상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)의 물 또는/및 유기용매 추출물, 상기 추출물의 유효성분인 베르베린(berberine) 또는 베르베린 유도체를 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은
1) 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)를 세절하여 물, 메탄올 또는 에탄올로 추출하는 단계;
2) 단계 1)에서 수득한 추출액을 침지 및 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 수득한 여과액을 감압농축하는 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물 제조방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)의 물 또는/및 유기용매 추출물, 상기 추출물의 유효성분인 베르베린(berberine) 또는 베르베린 유도체를 함유하는 식물 병원균 방제용 조성물을 제공한다.
미나리아재비과에 속하는 황련(Coptidis rhizoma)은 경상북도 이북 지역에서 자생하는 다년생 식물로, 위액 분비 촉진, 산도 상승, 펩신 작용 저하, 리파아제 작용 항진, 진경 작용, 항염증 작용, 동맥경화 예방효과, 황색 포도상구균 및 효모균에 대한 항균작용과 같은 약리학적 작용을 가지는 것으로 알려져 있다(마진열, 성현제, 주혜정, 김인락, 황금희, 정규용. 1999. 한국독성학회지 15:103-107).
황백(Phellodendron amurense)은 산초나무과의 황백나무 또는 기타 동속식물의 수피이고 동북아시아가 산지이며, 국내는 북한에서 주로 생산된다(엄동욱, 정윤철. 2001. 약학회지 45:34-38).
양귀비과에 속하는 다년생 식물인 생귀나리아(Sanguinaria canadensis : blood root)의 추출물은 구강연쇄상구균의 감소능력을 가진 벤조페난티리딘 알칼로이드(benzophenanthridine alkaloid)의 일종인 생귀나린(sangurine)을 포함하고 있는데, 이는 치면 세균막 형성 억제제로서 이용되고 있다(김종배, 백대일, 문혁수, 서현석, 진보형, 송연희. 1992. 대한구강보건학회지 16:522-530).
백굴채(Chelidonium majus var. asiaticum : 애기똥풀)는 독일약전 제 8 개정 및 중국약전에 수재된 생약으로 양귀비과에 속하는 다년초이며 우리나라에 널리 자생하고 있다(장승엽, 류경수. 1985. 경희약대논문집 13:143-147).
본 발명에 사용되는 상기 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)는 적절한 시기에 자생지에서 직접 채취할 수 있거나 건제로 시중에서 구입할 수 있다.
본 발명의 조성물은 고추 탄저병, 오이 모잘록병, 딸기 잿빛곰팡이병, 흰가루병 등의 방제에 사용될 수 있다. 구체적으로 본 발명의 조성물이 사용될 수 있 는, 상기 각각의 병에 대한 병원균은 다음과 같다. 고추 탄저병의 병원균은 콜레토트리큠 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 콜렉토트리쿰 데마티움(Colletotrichum dematium), 콜렉토트리쿰 코코데스(Colletotrichum cocodes), 오이 모잘록병의 병원균은 피티움 얼티멈(Pythium ultimum), 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 딸기 잿빛곰팡이병의 병원균은 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea), 흰가루병의 병원균은 스페러테카 아파니스(Sphaerotheca aphanis), 필락티니아 카키콜라(Pyllactinia kakicola), 라베일루이아 타우리카(Leveilluia taurica), 운시눌라 네카터(Uncinula necator), 스페러테카 판노사(Sphaerotheca pannosa), 에리시페 이코라세아룸(Erysiphe cichoracearum), 스페러테카 풀리기니아(Sphaerotheca fuliginea), 포도스파에라 루코트리카(Podosphaera leucotricha), 스페러테카 후물리(Sphaerotheca humuli), 스페러테카 푸스카(Sphaerotheca fusca), 에리시페 헤라클레이(Erysiphe heraclei), 에리시페 아퀼레지아(Erysiphe aquilegiae) 등을 포함한다. 특히, 본 발명의 조성물은 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 피티움 얼티멈(Pythium ultimum), 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 스페러테카 아파니스(Sphaerotheca aphanis)를 효과적으로 방제할 수 있다.
본 발명의 조성물의 효과는 하기와 같이 검증하였다.
본 발명자들은 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 추출물의 방제효과를 측정하였다. 구체적으로 실시예 1에서 제작한(도 1 또는 도 2 참조) 표준 엑스 일정량을 배지에 첨가하고 이에 고추 탄저균, 오이 모잘록균 및 딸기 잿빛 곰팡이를 접종한 후 균사의 생장 척도를 측정하여 표준 엑스의 항생력을 검정하였다. 그 결과, 표 1 내지 표 4에서와 같이 황련, 황백, 생귀나리아 및 백굴채(애기똥풀) 각각의 조추출물은 고추 탄저균, 모잘록균 및 딸기 잿빛곰팡이에 대해 균사생장 억제활성을 나타냄을 확인하였다.
본 발명자들은 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 추출물의 딸기 흰가루병에 대한 방제효과를 측정하기 위하여 실시예 1에서 제작한 표준 엑스를 처리하였다. 그 결과, 표 7에 나타난 바와 같이, 황련, 황백, 생귀나리아, 백굴채(애기똥풀) 추출물, 베르베린 또는 그 유도체로 처리된 식물에서 모두 약제처리 전에 비하여 딸기 흰가루병 이병과율이 큰 폭으로 감소하였다. 또한 상기 표준 엑스를 농도별로 처리한 결과, 표 8과 같이 농도에 의존적으로 딸기 흰가루병에 대해 방제효과가 나타남을 확인하였다.
이로써, 본 발명의 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)의 추출물은 고추 탄저병을 유발하는 병원균인 콜레토트리큠 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 오이 모잘록병을 유발하는 피티움 얼티멈(Pythium ultimum), 딸기 잿빛곰팡이병을 유발하는 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea) 및 흰가루병을 유발하는 스페러테카 아파니스(Sphaerotheca aphanis)에 대해 저지 효과가 있으며, 특히 스페러테카 아파니스(Sphaerotheca aphanis)에 대해 우수한 방제활성을 나타냄을 확인하였다. 본 발명의 추출물은 액체 및 분말로 제조될 수 있다.
본 발명자들은 실시예 1에서 얻어진 표준 엑스와 베르베린(berberine) 표준 품으로 TLC(thin layer chromatography)를 실시하여 전개된 밴드 중 표준 엑스와 베르베린 표준품이 일치하는 부분을 수집하고(도 3 참조) 이를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 단일 물질로 분리한 후, 베르베린 표준품과 비교하여 동정하였다. 그 결과, 도 5에서 보는 바와 같이 베르베린 표준품과 동일한 머무름 시간에서 피크(peak)가 형성되었다.
베르베린 및 그 유도체에 해당하는 TLC 밴드를 분리하여 이것으로 고추 탄저균, 오이 모잘록균, 딸기 잿빛곰팡이와 같은 공시 병원균에 대한 균사 생장 억제율을 조사하였다. 그 결과, 표 6에 나타난 바와 같이 베르베린 및 그 유도체로 처리한 페이퍼 디스크(paper disk) 주변에 생육 저지대가 뚜렷하게 나타났다. 따라서, 상기 실시예 1에서 공시 병원균에 대한 항생력을 가지는 것으로 밝혀진 본 발명의 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)의 추출물 또한 실험과 일치하는 효과를 나타냄을 확인하였다. 따라서, HPLC와 항생활성 실험결과 상기 추출물 중 항진균 활성을 나타내는 활성물질은 베르베린 및 그 유도체임을 확인하였다. 베르베린 또는 베르베린 유도체는 하기의 일반식으로 표시되며 X는 Cl-, I- 또는 Br-일 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 활성 성분 이외에 하나 이상의 다른 농약제를 첨가할 수 있고 수화제, 유화 농축제, 수용성 분말, 분제, 과립제, 현탁 농축제 등의 농약에 일반적으로 사용되는 적당한 담체 및 또는 첨가제를 혼합함으로써 제조될 수 있다. 고체 담체로는 콩가루, 밀가루 등의 곡분, 규조토, 인회석, 석고, 활석, 벤토나이트, 점토 등의 광물질이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 액체 담체로는 식물성 기름, 광물성 기름, 석유(예: 등유 및 나프타), 크실렌, 시클로 헥산, 시클로 헥사논, 디메틸포름아미드, 디메틸술폭시드, 트리코로로에틸렌, 메틸이소부틸케톤 및 물이 사용될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 필요하다면, 균질 및 안정한 제재를 조성하기 위하여 계면 활성제를 첨가한다.
본 발명의 조성물은 수화분말, 유화 농축제, 수용성 분말 및 현탁 농축제를 특정 농도가 되게 물로써 희석시켜 식물에 분무하기 위한 수성 현탁액 또는 수성 유제 등을 사용할 수 있다.
본 발명의 방제 조성물에서 상기 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 추출물(동결건조 분말) 각각의 방제를 위한 유효 농도(조성물의 부피당 동결 건조 분말의 중량)는 1 μg/ml 내지 1000 μg/ml 이고 바람직하게는 10 μg/ml 내지 1000 μg/ml 이다. 상기 추출물에 포함된 유효성분인 베르베린 및 그 유도체의 방제를 위한 유효 농도는 1 μg/ml 내지 1000 μg/ml 이고 바람직하게는 10 μg/ml 내지 1000 μg/ml 이다(표 8 참조).
본 발명의 방제 조성물은 들판, 산림, 조림지, 온실, 과수원 또는 포도원의 보호에, 재배작물 또는 삼림수, 예를들면 곡류(예, 옥수수, 밀, 쌀 또는 사탕수수), 목화, 담배, 채소류(예, 오이, 고추, 대두, 상치, 양파, 토마토 또는 후추), 밭농작물(예, 딸기, 감자, 사탕무우, 땅콩 또는 콩), 사탕수수, 목초지 또는 마초(예, 옥수수 또는 사탕수수 ), 재배작물(예, 차, 커피, 코코아, 바나, 팜유, 코코넛, 고무 또는 향료), 과수 또는 작은 나무밭(예, 감귤류, 키위, 아보카도, 망고, 올리브 또는 호도), 포도원, 장식용 식물, 꽃 또는 채소류 또는 풀밭, 정원 및 공원의 관목 또는 숲의 삼림수(낙엽수 및 상록수), 재배장 또는 양수의 보호에 유용하다.
또한, 본 발명은
1) 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)를 세절하여 물 또는/및 유기용매로 추출하는 단계;
2) 단계 1)에서 수득한 추출액을 침지 및 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)에서 수득한 여과액을 감압농축하는 단계를 포함하는 식물 병원균 방제용 조성물 제조방법을 제공한다.
본 발명의 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)의 추출물은 상기 시료를 채취 후 5일간 음건하거나, 시중에서 유통되는 상기 천연물을 마쇄한 후 물 또는/및 유기용매로 추출, 여과하고 감압 농축하여 추출물을 수득할 수 있다(도 1 및 도 2 참조). 상기 단계 1)에서 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)과 물 또는/ 및 유기용매는 당업계 숙련자 기준으로 적당 비율로 혼합할 수 있으며, 바람직하게는 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) g당 물 또는/ 및 유기용매 5ml 비율로 혼합하는 것이 적당하다. 추출에 사용할 수 있는 유기용매로는 에탄올, 퍼트롤리움 에테르(pertroleom ether), 클로로포름 및 메탄올, 바람직하게는 에탄올 및 메탄올 등이 있으며 이는 물과 적절한 비율로 혼합될 수 있고 바람직하게는 물: 유기용매의 비율이 2:1(v/v)이 될 수 있다. 본 발명의 추출물은 액체 및 분말을 포함하나 다른 언급이 없으면 분말을 의미한다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단. 하기 실시에는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 추출물의 제조
시중에서 구입 또는 적절한 시기에 직접 채취한 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)를 음건하고 절단한 후 분쇄기를 사용하여 20mesh 크기로 분쇄하였다. 각각 100g의 생체 시료에 500ml의 정제수(도 2) 또는 정제수와 에탄올(또 는 메탄올)이 2:1로 혼합된 용매(도 1)를 가하여 환류 추출장치로 상온에서 교반하여 주며 하루 동안 방치한 후 여과지를 사용하여 여과하였다. 수득된 조추출액을 감압 농축한 후 동결건조기내에서 24시간 건조시켜 수득된 분말을 4℃에 보관하면서 실험에 사용하였다(도 1 및 도 2). 상기 분말은 화합물의 성분이 밝혀지지 않은 추출물이라는 의미에서 ‘표준 엑스’라고 명명하였다.
<실시예 2> 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 추출물의 식물 병원균에 대한 방제효과
<실시예 1>에서 수득된 표준엑스의 식물 병원균에 대한 억제활성을 조사하기 위하여, 각각 고추 탄저병, 오이 모잘록병, 딸기 잿빛곰팡이병을 유발하는 공시 병원균인 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스(Colletotrichum gloeosporioides), 피티움 얼티멈(Pythium ultimum) 및 보트라이티스 시네레아(Botrytis cinerea)에 대하여 다음과 같이 검정하였다. 각 표준엑스 일정량을 1.6, 0.8, 0.4, 0.2, 0.1mg/ml가 되도록 2배씩 단계적으로 희석하고 멤브레인 필터(0.2μm)를 통과시킨 후 멸균한 PDA(potato dextrose agar) 18ml에 2ml씩 가해 잘 섞어 페트리 접시(Petri dish) 상에서 굳혔다. 29℃에서 5 일간 배양시킨 공시병원균 균총을 직경 5mm 크기로 천공하여 굳힌 배지에 접종하고, 29℃에서 4 일간 둔 후 균사의 생장 척도를 측정하여 항균력을 검정하였다. 즉, 표준 엑스을 처리한 배지의 균사체 직경 감소를 무처리구의 균사체 직경과 비교하여 상대적인 생장 저해율(%)을 계산하 여 EC50(50% effective concentration)을 조사하였다. 그 결과, 표 1~표 4에 나타난 바와 같이, 본 발명의 표준 엑스의 고추 탄저균, 모잘록균 및 딸기 잿빛곰팡이 대한 EC50값은 400~800μg/ml 로, 식물 곰팡이 병원균에 대해 균사생장 억제활성을 나타냄을 확인하였다. 각각의 표에서 LSD는 최소유의차(least significant difference)를 나타내고 CV는 변동계수(coefficient of variation)을 나타낸다.
[표 1] 황련 추출물의 농도에 따른 공시 병원균에 대한 균사생장 억제능
농도(μg/ml) |
고추 탄저균 |
오이 모잘록균 |
딸기 잿빛곰팡이 |
LSD(0.05) |
LSD(0.01) |
CV(%) |
100 |
51.3 a) |
65.3 |
31.3 |
4.17 |
5.78 |
4.83 |
200 |
47.7 |
52.3 |
25.3 |
4.85 |
6.73 |
6.63 |
400 |
41.3 |
46.7 |
19.7 |
3.20 |
4.44 |
5.09 |
800 |
32.0 |
31.3 |
15.3 |
4.25 |
5.90 |
9.25 |
1,600 |
26.0 |
22.3 |
11.3 |
2.98 |
4.13 |
8.55 |
Control |
60.3 |
78.7 |
36.3 |
5.16 |
7.16 |
5.04 |
LSD(0.05) LSD(0.01) |
3.77 5.23 |
3.03 4.21 |
2.82 3.92 |
- |
- |
|
CV(%) |
6.45 |
4.52 |
8.96 |
- |
- |
|
a) 균사체 직경(mm)
[표 2] 황백 추출물의 농도에 따른 공시 병원균에 대한 균사생장 억제능
농도(μg/ml) |
고추 탄저균 |
오이 모잘록균 |
딸기 잿빛곰팡이 |
LSD(0.05) |
LSD(0.01) |
CV(%) |
100 |
59.7 a) |
77.3 |
35.0 |
3.60 |
4.99 |
3.58 |
200 |
55.3 |
70.3 |
31.7 |
4.63 |
6.43 |
5.04 |
400 |
49.3 |
51.3 |
27.3 |
3.92 |
5.44 |
5.24 |
800 |
38.3 |
43.3 |
18.3 |
3.65 |
5.06 |
6.24 |
1,600 |
30.3 |
38.7 |
12.7 |
5.72 |
7.94 |
11.99 |
Control |
61.7 |
79.7 |
36.3 |
6.40 |
8.88 |
6.17 |
LSD(0.05) LSD(0.01) |
3.88 5.38 |
3.88 5.38 |
3.31 4.59 |
- |
- |
|
CV(%) |
5.82 |
4.75 |
9.07 |
- |
- |
|
a) 균사체 직경(mm)
[표 3] 생귀나리아 추출물의 농도에 따른 공시 병원균에 대한 균사생장 억제능
농도(μg/ml) |
고추 탄저균 |
오이 모잘록균 |
딸기 잿빛곰팡이 |
LSD(0.05) |
LSD(0.01) |
CV(%) |
100 |
58.7 a) |
75.3 |
32.3 |
4.95 |
6.88 |
5.10 |
200 |
56.3 |
69.7 |
24.7 |
5.25 |
7.29 |
5.97 |
400 |
46.3 |
52.3 |
19.7 |
4.29 |
5.95 |
6.21 |
800 |
39.7 |
38.3 |
15.3 |
5.45 |
7.56 |
9.99 |
1,600 |
31.0 |
29.7 |
12.0 |
2.34 |
3.24 |
5.50 |
Control |
59.7 |
77.0 |
34.7 |
3.60 |
4.99 |
3.59 |
LSD(0.05) LSD(0.01) |
4.21 5.84 |
2.58 3.58 |
3.35 4.65 |
- |
- |
|
CV(%) |
6.38 |
3.33 |
10.69 |
- |
- |
|
a) 균사체 직경(mm)
[표 4] 백굴채(애기똥풀) 추출물의 농도에 따른 공시 병원균에 대한 균사생장 억제 능
농도(μg/ml) |
고추 탄저균 |
오이 모잘록균 |
딸기 잿빛곰팡이 |
LSD(0.05) |
LSD(0.01) |
CV(%) |
100 |
55.7 a) |
67.3 |
30.3 |
6.07 |
8.42 |
6.78 |
200 |
42.3 |
52.3 |
23.3 |
3.35 |
4.65 |
4.87 |
400 |
37.3 |
39.7 |
17.3 |
3.65 |
5.06 |
6.62 |
800 |
29.7 |
31.3 |
11.7 |
3.65 |
5.06 |
8.59 |
1,600 |
22.7 |
25.3 |
9.7 |
4.41 |
6.12 |
13.09 |
Control |
61.3 |
72.7 |
33.3 |
3.20 |
4.44 |
3.27 |
LSD(0.05) LSD(0.01) |
3.18 4.42 |
3.84 5.32 |
2.54 3.52 |
- |
- |
|
CV(%) |
5.65 |
5.88 |
8.93 |
- |
- |
|
a) 균사체 직경(mm)
<실시예 3> 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)의 추출물의 성분분획과 성분분석 및 유효성분 베르베린(berberine)과 그 유도체의 항균활성 효과 시험
실시예 1에서 수득된 표준 엑스 및 대조군으로 베르베린(berberine) 표준품(시그마사)을 사용하여 공지된 방법에 따라 TLC(thin layer chromatography) 분석을 실시하였다. 즉, 상기 분말 및 표준품을 클로로포름 : 메탄올 : 증류수(5:1:0.1)을 용매로 하여 전개하고 UV하에서 나타난 밴드(band)를 확인하였다. 표준 엑스의 밴드 중 베르베린(berberine)과 일치하는 부분을 수집하고(도 3) 이로부터 얻은 분획시료를 HPLC(High Performance Liquid Chromatography)를 이용하여 단일 물질로 분리한 후, 베르베린 표준품과 비교하여 동정하였다. 구체적인 HPLC 조건은 표 5와 같다.
[표 5] HPLC 분석시 동작조건
Parameter |
Condition |
컬럼(Column) |
μBondpak C18 Column (4.6mm×250mm) |
용매 시스템(Solvent system) |
0.1% H3PO4 50%, CH3CN 50%, SDS 0.6% |
유속 |
1.5ml/min. |
탐지기(Detector) |
UV visible 254nm |
주입(Injection) |
부피 10μL |
HPLC에는 HPLC용 동급 용매(시그마사)를 사용하였고 증류수는 탈이온 처리하였으며 사용 전에 0.45μm 필터로 여과하여 사용하였다. 그 외 추출 및 조제용은 1급 시약을 사용하였으며 검량선 작성을 위하여, 베르베린 표준품 0.5mg을 메탄올 용액 5ml에 용해시킨 후 각각 5μl, 10μl, 50μl를 용매에 주입하여 검량선을 작성하였다(도 5). 상기와 같은 조건에서 HPLC로 분석한 결과, 표준 엑스는 베르베린 표준품과 동일한 머무름 시간에서 피크(peak)가 형성되었다.
또한, 1H NMR(nuclear magnetic resonance)을 이용하여 베르베린 표준품과 황련에서 분리된 물질을 조사한 결과, 도 6에 나타난 바와 같이, 피크의 모양이 서로 유사함을 확인하였다.
베르베린 및 그 유도체가 균사 생장 억제 활성을 나타내는지 확인하기 위하여, 베르베린 및 그 유도체에 해당하는 TLC 밴드를 수집하고 페이퍼 디스크법(paper disk method)(Ericsson, H., Hogman, C. & Wickman, K. (1954). Scandinavian Journal of Clinical Laboratory Investigation 6, Suppl. 11, 21-6) 을 이용하여 공시 병원균에 대한 항균활성을 조사하였다. 그 결과, 표 6에서 보는 바와 같이 베르베린 및 그 유도체를 처리한 페이퍼 디스크 주위에 뚜렷하게 저지대가 형성됨을 확인하였다.
따라서, 상기 HPLC 분석, 1H NMR 분석 및 식물병 곰팡이 억제 실험 결과, 본 발명의 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)의 추출물 중 병원균 억제 활성을 나타내는 물질은 베르베린 및 그 유도체로 동정되었다.
[표 6] TLC로부터 분리한 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 스팟(spot)과 베르베린 및 그 유도체의 공시 병원균에 대한 균사생장 억제능
Isolated compound from |
고추탄저균 |
오이 모잘록균 |
딸기 잿빛곰팡이 |
황련 |
++a) |
++ |
+ |
황백 |
+ |
+ |
+ |
생귀나리아 |
+ |
+ |
+ |
백굴채(애기똥풀) |
+ |
+ |
+ |
염화 베르베린 |
++ |
++ |
+ |
요오드화 베르베린 |
+ |
+ |
+ |
브롬화 베르베린 |
+ |
+ |
+ |
무처리 |
- |
- |
- |
a) ++ : 저지대(inhibition zone) 형성 뚜렷(distinctly).
+ : 저지대 형성 보통(moderately).
- : 저지대 형성 안됨
<실시예 4> 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 추출물, 그 유효성분 베르베린(berberine) 및 그 유도체의 딸기 흰가루 병원균에 대한 방제효과 시험
황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 추출물과 베르베린 및 그 유도체의 딸기 흰가루병에 대한 방제효과를 측정하기 위하여 실시예 1에서 얻어진 표준 엑스와 베르베린 및 그 유도체를 대상으로 스페러테카 아파니스 변종(Sphaerotheca aphanis var. aphanis) 병원균에 의해 발생한 딸기 흰가루병 방제 실험을 실시하였다. 생체시료 10g에 해당하는 양의 상기 추출물을 취하여 30ml의 250μg/ml 트윈20(Tween 20) 용액(시그마사)에 넣고 잘 용해시킨 후 시료를 준비하였고, 베르베린 및 그 유도체(도 4)는 최종 농도가 400μg/ml가 되도록 30ml의 250μg/ml 트윈20 용액에 넣어 잘 용해시킨 후 시료를 준비하였으며 음성 대조군은 증류수에 250μg/ml의 트윈 20을 가한 후 시료를 준비하였다. 대조약제로는 시판 중인 병충해 방제 약제인 리프졸 수화제 30%(Rifzol WP, Aventis Crop Science Korea)를 선택하여 4,000배 희석하고 포장 상용농도인 75μg/ml의 양을 처리하였다.
사질양토조건의 하우스에서, 장희 품종을 대상으로 하여 난괴법 3 반복으로 각 처리당 18주씩 조사주를 설정하여 약제 처리 전 이병과율 대비 처리 7일 후 이병과율을 조사하였다(난괴법이란 1인자는 모수이고 1인자는 변량인 반복이 없는 이원배치법의 실험을 말한다). 약제처리 전 딸기 흰가루병 이병과율은 34.1%이었다. 이병과율은 총 조사 과수에 대한 이병과수의 백분비를 산출하여 나타내었다. 그 결과, 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀) 추출물과 베르베린 및 그 유 도체는 표 7에 나타낸 것과 같이, 합성 농약을 대체할 수 있을 정도로 스페러테카 아파니스 변종(Sphaerotheca aphanis var. aphanis) 병원균에 의해 발생한 딸기 흰가루병에 대해 우수한 방제효과를 나타냄을 확인하였다.
[표 7] 시험약제의 딸기 흰가루병에 대한 이병과율 조사 (약제처리 7일 후)
CV : 27.82
시험약제 |
처리전 발병율 |
이병과율(%) |
유의차 (DMRT) |
방제가 (%) |
I반복 |
II반복 |
III반복 |
평균 |
황련 |
34.1 |
4.3 |
4.2 |
6.0 |
4.8 |
ab |
74.7 |
황백 |
32.4 |
7.1 |
10.3 |
11.4 |
9.6 |
c |
49.5 |
생귀나리아 |
32.2 |
12.0 |
6.9 |
6.1 |
8.3 |
bc |
56.3 |
백굴채 |
30.8 |
5.4 |
4.9 |
4.9 |
5.1 |
ab |
73.2 |
염화베르베린 |
29.5 |
5.9 |
6.4 |
5.1 |
5.8 |
abc |
69.5 |
요오드화베르베린 |
33.3 |
7.1 |
7.2 |
6.6 |
7.0 |
abc |
63.2 |
브롬화베르베린 |
32.1 |
5.2 |
7.5 |
6.1 |
6.3 |
abc |
66.8 |
대조약제 (리프졸 수화제) |
28.1 |
4.6 |
3.7 |
2.7 |
3.7 |
a |
80.5 |
무처리 |
34.1 |
13.8 |
20.0 |
23.1 |
19.0 |
d |
- |
<실시예 5> 황련, 황백, 생귀나리아 또는 백굴채(애기똥풀)의 추출물, 그 유효성분 베르베린(berberine) 및 그 유도체의 농도에 따른 딸기 흰가루병에 대한 방제효과 시험
실시예 1에서 얻어진 표준 엑스와 염화 베르베린, 요오드화 베르베린 및 브롬화 베르베린 표준품으로 실시예 4의 방법에 따라 각각의 약제 농도별 스페러테카 아파니스 변종(Sphaerotheca aphanis var. aphanis) 병원균에 의해 발생한 딸기 흰가루병 방제효과를 시험하였다. 그 결과, 표 8 내지 14에 나타난 바와 같이, 각 추출물은 모든 농도에서 딸기 흰가루병에 대한 방제효과가 우수하여 딸기 흰가루병에 대하여 대조군인 리프졸 수화제를 포장 상용농도인 75μg/ml의 양으로 처리한 것과 유사한 방제효과를 나타냈다. 따라서 각 추출물, 베르베린(berberine) 및 그 유도체는 농도에 의존적으로 딸기 흰가루병에 대해 방제효과가 나타났으며, 조성물 1ml 당 100g의 생체 시료에 500ml의 정제수를 가하여 실시예 1에 따라 수득한 추출물은 동결건조하여 만든 분말을 최소 1μg/ml 이상 농도로, 바람직하게는 10 μg/ml 이상 농도로 사용하여 스페러테카 아파니스 변종(Sphaerotheca aphanis var. aphanis) 병원균에 의해 발생한 딸기 흰가루병을 방제할 수 있고 이는 합성농약을 대체할 정도로 우수한 효과임을 확인하였다.
[표 8] 황련의 농도에 따른 딸기 흰가루병에 대한 이병과율 조사(약제처리 7일 후)
CV : 13.61
시험약제 |
농도 (μg/ml) |
처리전 발병율 |
이병과율(%) |
유의차 (DMRT) |
방제가 (%) |
I반복 |
II반복 |
III반복 |
평균 |
황련 추출물 |
1000 |
34.3 |
4.3 |
4.2 |
8.5 |
5.7 |
a |
83.9 |
300 |
39.1 |
8.2 |
6.9 |
9.2 |
8.1 |
ab |
77.1 |
100 |
32.5 |
10.3 |
12.1 |
8.9 |
10.4 |
b |
70.5 |
10 |
33.1 |
25.3 |
22.1 |
19.7 |
22.4 |
c |
36.5 |
1 |
33.6 |
30.1 |
29.3 |
27.8 |
29.1 |
d |
17.6 |
대조약제 (리프졸 수화제) |
75 |
35.3 |
6.9 |
5.2 |
2.3 |
4.8 |
a |
86.4 |
무처리 |
- |
33.1 |
32.4 |
38.9 |
34.7 |
35.3 |
e |
- |
[표 9] 황백의 농도에 따른 딸기 흰가루병에 대한 이병과율 조사(약제처리 7일 후)
CV : 10.27
시험약제 |
농도 (μg/ml) |
처리전 발병율 |
이병과율(%) |
유의차 (DMRT) |
방제가 (%) |
I반복 |
II반복 |
III반복 |
평균 |
황백 추출물 |
1000 |
33.1 |
10.5 |
8.2 |
9.3 |
9.3 |
b |
73.7 |
300 |
35.4 |
16.2 |
17.8 |
15.8 |
16.6 |
c |
53.0 |
100 |
36.5 |
18.4 |
19.3 |
14.7 |
17.5 |
c |
50.4 |
10 |
35.4 |
24.3 |
22.8 |
25.9 |
24.3 |
d |
31.2 |
1 |
32.9 |
31.2 |
32.7 |
32.1 |
32.0 |
e |
9.3 |
대조약제 (리프졸 수화제) |
75 |
35.3 |
6.9 |
7.2 |
2.3 |
5.5 |
a |
84.4 |
무처리 |
- |
33.1 |
32.4 |
38.9 |
34.7 |
35.3 |
e |
- |
[표 10] 생귀나리아의 농도에 따른 딸기 흰가루병에 대한 이병과율 조사(약제처리 7일 후)
CV : 13.13
시험약제 |
농도 (μg/ml) |
처리전 발병율 |
이병과율(%) |
유의차 (DMRT) |
방제가 (%) |
I반복 |
II반복 |
III반복 |
평균 |
생귀나리아 추출물 |
1000 |
36.7 |
11.2 |
8.4 |
6.2 |
8.6 |
ab |
75.6 |
300 |
37.1 |
14.3 |
12.4 |
11.1 |
12.6 |
bc |
64.3 |
100 |
29.9 |
13.7 |
15.4 |
18.3 |
15.8 |
c |
55.2 |
10 |
30.2 |
23.1 |
25.4 |
28.7 |
25.7 |
d |
27.2 |
1 |
33.4 |
29.7 |
28.5 |
32.1 |
30.1 |
d |
14.7 |
대조약제 (리프졸 수화제) |
75 |
35.3 |
6.9 |
7.2 |
2.3 |
5.5 |
a |
84.4 |
무처리 |
- |
33.1 |
32.4 |
38.9 |
34.7 |
35.3 |
e |
- |
[표 11] 백굴채의 농도에 따른 딸기 흰가루병에 대한 이병과율 조사(약제처리 7일 후)
CV : 13.79
시험약제 |
농도 (μg/ml) |
처리전 발병율 |
이병과율(%) |
유의차 (DMRT) |
방제가 (%) |
I반복 |
II반복 |
III반복 |
평균 |
백굴채 추출물 |
1000 |
39.1 |
10.2 |
7.4 |
6.9 |
8.2 |
a |
76.8 |
300 |
35.7 |
11.5 |
14.3 |
17.3 |
14.4 |
b |
59.2 |
100 |
38.7 |
15.1 |
16.3 |
18.4 |
16.6 |
b |
53.0 |
10 |
37.0 |
21.1 |
23.4 |
25.6 |
23.4 |
c |
33.7 |
1 |
39.1 |
35.4 |
33.7 |
41.2 |
27.8 |
d |
21.2 |
대조약제 (리프졸 수화제) |
75 |
35.3 |
6.9 |
7.2 |
2.3 |
5.5 |
a |
84.4 |
무처리 |
- |
33.1 |
32.4 |
38.9 |
34.7 |
35.3 |
d |
- |
[표 12] 염화 베르베린의 농도에 따른 딸기 흰가루병에 대한 이병과율 조사(약제처리 7일 후)
CV : 14.93
시험약제 |
농도 (μg/ml) |
처리전 발병율 |
이병과율(%) |
유의차 (DMRT) |
방제가 (%) |
I반복 |
II반복 |
III반복 |
평균 |
염화베르베린 |
1000 |
33.5 |
3.4 |
8.7 |
4.2 |
5.4 |
a |
84.7 |
300 |
32.8 |
5.2 |
8.5 |
10.3 |
8.0 |
a |
77.3 |
100 |
34.7 |
8.2 |
7.7 |
12.1 |
9.3 |
a |
73.7 |
10 |
30.1 |
23.4 |
22.1 |
19.9 |
21.8 |
b |
38.2 |
1 |
32.2 |
30.2 |
30.8 |
32.1 |
31.0 |
c |
12.2 |
대조약제 (리프졸 수화제) |
75 |
35.3 |
6.9 |
7.2 |
2.3 |
5.5 |
a |
84.4 |
무처리 |
- |
33.1 |
32.4 |
38.9 |
34.7 |
35.3 |
c |
- |
[표 13] 요오드화 베르베린의 농도에 따른 딸기 흰가루병에 대한 이병과율 조사(약제처리 7일 후)
CV : 15.58
시험약제 |
농도 (μg/ml) |
처리전 발병율 |
이병과율(%) |
유의차 (DMRT) |
방제가 (%) |
I반복 |
II반복 |
III반복 |
평균 |
요오드화 베르베린 |
1000 |
35.8 |
4.3 |
9.3 |
5.2 |
6.3 |
a |
82.2 |
300 |
32.9 |
6.2 |
7.9 |
8.4 |
7.5 |
a |
78.8 |
100 |
36.5 |
10.2 |
8.9 |
9.3 |
9.5 |
a |
73.1 |
10 |
33.4 |
25.8 |
23.1 |
19.6 |
22.8 |
b |
35.4 |
1 |
35.6 |
30.2 |
29.5 |
35.8 |
31.8 |
c |
9.9 |
대조약제 (리프졸 수화제) |
75 |
35.3 |
6.9 |
7.2 |
2.3 |
5.5 |
a |
84.4 |
무처리 |
- |
33.1 |
32.4 |
38.9 |
34.7 |
35.3 |
c |
- |
[표 14] 브롬화 베르베린의 농도에 따른 딸기 흰가루병에 대한 이병과율 조사(약제처리 7일 후)
CV : 14.93
시험약제 |
농도 (μg/ml) |
처리전 발병율 |
이병과율(%) |
유의차 (DMRT) |
방제가 (%) |
I반복 |
II반복 |
III반복 |
평균 |
브롬화 베르베린 |
1000 |
32.5 |
5.9 |
9.4 |
7.2 |
7.5 |
ab |
78.8 |
300 |
34.3 |
8.9 |
12.9 |
8.3 |
10.0 |
ab |
71.7 |
100 |
33.6 |
13.2 |
11.7 |
15.8 |
13.6 |
bc |
61.5 |
10 |
35.4 |
13.5 |
17.6 |
24.8 |
18.6 |
c |
47.3 |
1 |
33.1 |
29.6 |
27.6 |
35.4 |
30.9 |
d |
12.5 |
대조약제 (리프졸 수화제) |
75 |
35.3 |
6.9 |
7.2 |
2.3 |
5.5 |
a |
84.4 |
무처리 |
- |
33.1 |
32.4 |
38.9 |
34.7 |
35.3 |
d |
- |