KR20060073589A - 항암 치료법을 위한 표적으로서 트레포일 인자 3(ｔｆｆ3) - Google Patents

Abstract

본 발명은 트레포일 인자 3 (TFF3)의 분화 발현을 특징으로 하는 암과 같은, 암을 치료하고 예방하는 방법을 지시한다. 방법은 TFF3 활성 또는 발현을 조정하는 약제를 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명은 더 나아가 세포 운동성과 세포자멸사에 대한 저항성을 억제하는 것을 포함하여, 세포에서 TFF3 발현의 생리학적 효과를 줄이는 것을 지시한다. TFF3의 발현 또는 활성을 조절할 수 있는 올리고뉴클레오티드와 항체가 또한 제공된다.

트레포일 인자, TFF3, 암, 올리고뉴클레오티드, 안티센스 분자, 에피토프, 아미노산, 폴리펩티드.

Description

항암 치료법을 위한 표적으로서 트레포일 인자 3(ＴＦＦ3){TREFOIL FACTOR 3 (TFF3) AS A TARGET FOR ANTI-CANCER THERAPY}

본 출원은 2003년 8월 7일에 출원된 U. S. 가출원 60/493,173의 우선권 이점을 주장하고, 2003년 8월 28일에 출원된 미국 가출원 60/498, 438은, 그것의 각각이 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다.

본 발명은 부분적으로, 트레포일 인자 3 (TFF3)의 활성 발현을 조절하는 약제에 관한 것이다. 본 발명은 더 나아가 암을 치료하고, 예방하거나 검출하는데 이들 약제의 사용에 관한 것이다.

트레포일 인자 3 (TFF3 ; 또는 창자 트레포일 인자 (ITF); 또는 사람 창자 트레포일 인자 (HITF))는 창자 술잔세포에서 통상 생산되고 창자 관내강 안으로 분비된 프로테아제-저항 펩티드이다(Thim, et al., Biochemistry, 1995, 34, 4757). TFF3은 상해 후에 상피 복구에서 역할을 하고 (Mashimo, et al., Science, 1996, 274, 262 and Wong, et al., Biochemistry, 1995, 34, 4757) 몇가지 매카니즘을 통해 이것을 수행한다고 믿어진다: 1) 상피 세포를 세포자멸사로부터 보호하는 것 (Taupin, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2000, 97, 799) ; 2) 접하는 세포가 상처로 이동하고 커버하도록 유도하는 것(Dignass, et al., J. Clin. Invest., 1994, 94, 376) ; 및 3) 상처를 통해 상피 세포에 대한 접근을 얻는 혈청 보체 시스템 성분들의 침전을 막는 것(Andoh, et al., J Immunol., 2001, 167, 3887). 녹아웃 마우스는 그들의 창자가 상처입지 않으면 표현형으로 정상이고, 이 경우 그들은 상처를 치료하지 못해 죽는다. 재조합 TFF3은 과민성 대장 증후군 및 다른 대장 질환들과 관련된 치료법에 사용하도록 제안되었다 (참조, 예를 들어, 미국특허 No. 6,063, 755, 6,316, 218 및 미국 특허 App. 출원 No. 20010052483). 현재, TFF3 수용체는 알려져 있지 않다.

창자 세포에서 TFF3의 생리적 효과는 암 세포 성장, 증식, 및 전이에 유익한 것으로 간주될 수 있다. 예를 들어, 세포자멸사에 대한 내성, 이동의 유도, 및 보체 활성화로부터의 보호는 암 세포가 성장 제어를 그것을 통해 빠져나가고, 주변의 정상 조직을 침해하고, 면역 시스템 감시를 전이하거나 빠져나가는 메카니즘으로 믿어진다. 임상적인 추적 데이타는 TFF3의 발현이 위암에서의 불량한 예후와 상호관련될 수 있다고 암시하였다 (Yamachika, et al., Clin. Cancer Res., 2002, 8, 1092).

다른 단백질, 및 그들을 인코딩하는 핵산은, 암에 대한 진단 및 치료 타겟으로 유용한 것으로 보고되어왔다(참조, 예를 들어, 미국특허 No. 6,261, 562,6, 337,195, 6,465, 611,6, 476,207, 및 미국특허 App. Pub. No.: 20020192699).

본원에서 기술된 조성물과 방법은 암과 관련 질환을 위한 새롭고 보다 효과적인 치료를 충족시키는 것을 돕는다.

본 발명은 암에 시달리거나 또는 암에 걸리기 쉬운 포유류에게 치료에 효과적인 양의 TFF3 중화제를 투여하는 것을 포함하는, 암을 치료하거나 예방하는 방법을 제공하며, 이때 TFF3 중화제는 안티센스 분자, RNAi 분자, 리보자임, 또는 작은 분자이다.

일부 구체예에서 암은 유방암, 결장암, 전립샘암, 난소암, 또는 위암이다. 일부 구체예에서 TFF3은 상기 암 세포에서 분화하여 발현된다.

일부 구체예에서 중화제는 SEQ ID NO: 5-19 중 어떤 것에 해당하는 서열을 포함하거나 겹치는 안티센스 분자이다. 일부 구체예에서 중화제는 SEQ ID NO: 5-19 중 어떤 것에 해당하는 서열을 포함하거나 겹치는 RNAi 분자이다. 일부 구체예에서 중화제는 TFF3에 특이적으로 결합하는 항체이다.

본 발명은 또한 암으로 시달리거나 암에 걸리기 쉬운 포유류에게 치료에 효과적인 양의 TFF3 중화제를 투여하고, 포유류에게 전통적인 암 치료를 제공하는 것을 포함하는, 암의 치료 방법을 제공한다. 일부 구체예에서 전통적인 암 치료가 화학요법이다. 일부 구체예에서 전통적인 암 치료는 호르몬 절제 치료법이다. 일부 구체예에서 호르몬은 안드로겐이다.

본 발명은 더 나아가 TFF3 중화제와 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 세포자멸사를 유도하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서 세포는 포유동물이다. 일부 구체예에서 세포는 암에 걸린다. 일부 구체예에서 세포는 유방, 전립샘, 결장, 난소, 또는 위 세포이다.

더 나아간 구체예에서 본 발명은 종양을 TFF3 중화제와 접촉시키는 것을 포함하는, 종양 부피를 줄이고, 종양 성장을 늦추거나, 또는 종양 성장을 예방하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서 종양은 TFF3가 분화하여 발현되는 세포를 포함한다.

본 발명은 TFF3 중화제와 상기 세포를 접촉하는 것을 포함하는, TFF3의 발현과 연합된 적어도 하나의 생리적 효과를 제공한다. 일부 구체예에서 생리적 효과는 증가된 세포 운동성 또는 세포자멸사에 대한 저항성이다.

본 발명은 또한 TFF3 중화제와 상기 세포를 접촉시키는 것을 포함하는, 세포의 이동, 부착, 또는 증식을 억제하는 방법을 제공한다.

일부 구체예에서 본 발명은 암 세포를 TFF3 중화제와 접촉시키는 것을 포함하는, 암 세포의 침입성을 줄이는 방법을 제공한다.

본 발명은 세포를 TFF3 중화제와 접촉시키는 것을 포함하는, 세포에서 TFF3 발현을 조절하는 방법을 더욱 제공한다.

더 나아간 구체예에서 본 발명은 샘플을 TFF3 중화제와 접촉시키고 샘플에서 중화제 및 TFF3 사이의 결합을 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 TFF3을 검출하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서 TFF3 중화제는 검출가능한 라벨을 포함한다.

또한, 본 발명은 생물학적 샘플을 TFF3 중화제와 접촉시키고 생물학적 샘플에서 TFF3의 분화 발현의 증가를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 암의 존재를 검출하기 위한 방법을 제공한다. TFF3의 분화 발현의 증거는 암의 존재의 표시이다.

일부 구체예에서 "검출하는"은 접촉의 결과를 대조군과 비교하는 것을 포함한다. 일부 구체예에서 TFF3 중화제는 검출가능한 라벨을 포함한다.

본 발명은 또한 환자의 암 샘플에서 TFF3의 분화 발현의 증거를 검출하는 것을 포함하는, TFF3 중화제에 대한 환자의 감수성을 결정하기 위한 방법을 제공한다. TFF3의 분화 발현의 증거는 TFF3 중화제에 대한 환자의 감수성의 표시이다. 일부 구체예에서 TFF3의 분화 발현의 증거는 환자의 암 샘플에서 TFF3의 상향조절이다. 일부 구체예에서 환자의 암 샘플은 유방, 전립샘, 결장, 난소, 또는 위 조직이다.

일부 구체예에서 본 발명은 제 1 시점에서 환자에서 TFF3의 발현을 제 2 시점에서의 TFF3의 발현과 비교하는 것을 포함하는, 암의 진행을 평가하기 위한 방법을 제공한다. 제 1 시점에 비해 제 2 시점에서 TFF3의 증가된 발현은 암의 진행의 표시이다. 일부 구체예에서 "TFF3의 증가된 발현"은 적어도 약 25%, 적어도 약 50%, 적어도 약 75%, 또는 적어도 약 90%의 증가된 발현이다.

본 발명은 또한 제 1 시점에서 TFF3의 발현을 제 2 시점에서 TFF3의 발현에 비교하는 것을 포함하는, 환자에서 암의 전이의 증가된 위험을 검출하는 방법을 제공한다. 제 1 시점에 비해 제 2 시점에서 TFF3의 증가된 발현은 증가된 위험의 전이의 표시이다.

본 발명은 또한 TFF3의 발현을 조절하는 안티센스 분자를 제공한다. 일부 구체예에서 안티센스 분자는 SEQ ID NOS : 5-19의 서열을 포함하거나 오버랩한다. 일부 구체예에서 안티센스 분자는 SEQ ID NO: 5-19 중 어떤 것을 포함한다.

본 발명은 또한 TFF3의 발현을 조절하는 RNAi 분자를 제공한다. 일부 구체예에서 RNAi 분자는 SEQ ID NO: 5-19의 서열을 포함하거나 오버랩한다. 일부 구체예에서 RNAi 분자는 SEQ ID NO: 5-19 중 어떤 것을 포함한다.

본 발명은 또한 안티센스 분자 및/또는 RNAi 분자 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 분리된 항-TFF3 항체를 제공하고, 항체가 SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28에 해당하는 TFF3 서열의 적어도 하나의 영역을 인식한다. 일부 구체예에서 항체가 다음을 포함하는 공정에 의해 생산된다:

a) 파지에 항체의 라이브러리를 합성하는 단계;

b) 파지를 SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28에 해당하는 TFF3 서열의 적어도 하나의 영역을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 라이브러리를 샘플에 대해 패닝하는 단계 ;

c)조성물과 결합하는 파지를 분리하는 단계, 이때 항체는 적어도 10⁸ 1/의 결합 친화력과 함께 SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28에 해당하는 TFF3 서열의 적어도 하나의 영역에 결합하는 그것의 능력에 의해 특징지어지고 ;

및

d)분리된 파지를 분석하여, SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28에 해당하는 TFF3 서열의 적어도 하나의 영역이 결합하는, 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 결정하는 단계.

일부 구체예에서 항체는 단일클론 항체, 다클론 항체, 키메라 항체, 사람화 항체, 단일-사슬 항체 또는 Fab 단편이다. 일부 구체예에서 항체는 표지화된다. 일부 구체예에서 라벨은 효소, 방사성동위원소, 또는 형광발색단이다. 일부 구체예에서 항체의 결합 친화력은 TFF3 이외의 폴리펩티드에 대해서 약 1 x 10⁵ Ka 이다.

본 발명은 본 발명의 항체를 생산하는 분리된 세포와 하이브리도마를 더욱 제공한다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 13,20, 21,22, 23,24, 25,26, 27 또는 28으로부터 선택된 3 또는 더적은 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드를 제공한다. 일부 구체예에서 폴리펩티드는 길이가 약 8 내지 약 80 아미노산이다. 일부 구체예에서 폴리펩티드는 항-TFF3 항체에 특이적으로 결합한다.

본 발명은 항체:TFF3 착체의 형성을 허용하는 조건하에서, 본 발명의 항체를 상기 샘플과 조합하는 단계; 착체의 양을 측정하는 단계; 대조군에 착체의 양을 비교하는 단계를 포함하는, 샘플에서 TFF3의 분화 발현을 검출하기 위해 항체를 사용하는 방법을 더욱 제공한다. 샘플에서 상승된 수준의 착체는 TFF3의 분화 발현을 지시한다.

본 발명은 또한 SEQ ID NO: 1-4의 폴리펩티드의 분리된 에피토프-함유 단편을 포함한다. 일부 구체예에서 단편은 SEQ ID NO : 1-4의 약 6 내지 약 20 인접 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서 단편은 SEQ ID NO : 1- 4의 약 10 인접 아미노산을 포함한다. 일부 구체예에서 폴리펩티드는 SEQ ID NO : 2이다. 일부 구체예에서 단편은 SEQ ID NO: 20, 21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28을 포함한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 에피토프-함유 단편으로 대상을 면역화함으로써 얻어진 분리된 항-TFF3 항체를 제공한다. 일부 구체예에서 본 발명은 하나 이상의 약학적으로 허용가능한 담체와 함께 제약 조성물에서 분리된 항체를 제공한다. 일부 구체예에서 항체는 TFF3를 중화한다.

본 발명은 또한 TFF3에 결합하고 중화하는 항체를 확인하는 것과, 재조합 발현 숙주 세포에서 항체를 발현하는 것을 포함하는, 암의 치료를 위한 항체를 생성하기 위한 방법을 제공한다.

더 나아가, 본 발명은 TFF3에 결합하고 중화하는 항체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하고, 이때 항체는 재조합 숙주 세포를 사용하여 발생되었다. 일부 구체예에서 재조합 숙주 세포는 Chinese Hamster 난소 세포, 골수종 세포 및 박테리아 숙주 세포로 구성되는 군으로부터 선택된다.

도 1은 다른 전체 조직에서 TFF3 mRNA 발현의 변화를 도시한다.

도 2는 다른 세포계에서 TFF3 의 발현 수준의 변화를 도시한다.

도 3은 결장암 세포에서 TFF3 mRNA 발현 수준을 녹다운하는데서 다른 TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드의 변화하는 유효성을 도시한다.

도 4는 TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드의 특이성을 도시한다.

도 5는 더나아간 TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드의 특이성을 도시한다.

도 6은 암 세포계에서 TFF3 mRNA 발현을 녹다운하는데 있어서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효성을 도시한다.

도 7은 결장암 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포독성 및 항-증식 효과를 도시한다.

도 8A 및 8B는 전립샘암 세포에서 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포독성 및 항-증식 효과를 도시한다 .

도 9는 정상 세포에서 TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드의 무독성을 도시한다.

도 10는 전립샘암 세포에 대해 연 한천 배지에서 결장 성장의 TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드 억제를 도시한다.

도 11는 항-TFF3 항체를 사용하여 세포 증식의 억제를 도시한다. 항-TFF3 다클론 안티세라로부터 분리된 IgG 분획을 1% FBS을 함유하는 성장 배지에서 50 μg/ml의 최종 농도로 희석시켰고, 그후 증식 분석법의 0일과 4일에 4번째 웰로 첨가하였다. 세포 증식의 정도를 7일에 점수매겼다.

구체예의 상세한 설명

본 발명은 그중에서도 특히, TFF3 중화제와 이들 약제를 사용하여 암을 예방하고, 치료하고 검출하는 방법을 제공한다. TFF3 폴리펩티드는 (예를 들어, 단백질 또는 mRNA 수준에서) 전립샘암, 유방암, 난소암, 위암, 및 결장암과 연결된 것과 같은, 많은 암 조직과 암 세포계에서 분화하여 발현될 수 있다. 본원에서 예증된 바와 같이, TFF3 발현의 녹다운은 (올리고뉴클레오티드-기반 기술을 사용함으로 써) 세포독성과 고정-독립 성장의 억제를 초래할 수 있다. 따라서, 적절한 중화제를 사용하여 세포에서 TFF3 폴리펩티드 활성의 억제 또는 TFF3 폴리펩티드의 녹다운 또는 폴리뉴클레오티드 발현은 예를 들어, TFF3의 발현을 특징으로 하는 암을 예방하거나 치료하는 것을 도울 수 있다. 일부 구체예에서, 암 조직은 분화하여 TFF3을 발현할 수 있다 (예를 들어, 상향조절 또는 하향조절을 나타냄).

본원에서 사용된 바와 같이, 표현 "분화하여 발현된"은 일반적으로 암 세포에서 더 높거나 더 낮은 수준에서 발현되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말하고, 예를 들어, mRNA은 적어도 약 25%, 적어도 약 50% 내지 약 75%, 적어도 약 90%, 적어도 약 95%, 적어도 약 1.5-배, 적어도 약 2-배, 적어도 약 5-배, 적어도 약 10-배, 또는 적어도 약 50-배 이상의 수준에서 발견되고, 암이 아닌 동일한 세포 타입의 세포와 비교할때 (정상 세포) 암 세포에서 다르다 (예를 들어, 더 높거나 더 낮은). 예를 들어, 만일 인시투 조직에서 세포 타입들 사이의 어느 정도의 분별을 허용하는 부합화 또는 또다른 분석법을 사용한다면, 비교는 두개의 조직 사이에 만들어질 수 있다. 비교는 또한 그들의 조직 공급원으로부터 제거된 세포 사이에서 만들어질 수 있다. TFF3는 결장, 유방, 전립샘 및 다른 암에서 분화하여 발현되는 것으로 나타난 유전자이다. 일부 구체예에서, 분화 발현이 정상 발현보다 더 높은 것으로 관찰된다. 특정 세포에서 분화하여 발현되는 폴리펩티드와 폴리뉴클레오티드를 결정하기 위한 방법은 더욱 미국특허 App. Pub. No.: 20020192699 및 미국특허 No. 6,476, 207에서 기술된다. 암 전립샘 세포에서 분화하여 발현된 유전자 생성물은 U. S. Ser. No. 10/310,673에 기술되어 있다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "약"은 +/-10% 의 값을 말한다.

TFF3 폴리펩티드

본원에서 사용된 바와 같이 "TFF3" 또는 "TFF3 폴리펩티드"는 사람 트레포일 인자 3 (SEQ ID NO: 1-4, GenBank gi: 4507453, Q07654, NP_003217, AAH17859, BAA95531, BAB13731)과 실질적으로 상동인 단백질 (폴리펩티드) 또는 그것의 단편을 말한다. 본 발명에 의해 계획된 폴리펩티드는 유전자 코드의 퇴화 덕분에, 개시된 TFF3 폴리뉴클레오티드와 동일하지 않은 서열인 핵산은 물론이고, 개시된 TFF3 폴리뉴클레오티드 (SEQ ID NO: 5-8, GenBank gi: 4507452, BC017859, AF432265)에 의해 인코딩된 것들을 포함한다. 따라서, 본 발명은 그 범위 내에서 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열의 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드, 또는 그것의 변형을 포함한다. 일부 구체예에서 TFF3는 SEQ ID NO: 1-4의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 바람직한 구체예에서, TFF3는 SEQ ID NO : 2의 아미노산 서열을 포함한다.

용어 "폴리펩티드" 및 "단백질,"은 상호교환하여 사용가능하고 어떠한 길이의 아미노산의 폴리머 형태를 말하는데, 이것은 코드화 및 비-코드 아미노산, 화학적으로 또는 생물화학적으로 변형되거나 또는 유도된 아미노산, 및 변형된 펩티드 백본을 갖는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 용어는 융합 단백질, N-종말 메티오닌 잔기가 있고 없는, 이것으로 제한되지 않고, 이종유래 아미노산 서열과의 융합 단백질, 이종유래 및 동종 리더 서열과의 융합, ; 면역학적으로 태그된 단백질; 등을 포함한다. 용어는 또한 길이가 2 내지 약 30 아미노산인 폴리펩티드인 "펩티드" 를 포함한다. 폴리펩티드는 그것의 일부분 또는 단편은 물론이고, 인용된 폴리뉴클레오티드 (이를테면 TFF3 폴리뉴클레오티드)에 의해 인코딩된 전장 폴리펩티드, 인용된 폴리뉴클레오티드로 표시된 유전자에 의해 인코딩된 폴리펩티드 둘다를 말할 수 있다.

"폴리펩티드"는 또한 자연적으로 발생하는 단백질의 변형을 포함하고, 이때 그러한 변형은 자연적으로 발생하는 단백질과 동종이거나 또는 실질적으로 유사하고, 자연적으로 발생하는 단백질로서 동일한 또는 다른 종의 기원이 될 수 있다(예를 들어, 자연적으로 인용된 폴리펩티드를 발현하는 사람, 쥣과동물, 또는 일부 다른 종들, 보통 포유동물 종). 일반적으로, 변형 TFF3 폴리펩티드는 예를 들어, 디폴트 매개변수를 사용하여, BLAST에 의해 측정될 수 있을때, 본원에서 기술된 분화하여 발현된 폴리펩티드와 함께, 적어도 약 80%, 보통 적어도 약 90%, 및 더욱 보통 적어도 약 95% 서열 주체성 또는 이상, 즉 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 주체성을 갖는 서열을 갖는다. 변형 폴리펩티드는 자연적으로 또는 비자연적으로 글리코실화될 수 있고, 즉, 폴리펩티드는 대응하는 자연적으로 발생하는 단백질에서 발견된 글리코실화 패턴과는 다른 글리코실화 패턴을 가진다.

본 발명은 또한 동종이 다른 종들로부터 분리되는 TFF3 폴리펩티드의 동종(또는 그것의 단편)을 포함하고 자연적으로 발생하는 글리코실화 TFF3는 정상 및 종양 세포에 의해 제조된 것들을 포함하고, 이것은 다른 글리코실화 패턴, 즉 다른 동물 또는 식물 종을 나타낼 수 있고, 여기서 그러한 동종은, 보통 포유동물 종, 예를 들어 마우스, 래트와 같은 설치류 ; 가축 동물 , 예를 들어, 말, 소, 개, 고 양이;및 사람이다. "동종"에 의해 위에서 확인한 바와 같은 특정 단백질에 대해 적어도 약 35%, 보통 적어도 약 40% 및 보다 보통 적어도 약 60% 아미노산 서열 주체성을 갖는 폴리펩티드를 의미하고, 이때 서열 주체성은 예를 들어, 디폴트 매개변수와 함께 BLAST 알고리즘을 사용하여 결정된다.

일반적으로, 본 발명의 TFF3 폴리펩티드는 비-자연적으로 발생하는 환경에서 제공되고, 예를 들어 그들의 자연적으로 발생하는 환경으로부터 분리된다. 특정 구체예에서, 대상 단백질은 대조군과 비교할때 단백질에 대해 풍부한 조성물에 존재한다. 그러한 것으로서, 정제된 폴리펩티드가 제공되고, 그로인해 "정제된"은 단백질이 다른 폴리펩티드가 실질적으로 없는 조성물에 존재한다는 것을 의미하고, 그로인해 "실질적으로 없는"은 약 90%미만, 보통 약 60%미만, 또는 더욱 보통 50%미만의 조성물은 다른 폴리펩티드로 구성된다는 것을 의미한다.

또한 본 발명의 범위내에 변형이 있다; 폴리펩티드의 변형은 돌연변이, 단편, 및 융합을 포함한다. 돌연변이는 아미노산 치환, 추가 또는 결손을 포함할 수 있다. 아미노산 치환은 글리코실화 부위, 포스포릴화 부위 또는 아세틸화 부위를 바꾸거나, 또는 작용에 필요하지 않은 하나 이상의 시스테인 잔기의 치환 또는 결손에 의한 미스폴딩을 최소화하는 것과 같이, 비-필수 아미노산을 제거하기 위한, 보존 아미노산 치환 또는 치환이 될 수 있다. 보존 아미노산 치환은 치환된 아미노산의 일반적인 전하, 소수성/친수성, 및/또는 공간입체 벌크를 보존하는 것들이다. 변이체는 단백질의 특정한 영역의 강화된 생물학적 활성(예를 들어, 기능 도메인 및/또는, 여기서 폴리펩티드는 단백질 패밀리의 멤버, 일치 서열과 연합된 영 역이다)을 보유하거나 갖도록 설계될 수 있다. 변이체의 생산을 위한 아미노산 변경의 선택은 아미노산의 접근성 (내부 vs. 외부)에 기반될 수 있다 (참조, 예를 들어, Go et al, Int. J 펩티드 단백질 Res. (1980) 15 : 211), 변이체 폴리펩티드의 내열성은 (참조, 예를 들어, Querol et al., Prot. Eng. (1996) 9 : 265 이것은 전체가 참고문헌에 의해 본원에 포함된다), 원하는 글리코실화 부위 (참조, 예를 들어, Olsen and Thomsen, J Gen. Microbiol. (1991) 137 : 579), 원하는 디술피드 다리 (참조, 예를 들어, Clarke et al., Biochemistry (1993) 32: 4322; 및 Wakarchuk et al., Protein Eng. (1994) 7: 1379), 원하는 금속 결합 부위 (참조, 예를 들어, Toma et al., Biochemistry (1991) 30: 97, 및 Haezerbrouck et al., 단백질 Eng. (1993) 6 : 643), 및 프롤린 루프에서의 원하는 치환 (참조, 예를 들어, Masul et al., Appl. Env. Microbiol. (1994) 60: 3579 이것은 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다). 시스테인-고갈된 뮤테인은 전문이 참고문헌에 의해 본원에 포함된 미국특허 No. 4,959, 314에서 개시된 바와 같이 생산될 수 있다.

변이체는 또한 본원에서 개시된 폴리펩티드의 단편, 특히 생물학적으로 활성인 단편 및/또는 기능 도메인에 해당하는 단편을 포함할 수 있다. 관심의 단편은 전형적으로 길이가 적어도 약 10 aa 내지 적어도 약 15 aa 일 것이고, 길이 적어도 약 50 aa일 것이고, 길이가 300 aa 이상이 될 수 있고, 일부 구체예에서 길이가 약 1000 aa를 초과하지 못하고, 이때 단편은 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나의 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드와 동일한 아미노산의 스트레치, 또는 그것의 동족을 가질 것이다. 본원에서 기술된 단백 질 변이체는 본 발명의 범위내에 있는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 유전자 코드는 대응하는 변이체를 구성하기 위해 적절한 코돈을 선택하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 단편은 특정 도메인 또는 TFF3 단백질의 에피토프를 함유하는 것들을 포함할 것이다.

TFF3 폴리뉴클레오티드

일부 구체예에서, 본 발명은 예를 들어, 전립샘, 유방, 난소, 또는 결장암과 같은 일부 암에서 분화하여 발현되는 TFF3을 인코딩하는 TFF3 폴리뉴클레오티드의 억제 또는 검출에 관한 것이다. 일부 구체예에서 TFF3는 SEQ ID NO: 5-8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다. 일부 바람직한 구체예에서, TFF3은 SEQ ID NO: 7의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산에 의해 인코딩된다.

본원에서 기술된 방법에서 유용한 폴리뉴클레오티드 조성물에 관한 본 발명의 범위는 이것으로 제한되지 않지만, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열 중의 어느 하나에서 설명된 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, SEQ ID NO : 2); 엄격한 조건하에서 (특히 높은 엄중함의 조건) 부합화에 의해 본원에서 기술된 생물학적 재료 또는 다른 생물학적 공급원 (특히 사람 공급원)으로부터 얻어진 폴리뉴클레오티드 ; 제공된 폴리뉴클레오티드에 해당하는 유전자; 제공된 폴리뉴클레오티드의 변이체 및 그들의 대응하는 유전자, 특히 인코딩된 유전자 생성물의 생물학적 활성을 보유하는 그러한 변이체 (예를 들어, 유전자 생성물의 단백질 패밀리 (ies)으로의 할당 및/또는 유전자 생성물에 존재하는 기능 도메인의 동정의 결과로서, 제공된 폴리뉴클레오티드에 해당하는 유전자 생성물에 기인하는 생물학적 활 성)를 포함한다. 본 발명의 범위안에서 그것에 의해 계획되는 다른 핵산 조성물은 여기서 개시와 함께 제공될때 당업자들에게 쉽게 명백할 것이다. 조성물의 핵산을 참조하여 본원에서 사용된 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산"은 특별히 지시되지 않으면, 핵산의 길이나 구조에 대해서 제한하려는 의도가 아니다.

TFF3 폴리뉴클레오티드는 사람 암 조직, 이를테면 사람 전립샘, 유방, 및 결장 조직에서 발현될 수 있다. 특별한 관심의 본원에서 기술된 핵산 조성물은 여기서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나에서 설명된 서열 또는 그것의 동일화 서열을 포함한다. "동일화 서열"은 유일하게 폴리뉴클레오티드 서열을 동정하는, 예를 들어, 약 20 nt이상의 어떠한 인접 뉴클레오티드 서열에 대한 90%미만, 보통 약 80% 내지 약 85% 미만 서열 주체성을 나타내는, 잔기 길이가 적어도 약 10 nt 내지 약 20 nt, 보통 길이가 적어도 약 50 nt 내지 약 100 nt의 인접 서열이다. 따라서, 주제 핵산 조성물은 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어느 하나로부터 인접 뉴클레오티드의 동일화 서열을 포함하는 전장 cDNAs 또는 mRNAs을 포함한다.

본원에서 기술된 방법에서 유용한 폴리뉴클레오티드는 또한 천연 TFF3 DNA과의 서열 유사성 또는 서열 주체성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 이것은 연합된 5'과 3' 비해독 서열, 촉진자 및 인핸서 서열 및 센스 또는 안티센스 배향에 있는 서열을 포함한다. 서열 유사성을 갖는 핵산은 예를 들어, 50°C와 10XSSC (0.9 M 식염수/0.09 M 나트륨 시트레이트)에서 낮은 엄중함 조건하에서 부합화에 의해 검출되고, 1XSSC중의 55°C에서 세척시킬 때 결합된 채로 남아있다. 서열 주 체성은 엄격한 조건하에서, 예를 들어, 50°C 이상과 0.1XSSC (9 mM 식염수/0.9 mM 나트륨 시트레이트)에서 부합화에 의해 결정될 수 있다. 부합화 방법 및 조건은 당업계에 잘 알려져있고, 예를 들어, 미국특허 No. 5,707, 829를 참조하라. 제공된 폴리뉴클레오티드 서열과 실질적으로 동일한 핵산은, 예를 들어 대립 변이체, 유전적으로 변경된 버전의 유전자, 등은, 엄격한 부합화 조건하에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열에 결합된다. 프로브, 특히 DNA 서열의 표지 프로브를 사용하여, 동종 또는 관련 유전자를 분리할 수 있다. 동종 유전자의 공급원은 어떠한 종이 될 수 있고, 예를 들어 영장류 종, 특히 사람; 래트와 마우스와 같은 설치류 ; 갯과, 고양이과, 솟과, 양, 말, 효모, 선충류 등이 될 수 있다.

하나의 구체예에서, 부합화는 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 하나의 적어도 15 인접 뉴클레오티드 (nt)를 사용하여 수행된다. 즉, 개시된 폴리뉴클레오티드 서열 중 하나의 적어도 15 인접 nt가 프로브로 사용될 때, 프로브는 상보성 서열을 포함하는 핵산과 우선적으로 잡종화할 것이고, 유일하게 선택된 프로브에 잡종화하는 핵산의 동정 및 복구를 허용한다. 본원에서 제공된 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 서열로부터 프로브는 만일 그들이 유도되는 cDNA가 하나의 mRNA에 해당한다면, 동일한 핵산과 잡종화할 수 있다. 15 nt 이상의 프로브가 사용될 수 있고, 예를 들어, 약 18 nt, 25 nt, 50 nt, 75 nt 또는 100 nt의 범위내에서 일반적으로 약 15 nt 크기의 프로브는, 유일한 동정을 위해 충분한 서열을 나타낸다.

본 발명에 의해 계획된 폴리뉴클레오티드는 또한 자연적으로 발생하는 뉴클 레오티드 서열의 변이체 (예를 들어, 퇴화 변이체, 대립 변이체, 등)를 포함한다. 본 발명에 의해 계획된 폴리뉴클레오티드의 변이체는 본원에서 개시된 뉴클레오티드 서열와의 추정 변이체의 부합화에 의해 바람직하게는 부합화 엄격한 조건하에서 동정된다. 예를 들어, 적절한 세척 조건을 사용함으로써, 대립 변이체가 선택된 폴리뉴클레오티드 프로브에 대해 기껏해야 약 25-30% 베이스 쌍 (bp) 불일치를 나타내는, 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드의 변이체는 동정될 수 있다. 일반적으로, 대립 변이체는 약 15 내지 약 25% bp 불일치를 함유하고, 단일 bp 불일치는 물론이고, 심지어 약 5-15%, 또는 약 2-5%, 또는 약 1- 2% bp 불일치만큼 작게 함유할 수 있다.

본 발명은 또한 본원에서 제공된 TFF3 폴리뉴클레오티드 서열에 해당하는 동족을 포함하고, 이때 동종 유전자의 공급원은 어떠한 포유동물 종, 예를 들어, 영장류 종, 특히 사람; 설치류, 이를테면 래트; 갯과, 고양이과, 솟과, 양, 말, 효모, 선충류, 등이 될 수 있다. 포유동물 종 사이에, 예를 들어, 사람과 마우스, 동족은 일반적으로 TFF3 유전자 또는 그것의 일부에 대한 실질적인 서열 유사성, 이를테면, 예를 들어, 뉴클레오티드 서열 사이에 적어도 75% 서열 주체성, 적어도 90%, 적어도 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%을 가진다. 서열 유사성은 참조 서열에 근거하여 계산되고, 이것은 더큰 서열의 서브셋이 될 수 있고, 바람직하게는 세포외 코딩 서열, 예를 들어 보존된 모티프로서, 코딩 영역, 프랭킹 영역, 등의 일부가 될 수 있다. 참조 서열은 보통 적어도 약 18 인접 nt 길이, 더욱 보통 적어도 약 30 nt 길이가 될 것이고, 비교되는 완전한 서열로 연장될 수 있다. Altschul, et al. Nucleic Acids Res. (1997) 25 : 3389-3402에 개시된, 디폴트 매개변수를 사용하여,갭 BLAST와 같은 서열 분석을 위한 알고리즘은 당업계에 알려져있다.

일반적으로, 본원에 개시된 TFF3 폴리뉴클레오티드의 변이체는 MPSRCH 프로그램 (Oxford Molecular)에서 계획된 바와 같은 Smith-Waterman 상동성 연구 알고리즘에 의해 결정된 바와 같이, 적어도 약 65%, 바람직하게는 적어도 약 75%, 더욱 바람직하게는 적어도 약 85% 보다 더 큰 서열 주체성을 가지고, 적어도 약 90%, 95%, 96%, 98%, 99% 이상보다 더 클 수 있다. 퍼센트 주체성을 계산하는 방법의 예는 다음을 사용한, Smith-Waterman 알고리즘이다: 하기의 연구 매개변수 : 갭 오픈 페널티, 12 ; 및 갭 확장 페널티, 1를 갖고 아핀 갭 서치를 사용하여 MPSRCH 프로그램 (Oxford Molecular)에서 계획된 바와 같이, Smith-Waterman 상동성 연구 알고리즘에 의해 결정될 때 65% 이상의 통괄 DNA 서열 주체성.

대상 핵산은 그것의 단편은 물론이고, cDNAs 또는 게놈 DNA이 될 수 있고, 특히 생물학적으로 활성 유전자 생성물을 인코딩하는 및/또는 개시된 방법에서 유용한 단편 (예를 들어, 진단에서, 분화하여 발현된 관심의 유전자의 유일한 식별자로서, 등)이 될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "cDNA"는 천연 성숙 mRNA 종에서 발견된 서열 요소들의 배열을 공유하는 모든 핵산을 포함하도록 의도되고, 이때 서열 요소들은 엑손이고 3'및 5' 비-코딩 영역이다. 통상적으로 mRNA 종은 인접 엑손을 가지고, 개재하는 인트론이, 존재할때, 핵RNA 짜집기에 의해 제거되어, 폴리펩티드를 인코딩하는 연속 개방 판독 프레임을 생성한다. mRNA 종은 또한 엑손과 인트론 모두와 함께 존재할 수 있고, 여기서 인트론은 대안적인 짜집기에 의해 제 거될 수 있다. 더욱이 동일한 게놈 서열에 의해 인코딩된 다른 종의 mRNAs는 세포에서 변하는 수준으로 존재할 수 있고, 이들 다양한 수준의 mRNA 종의 검출은 세포에서 인코딩된 유전자 생성물의 분화 발현의 표시가 될 수 있다는 것을 주목해야 한다.

관심의 게놈 서열은 통상적으로 천연 염색체에 존재하는 인트론의 모두를 포함하는, 열거된 서열에서 정의된 바와 같이, 개시 코돈과 정지 코돈 사이에 존재하는 핵산을 포함한다. 그것은 성숙 mRNA에서 발견된 3' 및 5'비해독 영역을 더욱 포함할 수 있다. 그것은 전사된 영역의 5' 및 3' 말단 중에서 프랭킹 게놈 DNA의 약 1 kb, 하지만 가능하게는 더욱 포함하는, 촉진자, 인핸서, 등과 같은 특이적 전사 및 번역 규제 서열을 더욱 포함할 수 있다. 게놈 DNA는 100 kbp 또는 더작은 단편으로서 분리될 수 있고; 실질적으로 프랭킹 염색체 서열이 없다. 때때로 인트론에서 발견되는 바와 같이, 코딩 영역, 3'과 5' 중의 하나를 프랭킹하는 게놈 DNA, 또는 내부 규제 서열은 적절한 조직, 단계-특이적, 또는 질병-상태 특이적 발현을 필요로하는 서열을 함유한다.

본 발명의 핵산은 대상 TFF3 폴리펩티드의 전부 또는 일부를 인코드할 수 있거나 또는 예를 들어 유전자의 5' 또는 3' 비-코딩 영역으로부터 비-코딩 서열을 포함할 수 있다. 명시된 바와 같이, 이들 DNAs 또는 RNAs는 센스 또는 안티센스 배향에 있을 수 있다. 화학적으로 올리고뉴클레오티드를 합성함으로써 이중 또는 단일 가닥 단편은 종래의 방법으로, 제한 효소 소화, PCR 증폭, 등에 의해 DNA 서열로부터 얻어질 수 있다. 본 발명에 의해 계획된 분리된 폴리뉴클레오티드 및 폴 리뉴클레오티드 단편은 여기서 제공된 폴리뉴클레오티드로부터 선택된 적어도 약 10, 약 15, 약 20, 약 35, 약 50, 약 100, 약 150 내지 약 200, 약 250 내지 약 300, 또는 약 350 인접 nt를 포함한다. 대부분의 파트에 대해서, 단편은 적어도 15 nt, 보통 적어도 18 nt 또는 25 nt, 적어도 약 50 이하 인접 nt 길이 이상이 될 것이다. 일부 구체예에서, 폴리뉴클레오티드 분자는 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열 중 어떤 것으로부터 선택된 적어도 12의 인접 서열을 포함한다.

TFF3 폴리뉴클레오티드에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프로브는 본원에서 개시된 TFF3 폴리뉴클레오티드 서열을 사용하여 발생될 수 있다. 프로브는 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열 중의 어느 하나의 대응하는 인접 서열의 바람직하게는 적어도 약 12 nt, 15 nt, 16 nt, 18 nt, 20 nt, 22 nt, 24 nt, 또는 25 nt 단편이고, 길이가 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb, 또는 0.05 kb 미만이 될 수 있다. 프로브는 화학적으로 합성되거나 또는 제한 효소를 사용하여 더 긴 폴리뉴클레오티드로부터 발생될 수 있다. 프로브는 예를 들어, 방사능, 바이오티닐화, 또는 형광 태그로 표지화될 수 있다. 바람직하게는, 프로브는 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 서열의 어느 하나의 동일화 서열에 기반하여 설계된다. 보다 바람직하게는, 프로브는 서열에 대해 낮은 복잡성 (예를 들어, XBLAST)을 마스킹하기 위한 마스킹 프로그램의 적용 후에 마스크되지 않은 상태로 남아있는 대상 폴리뉴클레오티드의 하나의 인접 서열에 기반하여 설계된다, 즉, 마스킹 프로그램에 의해 제조된 마스크 서열의 폴리-n 스트레치 바깥쪽에 폴리뉴클레오티드에 의해 표시된 바와 같은, 비마스크 영역을 선택할 것이다.

본 발명의 TFF3 폴리뉴클레오티드는실질적인 순도로 일반적으로 무손상 염색체 이외의 형태로 분리될 수 있고 얻어진다. 전형적으로, DNA 또는 RNA로서, 폴리뉴클레오티드는 실질적으로 자연적으로 발생하는 핵산 서열이 없이 얻어질 수 있고, 일반적으로 적어도 약 50%, 보통 적어도 약 90% 순수하고 전형적으로 "재조합"이고, 예를 들어, 통상적으로 자연적으로 발생하는 염색체에 대해 연합되지 않은 하나 이상의 뉴클레오티드의 측면에 있다.

본원에서 기술된 TFF3 폴리뉴클레오티드는 선형 분자 로서 또는 원형 분자 내에서 제공될 수 있고, 자발적으로 복사하는 분자 (벡터)내에서 또는 복제 서열 없이 분자내에서 제공될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 발현은 그들의 고유의 또는 당업계에 공지된 다른 규제 서열에 의해 조절될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 트랜스페린 폴리양이온-매개된 DNA 이동, 맨 또는 캡슐화 핵산과의 트랜스펙션, 리포솜-매개된 DNA 이동, DNA-코팅된 라텍스 비드의 세포내 교통, 프로토플라스트 융합, 바이러스 감염, 전기천공법, 유전자 총, 칼슘 포스페이트-매개된 트랜스펙션, 등과 같은 당업계에서 유용한 다양한 기술을 사용하여 적절한 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다.

본원에서 기술된 핵산 조성물은 생물학적 샘플에서 폴리뉴클레오티드의 추가적인 카피를 생성하기 위해, 리보자임 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드를 생성하기 위해 mRNA 의 검출을 위한 프로브로서 (예를 들어, 사람 세포의 추출물), 그리고 단일 가닥 DNA 프로브로서 또는 3중-가닥 형성 올리고뉴클레오티드로서, 예를 들어, 폴리펩티드(이것은 항-TFF3 항체를 얻기 위해 사용될 수 있음)를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 프로브는 예를 들어, 본원에서 제공된 폴리뉴클레오티드 중의 어느 하나 또는 샘플에서 그것의 변이체의 존재 또는 부재를 결정하기 위해 사용될 수 있다. 이들 및 다른 사용은 아래에서 더욱 상세하게 기술된다.

본원에서 사용된 용어 "오버랩"은 하나 이상의 폴리뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드에 의해 공유된 서열의 영역을 말한다. 예를 들어, 더나아간 올리고뉴클레오티드를 오버랩하는 올리고뉴클레오티드는 실질적으로 더나아간 올리고뉴클레오티드에서 서열의 영역에 해당하는 서열의 영역을 갖는다. 일부 구체예에서, 오버랩은 길이가 적어도 약 3, 적어도 약 4, 적어도 약 5, 적어도 약 6, 적어도 약 7, 적어도 약 8, 적어도 약 9, 적어도 약 10, 적어도 약 15, 적어도 약 20, 적어도 약 50, 적어도 약 100, 또는 보다 뉴클레오티드가 될 수 있다.

중화제

본 발명의 방법 및 제조의 물품은 세포에서 TFF3 활성 또는 발현을 조절하는 TFF3 중화제를 사용 또는 혼입한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "조절하는"은 유전자, 단백질, 또는 세포 안, 바깥 또는 표면에 있는 어떠한 분자의 질 또는 양의 변화를 말한다. 변화는 분자의 발현 또는 수준의 증가 또는 감소가 될 수 있다. 용어 "조절한다"는 또한 예를 들어, 증식, 분비, 부착, 세포자멸사, 세포-대-세포 신호, 등과 같은 생물학적 기능/활성의 질 또는 양의 변화를 포함한다. 일부 구체예에서, 활성 또는 발현의 조절은 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 30% 이상, 약 40% 이상, 또는 약 50% 이상이 될 수 있다.

다양한 중화제는 본원에서 계획된, 이를테면 작은 분자, 펩티드, 항체, 안티센스 분자, 리보자임, RNAi 분자, 등이다.

작은 분자

중화제는 세포독성제에 선택적으로 융합되거나 접합된 작은 분자를 포함할 수 있다(본원에서 기술된 것들과 같은). 작은 분자의 라이브러리는 항원에 결합하는 작은 분자를 동정하기 위해 TFF3 또는 TFF3-발현 세포에 대해서 분비될 수 있다. 작은 분자는 그것의 대항에 대해 더욱 스크리닝되거나 또는 중화성 및/또는 잘 알려진 방법에 따라 세포독성제와 접합될 수 있다.

펩티드

중화제는 또한 합리적인 설계에 의해 또는 파지 표시에 의해(참조, 예를 들어, W098/35036) 발생된 펩티드가 될 수 있다. 하나의 구체예에서, 선택의 분자는 "CDR 유사제" 또는 항체의 CDR에 근거하여 설계된 항체 유사체가 될 수 있다. 그러한 펩티드가 그 자체로 대항일 수 있지만, 펩티드는 선택적으로 펩티드의 대항성을 추가하거나 강화하기 위해 세포독성제에 융합될 수 있다. 펩티드는 2 내지 약 20,2 내지 약 15, 또는 2 내지 약 10 아미노산을 포함할 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드

특정 환경에서, (예를 들어, 감소) 세포에서 발현된 TFF3의 양을 조절하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또다른 관점에서, TFF3 항-센스 올리고뉴클레오티드가 만들어질 수 있고 하나 이상의 TFF3 항-센스 올리고뉴클레오티드를 투여하는 것을 포함하는, 세포에 의해 TFF3의 발현의 수준을 줄이기 위해 이 용된 방법. 표현 "TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드"에 의해, TFF3의 발현이 감소되도록 TFF3 의 발현에 수반된 상보성핵산 서열과의 베이스 쌍을 통해 상호작용하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 참조한다. 바람직하게는, TFF3의 발현에 수반된 특이적 핵산 서열은 TFF3를 인코딩하는 게놈 DNA 분자 또는 mRNA 분자이다. 이 게놈 DNA 분자는 TFF3 유전자, 및/또는 성숙 TFF3 단백질을 위한 코딩 서열의 규제 영역을 포함할 수 있다.

TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그것을 위한 방법의 문맥에서 용어 "상보성"은 세포에서 즉, 생리적 조건하에서 서열에 대한 부합화를 허용하기 위해 그러한 서열에 충분히 상보성인 것을 의미한다. TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드는 바람직하게는 약 8 내지 약 100 뉴클레오티드를 함유하는 서열을 포함하고 보다 바람직하게는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 약 15 내지 약 30 뉴클레오티드 또는 약 18 내지 약 26 뉴클레오티드를 포함한다.

TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 예를 들어, 변경된 인터뉴클레오시드 연결[Uhlmann and Peyman, Chemical Reviews 90: 543-548 (1990); Schneider and Banner, Tetrahedron Lett. 31: 335, (1990) ], 5,958, 773 및 본원에 개시된 특허에 개시된 바와 같은 변경된 핵산 베이스, 및/또는 당 등과 같은 핵소체용해 분해에 대한 저항성을 주는 다양한 변경을 함유할 수 있다. 변경된 올리고뉴클레오티드의 더 나아간 기술은 아래에 제공된다.

안티센스 기술에 널리 적용가능한 것으로 알려진 안티센스 분자의 어떠한 변경 또는 변이는 본 발명의 범위 내에 포함된다. 그러한 변경은 미국 특허 5,536, 821 ; 5,541, 306; 5,550, 111; 5,563, 253; 5,571, 799; 5, 587, 361,5, 625,050 및 5,958, 773에서 개시된 바와 같은 인-함유 연결을 포함한다. 변경된 올리고뉴클레오티드의 더 나아간 기술은 아래에 제공된다.

본 발명의 안티센스 화합물은 변경된 베이스를 포함할 수 있다. 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드는 또한 올리고뉴클레오티드를 하나 이상의 부분 또는 접합체에 화학적으로 연결함으로써 변경되어 안티센스 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포, 또는 세포 흡수를 강화할 수 있다. 그러한 부분 또는 접합체는 콜레스테롤, 콜산, 티오에테르, 지방족 사슬, 인지질, 폴리아민, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG), 팔미틸 부분과 같은 지질, 및 예를 들어, 미국 특허 5,514, 758,5, 565,552, 5,567, 810, 5,574, 142, 5,585, 481, 5,587, 371,5, 597,696 및 5,958, 773에서 개시된 것들을 포함한다. 변경된 염기와 안티센스 올리고뉴클레오티드 접합체의 더 나아간 설명은 아래에 제공된다.

안티센스 업계에서, 특정 정도의 일상 실험은 특정 타겟을 위한 최적의 안티센스 분자를 선택하기 위해 수행될 수 있다. 그것의 설계에 있어서, 안티센스 분자는 접근가능한, 또는 노출된, 타겟 RNA 분자의 일부에 표적화될 수 있다. 세포에서 mRNA 수준은 처리된 제어 세포에서 mRNA의 역전사에 의해 그리고 cDNA 수준을 분석하여 일상적으로 측정될 수 있다. 생물학적 효과는 당업계에 알려진 바와 같이 세포 성장 또는 생활력을 측정함으로써 일상에서 결정될 수 있다.

cDNA 수준을 검정하고 분석함으로써 안티센스 활성의 특이성을 측정하는 것은 안티센스 결과를 확인하는 업계-인지된 방법이다. 예를 들어, 처리 및 제어 세 포로부터 RNA는 역-전사될 수 있고 결과의 cDNA 모집단을 분석하였다. (Branch, A. D., T. I. B. S. 23: 45-50 (1998)).

본 발명의 안티센스 분자는 SEQ ID NO: 5-8의 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산과 같이, 영역 또는 TFF3 폴리뉴클레오티드의 일에 상보적인 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 단독으로 또는 조합하여, 세포에서 TTF3의 발현을 줄일 수 있는 일부 예 안티센스 올리고뉴클레오티드는 하기 표 1에 제공된 서열, 또는 그것의 단편을 갖는 것들을 포함한다.

안티센스의 특이성 및 민감성은 치료 용도를 위한 당업자들에 의해 이용되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 동물과 사람의 질병 상태의 치료에 있어서 치료 부분으로서 채택되었다. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 사람에게 안전하고 효과적으로 투여되었고 수많은 임상적인 실험이 현재 진행중에 있다. 따라서 올리고뉴클레오티드가 세포, 조직 및 사람을 포함하는 포유동물의 치료를 위한 치료 요법에서 유용할 수 있는 유용한 치료 양상이 될 수 있다고 수립되었다.

본 발명에서 유용한 안티센스 화합물의 일부 예는 변경된 백본 또는 비-천연 인터뉴클레오시드 연결을 함유하는 올리고뉴클레오티드를 포함한다. 변경된 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드는 백본에서 인 원자를 보유하는 것들과 백본에서 인 원자를 갖지 않는 것들을 포함한다. 본 명세서의 목적을 위해, 당업계에서 일부 참조인용된 바와 같이, 그들의 인터뉴클레오시드 백본에서 인 원자를 갖지 않는 변경된 올리고뉴클레오티드는 또한 올리고뉴클레오시드로 간주될 수 있다.

변경된 올리고뉴클레오티드 백본의 예는 예를 들어, 포스포로티오에이트, 키랄 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포트리에스테르, 아미노알킬포스포트리-에스테르, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 키랄 포스포네이트, 포스피네이트를 포함하는 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 3'- 아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트를 포함하는 포스포라미데이트 , 티오노포스포라미데이트, 티오노-알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트리에스테르, 및 정상 3'-5'연결을 갖는 보라노-포스페이트, 2'-5'연결된 이들의 유사체, 및 뉴클레오시드 유닛의 인접한 쌍이 연결된 3'-5' 내지 5'-3' 또는 2'-5'내지 5'-2'인 역전된 극성을 갖는 것들을 포함한다. 다양한 염, 혼합 염 및 유리 산 형태가 또한 포함된다.

상기 인-함유 연결의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 이것으로 제한되지 않지만, 미국특허 No.: 3,687, 808; 4,469, 863; 4,476, 301; 5,023, 243; 5,177, 196; 5,188, 897; 5,264, 423; 5,276, 019; 5,278, 302; 5,286, 717; 5,321, 131 ; 5,399, 676; 5,405, 939; 5,453, 496; 5,455, 233; 5,466, 677; 5,476, 925; 5,519, 126; 5,536, 821; 5,541, 306; 5,550, 111; 5,563, 253; 5,571, 799; 5, 587, 361; 및 5,625, 050을 포함한다.

여기에서 인 원자를 포함하지 않는 일부 변경된 올리고뉴클레오티드 백본의 예는 단쇄 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 연결, 혼합된 헤테로원자 및 알킬 또는 사이클로알킬 인터뉴클레오시드 연결, 또는 하나 이상의 단쇄 헤테로원자 또는 헤테로고리 인터뉴클레오시드 연결에 의해 형성되는 백본을 가진다. 이들은 모르폴리노 연결을 갖는 것들(뉴클레오시드의 당 일부분으로부터 부분적으로 형성됨); 실옥세인 백본; 술피드, 술폭사이드 및 술폰 백본 ; 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 메틸렌 포름아세틸 및 티오포름아세틸 백본; 알켄 함유 백본; 술파메이트 백본; 메틸렌이미노 및 메틸렌히드라지노 백본; 술포네이트 및 술폰아미드 백본 ; 아미드 백본; 및 혼합된 N, O, S 및 CH₂ 성분 일부분을 갖는 다른 것들 을 포함한다.

상기 올리고뉴클레오시드의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이것으로 제한되지는 않지만, 미국특허 No.: 5,034, 506; 5,166, 315; 5, 185, 444; 5,214, 134; 5,216, 141; 5,235, 033; 5,264, 562; 5,264, 564; 5,405, 938; 5,434, 257; 5,466, 677; 5,470, 967; 5,489, 677; 5,541, 307; 5,561, 225; 5,596, 086 ; 5,602, 240; 5,610, 289; 5,602, 240; 5, 608, 046; 5,610, 289 ; 5, 618, 704; 5,623, 070; 5,663, 312; 5,633, 360; 5,677, 437; 및 5,677, 439을 포함한다.

다른 올리고뉴클레오티드 유사제, 뉴클레오티드 유닛의 당과 인터뉴클레오시드 연결 모두, 즉, 백본은 신규 기로 치환된다. 베이스 유닛은 적절한 핵산 표적 화합물과의 부합화를 위해 유지될 수 있다. 하나의 그러한 올리고머 화합물, 뛰어난 부합화 성을 갖는 것으로 나타난 올리고뉴클레오티드 유사제은, 펩티드 핵산 (PNA)으로 불린다. PNA 화합물에서, 올리고뉴클레오티드의 당-백본은 아미드 함유 백본, 특히 아미노에틸글리신 백본으로 치환된다. 뉴클레오베이스가 보유되고 직접 또는 간접적으로 백본의 아미드 부분의 아자 질소 원자에 결합된다. PNA 화합물의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이것으로 제한되지는 않지만, 미국특허 No.: 5,539, 082; 5,714, 331; 및 5,719, 262을 포함하고, 이것의 각각은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다. PNA 화합물의 더나아간 교시는 Nielsen et al., Science, 1991,254, 1497- 1500에서 발견될 수 있다.

본 발명의 더 나아간 구체예에서 포스포로티오에이트 백본을 갖는 올리고뉴클레오티드와 미국특허 No. 5,489, 677 및 미국특허 No. 5,602, 240에서 제공된 것과 같은, 헤테로원자 백본을 갖는 올리고뉴클레오시드이다. 또한 위에서 참조된 미국특허 No. 5,034, 506의 모르폴리노 백본 구조를 갖는 올리고뉴클레오티드가 제공된다.

변경된 올리고뉴클레오티드는 또한 하나 이상의 치환된 당 부분을 함유할 수 있다. 예를 들어, 올리고뉴클레오티드 2' 위치에서 다음중 하나를 포함할 수 있다: OH; F; O-, S-, 또는 N-알킬 ; O-, S-, 또는 N-알케닐; O-, S- 또는 N-알키닐; 또는 0-알킬- 0-알킬, 이때 알킬, 알케닐 및 알키닐은 치환 또는 미치환 C1 내지 C1O 알킬 또는 C2 내지 C10 알케닐 및 알키닐이 될 수 있다. 유사한 변경은 올리고뉴클레오티드에서 다른 위치에서 특히 3' 종말 뉴클레오티드 위에 또는 2'-5'연결된 올리고뉴클레오티드에서 당의 3'위치 및 5'종말 뉴클레오티드의 5'위치에서 만들어질 수 있다. 올리고뉴클레오티드는 또한 펜토푸라노실 당의 위치에 사이클로부틸 부분과 같은 당 유사제를 가진다. 그러한 변경된 당 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이것으로 제한되지는 않지만, 미국특허 No.: 4,981, 957; 5,118, 800 ; 5,319, 080; 5,359, 044; 5,393, 878; 5,446, 137; 5,466, 786; 5,514, 785; 5,519, 134; 5,567, 811; 5,576, 427; 5,591, 722; 5,597, 909; 5,610, 300; 5,627, 053; 5,639, 873; 5,646, 265; 5,658, 873; 5,670, 633; 및 5,700, 920을 포함하고, 이것의 각각은 그대로 본원에서 참조에 의해 포함된다.

올리고뉴클레오티드는 또한 뉴클레오베이스 (종종 당업계에서 간단히 "염기"라 부름) 변경 또는 치환을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "변경되지 않은" 또는 "천연" 뉴클레오베이스는 퓨린 염기 아데닌 (A) 및 구아닌 (G), 및 피리미딘 염기 티민 (T), 시토신 (C) 및 우라실 (U)을 포함한다. 변경된 뉴클레오베이스는 다른 합성 및 천연 뉴클레오베이스, 이를테면 5-메틸시토신 (5-me-C), 5-히드록시메틸 시토신, 크산틴, 하이포크산틴, 2-아미노아데닌, 아데닌 및 구아닌의 6-메틸 및 다른 알킬 유도체, 아데닌 및 구아닌의 2-프로필 및 다른 알킬 유도체, 2- 티오우라실, 2-티오티민 및 2-티오시토신, 5-할로우라실 및 시토신, 5-프로피닐 우라실 및 시토신, 6-아조 우라실, 시토신 및 티민, 5-우라실 (가짜우라실), 4-티오우라실, 8- 할로, 8-아미노, 8-티올, 8-티오알킬, 8-히드록실 및 다른 8-치환 아데닌 및 구아닌, 5-할로 특히 5-브로모, 5-트리플루오로메틸 및 다른 5-치환 우라실 및 시토신, 7-메틸구아닌 및 7-메틸아데닌, 8-아자구아닌 및 8-아자아데닌, 7- 데아자구아닌 및 7-데아자아데닌 및 3-데아자구아닌 및 3-데아자아데닌을 포함한다. 다른 변경된 뉴클레오베이스는 물론이고, 위에서 주목한 변경된 특정 뉴클레오베이스의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이것으로 제한되지는 않지만, 위에서 명시한 미국특허 No.: 4,845, 205; 5,130, 302; 5,134, 066 ; 5,175, 273; 5,367, 066; 5, 432, 272 ; 5,457, 187; 5,459, 255 ; 5,484, 908; 5,502, 177; 5,525, 711; 5,552, 540; 5,587, 469; 5,594, 121,5, 596,091 ; 5,614, 617; 5, 681, 941, 및 5,750, 692는 물론이고 미국특허 No. 3,687, 808를 포함하고, 이들의 각각은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드의 또다른 변경은 올리고뉴클레오티드의 활성, 세포 분포 또는 세포 흡수를 강화하는 올리고뉴클레오티드 하나 이상의 부분 또는 접합체에 대해 화학적으로 연결을 포함한다. 그러한 부분은 이것으로 제한되지는 않지만 콜레스테롤 부분, 콜산, 티오에테르과 같은 지질 부분, 예를 들어, 헥실-S-트리티올, 티오콜레스테롤, 지방족 사슬, 예를 들어, 도데칸디올 또는 운데실 잔기, 인지질, 예를 들어, 다이-헥사데실-rac-글리세롤 또는 트리에틸-암모늄 1, 2-di-O-헥사데실-rac-글리세로-3-H-포스포네이트, 폴리아민 또는 폴리에틸렌 글리콜 사슬, 또는 아다만탄 아세트산, 팔미틸 부분, 또는 옥타데실아민 또는 헥실아미노-카르보닐-옥시콜레스테롤 부분을 포함한다. 그러한 올리고뉴클레오티드 접합체의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는, 이것으로 제한되지는 않지만, 미국특허 No.: 4, 828, 979 ; 4,948, 882; 5,218, 105; 5, 525, 465; 5,541, 313; 5,545, 730; 5,552, 538; 5,578, 717,5, 580, 731; 5, 580, 731; 5,591, 584 ; 5,109, 124; 5,118, 802; 5,138, 045; 5,414, 077; 5,486, 603; 5,512, 439; 5,578, 718; 5,608, 046; 4,587, 044; 4,605, 735; 4,667, 025; 4,762, 779; 4,789, 737; 4, 824, 941 ; 4,835, 263; 4,876, 335; 4,904, 582; 4,958, 013; 5, 082, 830 ; 5,112, 963; 5,214, 136; 5,082, 830; 5,112, 963; 5,214, 136; 5,245, 022; 5,254, 469; 5,258, 506; 5, 262, 536 ; 5,272, 250; 5,292, 873 ; 5,317, 098 ; 5,371, 241,5, 391,723 ; 5,416, 203, 5,451, 463; 5,510, 475; 5,512, 667; 5,514, 785; 5,565, 552 ; 5,567, 810 ; 5,574, 142; 5,585, 481 ; 5,587, 371; 5,595, 726; 5,597, 696; 5,599, 923; 5,599, 928 및 5, 688, 941을 포함하고, 이들의 각각은 참조에 의해 본원에 포함된다.

주어진 화합물에서 모든 위치에서 균일하게 변경될 필요는 없고, 사실 위에서 언급한 변경 중 하나 이상은 단일 화합물 안에 또는 올리고뉴클레오티드내의 단일 뉴클레오시드에서 포함될 수 있다.

본 발명은 또한 키메라 화합물인 안티센스 화합물을 포함한다. 본 발명의 문맥에서 "키메라"안티센스 화합물 또는 "키메라"는 안티센스 화합물, 특히 올리고뉴클레오티드이고, 이것은 두개 이상의 화학적으로 구분된 영역을 함유하고, 각각은 적어도 하나의 모노머 유닛, 즉, 올리고뉴클레오티드 화합물의 경우에 뉴클레오티드로 구성된다. 이들 올리고뉴클레오티드는 전형적으로 적어도 하나의 영역을 함유하고 이때 올리고뉴클레오티드는 올리고뉴클레오티드에 뉴클레아제 분해, 증가된 세포 흡수에 대한 증가된 저항성, 및/또는 표적 핵산에 대해 증가된 결합 친화력을 주도록 변형된다. 올리고뉴클레오티드의 추가의 영역은 RNA: DNA 또는 RNA: RNA 잡종을 쪼갤 수 있는 효소에 대한 기질로서 작용할 수 있다. 예로서, RNase H는 RNA: DNA 중복부위의 RNA 가닥을 쪼개는 세포 엔도뉴클레아제이다. RNase H의 활성화는, 따라서, RNA 표적의 분할을 초래하고, 그로인해 유전자 발현의 올리고뉴클레오티드 억제의 효율을 크게 강화한다. 결과적으로, 동일한 표적 영역에 잡종화하는 포스포로티오에이트 데옥시올리고뉴클레오티드와 비교할때, 키메라 올리고뉴클레오티드가 사용될 때, 더짧은 올리고뉴클레오티드로 필적할만한 결과가 종종 얻어질 수 있다. RNA 표적의 분할은 겔 전기영동에 의해 만일 필요하다면, 당업계에 알려진 연합된 핵산 부합화 기술에 의해 일상적으로 검출될 수 있다.

본 발명의 키메라 안티센스 화합물은 두개 이상의 올리고뉴클레오티드, 위에서 기술한 바와 같은 변경된 올리고뉴클레오티드, 올리고뉴클레오시드 및/또는 올리고뉴클레오티드 유사제의 복합 구조로서 형성될 수 있다. 그러한 화합물은 또한 당업계에서 잡종 또는 갭머로 불린다. 그러한 잡종 구조의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이것으로 제한되지는 않지만, 미국특허 No.: 5,013, 830; 5, 149, 797 ; 5,220, 007; 5, 256, 775; 5,366, 878 ; 5,403, 711; 5,491, 133; 5,565, 350; 5,623, 065; 5,652, 355; 5,652, 356; 및 5,700, 922을 포함하고, 이들의 각각은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다.

본 발명에 따라 사용된 안티센스 화합물은 편리하게 일상적으로 고상 합성의 잘 알려진 기술을 통해 만들어질 수 있다. 그러한 합성을 위한 장비는 예를 들어, Applied Biosystems (Foster City, Calif.)를 포함하는 몇몇 업체에서 판매한다. 당업계에 알려진 그러한 합성을 위한 어떠한 다른 수단은 추가적으로 또는 대안으로서는, 채택될 수 있다. 포스포로티오에이트 및 알킬화 유도체와 같은 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위해 유사한 기술을 사용하는 것이 잘 알려져있다.

본 발명의 안티센스 화합물은 시험관내 합성될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 혼합될 수 있고, 캡슐화될 수 있고, 접합되거나 또는 다르게는 섭취, 분포 및/또는 흡착을 돕기 위해 예를 들어, 리포솜, 수용체 표적화 분자, 경구, 직장, 국소 또는 다른 제제와 같은, 다른 분자, 분자 구조 또는 화합물의 혼합물과 연합될 수 있다. 그러한 섭취, 분포 및/또는 흡착 돕는 제제의 제조를 교시하는 대표적인 미국 특허는 이것으로 제한되지는 않지만, 미국특허 No.: 5,108, 921 ; 5,354, 844; 5,416, 016; 5,459, 127; 5,521, 291; 5,543, 158; 5,547, 932; 5,583, 020; 5,591, 721; 4,426, 330; 4,534, 899; 5,013, 556; 5,108, 921; 5,213, 804; 5,227, 170; 5,264, 221; 5,356, 633; 5,395, 619; 5,416, 016; 5,417, 978; 5,462, 854; 5,469, 854 ; 5,512, 295; 5,527, 528; 5,534, 259; 5,543, 152; 5,556, 948; 5,580, 575; 및 5,595, 756을 포함하고, 이것의 각각은 본원에서 참조에 의해 포함된다.

본 발명의 안티센스 화합물은 더 나아가 어떠한 약학적으로 허용가능한 염, 에스테르, 또는 그러한 에스테르의 염, 또는 사람을 포함하는 동물에 투여될 때, (직접 또는 간접적으로) 생물학적으로 활성인 대사물 또는 그것의 잔여물을 제공할 수 있는 어떠한 다른 화합물을 포함한다. 따라서, 예를 들어, 개시는 또한 본 발명의 안티센스 화합물의 프로드러그 및 약학적으로 허용가능한 염 , 그러한 프로드러그의 약학적으로 허용가능한 염, 및 다른 생물등가물에 이끌린다.

본 발명의 안티센스 화합물은 진단, 치료, 예방을 위해 그리고 연구 시약 및 키트로서 이용될 수 있다. 치료를 위해서, TFF3의 발현을 조절함으로써 치료될 수 있는 질환 또는 장애가 있는 것으로 의심되는 동물, 바람직하게는 사람은 본 발명에 따라 안티센스 화합물을 투여함으로써 치료된다. 본 발명의 화합물은 유효량의 안티센스 화합물을 적절한 약학적으로 허용가능한 희석제 또는 담체에 첨가함으로써 제약 조성물에서 사용될 수 있다. 본 발명의 안티센스 화합물의 사용 및 방법은 또한 예를 들어, 종양 형성 또는 전이를 막거나 지연시키기 위해 예방적으로 유용할 수 있다.

본 발명의 안티센스 화합물은 이들 화합물은 TFF3을 인코딩하는 핵산으로 잡종화하여, 샌드위치 및 다른 분석법이 이러한 사실을 이용하도록 쉽게 구성되게 하기 때문에, 연구 및 진단에 유용하다. 핵산 인코딩 TFF3과의 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 부합화는 당업계에 알려진 수단에 의해 검출될 수 있다. 그러한 수단은 효소의 올리고뉴클레오티드에 대한 접합, 올리고뉴클레오티드의 방사능표지 또는 어떠한 다른 적절한 검출 수단을 포함할 수 있다. 샘플 중의 TFF3 의 수준을 검출하기 위한 그러한 검출 수단을 사용하는 키트는 또한 제조될 수 있다.

본 발명은 또한 본 발명의 안티센스 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 제제를 포함한다. 일부 구체예에서, 조성물 함유 안티센스 분자는 에멀젼으로서 제조되고 조제화될 수 있다. 에멀젼은 전형적으로 통상적으로 직경이 0.1 μm을 초과하는 물방울의 형태로 분산된 또다른 하나의 액체의 이질 시스템이다. 에멀젼은 종종 서로 친밀하게 혼합되고 분산된 두개의 혼합할 수 없는 액상을 포함하는 이상 시스템이다. 일반적으로, 에멀젼은 워터-인-오일 (w/o) 또는 오일-인-워터 (o/w) 다양성 중 하나가 될 수 있다. 수성상이 벌크 오일상 안으로 미세한 방울로서 미세하게 분할되고 분산될 때 결과의 조성물은 워터-인-오일 (w/o) 에멀젼이라고 부른다. 대안으로서는, 오일상이 벌크 수성상 안으로 미세한 방울로서 미세하게 분할되고부산될 때 결과의 조성물은 오일-인-워터 (o/w) 에멀젼이라고 부른다. 에멀젼은 분산된 상 및 수성상, 오일상 또는 그자체가 분리된 상으로서 용액으로서 존재할 수 있는 활성 약물에 더하여 추가의 성분을 함유할 수 있다. 유화제, 안정제, 염료, 및 항-산화제와 같은 제약 부형제는 필요할 때 에멀젼에 존재할 수 있다. 제약 에멀젼은 또한 예를 들어, 오일-인-워터-인-오일 (o/w/o) 및 워터-인-오일-인-워터 (w/o/w) 에멀젼의 경우에, 두개 이상의 상으로 구성되는 다중 에멀젼이 될 수 있다. 그러한 복합 제제는 종종 단순 2원 에멀젼이 주지 않는 특정한 잇점들을 제공한다. 에멀젼의 개별적인 오일 방울이 작은 물방울을 둘러싸는 다중 에멀젼은 w/o/w 에멀젼을 구성한다. 마찬가지로 오일 연속으로 안정화된 물의 방울에 둘러싸인 오일 방울의 시스템은 o/w/o 에멀젼을 제공한다.

또다른 관련 구체예에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 하나 이상의 안티센스 분자, 특히 제 1 핵산에 표적화된 올리고뉴클레오티드, 및 제 2 핵산 표적에 표적화된 하나 이상의 추가의 안티센스 화합물을 함유할 수 있다. 두개 이상의 조합된 화합물은 함께 또는 연속해서 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 적어도 하나의 표적화 핵산은 TFF3를 인코딩한다.

리보자임

중화제는 또한 예를 들어, TFF3 발현을 억제하는 리보자임이 될 수 있다. 리보자임은 전형적으로 단일-가닥 핵산, 이를테면 거기에 그들이 상보성 영역을 가지는 mRNA을 청소할 수 있는 리보핵 활성을 갖는 촉매 RNA 분자이다. 리보자임은 효소이기 때문에, 단일 리보자임 분자는 표적 RNA의 많은 분자를 쪼갤 수 있다. 게다가, 리보자임은 전형적으로 표적 RNA으로의 결합의 염기 쌍 메카니즘에는 물론이고, 또한 표적 RNA 분할의 메카니즘에 의존하는 억제의 특이성을 갖는, 매우 특이적 저해제이다. 촉매적으로 표적 유전자 mRNA 전사를 쪼개도록 설계된 리보자임 분자는 또한 표적 유전자 mRNA 의 번역, 따라서, 표적유전자 생성물의 발현을 방지하는데 사용될 수 있다. (참조, 예를 들어, WO 90/11364 및 Sarver, et al., 1990, Science 247,1222-1225).

리보자임은 표적 RNA에서 다양한 부위로 어닐링하도록 설계될 수 있다. 결합 팔은 TFF3 폴리뉴클레오티드와 같은 표적 부위에 상보적이 될 수 있다. 리보자임은 화학적으로 합성될 수 있다. 예 합성 방법은 Usman et al. , 1987 J. Am. Chem. Soc. , 109, 7845-7854 and in Scaringe et al. , 1990 Nucleic Acids Res. , 18,5433-5441에서 기술된 바와 같은 정상 RNA 합성을 위한 과정을 따를 수 있고, 5'-말단에서 디메톡시트리틸, 및 3'-말단에서 포스포라미다이트와 같은 공통 핵산 보호 및 커플링 기를 사용할 수 있다. 평균 단계별 커플링 수율은 >98%이 될 수 있다. 헤어핀 리보자임은 또한 두개의 부분으로 합성될 수 있고 어닐링되어 활성인 리보자임 (Chowrira and Burke, 1992 핵산s Res., 20,2835-2840)을 재구성할 수 있다. 리보자임은 뉴클레아제 저항 기, 예를 들어, 2'-아미노, 2'-C-알릴, 2'-플루오로, 2'-o-메틸, 2'- H 로 변경함으로써 안정성을 강화하도록 변경될 수 있다 (참조, 예를 들어, Usman 및 Gedergren, 1992 TIBS 17,34, 이것은 참조에 의해 본원에 포함된다).

리보자임은 겔전기영동 또는 높은 압력 액체 크로마토그래피 (HPLC)과 같은 당업계에 공지된 방법에 의해 정제될 수 있다.

리보자임 활성은 혈청 리보뉴클레아제에 의해 그들의 분해를 방지하는 변경으로 리보자임을 화학적으로 합성함으로써 최적화될 수 있다 (예를 들어, Eckstein et al. , WO 92/07065; Perrault et al., Nature, 1990,344 : 565; Pieken et al., Science 1991,253 : 314; Usman and Cedergren, Trends in Biochem. Sci. 1992,17 : 334; Usman et al. , WO 93/15187; 및 Rossi et al. , WO 91/03162, 및 미국특허 No. 5,652, 094 참조, 이것의 각각은 참조에 의해 본원에 포함되고, 이는 효소 RNA 분자의 당 부분에 만들어질 수 있는 다양한 화학 변경을 기술한다.

따라서, 리보자임은 (예를 들어, 미니자임은 물론이고, 헤어핀, 망치머리형, 또는 RNAase P 리보자임 (McCall, M. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 : 5710-5714), 또는 다른 촉매 RNA 분자) 촉매적으로 사용되어 clear TFF3 전사를 청소하고 그로인해 TFF3 mRNA의 번역을 억제할 수 있다. TFF3 에 대해 특이성을 갖는 리보자임은 TFF3의 뉴클레오티드 서열, 예를 들어, 본원에서 제공된 사람 TFF3 DNA 서열 또는 관련 폴리뉴클레오티드에 기반하여 설계될 수 있다. 리보자임을 합성하기 위한 기술은 Cech et al. , 미국 특허 4, 987, 071 및 5, 116, 742에서 개시된다. 대안으로서는, TFF3 mRNA 은 RNA 분자의 풀으로부터 특이적 리보핵 활성을 갖는 촉매 RNA를 선택하는데 사용될 수 있다. (참조, 예를 들어, Bartel 및 Stostak, J. W., J. Biol. Chem. 1261: 1411-1418 (1993)).

대안으로서는, TFF3 발현은 TFF3 의 조절 영역(촉진자, 인핸서)에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 표적화함으로써 표적 세포에서 전사를 막는 3중 나선형구조를 형성할 수 있다. (참조, 예를 들어, Helene et al., Annal. NYAcad Sci. 660: 27-36 (1992)).

일부 구체예에 따르면, 중화제는 망치머리형 리보자임이다. 망치머리형 리보자임은 표적 MRNA와 함께 상보성 염기 쌍을 형성하는 프랭킹 영역에 의해 지시된 위치에서 mRNAs를 쪼개는 것으로 믿어진다. 망치머리형 리보자임을 사용하는 특징은 표적 mRNA은 두개의 염기: 5'-UG-3'의 하기 서열을 갖는다는 것이다. 망치머리형 리보자임의 구성 및 제조는 당업계에 잘 알려져있고 Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, New York, (특히 도 4, 페이지 833 참조) 및 Haseloff and Gerlach, 1988, Nature, 334: 585-591에서 기술된다.

일부 구체예에 따르면, 리보자임은 예를 들어, 효율을 증가시키고 비-기능 mRNA 전사의 세포내 축적을 최소화하기 위해, 분할 인식 부위가 표적 유전자 mRNA의 5' 말단 근처에 위치하도록 엔지니어링된다.

본 발명의 리보자임은 또한 자연적으로 Tetrahymena 내열성 세균에서 일어나는 리보자임(IVS, 또는 L-19 IVS RNA으로 알려짐)과 같은 RNA 엔도리보뉴클레아제 (이후에 "Cech-타입 리보자임")을 포함하고 이것은 Thomas Cech 및 협력자들에 의해 광범위하게 기술되었다 (Zaug, et al., 1984, Science, 224: 574-578; Zaug and Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324: 429-433; University Patents Inc.; Been and Cech, 1986, Cell, 47: 207-216에 의해 공개된 국제 특허 출원 No. WO 88/04300). Cech-타입 리보자임은 전형적으로 표적 RNA 서열에 잡종화하는 8 염기 쌍 활성인 부위를 갖고 그후에 표적 RNA 의 분할이 일어난다.

리보자임은 직접 첨가될 수 있고, 또는 양이온 지질과 착화되고, 리포솜내에 패키징되고, 또는 다르게는 표적 세포로 송달될 수 있다. RNA 또는 RNA 착체는 바이오폴리머에 그들의 합일화가 있거나 없이, 주사, 에어로졸 흡입, 주입 펌프 또는 스텐트를 통해 생체외에서, 또는 생체내에서 관련 조직으로 국소 투여될 수 있다.

리보자임은 이것으로 제한되지 않고, 이온삼투요법, 또는 하이드로겔, 사이클로덱스트린, 생물분해성 나노캡슐, 및 생체결합성 미세구와 같은 다른 매개체 안으로 합일화에 의해 리포솜에 캡슐화를 포함하는, 당업자들에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포로 투여될 수 있다. 일부 지시를 위해서, 리보자임은 위에서 언급한 매개체 와 함께 또는 그것없이, 직접 생체외에서 세포 또는 조직에 송달될 수 있다. 대안으로서는, RNA/매개체 조합은 직접적인 주사 또는 카테터, 주입 펌프 또는 스텐트의 사용에 의해 국소적으로 송달될 수 있다. 송달의 다른 경로는 이것으로 제한되지는 않지만, 혈관내, 근육내, 피하 또는 관절 주사, 에어로졸 흡입, 경구 (정제 또는 알약 형태), 국소, 전신, 안구, 복막내 및/또는 경막내 송달을 포함한다. 리보자임 송달 및 투여의 보다 상세한 설명은 Sullivan, et al. , WO 94/02595에서 제공되고 이것은 그 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다.

세포내에서 축적하는 높은 농도의 리보자임(들)의 또다른 수단은 DNA 발현 벡터안으로 리보자임-인코딩 서열의 합일화를 수반할 수 있다. 리보자임 서열의 전사는 진핵 RNA 폴리머라아제 I (pol 1), RNA 폴리머라아제 II (pol II), 또는 RNA 폴리머라아제 III (pol III)에 대한 촉진자로부터 사라질 수 있다. pol II 또는 pol III 촉진자로부터의 전사는 모든 세포에서 높은 수준에서 발현될 것이다; 주어진 세포 타입에서 주어진 pol II 촉진자의 수준은 가까이 존재하는 유전자 규제 서열 (인핸서, 사일런서, 등)의 성질에 의존할 것이다. 원핵 RNA 폴리머라아제 효소 가 적절한 세포에서 발현된다는 것을 조건으로 하여, 원핵 RNA 폴리머라아제 촉진자가 또한 사용될 수 있다 (Elroy-Stein, O. and Moss, B. , 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, 6743-7; Gao, X. and Huang; L. , 1993, Nucleic Acids Res. , 21,2867-72 ; Lieber, A. , et al. , 1993, Method Enzymol. , 217, 47-66; Zhou, Y. , et al. , 1990, Mol. Cell. Biol. , 10,4529-37). 몇몇 연구자들은 그러한 촉진자로부터 발현된 리보자임은 포유동물 세포에서 기능할 수 있다는 것을 증명했다 (예를 들어(Kashani-Sabet, M., et al. , 1992, Antisense Res. Dev. , 2,3-15 ; Ojwang, J. O., et al. , 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 10802-6; Chen, C. J. , et al. , 1992, Nucleic Acids Res. , 20,4581-9 ; Yu, M. , et al. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 90,6340-4 ; L'Huillier, P. J. , et al. , 19921, EMBO J. , 11,4411-8 ; Lisziewicz, J. , et a. , 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 90,8000-4)). 상기 리보자임 전사 유닛은 포유동물 세포 안으로 도입을 위해 이것으로 제한되지 않고, 플라스미드 DNA 벡터, 바이러스 DNA 벡터 (이를테면 아데노바이러스 또는 아데노- 연합된 벡터), 또는 바이러스 RNA 벡터 (이를테면 레트로바이러스, Semliki 포리스트 바이러스, 신드비스 바이러스 벡터)을 포함하는, 다양한 벡터 안으로 합일화될 수 있다.

일부 구체예에 따르면, 표적 RNA (예를 들어, TFF3 mRNA)을 쪼개는 헤어핀 리보자임을 발현하는 전사 유닛은 플라스미드 DNA 벡터 또는 아데노바이러스 또는 아데노-연합된 DNA 바이러스 벡터 안으로 삽입될 수 있다. 바이러스 벡터 둘다 유전자를 폐로 이동시키는데 사용되었고 두 벡터 모두 일과성 유전자 발현을 야기하였다 (Zabner et al. , 1993 Cell 75,207 ; Carter, 1992 Curr. Opin. Biotech. 3,533). 아데노바이러스 벡터는 재조합 아데노바이러스 입자들로서 송달되었다. DNA는 단독으로 또는 매개체와 복합되어 송달될 수 있다 (상기 RNA에 대해 기술된 바와 같이). DNA, DNA/매개체 착체, 또는 재조합 아데노바이러스 입자들은 국소적으로 치료 부위로 투여될 수 있고, 예를 들어, 주사 카테터, 스텐트 또는 주입 펌프의 사용을 통해 또는 생체외에서 직접 세포 또는 조직으로 첨가될 수 있다.

RNAi 분자

RNA 간섭 (RNAi)은 본래 선충류 Caenorhabditis elegans의 연구에서 발견된, 진화론적으로 보존된 유전자 잠복 메카니즘이다(Lee et al, 세포 75: 843 (1993); Reinhart et al., Nature 403: 901 (2000)). 메카니즘은 dsRNA (이중-가닥 RNA)을 적절한 분자 기계류를 발현하는 세포 안으로 도입함으로써 유발되는 것으로 믿어지고, 이것은 그후 대응하는 내인 mRNA을 붕괴시킨다. 메카니즘은 리보뉴클레아제를 동종 mRNA 표적으로 향하게 하는 dsRNA의 짧은 RNAs로의 전환을 수반한다 (요약됨, Ruvkun, Science 2294: 797 (2001), 이것은 참조에 의해 본원에 포함된다). 이 과정은 바이러스에 대해 정상 방어 및 트랜스포손의 가동화에 관한 것이다. dsRNA로 치료는 유전자 기능 유기체를 분석하기 위한 보다 일반적인 방법이 되었다. RNA 간섭 또는 "RNAi"는 본래, 이중-가닥 RNA (dsRNA)가 벌레 안으로 도입될 때 유전자 발현을 차단할 수 있다는 관찰을 기술하기 위해 Fire 및 동료들에 의해 만들어진 용어이다 (Fire et al. (1998) Nature 391,806-811).

유전자 발현의 RNAi-매개된 조정을 수행하기 위해 사용된 RNAi 분자는 하나 이상의 가닥의 중합 리보뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 그것은 안정성 또는 결합 친화력을 강화하기 위해 포스페이트-당 백본, 당, 또는 뉴클레오베이스로의 변경을 포함하는, 안티센스 분자에 대해서 위에서 기술한 바와 같은 어떠한 수의 변경을 포함할 수 있다. 예를 들어, 천연 RNA의 포스포디에스테르 연결은 적어도 하나의 질소 또는 황 헤테로원자를 포함하도록 변경될 수 있다. RNA 구조에서 변경은 dsRNA에 의해 발생되는 일부 유기체에서 일반적인 공황 반응을 피하면서, 특이적 유전자 억제를 허용하도록 맞춰질 수 있다. 마찬가지로, 염기는 아데노신 디아미나아제의 활성을 차단하도록 변경될 수 있다. RNA는 효소적으로 또는 부분/전체 유기 합성에 의해 제조될 수 있다. 어떠한 변경된 리보뉴클레오티드는 시험관내 효소 또는 유기 합성에 의해 RNA 안으로 합일화될 수 있다. RNAi 분자는 dsRNA 분자가 될 수 있다.

이용될 수 있는 RNAi 분자의 크기는 그것의 발현이 억제되고 세포에서 대상 폴리뉴클레오티드의 발현을 감소시키기에 충분히 긴 대상 폴리뉴클레오티드의 크기에 따라 변화한다. 일반적으로, RNA는 적어도 약 10 내지 약 15 뉴클레오티드 길이이다. 특정 용도에서, RNA는 길이가 약 20,21, 22,23, 24 또는 25 뉴클레오티드 미만이다. 다른 경우에는, RNA는 길이가 적어도 약 50,100, 150 또는 200 뉴클레오티드이다. RNA는 특정한 다른 용도에서 적어도 약 300,400, 500 또는 600 뉴클레오티드와 같이 더욱 길어질 수 있다. 전형적으로, RNA는 약 3000 뉴클레오티드 미만이다. 어떠한 특정 대상 폴리뉴클레오티드에 대한 최적의 크기는 계통 형태에서 RNA의 크기를 줄이고 선택된 크기가 대상 폴리뉴클레오티드의 발현을 방해하는데 효과가 있는지 여부를 결정함으로써, 부적당한 실험 없이, 당업자에 의해 결정될 수 있다.

RNAi 분자는 세포당 적어도 하나의 카피의 송달을 허용하는 양으로 도입될 수 있다. 이중-가닥 재료의 더 높은 용량은 (예를 들어, 세포당 적어도 5,10, 100,500 또는 1000 카피) 좀더 효과적인 억제를 산출할 수 있고; 더낮은 용량은 또한 특이적 용도에 유용할 수 있다. 억제는 RNA의 중복부위 영역에 해당하는 뉴클레오티드 서열이 유전자 억제에 대해 표적화된다는 점에서 서열-특이적이다. 충분한 RNA은 조직 안으로 도입되어 이용가능한 검출방법론을 사용하여 표적 유전자의 발현에서 검출가능한 변화롤 초래한다 (후보 유전자는 사실 RNA가 그 안에 도입되는 세포에서 발현된다고 가정). 따라서, 일부의 경우에, 충분한 RNA가 도입되어 RNA가 도입되지 않은 세포와 비교할때 후보 유전자 발현에서 적어도 약 5 내지 약 10% 감소를 달성한다. 다른 경우에, 억제는 적어도 약 20,30, 40 또는 50%이다. 여전히 다른 경우에, 억제는 적어도 약 60,70, 80,90 또는 95%이다. 발현 일부의 경우에 필수적으로 완전히 검출가능하지 않은 수준으로 억제된다.

도입된 RNA의 양은 dsRNA가 동물 안으로 도입된다면, 이용된 투여의 모드, RNA의 크기, RNA가 투여되는 세포의 수, 및 동물의 나이와 크기와 같은 다양한 인자에 의존한다. 적절한 양은 예를 들면 몇가지 다른 농도에서 초기에 RNA를 투여함으로써 당업자들에 의해 결정될 수 있다. 특정한 경우에 RNA가 세포 배양 안으로 도입될 때, 세포 안으로 도입된 RNA의 양은 10⁶ 세포당 약 0.5 내지 약 3 μg 에서 변할 수 있다.

많은 옵션이 후보 유전자 발현의 간섭을 검출하기 위해 이용가능하다 (즉, 후보 유전자 잠복을 검출하기 위해). 일반적으로, 발현의 억제는 후보 유전자에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 감소를 검출하고, 유전자로부터 전사된 mRNA의 수준을 결정하고 및/또는 후보 유전자 발현과 연합된 페노타입에서의 변화를 검출함으로써 검출된다.

표적 유전자 (예를 들어, TFF3 폴리뉴클레오티드)의 일부와 실질적으로 동일한 뉴클레오티드 서열을 함유하는 RNA는 RNA 억제에 사용될 수 있다. 표적 서열에 비해 삽입, 결손, 및 단일점 돌연변이를 갖는 RNA 서열은 또한 억제에 효과적일 수 있다. 따라서, 서열 주체성은, 당업계에 잘 알려진 대로, 서열 비교 및 정렬 알고리즘에 의해 그리고 예를 들어, 디폴트 매개변수 (예를 들어, University of Wisconsin Genetic Computing Group)를 사용하여, BESTFIT 소프트웨어 프로그램에 이식된 바와 같은 Smith-Waterman 알고리즘에 의해, 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 차이를 계산함으로써 최적화될 수 있다. 일부 구체예에서, 서열 동일성은 저해제 RNA와 표적 유전자의 일부 사이에서, 90% 이상, 또는 약 100% 이상이 될 수 있다. 대안으로서는, RNA의 중복부위 영역은 기능적으로 표적 유전자 전사의 일부와 잡종화할 수 있는 뉴클레오티드 서열로서 한정될 수 있다 (예를 들어, 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 12-16 시간동안 50°C 또는 70°C 부합화 ; 그 다음 세척). RNA 뉴클레오티드 서열의 길이는 적어도 약 15,20, 25,50, 100,200, 300 또는 400 염기가 될 수 있다.

본원에서 개시된 바와 같이, RNA과 표적 유전자 사이의 100% 서열 주체성은 본 발명을 실행하는데 요구되지 않는다. 따라서 본 발명은 유전자 돌연변이, 균주 다형태, 또는 진화 발산으로 인해 예측될 수 있는 서열 변이를 견딜 수 있다는 잇점을 갖는다. 그러나, 일부 구체예에 따르면, 저해 RNA와 표적 유전자의 일부 사이에서 100% 서열 주체성이 존재한다. 추가적으로, 약 70%, 80%, 90% 또는 95% 서열 주체성 이상을 갖는 RNA는 본 발명에 사용될 수 있고, 따라서 유전자 돌연변이, 균주 다형태, 또는 진화 발산로 인해 예측될 수 있는 서열 변이를 견딜 수 있다.

RNA는 생체내에서 또는 시험관내에서 합성될 수 있다. 세포의 내인 RNA 폴리머라아제는 생체내에서 전사를 매개할 수 있고, 또는 클론 RNA 폴리머라아제는 전사 생체내에서 또는 시험관내 사용될 수 있다. 생체내에서 트랜스유전자 또는 발현 구성체, 규제 영역으로부터의 전사는 (예를 들어, 촉진자, 인핸서, 사일런서, 스플라이스 제공자 및 수용자, 폴리아데닐화) RNA 가닥 (또는 가닥들)을 전사하는데 사용될 수 있다. 억제는 기관, 조직, 또는 세포 타입에서 특이적 전사; 환경적 상태의 자극 (예를 들어, 감염, 스트레스, 온도, 화학 유발인자); 및/또는 발전 단계 또는 나이에서 엔지니어링 전사에 의해 표적화될 수 있다. RNA 가닥은 선택적으로 폴리아데닐화될 수 있다; RNA 가닥은 선택적으로 세포의 번역 장치에 의해 폴리펩티드로 번역될 수 있다. RNA은 더 나아가 화학적으로 또는 효소로 수동 또는 자동 반응에 의해 합성될 수 있다. RNA는 세포 RNA 폴리머라아제 또는 박테리오파지RNA 폴리머라아제 (예를 들어, T3, T7, SP6)에 의해 합성될 수 있다. 발현 구성체의 사용 및 제조는 당업계에 알려져있다(참조, 예를 들어, WO 97/32016; 미국특허 No. 5,593, 874,5, 698, 425,5, 712,135, 5, 789, 214, 및 5,804, 693). 만일 화학적으로 또는 시험관내 효소 합성에 의해 합성되면, RNA는 세포 안으로 도입하기 전에 정제될 수 있다. 예를 들어, RNA는 용매 또는 수지으로 추출, 침전, 전기영동, 크로마토그래피, 또는 그것의 조합에 의해 혼합물로부터 정제될 수 있다. 대안으로서는, RNA는 샘플 프로세싱으로 인한 손실을 피하기 위해 정제없이 또는 최소의 정제로 사용될 수 있다. RNA는 저장을 위해 건조되거나 또는 수용액에 용해시킬 수 있다. 용액은 중복부위 가닥의 어닐링, 및/또는 안정화를 촉진하기 위해 완충액 또는 염을 함유할 수 있다.

본 발명에 따르면, TFF3 폴리뉴클레오티드의 서열의 영역과 유사하거나 실질적으로 동일한 서열을 갖는 RNA는 RNA-간섭 메카니즘을 통해서와 같이 세포에서 TFF3 폴리펩티드의 발현을 조절하기 위해 사용될 수 있다. 표적화 서열의 영역은 TFF3 발현의 안티센스 조정을 위해 위에서 논의된 기준 중 어떤 것에 따라 선택될 수 있다. 일부 구체예에서, RNA는 실질적으로 동일하거나 또는 SEQ ID NO: 5-19중 어떤 것과 실질적으로 상보성인 서열을 포함할 수 있다. RNA는 또한 SEQ ID NO: 5-19의 어떤 것에 해당하는 서열의 일부, 또는 보체와 겹치는 서열을 가질 수 있다.

RNA는 안티센스 분자의 투여를 위해서 본원에서 기술된 바와 같이 유기체 또는 환자에게 투여될 수 있다. 일부 구체예에 따르면, RNA는 직접 세포 안으로 도입되거나(즉, 세포내로) ; 또는 공동, 사이질 공간안으로 유기체의 순환 안으로 세포외로 도입되거나, 경구로 도입되거나, 또는 RNA을 함유하는 용액에 유기체를 욕함으로써 도입될 수 있다. 경구 도입을 위한 방법은 음식으로서 사용되는 종이 RNA를 발현하도록 엔지니어링되고, 그후 영향받을 유기체에게 공급하는 엔지니어링된 접근은 물론이고, RNA과 유기체의 음식과의 직접적인 혼합을 포함한다. 핵산을 도입하는 물리적인 방법은, 예를 들어, 세포 안으로 직접 주사 또는 유기체 안으로 세포외 주사가 사용될 수 있다. 혈관 또는 혈관외 순환, 혈액 또는 림프 시스템, 체관부, 뿌리, 및 대뇌척수 유체는 RNA가 도입될 수 있는 부위이다. 재조합 구성체로부터 RNA를 발현하는 트랜스제닉 유기체는 접합체, 배아 줄기 세포, 또는 적절한 유기체로부터 유도된 또다른 다중효력 세포 안으로 구성체를 도입함으로써 생산될 수 있다.

핵산을 도입하는 물리적인 방법은 RNA의 존재하에서 RNA을 함유하는 용액의 주사, RNA에 의해 커버된 입자들에 의한 충격, RNA의 용액중에 세포 또는 유기체의 침지, 또는 세포 막의 전기천공법을 포함한다. 바이러스 입자 안으로 패키징된 바이러스 구성체는 발현 구성체의 세포 안으로의 효율적인 도입과 발현 구성체에 의해 인코딩된 RNA의 전사 둘다를 수행할 수 있다. 핵산을 세포 안으로 도입하기 위해 지질-매개된 담체 운반, 칼슘 포스페이트, 등과 같은 화학-매개 운반과 같은 당업계에 공지된 다른 방법이 사용될 수 있다. 따라서 RNA는 다음 활동 중 하나 이상을 수행하는 성분과 함께 도입될 수 있다: 세포에 의해 RNA 섭취를 강화하고, 중복부위 가닥의 어닐링을 촉진하고, 어닐링된 가닥을 안정화하고, 또는 그렇지 않으면 표적 유전자의 억제를 증가시킴.

표적 유전자의 발현의 억제는 표적 유전자(이는 예를 들어 특이적 항체 또는 당업자에게 알려진 다른 기술에 의해 검출될 수 있다) 및/또는 표적 유전자으로부터의 mRNA 생성물 (이것은 예를 들어 부합화 연구에 의해 검출될 수 있고) 및/또는 유전자의 발현과 연합된 페노타입에 의해 인코딩된 단백질의 수준의 부재 또는 관찰가능한 감소를 관찰하거나 검출함으로써 확인될 수 있다. 의학적 치료의 문맥에서, 표적 유전자의 발현의 억제의 확인은 증상의 감소, 완화, 질환 상태의 변화 등과 같은 대상의 질환 상태에서 변화를 관찰함으로써 수행될 수 있다. 일부 구체예에 따르면, 질환 상태의 변화는 느려진 종양 성장, 감소된 종양 부피, 세포의 감소된 운동성, 세포의 감소된 침입성, 등이 될 수 있다. 바람직하게는, 억제가 특이적이고, 즉 표적 유전자의 발현은 세포의 다른 유전자에 대한 명백한 효과 없이 억제된다.

효과적인 유전자 억제를 위해 포유동물에 투여된 RNA의 양은 투여의 경로, 나이, 포유동물의 크기와 상태, 억제될 유전자, 치료될 질환 또는 장애 등을 포함하여, 인자의 넓은 다양성에 따라 변할 수 있다. 일부 구체예에 따르면, dsRNA는 투여되어 각각의 세포에서 0.1 to 400 pg, 바람직하게는 1 내지 40 pg 가장 바람직하게는 1 내지 20 pg 을 제공할 수 잇다.

RNAi을 사용하기 위한 방법, 생체내에서 외인 추가 또는 전사는, 당업계에 알려져있다 (참조 Schubiger 및 Edgar, Methods in Cell Biology (1994) 44: 697-713, 및 PCT 출원 WO 99/32619, 각각, 이것의 각각은 참조에 의해 본원에 포함되고), 예를 들어, C. elegans에서, RNAi는 외음부 전구체 세포에서 종양 억제인자 유전자를 녹아웃하는 것으로 나타났다(Lu 및 Horvitz, 세포 (1998) 95: 981-991, 이것은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다).

RNAi을 사용하여 특정한 유전자 생성물의 발현을 줄이거나 억제하기 위한 방법은 미국특허 No. 6,506, 559 및 미국특허 출원 Pub. No. 20030027783 (포유동물에서 유전자 발현을 억제하는 것과 관련됨)에서 더욱 제공되고, 이것은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다.

항체

중화제는 또한 TFF3 단백질에 결합하는 항체 또는 그것의 단편과 같은 면역글로빈이 될 수 있다. 면역글로불린은 항원 특이성이 부족한 항체와 다른 항체-형 분자 둘다를 포함한다. 후자 종류의 폴리펩티드는, 예를 들어, 림프 시스템에 의해 낮은 수준에서 제조되고 골수종에 의해 높은 수준에서 제조된다.

"천연 항체 및 면역글로불린"은 보통 두개의 동일한 경(L)쇄와 두개의 동일한 중(H)쇄로 구성되는 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 글리코단백질이다. 각각의 경쇄는 하나의 공유결합 디술피드 결합에 의해 중쇄에 연결되는 한편, 디술피드 연결의 수는 다른 면역글로불린 동형의 중쇄들 사이에서 변한다. 각각의 중쇄 및 경쇄는 또한 규칙적인 공간의 쇄내 디술피드 다리를 갖는다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에서 가변 영역 (VH)을 가지고 이어서 많은 일정한 영역을 갖는다.

어떠한 척추 동물 종으로부터의 항체 (면역글로불린)의 "경쇄"는 그들의 일정한 영역의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 및 람다라 불리는 두개의 분명히 구분된 타입 중 하나로 할당될 수 있다. 그들의 중쇄의 불변 영역의 아미노산 서열 에 따라, 무손상 항체는 다른 "부류" 로 할당될 수 있다.

각각의 경쇄는 한 말단 (VL)에서 가변 영역과 그것의 다른 말단에서 불변 영역을 가지고 ; 경쇄의 불변 영역은 중쇄의 제 1 불변 영역과 정렬되고, 경쇄 가변 영역은 중쇄의 가변 영역과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기는 경쇄와 중쇄 가변 영역 사이에 경계면을 형성하는 것으로 믿어진다 (Chothia et al. J. Mol. Biol. 186: 651 (1985; Novotny and Haber, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 30 82: 4592 (1985); Chothia et al., Nature 342: 877-883 (1989)).

용어 "항체"는 넓은 의미로 사용되고 항원에 결합할 수 있는 항체 단편은 물론이고, 완전히 집합된 다클론 및 단일클론 항체를 커버한다 (예를 들어, Fab', F' (ab)₂, Fv, 단일 사슬 항체, 다이아바디).

본원에서 사용된 용어 "단일클론 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 얻어진 항체를 말하고, 즉, 모집단을 포함하는 개별적인 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다.

본 발명에 따라 사용된 항체 중화제의 제조를 위한 예시 기술에 대한 설명이 이어진다.

항체는 만일 1) 그들이 결합 활성의 역치 수준을 나타내고, 및/또는 2) 그들이 두드러지게 공지된 관련 폴리펩티드 분자와 교차-결합하지 않으면 "특이적으로 결합" 된다고 말한다. 항체의 결합 친화력은 예를 들어, Scatchard 분석 (Scatchard, Ann. NYAcad. Sci. 51: 660-672,1949)에 의해 당업자 중 누구나 쉽게 결정할 수 있다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 TFF3와 관련된 다른 단백질보다 적어도 10³, 더욱 바람직하게는 적어도 10⁴, 더욱 바람직하게는 적어도 10⁵, 좀더 바람직하게는 적어도 10⁶ 배 더 높게 TFF3에 결합한다.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 표준 웨스턴 블롯 분석 (Ausubel et al.)을 사용하여, 예를 들어, 만일 그들이 TFF3 폴리펩티드와 결합하지만 공지된 관련 폴리펩티드와는 결합하지 않는다면, 공지된 관련 폴리펩티드 분자와 특이적으로 결합하지 않는다 (또는 인정한다). 일부 구체예에서 항체는 공지된 관련 폴리펩티드에 대해서 스크리닝되어 특이적으로 TFF3 폴리펩티드에 결합하는 항체 모집단을 분리할 수 있다. 예를 들어, TFF3 폴리펩티드에 특이적인 항체가 적절한 완충액 조건하에서 불용성 기질에 부착된 TFF3 패밀리 폴리펩티드 (TFF3을 제외하고)을 포함하는 칼럼을 통해 흐를 것이다. 그러한 스크리닝은 밀접하게 관련된 폴리펩티드에 대한 다클론 및 단일클론 항체 비-교차반응의 분리를 허용한다(항체: A Laboratory Manual, Harlow and Lane (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocols in Immunology, Cooligan et al. (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc. , 1995). 특이적 항체의 스크리닝 및 분리는 당업계에 잘 알려져있다(참조, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff et al. , Adv. in Immunol. 43: 1-98,1988 ; Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd. , 1996; Benjamin et al. , Ann. Rev. Immunol. 2: 67-101,1984). 그러한 분석법의 대표적인 예는 다음을 포함한다: 동시 면역전기영동, 방사선면역분석법 (RIA), 방사선면역침전, 효소-연결 면역흡수 분석법 (ELISA), 도트 블롯 또는 웨스턴 블롯 분석법, 억제 또는 조성 분석법, 및 샌드위치 분석법.

일부 구체예에서, 본 발명의 항체는 공지된 관련 패밀리 멤버에 대해서보다 TFF3에 대해서 적어도 약 1000 배, 및 적어도 약 10,000 배 더 큰 친화력을 갖는다. 일부 구체예에서, 본 발명의 항체의 결합 친화력은 TFF3 이외의 관련 폴리펩티드에 대해서 약 1 x 10⁵ K_a미만, 약 1x10⁴ K_a미만, 및 바람직하게는 1 x 10³K_a미만이다.

다클론 항체

다클론 항체는 관련 항원 및 애주번트의 다중 피하 (sc), 복막내 (ip) 또는 근육내 (im) 주사에 의해 동물에서 기를 수 있다. 2기능 또는 유도제, 예를 들어, 말레이미도벤조일 술포숙시니미드 에스테르 (시스테인 잔기를 통한 접합), N-히드록시숙시니미드 (리신 잔기를 통하여), 글루타르알데히드, 숙신 알데히드, SOC1₂, 또는 R¹N=C=NR, (이때 R과 R^l은 다른 알킬 기이다)를 사용하여, 관련 항원을 면역화될 종에서 면역원성인 단백질, 예를 들어, 열쇠구멍 삿갓조개 헤모시아닌, 혈청 알부민, 솟과 티로글로불린, 또는 소이빈 트립신 저해제에 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 동물은 예를 들어, 100 pg의 단백질 또는 접합체 (토끼 또는 마우스에 대해, 각각)를 3 부피의 Freund의 완전 애주번트와 조합하고 다중 부위에서 용액을 피내로 주사함으로써 항원, 면역원성 접합체, 또는 유도체에 대해서 면역화된. 한달 후에 동물은 다중 부위에서 피하 주사에 의해 Freund의 완전 애주번트중의 1/5 내지 1/10 원래 양의 펩티드 또는 접합체로 부양된다. 7 내지 14 일 후에 동물은 출혈되고 혈청은 항체 역가에 대해 분석된다. 동물은 역가 평탄역에 올때까지 부양된다. 바람직하게는, 동물은 다른 단백질에 접함되거나 및/또는 다른 가교-결합 시약을 통해, 동일한 항원의 접합체로 부양된다. 접합체는 또한 단백질 융합으로서 재조합 세포 배양에서 만들어질 수 있다. 또한, 백반과 같은 응집제가 적절하게 사용되어 면역 반응을 높인다.

단일클론 항체

단일클론 항체는 실질적으로 균질한 항체의 모집단으로부터 얻어진다 , 즉, 모집단을 포함하는 개별적인 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연적으로 발생하는 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 따라서, 조절제 "단일클론"은 분리된 항체의 혼합물이 아니면서 항체의 특정을 나타낸다. 예를 들어, 단일클론 항체는 Kohler et al., Nature, 256: 495 (1975)에 의해 먼저 기술된 하이브리도마 방법을 사용하여 만들어질 수 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (미국 특허 No. 4, 816, 567)에 의해 만들어질 수 있다.

하이브리도마 방법에서, 마우스 또는 토끼 또는 햄스터와 같은 다른 적절한 숙주 동물은 위에서 기술한 바와 같이 면역화되어 특이적으로 면역화에 사용된 단백에 결합할 항체를 제조하거나 제조할 수 있는 림프구를 유도해낸다. 대안으로서는, 림프구는 시험관내에서 면역화될 수 있다. 림프구는 그후 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적절한 융화제를 사용하여 골수종 세포와 융합되어, 하이브리도마 세포를 형성한다 [Goding, 단일클론 항체. Principles and Practice, pp. 59-103 (Academic Press, 1986)].

그렇게 제조된 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은, 부모 골수종 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적절한 배양 배지에서 접종되고 성장된다. 예를 들어, 만일 부모 골수종 세포가 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스페라제 (HGPRT 또는 HPRT)이 부족하면, 하이브리도마를 위한 배양 배지는 전형적으로 하이포크산틴, 아미노프테린, 및 티미딘 (HAT 배지)을 포함할 것이고, 이 물질은 HGPRT-결핍 세포의 성장을 막는다.

골수종 세포의 예는 Salk Institute 세포 분포 Center, San Diego, California USA로부터 입수가능한 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양, 및 American 타입 배양 Collection, Rockville, Maryland USA로부터 입수가능한 SP-2, NZO, 또는 X63-Ag8-653 세포로부터 유도된 것들을 포함하여, 쥣과동물 골수종 라인과 같은 골수종 세포계를 포함하여, 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생성 세포에 의해 항체의 안정한 높은-수준 제조를 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것들이다. 사람 골수종 및 마우스 사람 헤테로골수종 세포계는 또한 사람 단일클론 항체의 제조에 대해 기술되었다 [Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., 단일클론 항체 제조 기술 및 응용, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987)].

하이브리도마 세포가 성장하고 있는 배양 배지는 예를 들어 효소-연결 면역흡수 분석법 (ELISA) 또는 방사선면역분석법 (RIA)과 같은 시험관내 결합 분석법에 의해, 필수의 특이성을 갖는 단일클론 항체의 제조를 위해 분석된다. 항체를 발현하는 세포의 위치는 FACS에 의해 검출될 수 있다. 그후에, 하이브리도마 클론은 제한 희석 과정에 의해 서브클로닝될 수 있고 표준 방법에 의해 성장된다 (Goding, 단일클론 항체 : Principles and Practice, Academic Press (1986) pp. 59-103). 이러한 목적을 위한 적절한 배양 배지는 예를 들어, DMEM 또는 RPMI-1640 배지를 포함한다. 게다가, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수 종양에서와 같이 생체내에서 성장될 수 있다.

서브클론에 의해 분비된 단일클론 항체는 예를 들어, 단백질 A-Sepharose, 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석, 또는 친화력 크로마토그래피와 같은 종래의 면역글로불린 정제 과정에 의해 배양 배지, 복수 유체, 또는 혈청으로부터 적절하게 분리된다.

단일클론 항체를 인코딩하는 DNA는 종래의 과정을 사용하여 쉽게 분리되고 서열화된다 (예를 들어, 쥣과동물 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함으로써). 하이브리도마 세포는 그러한 DNA의 공급원으로서 역할을 한다. 일단 분리되면, DNA는 발현 벡터 안으로 놓일 수 있고, 이것은 그후 다른 방법으로 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 E. coli 세포, 원숭이 COS 세포, Chinese Hamster 난소(차이니즈 햄스터 난소: CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 안으로 트랜스펙트되어, 재조합 숙주 세포에서 단일클론 항체의 합성을 얻는다. 그 항체를 인코딩하는 DNA의 박테리아에서 재조합 발현에 대한 리뷰 기사는 Skerra et al., Cur7". Opinion in Immunol., 5: 256-262 (1993) 및 Phickthun, Immunol. Revs., 130: 151-188 (1992)을 포함한다.

더 나아간 구체예에서, 항체 파지라이브러리로부터 McCafferty et al., Nature, 348: 552-554 (1990). Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) 및 Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991)에서 설명된 기술을 사용하여 발생된 항체 또는 항체 단편을 분리하고, 파지라이브러리를 사용하여, 쥣과동물과 사람 항체 각각의 분리를 설명한다. 이어지는 공보는 매우 큰 파지라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 조합 감염 및 생체내에서 재조합은 물론이고(Waterhouse et al., Nuc. Acids. Res., 21: 2265-2266 (1993) 이것은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다), 사슬 뒤섞기에 의해 높은 친화력 (nM 범위) 사람 항체의 제조를 기술한다 (Marks et al., Biol기술, 10 : 779-783 (1992) 이것은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다). 따라서, 이들 기술은 단일클론 항체의 분리를 위한 종래의 단일클론 항체 하이브리도마 기술에 대한 가변적 대안이다.

DNA는 또한 예를 들어, 동종 쥣과동물 서열의 위치에 코딩 서열을 사람 중쇄 및 경쇄 일정한 영역 대신으로 교체함으로써 (미국 특허 No. 4,816, 567; Morrison, et ad, Proc. Natl Acad. Scz. USA, 81: 6851 (1984) 이것은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다), 또는 비-면역글로불린 폴리펩티드에 대해서 코딩 서열의 전체 또는 일부를 공유결합으로 면역글로불린 코딩 서열에 결합함으로써, 변경될 수 있다. 전형적으로 그러한 비-면역글로불린 폴리펩티드는 항체의 일정한 영역에 대해 치환되거나, 또는 그들은 항체의 하나의 항원-조합 부위의 가변 영역에 대해 치환되어, 항원에 대한 특이성을 갖는 하나의 항원-조합 부위와 다른 항원에 대해 특이성을 갖는 부위를 조합하는 또다른 항원을 포함하는 키메라 2가 항체를 만들어낸다.

추가적으로, TFF3에 대한 재조합 항체는 예를 들어, 다양한 특허에서 기술된 바와 같이 트랜스제닉 동물에서 제조될 수 있다. 예를 들어, 재조합 항체 는 미국 특허 No. 5, 877, 397,5, 874,299, 5, 814, 318,5, 789,650, 5,770, 429, 5,661, 016,5, 633, 425, 5,625, 126,5, 569,825, 5,545, 806,6, 162,963, 6,150, 584, 6, 130, 364,6, 114, 598, 6,091, 001, 5,939, 598중 어떤 것에서 개시된 바와 같이, 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 설치류에서 발현될 수 있다. 대안으로서는, 재조합 항체는 미국 특허 No. 5,849, 992 또는 5,827, 690에서 논의된 바와 같이, 트랜스제닉 동물의 우유에서 발현될 수 있다.

사람화 항체

비-사람 항체를 사람화하기 위한 방법은 당업계에서 기술되었다. 바람직하게는, 사람화 항체는 사람이 아닌 공급원으로부터 그것 안으로 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이들 비-사람 아미노산 잔기는 종종 "수입" 잔기라 불리고, 이것은 전형적으로 "수입"가변 영역으로부터 취해진다. 사람화는 고변이 영역 서열을 사람 항체의 대응하는 서열 대신으로 교체함으로써, 필수적으로 Winter 및 동료들의 방법에 따라 수행될 수 있다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al, Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al, Science, 239: 1534-1536 (1988)). 따라서, 그러한 "사람화" 항체는 실질적으로 비-사람 종으로부터의 대응하는 서열에 의해 치환된 무손상 사람 가변 영역 미만인 키메라 항체 (미국 특허 No. 4,816, 567)이다. 실제로, 사람화 항체가 전형적으로 일부 고변 잔기와 가능하게는 FR 잔기가 설치류 항체에서 유사한 부위로부터의 잔기에 의해 치환되는 사람 항체이다.

사람화 항체를 만드는데 사용될 사람 가변 영역의 선택은, 경쇄와 중쇄 모두, 항원성에 영향을 준다. 소위 "가장 잘 맞는" 방법에 따르면, 설치류 항체의 가변 영역의 서열은 알려진 사람 가변-영역 서열의 전체 라이브러리에 대해서 스크리닝된다. 설치류의 서열과 가장 가까운 사람 서열은 그후 사람화 항체를 위한 사람 틀 영역 (FR)으로서 받아들여진다 (Sims et al, J. Immunol, 151: 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol, 196: 901 (1987) ). 또다른 방법은 경쇄 또는 중쇄의 특정 하위그룹의 모든 사람 항체의 일치 서열로부터 유도된 특정 틀 영역을 사용한다. 동일한 틀은 몇개의 다른 사람화 항체에 대해서 사용될 수 있다 (Carter et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA, 89 : 4285 (1992); Presta et al., J : Immunol, 151: 2623 (1993)).

항체는 항원 및 다른 유리한 생물학적 성질에 대해 높은 친화력의 보유로 사람화될 수 있다. 이러한 목표를 달성하기 위해, 일부 구체예에 따르면, 사람화 항체는 부모 및 사람화 서열의 3차원 모델을 사용하여, 부모 서열 및 다양한 개념 사람화 생성물의 분석 과정에 의해 제조된다. 3차원 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용가능하고 당업자들에게 친숙하다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 유망한 3차원 배좌 구조를 도시하고 보여주는 컴퓨터 프로그램이 이용가능하다. 이들 표시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능화에 있어서 잔기의 가망있는 역할의 분석, 즉, 후보 면역글로불린이 그것의 항원에 결합하는 능력에 영향을 주는 잔기의 분석을 허용한다. 이러한 식으로, FR 잔기는 받는이와 수입 서열로부터 선택되고 조합되어 표적 항원(들)에 대한 증가된 친화력과 같은 원하는 항체 특징이 달성되도록 한다. 일반적으로, 고변이 영역 잔기가 직접적이고 가장 실질적으로 항원 결합에 영향을 주는데 수반된다.

사람 항체

사람화에 대한 대안으로서, 사람 항체가 생성될 수 있다. 위에서 논의한 바와 같이, 항체의 제조, 특히 트랜스제닉 동물에서의 사람 항체가 알려져있다. 예를 들어, 면역화할때, 내인 면역글로불린 제조의 부재하에서 사람 항체의 전체 레퍼토리를 제조할 수 있는 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스)이 생산될 수 있다. 예를 들어, 키메라 및 생식계열 돌연변이 마우스에서 항체 중쇄 결합 영역 (JH) 유전자의 동종접합 결손은 내인 항체 제조 완전한 억제를 초래한다고 설명되었다. 그러한 생식계열 돌연변이 마우스에서 사람 생식계열 면역글로불린 유전자 배열의 이동은 항원 접종시에 사람 항체의 제조를 야기할 것이다. 참조, 예를 들어, Jakobovits et al., Proc. Mad. Acad. Sci. USA, 90: 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Inimuno., 7 : 33 (1993) ; 및 미국 특허 No. 5,591, 669,5, 589, 369 및 5,545, 807. 대안으로서는, 파지표시 기술 (McCafferty et al., Nature 348: 552-553 (1990) 이것은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다) 이 사용되어 비면역화 제공자로부터 면역글로불린 가변 (V) 영역 유전자 레퍼토리로부터 시험관내에서 사람 항체 및 항체 단편을 생산할 수 있다. 이 기술에 따르면, 항체 V 영역 유전자는 M13 또는 fd와 같은, 실모양 박테리오파지의 주요 또는 마이너 코트 단백질 유전자 중 하나 안으로 인-프레임 클로닝되고, 파지입자의 표면에서 기능적 항체 단편으로서 나타냈다. 실모양 입자가 파지게놈의 단일-가닥 DNA 카피를 함유하기 때문에, 항체의 기능적 성질에 기반한 선택은 또한 그러한 성질을 나타내는 항체를 인코딩하는 유전자의 선택을 야기한다. 따라서, 파지는 B 세포의 성질의 일부를 흉내낸다. 파지는 다양한 포맷에서 수행될 수 있다; 그들의 리뷰 참조를 위해, 예를 들어 Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J. , Current Opinion in Structural Biology 3: 564-571 (1993). V-유전자 단편의 몇가지 공급원은 파지표시를 위해 사용될 수 있다. Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991)는, 다양한 배열의 항-옥사졸론 항체를 면역화 마우스의 비장으로부터 유도된 V 유전자의 작은 무작위 조합 라이브러리로부터 분리시켰다. 비면역화 사람 제공자로부터의 V 유전자의 레퍼토리는 구성될 수 있고 다양한 배열의 항원 (자가-항원을 포함)에 대한 항체는 필수적으로 Marks et al., J Mol. Biol. 222: 581-597 (1991), 또는 Griffith et al., EMBO J. 12: 725-734 (1993)에 의해 설명된 기술에 따라 분리될 수 있다. 참조, 또한, 미국특허 No. 5,565, 332 및 5,573, 905. 사람 항체는 또한 시험관내 활성화 B 세포에 의해 발생될 수 있다 (미국특허 No. 5,567, 610 및 5,229, 275 참조).

항체 단편

다양한 기술은 항체 단편의 제조를 위해 개발되었다. 종래에, 이들 단편들은 무손상 항체의 단백질분해 소화를 통해 유도되었다 (참조, 예를 들어, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biopgysical Methods 24: 107-117 (1992) and Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) ). 그러나, 이들 단편은 또한 재조합 숙주 세포에 의해 직접 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 위에서 논의된 항체 파지라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대안으로서는, Fab'-SH 단편은 직접 E. coli로부터 회수될 수 있고 화학적으로 결합되어 F(ab')₂ 단편을 형성할 수 있다 [Carter et al., Bio/기술 10: 163-167 (1992) 이것은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다]. 또다른 접근에 따르면, F (ab')₂ 단편은 재조합 숙주 세포 배양으로부터 직접 분리될 수 있다. 항체 단편의 제조를 위한 다른 기술은 기술있는 개업의에게 명백할 것이다. 다른 구체예에서, 선택의 항체는 단일 사슬 Fv 단편 (scFv)이다. WO 93/16185 ; 미국 특허 No. 5,571, 894 ; 및 미국 특허 No. 5, 587, 458를 참조. 항체 단편은 또한 예를 들어, 미국 특허 5,641, 870에서 기술된 바와 같이, "선형 항체"가 될 수 있다. 그러한 선형 항체 단편은 단일특이적 또는 이특이적이 될 수 있다. 더욱이, 파지표시 라이브러리에서 확인된 항체 단편을 인코딩하는 핵산은 클로닝되고, 서열되고, 인코딩하고 어떠한 동형의 전체 크기의 항체를 발현할 수 있는 핵산의 일부로 엔지니어링될 수 있다.

이특이적 항체

이특이적 항체를 만드는 방법은 당업계에 알려져있다. 전장 이특이적 항체의 종래의 제조는 두개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 공동-발현에 근거하고, 이때 두개의 사슬이 다른 특이성을 가진다 (Millstein et al., Nature, 305: 537-539 (1983) 이것은 그대로 참조에 의해 본원에 포함된다). 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위 조합 때문에, 이들 하이브리도마 (쿼드로마스)는 10 다른 항체 분자의 잠재적인 혼합물을 생산하고, 그 중에서 오직 하나가 정확한 이특이적 구조를 가진다. 친화력 크로마토그래피 단계에 의해 수행될 수 있는 정확한 분자의 정제는, 다소 번거럽고, 생성물 수율이 낮다. 유사한 과정은 WO 93/08829, 및 Traunecker et al., EMBO J 10: 3655-3659 (1991)에 개시된다.

다른 접근에 따르면, 원하는 결합 특이성 (항체-항원 조합 부위)을 갖는 항체 가변 영역은 면역글로불린 불변 영역 서열에 융합된다. 융합은 바람직하게는 적어도 일부의 경첩, CH2, 및 CH3 영역을 포함하는, 면역글로불린 중쇄 불변 영역과이다. 일부 구체예에서, 경쇄 결합에 필요한 부위를 함유하는 제 1 중쇄 불변 영역 (CH1)은 적어도 하나의 융합에 존재한다. 면역글로불린 중쇄 융합을 인코딩하는 DNAs 인코딩 및, 바람직하다면, 면역글로불린 경쇄가, 개별적인 발현 벡터 안으로 삽입되고, 적절한 숙주 유기체 안으로 공동-트랜스펙트된다. 이는 구성에서 사용된 같지않은 비율의 3 폴리펩티드 사슬이 최적 수율을 제공할때 구체예에서, 3 폴리펩티드 단편의 상호 비율을 조절하는데 있어서 큰 유연성을 제공한다. 그러나, 동일한 비율로 적어도 두개의 폴리펩티드 사슬의 발현이 높은 수율을 초래할때 또는 비율이 특별히 중요하지 않을때, 하나의 발현 벡터에서 두개의 또는 모든 3 폴리펩티드 사슬에 대한 코딩 서열을 삽입하는 것이 가능하다.

일부 구체예에서 이특이적 항체는 하나의 팔에서 제 1 결합 특이성과 함께 잡종 면역글로불린 중쇄와, 다른 팔에서 잡종 면역글로불린 중쇄 경쇄 쌍 (제 2 결합 특이성을 제공함)을 함유한다. 오직 1/2의 이특이적 분자에서 면역글로불린 경쇄의 존재가 손쉬운 분리 방법을 제공하기 때문에, 이 비대칭구조가 원치않는 면역글로불린 사슬 조합으로부터 원하는 이특이적 화합물의 분리를 촉진한다는 것을 발견하였다. 이 접근은 WO 94/04690에서 개시된다. 이특이적 항체의 발생의 더욱 상세한 내용을 위해서, 예를 들어, Suresh et al., 방법 inEnzymology, 121: 210 (1986)를 참조할것.

미국 특허 No. 5,731, 168에서 기술된 또다른 접근에 따라, 항체 분자의 쌍 사이에 계면은 재조합 세포 배양으로부터 회수되는 헤테로다이머의 퍼센트를 최대화하도록 엔지니어링 될 수 있다. 일부 구체예에서 계면은 항체 불변 영역의 CH3 영역의 적어도 일부를 포함한다. 이 방법에서, 제 1 항체 분자의 계면으로부터 하나 이상의 작은 아미노산 측 사슬은 더 큰 측쇄 (예를 들어티로신 또는 트립토판)로 교체된다. 큰 측쇄(들)에 대한 동일한 또는 유사한 크기의 보상 "공동"은 큰 아미노산 측쇄를 더작은 것으로 바꿈으로써(예를 들어 알라닌 또는 트레오닌) 제 2 항체 분자의 계면에 생성된다. 이는 호모다이머와 같은 다른 원치않는 최종 생성물보다 헤테로다이머의 수율을 증가시키기 위한 메카니즘을 제공한다.

이특이적 항체는 교차-연결 또는 "헤테로접합체"항체를 포함한다. 예를 들어, 헤테로접합체에서 항체 중의 하나는 아비딘에 결합할 수 있고, 다른 것은 비오틴에 결합한다. 그러한 항체는, 예를 들어, 표적 면역 시스템 세포를 원치않는 세포로 향하게 하도록 (미국 특허 No. 4,676, 980), 그리고 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 91/00360 및 WO 92/200373)제안되었다. 헤테로접합체 항체는 어떠한 편리한 가교-결합 방법을 사용하여 만들어질 수 있다. 적절한 가교-결합제는 당업계에 잘 알려져있고, 많은 가교-결합 기술과 함께, 미국 특허 No. 4,676, 980에서 개시된다.

항체 단편으로부터 이특이적 항체를 발생시키기 위한 기술은 또한 문헌에 기술되어 있다. 예를 들어, 이특이적 항체는 화학 연결을 사용하여 제조될 수 있다. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)는, 무손상 항체가 단백질분해로 분할되어 F (ab') 2 단편을 발생시키는 과정을 기술한다. 이들 단편은 디티올 착화제 나트륨 아르세나이트의 존해하에서 감소되어 인접 디티올을 안정화하고 분자내 디술피드 형성을 방지한다. 발생된 Fab'단편은 그후 티오니트로벤조에이트 (TNB) 유도체로 전환된다. Fab'-TNB 유도체 중 하나는 그후 메르캅토에틸아민으로의 환원에 의해 Fab'-티올로 전환되고 동일한 양의 다른 Fab'-TNB 유도체와 혼합되어 이특이적 항체를 형성한다. 생산된 이특이적 항체는 선택적인 효소의 부동화를 위한 약제로서 사용될 수 있다.

최근의 과정은 E. coli으로부터의 Fab'-SH 단편의 직접적인 회수를 촉진하였고, 이것은 화학적으로 결합되어 이특이적 항체를 형성할 수 있다. Shalaby et al., J. Exp. Med., 175: 217-225 (1992)는, 전체 사람화 이특이적 항체 F (ab') 2 분자의 제조를 기술한다. 각각의 Fab'단편은 개별적으로 E. coli 로부터 분비되고 시험관내 지시된 화학 결합을 하여 이특이적 항체를 형성한다. 이렇게 형성된 이특이적 항체는 사람 유방 종양 표적에 대해서 사람 세포독성 림프구의 용해 활성을 시작하는 것은 물론이고, ErbB2 수용체 및 정상 사람 T 세포를 과발현하는 세포에 결합할 수 었었다.

재조합 세포 배양으로부터 직접 이특이적 항체 단편을 만들고 분리하기 위한 다양한 기술이 기술되었다. 예를 들어, 이특이적 항체는 류신 지퍼를 사용하여 제조되었다. Kostelny et al., J ; Immunol., 148 (5): 1547-1553 (1992). Fos 및 Jun 단백질로부터 류신 지퍼 펩티드는 유전자 융합에 의해 두개의 다른 항체의 Fab' 부분에 연결된다. 항체 호모다이머는 경첩 영역에서 감소되어 모노머를 형성하고 그후 재-산화되어 항체 헤테로다이머를 형성하였다. 이 방법은 또한 항체 호모다이머의 제조를 위해 이용될 수 있다. Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 6444-6448 (1993)에 의해 설명된 "다이아바디"기술은, 이특이적 항체 단편의 제조를 위한 대안적인 메카니즘을 제공하였다. 단편은 너무 짧아서 동일한 사슬에서 두개의 영역사이에서 짝짓기를 허용할수 없는 링커에 의해 경쇄 가변 영역 (VL)에 연결된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함한다.

따라서, 하나의 단편의 VH 및 VL 영역은 또다른 단편의 상보성VL과 VH 영역과 짝지어야 하고, 그것에 의하여 두개의 항원-결합 부위를 형성한다. 단일-사슬 Fv (sFv) 다이머의 사용에 의한 이특이적 항체 단편을 만들기 위한 또다른 전략은 또한 보고되었다. Gruber et al., J ; Immunol., 152: 5368 (1994) 참조. 두개 이상의 원자가를 갖는 항체가 계획된다. 예를 들어, 삼특이적 항체가 제조될 수 있다. Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

접합체 및 중화제의 다른 변경

방법에 사용된 또는 여기서의 제조 문헌에 포함된 중화제는 세포독성 또는 치료제에 선택적으로 접합될 수 있다. 예는 화학치료제를 포함한다. 그러한 화학치료는 특정 암의 치료에 수립된 효능을 가질 수 있다.

칼리케아마이신, 메이탄신 (미국 특허 No. 5,208, 020), 트리쵸텐, 및 CC1065과 같은 중화제 및 하나 이상의 작은 분자 독소의 접합체는 또한 본원에서 계획된다. 일부 구체예에 따르면, 중화제는 하나 이상의 메이탄신 분자 (예를 들어 중화제 분자당 약 1 내지 약 10 메이탄신분자)에 접합된다. 메이탄신은 예를 들어, May-SH3로 환원될 수 있는 May-SS-Me으로 전환될 수 있고 변형된 중화제 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992) )와 반응하여 메이탄시노이드-중화제 접합체를 생성할 수 있다.

대안으로서는, 중화제는 하나 이상의 칼리케아마이신 분자에 접합된다. 항생물질의 칼리케아마이신 패밀리는 서브-피코몰라 농도에서 이중-가닥 DNA 브레이크를 제조할 수 있다. 칼리케아마이신의 구조적 유사체는 또한 공지되어 있다. (Hinman et al. Cancer Research 53 : 3336-3342 (1993) and Lode et al. Cancer Research 58: 2925-2928 (1998)).

사용될 수 있는 효소적으로 활성인 독소와 그것의 단편은 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성인 단편, 외독소 A 사슬 (Pseudomonas aeruginosa으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사신, 다이안틴 단백질, Phytolaca 아메리카나 단백질 (PAPI, PAPII, 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 저해제, 쿠신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함한다. 참조, 예를 들어, WO 93/21232.

본 발명은 더나아가 핵소체용해 활성을 갖는 화합물과 접합된 중화제를 계획한다 (예를 들어 리보뉴클레아제 또는 DNA 엔도뉴클레아제 이를테면 데옥시리보뉴클레아제 ; DNase). 다양한 방사능 동위원소는 방사능접합된 중화제의 제조에 이용가능하다. 예는 Y⁹⁰, At²¹¹, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², p³² 및 Lu의 방사능 동위원소를 포함한다. 중화제 및 세포독성제의 접합체는 다양한 2기능 단백질 커플링제 이를테면 N-숙시니미딜-3- (2-피리딜디티올) 프로피오네이트 (SPDP), 숙시니미딜-4- (N- 말레이미도메틸) 사이클로헥세인-1-카르복실레이트, 이미노티올레인 (IT), 이미도에스테르의 2기능 유도체(이를테면 디메틸 아디피미데이트 HCL), 활성인 에스테르 (이를테면 다이숙시니미딜 수버레이트), 아이드히드 (이를테면 글루타렐드히드), 비스 아지도 화합물 (이를테면 비스 (p-아지도벤조일) 헥세인디아민), 비스-디아조늄 유도체 (이를테면 비스-(프디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소사이네이트 (이를테면 톨리엔 2,6-디이소사이네이트), 및 비스-활성인 플루오린 화합물 (이를테면 1, 5-다이플루오로-2, 4-다이니트로벤젠)을 사용하여 만들어질 수 있다. 예를 들어, 리신 면역독소는 Vitetta et al. Science 238: 1098 (1987)에서 제조될 수 있다. 탄소-14-표지 1-아이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트라이아민펜타아세트산 (MX-DTPA)는 중화제에 대한 방사능뉴클레오티드의 접합을 위한 킬레이트제의 예이다. 참조, 예를 들어, W094/11026. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 촉진하는 "쪼갤 수 있는 링커" 가 될 수 있다. 예를 들어, 산-불안정 링커, 펩티다아제-민감성 링커, 디메틸 링커 또는 디술피드-함유 링커 (Chari et al. Cancer Research 52: 127-131 (1992) )가 사용될 수 있다. 대안으로서는, 중화제 및 세포독성제를 포함하는 융합 단백질은, 예를 들어 재조합 기술 또는 펩티드 합성에 의해 만들어질 수 있다.

일부 구체예에서, 중화제는 종양 미리표적화에 이용하기 위한 "수용체" 에 접합될 수 있고 (스트렙타비딘과 같음) 이때 중화제-수용체 접합체는 환자에게 투여되고, 이어서 청소제를 사용하여 순환으로부터 미결합 접합체를 제거하고 그후 세포독성제에 접합되는 "리간드" (예를 들어아비딘) 를 투여한다(예를 들어 방사능뉴클레오티드). 본 발명의 중화제는 또한 프로드러그 (예를 들어 펩티딜 화학치료제, 참조W081/01145)를 활성인 항-암 약물로 변환시키는 프로드러그-활성화 효소와 접합될 수 있다. 참조, 예를 들어, WO 88/07378 및 미국 특허 No. 4,975, 278.

그러한 접합체의 효소 성분은 그것의 보다 활성인, 세포독성 형태로 그것을 변환시키기 위한 방법으로 프로드러그에서 작용할 수 있는 어떠한 효소를 포함한다. 본 발명의 방법에서 유용한 효소는, 이것으로 제한되지는 않지만, 포스페이트-함유 프로드러그를 자유 약물로 변환하기 위해 유용한 알칼라인포스파타아제; 술페이트함유 프로드러그를 자유 약물로 변환하기 위해 유용한 아릴술파타아제; 비-독성 5-플루오로시토신을 항-암 약물로 전환하기에 유용한 시토신 디아미나아제, 5-플루오로우라실; 프로테아제, 이를테면 세라티아 프로테아제, 터몰리신, 섭틸리신, 펩티드-함유 프로드러그를 자유 약물로 변환하기 위해 유용한 카르복시펩티다아제 및 카텝신 (이를테면 카텝신 B 및 L) ; D-아미노산 치환기를 함유하는 프로드러그를 전환하기에 유용한 D-알라닐카르복시펩티다아제; 글리코실화 프로드러그를 자유 약물로 전환하기에 유용한 p-갈락토시다아제 및뉴라미니다아제와 같은 카르보히드레이트 분할 효소; (3-락탐으로 유도된 약물을 자유 약물로 전환하기에 유용한 (3-락타마아제 ; 및 페니실린 아미다아제, 이를테면 그들의 아민 질소에서 페녹시아세틸 또는 페닐아세틸 기로 유도된 약물을 각각 자유 약물로 변환하기 위해 유용한 페니실린 V 아미다아제 또는 페니실린 G 아미다아제를 포함한다. 대안으로서는, 또한 "항체효소s"으로서 당업계에 공지된 효소 활성을 갖는 항체는 본 발명의 프로드러그를 자유 활성인 약물로 전환하기 위해 사용될 수 있다 (참조, 예를 들어, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). 중화제-항체효소 접합체는 항체효소의 종양 세포 모집단으로의 송달을 위해 본원에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

효소는 위에서 논의된 헤테로2기능 가교결합 시약의 사용과 같은 업계에 잘 알려진 기술에 의해 공유결합으로 TFF3 중화제에 결합될 수 있다. 대안으로서는, 본 발명의 효소의 적어도 기능적으로 활성인 부분에 연결된 본 발명의 중화제의 적어도 항원 결합 영역을 포함하는 융합 단백질은 당업계에 잘 알려진 재조합 DNA 기술을 사용하여 구성될 수 있다[참조, 예를 들어, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984) ].

중화제의 다른 변경이 본원에서 계획된다. 예를 들어, 중화제는 다양한 비단백질 폴리머 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜, 폴리옥시알킬렌, 또는 폴리에틸렌 글리콜 및 폴리프로필렌 글리콜의 코폴리머에 연결될 수 있다. 본원에서 개시된 중화제는 또한 리포솜으로 조제될 수 있다. 중화제를 함유하는 리포솜은 Epstein et al., Proc. Mad. Acad Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 미국특허 No. 4,485, 045 및 4,544, 545; 및 W097/38731에서 기술된 바와 같이, 당업계에 공지된 방법에 의해 제조된다. 강화된 순환 시간을 갖는 리포솜이 미국 특허 No. 5,013, 556에서 개시된다.

특히 유용한 리포솜은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 PEG-유도된 포스파티딜에탄올아민 (PEG-PE)을 포함하는 지질 조성물과 함께 역상 증발 방법에 의해 발생될 수 있다. 리포솜은 한정된 기공 크기의 필터를 통해 압출되어 원하는 직경을 갖는 리포솜을 산출한다. 본 발명의 항체의 Fab' 단편은 디술피드 상호교환 반응을 통해 Martin et al., J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)에서 기술된 바와 같이 리포솜에 접합체에 접합될 수 있다. 화학치료제는 선택적으로 리포솜 내에 함유된다. See Gabizon, et al. J National Cancer Inst. 81 (19) 1484 (1989). 본원에서 개시된 단백질 또는 펩티드 중화제의 아미노산 서열 변경(들)은 계획된다. 예를 들어, 중화제의 결합 친화력 및/또는 다른 생물학적 성질을 개선하는 것이 바람직할 수 있다.

중화제의 아미노산 서열 변이체는 적절한 뉴클레오티드 변화를 중화제 핵산 안으로 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조된다. 그러한 변경은 제한없이, 중화제의 아미노산 서열 내의 잔기의로부터의 결손, 및/또는 안으로 삽입 및/또는 그것의 치환을 포함한다. 결손, 삽입, 및 치환의 어떠한 조합이 만들어져 형식적인 구성체에 도달하고, 다만 최종 구성체는 원하는 특징을 갖는다. 아미노산 변화는 또한 글리코실화 부위의 수 또는 위치를 변화시키는 것과 같은 중화제의 후-번역 공정을 변경할 수 있다.

돌연변이유발을 위한 위치인 중화제의 특정한 잔기 또는 영역의 동정에 유용한 방법은 Cunningham and Wells, Science, 244 : 1081-1085 (1989)에 의해 기술된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"이라 불린다. 여기서, 잔기 또는 표적 잔기의 기가 확인되고(예를 들어, arg, asp, his, lys, 및 glu와 같이 하전된 잔기) 중성 또는 음으로 하전된 아미노산 (가장 바람직하게는 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 치환되어 아미노산과 항원과의 상호작용에 영향을 준다. 치환에 대한 기능적 민감성을 증명하는 그러한 아미노산 위치는 그후 더욱 또는 다른 변이체를, 치환의 부위에 또는 그곳을 위해 도입함으로써 한정된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입하기 위한 부위가 미리결정되지만, 돌연변이 그 자체로의 성질이 미리결정될 필요는 없다. 예를 들어, 주어진 부위에서 돌연변이의 수행을 결정하기 위해, 알라 스캐닝 또는 무작위 돌연변이유발을 표적 코돈 또는 영역에서 수행하고 발현된 중화제 변이체를 원하는 활성에 대해서 스크리닝한다.

아미노산 서열 삽입은 단일 또는 다중 아미노산 잔기의 서열내 삽입은 물론이고, 100이상의 잔기를 함유하는, 하나의 잔기에서 폴리펩티드까지 길이 범위에 이르는 아미노-및/또는 카르복실-종말 융합을 포함한다. 종말 삽입의 예는 N-종말 메티오닐 잔기를 갖는 중화제 또는 세포독성 폴리펩티드에 융합된 중화제를 포함한다. 중화제 분자의 다른 삽입 변이체는 효소의 중화제의 N-또는 C-종말 또는 중화제의 혈청 반감기를 증가시키는 폴리펩티드로의 융합을 포함한다.

변이체의 또다른 타입은 아미노산 치환 변이체이다. 이들 변이체는 다른 잔기에 의해 치환된 중화제 분자에서 적어도 하나의 아미노산 잔기를 가진다. 항체 중화제의 치환적 돌연변이유발을 위한 가장 큰 관심의 부위는 고변이 영역을 포함하지만, FR 변경이 또한 계획된다.

중화제의 생물학적 성질에서 실질적인 변경은 (i) 치환의 영역에서 폴리펩티드 백본의 구조 예를 들어, 시트 또는 나선형 입체형태으로서, (ii) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성, 또는 (iii) 측쇄의 벌크를 유지하는데에 대한 그들의 효과가 상당히 다른 치환을 선택함으로써 달성된다. 자연적으로 발생하는 잔기는 통상적인 측쇄 성질에 기반한 그룹으로 나뉘어 진다:

소수성: 노르류신, met, ala, val, leu, ile;

중성 친수성: cys, ser, thr; acidic: asp, glu ;

염기성: asn, gln, his, lys, arg ;

사슬 배향에 영향을 주는 잔기: gly, pro; 및

방향족: trp, tyr, phe.

비-보존 치환은 이들 부류의 하나의 멤버를 또다른 부류로 바꿀 것이다. 보존 치환은 동일한 부류 내에서 아미노산의 교환을 수반한다.

중화제의 적당한 입체형태을 유지하는데 수반되지 않는 어떠한 시스테인 잔기는 또한 일반적으로 세린으로 치환되어, 분자의 산화 안정성을 개선하고 이상 가교-결합을 방지할 수 있다. 반대로, 시스테인 결합 (들)은 중화제에 첨가되어 그것의 안정성 (특히 이때 중화제는 Fv 단편과 같은 항체 단편이다)을 향상할 수 있다.

일부 구체예에서, 치환적 변이체의 타입은 모 항체의 하나 이상의 고변이 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다. 일반적으로, 더 나아간 발전을 위해 선택된 결과의 변이체 (들)은 그들이 발생되는 모 항체에 비해 개선된 생물학적 성질을 가질 것이다. 그러한 치환적 변이체를 발생시키기 위한 편리한 방법은 파지표시를 사용하여 친화력 성숙이다. 간략하게는, 몇가지 고변이 영역 부위 (예를 들어, 6-7 부위)가 돌연변이되어 각각의 부위에서 모든 가능한 아미노 치환을 발생시킨다. 그렇게 발생된 항체 변이체는 각각의 입자 내에서 포장된 M13의 유전자 III 생성물로의 융합으로서 실모양 파지입자로부터 1가 형태로 표시된다. 파지-표시된 변이체는 그후 본원에서 개시된 바와 같이 그들의 생물학적 활성 (예를 들어 결합 친화력)에 대해 스크리닝된다. 변경을 위한 후보 고변이 영역 부위를 확인하기 위해, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발은 항원 결합에 상당히 기여하는 고변이 영역 잔기를 확인하기 위해 수행될 수 있다. 대안으로서는, 또는 게다가, 항체와 항원 사이의 접촉 점을 확인하기 위해 항원-항체 착체의 결정 구조를 분석하는 것이 유리할 수 있다. 그러한 접촉 잔기 및 이웃 잔기는 본원에서 상술된 기술에 따라 치환에 대한 후보이다. 일단 그러한 변이체가 발생되면, 변이체의 패널은 본원에서 기술된 바와 같이 스크리닝을 당하고 하나 이상의 관련 분석법에서 뛰어난 성질을 갖는 항체가 더욱 개발을 위해 선택될 수 있다.

본원에서 기술된 중화제의 아미노산 변이체의 또다른 타입은 중화제의 본래의 글리코실화 패턴을 바꾼다. "변경"이란 중화제에서 발견된 하나 이상의 카르보히드레이트 부분을 지우고, 및/또는 중화제에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위를 첨가하는 것을 의미한다.

폴리펩티드의 글리코실화는 전형적으로 N-연결 또는 0-연결 중의 하나이다. N-연결은 아스파라긴 잔기의 측쇄에 대한 카르보히드레이트 부분의 부착을 말한다. 트라이펩티드 서열 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌은(X은 프롤린을 제외하고 어떠한 아미노산), 카르보히드레이트부분의 아스파라긴 측쇄에 대한 효소 부착을 위한 인식 서열이다. 따라서, 폴리펩티드에서 이들 트라이펩티드 서열 중 하나의 존재는 잠재적인 글리코실화 부위이다. 0-연결 글리코실화는 5-히드록시프롤린 또는 5-히드록실리신이 또한 사용될 수 있지만, 당 N-아세일갈락토스아민, 갈락토스, 또는 크실로스 중의 하나의 히드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 대한 부착을 말한다. 글리코실화 부위의 중화제로의 추가는 그것이 하나 이상의 상기 트라이펩티드 서열 (N-연결 글리코실화 부위를 위한)을 함유하도록 아미노산 서열을 바꿈으로써 수행된다. 변경은 또한 본래의 중화제의 서열(0-연결 글리코실화 부위에 대한)에 대한 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 추가, 또는 치환에 의해, 만들어질 수 있다.

중화제의 핵산 분자 인코딩 아미노산 서열 변이체는 당업계에서 공지된 다양한 방법에 의해 제조된다. 이들 방법은 이것으로 제한되지는 않지만, 천연 공급원으로부터의 분리(자연적으로 발생하는 아미노산 서열 변이체의 경우) 또는 올리고뉴클레오티드-매개된 (또는 지시된 부위) 돌연변이유발에 의한 제조, PCR 돌연변이유발, 및 중화제의 더일찍 제조된 변이체 또는 비-변이체 버전의 카세트 돌연변이유발을 포함한다.

일부 구체예에서, 효과기 기능에 대해 예를 들어 중화제의 항원-의존성 세포-매개된 세포독성 (ADCC) 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 강화하기 위해, 본 발명의 중화제를 변경하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 항체 중화제의 Fc 영역에서 하나 이상의 아미노산 치환을 도입함으로써 달성될 수 있다. 대안으로서는, 또는 추가적으로, 시스테인 잔기(들)은 Fc 영역에 도입될 수 있고, 그로인해 이 영역에서 사슬간 디술피드 결합 형성을 허용한다. 그렇게 발생된 호모다이머 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 죽임 및 항체-의존성 세포 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다. 참조 Caron et al., J. Exp Med. 176: 1191-1195 (1992) 및 Shopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992). 강화된 항-종양 활성을 갖는 호모다이머 항체는 또한 Wolff et al. Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)에서 기술된 바와 같이 헤테로2작용 교차-링커를 사용하여 제조될 수 있다. 대안으로서는, 이중 Fc 영역을 갖는 항체는 엔지니어링될 수 있고 그로인해 강화된 보체 용해와 ADCC 능력을 가질 수 있다. 참조 Stevenson et al. 항-암 약물 설계 3: 219-230 (1989).

중화제의 혈청 반감기를 증가시키기 위해, 구제 수용체 결합 에피토프가 예를 들어, 미국 특허 5,739, 277에서 기술된 바와 같이 중화제 (특히 항체 단편) 안으로 혼입될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "구제 수용체 결합 에피토프"는 IgG 분자의 생체내에서 혈청 반감기를 증가시키는 원인인 IgG 분자의 Fc 영역의 에피토프를 말한다 (예를 들어, IgGl, IgG2, IgG3, 또는 IgG4).

본 발명은 또한 바람직한 치료 또는 진단 성질을 갖는 항-TFF3 항체를 확인하기 위한 스크린을 제공한다. 스크린은 종양 세포의 증식 및/또는 부착, ADCC 또는 CDC 활성, 항-세포고사 분석법에 영향을 주는 항-TFF3 항체를 확인하는 분석법, 세포 주기 체크포인트 분석법, 및 트랜스제닉 비-사람 동물, 예를 들어, 마우스 및 다른 설치류에서 생체내에서 분석법을 포함한다. 또한 본 발명은 위에서 기술한 바와 같은 단백질의 원하는 부분에 결합하고, 원하는 성질, 예를 들어, 블록 칼슘 결합, 블록 다이머 형성, 블록 가닥 형성을 갖고 및/또는 TFF3 영역 정렬과 대립하는항체를 확인하기 위한 스크린을 계획한다. 그러한 항체는 TFF3 단백질 또는 그것의 단편에 대해 제공된 항체의 모집단에 대해 확인될 수 있다.

다른 형태의 중화제

중화제는 또한 프로드러그의 형태가 될 수 있다. 용어 "프로드러그"는 내인 효소 또는 다른 화학 및/또는 상태의 작용에 의해 바디 또는 그것의 세포 내에 활성 형태 (즉, 약물)로 전환되는 비활성 형태로 제조되는 치료제를 말한다. 특히, 핵산-함유 중화제의 프로드러그 버전(안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, 및 RNAi 분자, 등과 같은)은 WO 93/24510에서 또는 WO 94/26764 및 미국특허 No. 5,770, 713에서 개시된 방법에 따라 SATE [ (S-아세틸-2- 티오에틸) 포스페이트] 유도체로서 제조될 수 있다.

중화제는 또한 약학적으로 허용가능한 염의 형태가 될 수 있다. 용어 "약학적으로 허용가능한 염"은 본발명의 화합물의 생리적으로 약학적으로 허용가능한 염: 즉, 거기에 원치않는 독소 효과를 부여하지 않는 모 화합물의 원하는 생물학적 활성을 보유하는 염을 말한다. 핵산-함유 중화제 (예를 들어, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 리보자임, RNAi 분자, 등)에 대해서, 약학적으로 허용가능한 염의 일부 예는 이것으로 제한되지는 않지만, (a) 나트륨, 칼륨, 암모늄, 마그네슘, 칼슘과 같은 양이온, 스퍼민 및 스퍼미딘과 같은 폴리아민, 등으로 형성된 염; (b) 무기 산, 예를 들어 염산, 브롬화수소산, 황산, 인산, 질산 등으로 형성된 산 부가 염; (c) 유기 산으로 형성된 염 이를테면, 예를 들어, 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 글루콘산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 벤조산, 탄산, 팔미트산, 알긴산, 폴리글루탐산, 나프탈렌술폰산, 메테인술폰산, p-톨루엔술폰산, 나프탈렌디술폰산, 폴리갈락투론산, 등; 및 (d) 염소, 브롬, 및 요오드와 같은 원소 음이온으로부터 형성된 염을 포함한다.

폴리뉴클레오티드 구성체

항체와 같은 폴리뉴클레오티드 분자 인코딩 TFF3, TFF3 단편, 또는 TFF3 중화제는 DNA 또는 RNA 구성체와 같은 폴리뉴클레오티드 구성체 안으로 삽입될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드 분자는 예를 들어, 발현 구성체에서 사용되어 숙주 세포에서 전부 또는 일부의 단백질, 변이체, 융합 단백질, 또는 단일-사슬 항체 를 발현한다. 발현 구성체는 선택된 숙주 세포에서 기능적인 촉진자를 포함한다. 당업자는 적절한 촉진자를 큰 수의 당업계에 공지되고 사용된 세포 타입-특이적 촉진자로부터 쉽게 선택할 수 있다. 발현 구성체는 또한 숙주 세포에서 기능적인 전사 종결부위를 함유할 수 있다. 발현 구성체는 전부 또는 일부의 원하는 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 포함한다. 폴리뉴클레오티드 단편은 촉진자로부터 하류에 위치한다. 폴리뉴클레오티드 단편의 전사는 촉진자에서 개시된다. 발현 구성체는 선형 또는 원형이 될 수 있고 바람직하다면, 자율 복제를 위한 서열을 함유할 수 있다.

숙주 세포

발현 구성체 인코딩 TFF3 또는 TFF3 중화제는 숙주 세포 안으로 도입될 수 있다. 발현 구성체를 포함하는 숙주 세포는 어떠한 적절한 원핵 또는 진핵 세포가 될 수 있다. 박테리아에서 발현 시스템은 Chang et al., Nature 275: 615 (1978); Goeddel et al., Nature 281: 544 (1979); Goeddel et al., Nucleic Acids Res. 8: 4057 (1980); EP 36,776 ; U. S. 4,551, 433; deBoer et al., Proc. Natl. Acad Sci. USA 80 : 21-25 (1983) ; 및 Siebenlist et al., Cell 20 : 269 (1980)에서 기술된 것들을 포함한다.

효모에서 발현 시스템은 Hinnnen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 1929 (1978); Ito et al., J Bacteriol 153 : 163 (1983); Kurtz et al., Mol. Cell. Biol. 6: 142 (1986) ; Kunze et al., JBasic Microbiol. 25: 141 (1985) ; Gleeson et al., J : Gen. Microbiol. 132: 3459 (1986), Roggenkamp et al., Mol. Gen. Genet. 202: 302 (1986) ) ; Das et al., J Bacteriol. 158: 1165 (1984); De Louvencourt et al., J Bacteriol. 154: 737 (1983), Van den Berg et al., Bio/Technology 8: 135 (1990); Kunze et al. , J. Basic Microbiol. 25: 141 (1985); Cregg et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3376 (1985); U. S. 4,837, 148; U. S. 4,929, 555; Beach and Nurse, Nature 300: 706 (1981); Davidow et al., Curr. Genet. 10: 380 (1985) ; Gaillardin et al., Curr. Genet. 10: 49 (1985); Ballance et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 112: 284-289 (1983); Tilburn et al., Gene 26: 205-22 (1983) ; Yelton et al., Proc. Natl. Acad, Sci. USA 81: 1470-1474 (1984); Kelly and Hynes, EMBO J. 4: 475479 (1985); EP 244,234 ; 및 WO 91/00357에서 기술된 것들을 포함한다.

곤충에서 이종유래 유전자의 발현은 U. S. 4,745, 051; Friesen et al. (1986) "바쿨로바이러스 유전자 발현의 조절" : THE 분자 BIOLOGY OF 바쿨로바이러스ES (W. Doerfler, ed. ) ; EP 127,839 ; EP 155,476 ; Vlak et al., J. Gen. Virol. 69: 765-776 (1988); Miller et al., Ann. Rev. Microbiol. 42: 177 (1988); Carbonell et al., 유전자 73: 409 (1988); Maeda et al., Nature 315: 592-594 (1985); Lebacq-Verheyden et al., Mol. Cell Biol. 8: 3129 (1988); Smith et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 8404 (1985); Miyajima et al., Gene 58: 273 (1987); 및 Martin et al., DNA 7: 99 (1988)에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다.

수많은 바쿨로바이러스 균주 및 변이체 및 숙주로부터 대응하는 증식허용 곤충 숙주 세포는 Luckow et al., Biol기술 (1988) 6: 47-55, Miller et al., GENETIC ENGINEERING (Setlow, J. K. et al. eds. ), Vol. 8, pp. 277-279 (Plenum Publishing, 1986) ; 및 Maeda et al., Nature, 315: 592-594 (1985)에서 기술된다.

포유동물 발현은 Dijkema et al., EMBO J : 4: 761 (1985); Gormanetal., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6777 (1982b) ; Boshart et al., 세포 41: 521 (1985) ; 및 U. S 4,399, 216에서 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 포유동물 발현의 다른 특징들은 Ham 및 Wallace, Meth Enz. 58: 44 (1979); Bannes 및 Sato, Anal. Biochem. 102: 255 (1980); U. S. 4,767, 704; U. S. 4,657, 866 ; U. S. 4,927, 762; U. S. 4,560, 655; WO 90/103430, WO 87/00195, 및 U. S. RE 30,985에서 기술된 바와 같이 촉진될 수 있다.

발현 구성체는 당업계에 공지된 어떠한 기술을 사용하여 숙주 세포 안으로 도입되었다. 이들 기술은 트랜스페린-폴리양이온-매개된 DNA 이동, 벌거벗은 또는 캡슐화 핵산으로 트랜스펙션, 리포솜-매개된 세포 융합, DNA-코팅된 라텍스 비드의 세포내 교통, 프로토플라스트 융합, 바이러스 감염, 전기천공법, "유전자 총, " 및 칼슘 포스페이트-매개된 트랜스펙션을 포함한다.

제약 제제

본 발명에 따르는 TFF3 중화제의 치료 조제물은 원하는 정도의 순도를 갖는 중화제를 냉동건조 제제 또는 수용액의 형태로, 선택적인 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정제와 혼합함으로써 저장을 위해 제조될 수 있다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정제는 채택된 용량 및 농도에서 받는이에게 독성이고, 포스페이트, 시트레이트, 및 다른 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제 ; 보존제 (이를테면 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄, 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤 이를테면 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀 ; 3-펜타놀; 및 m-크레졸); 낮은 분자량(약 10 잔기 미만) 폴리펩티드; 단백질, 이를테면 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 폴리머 이를테면 폴리비닐피롤리돈; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌, 또는 리신과 같은 아미노산; 모노사카리드, 디사카리드, 및 글루코스, 만노스, 또는 덱스트린을 포함하는 다른 카르보히드레이트 ; EDTA과 같은 킬레이트제; 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염 형성 반대이온 ; 금속 착체 (예를 들어 Zn-단백질 착체); 및/또는 TWEEN^TM, PLURONICS^TM 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다. 허용가능한 담체, 부형제, 또는 안정제는 더나아가 중화제의 활성을 방해하지 않는다.

제제는 또한 하나 이상의 활성인 화합물을 함유할 수 있다. 일부 구체예에서, 활성인 화합물은 서로 부정적인 영향을 주지 않는 상보성활성을 가진다. 예를 들어, 세포독성제, 화학치료제 또는 사이토킨을 더욱 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 효과적인 양의 그러한 다른 약제는 제제에 존재하는 중화제의 양, 암 치료의 타입, 및 위에서 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로 이전에 본원에서 사용된 투여 경로로 동일한 용량으로 또는 지금까지 채택된 용량의 약 1 내지 99% 사용된다.

활성인 성분은 또한 예를 들어, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합에 의해, 예를 들어, 각각 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리 (메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐, 콜로이달 약물 송달 시스템 (예를 들어, 리포솜, 알부민 미세구, 마이크로에멀젼, 나노-입자 및 나노캡슐) 또는 매크로에멀젼으로 제조된 마이크로캡슐에 트랩될 수 있다. 그러한 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.

지속 방출 조제품이 또한 제조될 수 있다. 지속 방출 조제품의 적절한 예는 중화제를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반투성 매트릭스를 포함하고, 이것은 매트릭스가 형상 물품, 예를 들어 막, 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 지속 방출 매트릭스의 예는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리 (2-히드록시에틸-메타크릴레이트), 또는 폴리 (비닐알코올)), 폴리락티드 (미국특허 No. 3,773, 919), L-글루탐산 및 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머 이를테면 LUPRON DEPOT^TM (락트산 글리콜산 코폴리머 및 류프롤리드 아세테이트), 및 폴리-D- (-)-3-히드록시부티르산으로 구성되는 주입가능 미세구를 포함한다.

일부 구체예에서, 투여는 무균 주입가능 제약 조성물의 사용을 통해 될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "주입가능 제약 조성물", 또는 그것의 변이체는, "주입가능체" 즉, 무균, 발열원-및 무-미립자를 위한 USP 요구조건을 만족시키는, 제약 조성물을 말하고, 특이적 pH 및 등장성 값을 갖는다. 무균 용약 제제는 무균 여과 막을 통해 여과에 의해 수행될 수 있다.

중화제로의 처리

암의 치료 또는 예방은 치료에 효과적인 양의 TFF3 중화제를 암으로 고통받거나 걸리기 쉬운 포유동물 (예를 들어, 사람)에게 투여함으로써 실행될 수 있다. 마찬가지로, 종양 부피을 줄이고, 종양 성장을 늦추고, 및/또는 종양 성장을 예방하기 위한 방법이 유사한 수단에 의해 달성될 수 있다.

용어 "치료", "치료하는","치료하다"등은 본원에서 일반적으로 원하는 약리 및/또는 생리적 효과를 얻는 것을 말한다. 효과는 완전히 또는 부분적으로 질환 또는 그것의 증상을 방지하는 관점에서 예방이 될 수 있고 및/또는 질환 및/또는 질환에 기여가능한 부정적인 효과에 대한 부분적인 또는 완전한 안정화 또는 치료의 관점에서 치료가 될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 "치료"는 포유동물, 특히 사람에서, 질환의 어떠한 치료를 커버하고 포함한다: (a) 질환 또는 증상이 질환 또는 증상에 걸리기 쉬울 수는 있지만 아직 질환을 가진 것으로 진단되지 않은 대상에서 일어나지 못하게 막는것; (b) 질환 증상을 억제하는 것, 즉 , 그것의 발전을 저지하는 것; 또는 질환 증상을 완화하는 것, 즉, 결장 또는 또다른 소화 암, 예를 들어, 위장 또는 간, 또는 유방, 난소, 또는 전립샘암과 같은 질환 또는 증상의 퇴행을 초래하는 것.

상호교환하여 사용된 용어 "개별적인," "대상," "숙주," 및 "환자,"는 어떠한 포유동물 대상, 진단, 치료, 또는 치료법이 바람직한, 특히 사람을 말한다. 다른 대상은 소, 개, 고양이, 기니피그, 토끼, 래트, 마우스, 말, 등을 포함할 수 있다.

TFF3 중화제, 예를 들어 항체, 펩티드, 안티센스 분자, RNAi 분자, 리보자임, 또는 작은 분자를 포함하는 조성물은 양호한 의학 진료와 일치하는 형태로 조제되고, 복용되고, 투여될 수 있다. 예를 들어, TFF3 중화제는 사람, 키메라 또는 사람화 항-TFF3 항체 scFv, 항체 단편, 펩티드, 또는 TFF3의 활성을 억제하는 작은 분자 ; 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi 분자, 또는 TFF3 발현을 억제하는 리보자임이다. 본 문맥에서 고려 인자는 치료되는 특정 암, 치료되는 특정 포유동물, 개별적인 환자의 임상적인 상태, 질환 또는 장애의 원인, 역제의 송달 부위, 투여의 방법, 투여의 스케줄링, 및 의학 개업의에게 알려진 다른 인자를 포함한다. 투여될 치료에 효과적인 양의 중화제는 그러한 고려에 의해 좌우될 수 있다.

치료에 효과적인 양의 중화제는 중화제로 치료된 환자에서 질환 또는 장애와 연합된 증상을 개선하거나 줄이기에 충분한 양이다. 일부 구체예에서, 치료에 효과적인 양은 종양 성장을 예방하고, 종양 성장을 늦추고, 종양 부피를 줄이고, 암 세포의 침입성을 줄이고, 암 세포의 이동, 부착, 및/또는 증식 등을 억제함으로써와 같이, 암의 증상을 줄일 수 있는 중화제의 양이다. 치료에 효과적인 양을 결정하고 중화제의 치료 효과를 평가하는 방법은 당업계에 잘 알려져있고 본원에서 더욱 기술된다.

한번 복용할때 비경구로 투여되는 치료에 효과적인 양은 예를 들어, 하루에 환자 체중의 약 0.1 내지 30 mg/kg 의 범위가 될 수 있고, 사용된 중화제의 전형적인 초기 범위는 약 2 내지 10 mg/kg의 범위이다. 위에서 명시한 바와 같이, 그러나, 이들 제안된 양의 중화제는 다량의 치료 결정권에 놓일 수 있다. 적절한 복용량 및 스케줄링의 선택에서의 요인은 위에서 지시된 바와 같이 얻어진 결과이다. 예를 들어, 비교적 더 높은 복용량은 초기에 진행중 및 급성 질환의 치료를 위해 필요할 수 있다. 가장 효능있는 결과를 얻기 위해, 질환 또는 장애에 따라, 중화제는 질환 또는 장애의 첫번째 신호, 진단, 모양, 또는 발생에 가능한 가깝게 또는 질환 또는 장애의 완화 동안에 투여된다 .

중화제는 비경구, 피하, 복막내, 폐안, 및 코안, 및 , 만일 바람직하다면 국소 면역억제 치료를 위해, 환부내 투여를 포함하는, 어떠한 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다.

게다가, 중화제는 펄스 주입에 의해 예를 들어, 중화제의 감소하는 복용량으로 적절하게 투여될 수 있다. 바람직하게는 투여는 부분적으로 투여가 간단한지 또는 만성인지 여부에 따라, 주사, 가장 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해 주어진다.

본원의 중화제와 함께 세포독성제, 화학치료제, 면역억제 제 및/또는 사이토킨과 같은 다른 화합물을 투여할 수 있다. 조합된 투여는 개별적인 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 공동투여, 및 어느 한 순서로 연속 투여를 포함하고, 이때 바람직하게는 두 (또는 모든) 활성제 모두 동시에 그들의 생물학적 활성을 발휘하는 동안의 기간이 존재한다.

안티센스 분자, RNAi 분자, 또는 리보자임 (선택적으로 벡터에 함유됨)와 같은 핵산을 생체내에서 및 생체외에서 환자의 세포안으로, 삽입하기 위하 당업계에 수많은 접근법이 존재한다. 생체내에서 송달을 위해 핵산은 보통 중화제가 요구되는 부위에서 직접 환자에게 투여될 수 있다. 생체외에서 치료를 위해, 환자의 세포 가 제거되고, 핵산은 이들 분리된 세포 안으로 도입되고 변형된 세포가 환자에게 직접 또는, 예를 들어, 환자에게 이식되는 다공질 막 내의 캡슐화(참조, 예를 들어미국 특허 No. 4,892, 538 and 5,283, 187)로 투여된다. 핵산을 생육가능 세포 안으로 도입하기 위해 이용가능한 다양한 기술이 존재한다. 기술은 핵산이 시험관내, 또는 생체내에서 의도된 숙주의 세포에서 배양된 세포 안으로 이동되는지 여부에 따라 변한다. 시험관내에서 핵산의 포유동물 세포 안으로의 이동을 위한 적절한 기술은 리포솜의 사용, 전기천공법, 마이크로주사, 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전 방법, 등을 포함한다. 유전자의 생체외에서 송달을 위해 주로 사용된 벡터는 레트로바이러스이다. 핵산은 또한 유체역학 송달 (증가된 압력 혈관내 주사)에 의해 투여될 수 있다.

생체내에서 핵산 이동 기술의 예는 바이러스 벡터 (아데노바이러스, Herpes simplex I 바이러스, 또는 아데노-연합된 바이러스와 같음)와의 트랜스펙션 및 지질-기반 시스템 (유전자의 지질 매개된 이동을 위해 유용한 지질은 DOTMA, DOPE 및 DC-Chol이다, 예를 들어)을 포함한다. 일부 상황에서 핵산 공급원에 세포 표면 막 단백질 또는 표적 세포에 대해 특이적인 항체, 표적 세포에서 수용체에 대한 리간드, 등과 같이, 표적 세포를 표적으로 하는 약제를 공급하는 것이 바람직하다. 리포솜이 채택되는 곳에서, 세포내이입과 관련된 세포 표면 막 단백질에 결합하는 단백질은 표적화를 위해 및/또는 예를 들어 특정 세포 타입에 친화성인 캡시드 단백질 또는 그것의 단편, 주기에서 내재화를 겪는 단백질을 위한 항체, 및 표적 세포내 국소화를 표적으로 하고 세포내 반감기를 개선하는 단백질 섭취를 촉진하기 위해, 사용될 수 있다. 수용체-매개된 세포내이입의 기술은 예를 들어, Wu et al., J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3410-3414 (1990)에 의해 기술된다.

본 발명에 따르면, 치료는 또한 조합 치료법을 포함할 수 있다. 본원에서 사용된 "조합 치료법"은 약물을 필요로하는 환자가 중화제와 함께 질환을 위한 또다른 약물로 치료되거나 주어지는 것을 의미한다. 이러한 조합 치료법은 순차적 치료법이 될 수 있는데 이때 환자는 하나 이상의 약물로 먼저 치료되고 그후 나머지로 치료되거나, 또는 두개 이상의 약물이 동시에 주어진다. 조합 치료법에 사용될 수 있는 일부 약물의 예는 화학치료제 (시스플라틴, 독시루비신, 다누루비신, 타목시펜, 탁솔, 메토트렉세이트, 등), 아로마타제 저해제, 혈관형성 저해제의 투여, 특이적 및 비특이적 면역조절제, 생물학적 반응 조절제 (BRMs), 결장-자극 인자 (CSFs), 인터페론, 인터류킨, 자가 종양 세포 백신, 호르몬, 등을 포함한다. 바람직하게는, 조합하여 투여되는 약물 또는 다른 약제는 중화제의 치료 활성을 방해하지 않는다.

일부 구체예에서, 중화제의 투여는 종래의 암 치료와 조합될 수 있다. 바람직하게는, 전통적인 암 치료 용량은 중화제의 효과를 방해하거나 줄이지 않는다. 종래의 암 치료의 일부 예는 수술 (예를 들어, 냉동수술, 단편적 절제 수술, 근치 전립샘절제술, 덩어리절제술, 유방절제술, 등을 포함하여), 화학요법, 방사선 치료법 (예를 들어, 내부 방사선 치료법, 바깥 빔 방사선 치료법), 근접치료법 (예를 들어, 방사선을 본래의 종양 부위에 직접 송달 및 유방암 치료법을 수행하기 위해 단일 카테터를 사용하여 방사선 시간 감소), 호르몬 절제 치료법 (호르몬 수준의 감소), 등을 포함한다.

본 발명은 더 나아가 종양을 TFF3 중화제와 접촉시킴으로써 종양 부피를 줄이고, 종양 성장을 늦추고, 및/또는 종양 성장을 예방하는 방법을 제공한다. 접촉을 수행할 수 있고, 예를 들어, 생체내에서 종양은 어떠한 적절한 수단에 의해 TFF3 중화제에 노출된다. 예를 들어, 종양은 TFF3 중화제를 함유하는 조성물로 직접 주사하거나 또는 코팅되거나, 또는 종양을 갖는 대상 또는 환자는 TFF3 중화제가 투여될 수 있다. 종양 부피 및 성장속도는 당업계에 공지된 방법에 의해 쉽게 측정될 수 있다.

추가적으로, 조직 또는 세포에서 TFF3 의 생리적 효과는 (과발현된 TFF3와 같이) TFF3 중화제의 환자에 투여 또는 세포를 TFF3 중화제와 접촉시킴으로써 조절될 수 있다. TFF3의 발현으로 인해 몇가지 생리적 효과는 위에서 논의되고, 예를 들어, 증가된 세포 운동성 (예를 들어, 이동 능력) 및 세포자멸사에 대한 저항성을 포함한다.

세포 운동성, 이동, 및 잠재적 침입성은 세포의 융합 플레이트를 상처 및 상처 안으로 세포의 이동을 수반하는 (예를 들어, 시간-경과 비디오 마이크로스코피에 의해 또는 상처에서 채워질 시간에 의해) 분석법에 의해 평가될 수 있다. 두개의 다른 분석법은 트랜스웰 필터를 사용하며, 이때 세포는 다공성 트랜스웰 삽입부의 상단에 플레이팅되고 바닥 웰로 또는 피브로넥션 코팅 필터의 아래쪽 위에 이동하는 세포의 수를 센다. 이들 후자의 두개의 분석법은 "보이덴-챔버"분석법의 변경이다. 트랜스웰 분석법은 화학주성 (화학유인물질을 바닥 웰에 놓음으로써), 화학역동현상 (꼭대기 및 바닥 웰 모두에 운동성 유발 화학물질을 놓음으로써) 및 침범 (재구성된 세포외 기질, 이를테면 매트리겔로 웰을 코팅함으로써)을 측정하도록 더욱 변경된다.

세포자멸사 또는 거기에 저항성은 어떠한 일반적인 세포독성 분석법에 의해 측정될 수 있다. 세포 형태학, 아가로스 겔에서 특징 180bp DNA 래더 밴딩 패턴의 모양 , TUNEL (TdT-매개 dUTP Nick-말단 표지화) 분석법, 흐름세포측정, DNA 단편 ELISA, 및 세포 막의 생물리적인 성질의 변화와 같은 많은 방법이 당업계에 공지된다. 시스테인 프로테아제의 카스파스 패밀리는 또한 세포 자살 경로의 통상적인 매개체로서 확인되었고 카스파스 활성을 위한 분석법은 세포자멸사를 검출하기 위해 사용된 방법의 축적에 추가되었다. 락테이트 데히드로게나아제 (LDH) 누출 분석법은, 또한 세포자멸사를 검출하거나 측정하기 위해 사용될 수 있다. 많은 이들 방법을 수행하기 위한 키트는 상업적으로 이용가능하다.

TFF3를 분화하여 발현하는 것들과 같은 세포는, 시험관내, 생체내에서, 또는 생체외에서 TFF3 중화제와 접촉할 수 있다. 접촉은 어떠한 본원에서 기술된 제제/투여 방법에 의해 또는, 예를 들어, 세포를 TFF3 중화제를 함유하는 배지에 노출시킴으로써 달성될 수 있다. 예를 들어, TFF3 중화제가 적어도 부분적으로 세포 막을 침투하고 및/또는 세포에서 TFF3 폴리펩티드 또는 TFF3 폴리뉴클레오티드와 접촉하기에 충분한 시간동안 세포를 세척하고, 배양하고, 또는 용액 또는 한천 배지에 현탁시킬 수 있다.

제제, 용량, 제약 조성물

본 발명의 제약 조성물은 국소 또는 전신 치료가 요구되는지 여부와 치료되는 부위에 따라 많은 방법으로 투여될 수 있다. 투여는 국소 (질 및 직장 송달을 포함하여 눈 및 점액막으로), 폐, 예를 들어, 분말 또는 에어로졸의 흡입 또는 흡입법에 의해, 분무기; 기관내, 코안, 표피 및 경피에 의한 것을 포함), 경구 또는 비경구가 될 수 있다. 비경구 투여는 정맥내, 동맥내, 피하, 복막내 또는 근육내 주사 또는 주입; 또는 두개내, 예를 들어, 경막내 또는 뇌실내, 투여를 포함한다.

국소 투여를 위한 제약 조성물 및 제제는 경피 패치, 연고, 로션, 크림, 겔, 드롭, 좌약, 스프레이, 액체 및 분말을 포함할 수 있다. 종래의 제약 담체, 수성, 분말 또는 오일 베이스, 농후제 등 필요하거나 또는 바람직할 수 있다. 코팅된 콘돔, 글러브 등은 또한 유용할 수 있다.

경구 투여를 위한 조성물 및 제제는 분말 또는 과립, 물 또는 비-수성 매질 중의 현탁액 또는 용액, 캡슐, 향낭 또는 정제를 포함한다. 농후제, 향료제, 희석제, 유화제, 분산보조제 또는 결합제가 바람직할 수 있다.

비경구, 경막내 또는 뇌실내 투여를 위한 조성물 및 제제는 또한 완충액, 희석제 및 이것으로 제한되지는 않지만, 관통 인핸서, 담체 화합물 및 다른 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 같은 다른 적절한 첨가제를 함유할 수 있는, 무균 수용액을 포함할 수 있다.

본 발명의 제약 조성물은 이것으로 제한되지는 않지만, 용액, 에멀젼, 및 리포솜-함유 제제를 포함한다. 이들 조성물은 이것으로 제한되지는 않지만, 미리형성된 액체, 자가-유화고체 및 자가-유화반고체를 포함하는 다양한 성분으로부터 발생될 수 있다.

편리하게 유닛 용량 형태로 제시될 수 있는 본 발명의 제약 제제는, 제약 산업에서 잘 아려진 종래의 기술에 따라 제조될 수 있다. 그러한 기술은 활성인 성분을 제약 담체 (들) 또는 부형제 (들)과 연합으로 가져가는 단계를 포함한다. 일반적으로 제제는 균일하고 친밀하게 활성인 성분의 액체 담체 또는 미세하게 나뉘어진 고체 담체 또는 둘다와의 연합으로 가져감으로써, 그후, 만일 필요하다면, 제품을 성형함으로써 제조된다.

본 발명의 조성물은 이것으로 제한되지는 않지만, 정제, 캡슐, 캐플릿, 액체 시럽, 소프르 겔, 좌약, 및 관장제와 같은 어떠한 많은 가능한 용량 형태로 조제될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 수성, 비-수성 또는 혼합 매질 안의 현탁액으로서 조제될 수 있다. 수성 현탁액은 더 나아가 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 현탁액은 또한 안정제를 함유할 수 있다.

일부 구체예에서, 제약 조성물은 포말로서 조제되고 사용될 수 있다. 제약 포말은 이것으로 제한되지는 않지만, 에멀젼, 마이크로에멀젼, 크림, 젤리 및 리포솜과 같은 제제를 포함한다. 이들 제제는 기본적으로 유사한 성질이지만 성분 및 최종 생성물의 일관성은 변한다. 그러한 조성물 및 제제의 제조는 일반적으로 제약 및 제제의 당업자들에게 잘 알려져있고 본 발명의 조성물의 제제에 적용될 수 있다.

"제약 담체" 또는 "부형제"는 하나 이상의 핵산을 동물에게 송달하기 위한 약학적으로 허용가능한 용매이고, 현탁제 또는 어떠한 다른 약리적으로 불활성 매개체이다. 부형제는 원하는 벌크, 일관성, 등을 제공하기 위해, 액체 또는 고체가 될 수 있고 핵산 및 주어진 제약 조성물의 다른 성분과 조합할때 제공하기 위해, 마음속에 계획된 방식의 투여로 선택된다. 전형적인 제약 담체는 이것으로 제한되지는 않지만, 결합제 (예를 들어, 미리젤라틴화 옥수수 전분, 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필 메틸셀룰로오스, 등) ; 충전제 (예를 들어, 락토오스및 다른 당, 미세결정 셀룰로오스, 펙틴, 젤라틴, 칼슘 술페이트, 에틸 셀룰로오스, 폴리아크릴레이트 또는 칼슘 수소 포스페이트, 등) ; 윤활제 (예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 실리카, 콜로이달 이산화규소, 스테아르산, 금속성 스테아레이트, 수소화 식물성 기름, 옥수수 전분, 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 벤조에이트, 나트륨 아세테이트, 등) ; 붕괴제 (예를 들어, 녹말, 나트륨 녹말 글리콜레이트, 등) ; 및 습윤제 (예를 들어, 나트륨 라우릴 술페이트, 등)을 포함한다.

핵산과 해롭게 상호작용하지 않는 경구 투여에 적절한 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 부형제는 본 발명의 조성물을 조제하는데 사용될 수 있다. 적절한 약학적으로 허용가능한 담체는 이것으로 제한되지는 않지만, 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 살리실산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.

핵산의 국소 투여를 위한 제제는 알코올과 같은 통상적인 용매 중에 무균 및 비-무균 수용액, 비-수용액, 또는 액체 또는 고체 오일 베이스중의 핵산의 용액을 포함할 수 있다. 용액은 또한 완충액, 희석제 및 다른 적절한 첨가제를 함유할 수 있다. 핵산과 해롭게 상호작용하지 않는 비-비경구 투여에 적절한 약학적으로 허용가능한 유기 또는 무기 부형제가 사용될 수 있다.

적절한 약학적으로 허용가능한 부형제는, 이것으로 제한되지는 않지만, 물, 염 용액, 알코올, 폴리에틸렌 글리콜, 젤라틴, 락토오스, 아밀로스, 마그네슘 스테아레이트, 활석, 살리실산, 점성 파라핀, 히드록시메틸셀룰로오스, 폴리비닐피롤리돈 등을 포함한다.

본 발명의 조성물은 그들의 업계 수립된 사용법 수준에서, 추가적으로 제약 조성물에서 종래에 발견된 다른 보조약 성분을 함유할 수 있다. 따라서, 예를 들어, 조성물은 예를 들어, 가려움약, 아스트린젠트, 국소 마취제 또는 항-염증제와 같이, 추가의, 호환가능한, 제약적으로-활성인 재료를 함유할 수 있고, 또는 염료, 향료제, 보존제, 항산화제, 불투명화제, 농후제 및 안정제와 같은 다양한 용량 형태의 본 발명의 조성물을 물리적으로 조제하는데 유용한 추가의 재료를 함유할 수 있다. 그러나, 그러한 재료는, 첨가될 때, 본 발명의 조성물의 성분의 생물학적 활성을 과도하게 방해해서는 안된다. 제제는 무균화될 수 있고, 바람직하다면, 보조제, 예를 들어, 제제의 핵산(들)과 해롭게 상호작용하지 않는 윤활제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 삼투압 압력에 영향주기 위한 염, 완충액, 착색제, 향료제 및/또는 방향족 물질등과 혼합된다.

수성 현탁액은 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어, 나트륨 카르복시메틸셀룰로오스, 소르비톨 및/또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 현탁액는 또한 안정제를 함유할 수 있다.

본 발명의 일부 구체예는 비-안티센스 메카니즘에 의해 작용하는 (a) 하나 이상의 안티센스 화합물 및 (b) 하나 이상의 다른 화학치료제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 그러한 화학치료제의 예는 이것으로 제한되지는 않지만, 다우노루비신, 닥티노마이신, 독소루비신, 블레오마이신, 미토마이신, 질소 머스타드, 클로람부실, 멜팔란, 사이클로포스파미드, 6-메르캅토퓨린, 6-티오구아닌, 시타라빈 (CA), 5-플루오로우라실 (5-FU), 플록수리딘 (5-FUdR), 메토트렉세이트 (MTX), 콜치신, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 에토포시드, 테니포시드, 시스플라틴 및 디에틸스틸베스톨 (DES)과 같은 항암 약물을 포함한다. 참조, 일반적으로, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. , Berkow et al. , eds., 1987, Rahway, N. J. , pages 1206-1228). 이것으로 제한되지는 않지만 비스테로이드 항-염증 약물 및 코르티코스테로이드를 포함하는 항-염증 약물, 및 이것으로 제한되지는 않지만 리비비린, 비다라빈, 아사이클로비르 및 간시클로비르를 포함하는 항바이러스 약물은 또한 본 발명의 조성물에서 조합될 수 있다. 일반적으로, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15th Ed. , Berkow et al., eds. , 1987, Rahway, N. J. , 각각 페이지 2499- 2506 및 46-49 참조). 다른 비-안티센스 화학치료제 는 또한 본 발명의 범위내에 있다. 두개 이상의 조합된 화합물은 함께 또는 순차적으로 사용될 수 있다.

진단, 예후, 치료요법의 평가 ( 테라메트릭스 ), 및 암의 관리

그들의 유전자 생성물은 물론이고 본원에서 기술된 TFF3 폴리뉴클레오티드는, 발암 경로를 따른 가장 이른 변화를 검출하고 및/또는 다양한 치료법 및 예방적인 개입의 효능을 모니터할 수 있는 유전자 또는 생화학 마커 (예를 들어, 혈액 또는 조직중)만큼 더욱 관심이 있다. 예를 들어, TFF3의 발현 수준은 불량한 예후의 표시가 될 수 있고, 따라서 환자를 위해 보다 공격적인 화학요법 또는 방사능치료법을 보장한다. 종양 특이적 신규 대용품의 상호관계는 치료에 대한 반응을 특징으로 하고 환자에서의 결과는 종양의 분자 프로파일을 기반으로 맞춤 치료법의 설계를 허용하는 예후 지표를 한정할 수 있다. 이들 치료법은 항체 표적화, 중화제 (예를 들어, 작은 분자), 및 유전자 치료법을 포함한다. TFF3의 발현을 결정하고 환자의 프로파일을 정상 조직 및 질환의 변이체에서 공지된 발현과 비교하는 것은 치료의 특이성의 관점과 환자의 편안함 수준의 관점 모두에서 환자를 위한 최상의 가능한 치료의 결정을 허용할 수 있다. 폴리뉴클레오티드 발현과 같은 대용품 종양 마커는, 또한 더 잘 분류하고, 따라서 암의 다른 형태 및 질환 상태를 진단하고 치료하는데 사용될 수 있다. 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드에 해당하는 유전자의 발현 수준의 동정으로부터 유리할 수 있는 종양학에서 널리 사용된 두개의 분류는 암 장애의 단계화이고, 암 조직의 성질을 등급화한다.

TFF3 발현을 측정하는 것은 분자 수준에서 잠재적으로 악성의 사건을 검출하기 위해 암에 걸렸거나 걸리기쉬운 환자를 모니터링하는데 유용할 수 있다. 게다가, 그러한 폴리뉴클레오티드에 해당하는 유전자는 물론이고, TFF3 폴리뉴클레오티드는, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드 또는 그들의 인코딩된 유전자 생성물을 사용함으로써, 치료법의 유효성을 평가하기 위해, 예를 들어, 치료법 전, 동안 및 후에서 환자에서 종양 부담을 평가하기 위해 테라메트릭스로서 유용할 수 있다.

더욱이, 암의 한가지 타입에서 분화하여 발현되는 유전자에 해당되는 것으로 확인된 폴리뉴클레오티드는 또한 발전 또는 다른 타입의 암의 발전의 위험의 암시를 가질 수 있고, 예를 들어, 폴리뉴클레오티드가 다양한 암 타입에 걸쳐 분화하여 발현된 유전자를 나타낸다. 따라서, 예를 들어, 결장암에 대한 임상적인 암시를 갖는 유전자에 해당하는 폴리뉴클레오티드의 발현은 또한 위장 암 또는 자궁 내막 암에 대한 임상적인 암시를 가질 수 있다.

시기결정

시기결정은 암 상태가 환자에서 얼마나 진행되었는지를 설명하기 위해 내과의사에 의해 사용된 과정이고, 시기결정은 예후를 결정하고, 치료를 계획하고 그러한 치료의 결과를 평가하는데 있어서 내과의사를 돕는다. 시기결정 시스템은 암의 타입에 따라 변하지만, 일반적으로 하기의 "TNM"시스템을 수반한다: T에 의해 표시된, 종양의 타입 ;N 에 의해 표시되는, 암이 가까운 림프절로 전이했는지 여부; 및 M에 의해 표시된, 암이 좀더 먼 부분의 신체로 전이했는지 여부. 일반적으로, 만약 암이 오직 어떠한 림프절로 퍼지지 않고 주요 병소 영역에서 검출가능하다면 그것은 단계 I로 불린다. 만일 그것이 오직 가장 가까운 림프절로만 퍼졌다면, 그것은 단계 II이라 불린다. 단계 III에서, 암은 일반적으로 주요 병소의 부위에 가까운 근처에서 림프절로 퍼졌다. 간, 뼈, 뇌 또는 다른 부위와 같이 몸의 먼 부분으로 퍼진 암은 가장 발전된 단계인 단계 IV이다.

본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드는 몸의 다른 영역에서 존재는 물론이고, 암의 공격성, 예를 들어 전이 잠재력에 대한 마커를 확인함으로써 시기결정 과정의 미세-조정을 촉진할 수 있다. 따라서, 높은 전이 잠재적 암을 의미하는 폴리뉴클레오티드를 갖는 단계 II 암은 경계선 단계 II 종양을 단계 III 종양으로 변화시키는데 사용될 수 있고, 보다 공격적인 치료법을 정당화한다. 반대로, 더 낮은 전이 잠재력을 의미하는 폴리뉴클레오티드의 존재는 종양의 보다 보존 시기결정을 허용한다 .

암의 등급화

등급은 종양이 얼마나 가깝게 그것의 동일한 타입의 정상 조직을 흉내내는지를 기술하는데 사용된 용어이다. 종양의 현미경적 모양은 세포 형태학, 세포 조직화, 및 분화의 다른 마커와 같은 매개변수에 기반한 종양 등급을 확인하는데 사용된다. 일반적인 규칙으로서, 종양의 등급은 성장 또는 공격성의 그것의 속도에 해당하고, 미분화 또는 높은-등급 종양은 일반적으로 잘 분화된 또는 낮은-등급 종양 보다 더욱 공격적이다. 하기의 가이드라인은 일반적으로 종양을 등급화하는데 사용된다 : 1) GX 등급은 평가될 수 없다; 2) Gl 잘 분화됨; G2 적당하게 잘 분화됨; 3) G3 안좋게 분화됨 ; 4) G4 미분화. 본 발명에 의해 계획된 폴리뉴클레오티드 는 종양의 등급을 결정하는데 있어서 특히 매우 유익할 수 있고, 그들이 오직 종양의 세포의 분화 상태를 결정하는데 도움이 될 수 있을 뿐만 아니라, 그들은 또한 전이 잠재력과 같은 종양의 공격성을 결정하는데 있어서 매우 유익한 분화 이외의 인자를 확인할 수 있다.

암의 검출

TFF3 발현 패턴은 대상에서 암, 특히 결장, 유방, 및 전립샘암을 검출하는데 사용될 수 있다. 직장결장암은 사람에서 가장 통상적인 종양 중 하나이고 아마도 유전적인 종양의 가장 잦은 형태이다.

예방 및 이른 검출은 직장결장암을 제어하고 치료하는데 있어서 주요 인자이다. 직장결장암은 작은 폴립으로서 시작되고, 결장의 안쪽 라이닝 위에 형성되는 세포의 성장을 시작한다. 몇년의 기간에 걸쳐서, 이들 폴립의 일부는 추가의 돌연변이를 축적하고 암이 된다. 다중 가족성 직장결장암 장애는 확인되었고, 이것은 다음과 같이 요약된다: 1) 가족성 아데노마토스 폴립증 (FAP); 2) Gardner 증후군; 3) 유전적인 비폴립증 결장암 (HNPCC); 및 4) Ashkenazi Jews에서 가족성 직장결장암. 적절한 폴리뉴클레오티드의 발현은 암의 진단, 예후 및 관리에서 사용될 수 있다. 암의 검출은 단독으로 또는 다른 유전자와 조합하여 TFF3 서열의 발현 수준을 사용하여 결정될 수 있다. 결장암의 공격적인 성질 및/또는 전이 잠재적의 결정은 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드에 해당하는 유전자의 하나 이상의 유전자 생성물의 수준을 비교하고, 암 조직에서 변하는 것으로 알려진 또다른 서열의 전체 수준을 비교함으로써 결정될 수 있다, 예를 들어, p53, DCC, ras, FAP의 발현(참조, 예를 들어, Fearon ER, et al., 세포 (1990) 61 (5) : 759; Hamilton SR et al., 암 (1993) 72 : 957; Bodmer W, et al., Nat Genet. (1994) 4 (3) : 217; Fearon ER, Ann N YAcad Sci. (1995) 768 : 101). 예를 들어, 암의 발전은 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드에 해당하는 TFF3의 발현의 수준을 종양유전자 (예를 들어 ras) 또는 종양 억제인자 유전자 (예를 들어FAP 또는 p53)의 수준까지 조사함으로써 검출될 수 있다. 따라서, 특이적 마커 폴리뉴클레오티드의 발현은 정상과 암 결장 조직 사이에서 구별하고, 기원의 다른 세포를 갖는 암 사이에서 구별하고, 다른 잠재적 전이율을 갖는 암 사이에서 구별하기 위해 사용될 수 있다. 암의 마커의 리뷰를 위해서는, 참조, 예를 들어, Hanahan et al. (2000) 세포 100: 57-70를 참조하고, 이것은 그것의 전문이 참조에 의해 본원에 포함된다.

암의 치료

본 발명은 TFF3 발현으로 특징지어지는 암 세포의 성장을 억제하고 및/또는 암의 부착, 이동 및/또는 전이를 조절하기 위한 방법을 제공한다. 그것의 예는 결장암, 위장(위)암과 같은 소화암 및 간암, 및 폐암, 유방암, 난소암, 및 전립샘암과 같은 다른 암을 포함한다. 일부 구체예에서, 암은 TFF3의 분화 발현을 나타낸다. 더 나아간 구체예에서, TFF3은 암에서 상향조절된다. 여전히 더 나아간 구체예에서, 암은 결장암을 제외하고, 다른 구체예에서, 암은 전립샘암 이외의 암이다.

본 발명은 TFF3 중화제의 투여가 적어도 하나의 암 세포 증식, 암 세포 이동, 암 세포 부착 및/또는 전이를 조절하는(예를 들어, 억제하는) 어떠한 암의 치료를 포함한다. 실시예에서 나타난 바와 같이, TFF3 중화제는 암 세포 부착을 억제하고 암 세포 증식을 억제하는 것으로 나타났다. 부착의 억제는 암 세포가 본래의 종양으로부터 다른 부위에서의 종양에 부착하고 발전시키는 능력을 억제함으로써 전이에 대한 조절 효과를 가질 수 있다. 일반적으로, 방법은 암 세포를 (1) TFF3에 해당하는 폴리뉴클레오티드의 발현; 또는 (2) TFF3 폴리펩티드의 수준 및/또는 활성을조절하는 물질과 접촉시키는 것을 포함한다. 방법은 암 세포에서 TFF3의 발현을 감소시키는 것을 제공하고 또는 TFF3의 수준을 감소시키고 및/또는 활성을 감소시킨다. 이 억제는 감소된 암 세포 증식, 이동 및/또는 부착, 감소된 종양 성장, 감소된 종양 부피, 감소된 종양 침입성, 등을 초래할 수 있다.

"종양 또는 암 세포의 성장을 줄이는 것"은 이것으로 한정되지는 않지만, 암 (또는 종양) 세포의 증식을 줄이는 것, 및 암 세포가 되는 비- 암 세포의 발생을 줄이는 것을 포함한다. 암 세포 성장에서 감소가 달성될 수 있는지 여부는 이것으로 제한되지는 않지만, [³H]-티미딘 합일화; 시간에 걸쳐서 세포 수를 세는 것; 결장암 (예를 들어, CEA, CA19-9, 및 LASA)과 연합된 마커를 검출하고 및/또는 측정하는 것 등을 포함하여, 어떠한 공지된 분석법을 사용하여 쉽게 결정될 수 있다.

본 발명은 암 세포 성장을 줄이는 물질을 암 세포 성장을 줄이고 암을 치료하는데 충분한 양으로, 필요로하는 개개인에게 투여하는 것을 포함하는, 특히 결장암, 유방암, 및/또는 전립샘암과 같은 TFF3 연합된 암을 치료하는 방법을 제공한다. 물질, 또는 특이적 양의 물질이, 환자에서 암을 치료하는데 효과적인지 여부는 이것으로 제한되지는 않지만, 구불결장경검사, 직장경검사법, 직장 검사, 생검으로 직장경, 대조 방사능그래프 연구, CAT 스캔, 혈관조영술, 및 개개인의 혈관에서 결장암과 관련된 종양 마커의 검출을 포함하여, 암에 대한 다양한 공지된 진단 분석법 중 어떤 것, 을 사용하여 평가될 수 있다. 물질은 전신으로 또는 국소적으로 투여될 수 있다. 국소 투여는 예를 들어, 고체 종양을 치료하는데 있어서 유용할 수 있다.

TFF3 의 검출을 수반하는 진단 및 다른 방법

본 발명은 진단 목적 및 다른 방법을 위해 본원에서 기술된 TFF3 중화제, TFF3 폴리펩티드, 및 TFF3 폴리뉴클레오티드를 사용하는 방법을 제공한다. 특이적 비제한 구체예에서, 방법은 결장, 유방, 난소, 위, 및 전립샘암 세포와 같이 TFF3 연합된 암 세포를 검출하고, 암과 암의 심각도 (예를 들어, 종양 등급, 종양 부담, 등)의 진단을 촉진하고, 대상의 예후의 결정을 촉진하고, 대상의 치료법에 대한 반응도 (예를 들어, 화학치료 요법 동안 또는 후에 종양 부담을 평가함을 통해 예를 들어, 치료 효과의 측정을 제공함으로써)를 평가하는데 유용하다. 검출은 세포에서 TFF3의 수준의 검출, 예를 들어, 암 세포에서 TFF3 폴리펩티드의 결장암 세포 및/또는 검출에 기반할 수 있다. 본 발명의 검출방법은 시험관내 또는 생체내에서 분리된 세포, 또는 전체 조직에서 또는 체액, 예를 들어, 혈액, 혈장, 혈청, 소변, 등에서 )수행될 수 있다.

따라서, 본 발명은 샘플을 접촉시키고 샘플에서 TFF3 의 분화 발현의 증거를 검출함으로써, 생물학적 샘플에서 TFF3을 검출하고 생물학적 샘플에서 암의 존재를 검출하는 방법을 제공한다. 증거는 샘플에서 TFF3 중화제와 TFF3 사이의 결합의 형태가 될 수 있다. 결합의 수준을 검출하고 측정하기 위한 수많은 방법은 당업계에 알려져있고 예를 들어, ELISA-기반 분석법 등을 포함한다. 결합 수준은 만일 TFF3 발현이 정상 샘플보다 더 낮거나 또는 더 높은지를 표시하기 위해 표준 샘플에 대해서 비교될 수 있다. 일부 구체예에서, 정상 TFF3 발현보다 더높은 검출은 암의 존재를 암시한다.

본 발명은 더나아가 환자의 암 샘플에서 TFF3의 분화 발현의 증거를 검출함으로써 환자의 TFF3 중화제에 대한 감수성을 결정하기 위한 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "민감한(걸리기 쉬운)"은 TFF3 중화제의 투여가 치료의 허용가능한 방법인 환자를 기술할 수 있고, 즉, 이 용어는 TFF3 중화제로 치료에 양성으로 반응할 것 같은 환자를 기술한다. 본 발명의 치료 방법에 민감한 암 환자는 예를 들어, 질환에 걸린 조직에서, 치료에 민감하지 않은 환자와 비교할때, TFF3의 분화 발현을 나타낼 수 있다.

본 발명의 검출방법은 키트의 부분으로서 제공될 수 있다. 따라서, 본 발명은 더나아가 암 세포에서 발현된 TFF3의 존재 및/또는 수준을 첨출하기 위한 키트(예를 들어, 분화하여 발현된 관심의 유전자에 의해 인코딩된 mRNA의 검출), 및/또는 생물학적 샘플에서 그것에 의하여 인코딩된 폴리펩티드를 제공한다. 이들 키트를 사용하는 과정은 임상적인 실험실, 실험 실험실, 의학 개업의 또는 개개인에 의해 수행될 수 있다. 결장암 세포에서 분화하여 발현되는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된 폴리펩티드를 검출하기 위한 본 발명의 키트는 특이적으로 특이적 항체, 안티센스 분자, RNAi 분자, 리보자임, 또는 작은 분자가 될 수 있는 폴리펩티드에 결합하는 부분을 포함한다. 암 세포에서 분화하여 발현되는 폴리뉴클레오티드를 검출하기 위한 본 발명의 키트는 그러한 폴리뉴클레오티드로 특이적으로 잡종화하는 부분을 포함한다. 키트는 선택적으로 이것으로 제한되지는 않지만, 완충액, 개발 시약, 라벨, 반응 표면, 검출 수단, 제어 샘플, 표준, 지시사항, 및 해석 정보를 포함하여, 과정에서 유용한 추가의 성분을 제공할 수 있다.

암 세포에서 TFF3 폴리펩티드를 검출하는 것

일부 구체예에서, 방법은 과도발현하는 TFF3 세포를 검출함으로써 TFF3 연합된 암을 검출하기 위해 제공된다. 이것으로 제한되지는 않지만, 면역분석법, 인코딩된 폴리펩티드에 특이적인 항체를 사용하는 것, 예를 들어, 효소-연결 면역흡수 분석법 (ELISA), 방사선면역분석법 (RIA), 등에 의해 ; 및 인코딩된 폴리펩티드, 예를 들어, 결합 활성 또는 효소 활성에 대한 기능적 분석법을 포함하여, 다양한 공지된 방법의 어떤 것은 검출을 위해 사용될 수 있다.

예를 들어, 면역형광 분석법은 먼저 인코딩된 폴리펩티드를 분리하지 않고 세포에서 수행될 수 있다. 세포는 먼저 현미경 슬라이드 또는 마이크로역가 웰과 같은, 고체 지지체 위에 고정된다. 이러한 고정 단계는 세포 막을 투과할 수 있다. 세포 막의 투과는 폴리펩티드- 특이적 항체가 결합하는 것을 허용한다. 다음에, 고정된 세포는 인코딩된 폴리펩티드에 특이적인 항체에 노출된다. 분석법의 민감성을 증가시키기 위해, 고정된 세포는 더나아가 제 2 항체에 노출될 수 있고, 이것은 표지화되고 인코딩된 폴리펩티드에 특이적인 제 1 항체에 결합한다. 전형적으로, 제 두번째 항체는 예를 들어, 형광 마커로 검출가능하게 표지화된다. 인코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포는 형광으로 표지될 것이고 현미경하에서 쉽게 보일 것이다. 참조, 예를 들어, Hashido et al. (1992) Biochem. Bioplzys. Res. Comm. 187 : 1241-1248.

본 명세서를 읽을 때 당업자들에게 쉽게 명백할 것처럼, 본원에서 기술된 검출방법 및 다른 방법은 쉽게 변할 수 있다. 그러한 변이는 본 발명의 의도된 범위안에 있다. 예를 들어, 상기 개략도에서, 검출에 사용하기 위한 프로브는 고체 지지체위에 고정될 수 있고, 테스트 샘플은 고정화 프로브와 접촉된다. 테스트 샘플의 프로브로의 결합은 그후 다양한 방법으로 예를 들어, 테스트 샘플-고정 프로브 착체의 검출을 촉진하기 위해 테스트 샘플에 결합된 검출가능한 라벨을 검출함으로써 검출될 수 있다.

본 발명은 더나아가 TFF3에 특이적 항체를 사용하여, 생물학적 샘플에서 TFF3 폴리펩티드의 존재를 검출하고 및/또는 그것의 수준을 측정하기 위한 방법을 제공한다. 방법은 일반적으로 : a) 샘플을 TFF3에 특이적인 항체와 접촉시키는 것 ; 그리고 b) 샘플의 항체와 분자 사이의 결합을 검출하는 것을 포함한다.

TFF3에 특이적인 항체의 특이적 결합의 검출은 적절한 대조군과 비교할때, TFF3가 샘플에 존재한다는 표시이다. 적절한 대조군은 TFF3을 함유하지 않는 것으로 알려진 샘플 및 인코딩된 폴리펩티드, 예를 들어, 항-이디오타입 항체에 특이적이지 않은 항체와 접촉된 샘플을 함유한다. 특이적 항체-항원 상호작용을 검출하기 위한 다양한 방법은 이것으로 제한되지는 않지만, 표준 면역 조직학 방법, 면역침전, 효소 면역분석법, 및 방사선면역분석법을 포함하는 방법에 사용될 수 있다. 일반적으로, 특이적 항체는 직접 또는 간접적으로 검출가능하게 표지가 될 것이다. 직접적인 라벨은 방사성동위원소; 그 생성물이 검출가능한 효소(예를 들어, 루시퍼라아제, 갈락토시다아제, 등); 형광 라벨 (예를 들어, 플루오레세인 아이소티오시아네이트, 로다민, 피코에리트린, 등); 형광 방출 금속, 예를 들어, EDTA와 같이 금속 킬레이팅 기를 통해 항체에 부착된 ^l52Eu, 또는 란탄계열원소 시리즈의 다른것; 화학발광 화합물, 예를 들어, 루미놀, 아이소루미놀, 아크리디늄 염, 등; 생물발광 화합물, 예를 들어, 루시페린, 에쿼린 (그린 형광 단백질), 등을 포함한다. 항체는 폴리스티렌 플레이트 또는 비드와 같은, 불용성 지지체에 부착(결합)될 수 있다. 간접적인 라벨은 인코딩된 폴리펩티드("제 1 특이적 항체")에 특이적인 항체에 대해 특이적인 제 2 항체 를 포함하고, 이때 제 2 항체는 위에서 기술한 바와 같이 표지화되고; 및 특이적 결합 쌍의 멤버, 예를 들어, 비오틴-아비딘, 등. 생물학적 샘플은 니트로셀룰로오스와 같은 고체 지지체 또는 담체와 접촉되고 그것에 고정될 수 있고, 그것은 세포, 세포 입자, 또는 가용성 단백질을 부동화할 수 있다. 지지체는 그후 적절한 완충액으로 세척될 수 있고, 검출가능하게-표지 제 1 특이적 항체와 접촉된다. 검출방법은 당업계에 공지되고 검출가능한 라벨에 의해 방출된 신호에 적절한 것으로 선택될 것이다. 검출은 일반적으로 적절한 대조군과 적절한 표준에 비교하여 수행된다.

일부 구체예에서, 방법은 예를 들어, TFF3 연합된 암 세포가 존재하는 부위를 위치시키거나 확인하기 위해 생체내에서 사용하기 위해 적합화된다. 이들 구체예에서, 검출가능하게-표지 부분, 예를 들어, 개개인에 투여되는 (예를 들어, 주사에 의해) TFF3 에 대해 특이적인 항체, 및 표지 세포는 이것으로 제한되지는 않지만, 자기 공명 이미징, 컴퓨터 단층촬영술 스캐닝, 등을 포함하여, 표준 이미징 기술을 사용하여 위치된다. 이러한 식으로, TFF3 발현 세포는 분화하여 표지화된다.

암 세포에서 TFF3 폴리뉴클레오티드를 검출

암 세포에서 TFF3 전사의 세포에서 발현을 검출함으로써 TFF3 암 세포를 검출하기 위한 방법이 제공된다. 어떠한 다양한 공지된 방법이 검출을 위해 사용될 수 있고, 이것으로 제한되지는 않지만, TFF3 폴리뉴클레오티드로 잡종화하는 폴리뉴클레오티드로 부합화에 의해 전사의 검출; 특이적 올리고뉴클레오티드 프라이머를 사용하는 폴리머라아제 사슬 반응에 의한 전사의 검출; 프로브로서 결장암 세포에서 분화하여 발현되는 유전자로 잡종화하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 세포의 인시투 부합화를 포함한다. 암 세포에서 발현된 mRNA 수준 TFF3 유전자를 검출하고 및/또는 측정하기 위해 방법이 사용될 수 있다. 일부 구체예에서, 방법은 : a) 부합화를 허용하는 조건하에서 샘플을 TFF3 폴리뉴클레오티드와 접촉하고; 및 b) 만일 있다면, 부합화를 검출하는 것을 포함한다.

분화 부합화의 검출은, 적절한 대조군과 비교할때, 암 세포에서 분화하여 발현되는 폴리뉴클레오티드의 샘플에서 존재의 표시이다. 적절한 대조군은 예를 들어, TFF3 폴리뉴클레오티드를 함유하지 않는 것으로 알려진 샘플을 포함한다. 부합화를 허용하는 조건은 당업계에 공지되어 있다. 검출은 또한 적절하게 표지 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 이것으로 제한되지는 않지만, 인시투 부합화, PCR (폴리머라아제 사슬 반응), RT-PCR (역전사-PCR), 및 "Northern" 또는 RNA 블로팅, 또는 그러한 기술의 조합을 포함하는 어떠한 공지된 방법에 의해, 성취될 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 다양한 라벨 및 라벨링 방법은 당업계에 공지되어 있고 본 발명의 분석법 방법에서 사용될 수 있다. 특이적 부합화는 적절한 대조군과 비교함으로써 결정될 수 있다.

일반적으로 본원에서 제공된 적어도 12 인접 nt의 TFF3 폴리뉴클레오티드를 포함하는 폴리뉴클레오티드는, 결장암 세포에서 분화하여 발현되는 폴리뉴클레오티드의 전사 수의 검출 및/또는 측정을 위한 프로브와 같이, 다양한 목적을 위해 사용될 수 있다. 특이적으로 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드를 잡종화하는 프로브는 다른 미관련 서열으로 제공되는 백그라운드 부합화보다 적어도 5-, 10-, 또는 20- 배 더높은 검출신호를 제공해야 한다. 본원에서 사용된 "프로브"는 테스트 샘플에서 TFF3유전자 생성물을 검출하기 위해 사용된 폴리뉴클레오티드 서열을 말하는 의미라는 것을 주목해야 한다. 당업자들에게 쉽게 이해될 바와 같이, 프로브는 검출가능하게 표지화될 수 있고, 예를 들어, 테스트 샘플로부터 얻어진 고정화 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, mRNA)를 포함하는 배열과 접촉할 수 있다. 대안으로서는, 프로브는 어레이 및 검출가능하게 표지된 테스트 샘플에 고정될 수 있다. 본 발명의 방법의 이들 및 다른 변이는 당업자의 기술내에 있고 본 발명의 범위내에 있다.

뉴클레오티드 프로브는 제공된 폴리뉴클레오티드에 해당하는 유전자의 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. Northern 블롯에서, mRNA 는 전기이동으로 분리되고 프로브와 접촉된다. 프로브는 특정 크기의 mRNA 종으로 잡종화하는 것으로 검출된다. 부합화의 양은 예를 들어 특정 조건하에서 발현의 상대적인 양을 결정하도록 양을 평가할 수 있다. 프로브는 발현을 검출하기 위해 세포로 인시투 부합화 에서 된다. 프로브는 또한 잡종화 서열의 진단 검출을 위해 생체내에서 사용될 숭 있다. 프로브는 전형적으로 방사능 동위원소로 표지된다. 발색단, 형광발색단, 및 효소와 같은 검출가능한 라벨의 다른 타입이 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 부합화 분석법의 다른 예는 W092/02526 및 미국특허 No. 5,124, 246에서 기술된다.

PCR는 작은 양의 표적 핵산을 검출하기 위한 또다른 수단이다 (참조, 예를 들어, Mullis et al., Meth. Enzymol. (1987) 155 : 335; 미국특허 No. 4, 683, 195 및 4, 683, 202). 표적 핵산으로 잡종화하는 두개의 프라이머 폴리뉴클레오티드 뉴클레오티드는 반응을 준비시키기 위해 사용된다. 프라이머는 본원에서 개시된 폴리뉴클레오티드에 대한 또는 3' 및 5' 내에 서열을 포함할 수 있다. 대안으로서는, 만일 프라이머가 이들 폴리뉴클레오티드에 대해 3' 및 5'이면, 그들은 그들 또는 보체로 잡종화할 필요가 없다. 열안정한 폴리머라아제로 표적의 증폭 후에, 증폭된 표적 핵산은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, Southern 블롯에 의해 검출될 수 있다. mRNA 또는 cDNA은 또한 Sambrook et al.,"Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (New York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) (예를 들어, PCR 증폭없이)에서 기술된 종래의 블로팅 기술 (예를 들어, Southern 블롯, Northern 블롯, 등)에 의해 검출될 수 있다. 일반적으로, 폴리머라아제 효소를 사용하여 mRNA으로부터 발생된 mRNA 또는 cDNA은 정제될 수 있고 겔 전기영동을 사용하여 분리될 수 있고, 니트로셀룰로오스와 같은 고체 지지체로 이동된다. 고체 지지체는 표지 프로브에 노출되고, 세척되어 어떠한 미잡종화 프로브를 제거하고, 표지 프로브를 함유하는 중복부위가 검출된다.

PCR 증폭을 사용하는 방법은 비록 적어도 약 10⁵ 세포를 사용하는 것이 편리하지만, 단일 세포로부터 DNA에서 수행될 수 있다. 폴리머라아제 사슬 반응의 사용은 Saiki et al. (1985) Science 239: 487에서 기술되고, 및 현재 기술의 리뷰는 Sambrook, et al. 분자 Cloning: A Laboratory Manual, CSH Press 1989, pp. 14.2-14. 33에서 찾아볼 수 있고, 이것의 각각은 참조에 의해 본원에 포함된다. 검출가능한 라벨은 증폭 반응에 포함될 수 있다. 적절한 검출가능한 라벨은 플루오로크롬, (예를 들어플루오레세인 아이소티오시아네이트 (FITC), 로다민, Texas Red, 피코에리트린, 알로피코시아닌, 6-카르복시플루오레세인 (6-FAM), 2', 7'-디메톡시-4', 5'-디클로로-6-카르복시플루오레세인, 6-카르복시-X-로다민 (ROX), 6-카르복시-2', 4', 7', 4, 7-헥사클로로플루오레세인 (HEX), 5-카르복시플루오레세인 (5-FAM) 또는 N, N, N', N'-테트라메틸-6-카르복시로다민 (TAMRA) ), 방사능 표지, (예를 들어 ³²P, ³⁵S, ³H, 등), 등을 포함한다. 라벨은 두개의 단계 시스템이 될 수 있고, 여기서 폴리뉴클레오티드는 높은 친화력 결합 파트너, 예를 들어 아비딘, 특이적 항체, 등을 갖는 비오틴, 햅텐, 등에 접합되고, 이때 결합 파트너는 검출가능한 라벨에 접합된다. 라벨은 프라이머의 하나 또는 둘다에 접합될 수 있다. 대안으로서는, 증폭 생산물 안으로 라벨을 혼입하기 위해, 증폭에서 사용된 뉴클레오티드의 풀은 표지화된다.

어레이

폴리뉴클레오티드 어레이는 샘플에서 많은 수의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 분석할 수 있는 높은 작업처리량 기술을 제공한다. 이 기술은 분화 발현을 위해 테스트에 대한 도구로서 사용될 수 있다. 이들 방법의 변이는 물론이고, 어레이를 제조하는 다양한 방법은 당업계에 공지되어 있고 본 발명에서 사용하기 위해 계획된다. 예를 들어, 어레이는 폴리뉴클레오티드 프로브를 기질위로 (예를 들어, 유리, 니트로셀룰로오스, 등) 스폿팅함으로써 결합된 프로브를 갖는 2차원 기질 또는 어레이에서 만들어질 수 있다. 프로브는 공유결합 또는 이를테면 소수성 상호작용과 같은 비-특이적 상호작용에 의해서, 기질에 결합될 수 있다. 폴리뉴클레오티드의 샘플은 검출가능하게 표지 (예를 들어, 방사능 또는 형광 라벨을 사용하여)화될 수 있고 그후 프로브에 잡종화될 수 있다. 프로브 폴리뉴클레오티드에 결합된 표지 샘플 폴리뉴클레오티드를 포함하는 이중 가닥 폴리뉴클레오티드는, 일단 샘플의 미결합 부분이 세척되면 검출될 수 있다. 대안으로서는, 테스트 샘플의 폴리뉴클레오티드는 어레이 위에 고정될 수 있고, 프로브는 검출가능하게 표지화된다. 어레이를 구성하는 기술과 이들 어레이를 사용하는 방법은 예를 들어, Schena et al. (1996) Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (20): 10614-9; Schena et al. (1995) Science 270 (5235): 467-70; Shalon et al. (1996) 게놈 Res. 6 (7): 639-45, 미국특허 No. 5, 807, 522, EP 799 897; WO 97/29212; WO 97/27317; EP 785 280 ; WO 97/02357; U. S. Pat. No. 5,593, 839; 미국특허 No. 5,578, 832 ; EP 728 520; 미국특허 No. 5,599, 695; EP 721 016 ; 미국특허 No. 5,556, 752; WO 95/22058 ; 및 미국특허 No. 5, 631, 734에서 기술된다.

어레이는 예를 들어, 유전자의 분화 발현을 조사하는데 사용될 수 있고 유전자 기능을 결정하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 어레이는 TFF3 유전자의 분화 발현을 검출하는데 사용될 수 있고, 이때 발현은 테스트 세포와 대조군 세포 (예를 들어, 암 세포 및 정상 세포) 사이에서 비교된다. 예를 들어, 대응하는 정상 세포에서 관찰되지 않은, 암 세포에서 특정 메세지의 높은 발현은 암 특이적 유전자 생성물을 지시할 수 있다. 어레이의 사용의 예는 더나아가 예를 들어, Pappalarado et al., Sem. Radiation Oncol. (1998) 8 : 217; 및 Ramsay Nature Biotechnol. (1998) 16 : 40에서 기술된다. 더욱이, 어레이를 사용하여 검출의 방법에 대한 많은 변이가 당업계 기술내에 잘 있고 본 발명의 범위내에 있다. 예를 들어, 고체 지지체에 프로브를 고정하기 보다는, 테스트 샘플은 프로브와 그후 접촉되는 고체 지지체에 고정될 수 있다.

제조 물품

본 발명의 다른 구체예에서, 본원에서 기술된 질환 또는 장애의 치료에 유용한 TFF3 중화제를 함유하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 라벨 또는 용기와 연합된 패키지 삽입부를 포함한다. 적절한 용기는 예를 들어, 병, 유리병, 주사기, 등을 포함한다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 또는 선택의 질환 또는 장애를 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하거나 함유하고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들어 용기는 정맥내 용액 백 또는 피하용 주사 바늘로 찌를수 있는 스톱퍼를 갖는 유리병이 될 수 있다). 조성물 내에 적어도 하나의 활성제는 TFF3 안티센스 분자, RNAi 분자, 리보자임, 작은 분자, 또는 항체와 같은 TFF3 중화제이다. 라벨 또는 패키지 삽입은 암, 예를 들어, 결장, 유방 또는 전립샘암을 갖거나 걸리기 쉬운 환자를 치료하기 위해 사용된다는 것을 암시한다. 제조 물품은 더나아가 주사 (BWFI)용 정균 물, 포스페이트-완충화 식염수, Ringer의 용액 및 덱스트로스 용액과 같은 약학적으로 허용가능한 희석제 완충액을 갖는 제 2 용기를 포함할 수 있다. 더나아가 상업적인 사용자 견지로부터 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘, 및 주사기를 포함하여 다른 재료를 포함하는 것이 바람직할 수 있다.

더나아가 본 발명의 세부사항은 하기의 비제한 실시예에 의해 예증된다. 명세서에서 모든 인용의 개시는 그대로 참조에 의해 본원에 표현되어 포함된다.

하기의 실시예는 당업자들에게 본 발명을 만들고 사용하는 방법의 완전한 개시 및 기술을 제공하기 위해 설명되고, 발명자들이 그들의 발명으로 간주한 것의 범위를 제한하려는 것이 아니고 그들은 하기 실험이 전부이거나 또는 오직 수행된 실험이라는 것을 제시하려는 의도도 아니다. 사용된 숫자(예를 들어 양, 온도, 등 )에 비해 정확성을 보장하기 위한 노력이 있었지만 일부 실험적 오차와 편차가 고려되어야 한다. 달리 표시되지 않으면, 부는 중량부이고, 분자량은 중량 평균 분자량이고, 온도는 ℃이고, 압력은 대기거나 대기 근처이다.

실시예 1: 생물학적 재료의 공급원

본 발명을 이끄는 실험에서 사용된 생물학적 재료는 아래에 기술된다.

환자 조직 샘플의 공급원

정상 및 암 조직은 레이저 포획 마이크로절개 (LCM) 기술을 사용하여 환자로부터 수집되었고, 이 기술은 당업계에 잘 알려져있다(참조, 예를 들어, Ohyama et al. (2000) Biotechniques 29: 530-6; Curran et al. (2000) Mol. Pathol. 53: 64-8; Suarez-Quian et al. (1999) Biotechniques 26 : 328-35; Simone et al. (1998) Trends Genet 14: 272-6; Conia et al. (1997) J. Clin. Lab. Anal. 11: 28-38; Emmert-Buck et al. (1996) Science 274: 998-1001). 아래 표 2는 다음을 포함하는 약 전립샘 조직 샘플이 분리된 각각의 환자에 대한 정보를 제공한다: 1)"환자 ID", 이것은 동정 목적을 위해 환자에게 할당된 수이고 ; 2) "조직 타입" ; 및 3) 종양의 "Gleason Grade". 모든 일차 종양의 조직병리학은 종양이 아데노암종이라는 것을 암시하였다.

실시예 2: 어레이를 사용하는 분화 발현의 검출

cDNA 프로브는 실시예 1에서 위에서 기술된 환자 세포로부터 분리된 전체 RNA로부터 제조되었다. LCM은 실질적으로 균질의 세포 샘플을 제공하기 위해, 특이적 세포 타입의 분리를 제공하기 때문에, 이는 유사하게 순수한 RNA 샘플을 제공하였다.

총 RNA는 먼저 T7 RNA 폴리머라아제 촉진자를 함유하는 프라이머를 사용하여cDNA로 역 전사되었고, 이어서 제 2 가닥 DNA 합성. cDNA는 그후 T7 촉진자-매개 발현 (참조, 예를 들어, Luo et al. (1999) Nature Med 5: 117-122)을 사용하여, 시험관내 전사되어 안티센스 RNA를 제조하였고 안티센스 RNA는 그후 cDNA로 전환되었다. cDNAs의 제 2 세트는 T7 촉진자를 사용하여, 안티센스 RNA를 제공하기 위해다시 시험관내 전사되었다. 선택적으로, RNA는 다시 cDNA로 전환되었고, 세번째 이하의 라운드의 T7-매개된 증폭이 더많은 안티센스 RNA를 생산하는 것을 허용한다. 따라서 과정은 형광 표지화에 사용하기 위한 최종 RNA을 제조하기 위해 시험관내 전사의 두개의 또는 3 라운드를 제공하였다.

형광 프로브는 안티센스 RNA 믹스에 대조 RNA를 먼저 첨가하고 RNA 출발 물질로부터 형광 표지 cDNA를 생산함으로써 발생되었다. 종양 RNA 샘플로부터 제조된 형광으로 표지 cDNAs는 정상 세포 RNA 샘플로부터 제조된 형광으로 표지 cDNAs에 비교되었다. 예를 들어, 정상 세포로부터 cDNA 프로브는 Cy3 형광 염료 (그린)으로 표지화되었고 종양 세포로부터 제조된 cDNA 프로브는 Cy5 형광 염료 (레드)로 표지화되었고, 반대로도 마찬가지이다.

사용된 각각의 어레이는 동일한 공간 레이아웃 및 조절 스폿 세트를 가졌다. 각각의 마이크로어레이는 두개의 영역으로 나뉘었고, 각각의 영역은 각각의 어레이위에 총 약 9,216 스폿에 대해서, 각각의 절반에, 32 x 12 스폿의 12 그룹화와 함께 어레이를 갖는다. 어레이당 각각의 클론의 적어도 두개의 부본을 제공하는 두개의 영역은 동일하게 스폿팅된다.

어레이에 사용하기 위한 폴리뉴클레오티드가 시중에서 구할수 있는 공급원과 위에서 기술한 바와 같은 선택된 세포계와 환자 조직으로부터 발생된 cDNA 라이브러리 모두로부터 얻어졌다. 이들 공급원으로부터 증폭된 약 0. 5kb 내지 2.0 kb 의 PCR 생성물은 제조업체의 추천에 따라 분자 Dynamics Gen III 스포터를 사용하여 어레이위에 스포팅되었다. 어레이에서 24 영역의 각각의 제 1 열은 4 네거티브 조절 스폿 및 8 테스트 폴리뉴클레오티드를 포함하여, 약 32 조절 스폿을 가졌다. 테스트 폴리뉴클레오티드는 2-600 pg/슬라이드로부터의 농도 범위와 1: 1의 비를 갖는 표지화 반응 전에, 각각의 샘플 안으로 스파이크되었다. 각각의 어레이 설계에 대해서, 두개의 슬라이드를 표지화 반응에서 역-표지된 테스트 샘플로 잡종화하였다. 이것은 각각의 클론에 대해서 약 4 부본 측정, 각각의 샘플에 대해서 한 색상의 두개와 나머지의 두개를 제공하였다.

분화 발현 분석법은 동일한 환자의 종양 세포와 정상 세포로부터 동일한 양의 프로브를 혼합함으로써 수행되었다. 어레이는 배양에 의해 약 2 시간동안 60℃에서 5X SSC/0.2% SDS/1 mM EDTA에서 미리잡종화되었고, 그후 물에서 3 번 세척하였고 아이소프로판올에서 두번 세척하였다. 어레이의 미리부합화 후에, 프로브 혼합물은 높은 엄중한 조건하에서(밤새 42℃에서 50% 포름아미드, 5X SSC, 및 0.2% SDS 중) 그후 어레이로 잡종화되었다. 부합화후에, 어레이는 다음과 같이 55°C에서 3 회 세척되었다: 1) 먼저 1X SSC/0.2% SDS에서 세척; 2) 0. 1X SSC/0.2% SDS 제 2 세척; 및 3) 0. 1X SSC에서 세번째 세척.

어레이는 그후 분자 Dynamics Generation III 이중 칼라 레이저-스캐너/검출기를 사용하여 그린 및 레드 형광에 대해서 스캐닝되었다. 이미지는 BioDiscovery Autogene 소프트웨어 및 각각의 스캔 세트로부터 정상에 비해 발현의 비를 제공하기 위해 표준화된 데이타를 사용하여 가공되었다. 마이크로어레이 실험으로부터의 데이타는 U. S. 출원 일련 no. 60/252,358, E. J. Moler, M. A. Boyle, and F. M. Randazzo에 의해 2000년 11월 20일 출원, 및 표제 "cDNA 마이크로어레이 데이타에서의 정밀도 및 정확도"에서 기술된 알고리즘에 따라 분석되었고, 이 출원은 참조에 의해 본원에 특이적으로 포함된다.

실험을 반복하였고, 이 시간에 "색상 지시" 둘다에서 분석법을 수행하기 위해 반대색상으로 두개의 프로브를 표지화한다. 각각의 실험은 때때로 두개 이상의 슬라이드로 반복되었다(각각의 색상 지시에서 하나). 어레이에서 각각의 서열에대한 수준 형광은 4 어레이로부터 8 복제본 스폿/유전자의 기하학적 수단의 비 또는 2 어레이로부터의 4 복제본 스폿/유전자 또는 일부 다른 변경으로서 발현하였다. 데이타는 각각의 부본 영역에 존재하는 스파이크된 양성 대조군을 사용하여표준화되었고, 이 표준화의 정밀도를 각각의 분화의 중요성의 최종 결정에 포함시켰다. 각각의 스폿의 형광 강도는 또한 어느 스폿이 각각의 샘플에서 상당한 발현 수준을 검출했는지를 결정하기 위해 각각의 부본 영역에서 네거티브 대조군에 비교되었다.

형광 강도의 통계적인 분석은 각각의 분화 측정의 정밀도 및 중요성을 평가하기 위해 부본 스폿의 각각의 세트에 적용되었고, 그 결과 각각의 환자의 종양과 정상 샘플 사이의 발현 수준에서 차이가 없다는 무효의 가설을 테스트하는 p-값을 야기하였다. 마이크로어레이의 초기 분석 동안에, 만약 p > 10^{- 3} 이면 가설은 수용되었고, 분화 비는 그러한 스폿에 대해서 1.000으로 세팅되었다. 모든 다른 스폿은 종양과 정상 샘플 사이에 발현에서 상당한 차이를 가진다. 만일 종양 샘플 은 검출가능한 발현을 가지고 정상은 그렇지 않다면, 정상 샘플에서 발현에 대한 값은 0이 될 것이고, 비는 수학적으로 유용한 값(예를 들어, 무한대)이 되지 않을 것이므로, 비는 1000에서 절단된다. 만일 정상 샘플이 검출가능한 발현을 가지고 종양은 그렇지 않다면, 종양 샘플에서 발현에 대한 값이 0이 될 것이고 비는 수학적으로 유용한 값이 되지 않을 것이므로, 비는 0.001으로 절단된다. 이들 후자의 두가지 상황은 본원에서 "온/오프."라고 부른다.

실시예 3: 세포에서 TFF3 의 발현

암에서 TFF3 mRNA 상향조절

종양 샘플로부터 암 세포와 인접한 정상 세포를 각각의 암 환자 샘플로부터 레이저-Capture 마이크로-절개에 의해 수집하였다(조직 샘플의 공급원에 대해 실시예 1 참조). 표지 프로브는 각각의 샘플의 RNA로부터 제조되었고 프로브 cDNA 마이크로어레이 칩 (실시예 2 참조)에 사용되었다. 각각의 마이크로어레이 칩은 동시에 정상과 암 프로브로 개별적인 환자에 대해서 잡종화되었다(정상 및 암은 다른 형광 시약으로 표지화되었다). 각각의 환자 샘플에 대해 정상 세포에서 발현보다 암에서의 발현의 비로서 발현 수준을 결정하였다. 표 3은 테스트된 환자의 적어도 20% 에서 정상 상피 세포보다 암에서 발현 비는 2-배 보다 더높고(>2x), 5-배보다 더높고 (>5x) 또는 1/2보다 더 낮은 (<0. 5x), 환자의 퍼센트를 지시한다.

TFF3 의 정상 조직 발현

전체 조직에서 TFF3의 발현 mRNA은 (예를 들어, 레이저-캡쳐 절개된 샘플이 아니고, 따라서 조직 샘플에서 모든 세포 타입을 나타낸다), 정상 (N)과 암 (C) 둘다, 실시간 정량 PCR에 의해 결정되었다. 결과를 도 1에 도시하고 값을 전체 조직에서 HPRT에 표준화한다. y-축 위에서 mRNA 발현의 수준에 대한 값은 표준화 대조군으로서 HPRT을 사용하여, 상대적인 수이다. 암 샘플은 8명의 개별적인 환자로부터 종양 샘플의 풀을 나타낸다(생물학적 재료의 공급원에 대해 실시예 1 참조 ). 명명법 "3+3"은 Gleason 등급 6을 말하고 "4+3"는 Gleason 등급 7을 말한다. 또한 정상 폐에서 (결장에서와 같이), TFF3는 술잔세포에 의해 발현되고 점액이 분비된다는 것을 주목한다 (참조, 예를 들어, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 1999, 159, 1330).

암환자에서 TFF3 의 면역조직화학 (IHC) 검출

개별적인 유방, 결장, 난소, 및 전립샘암 (CA) 환자 및 정상 조직 카운터파트 (NL)에 대한 조직 샘플 섹션은 (조직의 총 #) 사람 TFF3에 대한 면역친화력 정제된 토끼 다클론 항체로 염색되었다. 게다가, 몇가지 생체 정상 기관에 대한 샘플을 염색하였다. 각각의 카테고리에서 TFF3 포지티브 샘플의 퍼센트는 물론이고, TFF3의 존재에 대해 네거티브 (-) 및 포지티브 (+)인 샘플의 수가 표 4에 제공된다.

세포계에서 TFF3 의 발현

특정한 세포계에서 TFF3의 발현 mRNA은 실시간 정량 PCR에 의해 결정되었다. 결과가 도 2에 제공된다. 발현의 수준에 대한 값은 표준화 대조군으로서 β-액틴을 사용하는 상대적인 수이다. 또한 y-축은 대수 스케일이고, 이는 TFF3 발현이 매우 큰 마진에 의해 세포계에서 변했다는 것을 암시한다는 것을 주목하라. 세포계는 HUVEC (사람 Umbilical Vein 내피 세포), BMEC-1 (뇌 마이크로혈관 내피 세포), Du145 (사람 전립샘암종 세포), PC3 (사람 전립샘암종 세포), LnCap (사람 전립샘암종 세포), MDAPca2B (사람 전립샘암종 세포), 22rV1 (사람 전립샘암종 세포), HPV7 (사람 전립샘암종 세포), HPV10 (사람 전립샘암종 세포), RWPE-1 (사람 전립샘 상피 세포), RWPE-2 (악성의 사람 전립샘 상피 세포), PrEC (사람 전립샘 상피 세포), NIH 3T3 (섬유모세포), HT29 (사람 결장암종), SW620 (사람 결장암종), Colo320 (사람 결장암종), MDA231 (유방암), MDA435 (유방암), 및 MCF7 (유방암)을 포함하였다.

실시예 4: 유전자 발현의 안티센스 조절

암 세포에서 폴리뉴클레오티드에 의해 표시된 분화하여 발현된 유전자의 발현은 종양생성에서 예를 들어, 전이 페노타입을 촉진하는데 있어서, 유전자 생성물의 역할과 기능을 확인하기 위해 안티센스 녹아웃 기술을 사용하여 분석될 수 있다.

본원에서 확인된 분화하여 발현된 유전자에 의해 발생된 mRNA와 상보성인 많은 다른 올리고뉴클레오티드는 잠재적 안티센스 올리고뉴클레오티드로서 설계될 수 있고, 그들이 유전자의 발현을 억제하는 능력에 대해 테스트된다. 각각의 후보 표적에 특이적인 안티센스 올리고머의 세트는 분화하여 발현된 유전자에 해당하는 폴리뉴클레오티드의 서열 및 소프트웨어 프로그램 HYB시뮬레이터 버전 4 (Windows 95/Windows NT용 또는 Power Macintosh용, RNAture, Inc. 1003 Health Sciences Road, West, Irvine, CA 92612 USA)를 사용하여 설계된다. 안티센스 올리고뉴클레오티드를 설계할때 고려되는 인자는 다음을 포함한다: 1) 올리고뉴클레오티드의 제 두번째 구조 ; 2) 표적 유전자의 제 두번째 구조 ; 3) 다른 발현된 유전자에 대한 교차-부합화가 없거나 최소인 특이성 ; 4) 안정성; 5) 길이 및 6) 종말 GC 함량. 안티센스 올리고뉴클레오티드는 생리적 온도에서 매우 엄중한 조건하에서 그것이 그것의 표적 서열로 잡종화할 수 있도록 설계되지만(예를 들어, 배양에서 세포를 위한 최적의 온도는 세포에서 부합화를 제공함, 예를 들어, 약 37°C), 호모다이머의 최소 형성을 가진다.

올리고머 및 HYB시뮬레이터 프로그램의 세트를 사용하여, 3 내지 10 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그들의 역 조절은 각각의 후보 mRNA 전사에 대해서 설계되고 합성되고, 그 전사는 관심의 표적 폴리뉴클레오티드 서열에 해당하는 유전자로부터 얻어진다. 일단 합성되고 정량되면, 올리고머는 암 세포계의 패널에서 전사 녹-아웃의 효율에 대해 스크리닝된다. 녹-아웃의 효율은 라이트사이클러 정량화를 사용하여 mRNA 수준을 분석함으로써 결정된다. 그 수준이 적어도 약 50%, 바람직하게는 약 80-90%, 95%이하 또는 이상 검출불가능한 메세지까지인, 전사 녹-아웃의 가장 높은 수준을 초래한 올리고머는 세포-기반 증식 분석법, 고정 독립적인 성장 분석법, 및 세포자멸사 분석법에서 사용을 위해 선택된다.

각각의 설계된 안티센스 올리고뉴클레오티드가 유전자 발현을 억제할 수 있는 능력은 트랜스펙션를 통해 LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b, 또는 DU145 전립샘암종 세포로 테스트될 수 있다. 각각의 트랜스펙션 혼합물에 대해서, 담체 분자 (지질, 지질 유도체, 지질-형 분자, 콜레스테롤, 콜레스테롤 유도체, 또는 콜레스테롤-형 분자와 같은)는 물 중의 0.5 mM의 작업 농도로 제조되고, 초음파처리하여 균일한 용액을 얻고, 0.45 μm PVDF 막을 통해 여과한다. 안티센스 또는 대조군 올리고뉴클레오티드는 그후 무균 Millipore 물중의 100 uM 의 작업 농도까지 제조된다. 올리고뉴클레오티드는 더나아가 마이크로퓨지 튜브에서 OptiMEMTm (Gibco/BRL)에서 2 μM, 또는 대략 20 ig 올리고/ml의 OptiMEM까지 희석된다. 개별적인 마이크로퓨지 튜브에서, 담체 분자는, 전형적으로 약 1.5-2 nmol 담체/g 안티센스 올리고뉴클레오티드의 양으로, 올리고뉴클레오티드를 희석하기 위해 사용된 동일한 부피의 OptiMEMTM 안으로 희석된다. 희석된 안티센스 올리고뉴클레오티드는 즉시 희석된 담체에 첨가되고 위 아래로 피펫함으로써 혼합한다. 올리고뉴클레오티드는 세포에 최종 농도 30 nM까지 첨가된다.

트랜스펙트된 세포에서 관심의 표적 유전자에 해당하는 표적 mRNA의 수준은 Roche LightCycler^TM 실시간 PCR 기계 또는 PerkinElmer GeneAmp 기계를 사용하여 암 세포계에서 정량된다. 표적 mRNA에 대한 값은 내부 대조군에 대해서 (예를 들어, 베타-액틴) 표준화된다. 각각의 20 μl 반응을 위해서, 추출된 RNA (일반적으로 0.2-1 μg 총)은 무균 0.5 또는 1.5 ml 마이크로원심분리 튜브 안에 놓이고, 물을 전체 부피 12.5 μl로 첨가한다. 각각의 튜브에 7.5 μl의 완충액/효소 혼합물을 첨가하고, (나열된 순서로) 2.5 μl H20, 2.0 μl 10X 반응 완충액, 10 μl 올리고 dT (20 pmol), 1.0 μl dNTP mix (10 mM 각각의), 0.5 μl RNAsin® (20u) (Ambion, Inc. , Hialeah, FL), 및 0.5 μl MMLV 역 전사효소 (50u) (Ambion, Inc. )를 혼합함으로써 제조된다. 내용물은 피펫 위아래로 혼합하고, 반응 혼합물은 42°C에서 1시간동안 배양한다. 각각의 튜브의 내용물은 증폭하기 전에 원심분리한다.

증폭 혼합물은 다음 순서로 혼합한다: 1X PCR 완충액 II, 3 mM MgCl₂, 140 μM 각각의 dNTP, 0.175 pmol 각각의 올리고, 1: 50,000 dil의 SYBRO® 그린, 0.25 mg/ml BSA, 1 유닛 Taq 폴리머라아제, 및 H20 내지 20 wl. (PCR 완충액 II 은Perkin-Elmer, Norwalk, CT로부터 1OX 농도에서 이용가능하다). 1X 농도에서 그것은 10 mM 트라이 pH 8.3 및 50 mM KCI을 함유한다. SYBRO® 그린 (분자 프로브, Eugene, OR)은 이중 가닥 DNA에 결합될 때 형광을 내는 염료이다. 이중 가닥 PCR 생성물이 증폭하는 동안 생성되기 때문에, SYBRO 그린으로부터의 형광은 증가한다. 증폭 혼합물의 각각의 20 μl 알리콧에, 2 μl의 템플레이트 RT를 첨가하고, 증폭 을 표준 프로토콜에 따라 수행된다. 결과는 비-트랜스펙트 세포, 매개체-만 트랜스펙트된 (모의-트랜스펙트) 세포, 또는 역 대조군 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙트된 세포에 비해, 대응하는 유전자 생성물의 발현에서 퍼센트 감소로서 표현된다.

실시예 5: TFF3 발현의 안티센스 조정

안티센스 올리고뉴클레오티드

몇가지 안티센스 (AS) 올리고뉴클레오티드를 설계하였고, 제조하고, 실시예 4에서 수행된 과정 세트에 따라 SW620 세포 (높은 수준의 TFF3)를 발현하는 결장암 세포계)에서 TFF3 mRNA 수준을 조절하는 그들의 능력을 테스트하였다. 올리고뉴클레오티드는 상기 표 1에 제공된다. 비교적 높은 정도의 녹다운 활성을 갖는 안티센스 올리고뉴클레오티드는 SEQ ID NO: 9,10, 15,16, 17 및 18을 갖는 것들을 포함하였다. 이들중 각각에 대해서, 역 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드를 대조군으로서 (RC) 사용하기 위해 합성하여 안티센스 특이성을 보여주었다.

AS을 사용하여 TFF3 mRNA 의 녹다운

TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드의 유효성을 각각의 올리고뉴클레오티드를 SW620 세포로 트랜스펙트하고 실시간 정량 PCR을 사용하여, 트랜스펙션후 약 36 시간에서 남아있는 TFF3 mRNA 수준을 측정함으로써 테스트하였다.

도 3은 SEQ ID NO: 9-18에 해당하는 AS 올리고뉴클레오티드의 초기 스크리닝의 결과를 도시한다. AS SEQ ID NO: 9 및 10에 해당하는 올리고뉴클레오티드가 가장 효과적인 것으로 나타났다. 대조군 1 및 대조군 2로서 지정된 AS 올리고뉴클레오티드는 관련없는 AS 서열을 나타내고 TFF3 mRNA의 특이적 녹다운을 평가하기 위한 대조군으로서 역할을 한다.

도 4와 5는 SEQ ID NO: 9,10 및 15 에 해당하는 AS 올리고뉴클레오티드 대 그들의 역 대조군 (RC)의 비교의 결과를 도시한다. 볼 수 있듯이, AS 올리고뉴클레오티드는 원하는 특이성으로 작용하는 것으로 나타났다.

도 6는 더나아가 TFF3 mRNA 발현의 녹다운에서 SEQ ID NO: 10,15, 17 및 18 에 해당하는 AS 올리고뉴클레오티드의 유효성을 도시한다. 용어 "UT"는 트랜스펙트되지 않은 SW620을 표시한다.

실시예 6: 증식에 대한 발현의 효과

세포 증식의 억제에 대한 유전자 발현의 효과는 전이 유방암 세포계 (MDA-MB-231 ("231")) ; SW620 결장 직장결장암종 세포; SKOV3 세포 (사람 난소 암종 세포계); 또는 LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b, 또는 DU145 전립샘암 세포에서 평가될 수 있다.

세포는 96-웰 접시에서 대략 60-80% 컨플루언시로 플레이팅된다. 안티센스 또는 역 대조군 올리고뉴클레오티드는 OptiMEM^TM중에 2 μM로 희석시킨다. 올리고뉴클레오티드-OptiMEM^TM는 그후 송달 매개체로 첨가될 수 있고, 이 송달 매개체는 분석법에서 사용되는 특정 세포 타입에 대해 최적화되기 위해서 선택될 수 있다. 올리고/송달 매개체 혼합물은 그후 세포에서 혈청으로 배지 안으로 더욱 희석된다. 올리고뉴클레오티드의 최종농도는 모든 실험에 대해서 약 300 nM가 될 수 있다.

안티센스 올리고뉴클레오티드는 위에서 기술한 바와 같이 제조된다(실시예 4 와 5 참조). 세포는 밤새 37°C에서 트랜스펙션되고 트랜스펙션 혼합물은 신선한 배지로 다음날 아침 교체된다. 트랜스펙션을 실시예 4 와 5에서 위에서 기술한 바와 같이 수행한다.

SW620 세포의 증식의 억제를 초래하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대응하는 유전자가 암 결장 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에서 한 역할을 한다는 것을 지시한다. SKOV3 세포에서 증식을 억제하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 암 유방 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에서 역할을 하는 유전자를 나타낸다. MDA-MB-231 세포의 증식의 억제를 초래하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대응하는 유전자는 암 난소 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에서 한 역할을 한다는 것을 지시한다. LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b, 또는 DU145 세포에서 증식을 억제하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 암 전립샘 세포에서 암 페노타입제조 또는 유지에서 한 역할을 하는 유전자를 나타낸다.

실시예 7: mRNA 의 고갈의 폴리펩티드의 고갈 시에 세포 죽음의 유도

세포 죽음시 표적 메세지의 고갈의 효과를 평가하기 위하여, LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b, 또는 DU145 세포, 또는 관심의 암으로부터 유도된 다른 세포 는, 증식 분석법을 위해 트랜스펙트될 수 있다. 시스플라틴 (cis)의 존재하에서 세포독성 효과를 위해, 동일한 프로토콜은 이어지지만 2 μM 약물의 존재하에서 세포가 남아있다. 각각의 날, 세포독성은 막 손상으로 인해 배지에 방출된 LDH 효소의 양을 측정함으로써 모니터링된다. LDH 의 활성은 Roche Molecular Biochemicals로부터의 세포독성 검출 키트를 사용하여 측정된다. 배지에서 방출된 LDH vs. 동일한 시점 및 치료에 웰에 존재하는 총 LDH (rLDH/tLDH)의 비로서 데이타가 제공된다. BCL2 (공지된 항-세포고사 유전자)에 대한 안티센스 및 역 대조군 올리고뉴클레오티드를 사용하는 양성 대조군이 포함된다; BCL2에 대한 메세지의 손실은 대조군 올리고뉴클레오티드로 치료와 비교된 세포 죽음에서의 증가를 초래한다 (트랜스펙션으로 인한 백그라운드 세포독성).

실시예 8 : TFF3 안티센스의 세포독성 및 항-증식 활성

암 세포에서의 효과

TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드의 세포독성 및 항-증식 효과는 AS 및 RC 올리고뉴클레오티드의 트랜스펙션 후에 다른 시점에서 실시예 6 및 7의 과정에 따라서 SW620 세포에서 테스트되었다(실시예 4 및 5).

총 LDH 위에서 배양 배지 안으로 방출된 LDH (락테이트 데히드로게나아제)의 비를 측정함으로써 세포독성을 결정하였다. 증식은 무손상 점착성 세포에서 LDH 수준에 의해 지시되었다. 양성 대조군으로서, Bcl-2 특이적 안티센스는 또한 트랜스펙트되었다. Bcl-2는 공지된 항-세포고사 단백질이고 이 유전자의 차단된 발현은 증가된 세포자멸사를 초래한다. 결과를 도 7에서 도시한다.

세포독성 효과는 또한 다른 배양 조건 하에서 전립샘암 세포 (Pca2B)에서 관찰되었다. 도 8에서 결과를 도시한다. 전립샘암 세포계 CU145 및 22Rvl에 대해 유사한 결과를 얻었다. PC3 및 LNCaP 세포에서 더 약한 효과가 관찰되었다. TFF3의 발현을 억제하는 것으로 알려진 안티센스 올리고뉴클레오티드 및 그것의 역 서열 은 대조군으로서의 역할을 한다.

정상 세포

TFF3을 발현하지 않는 정상 섬유모세포 (MRC9) 및 정상 유방 상피 세포 (184B5)는 대조군 세포로서 AS 올리고뉴클레오티드의 비-특이적 세포독성 효과에 대해서 테스트하기 위해 사용되었다. 결과는 도 9에 도시된다. 이들 결과는 TFF3 AS의 효과가 TFF3을 발현하는 세포에 특이적이고 AS 올리고뉴클레오티드의 일반적인 독성으로 인한 것이 아니라는 것을 암시한다.

실시예 9: 세포 이동에 대한 유전자 발현의 효과

세포 이동의 억제에 대한 유전자 발현의 효과는 정적 내피 세포 결합 분석법, 비-정적 내피 세포 결합 분석법, 및 트랜스이동 분석법을 사용하여 LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b, 또는 DU145 전립샘암 세포에서 평가되었다.

정적 내피 세포 결합 분석법을 위해서, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 위에서 기술한 바와 같이 제조된다 (실시예 4와 5 참조). 사용하기 이틀 전에, 전립샘암 세포 (CaP)를 플레이팅하고 위에서 기술한 바와 같은 안티센스 올리고뉴클레오티드로 트랜스펙트된다 (실시예 4 및 5 참조). 사용하기 전날에, 배지를 신선한 배지로 교체하고, 사용하는 날, 배지는 2 μM CellTracker 그린 CMFDA (분자 프로브s, Inc. )을 함유하는 신선한 배지로 교체하고, 세포를 30분동안 배양한다. 배양후에, CaP 배지를 신선한 배지 (CMFDA없음)로 교체하고 세포를 추가의 30-60분 동안 배양한다. CaP 세포는 CMF PBS/2.5 mM EDTA 또는 트립신을 사용하여 분리하고, 스핀하고 DMEM/1% BSA/10 mM HEPES pH 7.0에 재현탁시킨다. 최종적으로, CaP 세포를 계수하고 1x10⁶ 세포/ml의 농도에서 재현탁시킨다.

내피 세포 (EC)는 사용하기 3일 전에 40-50% 합류에서 96-웰 플레이트 위에 플레이팅한다. 사용하는 날, EC를 PBS로 1X 세척하고 50λ DMDM/1% BSA/lOmM HEPES pH 7를 각각의 웰에 첨가한다. 각각의 웰에 그후 DMEM/1% BSA/lOmM HEPES pH 7중의 50K (50λ) CaP 세포를 첨가한다. 플레이트를 추가의 30 min동안 배양하고 Ca⁺⁺ 및 Mg⁺⁺를 함유하는 PBS로 5X 세척한다. 최종 세척후에, 100 I1L PBS를 각각의 웰에 첨가하고 형광은 형광 플레이트 판독기 (Ab492/Em 516 nm)에서 판독한다.

비-정적 내피 세포 결합 분석법을 위해, CaP는 위에서 기술한 바와 같이 제조한다. EC는 30-40% 합류에서 사용하기 3일 전에 24-웰 플레이트 위에 플레이팅한다. 사용하는 날, EC의 서브셋은 6시간동안 사이토킨으로 처리하고 그후 PBS으로 2X 세척한다. 각각의 웰에 그후 DMEM/1% BSA/lOmM HEPES pH 7 중의 150-200K CaP 세포를 첨가한다. 플레이트는 30분 동안 회전 셰이커 (70 RPM)위에 놓고 그후 Ca 및 Mg++을 함유하는 PBS로 3X 세척한다. 최종 세척후에, 500 gL PBS를 각각의 웰에 첨가하고 형광을 형광 플레이트 판독기에서 (Ab492/Em 516 nm) 판독한다.

트랜스이동 분석법을 위해, CaP를 하기의 변화와 함께 위에서 기술한 바와 같이 제조한다. 사용하는 날, CaP 배지는 5 μM CellTracker 그린 CMFDA (분자 프로브s, Inc.)을 함유하는 신선한 배지로 교체하고 세포를 30분 동안 배양한다. 배양후에, CaP 배지를 신선한 배지 (CMFDA 없음)로 교체하고 추가의 30-60분동안 세포를 배양한다. CaP 세포를 CMF PBS/2.5 mM EDTA 또는 트립신을 사용하여 분리시키고, 회전하고 EGM-2-MV 배지에 재현탁시킨다. 최종적으로, CaP 세포를 계수하고 1x10⁶ 세포/ml의 농도에서 재현탁시킨다.

EC를 사용전 5-7일에 30-40% 합류에서 FluorBlok 트랜스웰 (BD Biosciences) 위에 플레이팅한다. 배지는 사용하기 3일 전에 신선한 배지로 교체한다. 각각의 트랜스웰에 그후 50K 표지 CaP를 첨가한다. 제 1 형광 판독 30분 전에, 10μg의 FITC-덱스트란 (1OK MW)을 EC 플레이트화 필터에 첨가한다. 형광을 그후 형광 플레이트 판독기 (Ab492/Em 516 nm)에서 다중 시점에서 판독한다.

LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b, 또는 DU145 전립샘암 세포의 내피 세포에 대한 결합의 억제를 야기하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대응하는 유전자가 아마도 암 전립샘 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에서 한 역할을 한다는 것을 암시한다. LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA- PCA-2b, 또는 DU145 전립샘암 세포에 의해 내피 세포 트랜스이동의 억제를 초래하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대응하는 유전자가 아마도 암 전립샘 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에서 한 역할을 한다는 것을 암시한다.

실시예 10: 콜로니 형성에 대해 유전자 발현의 효과

SW620 세포, SKOV3 세포, MD-MBA-231 세포, LNCaP 세포, PC3 세포, 22Rvl 세포, MDA-PCA-2b 세포, 및 DU145 세포의 콜로니 형성에 대한 유전자 발현의 효과는 연한 한천 분석법에서 테스트될 수 있다. 먼저 세포 위에 층상화의 몇 시간내에 매질 플레이트된 신선 중의 2 ml의 0.6% 한천의 바닥층을 성립함으로써 연한 한천 분석법을 수행한다. 세포 층은 위에서 기술한 바와 같이 트렌스펙트된 세포를 0.05% 트립신을 사용하여 플레이트로부터 제거하고 매질에서 두번 세척함으로써 바닥층위에 형성된다. 세포를 Coulter 카운터에서 계수하고, 매질중에 ml 당 106 으로 재현탁시켰다. 10μl 알리콧을 매질과 함께 96-웰 플레이트 (WST1으로 카운팅을 체크하기 위해)에 놓고, 또는 연한 한천 분석법을 위해 더욱 희석시킨다. 2000 세포를 0.6% 한천 바닥층 위에 부본 웰에서 800 μl 0.4% 한천에서 플레이팅한다. 세포 층 한천가 고화된 후에, 2 ml의 매질을 꼭대기에 똑똑 떨어뜨리고 안티센스 또는 역 대조군 올리고 (실시예 3에서 기술한 바와 같이 제조됨)를 송달 매개체 없이 첨가한다. 신선한 매질과 올리고를 매 3-4일 첨가한다. 콜로니는 10일 내지 3 주 후에 형성된다. 콜로니의 필드를 눈으로 계수한다. Wst-1 대사작용 값은 시작 세포 수에서 작은 차이를 보상하기 위해 사용될 수 있다. 더 큰 필드는 차이의 시각 기록을 위해 스캐닝될 수 있다.

SW620 세포의 콜로니 형성의 억제를 야기하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대응하는 유전자가 암 결장 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에서 한 역할을 한다는 것을 암시한다. SKOV3 세포에서 콜로니 형성을 억제하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 암 유방 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에서 한 역할을 하는 유전자를 나타낸다. MDA- MB-231 세포의 콜로니 형성의 억제를 초래하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 대응하는 유전자가 암 난소 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에 있어서 한 역할을 한다는 것을 암시한다. LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b, 또는 DU145 세포에서 콜로니 형성을 억제하는 그러한 안티센스 올리고뉴클레오티드는 암 전립샘 세포에서 암 페노타입의 제조 또는 유지에서 한 역할을 하는 유전자를 나타낸다.

실시예 11: 암 세포의 고정-독립 성장의 안티센스 억제

전립샘암 세포계 MDA Pca-2b 는 TFF3 안티센스 올리고뉴클레오티드로 트랜스텍트되었다 (도 10에서 지시된 바와 같음; 안티센스 조제품의 설명을 위해 실시예 4 및 5 참조). 웰당 1000 또는 500 세포 (도 10에서 지시된 바와 같음)를 96-웰 플레이트에서 배양하고 7일동안 연한 한천 함유 매질중의 현탁액에서 성장시킨다. 연한 한천 세포 콜로니의 성장을 세포에 의한 Alamar 블루의 합일화에 의해 측정하였다. 결과는 대조군 AS (C79-7)와 TFF3 AS 올리고뉴클레오티드(각각의 RC 올리고뉴클레오티드가 아님)둘다 이 전립샘암 세포계의 고정 독립적인 성장을 억제했다는 것을 암시한다. 전립샘암 세포계 PC3에 대해서 유사한 결과를 얻었다.

실시예 12: 환자에서 전립샘암 에서 분화하여 발현된 유전자 생성물의 기능적 분석

암 세포에서 분화하여 발현된 유전자의 서열의 유전자 생성물 (TFF3와 같음) 은 예를 들어, 전이 페노타입의 발전을 촉진하거나 억제하는데 있어서, 종양생성에서 유전자 생성물의 역할과 기능을 확인하기 위해서,더욱 분석될 수 있다. 예를 들어, 본원에서 확인된 유전자에 해당하는 유전자 생성물의 기능은 세포에서 유전자 생성물의 기능을 차단함으로써 평가될 수 있다. 예를 들어, 유전자 생성물이 분비되거나 또는 세포 표면 막과 연합되는 경우, 차단 항체가 발생될 수 있고 세포 페노타입에 대한 효과, 예를 들어, 암, 특히 전이, 페노타입으로 세포의 변형을 검사하기 위해 세포에 첨가될 수 있다. 항체를 생성하기 위해, 선택된 유전자 생성물에 해당하는 클론을 선택하고, 부분적인 또는 완전한 코딩 서열을 나타내는 서열이 얻어진다. 결과의 클론은 발현되고, 제조된 폴리펩티드는 분리되고, 항체가 발생된다. 항체는 그후 세포와 조합되고 종양생성에 대한 효과가 평가되었다.

본원에서 확인된 분화하여 발현된 유전자의 유전자 생성물이 공지된 기능의 단백질(예를 들어, 특이적 키나아제 또는 프로테아제에)과 및/또는 공지된 기능의 단백질 패밀리(예를 들어, 프로테아제 패밀리 또는 키나아제 패밀리에 존재하는 영역 또는 다른 일치 서열을 함유하는)와 상동인 서열을 나타내고, 그후 유전자 생성물의 활성은 물론이고, 종양생성에서 유전자 생성물의 역할은 대응하는 단백질 또는 단백질 패밀리의 기능을 억제하고 강화하는 작은 분자를 사용하여 검사될 수 있다.

추가의 기능 분석법은 이것으로 제한될 필요는 없지만, 세포 주기 및 세포 이동에 대한 대응하는 유전자의 발현의 효과를 분석하는 것들을 포함한다. 그러한 분석법을 수행하기 위한 방법은 당업계에 잘 알려져있다.

실시예 13: Contig 어셈블리 및 추가의 유전자 특성화

본 발명에서 제공된 폴리뉴클레오티드의 서열은 (예를 들어, TFF3) 폴리뉴클레오티드가 해당하는 유전자의 서열 정보를 확장하기 위해 사용될 수 있다 (예를 들어, 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드의 서열을 갖는, 유전자, 또는 유전자에 의해 인코딩된 mRNA). 이렇게 확장된 서열 정보는 차례로 더나아가 대응하는 유전자를 특징짓는데 사용될 수 있고, 이것은 차례로 유전자 생성물의 성질에 대한 추가의 정보를 제공한다 (예를 들어, 유전자 생성물의 정상 기능). 추가의 정보는 치료 표적으로 사용된 유전자 생성물의 추가의 증거를 제공하는 역할을 할 수 있고 , 그것의 활성을 조절할 수 있는 약제의 타입에 대한 지침을 더욱 제공한다.

하나의 예에서, 콘티그는 본 발명의 폴리뉴클레오티드의 서열을 사용하여 조립되고, 이것은 클론에 존재한다. "콘티그"는 겹치는 (예를 들어, 공유되거나 또는 실질적으로 유사한) 서열 정보를 갖는 핵산 서열로부터 조립되는 뉴클레오티드의 인접 서열이다. 공개적으로 이용가능한 ESTs (Expressed Sequence Tags)의 서열 및 Chiron에서 합성된 몇가지 cDNA 라이브러리로부터 다양한 클론의 서열은 콘티그 어셈블리에서 사용될 수 있다.

콘티그는 제조업체의 지시사항에 따라 소프트웨어 프로그램 Sequencher, 버전 4.05을 사용하여 조립되고, 콘티그 서열의 개략 정렬이 제조된다. 콘티그 어셈블리에서 얻어진 서열 정보는 그후 Sequencher 프로그램을 사용하여 콘티그로부터 유도된 일치 서열을 얻기 위해 사용된다. 일치 서열은 aDGTI DoubleTwist 유전자 Index의 TeraBLASTN 연구에서 쿼리 서열로 사용되고(DoubleTwist, Inc., Oakland, CA), 이것은 공개 데이타베이스에서 모든 EST 및 중복되지 않은 서열을 함유한다.

콘티그 어셈블리와 소프트웨어 프로그램을 검색하는 상동성의 사용을 통해서 본원에서 제공된 서열 정보가 쉽게 확장되어 본 발명에 기술된 폴리뉴클레오티드의 서열을 갖는 유전자를 확인 또는 예측되는 유전자를 할 수 있다. 더나아가 얻어진 정보는 본원에서 기술된 폴리뉴클레오티드에 해당하는 유전자의 유전자 생성물의 기능을 확인하는데 사용될 수 있다 .

본 발명의 실행에 필요하지는 않지만, 대응하는 유전자의 기능의 동정은, 그것의 활성을 조절하고 암 페노타입을 조절하는 (예를 들어, 전이, 증식, 등을 억제함) 유전자를 표적화하는 치료제의 설계에서 지침을 제공할 수 있다.

실시예 14: TFF3 중화제의 생체내 테스트

TFF3 중화제는 약물 후보의 예비-임상적인 평가를 위해 당업계에 공지된 과정에 따라 동물 모델에서 항-종양 활성에 대해 테스트될 수 있다. 적절한 동물 모델은 전립샘암에 대한 TRAMP 마우스 (사람 암 Consortium Repository 또는 The Jackson Laboratory의 NCI-Frederick 마우스 모델로부터 이용가능함)과 결장암에 대한 Min 마우스 (The Jackson Laboratory로부터 이용가능함)를 포함한다. 다른 암에 대한 동물 모델은 당업계에 잘 알려져있다.

실시예 15: TFF3 에피토프

항체 인식 및 조제품에 대해 TFF3의 선형 에피토프는 수많은 당업계에 공지된 방법중 어떤 것에 의해 확인될 수 있다. 일부 실시예 방법은 항원의 아미노산 서열로부터 유도된 펩티드의 프로빙 항체-결합 능력을 포함한다. 결합은 BIACORE 또는 ELISA 방법을 사용함으로써 평가될 수 있다. 다른 기술은 평면 고체 지지체 ("칩")위에서 펩티드 라이브러리를 항체에 노출시키고 고상 스크리닝에서 사용된 다중 방법중 어떤 것을 통해 결합을 검출하는 것을 포함한다.

추가적으로, 파지 표시는 바이오플래닝 몇 라운드 후에 에피토프의 선택과 함께 펩티드의 라이브러리를 스크리닝하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따라 적절한 항체 중화제는 선형 또는 배좌 에피토프, 또는 그것의 조합을 인식할 수 있다.

아래 표 5는 항-TFF3 항체에 의해 인식에 적절한 선형 에피토프로서 확인되었던 TFF3의 영역을 제공한다.

실시예 16: TFF3 에 대한 다클론 항체는 종양 세포 성장을 저해한다

A. 다클론 항체의 발생

뉴질랜드 알비노 토끼를 마취하고 DNA 발현 벡터 인코딩 사람 TFF3을 사용하여 0일과 28일에 면역화되었다. 특이적으로, 각각의 면역화를 위해, 0.6 mg 의 DNA 발현 벡터를 토끼당 근육내 주사하였고, 온화한 전류를 주사 부위에 간략하게 적용하여 영역에서 근육 세포에 의해 DNA의 섭취를 자극하였다. MF-59 애주번트 또는 Incomplete Freund의 애주번트 중의 하나에 유화된 재조합 사람 TFF3 단백질의 근육내 주사에 의해 토끼를 매달 추가접종하였다. 혈액 샘플을 각각의 면역화 후 14일에 취하고, 혈액 샘플로부터 발생된 혈청을 재조합 사람 TFF3 단백질에 대한 항체 반응의 역가를 결정하기 위해 ELISA 분석법으로 테스트하였다. 세라는 그후 각각의 샘플에서 IgG 항체 성분을 정화하기 위해 단백질 A 칼럼 위에서 크로마토그래피에 의해 분획되었다.

B. SW620 증식 분석법

토끼 다클론 항체가 암 세포의 생존에 영향을 줄 수 있는지 여부를 테스트하기 위해, 면역화 토끼로부터 얻어진 정제된 IgGs의 연속 희석을 웨스턴 블로팅에 의해 나타낸 암 세포계 (SW620)에 첨가하여 TFF3 단백질를 분비하였다. 이 테스트를 위해, SW620 세포를 먼저 10% 태아 솟과 혈청 (FBS)을 함유하는 성장 배지에서 600 세포/웰의 밀도로 96-웰 플레이트 안으로 접종하였다. 24시간 후에(0일), 배지를 제거하고, FBS 및 면역화 또는 예비면역 토끼로부터 다양한 농도의 IgGs 을 함유한 신선한 성장 배지를 첨가하였다. 각각의 IgG 농도를 4겹 웰에서 테스트하였다. 4일째에, 배지를 다시 플레이트로부터 제거하였고, 각각의 IgG 분획의 1% FBS 및 알리콧을 함유하는 신선한 배지를 웰에 재첨가하였다. 각각의 웰에서의 세포의 상대적인 수는 "세포 역가 하나의 용액 세포 증식 분석법" (Promega)을 사용하여 0,1, 4,5, 6 및 7일에 측정되었다.

하나의 그러한 테스트의 결과는 면역화 토끼 중 하나(토끼 707)로부터 얻어진 IgG 항체에 대해 도 11에 도시된다. 그래프는 제 1 면역화 ("Pre-면역")하기 전에, 또는 몇 라운드의 면역화 ("면역 Day 156")후에 토끼로부터 취해진 IgG을 함유하는 웰에서 7일에 검출된 증식의 양을 비교한다. "면역 Day 156" IgG를 함유하는 웰은 "Pre-면역"IgG을 함유하는 것들보다 상당히 더 적은 증식을 보여주었다.

본 발명이 그것의 특이적 구체예를 참조하여 기술되었지만, 다양한 변화가 만들어질 수 있고 등가물은 본 발명의 진정한 정신과 범위를 벗어나지 않고 치환될 수 있다는 것이 당업자들에 의해 이해되어야 한다. 게다가, 많은 변경은 특정 상황, 재료, 물질의 조성물, 프로세스, 과정 단계 또는 단계를, 본 발명의 목적, 정신과 범위에 적응시키기 위해 만들어질 수 있다. 모든 그러한 변경은 거기에 첨부된 청구항의 범위 안에 있는 것으로 의도된다.

<110> Chiron Corporation JANATPOUR, Mary J. REINHARD, Christoph GARCIA, Pablo <120> Trefoil Factor 3 (TFF3) as a Target for Anti-Cancer Therapy <130> CHIROOO3-500 (19154.005) <150> PCT/US60/493.173 <151> 2003-08-07 <150> PCT/US60/498,438 <151> 2003-08-28 <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 74 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Leu Gly Leu Val Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu 1 5 10 15 Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg 20 25 30 Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg 35 40 45 Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys 50 55 60 Pro Leu Thr Arg Lys Thr Glu Cys Thr Phe 65 70 <210> 2 <211> 73 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Leu Gly Leu Val Leu Ala Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu 1 5 10 15 Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg 20 25 30 Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg 35 40 45 Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys 50 55 60 Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe 65 70 <210> 3 <211> 80 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Ala Ala Arg Ala Leu Cys Met Leu Gly Leu Val Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu Tyr Val Gly Leu Ser Ala Arg Gly Cys 20 25 30 Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys Gly Tyr Pro His Val Thr 35 40 45 Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg Ile Pro 50 55 60 Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys Thr Phe 65 70 75 80 <210> 4 <211> 130 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Met Gln Glu Arg Thr Gly Ala Ala Thr Ala Arg Arg Glu Ser Leu Pro 1 5 10 15 Gln Ala Asn Asn Pro Glu Gln Leu Cys Lys Gln Arg Cys Ile Asn Glu 20 25 30 Ala Ser Trp Thr Met Lys Arg Val Leu Ser Cys Val Pro Glu Pro Thr 35 40 45 Val Val Met Ala Ala Arg Ala Leu Cys Met Leu Gly Leu Val Leu Ala 50 55 60 Leu Leu Ser Ser Ser Ser Ala Glu Glu Tyr Val Gly Leu Ser Ala Asn 65 70 75 80 Gln Cys Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp Cys Gly Tyr Pro His 85 90 95 Val Thr Pro Lys Glu Cys Asn Asn Arg Gly Cys Cys Phe Asp Ser Arg 100 105 110 Ile Pro Gly Val Pro Trp Cys Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys 115 120 125 Thr Phe 130 <210> 5 <211> 398 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 gatgctgggg ctggtcctgg ccttgctgtc ctccagctct gctgaggagt acgtgggcct 60 gtctgcaaac cagtgtgccg tgccggccaa ggacagggtg gactgcggct acccccatgt 120 cacccccaag gagtgcaaca accggggctg ctgctttgac tccaggatcc ctggagtgcc 180 ttggtgtttc aagcccctga ctaggaagac agaatgcacc ttctgaggca cctccagctg 240 cccctgggat gcaggctgag cacccttgcc cggctgtgat tgctgccagg cactgttcat 300 ctcagttttt ctgtcccttt gctcccggca agctttctgc tgaaagttca tatctggagc 360 ctgatgtctt aacgaataaa ggtcccatgc tccacccg 398 <210> 6 <211> 685 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6 gccaaaacag tgggggctga actgacctct cccctttggg agagaaaaac tgtctgggag 60 cttgacaaag gcatgcagga gagaacagga gcagccacag ccaggaggga gagccttccc 120 caagcaaaca atccagagca gctgtgcaaa caacggtgca taaatgaggc ctcctggacc 180 atgaagcgag tcctgagctg cgtcccggag cccacggtgg tcatggctgc cagagcgctc 240 tgcatgctgg ggctggtcct ggccttgctg tcctccagct ctgctgagga gtacgtgggc 300 ctgtctgcaa accagtgtgc cgtgccagcc aaggacaggg tggactgcgg ctacccccat 360 gtcaccccca aggagtgcaa caaccggggc tgctgctttg actccaggat ccctggagtg 420 ccttggtgtt tcaagcccct gcaggaagca gaatgcacct tctgaggcac ctccagctgc 480 ccccggccgg gggatgcgag gctcggagca cccttgcccg gctgtgattg ctgccaggca 540 ctgttcatct cagcttttct gtccctttgc tcccggcaag cgcttctgct gaaagttcat 600 atctggagcc tgatgtctta acgaataaag gtcccatgct ccacccgagg acagttcttc 660 gtgcctgaaa aaaaaaaaaa aaaaa 685 <210> 7 <211> 491 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 7 ggagtcctga gctgcgtccc ggagcccacg gtggtcatgg ctgccagagc gctctgcatg 60 ctggggctgg tcctggcctt gctgtcctcc agctctgctg aggagtacgt gggcctgtct 120 gcaaaccagt gtgccgtgcc agccaaggac agggtggact gcggctaccc ccatgtcacc 180 cccaaggagt gcaacaaccg gggctgctgc tttgactcca ggatccctgg agtgccttgg 240 tgtttcaagc ccctgcagga agcagaatgc accttctgag gcacctccag ctgcccccgg 300 ccgggggatg cgaggctcgg agcacccttg cccggctgtg attgctgcca ggcactgttc 360 atctcagctt ttctgtccct ttgctcccgg caagcgcttc tgctgaaagt tcatatctgg 420 agcctgatgt cttaacgaat aaaggtccca tgctccaccc taaaaaaaaa aaaaaaaaaa 480 aaaaaaaaaa a 491 <210> 8 <211> 432 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 cgctccccag tagaggaccc ggaaccagaa ctggaatccg cccttaccgc ttgctgccaa 60 aacagtgggg gctgaactga cctctcccct ttgggagaga aaaactgtct gggagcttga 120 caaaggcatg caggagagaa caggagcagc cacagccagg agggagagcc ttccccaagc 180 aaacaatcca gagcagctgt gcaaacaacg gtgcataaat gaggcctcct ggaccatgaa 240 gcgagtcctg agctgcgtcc cggagcccac ggtggtcatg gctgccagag cgctctgcat 300 gctggggctg gtcctggcct tgctgtcctc cagctctgct gaggagtacg tgggcctgtc 360 tgcaaaccag tgtgccgtgc cagccaagga cagggtggac tgcggctacc cccatgtcac 420 ccccaaggag tg 432 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 9 tccttggctg gcacggcaca ct 22 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 10 cgggagcaaa gggacagaaa agc 23 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 11 gaagaactgt cctcgggtgg agc 23 <210> 12 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 12 tcagaaagtc tcaggcacga agaac 25 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 13 gcagcagaaa taaagcacaa cctca 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 14 aacagtagcg agagtggttg tgaaa 25 <210> 15 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 15 cggcacggca cactggtttg ca 22 <210> 16 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 16 ggtgcattct gtcttcctag tcagg 25 <210> 17 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 17 ggctccagat atgaactttc agcag 25 <210> 18 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 18 ggtggagcat gggaccttta ttcgt 25 <210> 19 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> TFF3 antisense oligonucleotide <400> 19 tggcacggca cactggtttg ca 22 <210> 20 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 20 Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val 1 5 <210> 21 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 21 Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp 1 5 <210> 22 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 22 Ala Val Pro Ala Lys Asp Arg Val Asp 1 5 <210> 23 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 23 Gly Tyr Pro His Val Thr Pro Lys 1 5 <210> 24 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 24 Tyr Pro His Val Thr Pro Lys Glu 1 5 <210> 25 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 25 Gly Thr Pro His Val Thr Pro Lys Glu 1 5 <210> 26 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 26 Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu 1 5 <210> 27 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 27 Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys 1 5 <210> 28 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> chemically synthesized peptide <400> 28 Phe Lys Pro Leu Gln Glu Ala Glu Cys 1 5

Claims (93)

1. 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 조제에 있어서 TFF3 중화제의 사용.
2. 제 1항에 있어서, 상기 TFF3 중화제가 핵산을 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 암은 유방, 결장, 전립샘, 난소, 또는 위암인 것을 특징으로 하는 사용.
4. 제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서, TFF3가 상기 암의 세포에서 분화하여 발현되는 것을 특징으로 하는 사용.
5. 제 1항에 있어서, 상기 중화제는 안티센스 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
6. 제 5항에 있어서, 상기 안티센스 분자는 SEQ ID NO: 5-19중 어떤 서열을 포함하거나 또는 그것과 겹치는 것을 특징으로 하는 사용.
7. 제 1항에 있어서, 상기 중화제는 RNAi 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
8. 제 7항에 있어서, 상기 RNAi 분자는 SEQ ID NO: 5-19 중 어떤 것에 상응하는 서열을 포함하거나 그것과 겹치는 것을 특징으로 하는 사용.
9. 제 1항에 있어서, 상기 TFF3 중화제는 특이적으로 TFF3에 결합하는 항체를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
10. 제 1항에 있어서, 상기 암은 결장암 또는 전립샘암이 아닌 것을 특징으로 하는 사용.
11. 종래의 암 치료와 조합하여 사용된, 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용.
12. 제 11항에 있어서, 상기 종래의 암 치료가 화학요법인 것을 특징으로 하는 사용.
13. 제 11항에 있어서, 상기 종래의 암 치료가 호르몬 절제 치료법인 것을 특징으로 하는 사용.
14. 제 13항에 있어서, 상기 호르몬은 안드로겐인 것을 특징으로 하는 사용.
15. 세포에서 세포자멸사의 조정을 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용.
16. 제 15항에 있어서, 상기 세포가 포유동물인 것을 특징으로 하는 사용.
17. 제 15항에 있어서, 상기 세포는 암인 것을 특징으로 하는 사용.
18. 제 15항에 있어서, 상기 세포는 유방, 전립샘, 결장, 난소, 또는 위 세포인 것을 특징으로 하는 사용.
19. 종양 성장의 억제 또는 종양 부피의 감소를 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용.
20. 제 19항에 있어서, 상기 종양이 TFF3가 분화하여 발현되는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
21. 세포에서 TFF3의 발현과 연합된 적어도 하나의 생리적 효과의 조정을 위한 약제의 제조에 있어서, TFF3 중화제의 사용.
22. 제 21항에 있어서, 상기 생리적 효과는 증가된 세포 운동성 또는 세포자멸사에 대한 저항성인 것을 특징으로 하는 사용.
23. 세포의 이동, 부착, 또는 증식의 억제를 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용.
24. 암 세포의 침입성의 감소를 위한 약제의 제조에 있어서, TFF3 중화제의 사용.
25. 세포에서 TFF3 발현의 조정을 위한 약제의 제조에 있어서, TFF3 중화제의 사용.
26. 상기 샘플을 TFF3 중화제와 접촉시키고 상기 샘플에서 상기 중화제와 TFF3 사이의 결합을 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 TFF3를 검출하는 방법.
27. 생물학적 샘플을 TFF3 중화제와 접촉시키고 상기 생물학적 샘플에서, 암의 존재의 표시인 TFF3의 분화 발현의 증가를 검출하는 것을 포함하는, 생물학적 샘플에서 암의 존재를 검출하기 위한 방법으로서, TFF3의 분화 발현의 증거는 암의 존재의 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
28. 제 27항에 있어서, 상기 검출은 상기 접촉의 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
29. 환자의 암 샘플에서 TFF3의 분화 발현의 증거를 검출하는 단계를 포함하는, TFF3 중화제에 대한 환자의 감수성을 결정하기 위한 방법으로서, TFF3의 분화 발현의 증거는 상기 TFF3 중화제에 대한 환자의 감수성의 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제 28항에 있어서, TFF3의 분화 발현의 상기 증거는 상기 환자의 암 샘플에서 TFF3의 상향조절인 것을 특징으로 하는 방법.
31. 제 28항에 있어서, 상기 환자의 암 샘플은 유방, 전립샘, 결장, 난소, 또는 위 조직으로부터인 것을 특징으로 하는 방법.
32. 제 1 시점에서의 환자에서 TFF3의 발현을 제 2 시점에서의 TFF3의 발현과 비교하는 것을 포함하는, 환자에서 암의 진행을 평가하기 위한 방법으로서, 제 1 시점에 비해 제 2 시점에서 TFF3의 증가된 발현은 상기 암의 진행의 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
33. 제 30항에 있어서, TFF3의 상기 증가된 발현은 적어도 약 25%의 증가된 발현인 것을 특징으로 하는 방법.
34. 제 1 시점에서의 환자에서 TFF3의 발현을 제 2 시점에서의 TFF3의 발현에 비교하는 것을 포함하는, 환자에서 암의 전이의 증가된 위험을 검출하기 위한 방법으로서, 제 1 시점에 비해 제 2 시점에서 TFF3의 증가된 발현은 전이의 상기 증가된 위험의 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
35. 제 1항 내지 제 34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFF3 중화제는 검출가능한 라벨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
36. 제 1항 내지 제 35항 중 어느 한 항에 있어서, TFF3 중화제는 방사능라벨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
37. 제 11항 내지 제 36항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TFF3 중화제는 항체, 핵산, 안티센스 분자, 또는 RNAi 분자를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
38. TFF3의 발현을 조정하는 안티센스 분자.
39. 제 38항에 있어서, 상기 안티센스 분자는 SEQ ID NO: 5-19중 어떤 것의 서열 을 포함하거나 겹치는 것을 특징으로 하는 안티센스 분자.
40. 제 38항에 있어서, 안티센스 분자는 SEQ ID NO: 5-19 중 어떤 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 안티센스 분자.
41. TFF3의 발현을 조정하는 RNAi 분자.
42. 제 41항에 있어서, 상기 RNAi 분자는 SEQ ID NO: 5-19중 어떤 것의 서열을 포함하거나 겹치는 것을 특징으로 하는 RNAi 분자.
43. 제 38항의 안티센스 분자와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
44. 제 43항의 RNAi 분자와 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
45. SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28에 상응하는 TFF3 서열의 적어도 하나의 영역을 인지하는 것을 특징으로 하는 분리된 항-TFF3 항체.
46. 제 47항에 있어서, 상기 항체는 하기 단계들을 포함하는 과정에 의해 제조되는 것을 특징으로 하는 항체.

    a) 파지에 항체의 라이브러리를 합성하는 단계;

    b) 파지를 SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28에 해당하는 TFF3 서열의 적어도 하나의 영역을 포함하는 조성물과 접촉시킴으로써 라이브러리를 샘플에 대해 패닝하는 단계 ;

    c)조성물과 결합하는 파지를 분리하는 단계, 이때 항체는 적어도 10⁸ 1/의 결합 친화력과 함께 SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28에 해당하는 TFF3 서열의 적어도 하나의 영역에 결합하는 그것의 능력에 의해 특징지어지고 ;

    및

    d)분리된 파지를 분석하여, SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28에 해당하는 TFF3 서열의 적어도 하나의 영역이 결합하는, 아미노산 서열을 인코딩하는 서열을 결정하는 단계.
47. 제 45항에 있어서, 상기 항체는 단일클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
48. 제 45항에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
49. 제 45항에 있어서, 상기 항체는 키메라 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
50. 제 45항에 있어서, 상기 항체는 사람화 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
51. 제 45항에 있어서, 상기 항체는 단일-사슬 항체인 것을 특징으로 하는 항체.
52. 제 45항에 있어서, 상기 항체는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 항체.
53. 제 45항에 있어서, 상기 항체는 표지화되는 것을 특징으로 하는 항체.
54. 제 53항에 있어서, 상기 라벨은 효소, 방사성동위원소, 또는 형광발색단인 것을 특징으로 하는 항체.
55. 제 45항에 있어서, 상기 항체의 결합 친화력은 TFF3 이외의 폴리펩티드에 대해 약 1 x 10⁵ K_a 미만인 것을 특징으로 하는 항체.
56. 제 45항의 항체를 제조하는 분리된 세포.
57. 제 45항의 항체를 제조하는 하이브리도마.
58. 제 45항의 항-TFF3 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
59. 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서, 제 45항의 항체인 TFF3 중화제의 사용.
60. 암의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용으로서, 상기 약제가 종래의 암 치료와 조합하여 사용되고, TFF3 중화제가 제 45항의 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
61. 제 60항에 있어서, 상기 종래의 암 치료는 화학요법인 것을 특징으로 하는 사용.
62. 제 60항에 있어서, 상기 종래의 암 치료가 호르몬 절제 치료법인 것을 특징으로 하는 사용.
63. 제 62항에 있어서, 상기 호르몬이 안드로겐인 것을 특징으로 하는 사용.
64. 세포자멸사의 유도를 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용으로서, 상기 중화제가 제 45항의 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
65. 제 64항에 있어서, 상기 세포가 포유동물인 것을 특징으로 하는 방법.
66. 제 64항에 있어서, 상기 세포가 암인 것을 특징으로 하는 사용.
67. 종양 부피의 감소, 종양 성장의 예방, 또는 종양 성장의 억제를 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용으로서, 상기 TFF3 중화제는 제 45항의 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
68. 제 67항에 있어서, 상기 종양은 TFF3가 분화하여 발현되는 세포를 포함하는 것을 특징으로 하는 사용.
69. 세포에서 TFF3의 발현과 연합된 적어도 하나의 생리적 효과의 조정을 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용으로서, 상기 TFF3 중화제가 제 45항의 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
70. 제 69항에 있어서, 상기 생리적 효과는 증가된 세포 운동성 또는 세포자멸사에 대한 저항성인 것을 특징으로 하는 사용.
71. 세포의 이동, 부착, 또는 증식의 억제를 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용으로서, 상기 TFF3 중화제가 제 45항의 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
72. 암의 침입성의 감소를 위한 약제의 제조에 있어서 TFF3 중화제의 사용으로 서, 상기 TFF3 중화제가 제 45항의 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
73. 상기 샘플을 제 45항의 항체와 접촉시키고 상기 샘플에서 상기 중화제와 TFF3 사이의 결합을 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 TFF3의 검출 방법.
74. 제 73항에 있어서, 상기 TFF3 중화제는 검출가능한 라벨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
75. 상기 생물학적 샘플을 제 45항의 항체와 접촉시키는 단계와 상기 생물학적 샘플에서 TFF3의 분화 발현의 증거를 검출하는 단계를 포함하는, 생물학적 샘플에서 암의 존재를 검출하기 위한 방법으로서, TFF3의 분화 발현의 증거는 암의 존재의 표시인 것을 특징으로 하는 방법.
76. 제 75항에 있어서, 상기 검출은 상기 접촉의 결과를 대조군과 비교하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
77. 제 75항에 있어서, 상기 TFF3 중화제는 검출가능한 라벨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
78. SEQ ID NO: 20,21, 22,23, 24,25, 26,27 또는 28로부터 선택된 3개 또는 더 적은 아미노산 서열을 포함하는 분리된 폴리펩티드.
79. 제 78항에 있어서, 상기 폴리펩티드는 길이가 약 8 내지 약 80 아미노산인 것을 특징으로 하는 펩티드.
80. 제 78항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 특이적으로 항- TFF3 항체에 결합되는 것을 특징으로 하는 펩티드.
81. 다음의 단계를 포함하는, 항체를 사용하여 샘플에서 TFF3의 분화 발현을 검출하는 방법.

    a) 항체: TFF3 착체의 형성을 허용하는 조건하에서 제 45항의 항체를 상기 샘플과 조합하는 단계 ;

    b) 상기 착체의 양을 측정하는 단계 ; 및

    c) 상기 착체의 양을 대조군과 비교하는 단계, 이때 상기 샘플에서 착체의 상승된 수준은 TFF3의 분화 발현을 나타낸다.
82. SEQ ID NO : 1-4의 폴리펩티드의 분리된 에피토프-함유 단편.
83. 제 82항에 있어서, SEQ ID NO : 1-4의 약 6 내지 약 20 인접 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 에피토프-함유 단편.
84. 제 83항에 있어서, SEQ ID NO : 1-4의 약 10 인접 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 에피토프-함유 단편.
85. 제 82항에 있어서, SEQ ID NO : 2의 약 6 내지 약 20 인접 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 에피토프-함유 단편.
86. 제 83항에 있어서, SEQ ID NO : 2의 약 10 인접 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 에피토프-함유 단편.
87. 제 83항에 있어서, SEQ ID NO: 20, 21, 22,23, 24,25, 26, 27 또는 28를 포함하는 것을 특징으로 하는 에피토프-함유 단편.
88. 제 83항의 에피토프-함유 단편으로 대상을 면역화함으로써 얻어지는 분리된 항-TFF3 항체.
89. 제 45항의 항체 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
90. 제 89항에 있어서, 항체가 TFF3를 중화하는 것을 특징으로 하는 제약 조성 물.
91. TFF3에 결합하고 중화하는 항체를 확인하고, 재조합 발현 숙주 세포에서 항체를 발현시키는 단계를 포함하는, 암의 치료를 위한 항체를 생성하기 위한 방법.
92. TFF3에 결합하고 중화하는 항체, 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물로서, 상기 항체가 재조합 숙주 세포를 사용하여 발생되는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.
93. 제 92항에 있어서, 재조합 숙주 세포는 차이니즈 햄스터 난소 세포, 골수종 세포 및 박테리아 숙주 세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제약 조성물.

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