KR20070000512A - 표적 ｄｎａ 또는 ｒｎａ 탐지용 올리고뉴클레오티드 - Google Patents

표적 ｄｎａ 또는 ｒｎａ 탐지용 올리고뉴클레오티드 Download PDF

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KR20070000512A
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Abstract

샘플에서 표적 DNA 또는 RNA의 존재를 탐지하는데 사용될 수 있는 올리고뉴클레오티드, 상기 올리고뉴클레오티드를 사용하여 표적 DNA 또는 RNA를 탐지하는 방법 및 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는 키트가 제공된다. 상기 올리고뉴클레오티드는 형광물질이 표지된 뉴클레오시드 및 상기 형광물질이 표지된 뉴클레오시드의 옆에 위치하는 적어도 하나의 이웃한 뉴클레오시드를 포함하며, 상기 이웃한 뉴클레오시드의 염기는 티민 또는 사이토신이다.

Description

표적 ＤＮＡ 또는 ＲＮＡ 탐지용 올리고뉴클레오티드{OLIGONUCLEOTIDE FOR DETECTING TARGET DNA OR RNA}
본 발명은 형광물질이 표지된 뉴클레오시드 및 상기 형광물질이 표지된 뉴클레오시드의 옆에 위치하는 적어도 하나의 특정 뉴클레오시드를 포함하는, 표적 DNA 또는 RNA 탐지용 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
서열 선택적인 DNA 탐지는 생명공학 분야에서 많은 생물학적 변화들을 관찰하기 위한 강력한 도구이다. 흔히 분자 표지(molecular beacon)라고 불리는 새로운 그룹의 올리고뉴클레오티드 프로브가 특정 핵산 표적 서열의 탐지를 용이하게 하기 위하여 개발되었다(Piatek et al., 1998, Nature Biotechnol. 16:359-363; 및 Tyagi and Kramer, 1996, Nature Biotechnol. 14:303-308 참조). 분자 표지는 형광물질(fluorophore)과 형광감쇄물질(quencher)을 각각 5'과 3' 말단에 갖는 핵산 서열이다. 분자 표지는 스템-루프(stem-loop) 구조를 형성하고, 형광물질을 여기(excitation)시킬 수 있는 빛을 받을 때 형광물질로부터 발산된 형광이 형광감쇄물질에 의해 흡수된다.
분자 표지는 관심대상의 표적 DNA 또는 RNA의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖도록 설계된다. 상기 분자 표지가 자신의 서열과 상보적인 서열을 갖는 표적 서열을 만날 때, 서열들간의 혼성화가 일어나서 이중 나선을 형성하고, 그 결과 생성된 비틀림 힘(torsional force)은 분자 표지의 스템 영역이 풀리는 것을 유도한다. 그 결과, 형광물질은 형광감쇄물질로부터 잡아당겨져서 떨어지게 되고 형광감쇄물질의 역할을 없애게 된다.
그러나, 일반적인 분자 표지는 다음과 같은 단점들을 갖는다. 첫째, 분자 표지는 자신의 서열과 완전히 상보적인 서열을 갖는 표적 DNA 또는 RNA만을 탐지할 수 있고, 둘째, 분자 표지의 말단을 형광물질과 형광감쇄물질이 점유하고 있기 때문에, 예컨대, 기질상에 분자 표지를 고정시키기 위해 사용될 수 있는 임의의 유용한 작용기가 부착할 수 있는 공간이 없으며, 셋째, 형광감쇄물질을 부착하기 위해서 복잡하면서도 고가의 방법이 사용되어야만 한다.
따라서, 본 발명자들은 상기 문제점들을 해결한 새로운 올리고뉴클레오티드 프로브 시스템을 개발하기 위하여 예의 노력하였다.
본 발명의 상기 및 다른 목적과 특징은 첨부된 도면과 함께 하기 본 발명의 설명으로부터 명확해질 것이다:
도 1은 형광물질로 표지된 2'-디옥시우리딘을 제조하는 개략적인 다이어그램이고,
도 2는 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드(서열번호: 1)의 일예이고,
도 3은 완전히 일치된 뉴클레오티드(서열번호: 1 및 5)와 단일염기 불일치된 뉴클레오티드(서열번호: 1 및 2, 서열번호: 1 및 3, 서열번호: 1 및 4)를 관찰한 형광 스펙트럼이고,
도 4는 서열번호: 6의 스템-루프 구조이며,
도 5는 완전히 일치된 뉴클레오티드(서열번호: 6 및 7)와 단일염기 불일치된 뉴클레오티드(서열번호: 6 및 8)를 관찰한 형광 스펙트럼이다.
따라서, 본 발명의 목적은 (i) 형광물질이 표지된 뉴클레오시드 및 (ii) 상기 형광물질이 표지된 뉴클레오시드의 옆에 위치하고 티민 또는 사이토신 염기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함하는, 표적 DNA 또는 RNA 탐지용 올리고뉴클레오티드를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드를 이용하여 표적 DNA 또는 RNA의 존재를 탐지하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 올리고뉴클레오티드를 포함하는, 표적 DNA 또는 RNA 탐지용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명은 (i) 형광물질이 표지된 뉴클레오시드 및 (ii) 상기 형광물질이 표지된 뉴클레오시드의 옆에 위치하고 티민 또는 사이토신 염기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함하는, 표적 DNA 또는 RNA 탐지용 올리고뉴클레오티드에 관한 것이다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 형광감쇄물질 없이 형광물질을 함유하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 형광물질로 표지된 2'-디옥시우리딘과 같은 형광물질로 표지된 뉴클레오시드는 당 기술분야에서 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 상기 형광물질은 플루오렌(fluorene), 파이렌(pyrene), 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine) 및 쿠마린(coumarin)으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 바람직하게는 플루오렌일 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 형광물질로 표지된 뉴클레오시드와 상기 형광물질로 표지된 뉴클레오시드의 옆에 위치하고 티민 또는 사이토신 염기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함한다. 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드를 제조하는 데에는, 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위한 당 기술분야에 공지된 임의의 방법이 사용될 수 있다. 바람직하게는, 자동화된 DNA 합성기가 사용된다.
형광물질은 올리고뉴클레오티드 내에서 임의의 위치에 존재할 수 있지만, 바람직하게는 올리고뉴클레오티드의 중앙에 위치한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 또한 형광물질로 표지된 뉴클레오시드의 옆에 위치하는 티민 또는 사이토신 기반의 뉴클레오시드가 형광물질로부터 발산되는 형광을 감쇄시키는데 중요한 역할을 하기 때문에 형광감쇄물질의 사용을 필요없게 한다는 데에 특징이 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드가 완전히 일치된 염기서열을 갖는 표적 DNA 또는 RNA와 혼성화할 때, 형광 강도는 자유 상태의 올리고뉴클레오티드의 형광 강도에 비해 급격하게 증가한다. 반면에, 검사된 샘플이 본 발명의 올리고뉴클레오티드의 서열과 단지 하나만 일치하지 않는 염기를 갖는 DNA 또는 RNA를 포함할 때, 형광 강도는 자유 상태의 올리고뉴클레오티드의 형광 강도와 비교할 때 뚜렷하게 감소한다. 따라서, 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드는 샘플에서 완전히 일치된 또는 단일 염기 불일치된 서열을 갖는 표적 DNA 또는 RNA의 존재 탐지용으로 유리하게 이용될 수 있다.
본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 일예는 서열번호: 1 및 6의 염기서열 중 하나를 갖는다(도 2 및 도 4 참조).
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 전형적인 분자 표지와 같이 스템-루프 구조를 형성할 수 있지만, 스템-루프 구조를 형성하는 올리고뉴클레오티드의 부류에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 상기 올리고뉴클레오티드와 완전히 일치하거나 단일 염기 불일치된 염기서열을 갖는 표적 DNA 또는 RNA의 존재를 탐지하는데 유용하게 사용될 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 샘플에 있는 DNA 또는 RNA와 혼성화될 수 있고, 이후 형광 강도를 측정하여 형광 강도가 자유 상태의 올리고뉴클레오티드의 형광 강도와 비교하여 증가하는지 또는 감소하는지를 검사한다. 샘플이 본 발명의 올리고뉴클레오티드와 상보적인 염기서열을 갖는 DNA 또는 RNA를 포함할 때, 형광 강도는 자유 형태의 올리고뉴클레오티드의 형광 강도에 비해 2 또는 그 이상의 비율로 증가하는 반면, 단일 염기 불일치된 염기서열을 갖는 DNA 또는 RNA가 샘플에 존재할 때, 형광 강도는 자유 상태의 올리고뉴클레오티드의 값과 비교할 때 0.1 내지 0.3배의 크기로 감소한다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 완전히 일치되거나 단일 염기 불일치된 서열을 갖는 DNA 또는 RNA를 탐지할 수 있다. 따라서, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 완전히 일치되거나 단일 염기 불일치된 염기서열을 갖는 DNA 또는 RNA를 탐지하기 위한 효율적인 형광 ON/OFF 시스템으로서 이용될 수 있다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 그의 말단에 어떠한 형광감쇄물질도 포함하지 않기 때문에 제조 공정이 간단하며, 자유 말단에 광범위한 적용을 위해 이용될 수 있는 임의의 작용기의 도입이 가능하다.
본 발명은 또한 (i) 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 샘플과 반응시켜 임의의 가능한 혼성화가 일어나도록 하고, (ii) 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광의 강도를 측정하여, (iii) 표적 DNA 또는 RNA가 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는, 샘플에서 표적 DNA 또는 RNA의 존재를 탐지하는 방법을 제공한다.
나아가 본 발명은 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 DNA 또는 RNA 탐지용 키트를 제공한다. 상기 키트는 혼성화를 위해 사용되는 일반적인 완충용액, 첨가제 등 관련 기술분야에서 공지된 것을 추가로 포함할 수 있다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
1H, 13C 및 31P NMR 스펙트럼은 브루커 NMR 분광계(Bruker NMR spectrometer; Aspect 300 MHz), FAB 질량 스펙트럼 및 JEOL 포 섹터 탄뎀 질량 분광계(JEOL four sector tandem mass spectrometer; JMS-HX/HX110A)를 사용하여 얻었다. 나아가, 하기 제시된 고체/고체 혼합물, 액체/액체 혼합물 및 고체/액체 혼합물에서의 백분율은 각각 중량/중량, 부피/부피 및 중량/부피를 나타낸다. 특별히 다른 지적이 없다면, 모든 반응들은 상온에서 수행되었다.
실시예 1: 형광물질로 표지된 2'-디옥시우리딘의 제조
(1-1) 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)페닐메틸]-2'-디옥시-5-(2-에티닐플루오레닐)우리딘의 제조
5-아이오도-5'-디메톡시트리틸-2'-디옥시우리딘(497 mg, 0.757 mmol)(도 1의 화합물 1 참조)과 2-에티닐플루오렌(231 mg, 1.21 mmol)을 Et3N(4 mL)과 THF(12 mL)에 용해시켜 얻은 용액에 (PPh3)2PdCl2(53 mg, 0.076 mmol)와 CuI(14 mg, 0.074 mmol)를 첨가하였다. 상기 혼합물에 아르곤을 2분간 버블링(bubbling)시키고, 상기 혼합물을 10회 펌프/퍼지하였다. 이후, 상기 혼합물을 2시간동안 45 내지 50℃에서 교반하고 감압하에서 용매를 증발시켰다. 그 결과 잔여물을 헥산/EtOAc(1:5)를 용출 용액으로 사용하여 칼럼 크로마토그래피(Merck 60 silica gel, 230-400 mesh)를 수행하여 표제 화합물을 얻었고(434 mg, 80%), 이를 CHCl3/MeOH (1:1)로 재결정하였다(도 1의 화합물 2 참조).
M.p. 160-161℃.
[α]14D = +40° (c = 1.05, CHCl3).
IR (film): ν 3425, 3185, 3013, 2932, 2836, 2261, 1700, 1608, 1508, 1453, 1251, 1177, 1094, 1034, 829, 767, 701, 668 cm-1.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ10.26 (br s, 1H; NH), 8.32 (s, 1H; H-6), 7.73 (d, J = 7.4 Hz, 1H: fluorene-H), 7.58-7.51 (m, 4H; fluorene-H), 7.43-7.26 (m, 2H + 6H; fluorene-H 및 DMT-H), 7.15 (d, J = 7.5 Hz, 2H; DMT-H), 7.04 (br s, 1H; DMT-H), 6.83 및 6.81 (2d, J = 8.5 Hz, 4H; DMT-H), 6.48 (t, J = 5.9 Hz, 1H; H-1'), 4.63 (br s, 1H; H-3'), 4.26 (br s, 1H; H-4'), 3.99 (br s, 1H; OH), 3.71 (s, 2H; ArCH2), 3.64 및 3.63 (2s, 6H; OCH3), 3.50 (br d, J = 9.2 Hz, 1H; H-5'), 3.33 (br d, J = 8.1 Hz, 1H; H-5'), 2.68 (br s, 1H; H-2'), 2.39 (br s, 1H; H-2').
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 162.0, 158.3, 149.6, 144.4, 143.4, 142.5, 142.0, 141.5, 140.9, 135.5, 135.4, 130.2, 129.9, 129.8, 128.1, 127.9, 127.8, 126.9, 126.7, 124.9, 120.3, 120.0, 119.2, 113.2, 100.7, 94.5, 86.8, 85.9, 79.9, 77.2, 72.3, 63.5, 55.0, 41.5, 36.5.
HRMS-FAB (m/z): [M + Na]+ calcd for C45H38N2O7Na, 741.2578; found, 741.2577.
(1-2) 5'-O-[비스(4-메톡시페닐)페닐메틸]-2'-디옥시-5-(2-에티닐플루오레닐)-3'-[2-시아노에틸비스(1-메틸에틸)포스포라미딜]우리딘의 제조
실시예 (1-1)에서 제조된 화합물(301 mg, 0. 419 mmol)과 4-메틸모르폴린(140 μL, 1.27 mmol)을 실온에서 CH2Cl2(12 mL)에 용해시켜 얻은 용액에 2-시아노에틸다이이소프로필 클로로포스포라미다이트(120 μL, 0.537 mmol)를 점적으로(dropwise) 첨가하였다. 반응이 완료된 후에(약 30분), 상기 혼합물을 감압하에서 농축시키고 헥산/EtOAc (1:1)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피(Merck 60 silica gel, 230-400 mesh)로 정제하여 표제 화합물을 얻었다(285 mg, 74%)(도 1의 화합물 3 참조).
M.p. 98-100℃.
[α]14D = +35° (c = 0.995, CHCl3).
IR (film): ν 3186, 3016, 2967, 2837, 2254, 1699, 1608, 1581, 1508, 1455, 1364, 1304, 1251, 1178, 1155, 1035, 880, 830, 771, 667 cm-1.
1H NMR (300 MHz, CDCl3): δ 8.33 및 8.28 (2s, 1H; NH), 7.74 및 7.71 (2s, 1H; H-6), 7.57-7.48 (m, 4H; fluorene-H), 7.40-7.26 (m, 3H + 6H; fluorene-H+DMT-H), 7.17-7.05 (m, 2H; DMT-H), 6.99 및 6.95 (2s, 1H; DMT-H), 6.80 (d, J = 8.7 Hz, 4H; DMT-H), 6.39 (dd, J = 12.7, 5.6 Hz, 1H; H-1'), 4.63 (br s, 1H; H-3'), 4.26 및 4.21 (2br s, 1H; H-4'), 3.88-3.75 (m, 1H; PCH2), 3.71 and 3.70 (2s, 2H; ArCH2), 3.67 및 3.65 (2s, 6H; OCH3), 3.64-3.50 (m, 4H; NCH, PCH2, H-5'), 3.32-3.28 (m, 1H; H-5'), 2.66-2.58 (m, 2H; CH2CN, H-2'), 2.46-2.35 (m, 2H; CH2CN, H-2'), 1.18 및 1.07 (2d, J = 6.7 Hz, 12H; NCHCH 3).
13C NMR (75 MHz, CDCl3): δ 161.4, 158.5, 149.2, 1443, 144.3, 143.5, 142.5, 141.8, 141.6, 141.0, 135.4, 130.3, 129.9, 128.2, 128.0, 127.0, 126.8, 125.0, 120.4, 120.1, 119.2, 117.6, 117.4, 113.2, 100.8, 94.5, 87.0, 86.2, 85.7, 79.8, 63.2, 63.0, 58.2, 58.0, 55.1, 43.3, 43.2, 43.1, 43.0, 40.8, 36.5, 24.6, 24.5, 20.4, 20.3, 20.2, 20.1, 19.2.
31P NMR (121 MHz, CDCl3): δ 151.6, 151.1.
HRMS-FAB (m/z): [M + Na]+ calcd for C54H55N4O8PNa, 941.3658; found, 941.3654.
실시예 2: 본 발명에 따른 올리고뉴클레오티드의 합성
실시예 (1-2)에서 얻은 화합물을, 서열번호: 1 내지 6의 형광을 내는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 빌딩 블록으로서 Controlled Pore Glass 9CPG 고체 지지체 상에 자동화 DNA 합성기(PerSeptive Biosystems 8909 ExpediteTM Nucleic Acid Synthesis System)를 사용하는 포스포라미다이트 접근법으로 도입하였다. 제조된 올리고뉴클레오티드를 MALDI-TOF 질량 분광계로 분석하면 다음과 같다:
서열번호: 1의 올리고뉴클레오티드, calcd m/z 4717, found 4723; 및
서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드, calcd m/z 5903, found 5903.
나아가, 표적 DNA 후보물질인 서열번호: 2 내지 5, 7 및 8의 올리고뉴클레오티드를 동일한 자동화 DNA 합성기를 이용하여 제조하였다.
표 1에서 보는 바와 같이, 서열번호: 5 및 7의 올리고뉴클레오티드는 서열번호: 1 및 6과 각각 상보적인 염기서열을 가지고 있다. 반면에, 서열번호: 2 내지 4의 올리고뉴클레오티드와 서열번호: 8의 올리고뉴클레오티드는 각각 서열번호: 1 및 6과 하나의 염기만 일치하지 않는 염기서열을 가지고 있다.
합성된 올리고뉴클레오티드는 55℃에서 10시간동안 30% 수성 NH4OH(1.0 mL)를 처리하는 것에 의해 고체 지지체로부터 절단된다. 자동화된 올리고뉴클레오티드 합성에 의해 얻은 상기 조 산물(crude product)을 동결건조하고 증류수(1 mL)로 희석하였다. 상기 올리고뉴클레오티드를 HPLC(Merck LichoSPHER® 100 RP-18 endcapped column, 10×250 mm, 5 μm)로 정제하였다. 상기 HPLC 이동상은 10분간 2.5 mL/분의 유속으로 5% 아세토나이트릴/0.1 M 트리에틸암모늄 아세테이트(TEAA)(pH 7.0)를 등용매로(isocratically) 유지하였다. 이후, 동일한 유속에서 5% 아세토나이트릴/0.1 M TEAA에서 50% 아세토나이트릴/0.1 M TEAA까지 10분 이상 농도구배를 선형으로 증가시켰다. 정제된 올리고뉴클레오티드를 포함하는 분획들을 모아서 동결건조하였다. 80% 수성 AcOH를 상기 올리고뉴클레오티드에 첨가하였다. 주위 온도에서 30분후에 상기 용매를 감압하에서 증발시켰다. 잔여물을 증류수(1 mL)로 희석시킨 후, 상기 기술된 것과 동일한 조건하에서 HPLC로 정제하였다. 특성 분석을 위해, 상기 올리고뉴클레오티드의 MALDI-TOF(matrix-assisted laser-desorption-ionization time-of-flight) 질량 분광 데이터를 Voyager RP (PerSeptive Biosystems, Framingham, MA, USA) time-of-flight (TOF) dual-stage reflector 질량 분광계로 수집하였다. 상기 기기는 샘플을 탈착/이온화(desorb/ionize)하기 위해 337 nm에서 질소 레이저를 사용하였다. 가속 전압은 20 kV였고 비행 거리는 1.1 m였다.
실시예 3: 형광 강도의 측정
본 발명의 형광을 내는 올리고뉴클레오티드(서열번호: 1 및 6)를 완전히 일치하거나 단일 염기 불일치된 염기서열을 갖는 표적을 탐지하는데 사용할 수 있는지의 관점에서 다음과 같이 검사하였다:
서열번호: 1의 올리고뉴클레오티드를 서열번호: 2 내지 5의 각각의 올리고뉴클레오티드들과 완충용액(100 mM NaCl, 20 mM MgCl2 및 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.2))에서 1:1의 몰비로 혼성화시키고, 그의 안정상태(steady-state) 형광(FL) 스펙트럼을 15 nm의 밴드폭과 1 cm의 빛 통과 거리를 갖는 0.5×2 cm의 수정 큐벳(cuvette)을 사용하는 MD-5020 PTI 모델 현미경 광도계로 구하였다. 셀 지지체는 PolyScience digital temperature controller 9110으로 조절되는 순환수로 단열시켰다. 형광 측정은 상기 혼성화에서 사용된 것과 동일한 완충용액하에서 수행하였다. 형광 발산 스펙트럼은 도 3에 도시되어 있다. 425nm의 최대파장(λmax)에서 측정한 형광 강도는 표 2에 기재되어 있다.
따라서, 올리고뉴클레오티드 사이의 모든 염기쌍이 완전히 일치하는 이중체(duplex)의 경우(서열번호: 1 및 5의 올리고뉴클레오티드 이중체), 형광 강도는 뚜렷하게 증가하였다. 반면에, 하나의 염기쌍이 불일치된 이중체의 경우(서열번호: 1 및 2, 1 및 3, 그리고 1 및 4의 올리고뉴클레오티드 이중체들의 경우), 형광강도가 급격하게 감소하였다.
또한, 위의 실험을 서열번호: 2 내지 5의 올리고뉴클레오티드 대신에 서열번호: 7 및 8의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것을 제외하고는 형광을 내는 서열번호: 6의 올리고뉴클레오티드에 대해 반복하였다. 관찰된 형광 발산 스펙트럼은 도 5에 도시되어 있고, 425nm에서 측정된 형광 강도는 표 3에 기재되어 있다.
따라서, 올리고뉴클레오티드 사이의 모든 염기쌍이 완전히 일치될 때(서열번호: 6 및 7의 올리고뉴클레오티드 이중체), 형광 강도는 큰 폭으로 증가하였고, 반면에 올리고뉴클레오티드 사이에 하나의 염기쌍이 불일치하는 경우에는(서열번호: 6 및 8의 올리고뉴클레오티드 이중체), 형광 강도는 뚜렷하게 감소하였다.
본 발명을 상기의 구체적인 실시예와 관련하여 기술하였지만, 첨부된 특허청구범위에 의해 정의된 본 발명의 범위내에서 당 분야의 숙련자가 본 발명을 다양하게 변형 및 변화시킬 수 있음을 이해해야 한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 형광 강도의 변화를 측정하는 것에 의해 완전히 일치하거나 단일 염기 불일치된 염기서열을 갖는 DNA 또는 RNA를 탐지하는데 유리하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> POSTECH FOUNDATION <120> OLIGONUCLEOTIDE FOR DETECTING TARGET DNA OR RNA <130> PCA40323/PSC <150> US 60/561,146 <151> 2004-04-12 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An exemplary oligonucleotide of the present invention <220> <221> misc_structure <222> (8) <223> n is fluorophore-labeled 2'-deoxyuridine <400> 1 tggactcnct caatg 15 <210> 2 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having single base noncomplementary to SEQ NO: 1 <400> 2 cattgagtga gtcca 15 <210> 3 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having single base noncomplementary to SEQ NO: 1 <400> 3 cattgaggga gtcca 15 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having single base noncomplementary to SEQ NO: 1 <400> 4 cattgagcga gtcca 15 <210> 5 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having complementary to SEQ NO: 1 <400> 5 cattgagaga gtcca 15 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> An exemplary oligonucleotide of the present invention <220> <221> modified_base <222> (10) <223> n is fluorophore-labeled 2'-deoxyuridine <400> 6 ttctgactcn ctttcagaa 19 <210> 7 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having complementary to SEQ NO: 6 <400> 7 ttctgaaaga gagtcagaa 19 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Oligonucleotide having single base noncomplementary to SEQ NO: 6 <400> 8 ttctgaaagc gagtcagaa 19

Claims (10)

  1. (i) 형광물질이 표지된 뉴클레오시드 및 (ii) 상기 형광물질이 표지된 뉴클레오시드의 옆에 위치하고 티민 또는 사이토신 염기를 갖는 적어도 하나의 뉴클레오시드를 포함하는, 표적 DNA 또는 RNA 탐지용 올리고뉴클레오티드.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 형광물질이 표지된 뉴클레오시드가 2'-디옥시우리딘인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 형광물질이 올리고뉴클레오티드의 중앙에 위치하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 형광물질이 플루오렌(fluorene), 파이렌(pyrene), 플루오레세인(fluorescein), 로다민(rhodamine) 및 쿠마린(coumarin)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 형광물질이 플루오렌인 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호: 1의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    스템-루프(stem-loop) 구조를 형성하는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  8. 제7항에 있어서,
    서열번호: 6의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 올리고뉴클레오티드.
  9. (i) 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 샘플과 반응시켜 임의의 가능한 혼성화가 일어나도록 하고;
    (ii) 혼성화 혼합물로부터 방출되는 형광의 강도를 측정하여;
    (iii) 표적 DNA 또는 RNA가 상기 샘플에 존재하는지 여부를 결정하는 것을 포함하는,
    샘플에서 표적 DNA 또는 RNA의 존재를 탐지하는 방법.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 따른 올리고뉴클레오티드를 포함하는 표적 DNA 또는 RNA 탐지용 키트.
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