KR20060130788A

KR20060130788A - 전립선암의 화학적 예방법

Info

Publication number: KR20060130788A
Application number: KR1020067024871A
Authority: KR
Inventors: 미첼 에스. 스테이너; 샤란 라고우
Original assignee: 유니버시티 오브 테네시 리서치 파운데이션
Priority date: 1999-11-08
Filing date: 2000-11-08
Publication date: 2006-12-19
Also published as: HUP0203304A3; BG106738A; WO2001034117A9; SK8162002A3; KR100793721B1; BG65794B1; NO20022221L; WO2001034117A1; NO20022221D0; CN1420765A; KR20020070276A; US6413533B1; CZ20021763A3; AU1588401A; HK1057000A1; CA2390295A1; CA2390295C; MXPA02004676A; CN1331463C; JP2003513903A

Abstract

본 발명은 전립선암의 화학적 예방, 특히 포유류 대상에게 화학적 예방제 및 그의 유사체 및 대사산물을 투여하는 단계를 포함하는 잠재적 전립선암을 억제 또는 저해하는 방법에 관한 것이다. 화학적 예방제는 전립선의 암발생을 예방, 재발의 방지, 억제 또는 저해하고, 전립선암을 치료한다.

전립선암, 종양, 예방, 에스트로겐, 토레미펜, 항암제, 상피내 신생물

Description

전립선암의 화학적 예방법 {A METHOD FOR CHEMOPREVENTION OF PROSTATE CANCER}

도 1은 TRAMP 모델에서의 토레미펜(Toremifene)의 화학적 예방 효과를 예시하는 그래프.

도 2A 내지 도 2C는 정상 마우스의 복부 전립선 세포의 H & E 단면 및 연구에 이용한 TRAMP 마우스의 전립선 암종의 H & E 단면을 나타내는 도면.

도 3은 TRAMP 마우스의 복부 전립선 발달에 미치는 토레미펜의 효과를 나타내는 도면.

도 4는 TRAMP 마우스에서의 종양 발달에 미치는 토레미펜의 효과를 나타내는 그래프.

도 5는 TRAMP 모델에서의 종양 발달에 미치는 토레미펜의 효과를 나타내는 도면.

도 6A 및 도 6B는 플라시보와 토레미펜이 종양 성장에 미치는 영향의 비교 그래프.

전립선암은 미국에서 남성 중 가장 흔하게 발생하는 암 중 하나이고, 매년 10 만명의 새로운 환자가 진단된다. 불행하게도, 전립선암으로 새로이 진단된 60% 이상은 병리학적으로 진전된 것으로 밝혀져, 치료법이 없고 암울한 예후를 나타낸다. 이 문제에 대한 하나의 접근법은 스크리닝 프로그램을 통해 조기에 전립선암을 예방하여 진전된 전립선암 환자의 수를 줄이는 것이다. 다른 전략으로는 전립선암을 예방하기 위한 약품을 계발하는 것이다. 50세 이상의 전체 남성의 1/3은 생명을 위협하는 임상적 전립선 암 형태로 활성화될 수 있는 전립선암의 잠재적 형태를 가지고 있다. 잠재적 전립선 종양의 빈도는 50대(5.3-14%)에서 90대(40-80%)로 매 10대 마다 실질적으로 증가하는 것으로 나타났다. 잠재적 전립선암을 가진 인구수는 모든 문화, 인종군 및 민족에 걸쳐 동일하지만, 임상적으로 침습성 암의 빈도는 뚜렷하게 다르다. 이것은 환경적 요인이 잠재적 전립선암을 활성화시키는 데 역할을 할 것이라는 것을 시사한다. 따라서, 전립선암에 대한 화학예방 전략의 개발은 전립선암에 대한 의학적으로나 경제학적으로 가장 커다란 효과를 가지고 있다.

Toremifen은 본 명세서에서 인용되고 있는 Toivola 등의 미국 특허 제4,696,949호 및 제5,491,173호에 기재된 트리페닐알켄 화합물의 예이다. Toremifen을 함유한 제형을 포유류 대상에게 비경구 및 국부 투여는 본 명세서에 인용되고 있는 Jalonene 등의 미국 특허 제5,571,534호 및 DeGregorio 등의 미국 특허 제5,605,700호에 기재되어 있다.

본 명세서에 인용되고 있는 Labrie의 미국 특허 제5,595,985호에도 5α-환원효소 억제제 및 안드로겐 수용체에 결합하고 접근을 봉쇄하는 화합물을 이용하여 초기 전립선 과증식증을 치료하는 방법을 기재하고 있다. 안드로겐 수용체를 봉쇄하는 화합물의 일례는 플루타마이드가 있다.

본 명세서에서 인용되고 있는 Neri 등의 미국 특허 제4,329,364호 및 제4,474,813호는 전립성 종양의 발병을 지연하고 및/또는 예방하기 위한 플루타마이드를 포함하는 제약학적 제제를 기재하고 있다. 이 제제는 캡슐, 정제, 좌약, 또는 일릭셔의 형태일 수 있다. 이러한 개발에도 불구하고, 전립선암의 예방을 위한 효과적인 약제 및 방법에 대한 계속적인 필요가 있다.

전립선암의 높은 유병율과 사망률 때문에, 이 공포스러운 질병에 대한 화학적 예방 전략을 개발하는 것이 긴급하다. 전립선암의 시작, 촉진, 및 진행을 포함하는 전립선 발암에 기여하는 인자를 이해하는 것은 발암 진행을 방지하고 중지시키는 매개의 적절한 포인트에 대해 분자의 대사적인 실마리를 제공할 것이다. 기초 과학 및 임상적 수준 모두에서 전립선암의 발병을 감소시키고 잠재적인 전립선암의 퇴행을 중지하는 새로운 혁신적인 접근이 긴박하게 요구된다. 전립선암의 빈도는

남성이 다른 경쟁적인 사망의 원인에 직면하는 동일 연령에서 극적으로 상승 시키기 때문에, 전립선 선종양의 진행을 단순히 나타내는 것은 보건 전략상 더욱 적합하고 비용적으로 효과적일 것이다. 본 발명은 이러한 필요를 만족시키기 위한 것이다.

또한, 전립선 상피내 신생물은 전립선암으로 가는 직접적 불규칙적인 경로이고 전립선 상피내 신생물은 전립선암의 증가된 위험의 특이적인 전조가 되기 때문에, 상피내 신생물을 가진 것으로 진단된 남성은 삶의 질이 급격하게 변화된다. 전립선 상피내 신생물을 진단하는 유일한 방법은 전립선의 생체검사에 의한 것뿐이다. 그러나 일단 전립선의 상피내의 신생물의 진단이 이루어지면, 표준 의학적 치료법으로는 환자가 더욱 빈번한 생체검사와 의사의 방문을 해야만 한다. 또한, 전립선암의 진단이 촉박하기 때문에 환자와 의사의 커다란 근심이 되고 있다. 현재, 전립선 상피내의 신생물을 가지는 환자에 유용한 치료법은 없다.

본 발명은 항-에스트로겐, 또는 그의 유사체, 유도체, 이성체 및 대사산물; 그리고 제약학적으로 허용 가능한 그들의 염, 에스테르 또는 N-옥사이드 및 이들의 혼합물을 포함하는 전립선암, 또는 전립선 선암 병변의 전암성 전구체의 치료, 억제, 예방 또는 그의 양의 감소 방법 및 이에 사용되는 약학 조성물의 제공에 관한 것이다.

본 발명은 항-에스트로겐, 또는 그의 유사체, 유도체, 이성체 및 대사산물; 그리고 제약학적으로 허용 가능한 그들의 염, 에스테르 또는 N-옥사이드 및 이들의 혼합물을 포함하는 제약학적 제제를 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 전립선암 발생의 예방 방법에 관한 것이다.

본 발명은 항-에스트로겐, 또는 그의 유사체, 유도체, 이성체 및 대사산물; 그리고 제약학적으로 허용 가능한 그들의 염, 에스테르 또는 N-옥사이드 및 이들의 혼합물을 포함하는 제약학적 제제를 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 잠재된 전립선암의 억제 또는 저해 방법에 관한 것이다.

본 발명은 항-에스트로겐, 또는 그의 유사체, 유도체, 이성체 및 대사산물; 그리고 제약학적으로 허용 가능한 그들의 염, 에스테르 또는 N-옥사이드 및 이들의 혼합물을 포함하는 제약학적 제제를 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 대상의 전립선암의 발병 위험을 감소시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 항-에스트로겐, 또는 그의 유사체, 유도체, 이성체 및 대사산물; 그리고 제약학적으로 허용 가능한 그들의 염, 에스테르 또는 N-옥사이드 및 이들의 혼합물을 포함하는 제약학적 제제를 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 전립선암을 가지는 대상의 생존률을 증가시키는 방법에 관한 것이다.

본 발명은 항-에스트로겐, 또는 그의 유사체, 유도체, 이성체 및 대사산물; 그리고 제약학적으로 허용 가능한 그들의 염, 에스테르 또는 N-옥사이드 및 이들의 혼합물을 포함하는 제약학적 제제를 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 전립선암을 가지는 대상의 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명은 항-에스트로겐, 또는 그의 유사체, 유도체, 이성체 및 대사산물; 그리고 제약학적으로 허용 가능한 그들의 염, 에스테르 또는 N-옥사이드 및 이들의 혼합물을 포함하는 제약학적 제제를 포유류 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 전립선 선암 병변의 전암성 전구체 양의 감소시키는 방법에 관한 것이다.

일 실시예에서, 항-에스트로겐은 선택적 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM), 트리페닐에틸렌 또는 트리페닐알칸이다. 일 실시예에서, 전립선 선암의 전암성 전구체가 전립선 상피내 신생물(PIN)이다. 일 실시예에서, 전립선 선암의 전암성 전구체가 높은 등급의 전립선 상피내 신생물(PIN)이다.

본 발명은 전립선 발명을 예방하고 잠재적 전립선암을 억제하거나 저해하기 위한 안전하고 효과적인 방법을 제공한다. 본 발명은 특히 전립선암의 발병의 상승된 위험을 가지는 대상을 치료하는 데 특히 유용하다. 대상은 예를 들면 온화한 전립선 과증식, 전립선 상피내 신생물(PIN), 또는 순환 전립선 특이적 항체(PSA)의 비정상적으로 높은 수준을 가지거나 또는 전립선암의 가족력을 가진 사람이다.

본 발명은 본 발명에 따라 제공되는 화학적 예방제를 투여함으로써 1) 전립선 발암현상을 예방하는 방법; 2) 전립선암을 억제 또는 방지하는 방법; 3) 전립선 암이 발달할 위험성을 낮추는 방법; 4) 대상의 생존율을 높이는 방법; 5) 전립선암의 치료 방법; 6) 전립선 상피내 종양의 퇴행을 위한 방법 및 전립선 상피내 종양 병변의 정도를 저감하기 위한 방법을 제공한다.

일 실시예에서, 본 발명의 화학적 예방제는 항에스트로겐, 그 유사체, 유도체, 이성체 및 그것의 대사산물이다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제는 트 리페닐알칸, 또는 그 유사체, 유도체, 이성체 및 그 대사산물이다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제는 디하이드로나프탈렌, 그 유사체, 유도체, 이성체 및 그 대사산물이다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제는 벤조티오펜, 또는 그 유사체, 유도체, 이성체 및 그 대사산물이다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제는 선택성 에스트로겐 수용체 조절인자(SERM) 및 그 유사체, 유도체, 이성체 및 그 대사산물이다. 다른 실시예에서, 상기 항에스트로겐은 비 DNA 부가물 형성 항에스트로겐 및 그 유사체, 유도체, 이성체 및 그 대사산물이다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제는 타목시펜(tamoxifen)이다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제는 파슬로덱스(faslodex)이다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제는 랄록시펜(raloxifene)이다.

일 실시예에서, 전립선 발암현상의 예방, 잠재적 전립선암의 억제 또는 방지를 위한 화학적 예방제의 사용에 있어서, 상기 화학적 예방제는 하기 일반식을 갖는 화합물을 함유하지 않는다:

(상기 식에서 R₁ 및 R₂는 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 H 또는 OH이고, R₃는 OCH₂CH₂NR₄R₅이고, 여기서 R₄ 및 R₅는 동일하거나 상이할 수 있는 것으로 H 또는 탄소원자수 1 내지 약 4인 알킬기 및 유사체 및 그 대사산물임).

제시된 바와 같이, 항에스트로겐의 예인 타목시펜, 파슬로덱스, 및 랄록시펜은 화학적 예방제이며 전립선 상피내 종양제이다.

중간 종말점 바이오마커(biomarker)는 명백한 종양의 개시와 발달 사이에 일어나는 측정 가능한 생물학적 변화이다. 바이오마커는 최종 종말점인 암 발생이 추정되는 화학적 예방제에 의해 감소될 경우에 유효성이 인정된다. 암에서의 중간 바이오마커는 다음과 같은 군으로 분류될 수 있다: 조직학적 마커, 증식 마커, 분화 마커, 및 생화학적 마커. 어느 화학적 예방술에 있어서나, 조직학적으로 식별 가능하고 수용된 전암성 병변에 대한 가능성이 중요한 출발점이 된다. 전립선의 경우에, 조직학적 마터는 전립선 선암종(adenocarcinoma)의 전암성 전구체로서 전립선 상피내 종양(PIN)이 그 일례이다. PIN은 세포 이형성증의 전암 병소의 전립샘관 내의 비정상 증식 및 기질 침입이 없이 원래 위치에서의 종양으로서 나타난다. PIN 및 조직학적 전립선암은 형태학적 및 표현형적으로 유사하다. 따라서 높은 수준의 PIN의 발달은 정상적 전립선이 PIN, 조직학적 전립선암, 침입성 의학적 전립선암 및 전이로 발전하는 진행 경로에서의 중요한 단계를 나타낸다.

전립선 상피내 종양은 전암성 병변 또는 전립선 선암종의 전구체인 것으로 밝혀졌다. 전립선 상피내 종양은 세포 이형성증의 전암 병소의 전립샘관 내의 비정상 증식 및 기질 침입이 없이 원래 위치에서의 종양이다. 전립선 상피내 종양은 전립선 발암현상의 가장 정확하고 신뢰할만한 마터이므로, 전립선 화학예방 시험에서 수용 가능한 종말점으로 이용할 수 있다. 전립선 상피내 종양은 선암종에 대한 마커로서 높은 예측치를 가지며, 그 식별은 동시적 또는 계속적인 침입성 암종에 대한 재현성있는 생체검사를 보장한다. 많은 연구 결과에서 전립선 상피내 종양을 가진 대부분의 환자들이 10년 이내에 암종을 얻게 되는 것으로 나타난다. 흥미로운 것은 전립선 상피내 종양이 혈청 PSA에 기여하지 않는 점인데, 이는 전립선암과는 달리 전립선 상피내 종양은 전립선의 맥관계를 침입하여 혈액 속으로 PSA가 새어 나가게 하지 않았기 때문에 놀라운 일은 아니다. 따라서, 전립선 상피내 종양은 혈청 PSA 상승과 관련한 전립선암보다도 선행할 수 있다.

일 실시예에서, 전립선의 화학적 예방제로 작용하는 항에스트로겐에는, 드롤록시펜, 이독시펜, (2)-4-OH-타목시펜을 포함하는 트리페닐렌류; 아르족시펜; 레보멜록시펜 및 센트크로만과 같은 크로만류; 랄록시펜과 같은 벤조티오펜류; LY 353381; CP336,156과 같은 나프탈렌류가 포함된다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제에는 다이드제인을 포함하는 이소플라바노이드, 제니스테인, 예노에스트로겐과같은 식물성 에스트로겐; 쿠메스트롤; 제아랄레논; 다이드제인; 아피게닌; 와엠페롤; 프롤레틴; 비오카닌 A; 나링게닌; 포르모노네틴; 이프리플라본; 케르세틴; 및 크리신이 포함된다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제에는 플라보노이드; 플라본, 이소플라본, 플라바논 및 칼콘; 쿠메스탄; 마이코에스트로겐; 레조르사이클산 락톤; 나폭시덴 및 그 등가물, 및 엔테로디올 및 엔테로락톤을 포함하는 리그난이 포함된다. 다른 실시예에서, 상기 화학적 예방제에는 하기 화합물이 포함된다: ICI 164,384, ICI 182,780; TAT-59, EM-652(SCG 57068), EM-800(SCH57050), EM-139, EM-651, EM-776, 및 인간 에스트로겐 수용체의 펩티드 길항제.

본 발명은 전술한 바와 같이 제공되는 화학적 예방제 및 담체 또는 희석제 및/또는 그것들의 약제학적 허용 담체, 희석제, 염류, 에스테르, 또는 N-옥사이드 및 이들의 혼합물을 투여함으로써 전립선 발암현상의 예방; 전립선암의 억제 또는 방지; 전립선 암이 발달할 위험성의 저감; 대상의 생존율의 제고; 전립선암의 치료; 전립선 상피내 종양의 퇴행 및 전립선 상피내 종양 병변율의 저감을 위한 약제학적 조성물 및 그 용도를 제공한다.

본 발명은 발암현상의 예방, 잠재성 전립선암의 억제 또는 방지를 위한 안전하고 효과적인 방법을 제공하며, 특히 예를 들면 양성 전립선 과다형성, 전립선 상피내 종양(PIN), 또는 비정상적으로 과도한 수준의 전립선 특이성 항체(PSA) 등의 질환을 가진 사람 또는 전립선암의 가족력이 있는 사람과 같이 전립선암의 발생 위험이 높은 대상을 치료하는 데 유용하다. 일 실시예에서, 상기 대상은 포유류 동물이고, 또 다른 실시예에서 상기 대상은 인간이다.

본 발명은 화합물의 순수한 (Z) 및 (E)-이성체 및 이들의 혼합물과 순수한 (RR, SS) 및 (RS, SR)-거울상 이성질체쌍 및 이들의 화합물을 포함한다.

본 발명은 유기산 및 무기산, 예를 들면 구연산 및 염산을 함유한 아미노 치환 화합물의 제약학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 또한 본 발명은 화학식(I)의 화합물의 아미노 치환체의 N-산화물을 포함한다. 또한 제약학적으로 허용가능한 염은 무기 베이스로 처리한 페놀 화합물, 예를 들면 염화나트륨을 처리하여 마련될 수 있다. 또한 페놀 화합물의 에스테르는 지방성 카르복실산 및 방향성 카르복실산으로 제조될 수 있는 것으로서, 예를 들면 아세트산 및 벤조산 에스테르가 포함된다.

여기서 사용되는 것과 같이, 제약학적 화합물은 적절한 희석제, 방부제, 가용화제, 유화제, 아주번트(adjuvant) 및/또는 담체와 함께 제약학적유효량의 제제를 의미한다. 여기서 사용되는 "제약학적 유효량"은 주어진 조건과 두여량용으로서 제약학적인 효과를 제공하는 양을 일컫는다. 이러한 화합물은 액체 또는 동결 건조되거나, 그렇지 않으면 건조 제형이고, 다양한 완충액 함량(예를 들면 트리스염산, 아세테이트, 포스페이트)의 희석제, pH, 이온력, 표면 흡수를 방지하는 알부민 또는 젤라틴 등의 첨가제, 세제(예를 들면 트윈(Tween) 20, 트윈 80, 플루로닉 F68, 담즙산염), 유화제(예를 들면, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제(예를 들면, 아스코르브산, 소디움 메타비설파이트), 방부제(예를 들면 티머로설(Thimerosal),벤질 알코올, 파라벤(paraben)), 벌크 물질, 독성 변형자(예를 들면, 락토세, 만니톨), 폴리에틸렌 글리콜 등의 폴리머와 단백질의 공유 결합, 금속 이온의 복합체, 폴리락틱산, 폴리글리콜산, 하이드로겔 등의 폴리머 화합물의 미립자 제재 내 또는 제재 상으로의 물질의 혼입, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 교질 입자, 단일 라멜라, 다중라멜라 비히클, 에리트로사이트 고스트(erythrocyte ghost) 또는 스페로플라스트 상에 융합된 물질을 포함한다. 이러한 화합물은 물리적 상태, 용해도, 안정성 생체내 방출율 및 생체내 클리어런스(clearance)율에 영향을 끼친다. 제어되거나 유지된 방출 화합물은 친지성 저장소(예를 들면, 지방산, 왁스, 오일)에 제형을 포함한다. 또한 본 발명은 폴리머(예를 들면 폴록사머(poloxamer) 또는 폴록사민(poloxamine))로 피복된 미립자 화합물을 포함한다. 본 발명의 화합물의 다른 실시예는 비경구, 폐, 코 및 입을 포함하여 미립자 형태의 보호 코팅, 프로테아제 억제제 또는 다양한 투여법용 침투 촉진제를 융합한다. 일 실시예에서, 제약학적 화합물은 비경구로, 파라-암(paracancer), 점막내부, 경피, 근육내, 정맥내, 피(皮)내, 피하, 복막내, 심실내 및 두개내, 종양으로 투여된다. 투여량은 하루에 5-80mg이 될 수 있다. 다른 실시예에서 투여량은 하루에 35-66mg이 될 수 있다. 또다른 실시예에서 투여량은 하루에 40-60mg이 될 수 있다. 또다른 실시예에서 투여량은 하루에 45-60mg이 될 수 있다. 또다른 실시예에서 투여량은 하루에 15-25mg이 될 수 있다. 또다른 실시예에서 투여량은 하루에 55-65mg이 될 수 있다. 또다른 실시예에서 투여량은 하루에 45-60mg이 될 수 있다. 투여량은 하루에 60mg이 될 수 있다. 투여량은 하루에 20mg이 될 수 있다. 투여량은 하루에 45mg이 될 수 있다. 경구 투여용 정제는 88.5mg의 화학적 예방제를 함유하며, 이는 화학적 예방제 60mg과 동일하다.

또한, 여기서 사용된 제약학적으로 허용할 수 있는 담체가 당업자에 잘 알려져 있으며 제한되지는 않지만 0.01~0.1M, 바람직하게는 0.05M의 인산염 완충제 또는 0.8%의 염분을 함유한다. 또한, 이처럼 제약학적으로 허용할 수 있는 담체는 수용성 용액 또는 비수용성 용액, 혼탁액 및 에멀젼일수 있다. 비수용성 용매의 예는 폴리프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유 등의 식물성 오일 및 에틸올리에이트 등의 주사용 유기 에스테르이다. 수용성 담체는 물, 알코올/수용액, 에멀젼 또는 염분 또는 완충 매체를 함유하는 혼탁액을 포함한다. 비경구 비히클은 나트륨 클로라이트 용액, 링거(Ringer)의 덱스트로스, 덱스트로스 및 나트륨 클 로라이드, 락테이트 링거 또는 고정 오일을 포함한다. 정맥 비히클은 액체 및 영양물 보충제, 링거의 덱스트로스에 기초한 전해질 보충제를 포함한다. 방부제 및 기타 첨가제도 존재할 수 있으며, 예를 들면 항균제, 항산화제, 콜레이팅(collating)제, 불활성 기체 등이다.

"아주번트(adjuvant)"라는 용어는 항원에 대한 면역을 향상시키는 화합물 또는 혼합물을 일컫는다. 아주번트는 항원을 천천히 방출하는 근육 저장소의 역할을 할 수 있고, 구체적이지는 않지만 면역 응답을 향상시키는 림포이드 시스템 활성제의 역할을 할 수도 있다. (Hood 등. 면역학 2판 1984, 벤자민/커밍스, 메니오 박, 캘리포니아 p.384) 가끔 아주번트 없이 항원만으로의 우선 시도는 체액 또는 세포 면역 응답 유도에 실패한다. 제한되지는 않지만 아주번트는 완전한 프레운드(Freund)의 아주번트, 불완전한 프레운드의 아주번트, 사포닌, 알루미늄 하이드록사이드 등의 미네랄 겔, 라이솔렉티닌(lysolectinin) 등의 표면 활성물, 플루오닉 폴리올스, 폴라니욘, 펩타이드, 오일 또는 탄화수소 에멀젼, 키홀 림프 헤모캬니안, 디니트로페놀 및 BCG(bacille Calmette-Guerin) 및 코린박테리움 파븀(Corynebacterium parvum) 등의 잠재적으로 유용한 인간 아주번트를 포함한다. 아주번트는 제약학적으로 허용할 수 있는 것이 바람직하다.

조절 또는 지연 방출 조성물은 친지성 침착물(예를 들어, 지방산, 왁스, 오일)을 포함한다. 또한 본 발명에 의해 포함되는 것은 폴리머로 코팅된 미립자 조성물(예를 들어, 폴록사머 또는 폴록사민)과 조직 특이적인 수용체(tissu-specific receptor), 리간드나 항원 또는 조직 특이적인 수용체의 리간드와 결합하는 리간드 로 향하는 항체에 결합되는 화합물이다. 미립자를 결합하는 본 발명의 조성물의 다른 실시예들은 비경구적인 폐, 코 및 구강을 포함한 다양한 경로의 투여에 대해 보호막, 프로테아제 억제제 또는 침투 촉진제(permeation enhancer)를 형성한다.

폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜의 코폴리머 및 폴리프로필렌 글리콜, 카르복실메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리비닐 알콜, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린 등의 수용성 폴리머의 공유적인 부착에 의해 변성된 화합물은 대응하는 비변성 화합물에 비해 혈액이 흐르는 정맥 주사에서 대체로 더 긴 반 수명(half-lives) 나타내는 것으로 알려져 있다(Abuchowski 등, 1981; Newmark 등, 1982; 그리고 Katre 등, 1987). 이러한 변성은 또한 수용액에서 화합물의 용해도를 증가시키고, 응집체를 제거하며, 화합물의 물리적 화학적 안정성을 증대시킬 수 있고, 화합물의 면역원성(immunogenicity) 및 반응성을 대폭 감소시킨다.

결과로서, 원하는 생체내 생물학적 활성은 비변성된 화합물에 비해 덜 빈번하게 또는 더 적은 양으로 이러한 폴리머 화합물의 투여에 의해 실현된다.

또 다른 실시예에서, 제약학적 조성물은 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 예를 들어, 제제는 정맥내 주입, 매몰식 삼투성 펌프(inplantable osmotic pump), 경피용 패치, 리포솜 등의 투여 방식 이용하여 투여될 수 있다. 일 실시예에서, 펌프가 사용될 수 있다[Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201(1987); Bushwald 등, Surgery 88:507(1980); Saudek 등, N. Engl. J. Med. 321:574(1989) 참조]. 다른 실시예서, 고분자 물질을 사용할 수 있다. 다른 실시예에서, 조절 방출 시스템은 치료 표적, 즉 뇌의 근처에 놓일 수 있고, 따라서 소량의 전신 투여량만이 요구된다[예를 들어 Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol.2, pp. 115-138(1984) 참조]. 바람직하게는 조절 방출 장치는 면역 활동에 부적당한 장소 또는 종양의 근방의 대상 내로 도입된다. 다른 조절 방출 시스템은 Langer의 논문에 논의되어 있다[Science 249:1527-1533(1990)].

본 발명의 전립암을 예방하는 방법은 화학적 예방제이나 그 대사 물질 또는 염을 포함하는 포유류 대상의 제약학적 제제의 투여를 수반한다. 제약학적 제제는 화학적 예방제만을 포함하거나, 제약학적으로 수용 가능한 담체를 더 포함할 수 있으며, 정제, 분말, 캡슐, 펠럿(pellet), 용액, 현탁액, 일릭셔(elixir), 에멀wuswus, 겔, 크림, 또는 직장 및 요도 좌약을 포함하는 좌약 등이 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 제약학적으로 수용 가능한 담체는 검, 전분, 당, 셀룰로스 물질 및 그들의 혼합물을 포함한다. 화학적 예방제를 포함하는 제약학적 제제는 예를 들어 펠럿의 피하 주입에 의해 대상에 투여될 수 있으며, 다른 실시예에서 이 펠럿은 한 시간 주기에 걸쳐 약학적 예방제의 조절된 방출을 제공한다.

이 제제는 또한 액체 제제의 정맥, 동맥 또는 근육내 주사, 액체 또는 고체 제제의 경구 투여, 또는 국부 적용에 의해 투여 될 수 있다. 투여는 또한 직장 좌약 또는 요도 좌약을 사용하여 실현될 수 있다. 제약학적 제제는 또한 비경구 제형일 수 있으며, 일 실시예에서 이 제형은 앞서 Jalonen 등의 관련 미국 특허 제5,571,534호에서 기술한 바와 같이 예를 들어, 토레미펜 및 시클로텍스트리르 화합물과 같은 화학적 예방제의 복합물을 포함하는 리포좀을 포함한다.

본 발명의 제약학적 제제는 기지의 용해, 혼합, 과립 또는 정제 형성 과정에 의해 제조할 수 있다. 경구 투여를 위해, 화학적 예방제 또는 염, 에스테르, N-옥사이드 등의 그들의 생리학적으로 내성이 있는 유도체는 용도에 적합하게 비히클, 안정화제 또는 불활성 희석제 등의 접착제와 혼합되며, 정제, 코팅 정체, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 수성, 알콜 또는 오일 용액과 같은 적합한 방법에 의해 투여에 적절한 형태로 전환된다.

적합한 비활성 비히클의 예는 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴 또는 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산 또는 스테아릭산이나 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤할제를 가지는 붕해제를 갖는 결합제와 결합하는 락토스, 슈크로스 또는 옥수수 전분 등을 기반으로 하는 종래의 정제이다. 적합한 오일 비히클 또는 용매의 예는 해바라기 오일 또는 생선 간(fish-liver) 오일과 같은 식물성또는 동물성 오일이다. 제제는 건식 또는 습식 과립으로 만들어 진술 있다. 비경구 투여(피하, 정맥, 동맥 또는 근육내 주사)의 경구, 화학적 예방제 또는 염, 에스테르, N-옥사이드 등의 그들의 생리학적으로 내성이 있는 유도체는 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로 전환될 수 있으며, 실제적으로 필요하고 용도에 적합하다면, 예를 들어 가용화제 또는 기타 보조제로 할 수 있다. 예로는 계면 활성제 및 기타 제약학적으로 수용 가능한 아주번트가 부가되거나 부가되지 않은 물 및 오일 등의 멸균액이다. 예시적인 오일은 석유, 동물성 오일, 식물성 오일, 또는 예를 들어 땅콩 오일, 콩 오일 또는 미네랄 오일 등의 합성 유래이다. 일반적으로, 물, 식염수, 수성 덱스트로스 및 관련된 당 용액 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리 콜과 같은 글리콜은 바람직한 액체 담체이며, 특히 주입 가능한 용액이다.

활성 성분을 함유하는 제약학적 조성물의 제조법은 본 기술분야에 잘 알려져 있다. 통상, 상기 조성물은 비인두에 전달되는 폴리펩타이드의 에어로졸 또는 액체용액 또는 현탁액 주사제로 제조되지만, 주사 전에 액상의 용액 또는 현탁액이 되기에 적합한 고체 형태로 제조될 수도 있다. 제제는 에멀젼화될 수도 있다. 활성 치료성분은 종종 제약학적으로 수용가능하고 활성성분과 친화적인 부형제와 혼합된다. 적합한 부형제는 예를 들면 물, 식염수, 덱스트로즈, 글리세롤, 에탄올 등 및 그의 조합물이 있다. 또한, 소망에 따라, 조성물은 소량의 습윤화제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 활성 성분의 효율을 증가시키는 보조 물질을 포함할 수도 있다.

활성성분은 중화된 제약학적으로 허용가능한 염의 형태의 조성물로 제형화될 수 있다. 제약학적으로 수용가능한 염은 산부가염(폴리펩타이드 또는 항체 분자의 유리 아미노기로 형성됨)을 포함한다. 예를 들면 염산 또는 인산과 같은 부기염 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성된다. 유리 카르복실기에서 형성된 염은 예를 들면 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 또는 수산화철과 같은 무기염 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기염에서 유래될 수 있다.

예를 들면 크림, 젤, 드롭 등을 이용하여 신체 표면에 국부 투여하는 화학적 예방제 또는 염, 에스테르, N-옥사이드 등과 같은 그의 생리학적으로 내성이 있는 유도체를 제조하고 생리적으로 허용가능한 희석액 내에서 제약학적 담체가 있거나 또는 없어도 용액, 현탁액, 또는 에멀젼으로 적용한다.

다른 실시예에서, 활성 화합물은 소포내, 특정 리포좀(Langer, Science 249:1527-1533(1990); Treat et al., Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (편저), Liss, New York, pp 353-365 (1989); Lopex-Berestein, 상기 논문, pp317-327, 참조) 내에 전달된다.

본 발명의 제약학적 조성물은 특히 전립선암을 진전시킬 위험을 지닌 대상(subject)을 치료하는데 효과적이다. 예를 들어, 이러한 위험성이 높은 대상으로는 양성 전립선 이상증식이 있는 전립선 상피내 신생물(neoplasia) (PIN;prostatic intraepithelial neoplasia) , 또는 비정상적으로 순환하여 높은 수치를 나타내는 전립선 특이항체(PSA; prostate specific antibody), 또는 전립선암의 가계도가 있는 사람들이 있다.

또한, 전립선 화학적 치료제는 다른 사이토카인(cytokines)과 결합하여 투여될 수 있고, 또는 성장 인자는 IFN-γ또는 α, IFN-β; 인터류킨(interleukin;IL) 1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, IL-12, 암 괴사 인자(TNF; tumor necrosis factor) α, TNF-β, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF; granulocyte colony stimulateing factor), 과립구/매크로파지(macrophage) CSF(GM-CSF); 인테그린(integrin) 상과의 멤버들 및 LFA-1, LFA-3, CD22, 및 B7-1, B7-2 및 ICAM-1T 세포를 동시에 자극하는 분자들와 같은 Ig 멤버들을 포함하는 보조 분자(accessory molecules)를 포함하나 이것으로 제한되는 것은 아니다.

상기 화학적 예방제는 DNA 손상시키는 약물 처리 전 또는 후에 분 또는 주 간격으로 시행할 수도 있다. 프로토콜과 방법들은 종래 기술로 알려져 있다. DNA 손상시키는 약물들 또는 인자들은 종래 기술로 알려져 있으며, 세포에 적용하는 경우 DNA 손상을 유도하는 화합물 또는 처리방법이라면 어느 것이든 사용 가능하다. 이러한 약물 및 인자들로는 방사선과 DNA 손상을 유도하는 감마 방사선, X-선, 자외선, 초고주파, 전기 방출파 등등과 같은 파장이 있다. 연관된 처리 방법으로 사용하는 것을 목적으로 하는 모든 "화학적 치료제"로 표기되는 다양한 화합물들 및 DNA 손상을 유도하는 작용이 본 명세서에 개시되어 있다. 사용 가능한 화학적 치료제로는, 예를 들어 아드리아마이신(adriamycin), 5-플루오로우라실(fluorouracil; 5FU), 에토포사이드(etoposide, VP-16), 켐프토테친(camptothecin), 액티노마이신(actinomycin)-D, 미토마이신(mitomycin) C, 시스플라틴(cisplatin;CDDP), 및 과산화수소 등이 있다. 또한 본 발명은, 시스플라틴과 함께 X-레이를 사용하거나 에토페사이드와 함께 시스플라틴을 사용하는 것과 같이, 방사선계 화합물 또는 실제 화합물이든, 1 종 또는 1종 이상의 DNA 손상 약물들의 조합을 사용한다.

또 다른 실시예에 있어서, 본 발명은 X-선, 자외선, 감마선 또는 초고주파와 같은 DNA를 손상시키는 방사선과 함께 국소 종양 부위를 조사할 수도 있다. 대체적으로, 종양 세포들은 아드리아마이신, 5-플루오로우라실, 에토포사이드, 캠프토테친, 액티노마이신-D, 미토마이신 C, 또는 보다 바람직하게는 시스플라틴과 같은 DNA를 손상시키는 화합물을 함유하는 제약학적 조성물의 치료 유효량으로 피험자들에게 투여됨으로써 DNA를 손상시키는 약물과 접촉된다. 또한, DNA를 손상하는 제 제들로는 DNA 복제, 유사분열 (mitosis), 염색체 분열을 방해하는 화합물들이 있다. 이러한 chemotherapeutic 화합물들로는 독소루비친(doxorubicin)으로 알려져 있는 아드리아마이신, 에토포사이드, 베라파밀(verapamil), 포도필로톡신(podophyllotoxin) 등이 있다.

DNA를 손상하고 널리 사용되어 온 인자들로는 통상적으로 알려진 감마선, X-선, 및/또는 종양 세포들로 정해진 방사선 동위원소를 수송하는 수송체가 있다. 다른 형태의 DNA 손상 인자들은 또한 초고주파, 자외선 조사와 같이 사용된다. 이러한 모든 인자들은 DNA 전구체상에, DNA복제 및 복구, 및 염색체 집합과 유지에 지대한 영향을 끼치기 쉽다.

본 발명의 방법 및 제약학적 조성물은 특히 포유류, 바람직하게는 인체에 처방에 적용된다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예 및 비교예를 기재한다. 그러나, 하기한 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일 뿐 본 발명이 하기한 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예1 : 형질전환 선암 마우스 전립선

전립선 암의 화학적 예방에 대한 연구는 적당한 동물 모델이 없어서 지연되어 왔다. 형질전환 선암 마우스 전립선(TRAMP)에 대한 최근의 발달은 화학적 예방에 관한 연구를 가능하게 한다. TRAMP 모델에서 그린버그 등에 의해서 기술된(형질전환 마우스의 전립선 암, Proc. Nat1 Acad. Sci. USA, 1995, Vol. 92, 3439- 3443쪽) PB-SV40 라지 T항원(PB-T ag) 트랜스진(transgene)은 설치류 전립선의 상피 세포에서 구체적으로 나타난다. 결과로서 이러한 모델은 현존하는 모델보다 여러 가지 장점을 가진다. 1) 마우스는 생후 10주 보다 빨리 전립선 상피세포의 식욕과다와 약 18주 후에 침입하는 선암의 진보된 형태를 발달시킨다. 2) 전립선 암 전이 형태는 림프절, 허파, 신장, 부신 및 뼈 등의 일반적인 곳으로 전이하는 인간 전립선 암과 흡사하다. 3) 전립선 암의 성장 및 진행이 상대적으로 짧은 기간인 10에서 30주 내에서 일어날 수 있다. 4) 종양은 100% 빈도로 일어난다. 5) 동물은 임상 전립선암의 개시에 앞서서 전립선 암 트랜스진의 존재로부터 스크린될 수 있어서 전립선 발암을 바꿀 수 있는 토레미펜(Toremifene) 처리를 직접 시험한다.

TRAMP 형질전환 마우스 모델은 뛰어난 생체내 모델이어서 전립선암의 입문 및 촉진의 작용을 결정하고 잠재적인 토레미펜의 효율을 시험한다. 이러한 마우스는 급진적으로 전립선 상피세포의 식욕과다를 발달시키고(PIN) 그 후 짧은 기간 내(<17주)에 전립선암을 발달시킨다.

변종 TRAMP 마우스의 화학적 예방 처리는 출생 후 30일에 하루당 실험 대상물의 무게에 대하여 약 0.5∼50 mg/kg 수준으로, 바람직하게는 약 6∼30 mg/kg 토레미핀을 사용하여 개시된다. 토레미핀은 편리하게 21일 및 90일 펠렛으로 처리되고(Innovative Research of America, Sarasota, FL에 의하여 가공) 피하 삽입으로서 전달된다. 대조군 동물은 플라시보 삽입(placebo implants)을 수용한다. 각 약제 처리군에서 동물은 촉진할 수 있는 종양의 발달까지 5, 7, 10, 15, 20, 25, 30, 40 및 50 주의 나이에서 희생된다. 피를 처리 시간마다 채취하여 혈청 테스토 스테론 및 에스트라디올 변화를 분석한다. 전립선 조직은 모포메트릭(morphometric), 조직학 및 분자 연구용으로 채취된다.

다음 시험 과정이 이용된다.

1) 전립선 전체 분석을 연속적으로 수행하여 처리가 있는 시간 및 처리가 없는 시간 내내 전립선 관 형태의 변화를 탐지한다. 실시예는 도 2에 도시된다. 조직 절편은 H&E 및 매슨-트리콤(Masson-trichome) 표준 염색에 의하여 조직학적으로 분석된다. PIN의 발생은 평가되고 등급이 매겨진다.(Ⅰ-가벼운 것에서 Ⅲ-심한 것으로)

2) 혈청 에스트라디올 및 전체 테스토스테론 수준이 각 나이 구간에 대하여 측정되어(RIA) 토레미핀의 결과로서 이러한 호르몬의 변화를 평가한다.

실시예 2: 면역조직화학적 데이터 분석

Nikon Microphot-FX 현미경상의 Kodak DCS 460 카메라를 이용하고 컴퓨터로 보조된(Mac 9500-I 32 컴퓨터 및 모니터) 이미지 정량화(NIH Image 1.6 PPC)를 이용하여 현미경 이미지를 평가하고, 염색된 조직 섹션의 색상 차이를 분별하는 칼라-보조된 정량화 시스템 이미지 분석(IPLab Spectrum 3.1, Scanalytics, Inc. VA)을 이용하여 정량화하였다. 역치는 전립선의 다양한 조직 성분을 확인하기 위해 고정하였다. 각 조직 성분에 해당하는 영역 픽셀 밀도를 칼라 모니터의 풀 스크린에 대해 산출한다. 전립선 섹션당 총 5개의 스크린을 평균하였다. 면역조직화학적 이미지를 디지털화하고 샘플 상관계수 및 가능성(2-테일드)을 측정하여 통계적인 평 가가 가능하도록 정량화할 수 있다.

실시예 3: 화학억제 활성 연구

TRAMP 형질전환 동물(PBTag X FVBwt)( Baylor College of Medicine, TX의 Dr. Norman Greenberg 제공)에 토레미펜의 약효를 측정하기 위한 연구를 수행하였다. 이들 마우스는 10주 정도에서 암의 예비적인 조짐를 보였다. TRAMP 형질 전화 수컷 한배 새끼를 Large T ag 트랜스진을 위하여 스크린하였고, 양성 수컷은 연구에 사용하였다. 화학억제 효과 가능성을 테스트하게 될 항에스트로겐, 토레미펜을 특별히 고안된 펠렛(Innovative Research of America, Sarasota, Fl) 에 넣고 마우스를 화학억제 치료를 생후 30일 (마우스 평균 중량 14 g)에서 시작하였다. 10-12 동물 4그룹에게 각각 90일 방출 토레미펜 함유 펠렛을 피하 삽입하였다. 중량 변화와 관련된 성장에 맞추어 조절된 확산 약물 투여량을 설계하여 토레미펜 낮은 투여량 (6mg/kg) 또는 높은 투여량(30mg/kg)을 전달하게 하였다. 대조 동물(n=10)은 플라시보 삽입을 받았다. 치료 약효는 촉진가능한 종양 형성 유무를 측정하여 측정하였다. 쥐의 전립선 종양을 수거하여 분자적 조직학적 기술로 분석하였다.

전립선 암 종이 상속된 모든 동물이 전립선 암을 일으키는 전립선 의 TRAMP 형질 전환 모델을 사용하여, Toremifene은 전립선 암의 잠복을 증가시키고 또한 발생을 감소시킨다.

도 1에 도시되었듯이, 저 및 고 도우즈 Toremifene의 효과는 둘 다 효율적이 다. TRAMP 쥐 관 전립선내의 종양의 형성은 플라세보 그룹(n=10)에 대해 17째 주에, 고 도우즈 Toremifene 처리된 그룹(n=12)에 대해서는 19째 주에, 저 도우즈 Toremifene 처리된 그룹(n=12)에 대해서는 28째 주에 인지되었다. 따라서, Toremifene에 의한 5 가지 처리는 실질적으로 TRAMP 쥐의 관 전립선내의 암의 발생에 대한 잠복기를 11 주까지 증가시켰다.

Toremifene 처리된 동물은 연구 기간 동안에 50% 종양 발생점에 도달하지 않았기 때문에, 동물의 25%가 종양을 가진 시간이 그룹들 사이에서 비교되었다. 종양은 플라세보 그룹에서는 23째 주에, 고 및 저 Toremifene 그룹에서는 30-31째 주에서 10 동물의 25%에서 명백하며, 이것은 7-8 주의 지연이다. 플라세보 대 저 Toremifene 및 고 Toremifene은 둘 다 아래의 표 1에 도시된 바와 같이 로그 등급 및 Wilcoxon 통계적 분석에 의해 중요하였다.

표1-통계적 분석

로그 등급 Wilcoxon

P p

저 Toremifene 대 플라세보 0.0003* 0.0004*

고 Toremifene 대 플라세보 0.0017* 0.0071*

* 유의성 P<0.05

33째 주에, 모든 콘트롤 동물이 종양을 발생한 점에서, 저 도우즈의 72% 및 고 도우즈 Toremifene 처리된 동물의 60%가 여전히 종양이 없었다. 따라서, Toremifene 처리은 저 및 고 도시지(dosage)에서 TRAMP 쥐의 관 전립선내의 종양의 발생을 크게 감소시켰다. 이러한 데이터는 전립선 암의 발생이 현저히 감소되었고 잠복 기간을 증가시켰다는 것을 입증하였다.

이미 논의되었듯이, Toremifene을 처방하는 것은 TRAMP 쥐의 관 전립선내의 종양에 대해 실질적인 화학적 예방 효과를 발생시킨다. 이 결과는 전립선이 설치류 동물의 관 전립선에 대응되는 세그멘트를 포함하는 인간 주체에 대한 유사한 이로운 효과를 위해 용기를 북돋우는 것이다.

실시예 4: 전립선 조직의 조직학적 연구

촉진 시에 취해진 플라세보 및 고 Toremifen 처리된 그룹으로부터의 종양은 조직학적으로 평가되었다. 도 2A는 17-주된 정상적 성숙한 쥐의 관 전립서의 H&E 섹션이다. 도 2B는 플라세보 처리된 16주된 TRAMP 쥐의 관 전립선의 섹션으로서, 도 2A에 도시된 정상적 전립선과는 달리 TRAMP 쥐 관 전립선은 높은 분열 지수를 가진 구별되지 않은 악성 세포의 시트(sheet)에 의해 특징지어진다. 대조적으로, 도 2C에 도시되었듯이, Toremifene 처리된 30주된 TRAMP 쥐의 전립선은 대부분의 정상적 미립자 구조와 더욱 구별된 구조를 가진 ha 종양을 유지한다. 이러한 결과는 Toremifene은 저 도시지에서도 TRAMP 모델에서 전립선 암 발생을 억제할 수 있다.

서던 블롯 분석 : 전립선 조직(등의 측방향 및 복부 로브)는 10주된 것에서 취해졌고, 액체 N₂ 내에 스냅-동결되고, -80℃에서 저장되었다. 조직 용균물이 프로테아제 금지자(pefabloc, 아프로티닌, 베스타틴, 루펩틴, 및 펩스테인)과 포스파타제 금지자 Na₃VO₄(10mM)의 혼합물을 포함하는 RIPA 완충액(150 nM NaCl, 1%의 NP40, 0.5% 디옥시클로레이트, 0.1% SDS 및 50mM Tris, pH 7.5)을 사용하여 준비되었다. 호모제네이트는 10분 동안 4℃에서 14,000x g에서 원심분리되었고, 용균물은 -80℃에서 저장되었다.

프로테인 농도는 Bradford 프로테인 애세이(Bio-Rad)를 사용하여 결정되었다. 조직 용균물은 7.5% 폴리아크릴아미드 겔 상에 로딩되었고, 프로테인(40 μg/레인)은 SDS-PAGE 에 의해 분리되고, 전달 완충액(192 mg 글리신, 25mM Tris-HCL 및 20% 메타놀) 내에서 니트로셀룰로스 막(0.2μm, Bio-Rad, Hercules, CA)으로 전기 이동식으로 전달되었다. TRAMP 전립선 종양 조직은 포지티브 콘트롤로서 사용되었다. 케미루미네슨트 Cruz Markers(Santa Cruz 생물공학, Santa Cruz, CA)는 분자 중량 표준으로서 사용되었다. 블롯들은 BLOTTO(1X TBS 내의 6% 비지방 건조 우유)에서 4℃에서 밤새도록 블록킹되었고, 실내온도에서 2 시간 동안 큰 T-항원 주 항체(Pab 101 쥐 모노클로널, 1:200, Santa Cruz 생물공학)로 인큐베이트되었다. 블롯은 TTBS(0.05% Tween 20, 50mM Tris-Hcl, 200mM NaCl)로 세척되고, 25℃에서 1 시간 동안 호스래디시 페록사이다제 (HRP)-공액 2차 항체(1:5000)로 인큐베이트되었다. 면역반응성 프로테인은 강화된 케미루미네슨스(ECL) 시스템(APB, 피스카타웨이, NJ)을 사용하여 자동 X-선 사진 필림 상에 시각화되었다. 액틴 프로테인 표현 은 Tag 결과를 정규화하기 위해서 사용되었다. 이러한 목적을 위해서, 상기 막은 스트립핑 완충액(100 mM 2-메르캡토에타놀, 2% SDS, 62.5mM Tris-Hcl pH 6.7) 내에 담겨졌고, 가끔씩 교반하면서 30분 동안 50℃에서 인큐베이트되었다. 블록킹 후에, 막은 액틴 주 항체(1:2500, 케미콘, 테메큘라, CA)로 그 다음에는 (HBR)-공액 2차 항체(1:10000)로 재탐침되었다. ECL 검출 다음에, 밴드 강도는 Adobe Photoshop 5.0 Acquisition 및 ImageQuant 분석(분자 동력학) 시스템을 사용하여 정량화되었다.

실시예 5: 트램프 마우스 모델의 이전상태 암에 대한 토레미핀의 화학예방 효능의 사용

상기 실험에서 토레미핀의 화학예방 효능이 확인 및 증명된다. 상기 연구는 표준 동물의 이전상태 종양의 발달과 관련된 조직 및 분자 변경 및 양육, 스크린 및 양육 릴리스 약제 펠릿으로 처리된 TRAMP 동물의 토레미핀 메커니즘에 촛점을 맞춘다. 소정의 시간에, 5종의 동물 그룹을 희생시켜 그들의 이전상태를 제거하여 분석하였다. 이전상태 글랜드를 조직, 전장 해부, 및 큰 T 항원 면역조직화학에 의하여 종양의 존재를 평가하였다. 현재까지, 플레이스보 및 토레미핀 처리는 7, 10, 15 및 20주 포인트에 대하여 완료하였고, 그 결과는 다음과 같다.

결과: 여러 그룹에 대한 7, 10, 15 및 20주의 이전상태 전장을 완료하였다. 전장 분석에서는 플레이스보 처리된 쥐는 이전의 파일럿 연구와 유사하게 15-20주 마다 이전상태 종양이 발달된다는 점을 알았다. 또한, 토레미핀 처리된 동물은 20주까지는 이전상태 암의 발생이 지연되었다(도 3 참조). 20주까지는, 35주까지 토 레미핀 처리된 그룹에서 종양 발생이 현저하게 지연되었다(도 4 참조). 이들 데이터는 보다 민감한 발암 평가로도 토레미핀은 화학예방 활동을 나타내는 것으로 확인되었다. 조직 평가를 위하여, 세포조직 샘플을 고정시키고, 처리하고 그리고 파라핀을 매입하였다. 부분(두께 5pM)을 절단하여 일반적인 H&E 방법으로 착색시켰다. 토레미핀은 관 발달 및 세포조직 차이를 억제하였다(17주 TRAMP 쥐 이전상태 종양 대 야생(도 4 참조); b) 토레미핀 처리된 이전상태 조직 대 15주의 플레이스보(도 5 참조)를 비교). 질적으로, 플레이스보 및 토레미핀 처리된 세포조직의 면역조직화학은 복부 이전상태에 T-항원이 존재하는 것으로 나타났다. 따라서, 토레미핀에 의하여 알 수 있는 화학예방 활동은 TRAMP 모델의 프로베이신 프로모터 인자의 억제에 의하여 나타나지 않는다.

결론: TRAMP 모델에 이전상태 암이 발생하는 것을 방지하는 토레미핀의 능력은 종양을 형성시키는 더욱 민감한 기술을 사용함으로서 확인되었다. 토레미핀의 화학예방 효과의 메커니즘은 큰 T-항원 프로틴을 위한 전환 손실을 통해 나타나지 않는다.

실시예 6: 토레미핀이 누드 쥐 모델에 설정된 사람의 이전상태 암 종양의 퇴화를 유도

이전상태 암은 현재 미국 남자들에게 가장 공통적으로 진단되는 암이다. 그러나, 이들 질병에 대한 원인론 및 처리에 대하여 남아있는 의문은 특히 진전된 형태이다. 호르몬 치료는 호르몬 면역 질병이 공통적으로 발병함에도 불구하고 재발 성 및 진전된 이전상태 암을 처리하는 표준 방법이다. 따라서, 이전상태 암의 예방 및 처리에 대한 새로운 접근이 상기 질병으로 진단된 증가하는 많은 남자들을 수용하는데 필요하다. 실험 및 아래의 결과는 토레미핀이 애시믹 누드 쥐에서 호르몬 민감성 LNCaP 종양 성장을 억제하는 것을 나타낸다.

소재 및 방법: 매트리젤의 백만개의 LNCaP 셀을 애시믹 누드 쥐의 각 플랭크 내에 피하 주입하였다. 총 40 마리의 쥐에게 주입하였다. 대략 3-4주 후, 눈에 보이는 종양이 발달하였다. 종양의 치수를 두 가지 치수로 기록한 후, 쥐를 플레이스보로 분할하여 균등한 종양 부담에 따라 그룹을 처리하였다. 하나의 펠릿(플레이스보 대 토레미핀 35mg)을 각각의 쥐의 어깨뼈 사이에 피하 주입하였다. 종양 치수를 매주 측정하여 기록하였다. 종양의 체적을 계산하였다(종양 체적 = 0.5(L + W) X L X W X 0.5236, 여기서 L = 종양 길이 및 W = 폭). 펠릿 이식 시의 종양 체적을 앞으로의 종양의 치수 변경에 대한 기준점으로 사용하였다. 각각의 종양 체적의 매주 변화를 펠릿 이식 시의 본래 측정치에 대하여 백분율로서 기록하였다.

결과: 78개의 종양 주입 사이트 중에서, 적당한 체적의 종양의 55개(70%)를 평가하였다. 총 50개의 종양(24개의 플레이스보 및 26개의 토레미핀 처리된 동물)을 평가하였다. 펠릿 이식 시의 평균 종양 체적은 토레미핀 및 플레이스보 그룹(1.90mm³ 및 1,72mm³)와 유사하였다. 평균 종양 체적은 토레미핀 그룹(-0.22mm³)에서는 1,68mm³로 감소되는 한편, 플레이스보 그룹(+0.61mm³)에서는 2,33mm³로 증가하였다. 평균 혈청 PSA 레벨은 토레미핀 그룹(2.80ng/ml)에서보다 플레이스보 그 룹(3.80ng/ml)에서 더 높지만, 이것은 통계학적으로 중요한 것은 아니다(p=0.755). 총 테스토스테론 혈청 레벨은 플레이스보 그룹(n=17)에 대하여는 2.18(ng/ml) 그리고 토레미핀 그룹(n=19)에 대하여는 2.96ng/ml이었다.

두 마리의 쥐가 다른 쥐로부터의 치명상 때문에 펠릿 이식 후 곧바로 죽었다. 토레미핀으로 처리된 한 마리 쥐를 과다한 종양 출혈 및 혈종 발달 때문에 연구 대상에서 제외시켰다. 모든 쥐에 일방향 및 양방향으로 눈에 보이는 종양이 발달하였다. 각각의 종양은 연구하는 도중에 별개로 취급하였다. 24개의 종양을 플레이스보로 처리하고 28개의 종양을 토레미핀으로 처리하였다. 결과가 표 2 및 도 6A와 도 6B에 도시되어 있다.

< 표 2 >

플라시보군

주	수	치료 0일째 대비 상대적 부피 변화 %
3	11	9.44
4	8	115.27
5	8	271.71
6	8	600.88

토레미펜

주	수	치료 0일째 대비 상대적 부피 변화 %
3	11	-34.58
4	7	-61.01
5	7	-74.51
6	5	-61.72

추후 간격을 현재 보고된 집단에 대하여 연장할 것이며 추가 동물에 대한 데이터도 현재 수집하고 있다

결론: 토레미펜은 만성화된 LNCaP 종양을 억제하고 퇴화를 유도한다. 토레미펜이 이와 같은 효과를 발휘하는 메카니즘에 대해서는 알 수 없으나, 이와 같은 효과를 나타내는 능력은 만성화된 전립선 암의 미세전이가 있는 높은 위험의 환자에게서 전립선 암의 치료 및 전립선 암의 재발생을 억제하는 토레미펜의 용도를 확인시킨다.

실시예 7: 토레미펜은 IIa 상 전립선 암 화학억제 인체 임상 실험에서 HGPIN 퇴화를 일으킨다.

전립선 암에 대한 토레미펜의 화학억제 효과는 자연발생 인체 전립선 암이 만성화된 동물 모델에서 반복적으로 확인되고 있다. 이는 전립선 암에 대한 화학억제 활성을 나타내는 첫 번째 화합물을 대표한다. 또한 높은 진행도의 PIN(HGPIN)이 만성화되고 잠복성 전립선 암으로 알려진 인체 전립선 암에 대한 전조 장애에 시간이 테스트된다.

동시에 HGPIN은 인체 전립선 암에 대한 중간체 종점 또는 대용체 종점으로서 사용된다. 실제로, NCI는 PIN이 인체 전립선 암의 중간체 종점 또는 대용체 종점으로서 사용하도록 권장하고 있다.

17명의 사람 대상으로 IIa 상, 공개 라벨된 비 임의적 단일 센터 연구가 실시되었다. 이 프로토콜에서, 생체조직검사로 PIN으로 밝혀진 환자를 토레미펜 60mg으로 매일 4개월동안 치료하였다. 4개월후, 환자들은 다시 생체조직검사(8 생체조직검사)하고, PIN 상태를 다시 분석하였다. 21명의 환자가 연구 대상이 되었 고, 16명의 환자에 대하여 연구를 완료하였다. 이들 16명의 환자의 전립선 생체조직검사의 병리학적 연구 결과는 12 환자의 PIN이 양성 또는 완화된 전립선 조직으로 퇴화됨을 보여 주었다: 따라서 16명중 12명(75%)의 환자가 완치 반응을 나타내었다. 나머지 4명의 환자중 3명은 전립선 암을 갖고 있었으나 PIN의 양이 감소하였고 1명의 환자는 지속적으로 병이 유지되었으나 PIN 상피조직이 완화되고 퇴화되는 변화를 알 수 있었다.

병리학적 평가는 전립성 상피조직에서 완화된 변화를 갖고 PIN이 완전히 삭아 없어짐을 나타냈다. 이 환자들은 토레미펜 처리시 급성 또는 만성 독성을 경험하지 못하였다. PSA 혈청, 무테스토스테론 혈청, 총 테스테스테론 혈청 및 에스타디올 혈청이 통상의 범위내에서 남아 있었다. 성교 능력 및 성욕에 아무런 영향이 없는 것을 포함하여 라이프(life) 양적으로 아무런 변화가 없었다. 그러므로 이러한 결과는 토레미펜의 전립선 질환에 대한 예방적 효과를 나타내는 것이다.

이 결과들로부터 토레미펜이 PIN을 감소시키고 이에 따라 전립선 암의 빈도 및 잠복성의 연장을 감소시키도록 영향을 주고 전립선 발암을 억제함을 알 수 있다.

실시예 8: 화학억제제의 역할: 항에스트로겐 : 타목시펜 사이트레이트 및 라록시펜 ( SERMs ) 및 파스로덱스 (순수 항에스트로겐 ICI 182, 780), 전립선 발암 억제

실험 계획: 마우스의 화학억제 치료법은 생후 30일에 시작하였다. 50개의 이종 TRAMP 수컷 마우스 3군 각각에 대하여 항에스트로겐 타목시펜 사이트레이트 또는 라록시펜 (SERMs) 도는 파스로덱스 (순수 항에스트로겐 ICI 182, 780)으로 치료하였다. 약은 고안된 서방성 펠렛으로 없었다(Innovative Research of America, Sarasota, FL)고 피하 이식으로 전달하였다(예비 데이터 참조). 대조 동물은 약리학적 활성이 없는 플라시보 이식을 받았다. 동물(n=10)은 주기적 간격 10, 15, 20, 25, 및 30 주령으로 죽여시켜, 암 형성 없음 또는 있더라도 암 크기의 감소를 보이는 약효를 플라시보 대조 동물과 비교하여 분석하였다. 혈액을 수거하여 각 치료시 혈청에서 안드로겐 및 에스트로겐의 변화를 측정하였다. 전립선 조직을 a) 형태 연구용, b) 조직학적 연구용, 조직을 10% 완충용액 포르말린에 고정하고 처리하여 파라핀에 묻음, c) 분자 연구용, 조직을 액체 질소에서 동결시키고 -70。C에서 보관함,으로 보관하였다. 괴저(Necropsies) 및 생존 데이터를 기록하였다.

실험 결과는 TRAMP 모델에서 전립선 암의 억제 및 지연에서 다양한 항에스트로겐의 상대적 화학억제 효능을 나타내었다. 형태학적 연구는 전체적 변화, 있는 경우, 각 치료에 따라 전립선 크기 및 도관 패턴의 변화를 나타낸다. 파라핀화된 조직 절편은 H&E 기술을 사용해서 염색하여 PIN 등의 조직학적 변화를 검사하여 표준 전립선 선암의 전구체로서 전암 증상의 장애 형상을 모니터한다. 혈청 에스트라디올 및 총 테스토스테론 레벨은 각 시기별 간격으로 측정하여 이들 호르몬의 변화를 분석하고, 이들이 PIN의 변화와 관련되었는지를 분석한다. TGF, TGF1, TGF3 및 bFGF 펩티드 성장 팩터 레벨은 각 시기 별로 얻은 전립선 샘플에서 정량한다. 대응 펩티드 성장 팩터 리셉터도 EGFR 및 TGF RI 및 RII를 위해 분석하였다.

< 표 3 >

TRAMP 모델에서 전립선 암 억제에 대한 SERMs (Selective Estrogen Receptor Modulators)의 효과

SERM	양	20주/종양 수	20주 (종양 %)
플라시보		5/5	100%
토레미펜	20 mg/kg/d	1/7	14.2%
타목시펜	20 mg/kg/d	2/9	22%
라록시펜	20 mg/kg/d	3/10	30%
*파스로덱스(ICI 128, 780)	10 mg/kg/d	8/11	72%

동물들은 2-주령에서 죽이고 전립선을 전체량 분석 및 조직학적으로 분석을 행하였다.

* 파스로덱스는 순수 항에스트로겐이고 상대적인 성교 능력은 다른 SERMs의 2x여서, 파스로덱스 10mg/kg/d=SERM의 20mg/kg/d 이다.

본 발명은 전립선암의 화학적 예방, 특히 포유류 대상에게 화학적 예방제 및 그의 유사체 및 대사산물을 투여하는 단계를 포함하는 잠재적 전립선암 및 전립선 선암 병변의 전암성 전구체의 치료, 억제, 예방 또는 그의 양의 감소에 유효하다.

Claims

랄록시펜, 타목시펜, 드롤록시펜 또는 이독시펜; 및 그 제약학적으로 허용 가능한 염, 또는 이들의 혼합물을 포함하는, 전립선 선암 병변의 전암성 전구체의 치료, 억제, 예방 또는 그의 양의 감소용 약학 조성물.
제1항에 있어서,

상기 전립선 선암의 전암성 전구체는 전립선암이 아닌 것을 특징으로 하는 조성물.
제2항에 있어서,

상기 전립선 선암의 전암성 전구체가 전립선 상피내 신생물(PIN)인 것을 특징으로 하는 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

제약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 담체는 검, 전분, 당, 셀룰로오스 물질, 및 이들의 혼합물로 이루어지 는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 이를 함유하는 펠릿을 피하 삽입하여 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제6항에 있어서,

상기 펠릿은 일정 기간에 걸쳐 상기 약학 조성물의 조절 방출을 제공하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 액체 형태로 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 주사로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 액체 또는 고체 제제로 경구투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 피부표면에 국부적으로 적용하여 투여되는 것을 특징으 로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 펠릿, 정제, 캡슐, 용액, 현탁액, 에멀젼, 일릭서, 젤, 크림, 및 좌약으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제11항에 있어서,

상기 좌약이 직장용 좌약 또는 요도용 좌약인 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 비경구용 제형인 것을 특징으로 하는 조성물.
제13항에 있어서,

상기 비경구용 제형은 화학적 예방제 및 사이클로덱스트린 화합물의 복합체를 포함하는 리포좀을 포함하는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 체중 kg당 0.5 mg/일 내지 80 mg/일 용량의 화학적 예방제로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 체중 kg당 10 mg/일 내지 60 mg/일 용량의 화학적 예방제로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 체중 kg당 20 mg/일 내지 60 mg/일 용량의 화학적 예방제로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 체중 kg당 60 mg/일 용량의 화학적 예방제로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.
제4항에 있어서,

상기 약학 조성물은 체중 kg당 20 mg/일 용량의 상기 화학적 예방제로 투여되는 것을 특징으로 하는 조성물.