KR20070002208A - 재배마의 초저온 동결보존 및 재생을 통한 마 모자이크 바이러스（ｙｍｖ-ｋ）가 없는 마 식물체의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 재배마 및 야생마의 초저온 동결보존 및 재생을 통한 YMV-K 바이러스가 없는 마 식물체의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재배마 및 야생마의 신초 또는 접합자 배를 이용하여 효율적으로 동결보존 및 재생하고, 이를 이용하여 YMV-K 바이러스가 없는 마 식물체를 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따른 초저온 동결보존·재생 방법을 통하여 재배마 및 야생마를 유전적인 변이 없이 효율적으로 장기 저장할 수 있고, 초저온동결 처리 과정 후 재생된 식물체는 YMV-K 바이러스가 제거된다. 또한 본 발명에 따르면 이를 유전자원으로 효율적으로 보급할 수 있는 효과가 있다.

초저온 동결보존, 바이러스 제거, 마, 둥근마, 야생마, 단마

Description

재배마 및 야생마의 초저온 동결보존 및 재생을 통한 ＹＭＶ-Ｋ 바이러스가 없는 마 식물체의 생산방법{Method for Producing YMV-K Free Yam Plants Using the Cryopreserving·Regenerating of Cultivated Yam and Wild Yam}

도 1은 네 개의 다른 동결보존법에 의하여 -196℃에서 동결 보존된 둥근마(D. batatas cv. 'Db037') 의 생존율을 도시한 것이다.

도 2는 캡슐화 탈수법에 의해 D. batatas의 신초를 동결보존하는 절차를 도시한 것이다.

도 3은 D. batatas를 동결보존하는 과정에 있는 신초의 사진을 나타낸 것이다. A는 in vitro에서 자란 소식물체와 재료로 사용한 신초를 나타낸 것이고, B는 신초를 Na-알지네이트 용액에서 캡슐화한 양태를 나타낸 것이며, C는 동결보존된 캡슐로부터 재생된 신초를 나타낸 것이다.

도 4는 동결보존된 (+LN) D. batatas 신초의 생존에 신초의 사이즈가 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 5는 동결보존된(+LN) 마 신초조직의 생존에 전배양 배지의 수크로스 및 소르비톨의 농도가 미치는 영향을 도시한 것이다.

도 6은 동결보존된(+LN) D. batatas. 신초조직의 생존에 캡슐의 자연건조 (bead desiccation) 시간이 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 7은 신초(shoot apices) 조직으로부터 직접식물체를 형성하는데 효과적인 식물생장조절제 선발을 위한 실험결과를 그래프로 도시한 것이다.

도 8은 캡슐화 보존법으로 -196℃에서 동결보존된 세 가지 마, 재배마로서 둥근마 및 단마와 야생마의 생존율(%)을 나타낸 것이다.

도 9는 세 가지 다른 방법(단순건조, 전배양 및 캡슐화 탈수법)에 의해 -196℃에서 동결보존된 야생마 접합배(D. batatas)의 생존율 (%)을 도시한 것이다.

도 10은 단순건조에 의한 Dioscorea 종 야생마의 접합 배 동결보존방법의 절차를 도시한 것이다.

도 11의 A는 야생마 종자(왼쪽: D. nipponica, 오른쪽: D. batatas)에서의 접합자 배의 사진이고, B는 해동 후 동결보존된 배로부터 발아된 야생마를 나타낸 것이다.

도 12는 D. batatas(야생형)의 개화 후 35일된 접합배와 50일된 접합배를 -196℃에서 전배양법에 의해 동결보존하였을 때의 생존율(%)을 나타낸 것이다.

도 13은 각각 35일과 50일 지난 종자 배를 사용하여 아무 처리 없이 동결보존 하였을 때와 30분 정도의 건조처리를 한 후 동결보존 하였을 때 생존율의 차이를 나타낸 것이다.

도 14는 단순건조 처리 후 동결보존하였을 때, D. batatas에 속하는 야생마 및 D. nipponica(부채마)에 속하는 야생마의 생존율(%)을 나타낸 것이다.

도 15는 둥근마(D.batatas cv. 'Db037')의 대조군 (-LN) 및 동결보존된 (+LN) 마로부터 배양된 식물체의 바이러스(YMV-K) 검출사진이다.

도 16은 동결보존된 신초 조각으로부터 유래된 마의 조직에서 바이러스 (YMV-K)를 검출한 사진이다.

도 17은 D. batatas.의 조직 배양에 의한 in vitro 증식 및 소괴경 형성절차를 도시한 것이다.

도 18은 in vitro 식물체로부터 소괴경이 형성된 모습을 나타낸 사진이다.

도 19는 마 조직배양묘로부터 소괴경 형성에 효과적인 식물생장조절제를 선발하기 위한 실험결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 20은 저온처리(4℃) 기간이 기내 소괴경 맹아에 미치는 영향을 그래프로 나타낸 것이다.

도 21은 소괴경 맹아에 효과적인 온도 조건을 선발하기 위한 실험결과를 그래프로 나타낸 것이다.

도 22는 4℃에서 3개월간 저온 처리된 소괴경을 이식하여 26~30℃에 두었을 때의 재배마 종류별 소괴경 맹아율을 비교하여 그래프로 나타낸 것이다.

발명의 분야

본 발명은 재배마 및 야생마의 초저온 동결보존 및 재생을 통한 YMV-K 바이 러스가 없는 마 식물체의 생산방법에 관한 것으로, 보다 상세하게는 재배마 및 야생마의 신초 또는 접합자 배를 이용하여 효율적으로 동결보존 및 재생하고, 이를 이용하여 YMV-K 바이러스가 없는 마 식물체를 효율적으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

발명의 배경

마는 한약재로 이용될 뿐만 아니라 말리지 않는 괴경을 생식하는 건강식품으로서 최근 인기가 높아지고 있는 작목으로 단위 면적당 소득이 높은 작물에 속한다. 다년생의 덩굴성 초본식물인 마의 경우는 자웅이주 식물이며 타식으로 종자를 형성하고 지하부에서 발달된 괴경과 지상부 덩굴의 액아부위에 착생하는 주아(영여자)를 번식체로 이용한다. 이러한 번식 특성상 바이러스와 같은 병원이 후대에 이어진다는 단점을 가지고 있다. 이런 이유로 마의 무병종묘의 생산과 보급은 농가의 소득 증대에 기여할 것이다.

마 모자이크 바이러스(Yam mosaic virus-K)는 둥근마(Dioscorea batatas), 참마(Dioscorea japonica)에 모자이크 병을 일으키는 바이러스인데, 포티 바이러스(potyvirus)로서 포티비리데 패밀리의 한 종으로, 현재까지 가장 많은 종을 포함하고 있으며, 외, 쌍떡잎 두 식물을 포함하는 기주범위를 가진다. 이들은 짧은 잠복기내에서 주로 진딧물에 의해 전염되며 작물에 심각한 경제적 손실을 일으킨다.

마 유전자원의 효율적인 보존 또한 높은 노동력을 요한다. 영양 번식성 작물인 마는 생체 수집종으로서 유전자원포장 상태에서 유전자원이 유지된다. 하지만 유전자원의 포장보존은 생물적 혹은 무기적 스트레스로 인해 소실된 위험을 지니고 있으며, 유전자원은 충과 병 혹은 한발, 과습, 인간의 실수 등의 자연적 장해에 노출되어있는 실정이다.

조직 배양(tissue culture)을 통한 in vitro 보존은 이러한 포장보존의 단점을 일부 보완할 수 있기는 하지만 이러한 방법 또한 오염, 유전적 변이 등으로부터 유지하는데 드는 비용의 면 등에서 몇 가지 단점을 지니고 있다.

초저온 동결보존(Cryopreservation)은 유전자원을 장기간 보존하는 가장 안정하고 비용과 공간이 적게 요구되는 방법으로 여겨지며 특히 영양번식작물의 유전자원 보존에 효과적인 방법이다(Gonzalez Arnao MT et al., Cryo-lett 14: 303-8, 1993; Pence VC et al, In: Bajaj YPS (ed.), Biotechnology in Agriculture and Forestry, 29~50, 1995; Schafer-Menuhr A et al., Final Report for the Period Sept 1991~1993, Aug 1996; Malaurie B et al., Cryo-Lett. 19: 15~26, 1998) 일부 영양번식성 작물의 경우 초저온 동결보존 방법을 통해 성공적으로 유전자원이 보존되고 있고 마이크로프로파게이션 시스템(microproagation system)을 통하여 증식되고 있으며, 이러한 기술들은 유전자원의 보존뿐만 아니라, 유용자원의 증식 또는 선발의 효율을 증진 시키는 등 육종기술에도 유용하게 이용되고 있다.

동결보존된 자원의 증식과 표장 순화의 방법으로 마디 배양을 통한 기내증식과 기내 소괴경 형성법을 사용하였는데, 기내에서 유도된 소괴경은 증식의 재료로서의 중요성과 함께 유전자원의 보존 및 공급의 수단으로서의 가치를 가질 뿐만 아니라(Alizadeh S et al., Tissue and Organ Culture 53: 2., 107~12, 1998) 기대 배양을 통해 얻어진 식물체의 포장 순화효율을 높일 수 있는 방법으로 사용되기도 한다(John JL et al., Tissue and Organ Culture, 34: 245~52, 1993; Mantell SH et al., IFS, Vietnam, Proceedings of the Southeast Asian Regional Workshop on Propagation Techniques for Commercial Crops of the Tropics, 66~93, 1993; Ng SYC et al., ODA Project R4886 (H) Final Report. Wye College University of London, UK, 12p, 1997). 그러나 이들 소괴경 또한 포장에서 출아시키기에 앞서 휴면을 타파하고 적당한 출아조건을 제공해 주어야 할 필요성을 여전히 가지고 있다.

이에 본 발명자들은 재배마와 야생마를 효율적으로 보존하기 위한 동결보존 조건 및 동결보존된 마 종으로부터 YMV-K가 없는 마 식물체를 생산하기 위한 출아조건을 밝혀내고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

결국 본 발명의 주된 목적은 마 유전자원의 효율적인 초저온 동결보존·재생 방법을 제공하는데 있다

본 발명의 다른 목적은 상기 마의 초저온 동결보존·재생 방법을 이용한 YMV-K 바이러스가 없는 마 식물체의 생산방법을 제공하는데 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 (a) 재배마의 신초(shoot)를 절취하여 당을 함유하는 배지에서 전배양(pre-culture) 하는 단계; (b) 상기 전 배양된 신초를 Na-알지네이트 용액으로 캡슐화시키는 단계; (c) 상기 신초 캡슐을 무균에서 자연 건조 후, 액체질소에 보존하는 단계; (d) 상기 액체질소에 보존된 신초 캡슐을 해동하는 단계; 및 (e) 상기 해동된 캡슐을 식물성장조절제로서 BAP 또는 BAP·키네틴(kinetin)의 혼합물을 함유하는 배지에서 배양하여 재생하는 단계를 포함하는 재배마 종의 초저온 동결보존·재생 방법을 제공한다.

상기 보존·재생 방법에서, 상기 (a) 단계의 당은 약 0.3M의 수크로스 또는 소르비톨(sorbitol)을 사용하는 것이 바람직하고, 상기 (c) 단계는 상기 신초 캡슐을 글리세롤 및 당을 함유하는 액체 배지에서 부유시킨 후 액체질소에 보존하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명은 또한, (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 방법에 의해 초저온 동결보존·재생된 재배마 종묘를 마디 배양(nodal piece culturing)하는 단계; (b) 상기 마디 배양된 재배마 종묘를 GA₃를 함유하는 배지에서 기내 소괴경(in vitro microtuber)를 유도하는 단계; (c) 상기 기내 소괴경을 약 4℃에서 2개월 이상 저장하는 단계; 및 (d) 상기 저장된 소괴경을 맹아(sprouting)시키는 단계를 포함하는 YMV-K 바이러스가 없는 재배마 소괴경의 제조방법을 제공한다.

상기 재배마 소괴경의 제조방법에 있어서, 상기 기내 소괴경 저장은 약 3개월 동안 하는 것이 바람직하다.

이와 더불어 본 발명에서는 (a) 미성숙 또는 성숙 야생마 종자로부터 접합자 배를 절취하는 단계; (b) 상기 절취된 접합자 배를 자연 건조하는 단계; (c) 상기 건조된 접합자 배를 액체질소에서 보존하는 단계; (d) 상기 보존된 접합자 배를 해동하는 단계; 및 (e) 상기 해동된 접합자 배를 GA₃를 함유하는 배지에 배양하여 재생하는 단계를 포함하는 야생마 종의 초저온 동결보존·재생 방법을 제공한다.

상기 야생마 보존·재생방법에 있어서, 접합자 배는 개화 후 약 35일 이상 지난 종자에서 절취하는 것이 바람직하고, 상기 (b) 단계의 건조처리는 약 30분 행하는 것이 바람직하며, 상기 야생마는 D. batats 또는 D. nipponica에 속하는 것을 특징으로 할 수 있다.

최근 마(Dioscorea spp.)에서 신초(shoot-apices)를 이용한 초저온 동결보존에 관한 관심이 높아지고 있는데, 신초의 성공적인 동결보존을 위해 Mandal 등(Mandal BB et al., Cryo-Lett. 17: 165~74, 1996)이 열대지역에서 재배되고 있는 마를 재료로 캡슐화-탈수법을 이용하여 보존한 보고가 있었다.

그러나 마를 재료로 한 상기 Mandal 등의 연구에서 보존의 재료로 사용된 Dioscorea 속의 식물은 열대지방에서 주요 식량작물에 속하는 D. alata, D.wallichii, D. bulbifera이며 이들은 우리나라에서 재배 혹은 자생되는 자원인 D. batatas나 다른 야생마들과는 생육특성 면에서 차이가 있다. 열대마를 재료로 선행된 동결보존법에서도 종간의 반응 차이는 있었지만 캡슐화-탈수법을 이용한 동결보존을 효과적인 방법으로 선발하였다. 그러나 본 발명과는 이들이 재료로 사용한 신초조직의 크기는 2~5m 정도로 큰 조직을 이용하여 3일정도 전배양 재료를 Na 알지네이트로 캡슐화 하여 6~24시간정도의 비교적 긴 시간의 건조시간을 최적의 조건으로 제시하였다는 점이 상이하다. 유전자원 간에는 19~60% 정도의 동결보존성공율을 나타내었다. 본 발명은 우리나라에서 자생하는 마종의 초저온 동결보존을 위한 최적 조건을 실험을 통하여 구명하고 제공하였다는데 의의가 있다.

본 발명에서는 재배마와 야생마를 유전자원으로서 안정적인 장기보존할 수 있는 동결보존 조건을 밝혀내고 이를 이용하여 YMV-K 바이러스가 없는 마 식물체를 유도할 수 있었다. 또한, 본 발명에서는 유전자원으로서 마 식물체를 안정적으로 대량 증식할 수 있는 기내 소괴경 형성조건을 제공한다.

마속 식물은 곰팡이, 바이러스 선충과 같은 몇 가지 심각한 병에 의해 피해를 받는데 조직배양 과정을 거치면 바이러스를 제외한 대부분의 병을 배제할 수 있다. 마와 같은 영양번식성 작물에서 주로 문제가 되는 바이러스의 경우는 생장점 배양을 통해 바이러스에 감염되지 않은 무병묘를 생산하기도 하는데, 이 과정은 현미경 하에서 이루어지는 매우 섬세한 작업으로 숙달된 연구자의 솜씨를 필요로 하며, 생장점이라는 아주 작은 조직을 사용 하여야 하므로 식물채분화 효율도 낮을 뿐만 아니라, 바이러스 무병묘의 획득율 또한 30% (by ELISA indexation) 이하로 낮은 실정이다. 한국에서 재배되는 마에서 주로 문제되는 마 모자이크 바이러스 종류는 ChYNMV(Chinese yam necrotic mosaic virus)와 YMV-K(Japanese yam mosaic virus)이다.

유전적으로 안정적인 마 종묘의 보존을 위해서 조직배양을 통한 기내보존이 나 초저온 동결보존의 재료로 생장점 배양을 통하여 얻어진 묘를 바이러스 검정하여 바이러스가 없는 종묘를 선발하여 보존하는 것이 일반적이나, 본 발명에 따른 방법으로 초저온 동결보존을 하면 바이러스에 감염된 재배마 또는 야생마의 묘로부터 YMV-K 바이러스가 제거된 마 종묘를 생산할 수 있었다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다 할 것이다.

실시예 1: 재배마 및 야생마의 초저온 동결보존

A. 재배마의 초저온 동결보존

(1) 재배마의 초저온 동결보존법 선발

재배마를 유전자원으로서 안정적으로 보존할 수 있는 방법을 확인하기 위하여, D. batatas 재배마 신초 조직을 재료로 하여 단순 건조처리(Desiccation), 삼투압 조절물질이 첨가된 배지에 전배양하는 방법(Preculture-dehydration), 동결보존액을 처리하는 방법(Vitrification), 및 캡슐화-탈수법(Encapsulation -dehydration)으로 각각 보존하였다.

가. 단순건조법(Desiccation techniques)

단순건조법으로 재생마를 동결보존하기 위하여, in vitro에서 자란 소식물체(plantlet)에서 잘라낸 신초(Shoot-apices)를 40분 동안 라비나 플로우 캐비넷의 공기 흐름에 두고 건조시킨 후, 액체질소에 넣었다.

나. 전배양 탈수법(Preculture-dehydration techniques)

신초를 하루 동안 0.3M의 수크로스를 함유하는 MS 배지에서 전배양한 후, 액체질소에 넣었다.

다. 비트리피케이션법(Vitrification techniques)

전배양된 신초를 30분 동안 PVS2에서 처리한 후, 액체 질소에 넣었다.

라. 캡슐화 탈수법(Encapsulation-dehydration techniques)

신초를 0.3M의 수크로스와 함께 고형 MS 배지에서 하루 동안 전배양하였다. 캡슐화된 신초를 상온의 라미나 플로우 캐비넷에서 네 시간동안 자연건조하여 탈수시킨 후, 액체질소에 넣었다.

상기 네 가지 방법에 의해 동결 한 후 재생하였을 때, 단순건조, 전배양 및 동결보존액 처리법에서 재배마의 생존율이 없거나 매우 낮았으나, 캡슐화-탈수법(Encapsulation -dehydration)의 경우는 20%의 생존율을 보이는 것을 확인할 수 있 었다. 도 1에는 상기 네 가지 동결보존법에서의 재배마 생존율이 도시되어 있다. 상기 결과에 따라, 본 발명에서는 캡슐화-탈수법을 재배마의 적정한 동결보존 법으로 선발 하였다.

(2) 캡슐화 탈수법(encapsulation-dehydration)을 이용한 재배마 기내 신초(shoot)의 초저온 동결보존·재생 과정

D. batatas 재배마의 신초 조직은 캡슐화 탈수법을 이용하여 성공적으로 초저온 동결보존 할 수 있었다. 도 2에는 재배마를 캡슐화 탈수법으로 초저온 동결보존하는 과정이 도시되어 있다.

동결보존 효율을 높이기 위하여, 동결보존 재료의 삼투저항성을 증대시키고, 동결 후 재생율을 높이기 위한 조치가 필요하다.

우선, in vitro에서 자란 소식물체(plantlets)로부터 신초조직을 1mm 이하의 크기로 잘라냈다. 신초조직의 크기는 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 1mm 이하로 잘라내고 캡슐화 하였을 때, 액체질소로 보존 후 배양 시 1~2mm 크기로 자른 것에 비해 생존율이 높아 이를 캡슐화하는 신초의 크기 범위로 선택하였다.

1mm 이하로 잘라낸 신초를 0.3M의 수크로스나 소르비톨(sorbitol)이 첨가된 MS 배지에 16~24 시간 전배양 하였다. 도 5에는 첨가해주는 수크로스와 소르비톨의 농도에 따른 마 신초의 생존율을 나타내었다. 도 5에서 확인되는 바와 같이 0.3M의 수크로스와 소르비톨을 사용한 경우가 0.6M을 사용한 경우에 비해 생존율이 좋아 0.3M을 전배양시의 수크로스와 소르비톨 농도로 채택하였다.

전배양 후, 신초를 3% Na-알지네이트(Na-alginate) 용액으로 캡슐화 하였다. 캡슐화된 신초를 2M 글리세롤 및 0.5M 수크로스를 함유하는 MS 액체 배지에서 1시간동안 부유시킨후, 무균에서 3.5~4시간 동안 자연건조하였다. 도 6에는 캡슐화된 비드의 자연건조 시간에 따른 D. batatas의 생존율을 나타내었다. 도 6에서 확인되는 바와 같이, 3.5 내지 4 시간동안 건조하였을 때 생존율이 가장 좋아 비드의 자연건조 시간으로 채택하였다.

자연건조된 상기 비드를 2ml의 세포동결용기(cryovial)을 이용하여 액체질소에 넣고 동결 보존하였다.

상기 동결 보존된 신초 캡슐은 40℃의 워터 배스에서 3~5 분간 해동하고 0.2mg/L의 BAP를 단독으로 함유하거나, 0.2mg/L의 BAP와 0.2mg/L의 키네틴(kinetin)을 함유하는 MS 배지에서 배양하였다. 이와 같은 방법으로 배양하면 동결보존된 신초로부터 식물체가 재생된다.

가장 적합한 식물성장조절제를 선발하기 위하여 식물성장조절제로 사용되는 BAP, 키네틴(kinetin), 2,4-D 및 NAA를 이용하여 재생결과를 확인하였다. 하기의 표 1과 도 7은 D.batatas에 속하는 재배마의 신초조직으로부터 식물체 재생에 효과적인 식물생장조절제 조성을 검토한 결과이며, 그 결과로부터 0.2mg/L의 BAP 단독 처리한 조직과 0.2mg/L의 BAP와 0.2mg/L의 키네틴(kinetin)을 동시에 처리한 조직으로부터 식물체 재생율을 높일 수 있다는 것을 알 수 있었다. 기내 배양에서 식물체는 조직으로부터 직접적으로 분화하거나 부정아를 형성한 후 식물체로 자라는 현상을 보이므로, 캘러스를 거치지 않고 부정아나 신초를 형성하는 것이 중요하다.

D.batatas에 속하는 세 가지 재배마의 신초조직으로부터 부정아 효과적인 식물생장조절제 조성

식물 성장 조절제(mg/L)	Ma1(단마)	Db004(장마)	Db037(둥근마)
대조군	-	-	90
B 0.2	98	94	100
K 0.2	22	20	100
B 0.2 + K 0.2	96	88	90
D 0.2 + B 0.2	84	85	87
D 0.5 + B 0.5	73	68	56
N 0.01 + K 0.2	77	78	98
N 0.05 + K 0.5	50	55	70
N 0.05 + B 0.5	24	24	60
N 0.05 + B 1.0	15	20	77

*B, K, D 및 N은 각각 BAP, 키네틴(kinetin), 2,4-D 및 NAA 임.

(3) 캡슐화 탈수법의 마 유전자원별 적용 결과

마의 유전자원 종류에 따라 초저온 동결보존의 조건이 달라지는데, 상기 신초조직을 재료로 캡슐화 탈수법을 이용한 동결보존법은 D. batatas에 속하는 재배마의 보존에 특히 적합한 것이었으며, 야생마의 경우 보존의 재료나 동결보존 조건이 동일하지 않았다. 도 8에는 재배종으로서 둥근마, 단마와 야생마의 기내 액아조직을 재료로 캡슐화 탈수법(encapsulation-dehydration)을 사용하여 상기 조건들을 적용하여 보존하였을 때, 보존 후 생존율을 나타내었다. 재배마인 둥근마의 경우 40%, 단마의 경우는 29%의 보존율을 나타내었으나, 야생마의 경우 초저온 동결 후 생존된 개체가 확인되지 않았다.

B. 야생마의 초저온 동결보존

(1) 야생마의 초저온 동결보존법 선발

액아(axillary buds) 조직을 재료로 동결보존이 어려웠던 야생마는 자연상태에서 형성되는 종자의 배를 절취하여 동결보존 재료로 사용할 경우, 높은 보존율을 보인다(다만, 재배마는 자연상태에서 종자를 잘 형성하지 않으므로 적용이 불가능하다).

야생마 종자의 접합자 배를 초저온 동결 보존할 경우 단순 건조처리(Desiccation), 배지에 일정기간 전배양하는 처리(preculture) 및 캡슐화 탈수법으로 각각 처리하였다.

가. 단순건조법(Desiccation techniques)

종자(seed)로부터 잘라낸 배(Embryo)를 30분 동안 라미나 플로우 캐비넷의 공기흐름 상에서 건조하였다.

나. 전배양법(Preculture techniques)

0.3 mg/L의 GA₃를 함유하는 MS 배지에서 접합배를 하루 동안 전배양시켰다.

다. 캡슐화 탈수법(Encapsulation-dehydration techniques)

캡슐화된 배(embryos)를 라미나 플로우 캐비넷에서 상온으로 4시간동안 자연 건조함으로써 탈수시켰다.

상기 세 가지 보존 처리법에서 야생마는 60% 이상의 높은 보존율을 나타내었다. 도 9에는 상기 세 가지 동결보존법에 따른 야생마의 생존율이 도시되어 있다. 특히 처리가 가장 간단하고 시간이 적게 소요되는 단순건조처리(Desiccation techniques)에서 96.6 %의 높은 보존율을 나타내므로 이를 야생마 유전자원의 동결보존에 적합한 방법으로 선발하였다.

(2) 단순건조를 이용한 야생마의 초저온 동결보존·재생 과정

Dioscorea 종 야생마는 접합자 배를 재료로 단순건조법을 이용하여 성공적으로 동결보존할 수 있었다. 도 10에는 단순건조에 의한 Dioscorea 종 야생마의 접합 배 동결보존방법의 절차를 도시되어 있다.

도 11의 A는 야생마 종자(왼쪽: D. nipponica, 오른쪽: D. batatas)에서의 접합자 배의 사진이고, B는 상기 절차에 따라 동결보존된 배로부터 해동 후 발아된 야생마를 나타낸 것이다.

야생마의 접합자 배를 재료로 초저온 동결 보존하기 위하여, 개화 후 35일 이상된 종자에서 접합자 배(zygotic embryo)를 절취하였다. 상기 접합자 배를 무균 라미나 공기 플로우 캐비넷에서 30 분간 자연 건조 후, 2ml 세포동결용기를 사용하여 액체질소에 보관하고, 40℃에서 3~5분간 해동한 후, GA₃를 0.3 mg/L 함유하는 MS 배지에서 배양하면 90% 이상의 보존율을 확인할 수 있었다(도 14).

도 12는 D. batatas에 속하는 야생마의 성숙 정도에 따른 동결보존·재생시의 생존율을 나타낸 것이다. 도 12를 통하여 확인되는 바와 같이, 동결보존에 사용하는 종자배의 성숙정도는 35일보다 50일 정도의 배가 보존에 효과적이었다. 그러나 도 13과 같이, 35일 정도의 미숙배의 경우도 30분간 건조 처리(desiccation)를 거치면 보존율을 80% 이상으로 높일 수 있다.

도 13은 각각 35일과 50일 지난 종자 배를 사용하여 아무 처리 없이 동결보존 하였을 때와 30분 정도의 건조처리를 한 후 동결보존 하였을 때 생존율의 차이를 나타낸 것이다. 따라서 동결 건조 처리를 통한 동결보존 법에서는 미숙배를 재료로 하여도 무방하다.

도 14는 상기 단순건조 처리 후의 동결건조법이 D. batatas에 속하는 야생마 및 D. nipponica(부채마)에 속하는 야생마의 보존에 모두에 효과적인 방법이라는 사실을 보여준다(90% 이상의 생존율).

실시예 2: 초저온 동결처리를 이용한 YMV-K 바이러스가 없는 식물체 생산

야생마는 접합자 배를 보존 재료로 사용하기 때문에 접합자 배에서 발생한 식물체는 동결보존 유무에 관련 없이 모두 바이러스가 없는 식물체를 얻을 수 있지만, 재배마는 바이러스에 감염된 것이라도 초저온 동결보존처리하면 YMV-K 바이러스가 없는 묘를 생산할 수 있다. 특히, 동결 보존 전에 바이러스를 제거하기 위한 별도의 노력이 요구되지 않는다.

도 15는 D.batatas cv. 'Db037'의 대조군 (-LN) 및 동결보존된 (+LN) 마로부터 배양된 식물체의 바이러스(YMV-K) 검출사진이다. 대조군(1~3 레인) 및 동결보존된 마 (4~5 레인)는 단일의 소식물체(plantlet)로부터 유래된 것이다. 도 15에서 확인할 수 있는 바와 같이 액체질소(LN)로 동결보존한 마 식물체(4~5)에서는 바이러스가 검출되지 않음을 알 수 있다.

YMV-K 바이러스의 경우는 동결보존 전 바이러스에 감염된 묘로부터 액아를 채취하는 과정에서 40%정도가 바이러스가 제거되어 재료가 되는 액아 중 60%는 바이러스 이병된 재료를 동결보존 재료로 사용하게 된다. 따라서 조직 배양묘로부터 1mm이하의 액아를 절취하여 묘를 생산하는 것만으로도 생장점 배양을 통한 경우보다 바이러스가 없는 종자를 생산할 수 있으며, 이들 재료를 동결보존에 이용할 경우 생존된 개체의 90%가 무병주로 나타나는 것을 확인할 수 있었다(도 16).

실시예 3: 동결보존 후 재생된 식물체의 기내 증식 및 종서 보급 방법

초저온 동결보존 후 재생된 마 유전자원은 마디 배양을 통해 증식하고(키네틴 0.5 mg/L 처리), 포장(field)상태에서의 적응을 위해 GA₃ 1 mg/L 가 첨가된 배지에서 기내 소괴경(microtuber)을 생산하여, 4℃에서 3개월 정도 저장한 후 26~30℃에서 맹아시키는 방법으로 YMV-K 바이러스가 없는 마 종서를 효과적으로 보급할 수 있었다. 도 17에서는 D. batatas.의 조직 배양에 의한 생존율 증식 및 소괴경 형성절차를 도시하였다.

상기와 같은 대량증식을 위한 소괴경을 형성방법으로 그들이 가지는 휴면을 타파하여 기내 출아율을 높일 수 있으므로, YMV-K 바이러스가 없는 마 식물체를 안정적으로 대량 공급할 수 있다. 도 18에는 in vitro 식물체로부터 상기와 같은 방법으로 소괴경이 형성된 모습을 나타내었다.

도 19는 조직배양 식물체로부터 기내소괴경 형성에 효과적인 식물생장조절제를 선발하기 위한 실험결과를 보여주는 것으로, 이를 통하여 옥신(2,4-D, NAA)류나 사이토카이닌(BA)류의 식물생장조절제 보다 지베렐린(GA₃)을 첨가할 경우 특히 GA₃ 1mg/L 첨가한 배지에서 소괴경 형성율이 높은 것을 확인할 수 있었다.

도 20은 기내에서 형성된 소괴경을 4℃에 저장하여 저장 기간별로 포트에 이식하여 맹아정도를 조사한 결과를 나타낸 것인데, 저온처리가 2개월 이상이면, 파종 후 약 100일 경에 90%이상의 맹아율을 보이는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 기내소괴경의 맹아에는 최소한 2개월의 저온처리를 하는 것이 바람직하다.

그러나 2개월 저온처리에서는 90% 이상 맹아 되는데 소요되는 기간이 100일 정도 소요되는데 반해, 3개월 이상 처리에서 파종 후 50일 정도에 90% 맹아를 나타냈다. 5개월 처리의 경우, 파종 후 30일 경에 맹아율이 90% 정도에 도달하였으나 3개월 처리보다 저온처리 기간이 2개월 차이나는 것을 감안한다면, 3개월 정도의 저온처리 기간이 맹아율과의 관계로 보건대 가장 바람직하다.

도 21은 3개월간 저온처리된 소괴경의 맹아(sprouting)온도에 대한 실험결과를 보여주는 것이다. 실험결과, 맹아온도에 따른 맹아율에는 차이를 나타내지는 않았으나 4℃(밤)~37℃(낮)의 변온상태인 노지(field)상태 보다 26~30℃의 온도에서 맹아일수가 단축되었다.

상기의 온도조건은 재배마 종류에 상관없이 맹아에 효과적이라는 사실을 재배마 종류별 소괴경 맹아율을 비교한 도22를 통하여 확인할 수 있었다. 도 22에는 장마(Db004), 단마(Ma1) 및 둥근마(Db037) 세 종류의 재배마 기내소괴경의 맹아율과 80% 맹아에 필요한 일수를 나타내었는데, 4℃에서 3개월간 저온 처리된 소괴경을 포트에 이식하여 26~30℃에 두었을 때의 맹아율을 나타낸 것이다.

이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

본 발명에 따르면, 재배마 및 야생마를 캡슐화 탈수법 및 단순건조법을 근간으로 초저온동결보존하기에 적합한 조건 및 식물체를 재생하고 대량증식하는 조건이 제공되고, 이를 통하여 YMV-K 바이러스가 없는 종묘가 생산된다. 본 발명에서 제공하는 조건들을 통하여 마 종묘를 유전적인 변이 없이 장기 저장할 수 있고, 별도의 처리없이 YMV-K 바이러스가 제거되는 효과가 있다. 또한, 본 발명에서 밝힌 대량증식을 위한 소괴경 형성방법에 따르면 소괴경의 휴면현상을 타파하고 기내 출아율을 높일 수 있어, YMV-K 바이러스가 없는 마 식물체를 안정적으로 대량 공급할 수 있다.

Claims (9)

1. 다음의 단계를 포함하는 재배마 종의 초저온 동결보존·재생 방법:

   (a) 재배마의 신초(shoot)를 절취하여 당을 함유하는 배지에서 전배양(pre-culture) 하는 단계;

   (b) 상기 전배양된 신초를 Na-알지네이트 용액으로 캡슐화시키는 단계;

   (c) 상기 신초 캡슐을 무균에서 자연 건조 후, 액체질소에 보존하는 단계;

   (d) 상기 액체질소에 보존된 신초 캡슐을 해동하는 단계; 및

   (e) 상기 해동된 캡슐을 식물성장조절제로서 BAP 또는 BAP·키네틴(kinetin)의 혼합물을 함유하는 배지에서 배양하여 재생하는 단계.
2. 제1항에 있어서, 상기 (a) 단계의 당은 약 0.3M의 수크로스 또는 소르비톨(sorbitol)을 사용하는 것을 특징으로 하는 방법.
3. 제1항에 있어서, 상기 (c) 단계는 상기 신초 캡슐을 글리세롤 및 당을 함유하는 액체 배지에서 부유시킨 후 액체질소에 보존하는 것을 특징으로 하는 방법.
4. 다음의 단계를 포함하는 YMV-K 바이러스가 없는 재배마 소괴경의 제조방법:

   (a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 방법에 의해 초저온 동결보존·재생된 재배마 종묘를 마디 배양(nodal piece culturing)하는 단계;

   (b) 상기 마디 배양된 재배마 종묘를 GA₃를 함유하는 배지에서 기내 소괴경(in vitro microtuber)를 유도하는 단계;

   (c) 상기 기내 소괴경을 약 4℃에서 2개월 이상 저장하는 단계; 및

   (d) 상기 저장된 소괴경을 맹아(sprouting)시키는 단계.
5. 제4항에 있어서, 상기 기내 소괴경 저장은 약 3개월 동안 하는 것을 특징으로 하는 방법.
6. 다음의 단계를 포함하는 야생마 종의 초저온 동결보존·재생 방법:

   (a) 미성숙 또는 성숙 야생마 종자로부터 접합자 배를 절취하는 단계;

   (b) 상기 절취된 접합자 배를 자연 건조하는 단계;

   (c) 상기 건조된 접합자 배를 액체질소에서 보존하는 단계;

   (d) 상기 보존된 접합자 배를 해동하는 단계; 및

   (e) 상기 해동된 접합자 배를 GA₃를 함유하는 배지에 배양하여 재생하는 단 계.
7. 제6항에 있어서, 상기 접합자 배는 개화 후 약 35일 이상 지난 종자에서 절취하는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 제6항에 있어서, 상기 (b) 단계의 건조처리는 약 30분 행하는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 제6항에 있어서, 상기 야생마는 D. batats 또는 D. nipponica에 속하는 것을 특징으로 하는 방법.

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