4)(실시예 3)의 mPEG-숙신이미딜 카르보네이트와의 반응에 의하여 우레탄 연결을 형성할 수 있다.
실시예 5: mPEG- DTC NHS 에스테르(5)의 합성
예를 들면 G.W Anderson et al., J. Amer . Chem . Soc . 86:1839(1964); R, Knorr et al., Tetrahedron Lett. 30: 1927(1989); 또는 M. Wilchek et al., Bioconjugate Chem. 5:491(1994)에 기재된 것과 같이, 당업계에 알려진 에스테르화 과정을 이용하여 mPEG-우레탄-연결 디티오신남산(5a)을 N-히드록시 숙신이미드 에스테르로 전환할 수 있다.
실시예 6: mPEG- DTC -단백질 콘쥬게이트(6)의 제조
공개된 다양한 과정에 따라, N-히드록시숙신이미드 에스테르(5)를 전형적으로 중성 또는 염기성 pH(pH 7-9)의 수성 완충액에서 단백질의 아미노기와 반응시킬 수 있다. 대표적인 과정으로, 위에서 언급된 S. Zalipsky et al.,(1992); H.C. Chiu et al., Bioconjugate Chem. 4:290(1993)을 참조한다. 단백질 상에서, mPEG 시약 및 아미노기의 비율, 반응 완충액의 pH, 온도, 및 반응의 지속시간 같은 다양한 반응 매개 변수에 따라 PEG화 정도가 다양한 콘쥬게이트 종의 범위를 얻을 수 있다. 일반식(mPEG)n-단백질의 콘쥬게이트 혼합물을 다양한 크로마토그래피 기술에 의해 분류할 수 있다. n=1인 (mPEG)n-단백질 콘쥬게이트를 예를 들면 이온 교환 크로마토그래피에 의하여 정제하는 것도 때로는 가능하다.
실시예 7: mPEG- DTC -단백질 콘쥬게이트의 가티올분해
생물학적으로 연관된 조건하에서 가티올 분해에 응답하는 PEG 제거(De-PEGylation)는 예를 들면 시스테인, 글루타티온, 또는 알부민과 같이 생리적으로 존재하는 티올과 함께 콘쥬게이트를 배양함으로써 증명될 수 있다 (S. Zalipsky et al., Proceed. Int'l . Symp . Control Rel . Bioact . Mater. 28:73(2001)을 참조). 절단 가능 PEG-단백질 콘쥬게이트의 자유 단백질로의 전환을 예를 들면 SDS-PAGE에 의해 검출할 수 있다. 시간과 함께 콘쥬게이트 종이 사라짐에 따라 콘쥬게이트 종의 농도를 측정하거나 또는 나타나는 자유 단백질을 측정함으로써 반응의 속도를 이어서 검출할 수 있다. 만약 콘쥬게이트가 PEG화의 결과로서 생물학적 활성을 갖고 있지 않다면, 절단 가능 조건 하에서 단백질의 생물학적 활성의 회복의 시간 경로를 측정할 수 있다.(S. Zaliplsky et al., Reversible PEGylation: thiolytic regeneration of active protein from its polymer conjugates, in Peptides: The Wave of the Future, M Lebl and R.A. Houghton, eds., Amer. Peptide Soc., 2001, 페이지 953; R.B. Greenwald et al., Bioconjugate Chem . 14:395(2003)을 참조)
본 발명은 특정한 구체예에 대하여 설명하고 있으나, 본 발명으로부터 벗어나지 않는 범위에서 다양한 변화 및 변형이 가능하다는 것은 당업자에게 자명할 것이다.

Claims (40)

  1. 하기 구조식 I을 갖는 콘쥬게이트.
    Figure 112006083378863-PCT00011
    여기서
    R1X는 아민- 또는 히드록실-함유 리간드로, 여기서 X는 산소, 1차 질소 또는 2차 질소이고:
    M은 cis-CRb=CRc-, -CRbRd-, 및 -CRbRd-CRcRe-로부터 선택되는데, 여기서 Rb, Rc, Rd, 및 Re 의 각각은 H, 메틸, 치환된 메틸, 플루오로, 및 클로로로부터 독립적으로 선택되며, 메틸은 히드록실, 플루오로, 또는 클로로로 치환될 수 있고;
    D-모양 구조는 5- 또는 6-원 고리를 나타내고, 여기에 M 및 이황화기 S-S가 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 붙으며;
    Ra는 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로, 할로겐, 및 또 다른 접합 고리로부터 선택되는 하나 이상의 고리상의 치환체이며, 여기서 R은 C1-C6 히드로카빌이고 이것은 할로겐으로 더 치환될 수 있 으며; 그리고
    L은 선형 또는 가지형 C1-C6 알킬기로, 이것은 아릴 또는 아랄킬로 더 치환될 수 있는데;
    여기서 L 및 Ra는 함께 고리를 형성할 수 있으며;
    그리고 여기서 콘쥬게이트는 L에, Ra에, 또는 5-또는 6-원 고리에 붙은 지질 또는 친수성 폴리머를 더 포함한다.
  2. 제 1항에 있어서, L 및 Ra는 고리를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 콘쥬게이트는 L 또는 Ra에 붙은 친수성 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  4. 제 2항에 있어서, 5-또는 6-원 고리는 방향족 고리인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  5. 제 4항에 있어서, 방향족 고리는 벤젠 고리이고, M은 cis-CRb=CRc-이므로, 콘쥬게이트는 하기 구조식 Ia를 갖는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
    Figure 112006083378863-PCT00012
  6. 제 5항에 있어서, Rb 및 Rc의 각각은 수소인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  7. 제 6항에 있어서, 콘쥬게이트는 L에는 붙으나 Ra에는 붙지 않은 친수성 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  8. 제 7항에 있어서, Ra는 수소인 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  9. 제 5항에 있어서, L은 -CR3R4-CR5R6- 구조를 가지어 -CR3R4는 이황화기에 붙으며, R3 및 R4는 H, 알킬, 아릴 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택되고, R5 및 R6는 수소 및 메틸로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  10. 제 9항에 있어서, R3 및 R4의 각각은 수소, 메틸, 에틸, 아릴 및 프로필로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  11. 제 10항에 있어서, R4는 H, 그리고 R3는 수소, 메틸, 에틸, 및 프로필로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  12. 제 1 항에 있어서, L 및 Ra는 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 5- 또는 6-원 고리에 붙어 있고, L 및 Ra는 함께 또 다른 5- 내지 7-원 고리를 형성하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  13. 제 12항에 있어서, 콘쥬게이트는 5- 또는 6-원 고리에 붙은 친수성 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  14. 제 12항에 있어서, 콘쥬게이트는 상기 또 다른 5- 내지 7-원 고리에 붙은 친수성 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  15. 아민- 또는 히드록실-함유 분자 R2XH를 혈류에 투여하기 위한 방법으로서, 아래 구조식을 갖는 콘쥬게이트를 혈류에 투여하는 단계를 포함하며, 이로써 상기 분 자 R2XH는 상기 콘쥬게이트의 생체 내 가티올분해 반응을 통하여 상기 콘쥬게이트로부터 방출되는 것을 특징으로 하는 방법.
    Figure 112006083378863-PCT00013
    상기 식에서
    R1X는 아민- 또는 히드록실-함유 리간드로, 여기서 X는 산소, 1차 질소 또는 2차 질소이고;
    M은 cis-CRb=CRc-, CRbRd-, 및 -CRbRd- CRcCRe-로부터 선택되고, 여기서 Rb, Rc, Rd, 및 Re의 각각은 H, 메틸, 치환된 메틸, 플루오로, 및 클로로로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 메틸은 히드록실, 플루오로, 또는 클로로로 치환될 수 있으며;
    D-모양 구조는 5- 또는 6-원 고리를 나타내고, 여기에 M 및 이황화기 S-S가 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 붙어 있으며;
    Ra는 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로, 할로겐, 및 또 다른 접합 고리로부터 선택되는 하나 이상의 고리 상의 치환체를 나타내는데, 여기서 R은 C1-C6 히드로카빌이고 이것은 더 나아가 할로겐으 로 치환될 수 있으며; 그리고
    L은 선형 또는 가지형 C1-C6 알킬기이고, 이것은 더 나아가 아릴 또는 아랄킬로 치환될 수 있는데;
    여기서 L 및 Ra는 함께 고리를 형성할 수 있고;
    그리고 여기서 콘쥬게이트는 L에, Ra에, 또는 5- 또는 6-원 고리에 붙은 지질 또는 친수성 폴리머를 더 포함한다.
  16. 제 15항에 있어서, L 및 Ra 는 고리를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 친수성 폴리머는 L 또는 Ra에 붙는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 5- 또는 6-원 고리는 벤젠 고리이고, M은 cis-CRb=CRc-이며, 콘쥬게이트는 하기 구조식 Ia를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
    Figure 112006083378863-PCT00014
  19. 제 18항에 있어서, 친수성 폴리머가 L에는 붙으나 Ra에는 붙지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, Ra는 수소인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 18항에 있어서, L은 -CR3R4-CR5R6- 구조를 가지어 -CR3R4는 이황화기에 붙으며, 여기서 R3 및 R4는 H, 알킬, 아릴, 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택되고, R5 및 R6는 H 및 메틸로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 21항에 있어서, R3 및 R4의 각각은 수소, 메틸, 에틸, 및 프로필로부터 독 립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 15항에 있어서, L 및 Ra가 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 5- 또는 6-원 고리에 붙으며, L 및 Ra는 함께 또 다른 5- 내지 7-원 고리를 형성하는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 친수성 폴리머가 5- 또는 6-원 고리에 붙는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 23항에 있어서, 친수성 폴리머가 상기 또 다른 5- 내지 7-원 고리에 붙는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 15항에 있어서, 상기 절단 반응에 의하여 방출되는 형광 부분의 검출을 통하여 상기 분자의 방출을 모니터하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 친수성 폴리머 사슬의 표면 코팅을 가지며, 하기 구조식 I을 갖는 지질-폴리머 콘쥬게이트를 포함하는 것을 특징으로 하는 리포솜.
    Figure 112006083378863-PCT00015
    여기서
    R1X는 아민- 또는 히드록실-함유 지질이며, X는 산소, 1차 질소 또는 2차 질소이고;
    M은 cis-CRb=CRc-, -CRbRd-, 및 -CRbRd-CRcRe-로부터 선택되며, 여기서 Rb, Rc, Rd, 및 Re의 각각은 H, 메틸, 치환된 메틸, 플루오로, 및 클로로로부터 독립적으로 선택되고, 여기서 메틸은 히드록실, 플루오로, 또는 클로로로 치환될 수 있고;
    D 모양 구조는 5- 또는 6- 원 고리를 나타내고, 여기에 M 및 이황화기 S-S가 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 붙어 있으며;
    Ra는 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로, 할로겐, 및 또 다른 접합 고리로부터 선택되는 하나 이상의 고리상의 치환체를 나타내고, 여기서 R은 C1-C6 히드로카빌이고, 이것은 할로겐으로 더 치환될 수 있으며; 그리고
    L은 선형 또는 가지형 C1-C6 알킬기이고, 이것은 아릴 또는 아릴킬로 더 치환될 수 있는데;
    여기서 L 및 Ra는 함께 고리를 형성할 수 있고;
    그리고 여기서 콘쥬게이트는 L에, Ra에, 또는 5- 또는 6-원 고리에 붙은 친수성 폴리머를 포함한다.
  28. 제 27항에 있어서, L 및 Ra는 고리를 형성하지 않으며, 친수성 폴리머가 L에 붙는 것을 특징으로 하는 리포솜.
  29. 제 27항에 있어서, 5- 또는 6-원 고리는 벤젠 고리이고, M은 cis-CRb=CRc-이며, 콘쥬게이트는 하기 구조식 Ia를 갖는 것을 특징으로 하는 리포솜.
    Figure 112006083378863-PCT00016
  30. 제 29항에 있어서, Ra는 수소인 것을 특징으로 하는 리포솜.
  31. 제 29항에 있어서, L은 구조-CR3R4-CR5R6-를 갖고 -CR3R4는 이황화기에 붙으며, 여기서 R3 및 R4는 H, 알킬, 아릴, 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택되고, R5 및 R6는 H 및 메틸로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 리포솜.
  32. 제 31항에 있어서, R3 및 R4의 각각은 수소, 메틸, 에틸, 및 프로필로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 리포솜.
  33. 제 26항에 있어서, L 및 Ra가 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 5- 또는 6-원 고리에 붙으며, L 및 Ra는 함께 또 다른 5- 내지 7- 원 고리를 형성하는 것을 특징으로 하는 리포솜.
  34. 제 33항에 있어서, 친수성 폴리머는 5- 또는 6-원 고리에 붙거나 또는 상기 또 다른 5- 내지 7-원 고리에 붙는 것을 특징으로 하는 리포솜.
  35. 제 27항에 있어서, 포획된 치료제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 리포 솜.
  36. 아민- 또는 히드록실-함유 분자가 하기 구조식 II를 갖는 화합물과 반응함으로써 얻어지는 콘쥬게이트.
    Figure 112006083378863-PCT00017
    여기서
    Z는 히드록실 또는 아미노 기에 의하여 교체될 수 있는 이탈기이고;
    M은 cis-CRb=CRc-, -CRbRd-, 및 -CRbRd-CRcRe-로부터 선택되며, 여기서 Rb, Rc, Rd, 및 Re의 각각은 H, 메틸, 치환된 메틸, 플루오로, 및 클로로로부터 독립적으로 선택되며, 여기서 메틸은 히드록실, 플루오로, 또는 클로로로 치환될 수 있고;
    D 모양 구조는 5- 또는 6-원 고리를 나타내고, 여기에 M 및 이황화기 S-S가 cis-1,2- 또는 오르쏘 배향으로 붙으며;
    Ra는 수소, 또는 R, OR, C(O)OH, C(O)OR, OC(O)OR, C(O)NR2, OC(O)NR2, 시아노, 니트로, 할로겐, 및 또 다른 접합 고리로부터 선택되는 하나 이상의 고리상의 치환체를 나타내며, 여기서 R은 C1-C6 히드로카빌이고, 이것은 할로겐으로 더 치환될 수 있으며; 그리고
    L은 선형 또는 가지형 C1-C6 알킬 기이고, 이것은 아릴 또는 아랄킬로 더 치환될 수 있는데;
    여기서 L 및 Ra는 함께 고리를 형성할 수 있고;
    그리고 여기서 화합물은 L에, Ra에, 또는 5- 또는 6-원 고리에 붙는 지질 또는 친수성 폴리머를 포함한다.
  37. 제 36항에 있어서, L 및 Ra는 고리를 형성하지 않는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  38. 제 37항에 있어서, 콘쥬게이트는 L에 붙은 친수성 폴리머를 포함하는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
  39. 제 38항에 있어서, 5- 또는 6-원 고리는 벤젠 고리이고, M은 cis-CRb=CRc-이므로, 화합물이 하기 구조식 IIa를 갖는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
    Figure 112006083378863-PCT00018
  40. 제 39항에 있어서, L은 구조-CR3R4-CR5R6-를 갖고, -CR3R4는 이황화기에 붙으며, 여기서 R3 및 R4는 H, 알킬, 아릴, 및 아랄킬로부터 독립적으로 선택되고, R5 및 R6는 H 및 메틸로부터 독립적으로 선택되는 것을 특징으로 하는 콘쥬게이트.
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