KR20060133022A

KR20060133022A - 알루미노실리케이트를 사용한 트레할로스의 농축 방법

Info

Publication number: KR20060133022A
Application number: KR1020067021484A
Authority: KR
Inventors: 마티아스 보이; 마르쿠스 폼페이우스; 다니엘라 클라인; 마틴 폴커르트; 제임스 루벤 브라운
Original assignee: 바스프 악티엔게젤샤프트
Priority date: 2004-03-18
Filing date: 2005-03-18
Publication date: 2006-12-22
Also published as: RU2006136504A; US20080108113A1; BRPI0508863A; CA2559574A1; DE102004013736A1; NO20064549L; TW200604205A; WO2005090375A1; AU2005223347A1; ZA200607727B; JP2007535504A; AR048180A1; CN1696139A; EP1727823A1

Abstract

본 발명은 흡착제를 사용하여 용액으로부터 트레할로스를 농축하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 상기 흡착제가 알루미노실리케이트인 것을 특징으로 한다. 바람직하게는, 알루미노실리케이트는 제올라이트이다. 본 발명은 또한, 특히 다른 가치있는 생성물의 발효적 생산으로부터의 커플링된 생성물로서, 발효 배양액으로부터 트레할로스를 농축 및 정제하는 것에 관한 것이다.

트레할로스, 흡착제, 알루미노실리케이트, 제올라이트, 발효

Description

알루미노실리케이트를 사용한 트레할로스의 농축 방법 {METHOD FOR ENRICHING TREHALOSE WITH THE AID OF ALUMINOSILICATES}

하기 본 발명은 흡착제를 사용하여 용액으로부터 트레할로스를 농축하는 방법에 관한 것이다.

이당류인 트레할로스 (α-D-글루코피라노실-α-D-글루코피라노시드)는 α,α-1,1 결합을 통해 서로 공유결합되어 있는 2개의 글루코스 분자로 이루어져 있다. 트레할로스는, 성능 측면에서 그의 특성이 관심의 대상이 되고 있기 때문에, 산업상 중요성이 증가하고 있다. 중요한 응용 분야는 단백질 및 펩티드, 예를 들면 효소 및 백신을 안정화시키는 것이다. 트레할로스는 식품 산업에 바람직하게 사용된다. 트레할로스는, 저하된 당도 및 맛을 보존하는 특성 때문에, 수크로스 대용으로 사용되기도 한다. 또한, 트레할로스는 동결 및 건조 작업시 안정화 작용을 한다. 다른 응용 분야는 미용 부문이다.

트레할로스는 바람직하게는 효소에 의해 또는 적합한 미생물을 사용하는 발효에 의해 생성된다 (문헌 [Schiraldi, C., et al. (2002). Trehalose Production: Exploiting Novel Approaches. Trends in Biotechnology, vol. 20(10), pages 420-425]). 종종, 트레할로스는 다른 물질의 생성에 사용되는 발효에서 부산물로서 형 성되기도 한다 (문헌 [Hull, S.R., Gray, J.S.S., et　al. (1995). Trehalose as a Common Industrial Fermentation Byproduct. Carbohydrate Research, vol. 266, pages 147-152]). 특히, 발효의 경우에는, 화학적 합성 이외에도, 예를 들면 세포, 단백질, 지질 또는 다른 당을 함유할 수 있는 고도로 오염된 용액이 형성된다.

따라서, 트레할로스는 이와 같이 고도로 오염된 용액으로부터 농축되어야 하며, 의도하는 용도에 따라 추가로 정제되어야 한다.

종래에, 트레할로스에 대한 다양한 농축 및 정제 방법이 공지되어 있다.

US　5,759,610는 여과 및 원심분리 단계, 활성 탄소 처리 단계, 탈이온화 단계, 이온 교환제를 사용하는 정제 단계, 시럽 생성물 형성을 위한 농축 단계, 컬럼 크로마토그래피 기술 (예컨대, 이온-교환 컬럼 크로마토그래피, 활성 탄소 크로마토그래피 및 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피)에 의한 추가의 정제 단계, 유기 용매 (예컨대, 알콜 및 아세톤)를 사용한 침전 및 적합한 막을 통한 여과 단계, 및 임의의 잔류하는 당류를 제거 또는 분해 하기 위한 효모 발효 또는 알칼리 처리 단계를 포함하는, 미생물 배양액으로부터 트레할로스를 정제하는 방법을 기재하고 있다. 추가의 정제를 위해, 예를 들어 냉각 결정화 또는 분무 건조가 제안되어 있다. 여기서, 트레할로스를 흡착제에 흡착시키는 과정은 수행되지 않았다.

JP　07000190 (Tradashi, W., et al.)은 양조(brewery) 발효액의 고체 잔류물로부터 트레할로스를 단리하는 것을 기재하고 있다. 잔류물을 알콜로 처리하고/하거나 초음파로 처리하여 잔류물로부터 트레할로스를 추출한다. 또한, 잔류물에 존재하는 효소 트레할라제는 열 처리에 의해 불활성화된다. 특히, 정제는 이온-교환 컬럼 및 하나의 활성 탄소 컬럼을 통해 수행한다. 이 방법에서, 트레할로스는 컬럼에 흡착되지 않는다.

US　5,441,644는 발효 배양액으로부터 트레할로스를 정제하는 방법을 기재하고 있다. 이 방법에서는, 특히 활성 탄소를 사용하는 한외여과 및 탈색을 수행한다. 이 방법에서, 트레할로스는 활성 탄소에 흡착되지 않는다.

상기 방법들의 단점은 각각의 흡착제가 원치않는 외부 물질의 흡착을 위해서만 사용되고, 트레할로스 자체는 흡착시키지 않는 것으로 나타났다. 추출 및 정제 단계는 외부 물질에 따라 변형되어야 하기 때문에, 복잡하고, 산업상 규모에 적용하기 곤란하다. 특히, 이는 트레할로스 함량이 통상적으로 건조 중량의 15％ 미만인 발효 배양으로부터의 정제에 적용된다 (문헌 [Schiraldi et al. (2002), Trehalose Production: Exploiting Novel Approaches. Trends in Biotechnology, vol. 20(10), page 421]).

다른 방법에 따라, 트레할로스는 활성 탄소 및 바이오-겔 (Bio-Gel) P-2상에서의 순차적인 크로마토그래피에 의한 발효의 부산물로서 정제되었다 (문헌 [Hull, S.R., Gray, J.S.S., et　al. (1995). Trehalose as a Common Industrial Fermentation Byproduct. Carbohydrate Research, vol. 266, pages 147-152]). 그러나, 이 방법은 단지 검출 방법일 뿐, 산업상 규모에 적용하기에 적합한 방법은 아니다.

US　5,441,644는, 상기 기재된 방법 이외에도, 트레할로스-함유 아세토니트릴 용액을 실리카-겔 크로마토그래피에 의해 처리하는 종래의 추가의 방법을 언급하고 있다. 그러나, 이 간행물은 이들 크로마토그래피 방법이 산업상 규모의 트레할로스 농축 또는 트레할로스 정제에 적합하지 않다고 언급하고 있다.

문헌 [Buttersack et al., Specific Adsorption from Aqueous Phase on Apolar Zeolites, Progress in Zeolite and Microporous Materials, vol. 105, pp.　1723-1730, 1997]은 특정 단당류 및 이당류와 선택된 FAU, PEA 및 MFI 제올라이트의 결합을 기재하고 있다. 각 이당류에서, 매우 상이한 흡착 특성이 나타났다. 트레할로스는 연구되지 않았다.

추가의 연구에서, 문헌 [Buttersack et　al.]은 이당류와 상이한 Y 제올라이트 및 탈알루미늄화된 Y 제올라이트의 결합을 기재하고 있다 (문헌 [Buttersack et al. (1994). Adsorption of Glucose and Fructose containing Disaccharides on Different Faujasites. Studies in Surface Science and Catalysis, vol. 84, pp.　1363-1371]). 이들은 제올라이트와의 흡착에 대해 연구된 이당류에서 프룩토스 라디칼의 중요성을 강조하고 있다. 트레할로스는 연구되지 않았으며, 프룩토스 라디칼도 갖지 않는다.

종래 흡착제의 단점은 이들이 매우 일반적인 흡착 특성을 가지며, 각 방법에 대해 개별적으로 조정될 수 없다는 것이다.

이에 따라, 보다 양호한 흡착제를 사용하여 용액으로부터 트레할로스를 농축하는 방법이 요망되고 있으며, 특히 각 방법에 대해 최적인 흡착제가 요망되고 있다. 따라서, 본 발명의 목적은 상기와 같은 방법, 특히 크로마토그래피 방법에 사용하기 위한 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 추가 목적은 발효 배양액, 특히 리신 생성 발효 배양액으로부터 트레할로스를 농축할 수 있는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명자들은 상기 목적이 흡착제를 사용하여 용액으로부터 트레할로스를 농축하는 공지된 방법으로부터 출발하여 달성된다는 것을 발견하였다. 본 발명 방법의 특징은 흡착제가 알루미노실리케이트인 것이다.

선행 기술에 따라 사용되는 흡착제 (예를 들면, 활성 탄소 및 이온 교환제)에 비해, 알루미노실리케이트, 특히 제올라이트는 훨씬 더 많은 수의 변이체가 제조될 수 있다는 이점을 제공하며, 그 결과 이 흡착제가 분리 문제를 보다 양호하게 해결할 수 있다.

트레할로스는 다수의 공지된 방법에 의해 생성될 수 있다. 전통적으로, 트레할로스는 발효 방법에 의해 생성되며, 한편으로는 효소에 의한 생성 방법도 구축되었다 (문헌 [Schiraldi, C., et　al. (2002) Trehalose Production: Exploiting Novel Approaches. Trend in Biotechnology, vol.　20(10), pp.　420-425]). 미생물에서, 트레할로스 합성을 위한 3 가지 주요 효소 경로가 발견되었다: (1) 진균 및 효모의 포스포릴라제 시스템, (2) 중온성 및 고온성 박테리아의 글루코실트랜스퍼라제-히드롤라제 및 (3) 트레할로스-신타제에 의해 촉매되는 트레할로스로의 말토스의 글리코실화 (예를 들면, JP　09098779, KR99029104).

용어 "농축"은 당업자에게 공지되어 있다. 본 발명에 있어서, 용어 "농축"은 특히, 원치않는 외부 물질에 대하여 트레할로스의 비율을 증가시키는 것과 관련이 있다. 통상적으로, 트레할로스의 상기 비율은 생성물의 건조 중량에 상응한다.

바람직한 실시양태에서, 용어 "농축"은 또한 트레할로스의 정제와 관련이 있다. 용어 "정제"는 당업자에게 공지되어 있다. 본원에서, 정제의 목적은 특히 다른 물질에서 트레할로스가 실질적으로 존재하지 않는 트레할로스 순도를 달성하는 것이다. 이는 특히, 결정질 형태의 트레할로스를 의미한다.

농축 또는 정제 방법은 그 수율이 만족스러울 경우에만 경제적으로 적합하다. 따라서, 본 발명 방법의 추가의 목적은 고농축 뿐만 아니라 고수율을 달성하는 것이다.

용액과 관련하여, 용매에 대해 특별한 제한은 없지만, 사용될 수 있는 용매로는 예를 들어 물 또는 아세토니트릴이 있다. 바람직하게는, 용액은 수용액이다.

본 발명의 의미에 포함되는 흡착제는 다른 물질의 흡착이 일어나는 표면 상의 고체 또는 겔-유사 물질이다. 여기서, 용어 "표면"은 또한 삼차원 매트릭스의 내부 표면, 예를 들면 제올라이트의 삼차원 틀 구조의 내부 표면과 관련이 있다.

본 발명의 의미에 포함되는 흡착제의 예로는 실리카 겔, 활성 탄소 및 알루미노실리케이트가 있다.

알루미노실리케이트는 당업자에게 공지되어 있다. 용어 알루미노실리케이트는, 예를 들면 산-활성화된 벤토나이트 (표백토) 및 제올라이트를 포함한다. 산-활성화된 벤토나이트 (표백토)는, 산 처리에 의해 부분적으로 용해되고, 이에 따라 넓은 표면적 및 큰 세공 부피를 갖는 스멕타이트 (팽윤가능하거나 점토성 광물임)인 벤토나이트이다. 벤토나이트는 화산회 (튜퍼; tufa)의 풍화에 의해 형성되며 몬트모릴로나이트 및 베이델라이트 광물 (스멕타이트 광물 군)로 이루어진 점토이다.

본 발명에서 특히 바람직한 알루미노실리케이트는 제올라이트이다. 여기서, 알루미늄을 함유하지 않는 제올라이트가 본 발명에 포함될 수도 있다.

제올라이트는 광범위하게 분포된 결정질 실리케이트 군, 보다 정확하게는 일반식 M₂/_zOㆍAl₂O₃ㆍxSiO₂ㆍyH₂O (여기서, M = 1가 또는 다가의 금속 (통상적으로는, 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 양이온) H 또는 NH₄ 등, z = 양이온의 원자가, x = 1.8 내지 약 12, 및 y　=　0 내지 약 8)의 물-함유 알칼리 금속 또는 알칼리 토금속 알루미노실리케이트이다. Al₂O₃에 대한 SiO₂의 화학량론적 비(비율)은 제올라이트의 중요한 파라미터이다.

제올라이트의 결정 격자는 산소 브릿지를 통해 연결된 SiO₄ 및 AlO₄ 사면체로부터 구축된다. 이는, 서로 크기가 동일한 채널 또는 세공 개구부를 통해 접근한가능한, 동등하게 구축된 (흡착) 공동의 공간에 배열을 형성한다. 이러한 유형의 결정 격자는, 세공 개구부보다 작은 단면을 갖는 분자는 격자의 공동으로 투과시키고, 보다 큰 분자는 투과시키지 못하는 체(sieve)로 작용할 수 있다. 따라서, 제올라이트는 또한 분자체로 지칭된다. 정전기적 상호작용, 수소 결합 및 다른 분자간 힘도 흡착에 작용할 수 있다. 제올라이트의 화학적 및 물리적 성질은 대부분 Al 함량에 따라 달라진다.

본 발명에 있어서, 용어 "제올라이트"는 천연 제올라이트 뿐만 아니라 합성 제올라이트와 관련이 있다.

자연 발생 제올라이트는 화산 유리 또는 튜퍼-함유 퇴적물로부터 열수 전환에 의해 형성된다. 이들의 결정 격자에 따라, 천연 제올라이트는 사상 제올라이트 (예를 들면, 모르데나이트 (MOR)), 엽상 제올라이트 및 입방형 제올라이트 (예를 들면, 파우자사이트 (FAU) 및 오프레타이트 (OFF))로 분류될 수 있다. 상이한 제올라이트는 통상적으로 3-문자 코드 (예를 들면 MOR, FAU, OFF)로 주어진다.

합성 제올라이트를 제조하기 위해, 출발 물질로 SiO₂-함유 물질 (예를 들면, 물유리, 실리카 충전재, 실리카 졸) 및 Al₂O₃-함유 물질 (예를 들면, 수산화알루미늄, 알루미네이트, 카올린)이 사용되며, 이들은 알칼리 금속 수산화물 (통상적으로는, NaOH)과 함께 50 ℃가 넘는 온도의 수성 상에서 결정질 제올라이트로 전환된다.

흡착제로서의 산업상 용도를 위해, 합성 제올라이트는 추가로 변형시킬 수 있다.

바람직하게는, 제올라이트의 세공 크기는 7　Å 이상이어야 한다. 제올라이트의 세공 크기 및 극성은, 예를 들면 상이한 당의 분포 중량에 영향을 끼쳐, 예를 들면 크로마토그래피 적용에 분리 특성을 제공한다. 알루미늄 저함유 제올라이트는 일반적으로 극성이기 때문에 우선적으로 당을 흡착시킨다.

앞서 이미 기재한 바와 같이, 제올라이트는 분리 문제를 용이하게 해결할 수있다. 1차 제조는 세공 크기에 영향을 끼칠 수 있으며, 이어서 극성은 알루미늄 함량 감소에 의한 후처리를 통해 달라질 수 있다.

본 발명에 있어서 바람직한 제올라이트는 FAU, BEA 및 OFF이다. 본 발명에서 상이한 제올라이트의 이로운 특성은 각각 실시예 1에서 볼 수 있다. OFF가 특히 바람직하다.

알루미노실리케이트를 사용하는 농축은 이론적으로 2 가지 상이한 방법으로 수행할 수 있다. 알루미노실리케이트는 원치않는 외부 물질을 흡착시켜 트레할로스를 용액에 잔류시키거나, 또는 트레할로스를 흡착시켜 원치않는 외부 물질을 용액에 잔류시킬 수 있다. 두 경우 모두에서, 흡착은 가능한 선택적으로 일어나는 것이 바람직하다.

흡착제로서, 고정층, 이동층 및 유동층 흡착제를 사용할 수 있다. 흡착은 배치식으로 또는 연속적으로 수행할 수 있다.

트레할로스가 알루미노실리케이트에 흡착되는 실시양태에서, 다수의 이점이 발생한다. 트레할로스 단리를 위해 필요한 후처리 단계의 수는, (매우 다양한 원치않는 외부 물질을 단계적으로 제거해야 하는 종래의 트레할로스 단리 방법과는 달리) 트레할로스의 선택적인 농축에 의해 감소된다. 부산물/폐기 스트림의 수는 원치않는 외부 물질의 단계식 제거에 비해 감소된다. 트레할로스는, 선택적인 흡착 때문에, 알루미노실리케이트를 사용하는 1차 농축 단계 후에도 높은 순도로 존재한다. 후처리 단계 수의 감소 및 부산물/폐기 스트림 수의 감소에 의해, 생산 비용이 절감된다. 또한, 비교적 낮은 농도의 트레할로스는 선택적인 농축에 의해 비용면에서 효율적으로 농축된다.

따라서, 상기 실시양태에서 바람직한 알루미노실리케이트는 알루미노실리케이트, 특히 제올라이트로, 여기에 트레할로스가 흡착되고, 바람직하게는 용액에 존재하는 원치않는 외부 물질에 비해 높은 선택도로 결합된다.

트레할로스를 알루미노실리케이트에 흡착시킨 후에, 추가의 단계로서 트레할로스를 알루미노실리케이트로부터 용출시킬 수 있다. 이는, 예를 들면 메탄올, 에탄올, 물, 온수 (50 내지 100 ℃), 고온 메탄올 (50 내지 65 ℃), 고온 에탄올 (50 내지 80 ℃) 또는 다른 적합한 용리액, 예를 들면 염화메틸렌, 아세토니트릴, NMP (N-메틸-2-피롤리돈), DMSO (디메틸 술폭시드), 단쇄 케톤 또는 단쇄 에테르를 사용하는 용출에 의해 용출된다. 여기서, 단쇄란 길이가 C10 이하, 바람직하게는 C6 이하, 특히 바람직하게는 C4 이하인 쇄를 의미한다.

본 발명의 추가의 실시양태는 흡착제가 크로마토그래피 분리에 사용되는 트레할로스 농축 방법에 관한 것이다. 크로마토그래피 방법에서, 트레할로스는 용액에 존재하는 다른 물질에 비해 상이한 수행 시간 반응을 통해 분리될 수 있다. 이는 트레할로스를 함유하는 용출액이 포함된 분획을 생성한다.

본 발명의 의미에서, 용어 "크로마토그래피"는 모든 공지된 적합한 크로마토그래피 분리 방법, 예를 들면 고정층 크로마토그래피, 이동층 크로마토그래피 및 모의 이동층 크로마토그래피를 포함한다. 크로마토그래피는 배치식으로 또는 연속적으로 수행할 수 있다. 연속적인 크로마토그래피는, 예를 들면 연속 회전 환상 크로마토그래피 (CRAC), 참 이동층 크로마토그래피 (TMBC) 또는 모의 이동층 크로마토그래피 (SMB)를 이용하여 수행할 수 있다.

트레할로스-함유 용출액으로부터, 당업자에게 공지된 적합한 추가의 방법에 의해 농축 또는 정제를 더 수행할 수 있다.

예를 들면, 트레할로스의 추가의 농축 또는 정제는 침전에 의해 수행될 수 있다. 이 단계에서, 원하는 가치있는 물질이나 또는 원치않는 외부 물질이 침전될 수 있다. 침전은, 특히 추가의 용매를 첨가하거나, 염을 첨가하거나, 또는 온도를 변화시켜 개시될 수 있다. 생성된 고체 침전물은 당업자에게 공지된 방법에 의해 분리할 수 있다.

예를 들면, 고체는 압력 여과 및 진공 여과와 같은 여과에 의해 분리될 수 있다. 또한, 케이크 여과, 심부 여과 및 횡류 여과를 이용할 수도 있다. 횡류 여과가 바람직하다. 0.1 ㎛ 초과의 고체를 분리하는 경우에는 미세여과가 특히 바람직하다.

고체를 분리할 수 있는 추가의 방법은 침강 및/또는 원심분리이다. 원심분리의 경우, 다양한 유형의 구성, 예를 들면 튜브 및 바스켓 원심분리기, 특히 푸셔, 전도 여과 원심분리기 및 원반형 분리기를 이용할 수 있다.

추가의 농축 또는 정제 단계로서, 활성 탄소 처리 또는 이온 교환제 (음이온 교환제 및/또는 양이온 교환제) 처리를 수행할 수 있다. 이러한 유형의 방법의 단계는 선행 기술로부터 공지된 것이다 (예를 들면, US　5,441,644, US　5,858,735 및 EP　0　555　540　A1 참조).

농축, 특히 정제를 수행할 수 있는 추가의 방법은, 미세여과 및 한외여과 (예를 들면, 케이크, 심부 및 횡류 여과 기술로서) 및 역삼투를 이용하는 것이다. 이 경우에, 특히, 세공성, 균질성, 비대칭성, 및 하전된 막들이 사용될 수 있으며, 이들은 공지된 방법에 의해 제조된다. 막에 사용되는 통상적인 재료는 셀룰로스 에스테르, 나일론, 폴리(염화비닐), 아세토니트릴, 폴리프로필렌, 폴리카르보네이트 및 세라믹이다.

막은, 예를 들면 판상 모듈, 나선형 모듈, 튜브 다발 및 중공사 모듈로 사용될 수 있다. 또한, 액상막을 사용할 수도 있다. 트레할로스는 공급 측면에서 농축되어 잔류물 스트림을 통해 분리할 수 있을 뿐 아니라, 공급 측면에서 방출하여 여액/투과액 스트림을 통해 분리할 수도 있다.

트레할로스의 추가 농축, 특히 정제 및 최종 처리를 위해, 당업자에게 공지된 다양한 방법이 이용될 수 있다. 여기서, 바람직한 방법은 결정화 방법이다. 결정화는 예를 들면 냉각, 증발, 진공 결정화 (단열 냉각), 반응물 결정화 및 염석에 의해 달성될 수 있다. 결정화는, 예를 들면 교반 탱크 및 비교반 탱크, 직접-접촉 방법, 증발성 결정화제, 배치식 또는 연속 진공 결정화제, 예를 들면 강제순환 결정화제 (스웬슨 (Swenson) 강제순환 결정화제) 또는 유체-베드 결정화제 (오슬로형; Oslo type)를 사용할 수 있다. 분별 결정화도 이용할 수 있다.

수용액으로부터의 결정화를 비롯한 트레할로스의 결정화는 이론상 당업자에게 익숙한 것이며, 널리 기재되어 있다 (US　5,441,644의 컬럼 4 및 5 참조). 예를 들어, 결정화는 종래의 한외여과에 의해 달성될 수 있다.

특히 전형적인 트레할로스 결정화 방법은 적합한 용매, 예를 들면 에탄올, 메탄올, 물, 염화메틸렌, 아세토니트릴, NMP, DMSO, 단쇄 케톤 또는 단쇄 에테르로부터 냉각 결정화시키는 방법이다. 여기서, 단쇄란 길이가 C10 이하, 바람직하게는 C6 이하, 특히 바람직하게는 C4 이하인 쇄를 나타낸다.

다른 결정화 방법은 침전 결정화이다. 이 방법에서, 트레할로스는 예를 들면 물에 존재하며, 이어서 용해도가 더 낮은 용매, 예를 들면 단쇄 알콜 또는 단쇄 케톤을 첨가하여 침전시킨다. 여기서, 단쇄란 길이가 C10 이하, 바람직하게는 C6 이하, 특히 바람직하게는 C4 이하인 쇄를 나타낸다.

결정화는 결정화 시드로 작용하는 트레할로스 결정을 소량 첨가하여 가속화시킬 수 있다.

트레할로스의 추가 농축, 특히 정제 및 최종 처리를 위한 추가의 방법으로는 건조법이 있다. 대류 건조, 예를 들면 건조 오븐, 터널 건조기, 벨트 건조기, 디스크 건조기, 제트 건조기, 유체-베드 건조기, 탄산가스 함유된 회전 드럼 건조기, 및 분무 건조 방법이 존재한다. 본 발명에서 바람직한 방법은 분무 건조 방법이다. 추가의 방법은 접촉 건조, 예를 들면 블레이드 건조기를 사용한다. 이와 마찬가지로, 방열 (적외선 조사) 및 유전체 에너지 (마이크로파)를 건조에 사용할 수 있다. 추가의 분야는 진공 또는 동결 건조이다. 응축 (이는 농축을 유도하는 건조법이지만, 반드시 건조되는 것은 아님) 또한 이용할 수 있다.

추가의 트레할로스 농축, 특히 정제 및 최종 처리를 위한 추가의 방법은 나노여과법이다. 이 방법에서, 트레할로스는 잔류물 측면에 전체적으로 또는 부분적으로 잔류하여 농축된다.

상기 추가 농축 단계는 본 발명에서의 알루미노실리케이트 처리 전 뿐만 아니라 처리 후에도 수행할 수 있다는 것이 당업자에게 명백하다.

추가의 실시양태에서, 본 발명은 효소에 의한 트레할로스의 합성으로부터 유래된 용액으로부터 트레할로스를 농축하는 방법에 관한 것이다. 효소에 의해 트레할로스의 합성은 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Schiraldi et al. (2002), Trehalose Production: Exploiting Novel Approaches. Trends in Biotechnology, vol. 20(10), pages 421-425], 및 US　5,919,668 및 EP　0　990　704　A2 참조).

추가 실시양태에서, 상기 용액은 발효 배양액이다.

본 발명의 의미에 속하는 발효 배양액은 진핵 생물 및 원핵 생물, 특히 미생물 (예를 들면, 박테리아, 효모 또는 다른 진균) 배양액에서 제조된다.

트레할로스의 합성에 바람직한 미생물은 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종, 특히 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae); 바실러스 (Bacillus) 종; 칸디다 (Candida) 종, 특히 칸디다 페르멘티 (Candida fermentii); 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli); 코리네박테리움 (Corynebacterium) 종, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 코리네박테리움 아세토아시도피룸 (Corynebacterium acetoacidofirum) (예를 들면, ATCC 13870), 코리네박테리움 릴리움 (Corynebacterium lilium) (예를 들면, ATCC 15990) 및 코리네박테리움 멜라세콜라 (Corynebacterium melaseccola) (예를 들면, ATCC 17965); 슈도모나스 (Pseudomonas) 종; 노카르디아 (Nocardia) 종; 브레비박테리움 (Brevibacterium) 종, 특히 브레비박테리움 락토페르멘툼 (Brevibacterium lactofermentum) (예를 들면, ATCC 13869), 브레비박테리움 플라붐 (Brevibacterium flavum) (예를 들면, ATCC 14067) 및 브레비박테리움 디바리카티움 (Brevibacterium divaricatium) (예를 들면, ATCC 21642); 아트로박터 (Arthrobacter) 종, 특히 아트로박터 술푸레이스 (Arthrobacter sulfureis) (예를 들면, ATCC 15170), 아트로박터 시토레우스 (Arthrobacter citoreus) (예를 들면, ATCC 11624); 아스페르길루스 (Aspergillus) 종; 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종; 마이크로박테리움 (Microbacterium) 종, 특히 마이크로박테리움 암모니아필룸 (Microbacterium ammoniaphylum) (예를 들면, ATCC 15354); 피치아 (Pichia) 종; 필로바시디움 (Filobasidium) 종, 특히 필로바시디움 플로리포르메 (Filobasidium floriforme)이다.

추가로 적합한 미생물이 당업자에게 공지되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Miyazaki, J.-I., et al. (1996)., Trehalose acumulation by a basidiomycotinous yeast, Filobasidium floriforme. Journal of Fermentation and Bioengineering, vol. 81(4), pages 315-319] 참조).

돌연변이 또는 유전자 변형에 의해 유래되었거나, 또는 증가된 트레할로스 합성 능력을 갖는 상기 균주들의 변이체도 본 발명에 사용될 수 있다.

또한, 상기 미생물들은 적합한 항생제를 첨가하여 배양할 수 있는데, 예를 들면 β-락탐 고리 항생제를 첨가함으로써 트레할로스 합성을 유도한다.

이 경우에 발효 배양액은 1차적으로 세포 뿐만 아니라 배양 배지도 포함한다. 발효 유형에 따라, 트레할로스의 상당 부분이 세포 내에 축적될 수 있다. 이러한 경우에, 사용된 세포를 분해시키고, 적합한 방법을 이용하여 트레할로스를 추출하기 적합하다. 적합한 방법, 예를 들면 초음파 처리, 디터전트 처리, 알칼리성 용해 및/또는 알콜 또는 트리클로로아세트산을 사용하는 추출이 당업자에게 공지되어 있다 (JP　07　000　190, US　5,441,644).

발효 배양액에는, 일반적으로 1차적으로 분리되어야 바람직한 고체가 상당량 존재한다.

용어 "고체"는 또한 본원에서 세포 및 세포 성분 (예컨대, 핵산 및 단백질)을 포함한다. 고체, 특히 세포 성분을 분리하기 위해, 우선 이들을 응집시키는 것이 유리하다. 이는 임의의 적합한 방법으로 수행될 수 있지만, 트레할로스 분해의 경우 (예를 들면, 가수분해에 의한 분해)에는 대부분 피해야 한다. 적합한 방법은, 예를 들면 알칼리 처리, 예를 들면 Ca(OH)₂ 처리, 또는 가열을 포함한다. 유리하게도, 이 경우에, 존재할 수 있는 트레할라제 활성을 갖는 효소도 불활성화된다.

이어서, 고체를 당업자에 공지된 방법에 의해 분리할 수 있다. 이러한 방법의 예는 이미 상기에 언급되어 있다.

본 발명의 방법은 또한 발효 배양액의 건조 중량을 기준으로, 트레할로스가 낮은 농도 (특히, 15 중량％ 미만)로 존재하는 용액, 특히 발효 배양액으로부터 트레할로스를 농축하기에 적합하다.

전형적으로, 트레할로스 농도는 발효 배양액의 건조 중량을 기준으로 3 내지 8 중량％이다. 다른 가치있는 생성물 (예를 들면, 리신)을 분리한 후에, 트레할로스의 질량 분획을 나머지 발효 배양액의 건조 중량을 기준으로 10 내지 20 중량％로 증가시킬 수 있다. 출발 지점에서 불용성 성분으로서의 바이오매스(biomass) 분리가 이용된다면, 트레할로스 농도는 발효 배양액의 건조 중량을 기준으로 20 내지 40 중량％이다.

따라서, 본 발명의 추가의 실시양태는 또한 트레할로스가 발효 배양액의 건조 중량을 기준으로 15 중량％ 미만의 농도로 존재하는 발효 배양액으로부터 트레할로스를 농축하는 방법이다.

다수의 발효법에서, 다수의 가치있는 생성물이 생성된다. 종종, 트레할로스는 추가의 가치있는 생성물로 생성된다. 이 경우의 문제는 발효에 의해 생성된 물질의 농축 또는 정제 방법이 각각의 가치있는 생성물에 대해 특이적으로 변형되어야 한다는 것이다 (예를 들면, 아미노산 또는 유기산의 경우, 이온 교환 크로마토그래피를 통한 정제를 이용함). 제1의 가치있는 생성물을 농축한 후에, 트레할로스와 같은 다른 가치있는 생성물이 추가의 가치있는 생성물의 농축을 방해하는 환경에 실제로 존재한다. 이온 교환 매트릭스로부터 아미노산을 용출한 후의 높은 이온 농도가 그 예이다. 이는, 트레할로스가 간단한 농축에 적합한 특별한 화학적 성질 (예를 들면, 수용액에서의 낮은 용해도 또는 전하량)을 갖지 않기 때문에, 트레할로스의 경우에 특히 문제가 된다. 따라서, 트레할로스는 발효액로부터의 폐기 스트림과 함께 배치되기도 한다.

따라서, 본 발명의 추가 목적은 제1의 가치있는 생성물이 이전에 후처리되었거나 또는 후속적으로 후처리될 발효 배양액으로부터 수득한 추가의 가치있는 생성물로서 트레할로스를 후처리하는 것이다.

따라서, 추가 실시양태에서, 본 발명은 고체를 분리하고, 흡착제를 사용하는 트레할로스를 농축하는 단계(이 때, 흡착제는 알루미노실리케이트임)를 포함하는, 1종 이상의 제1의 가치있는 생성물이 수득되었거나 이를 수득하는 발효 배양액으로부터의 추가의 가치있는 생성물로부터 트레할로스를 농축하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 방법은 특히 트레할로스가 존재하는 용액의 특성에 대해 허용성을 갖는다는 점에서 구별된다. 따라서, 본 발명의 방법은 트레할로스가 통상적으로 농축을 방해하는 환경에 존재하는 경우에 사용될 수도 있다.

반대로, 트레할로스가 존재하는 용액은 본 발명의 방법에 의해 특히 부드럽게 처리하여 트레할로스를 농축한 후에도 추가의 가치있는 생성물을 수득할 수 있도록 한다.

따라서, 트레할로스는 제1의 가치있는 생성물을 수득하기 전에, 후에, 또는 동일한 시점에 수득할 수 있다.

본 발명의 의미에 포함되는 가치있는 생성물은, 예를 들면 유기산, 단백질원성 및 비-단백질원성 아미노산, 뉴클레오티드 및 뉴클레오시드, 지질 및 지방산, 디올, 탄수화물, 방향족 화합물, 비타민 및 보조-인자, 저장 물질, 예를 들면 PHA (폴리히드록시알카노에이트) 또는 PHB (폴리히드록시부티레이트), 및 단백질 및 펩티드 (예를 들면, 효소)를 포함한다.

본 발명에 있어서 바람직한 제1의 가치있는 생성물은 리신 아미노산이다.

예시적 실시양태에서, 추가의 방법들이 다른 가치있는 생성물을 이미 수득한 발효 배양액으로부터 트레할로스를 정제하는데 적합한 것으로 밝혀졌다.

도면 및 실시예는 본 발명의 보다 상세하게 설명하기 위해 제공된다.

첨부된 도면은 다음을 도시하고 있다.

도 1. 제올라이트의 수크로스 (sac) 및 말토스 (malt)에 대한 선택도와 트레할로스 (tre)에 대한 선택도의 비교.

도 2. 선택된 제올라이트의 세공 크기 (p)와 관련된 수크로스 (sac) 및 말토스 (malt)에 대한 선택도와 트레할로스에 대한 선택도의 비교.

세공 크기 결정: 원자가 중심에 위치한 공간-충전된 구를 사용하여, MSI 프로그램 머터리얼 스튜디오 (MSI Program Material Studio)에 정의된 바와 같이, 원자에 대한 반데르발스 부피, 반데르발스 반지름에 상응하는 구의 반지름을 나타내었다. 0.9의 팽창 인자를 제올라이트 세공 내 원자의 반데르발스 반지름에 적용한 후에, 헬륨 원자를 세공의 중앙에 위치시켰다. 헬륨 원자 반데르발스 반지름에 대한 팽창 인자는, 헬륨 원자의 팽창된 공간-충전 부피가 제올라이트 세공의 공간-충전 부피와 접하게 될 때까지 수동으로 최적화시켰다. 이 헬륨 팽창 인자는 세공 (세공 크기)의 팽창 인자로서 사용된다.

도 3. 선택된 제올라이트의 세공 크기 (p)와 관련된 탄화수소에 대한 선택도.

실시예 1

다양한 제올라이트에서의 당의 확산을 정량적으로 비교하기 위해, 이론적으 로 계산하였다. 이 때, 확산 좌표에 따라 통상적인 동적 분자 모의실험을 수행하였다. 확산 좌표는 가장 넓은 공경 또는 가장 넓은 채널의 축을 따라 적용되는 작은 구동력에 의해 결정하였다. 이는 농도 구배의 효과를 흉내낸다.

우선, 상기 모의실험이 정확한 결과를 도출하는지 알아보기 위한 연구를 수행하였다. 이러한 목적을 위해, FAU 및 BEA에서의 말토스 및 수크로스에 대해 계산된 확산 시간을 실험 측정값과 비교하였다. 계산법에 따라, 말토스는 FAU를 통해 트레할로스 및 수크로스보다 훨씬 느리게 확산된다 (표 1 참조). 이는 말토스가 수크로스보다 현저하게 낮은 흡착 능력을 갖는다는 것을 보여주는 실험 결과와 일치하는 것이다.

BEA의 경우, 수크로스는, 이용된 시간 스케일의 측면에서, 제올라이트를 통해 전혀 이동하지 못하는 것으로 계산되었다 (표 2 참조). 이러한 효과 (비흡착)는 실험에서 측정된 다른 1 내지 2개의 프룩토스 이당류의 일반적인 특성이다. BEA 및 FAU에 대한 상기 결과로부터, 상기 계산법에 의해 말토스 및 수크로스의 FAU 및 BEA에 대한 상대적인 "용해도"가 정량적으로 정확하게 예측된다는 결론이 나왔다.

우선, 트레할로스, 말토스 및 수크로스 분리에 적합한 제올라이트에 대해 후보물질의 목록을 만들었다 (표 1).

	실제 조성	계산된 조성
DON	[Si₆₄O₁₂₈]ㆍ2(Cp^*)2 CoF₀ _.75(OH)_0.25)	Si₆₄O₁₂₈
EMT	Na₂₁(18-크라운-6)_n[Al₂₁Si₇₅O₁₉₂]	Al₂₁Si₇₅O₁₉₂
CFI	[Si₃₂O₆₄]	Si₃₂O₆₄
MOR	Na₈[Al₈Si₄₀O₉₆]ㆍ24H₂O	Si₄₀O₉₆
MAZ	(Na₂,K₂,Ca,Mg)₅[Al₁₀Si₂₆O₇₂]ㆍ28H₂O	Al₁₀Si₂₆O₇₂
OFF	(Ca,Mg)_1.5K[Al₄Si₁₄O₃₆]ㆍ14H₂O	Si₁₈O₃₆
FAU	(Na₂,Ca,Mg)₂₉[Al₅₈Si₁₃₄O₃₈₄]ㆍ240 H₂O	Al₉₆Si₉₆O₃₈₄
BEA	Na_n[Al_nSi₆₄ _- _nO₁₂₈]	Si₆₄O₁₂₈

이어서, 3 가지 당 모두에 대해 상기 제올라이트를 사용하여 동적 분자 모의실험을 수행하였다. 이 방법으로, 상응하는 채널을 통한 확산에 대한 당의 상대적인 선택도를 계산할 수 있었다.

298　K의 미세정준 집합에서 동적 분자력장 모의실험을 수행하였다. 정전기력에 의해 제올라이트 구조의 세공을 통해 구동된 분자에 대해 상대적인 시간을 측정하였다. 이 힘은 하전된 헬륨 원자의 좌표를 분자 세공의 반대편으로 고정시킨 후에, 이 분자를 각각의 원자에 상응하는 반대전하로 균일하게 하전시키는 방법에 의해 생성된다. 예를 들면, 헬륨 원자의 전하량은 +1.5　q이지만, 헬륨에 가장 근접한 트레할로스의 5개 분자에는 각각 -0.3　q의 전하량이 할당되었다. 계 내의 나머지 원자는 하전시키지 않았다. 도 1의 선택도는 하기 식에 따라 계산하였다:

선택도 =

(여기서, t_당이 8000 ps를 초과하는 경우, t_당 = 8000)

당에 대해 계산된 확산 시간을 표 2에 기재하였다.

	트레할로스	수크로스	말토스
FAU	1500	2400	8000
BEA	1500	8000	3900
DON	2400	4400	2700
EMT	5100	4500	3000
CFI	1700	1200	1200
MOR	2400	1600	1950
MAZ	1800	1700	1800
OFF	2000	8000	8000

선택도의 그래프를 도 1에 도시하였다. 도 1로부터, 당의 혼합물로부터 트레할로스를 분리하는 각 제올라이트의 능력이 상이하다는 것이 명확해졌다. 대부분의 제올라이트는 알루미늄을 함유하지 않는 OFF (오프레타이트)로, 다른 2 가지 당에 비해 트레할로스를 현저하게 선호하는 것으로 나타났다. 이와 마찬가지로, FAU 및 BEA는 트레할로스에 대해 높은 상대적인 선택도를 나타낼 뿐만 아니라, 수크로스 및 말토스에 대해 특정 선택도를 나타내었다.

실시예 2

수산화칼슘을 사용하는 침전에 의한 트레할로스의 농축, 원심분리에 이은 활성 탄소 처리, 및 잔류물의 건조

리신 발효 배양액 1　ℓ를, 리신을 이온 교환제 상에서 분리한 후에, 고형 수산화칼슘 250　g과 혼합하였다. 현탁액을 4 시간 동안 교반한 후에, 현탁액을 실험실용 원심분리기에서 10 분 동안 3000　g에서 원심분리하였다. 그 결과, 진한 갈색 발효 배양액으로부터 황색빛 상층액 800 ml를 수득하였으며, 이 상층액은 처음 사용된 트레할로스 8　g 중 7.6　g을 함유하였다. 상기 상층액을 추가로 정제하기 위해, 분쇄된 활성 탄소 400　g을 첨가하였다. 실온에서 12 시간 동안 인큐베이션한 후에, 활성 탄소를 홈이 파인 필터를 통해 분리하였다. 연한 황색빛 여액 650　ml를 수득하였으며, 이는 트레할로스를 총 6.3　g 함유하였다. 마지막으로, 여액을 동결건조시켰다. 나머지 잔류물 9.7　g의 트레할로스 함량은 64.9 중량％였다.

실시예 3

수산화칼슘을 사용하는 침전에 의한 트레할로스의 농축, 여과에 이은 활성 탄소 처리, 및 잔류물의 건조

실시예 2와는 달리, 수산화칼슘을 침전시킨 후에, 형성된 고체를 여과에 의해 분리하였다. 이로부터 황색빛 여액 730　ml이 생성되었다. 추가 절차를 실시예 2와 유사한 방법으로 수행한 결과, 트레할로스 함량이 66.2 중량％인 무수 잔류물 8.7　g을 수득할 수 있었다.

실시예 4

열에 의해 유도되는 침전에 의한 트레할로스의 농축, 횡류 여과에 이은 활성 탄소 처리, 및 잔류물의 건조

실시예 5

수산화칼슘을 사용하는 침전에 의한 트레할로스의 농축, 원심분리에 이은 활성 탄소 처리, 잔류물 (새롭게 후처리하여 수득한 배양액)의 건조

리신 발효 배양액 1　ℓ를, 리신을 이온 교환제 (트레할로스 함량: 11　g/l) 상에서 분리한 후에, 고체 수산화칼슘 100　g과 혼합하였다. 현탁액을 4 시간 동안 교반한 후에, 현탁액을 실험실용 원심분리기에서 10 분 동안 3000　g에서 원심분리하였다. 활성 탄소 20　g을 생성된 암갈색 상층액 800　ml에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 19 시간 동안 인큐베이션하였다. 활성 탄소를 여과에 의해 분리하였다. 여액은 트레할로스 8.9　g을 함유하였다. 진공에서 농축시킴으로써, 트레할로스 함량이 10.4 중량％인 암갈색의 점성 잔류물 72.6　g을 수득하였다.

실시예 6

활성 탄소로의 흡착에 의한 트레할로스의 농축 및 메탄올을 사용한 탈착

트레할로스 함유 발효 배양액 (함량 9.76　g/l) 100　ml를 활성 탄소 (CPG 1240) 10　g과 함께 실온에서 16 시간 동안 진탕시켰다. 슬롯 스크린 석션 필터(slotted screen suction filter)를 통한 석션으로 혼합물을 여과한 후에, 활성 탄소를 메탄올 100　ml와 함께 실온에서 60　시간 동안 진탕시켰다. 다시 새롭게 여과한 후에, 여액을 농축시켜 회전 증발기 상에서 건조시켰다. 갈색 잔류물 1.1　g이 트레할로스 300　mg을 함유하였다 (27 중량％).

실시예 7

활성 탄소로의 흡착에 의한 트레할로스의 농축 및 냉각 결정화하에서 에탄올을 사용한 탈착

트레할로스 용액 (함량 9.25　g/l) 300　ml를 활성 탄소 20　g과 함께 실온에서 18 시간 동안 진탕시켰다. 슬롯 스크린 석션 필터를 통한 석션에 의해 혼합물을 여과한 후에, 활성 탄소를 에탄올 300　ml와 혼합하고, 환류하에 15 시간 동안 교반하였다. 활성 탄소를 고온에서 여과하고, 여액을 0 내지 5℃로 냉각시켜 트레할로스를 결정화시켰다. 석션으로 혼합물을 여과한 후에, 트레할로스 1.3　g을 밝은 회색 결정으로 수득하였으며, 여액을 농축시켜 회전 증발기 상에서 건조시킨 결과, 생성물은 트레할로스 0.1　g을 백색 결정으로 함유하였다.

활성 탄소를 여과한 후에 MeOH 300　ml와 함께 실온에서 16 시간 동안 진탕시키고, 여과하여 분리하고, 여액을 회전 증발기 상에서 농축시켜, 트레할로스 0.5　g을 실질적인 백색 결정으로서 추가로 수득하였다.

실시예 8

실리카 겔로의 흡착에 의한 트레할로스의 농축 및 메탄올을 사용한 탈착

트레할로스 함유 발효 배양액 (함량 14　g/l) 100　ml를 실리카 겔 (MR3482) 10　g과 함께 실온에서 19 시간 동안 진탕시켰다. 유리 석션 필터를 통한 석션을 이용하여 혼합물을 여과한 후에, 실리카 겔을 메탄올 100　ml와 실온에서 16 시간 동안 진탕시켰다. 여과를 반복한 후에, 여액을 농축하여 회전 증발기 상에서 건조시켰다. 갈색 잔류물 1.5 g은 트레할로스 110　mg을 함유하였다 (7 중량％).

Claims

흡착제를 사용하여 농축하며, 이 때 상기 흡착제는 알루미노실리케이트인, 용액으로부터 트레할로스를 농축하는 방법.
제1항에 있어서, 알루미노실리케이트가 제올라이트인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 트레할로스가 알루미노실리케이트에 흡착되는 것인 방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제올라이트가 FAU, BEA, DON, EMT, CFI, MOR, MAZ 및 OFF로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 흡착제가 크로마토그래피 과정 중에 사용되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 용액이 효소에 의한 트레할로스 합성으로부터 유래된 것인 방법.
고체를 분리하고, 흡착제를 사용하여 트레할로스를 농축하는 단계를 포함하 며, 이 때 상기 흡착제는 알루미노실리케이트인, 발효 배양액으로부터 트레할로스를 농축하는 방법.
제7항에 있어서, 트레할로스와는 별도로 1종 이상의 가치있는 추가 생성물을 발효 배양액으로부터 분리하는 것인 방법.
제7항 또는 제8항에 있어서, 발효 배양액이 사카로마이세스 (Saccharomyces) 종, 칸디다 (Candida) 종, 에스케리치아 콜리 (Escherichia coli), 코리네박테리움 (Corynebacterium) 종, 코리네박테리움 글루타미쿰 (Corynebacterium glutamicum), 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 노카르디아 (Nocardia) 종, 브레비박테리움 (Brevibacterium) 종, 아트로박터 (Arthrobacter) 종, 스트렙토마이세스 (Streptomyces) 종, 마이크로박테리움 (Microbacterium) 종, 아스페르길루스 (Aspergillus) 종, 바실러스 (Bacillus) 종, 피치아 (Pichia) 종 및 필로바시디움 (Filobasidium) 종으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 미생물을 사용하는 발효로부터 유래된 것인 방법.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 발효 배양액에 트레할로스가 발효 배양액의 건조 중량을 기준으로 15 중량％ 미만의 농도로 존재하는 것인 방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 활성 탄소 처리, 한외여과 및 이온-교환제 처리로 이루어진 군으로부터 선택된 추가의 단계를 하나 이상 포함하는 방법.