KR20060133789A - 암 전이 억제용 조성물 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암 전이 억제용 조성물에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 인삼을 물, 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출하고 산 가수분해 후의 정제 공정을 통해 암 전이 억제 조성물을 제조함으로써 기존의 20(S)-진세노사이드 Rg3만을 사용한 경우에 비해 항암 효과 및 암 전이 억제 효과가 우수한 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 내지 80 %(w/w) 함유된 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
진세노사이드 Rg3 조성물, 암 전이, 침윤억제

Description

암 전이 억제용 조성물{A composition having anti-metastatic effect}
도 1은 20-(S)-진세노사이드 Rg3가 50%(w/w) 함유된 조성물의 고압 액체 크로마토그램을 나타낸 것이다.
도 2는 20-(S)-진세노사이드 Rg3의 in vivo 암 전이 억제 최종일 실험의 폐 사진을 나타낸 것이다.
도 3은 20-(S)-진세노사이드 Rg3가 50%(w/w) 함유된 조성물의 in vivo 암 전이 억제 최종일 실험의 폐 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 암 전이 억제용 조성물에 과한 것으로서, 더욱 상세하게는 인삼을 물, 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출하고 산 가수분해 후의 정제 공정을 통해 암 전이 억제 조성물을 제조함으로써 기존의 20(S)-진세노사이드 Rg3만을 사용한 경우에 비해 항암 효과 및 암 전이 억제 효과가 우수한 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 내지 80 %(w/w) 함유된 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
인삼 및 인삼을 가공한 홍삼에는 인삼 속 식물에만 존재하는 특유의 사포닌들이 들어 있어 특유의 약리 활성을 나타내는데, 이러한 사포닌은 지금까지 34종이 알려져 있다. 인삼 사포닌은 아글리콘의 구조에 따라 크게 파낙사다이올계, 파낙사트라이올계 및 올레아난계 진세노사이드로 분류되며, 아글리콘에 결합되어 있는 당의 종류나 결합된 당의 수 또는 결합위치에 따라 약리 효능이 다르다. 특히, 담마란계의 트리테르페노이드인 파낙사다이올과 파낙사트라이올에 글루코오스, 람노오스, 아라비노오스 또는 자일로오스같은 당류가 결합된 화합물들이 특유의 약리 활성을 나타낸다.
상기 34종의 인삼 사포닌 중 진세노사이드 Rg3은 1980년 Kaku 등이 [Kaku 등, Arzneim. Forsch. Drug Res. 30, 936-943, 1980] 홍삼으로부터 20(R)-진세노사이드 Rg3을 분리하여 구조를 확립한 이후(C42H72O13, 분자량 784), 1983년 일본 오사카대학의 Kitagawa 교수는 홍삼과 백삼의 사포닌성분을 중심으로 양자간의 차이점을 광범위하게 검토하였다[Kitagawa 등, The Ginseng Review, Vol 1, p21, 1983]. 그 결과 홍삼의 특징적인 사포닌으로 20(S)-진세노사이드 Rg3 (0.006%), 20(R)-진세노사이드 Rg3 (0.014%), 20(S)-진세노사이드 Rh2 (0.001%), 20(R)-진세노사이드 Rg2 (0.003%), 20(R)-진세노사이드 Rh1 (0.007%)이 함유되었음을 규명하였으나 대단히 미량 성분인 것을 알 수 있으며, 백삼의 특이성분으로 말로닐 진세노사이드 Rb1 (0.82%), -Rb2 (0.41%), -Rc (0.30%), -Rd (0.12%)을 분리하였고 홍삼에는 극미량 검출된다고 하였다[Kitagawa 등, Chem. Pharm. Bull., 31, 3353, 1983)(Kitagawa등 Chem. Pharm. Bull., 37, 2961, 1989]. 또한, 진세노사이드 Rg3은 진세노사이드 Rb1을 위산 조건인 pH 2, 37 ℃에서 가온하면 쉽게 생성되는데, 이때는 Δ20-진세노사이드 Rg3과 25-하이드록시 진세노사이드 Rg3이 함께 생성된다[Han, B. H.등, Arch. Pharm Res., 4, 25-32,1981, Han, B. H. 등, Planta Med., 44, 146-149, 1982]. 이것이 인삼사포닌 대사체 연구의 효시가 되었다.
진세노사이드 Rg3이 다량 함유된 인삼추출물을 제조하기 위하여 인삼, 인삼추출물을 약산 특히 유기산으로 가수분해하거나, 고온고압에서 가열하는 방법[Park, M. K.등, 대한민국 특허등록 제 192678호], 인삼을 산미가 있는 생약재와 물에서 가열하는 방법[Park, M. H.등, 대한민국특허 제 425022호, 제 453542호] 등이 알려져 있다. 비록 파낙사다이올계 사포닌을 순수하게 분리하여 산 분해 방법으로 진세노사이드 Rg3을 제조한다 하더라도 C-20의 3급수산기는 산 촉매에 의해 에피머화하여 20(S)-체 및 20(R)-체의 혼합물이 얻어진다. 이러한 입체 이성질체에 따른 약리 활성의 차이는 존재하며, 20(R)-진세노사이드 Rg3에 대한 암 전이 억제에 대한 효과는 일본특허출원 평3-160661호에 언급되어 있고 이는 정맥 투여(i.v)에 의한 암 전이 억제 효과로서 본 실험의 경구 투여(p.o) 약리 검증 실험과 비교 시 약물 흡수 등의 차이로 인해 직접적으로 비교하기는 어려운 점이 있다. 또한, 20(S)-진세노사이드 Rg3 및 기타 인삼의 미량 성분으로 알려진 진세노사이드 Rh2와 진세노사이드 Rg5, Rk1 등도 항암 및 암 전이 억제에 대한 작용, 혈관 이완 작용 및 항암제의 내성 억제 작용 등이 있는 것으로 알려져 있다[Shinkai, K. Jpn.J. Cancer Res., 87, 357-362, 1996., Mochizuki, M., Biol. Pharm. Bull., 18, 1197, 1995., Park, J. D., Arch. Pharm. Res., 19, 213-218 1996., Yun, T. K., J. Ginseng Res., 25, 107-111, 2001].
이에, 본 발명자들은 부작용이 없는 암 전이 억제제의 개발을 위하여 많은 연구를 진행하였으며, 특히 인삼 또는 홍삼 등 널리 복용되어 왔던 천연식품을 이용하여 암 전이 억제제를 개발하고자 연구를 진행하였다.
문헌에 보고된 항암 및 암전이 억제에 대한 약리 작용을 갖는 인삼 사포닌은 진세노사이드 Rg3, Rh2 및 이들의 아글리콘과 진세노사이드 Rk1, Rg5 및 컴파운드 K 등이 존재한다. 또한, 진세노사이드 Rg3과 Rh2는 인삼을 출발물질로 가열, 증삼 처리 시 구조적으로 불안정한 진세노사이드 아글리콘 C-20위치에 결합되어 있는 배당체결합이 쉽게 가수분해됨과 동시에 수산기가 반전평형을 일으켜 C-20(S)와 C-20(R)의 이성체가 생성되고, 이의 입체 이성질체의 형태에 따라 항암 및 암 전이 억제에 대한 약리 효과의 차이가 존재함이 규명되었다.
암 전이 억제 조성물로 인삼 사포닌을 산업화하기 위해서 항암 및 암 전이 억제에 효과가 있다고 알려진 진세노사이드에 대해 암 전이 억제 비교 우위 실험을 진행하였고, 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20(R)-진세노사이드 Rg3 및 기타 인삼 사포닌에 비해 암 전이 억제 효과가 비교 우위에 있음을 확인하였다.
진세노사이드 Rg3은 인삼에 함유된 모든 파낙사다이올계 사포닌이 주근부 사 포닌의 60%, 측근(미삼) 사포닌의 78%를 차지하면서 공통된 프로사포게닌, 즉 진세노사이드 Rg3을 갖고 있기 때문에, 특정한 방법을 통해 진세노사이드 Rg3을 고수율로 얻을 수 있다는 점에서 자원화 하기에 유리한 점이 있다. 그러나, 인삼 유래 조사포닌 추출물을 농축하여 진세노사이드 Rg3을 분리 정제할 경우 나타나는 문제점은 분자량이 거의 같고 이화학적 특성이 매우 유사한 진세노사이드 Rg그룹의 사포닌 성분들이 혼합물 상태로 함께 분리되어 최종적으로 정제할 때까지도 극미량으로 혼합 검출되어 고순도로 분리, 정제하는 데는 반복되는 정제과정으로 시간과 비용이 많이 소요된다. 따라서, 산업화되기 위한 생산성 확보 및 약물의 암 전이 억제 효능을 증가시키기 위해 여러 조성물에 대한 활성을 연구한 결과, 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 내지 80%(w/w)로 존재하는 조성물을 투여할 경우 20(S)-진세노사이드 Rg3 또는 20(R)-진세노사이드 Rg3을 단독으로 투여하였을 경우 보다 탁월한 암 전이 효과를 나타낸다는 사실을 알게 되어 최적의 암 전이 억제 작용을 갖는 조성물을 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 암 전이 억제 효과가 20(S)-진세노사이드 Rg3 단독 투여시 보다 암 전이 억제 효과가 우수하며 부작용이 없는 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 내지 80%(w/w) 함유된 조성물 및 이의 제조방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 지속적으로 복용함으로써 암을 예방하거나 치료할 수 있는, 상기 우수한 암 전이 억제 효과를 나타내는 조성물을 이용한 드링크제, 정제, 환제, 캡슐제 및 주사제를 제공하는데 또 다른 목적이 있다.
본 발명은 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 ~ 80%(w/w) 함유된 암 전이 억제용 조성물을 그 특징으로 한다.
본 발명은
1) 파낙스 속 식물 및 이의 조직 배양물을 물, 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 된 추출용매로 추출하는 단계;
2) 상기 추출단계에서 얻은 추출액을 감압 하에 농축하여 물에 현탁시킨 후 알칼리화하여 극성 유기용매로 추출하여 파낙사트리올계 사포닌을 분리하는 단계;
3) 상기 파낙사트리올계 사포닌을 분리 후 남은 수층을 중화하여 극성 유기용매로 추출하여 파낙사다이올계의 사포닌을 분리하는 단계; 및
4) 상기 파낙사다이올계 사포닌을 30 ~ 100 ℃에서 젖산으로 산 가수분해한 다음, 중화 후 극성 유기용매로 추출한 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 클로로포름/메탄올/물(14:2:0.1 ~ 12:3:0.3)의 농도구배를 달리한 혼합용매를 용출제로 사용하여 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 ~ 80%(w/w) 함유된 암 전이 억제 조성물을 제조하는 단계를 포함하는 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 ~ 80%(w/w) 함유된 암 전이 억제 조성물의 제조방법을 또 다른 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 인삼을 물, 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 추출하고 산 가수분해 후의 정제 공정을 통해 암 전이 억제 조성물을 제조함으로써 기존의 20(S)-진세노사이드 Rg3만을 사용한 경우에 비해 항암 효과 및 암 전이 억제 효과 가 우수한 20(S)-진세노사이드 Rg3이 Rg3 20 내지 80%(w/w) 함유된 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에서 추출 대상이 되는 인삼은 파낙스 속 식물, 예를 들면, 파낙스 진생(Panax ginseng), 파낙스 노토진생(Panax notoginseng), 파낙스 퀸크폴리움(Panax quinquefolium), 파낙스 야포니쿠스(Panax japonicus)등이나 또는 이들 식물의 조직 배양물을 의미한다.
본 발명에 따른 암 전이 억제 조성물의 제조방법을 그 단계별로 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
먼저, 상기 인삼 속 식물 및 조직 배양물을 물, 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 1차 추출한다. 상기 추출 용매로 사용하는 극성 유기용매로는 탄소수 1 ∼ 4 개의 저급 알콜, 더욱 바람직하게는 메탄올 또는 에탄올을 사용할 수 있으며, 그 외에도 적당한 극성을 가지는 극성 유기용매가 사용될 수 있다. 통상적인 방법에 따라 추출한 후 추출물을 감압 하에 농축시키고 물에 현탁시킨 다음 염기 처리하여 디클로로메탄, 클로로포름, 디에틸에테르, 에틸아세테이트 및 수포화 부탄올 등의 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 2차 추출을 함으로써 극성 유기 용매 분획으로 파낙사트리올계 사포닌을 분리할 수 있다. 남은 수층을 중화하여 상기의 유기 용매로 3차 추출 후 추출물을 감압 하에 농축시킴으로써 파낙사다이올계 사포닌을 수득할 수 있다.
얻어진 파낙사다이올계 사포닌을 산, 바람직하게 젖산과 같은 약산으로 산 처리된 물에 현탁시킨 후 30 내지 100 ℃에서 10 내지 50시간동안 교반 가열 처리 하면 진세노사이드 Rg3을 함유하는 최종 산분해물을 얻을 수 있다. 이 산 분해물의 수층을 염기 처리하여 중화한 후 디클로로메탄, 클로로포름, 디에틸에테르, 에틸아세테이트 및 수포화 부탄올 등의 유기용매 및 이들의 혼합 용매로 추출을 하고 감압 하에 농축을 한 추출물을 저급 알콜, 예를 들면 메탄올 또는 에탄올을 통한 재결정으로 20(R)-진세노사이드 Rg3을 순순히 얻을 수 있으며, 또한 추출물을 클로로포름/메탄올/물(14:2:0.1 ~ 12:3:0.3)의 농도구배를 달리한 혼합용매를 용출제로 사용한 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 목적하는 비율의 20(S)-진세노사이드 Rg3의 양이 존재하는 조성물을 수득할 수 있다. 그리고 이 조성물에는 20(S)-진세노사이드 Rg3 외에 Rg5 등이 함유되어 있고, 첨부도면 도 1과 같은 특징을 한 크로마토그램을 갖는 조성물로 확인되었다.
본 발명에 따르는 활성 조성물로서 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 내지 80%(w/w)로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물은 우수한 암 전이 억제 효과를 발휘하여 암 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물에 대한 인체 내로의 투여량은 체내에서 활성성분의 흡수도, 불활성화율 및 배설속도, 환자의 연령, 성별 및 상태, 암의 진행상태 등에 따라 적절히 선택되나, 일반적으로는 성인에게 합계량으로, 1일 10 내지 200 mg 투여도록 하는 것이 바람직하다. 1일 10 mg 미만으로 복용할 경우 암 전이 억제 효과가 부족하게 되고, 1일 200 mg 초과 복용할 경우, 암 전이 억제 효과가 더 이상 증가하지 않는다.
본 발명의 조성물은 식품 또는 의약품으로 제조하여 상기 1일 복용량에 맞추 어 1일 1회 내지 2회 정도로 분할하여 복용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 통상적인 방법으로 드링크제, 정제, 환제 또는 캡슐제의 형태로 제조하여 경구 복용할 수 있으며 또는 주사제로 제조하여 투여할 수 있다.
본 발명의 조성물을 함유하는 의약 조성물의 제형을 제조함에 있어서, 조성물을 담체, 부형제 및 희석제와 함께 혼합하거나 이들로 희석하여 제조된 조성물을 캅셀 및 기타 용기의 형태의 담체 등에 봉입시키는 것이 바람직하다. 이러한 제형들은, 예를 들어, 정제, 환제, 과립제, 분말, 엘릭실제, 현탁제, 유제, 액제, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀제, 멸균 분말 등의 형태일 수 있다. 특히, 경구투여용 제제로 제형화된 형태가 바람직하다. 또한, 경구 투여 시에 약제가 위산에 의해 분해되는 것을 방지하기 위하여 제산제를 병용하거나, 정제 등의 경구 투여용 고형 제제를 장용피로 피복한 제제로 제형화하여 투여할 수도 있다.
한편, 본 발명의 조성물을 포함하는 것으로써 반드시 의약품으로 허가되는 것만을 의미하지는 않으며, 통상적인 기능성 식품 또는 건강 보조식품까지도 포함하는 개념으로 이해될 수 있다.
본 발명에 따르는 조성물의 활성성분인 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 내지 80%(w/w)로 존재하는 것을 특징으로 하는 조성물을 조제하여 복용할 경우 그 효과가 우수할 뿐만 아니라, 후술하는 실험결과로부터 입증되는 바와 같이 부작용이 없으며 실험동물에 대하여 독성을 나타내지 않아 안전하게 사용할 수 있다.
이하에서는, 구체적인 실시예 및 실험예를 통하여 본 발명을 구체적으로 예시한다. 그러나, 하기의 예는 본 발명의 구체적인 실시 형태를 예시하는 것에 불과하며, 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.
실시예 1: 파낙사다이올계와 트리올계의 사포닌 분획 분리
미삼 1 kg을 80 ℃로 5시간동안 70% 메탄올 7L로 2회 추출하여 농축한 추출물을 고형분 함량 25%가 되도록 물에 현탁시켰다. 수산화나트륨 50 g을 가하여 알칼리화시킨 후 수포화 부탄올 1.2L로 4회 추출함으로 인해 파낙사트리올계의 사포닌을 39.6g 수득하였다. 추출 후 남은 수층에 18% 염산을 180 ml 교반 투입하여 중화 후 수포화 부탄올 1.4L로 3회 추출함으로 인해 파낙사다이올계의 사포닌을 46.3 g 수득하였다.
실시예 2: 산 분해 가공물의 파낙사다이올계 사포닌 분획 제조
상기 실시예 1에서 얻어지는 진세노사이드 Ra, Rb1, Rb2, Rc, Rd 등의 파낙사다이올계의 사포닌을 2.4L의 물에 완전 용해 후 70 ℃에서 36시간 동안 젖산 23 g을 첨가하여 교반 반응시켰다. 수산화나트륨 20 g을 가하여 중화시킨 후 수포화 부탄올 1.4L로 2회 추출하여 감압 하에 농축함으로써 산 분해 가공물의 파낙사다이올계 사포닌을 27 g 수득하였다.
실시예 3: 20(R)-진세노사이드 Rg3 제조
상기 실시예 2에서 얻어지는 산 분해 가공물의 파낙사다이올계 사포닌 20 g을 메탄올 또는 에탄올 380 ml을 가한 후 2시간 동안 80 ℃에서 환류 반응 시 흰색 분말의 난용성 물질인 20(R)-진세노사이드 Rg3 4 g을 수득하였다. 수득한 20(R)-진세노사이드 Rg3은 문헌[참조 : 약학회지 제 35권 5호, 432-437 (1991)]에 공지된 것과 일치하는 13C-NMR 스펙트럼 및 질량 스펙트럼을 나타낸다.
실시예 4: 20(S)-진세노사이드 Rg3 제조 및 다양한 비율의 20(S)-진세노사이드 Rg3을 함유한 분획물의 제조
상기 실시예 3에서 20(R)-진세노사이드를 수득하고 남은 여과물의 용매를 감압 농축하여 산 분해 가공물의 파낙사다이올계 사포닌 15 g을 얻었다. 이 산 분해 가공물을 클로로포름/메탄올/물(14:2:0.1 ~ 12:3:0.3)의 농도 구배를 달리한 혼합용매를 용출제로 사용하여 실리카겔 컬럼상에서 크로마토크래피를 수행하여 목적하는 비율의 20(S)-진세노사이드 Rg3 분획물을 수득하였다. 각 조성물의 대표도면으로서 20-(S)-진세노사이드 Rg3이 50%(w/w) 존재하는 조성물은 도 1에 명기하였다.
함유 비율 중 얻어진 20(S)-진세노사이드 Rg3 함량이 80%(w/w) 이상인 분획물을 세미분취용 칼럼(250*20 mm, YMC-ODS H80, s-4 um/ 용출액 = 43% 시안화메틸)을 이용한 고압 액체 크로마토그래피로 정제하여 순수한 20(S)-진세노사이드 Rg3 500 mg을 얻었다. 수득한 20(S)-진세노사이드 Rg3은 실시예 3에서 얻어지는 20(R)-진세노사이드 Rg3과 함께 문헌[참조 : 약학회지 제 35권 5호, 432-437(1991)]에 공지된 것과 일치하는 13C-NMR 스펙트럼 및 질량 스펙트럼을 나타내었다.
실험예 1: 20(S)-진세노사이드 Rg3 및 기타 다른 진세노사이드의 in vitro 항침윤 작용
상기 실시예 3,4에서 얻어진 20(R)&(S)-진세노사이드 Rg3 및 문헌 조사를 통해 항암 및 암 전이 억제에 효과가 있다고 알려진 기타 다른 진세노사이드 즉 컴파운드 K, 20(R)-진세노사이드 Rh2 및 20(S)-진세노사이드 Rh2 등을 디메틸설폭사이드(dimethyl sulfoxide)에 녹인 후 1 ㎍/ml 농도로 세포배지(DMEM)에 희석하였다. 실험에 사용하는 챔버는 BD BioCoatTM MatrigelTM 침윤 챔버이며 사용하기 전 90분 동안 실온에서 혈청이 포함되지 않은 DMEM을 첨가하여 리하이드레이션(rehydration)시켰다. 그 후 배지를 제거한 침윤 챔버를 5% 우태아혈청(FBS : Fatal Bovine Serum)을 포함하는 DMEM 배지가 웰당 750 ㎕씩 분주되어 있는 24 웰 플레이트로 옮겼다. 암세포에 대한 항침윤 효과를 평가하는데 사용된 세포는 마우스 고 전이성 피부암세포인 B16F10 메라노마로 0.5 X 105 cells/ml의 농도로 각 웰당 450 ㎕씩 세포를 분주하였다. 그 후 1 ㎍/ml의 농도로 희석시킨 상기 실험군을 50 ㎕씩 첨가한 후 24 시간 동안 37 ℃를 유지하는 5% 이산화탄소 인큐베이터에서 배양하였다. 24시간 후 챔버 위의 배지를 걷어낸 후 침습된 세포들을 메탄올로 고정하 고 0.5 % 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 염색된 필터 부분은 사진 촬영 후 세포의 개수를 세어 암세포에 대한 항침윤 정도를 평가하였다. 상기의 실험방법으로 실험하였을 때 약물을 처리하지 않았을 시 챔버를 통과한 세포 수에 비해 약물 처리시 챔버를 통과한 세포수의 비를 항침윤 정도(inhibition rate, %)로 표시하였으며, 이를 다음 표 1에 나타내었다(각 값은 3 웰의 평균임).
1 ㎍/ml 농도에서 B16F10 메라노마 세포에 대한 항침윤 효과(단위: %)
구분 컴파운드 K 20(S)-Rh2 20(R)-Rh2 20(S)-Rg3 20(R)-Rg3
B16F10 40.5 16 38 62.5 11.5
상기 실험 결과, 마우스 고 전이성 피부암세포인 B16F10 메라노마에 대해 컴파운드 K, 20(R)-진세노사이드 Rh2 및 20(S)-진세노사이드 Rg3이 높은 항침윤 효과를 보이는 것을 알 수 있었으며, 특히 20(S)-진세노사이드 Rg3은 가장 우수한 항침윤 효과를 나타내었다. 또한, 20(S)-진세노사이드 Rg3은 20(R)-진세노사이드 Rg3에 비하여 암세포에 대한 항침윤 정도가 약 5.4배 높은 것으로 나타났다.
실험예 2: 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량비를 달리한 조성물의 in vitro 항침윤 작용
다음으로는 상기 실험예 1에서 우수한 항침윤 효과를 보이는 20(S)-진세노사이드 Rg3은 상기 실시예 4에서 명기한 바와 같이 컬럼 크로마토그래피화하여 목적하는 비율의 조성물을 제조하여 각각에 대해 상기 실험방법을 통한 B16F10 메라노마에 대한 항침윤 정도를 살펴보았다. 20(S)-진세노사이드 Rg3이 전혀 포함되지 않은 분획물부터 20, 40, 50, 60, 80 그리고 100 %(w/w)가 포함된 조성물의 B16F10 메라노마에 대한 항침윤 효과를 0.03 ㎍/ml 농도에서 평가한 값을 다음 표 2에 나타내었다(각 값은 3 웰의 평균임). 조성물은 목적하는 20(S)-진세노사이드 Rg3 외에 Rg5 등 기타 미량의 진세노사이드 혼합물로 첨부한 대표 도 1과 같은 특징을 한 크로마토그램을 갖는 조성물이며, 20(S)-진세노사이드 Rg3이 전혀 포함되지 않은 분획물의 경우 진세노사이드 Rg5를 주성분으로 하는 진세노사이드 혼합물이다.
0.03 ㎍/ml 농도에서 B16F10 메라노마 세포에 대한 항침윤 효과 (단위: %)
구분 0 %(w/w) 20 %(w/w) 40 %(w/w) 50 %(w/w) 60 %(w/w) 80 %(w/w) 100 %(w/w)
B16F10 14.5 35.2 41.5 45.7 41.3 29.7 20.3
상기 실험결과, 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량이 20~80 %(w/w)일 때의 항침윤 정도가 20(S)-진세노사이드 Rg3이 전혀 포함되지 않은 실험군이나 20(S)-진세노사이드 Rg3만 포함된 실험군에 비해 최고 3.1배 높은 것을 알 수 있었다. 또한, 20(S)-진세노사이드 Rg3의 함량이 50%(w/w)일 때의 항침윤 효과가 20(S)-진세노사이드 Rg3이 다른 함량으로 포함된 분획물에 비하여 높은 항침윤 효과를 나타냈다.
실험예 3: 20(S)-진세노사이드 Rg3과 이를 50%(w/w) 함유한 조성물의 in vivo 암전이 억제 작용
상기 실험예 1 및 2의 결과에서 in vitro 상에서 B16F10 메라노마에 대해 항침윤 효과가 우수하게 나타난 20-(S)-진세노사이드 Rg3 단독과 이를 50%(w/w) 함유한 조성물의 암 전이 억제 활성을 in vivo 상에서 비교하기 위하여 다음 실험을 실시하였다. 실험에 사용한 세포는 실험예 1과 마찬가지로 마우스 고 전이성 피부암세포인 B16F10 메라노마이며 실험군은 0.5% 카르복시메틸셀룰로오즈를 부형제로 하여 약물을 제조하였다. 20(S)-진세노사이드 Rg3의 최고 용량은 10 mg/kg 로 제조하였으며 그 아래 용량은 공비를 2로 하여 최고 용량을 희석하여 사용하였다. 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물의 최고용량은 40 mg/kg로 제조하였으며, 그 아래 용량은 공비를 2로 하여 5 mg/kg까지 최고 용량을 희석하여 사용하였다.
B16F10 메라노마 세포를 배양한 후 세포를 트립신-EDTA를 이용하여 분리한 후 0.85% 식염수로 희석하여 2.5 X 106 cells/ml 맞추어 암컷 S.P.F C57BL/6 마우스의 꼬리정맥 내에 마리당 0.2 ml씩 주사하였다. 마우스는 군당 6마리씩 배치하였다. 세포이식 4시간 뒤 약물 투여를 시작하여 14일간 마우스 몸무게 10 g 당 0.2 ml씩 매일 경구 투여하였다. 몸무게 측정은 실험당일 및 3, 6, 9, 12, 14 일에 하였으며 세포이식 14일 후 마우스를 부검하여 암세포가 전이된 폐를 적출하고 디지털 카메라를 이용하여 각 군별로 폐를 촬영하였다. 적출한 폐는 10%의 중성 포르말린액에 담가 보관하였으며 폐종양 콜로니(pulmonary tumor colony) 수를 육안으로 계수하여 약물의 암 전이 억제 정도를 평가하였다. 부형제 대조군에 비해 마우스에 약물을 투여하였을 때 폐에 전이된 콜로니 수의 비를 암전이 억제 정도(inhibition rate, %)로 표시하였으며, 이를 다음 표 3 및 도 2에 나타내었다. 실험의 통계학적 유의성은 Student's t-TEST로 검정하였다.
in vivo 암 전이 억제 작용
구분(%) 농도 (mg/kg)
5 10 20 40
20(S)-Rg3 31.6 47.1 - -
50%(w/w)* 57.6 56.0 50.7 53.9
* 50%(w/w) : 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물
상기 실험 결과, 20(S)-진세노사이드 Rg3은 5 mg/kg 용량에서 암 전이 억제 정도는 31.6%였으며, 동량의 20(S)-진세노사이드 Rg3을 함유하고 있는 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물 10 mg/kg 용량에서의 암 전이 억제정도는 56.0%로서 20(S)-진세노사이드 Rg3 5 mg/kg 용량 보다 약 1.8배 높게 나타났다. 또한, 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물 5 mg/kg 용량에서의 암 전이 억제 정도는 57.6%로 10 mg/kg 용량과 비슷하게 나타나는 것으로 보아 5 mg/kg 보다 낮은 용량에서 암 전이 억제 활성이 포화되는 것을 알 수 있었다.
실험예 4: 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물의 독성 실험
상기 실험예 1, 2 및 실험예 3의 결과에서 in vitro in vivo 상에서 항침윤 활성이 우수하게 나타난 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물의 독성 정도를 평가하기 위하여 다음 실험을 실시하였다. 실험에 사용된 동물은 SD(Sprague-Dawley) 계통의 특정병원균 부재 랫드이며 군당 암수 5 마리씩 배치하였다. 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물은 0.5% 카르복시메틸셀룰로오스를 부형제로 하여 약물을 제조하였으며 최고 용량은 예비 실험 결과를 본 후 2000 mg/kg로 제조하였으며 그 아래 용량은 공비를 2로 하여 1000 mg/kg까지 최고 용량을 희석하여 사용하였고 랫드 한 마리당 20 mg/kg 용량으로 1회 경구 투여하였다. 그 후 모든 동물에 대하여 투여 당일에는 투여 직후 및 이후 6 시간까지는 매시간, 그 이후는 매일 1회 이상 투여 후 14일까지 이상 증상관찰을 실시하였다. 몸무게 측정은 투여 전, 투여 후 1, 3, 7 및 14 일에 하였으며 투여 14일 후 모든 생존동물을 에테르를 이용하여 마취시킨 후 개복하여 후대동맥을 절단하는 방법으로 방혈 치사시켜 육안적으로 모든 장기를 검사하였다. 만약 투여 후 1일 이후에 사망 동물이 발생 시 육안적 이상 장기의 조직은 10% 중성 포르말린액에 고정하고 필요한 경우에 병리 조직검사를 실시하기로 하였다. 실험의 통계학적 유의성은 SPSS 10.1을 이용한 일원배치 분산분석으로 검정하였다.
상기 실험 결과, 암수 SD 랫드에 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물을 투여한 모든 실험군에서 사망동물 및 아무런 이상 증상이 관찰되지 않아 20(S)-진세노사이드 Rg3을 50%(w/w) 함유한 조성물의 최소치사량(MLD : Minimal Lethal Dose, 죽음을 초래하는 한계 최소량)은 2000 mg/kg 이상인 것으로 판단하였다.
본 발명에 따르는 조성물은 진세노사이드 Rg3 단독에 비해 우수한 암전이 억제 효과를 나타낼 뿐만 아니라 부작용도 없어 암 예방 및 암 전이 억제에 효과적으 로 사용할 수 있다.

Claims (7)

  1. 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 ~ 80%(w/w)로 함유된 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 ~ 60%(w/w)로 함유된 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 20(S)-진세노사이드 Rg3이 40 ~ 60%(w/w)로 함유된 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.
  4. 제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 주사제 및 경구투여용 제제로 제형화된 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 조성물의 1일 경구 복용량이 성인 기준으로 10 ~ 200 mg인 것을 특징으로 하는 암 전이 억제용 조성물.
  6. 1) 파낙스 속 식물 및 이의 조직 배양물을 물, 극성 유기용매 또는 이들의 혼합용매로 된 추출용매로 추출하는 단계;
    2) 상기 추출단계에서 얻은 추출액을 감압 하에 농축하여 물에 현탁시킨 후 알칼리화하여 극성 유기용매로 추출하여 파낙사트리올계 사포닌을 분리하는 단계;
    3) 상기 파낙사트리올계 사포닌을 분리 후 남은 수층을 중화하여 극성 유기용매로 추출하여 파낙사다이올계의 사포닌을 분리하는 단계; 및
    4) 상기 파낙사다이올계 사포닌을 30 ~ 100 ℃에서 젖산으로 산 가수분해한 다음, 중화 후 극성 유기용매로 추출한 추출물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피로 클로로포름/메탄올/물(14:2:0.1 ~ 12:3:0.3)의 농도구배를 달리한 혼합용매를 용출제로 사용하여 20(S)-진세노사이드 Rg3이 20 ~ 80 %(w/w) 함유된 암 전이 억제 조성물을 제조하는 단계
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 청구항 1의 암 전이 억제용 조성물 제조방법.
  7. 제 5 항에 있어서, 상기 1) 단계의 극성 유기용매는 탄소수 1 ∼ 4 개인 저급 알콜이며, 상기 2), 3) 및 4)의 극성 유기용매는 디클로로메탄, 클로로포름, 디에틸 에테르, 에틸 아세테이트 및 이들의 혼합용매 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
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