MXPA06001327A - Factor trefoil3 (tff3) como objetivo para terapia anti-cancer. - Google Patents

Abstract

La presente invencion se dirige a metodos para tratar o prevenir el cancer, tal como el cancer caracterizado por la expresion diferencial del factor trefoil 3 (TFF3). Los metodos incluyen administrar a un paciente un agente que modula la actividad o la expresion del TFF3. La presente invencion se dirige ademas a la reduccion de los efectos fisiologicos de la expresion del TFF3 en celulas, inclusive la inhibicion de la motilidad celular y la resistencia a la apoptosis. Tambien se proporcionan oligonucleotidos y anticuerpos que pueden modular la expresion o la actividad del TFF3.

Description

FACTOR TREF0IL3 (TFF3) COMO OBJETIVO PARA TERAPIA ANT -CANCER CAMPO DE LA INVENCION _ La presente invención se refiere, en parte, a agentes que modulan la actividad o la expresión del factor trefoil 3 (TFF3, por sus siglas en inglés) . La presente invención se refiere además al uso de estos agentes en el tratamiento, prevención o detección de cánceres. ANTECEDENTES DE LA INVENCION El factor trefoil 3 (TFF3; o factor trefoil intestinal (ITF, por sus siglas en inglés) ; o factor trefoil intestinal, humano (HITF, por sus siglas en inglés)) es un péptido resistente a proteasa que es producido normalmente en las células calciformes, intestinales y es secretado en el lumen intestinal (Thim y colaboradores, Biochemistry, 1995, 34, 4757) . El TFF3 juega un papel principal en la restitución epitelial después de la lesión (Mashimo y colaboradores, Science, 1996, 274, 262 y Wong y colaboradores, Biochemistry, 1995, 34, 4757) y se creé que realiza esto a través de varios mecanismos: 1) la protección de células epiteliales de la apoptosis (Taupin y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 2000, 97, 199) ; 2) la inducción de células delomorfas a migrar y cubrir la herida (Dignass y colaboradores, J. Clin. Jnvest., 1994, 94, 376) y 3) el bloqueo de la deposición de REF: 169716 componentes del sistema de complementos del suero que ganan acceso a las células epiteliales a través de la herida (Andoh y colaboradores, J". I unol . , 2001, 167, 3887) . Los ratones "con gen inactivado" son fenotípicamente normales a menos que su intestino sea herido, caso en el cual mueren por dejar de curar la herida. El TFF3 recombinante ha sido propuesto para el uso en la terapia relacionada con el síndrome de intestino irritable y otras enfermedades del intestino (véase, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 6,063,755, 6,316,218 y la ' publicación de solicitud de patente norteamericana No. 20010052483) . Actualmente, los receptores del TFF3 son desconocidos. Los efectos fisiológicos del TFF3 en células intestinales pueden considerarse" benéficos para el crecimiento, proliferación y metástasis de células cancerosas. Por ejemplo, se creé que la resistencia a la apoptosis, inducción de la migración y protección de la activación de complementos son mecanismos a través de los cuales las células cancerosas ' escapan del control de crecimiento, invaden los tejidos normales circundantes y se diseminan de manera metastática o escapan del control del sistema inmune. Los datos de seguimiento clínico han sugerido que la expresión del TFF3 puede estar correlacionada con una pobre prognosis en el cáncer gástrico (Yamachika y colaboradores, Clin. Cáncer Res . , 2002, 8, 1092) .

Se ha reportado que otras proteínas, y los ácidos nucleicos que las codifican, son útiles como agentes de diagnóstico y terapéuticos para cánceres (véase, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 6,261,562, 6,337,195, 6,465,611, 6,476,207 y la publicación de solicitud de patente norteamericana No: 20020192699). Las composiciones y los métodos descritos en este documento ayudan a satisfacer las necesidades actuales por tratamientos nuevos y más efectivos para el cáncer y las enfermedades relacionadas. BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir el cáncer que comprenden administrar a un mamífero afligido por o predispuesto al cáncer una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente neutralizante del TFF3 , en donde el agente neutralizante del TFF3 es una molécula antisentido, molécula de iARN, ribozima o molécula pequeña . En algunas modalidades, el cáncer es cáncer de mama, colon, próstata, ovario o gástrico. En algunas modalidades, el TFF3 es expresado diferencialmente en células del cáncer. En algunas modalidades, el agente neutralizante es una molécula antisentido que comprende o que se superpone a una secuencia que corresponde a cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. En algunas modalidades, el agente neutralizante es una molécula de iARN que comprende o que se superpone a una secuencia que corresponde a cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. En algunas modalidades, el agente neutralizante es un anticuerpo que se une específicamente al TFF3. La presente invención también proporciona métodos para tratar el cáncer que comprenden administrar a un mamífero afligido por el cáncer o predispuesto a adquirir cáncer una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente neutralizante del TFF3 y proveer al mamífero con un tratamiento tradicional contra el cáncer. En algunas modalidades, el tratamiento tradicional contra el cáncer es la quimioterapia. En algunas modalidades, el tratamiento tradicional contra el cáncer es la terapia de ablación hormonal. En algunas modalidades, la hormona es un andrógeno . La presente invención proporciona además métodos para inducir la apoptosis en una célula que comprenden poner en contacto la célula con un agente neutralizante del TFF3. En algunas modalidades, la célula es de un mamífero. En algunas modalidades, la célula es cancerosa. En algunas modalidades, la célula es una célula de mama, próstata, colon, ovario o gástrica. En las modalidades adicionales, la presente invención proporciona métodos para reducir el volumen del tumor, para disminuir la velocidad de crecimiento del tumor o para prevenir el crecimiento del tumor que comprenden poner en contacto el tumor con un agente neutralizante del TFF3. En algunas modalidades, el tumor comprende células en las cuales el TFF3 es expresado diferencialmente . La presente invención proporciona métodos para modular al menos un efecto fisiológico asociado con la expresión del TFF3 en una célula que comprenden poner en contacto la célula con un agente neutralizante del TFF3. En algunas modalidades, el efecto fisiológico es la motilidad celular incrementada o la resistencia a la apoptosis. La presente invención también proporciona métodos para inhibir la migración, adherencia o proliferación de una célula que comprenden poner en contacto la célula con agente neutralizante del TFF3. En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para reducir la invasibilidad de una célula cancerosa que comprenden poner en contacto la célula cancerosa con un agente neutralizante del TFF3. La presente invención proporciona además métodos para modular la expresión del TFF3 en una célula que comprenden poner en contacto la célula con un agente neutralizante del TFF3. En las modalidades adicionales, la presente invención proporciona métodos para detectar el TFF3 en una muestra biológica que comprenden poner en contacto la muestra con un agente neutralizante del TFF3 y detectar el enlace entre el agente neutralizante y el TFF3 en la muestra. En algunas modalidades, el agente neutralizante del TFF3 comprende una etiqueta detectable . También, la presente invención proporciona métodos para detectar la presencia de cáncer en una muestra biológica que comprenden poner en contacto la muestra biológica con un agente neutralizante del TFF3 y detectar la evidencia de expresión diferencial del TFF3 en la muestra biológica. La evidencia de expresión diferencial del TFF3 es indicativa de la presencia de cáncer. En algunas modalidades, la "detección" comprende comparar los resultados del contacto con un control . En algunas modalidades, el agente neutralizante del TFF3 comprende una etiqueta detectable . La presente invención también proporciona métodos para determinar la susceptibilidad de un paciente a un agente neutralizante del TFF3 que comprenden detectar la evidencia de expresión diferencial del TFF3 en la muestra de cáncer del paciente. La evidencia de expresión diferencial del TFF3 es indicativa de la susceptibilidad del paciente al agente neutralizante del TFF3. En algunas modalidades, la evidencia de la expresión diferencial del TFF3 es la sobrerregulación del TFF3 en la muestra de cáncer del paciente . En algunas modalidades, la muestra de cáncer del paciente es de tejido de mama, próstata, colon, ovario o gástrico.

En algunas modalidades, la presente invención proporciona métodos para valorar el progreso del cáncer en un paciente que comprenden comparar la expresión del TPF3 en el paciente en un primer punto de tiempo con la expresión del TFF3 en un segundo punto de tiempo. La expresión incrementada del TFF3 en el segundo punto de tiempo con relación al primer punto de tiempo es indicativa del progreso del cáncer. En algunas modalidades, la wexpresión incrementada del TFF3" es una expresión incrementada de al menos aproximadamente 25%, al menos aproximadamente 50%, al menos aproximadamente 75% o al menos aproximadamente 90%. La presente invención también proporciona métodos para detectar un riesgo incrementado de metástasis de un cáncer en un paciente que comprenden comparar la expresión del TFF3 en el paciente en un primer punto de tiempo con la expresión del TFF3 en un segundo punto de tiempo. La expresión incrementada del TFF3 en el segundo punto de tiempo con relación al primer punto de tiempo es indicativa de un riesgo incrementado de metástasis. La presente invención también proporciona moléculas antisentido que modulan la expresión del TFF3. En algunas modalidades, la molécula antisentido comprende o se superpone a una secuencia de las SEC ID NOS: 5-19. En algunas modalidades, las moléculas antisentido comprenden cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19.

La presente invención también proporciona moléculas de iARN que modulan la expresión del TFF3. En algunas modalidades, la molécula de iARN comprende o se superpone a una secuencia de las SEC ID NOS: 5-19. En algunas modalidades, las moléculas de iARN comprenden cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. La presente invención también proporciona composiciones que comprenden moléculas antisentido y/o moléculas de iARN y un portador farmacéuticamente aceptable. La presente invención también proporciona anticuerpos- anti-TFF3 aislados, en donde los anticuerpos reconocen al menos una región de la secuencia del TFF3 que corresponde a las SEC ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28. En algunas modalidades, el anticuerpo es producido por medio de un procedimiento que comprende: a) sintetizar una biblioteca de anticuerpos en un fago; b) seleccionar y aislar la biblioteca contra una muestra al poner en contacto el fago con una composición que comprende al menos una región de la secuencia del TFF3 que corresponde a las SEC ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 25, 27 o 28; c) aislar el fago que se enlaza a la composición, en donde el anticuerpo está caracterizado por su capacidad para enlazarse a al menos una región de la secuencia del TFF3 que corresponde a las SEC ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28 con una afinidad de enlace de al menos 1081/; y d) analizar el fago aislado para determinar una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos a la cual se enlaza a al menos una región de la secuencia del TFF3 que corresponde a las SEC ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo policlonal, un anticuerpo quimérico, un anticuerpo humanizado, un anticuerpo de cadena individual o un fragmento Fab. En algunas modalidades, el anticuerpo es etiquetado. En algunas modalidades, la etiqueta es una enzima, radioisótopo o fluoróforo. En algunas modalidades, la- afinidad de enlace del anticuerpo es menor que aproximadamente 1 x 105 Ka para un polipeptido diferente del TFF3. La presente invención proporciona además células aisladas e hibridomas que producen los anticuerpos de la presente invención. La presente invención también proporciona polipéptidos aislados que comprenden tres o menos secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEC ID NOS: 13, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28. En algunas modalidades, el polipéptido es de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 aminoácidos de longitud. En algunas modalidades, el polipéptido se enlaza específicamente a un anticuerpo anti-TFF3.

La presente invención proporciona además métodos para utilizar un anticuerpo para detectar la expresión diferencial del TFF3 en una muestra que comprenden combinar los anticuerpos de la presente invención con la muestra baj o condiciones que permitan la formación de complej os de anticuerpo : TFF3 ; para medir la cantidad de complej os ; y para comparar la cantidad de complej os para un control . Los niveles elevados de complej o en la muestra indican la expresión diferencial del TFF3 . La presente invención también proporciona fragmentos aislados que llevan epitopos del polipéptido de las SEC ID NOS : 1 -4 . En algunas modalidades , los fragmentos comprenden entre aproximadamente 6 y aproximadamente 20 aminoácidos contiguos- de las SEC ID NOS : 1-4. En algunas modalidades, el- fragmento comprende aproximadamente 10 aminoácidos contiguos de las SEC ID NOS : 1-4. En algunas modalidades, el polipéptido es la SEC ID NO: 2 . En algunas modalidades, el fragmento comprende las SEC ID NOS : 20, 21, 22 , 23 , 24, 25, 26, 27 o 28. También, la presente invención proporciona anticuerpos anti-TFF3 aislados que se obtienen por medio de la inmunización de un sujeto con el fragmento que lleva epitopos de la presente invención. En algunas modalidades, la presente invención proporciona los anticuerpos aislados en composiciones f rmacéuticas con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables . En algunas modalidades , el anticuerpo neutraliza el TFF3 .

La presente invención también proporciona métodos para generar un anticuerpo para el tratamiento del cáncer que comprenden identificar un anticuerpo que se enlaza a y que neutraliza el TFF3 y expresar el anticuerpo en una célula hospedera de expresión recombinante . Además, la presente invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden un anticuerpo que se enlaza a y que neutraliza el TFF3 y un portador farmacéuticamente aceptable, en donde el anticuerpo se generó utilizando una célula hospedera recombinante. En algunas modalidades, la célula hospedera recombinante se selecciona del grupo que consiste de células de ovario de hámster chino, células de mieloma y células hospedantes, bacterianas. BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La figura 1 representa la variación de la expresión de ARNm del TFF3 en diferentes tejidos completos (cuyo título es "Expresión en Tejido Normal del TFF3 (Normalizada con HPRT en Tejido Total)") . La figura 2 representa la variación de los niveles de expresión del TFF3 en diferentes líneas de células (cuyo título es "Expresión del TFF3 en Líneas de Células (Normalizada con ß-actina en Tejido Total)"). La figura 3 representa la efectividad variante de diferentes oligonucleótidos antisentido del TFF3 en la supresión de los niveles de expresión de ARNm del TFF3 en células cancerosas de colon (cuyo título es "Prueba de Efectividad de AS en la Supresión del ARNm del TFF3") . La figura 4 representa la especificidad de los oligonucleótidos antisentido del TFF3 (cuyo título es "Especificidad de AS en la Supresión del ARNm del TFF3") . La figura 5 representa la especificidad de los oligonucleótidos antisentido del TFF3 adicionales (cuyo título es "Especificidad de AS en la Supresión del ARNm del TFF3" ) . La figura 6 representa la efectividad de los oligonucleótidos antisentido en la supresión de la expresión de ARNm del TFF3 en una línea de células cancerosas (cuyo título es "Especificidad de AS en la Supresión del ARNm del TFF3") . La figura 7 representa los efectos citotóxicos y anti-proliferativos de los oligonucleótidos antisentido en células cancerosas de colon. Las figuras 8A y 8B representan efectos citotóxicos y anti-proliferativos de los oligonucleótidos antisentido en células cancerosas de próstata (cuyos títulos son "AS del TFF3 en MDA-PCa-2b 9/2/02 (Ll) " y "Esferoides de PCa2B Tratados con AS del TFF3", respectivamente) . La figura 9 representa la ausencia de toxicidad de los oligonucleótidos antisentido del TFF3 en células normales (cuyo título es "Los AS del TFF3 no son Tóxicos en Fibroblastos Normales (MRC9) o Epitelio de Mama Normal (184B5) ") . La figura 10 representa la inhibición de oligonucleótidos antisentido del TFF3 en el crecimiento de colonias en medios de agar suave para células cancerosas de próstata (cuyo título es "Efecto de AS del TFF3 ¦ sobre el Crecimiento en Agar Suave de las Células MDA PCa-2b") . La figura 11 representa la inhibición de la proliferación celular utilizado anticuerpos anti-TFF3. Las fracciones de IgG aisladas de los antisueros policlonales anti-TFF3 se diluyeron a una concentración final de 50 µg/ml en un medio de crecimiento que contenia FBS 1% y entonces se adicionaron a pocilios por cuadruplicado en los días 0 y 4 del ensayo de proliferación. El grado de proliferación celular se registró en el día 7 (cuyo título es "Inhibición de la Proliferación en Células SW620 por el Anticuerpo anti-TFF3" ) . DESCRIPCION DETALLADA DE LAS MODALIDADES La presente invención proporciona, inter alia, agentes neutralizantes del TFF3 y métodos para prevenir, tratar y detectar el cáncer utilizando estos agentes. Los polipéptidos del TFF3 pueden expresarse diferencialmente (por ejemplo, a nivel de proteínas o ARNm) en muchos tejidos cancerosos y líneas de células cancerosas, tal como en conexión con el cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario, cáncer gástrico y cáncer · de colon. Como se ejemplifica en este documento, la supresión de la expresión del TFF3 (tal como al utilizar técnicas basadas en oligonucleótidos) puede conducir a la citotoxicidad y la inhibición del crecimiento independiente del anclaje. Por consiguiente, la inhibición de la actividad de polipéptidos del TFF3 o la supresión de la expresión de polipéptidos o polinucleótidos del TFF3 en células utilizando los agentes neutralizantes apropiados puede ayudar a prevenir o a tratar cánceres caracterizados, por ejemplo, por la expresión del TFF3. En algunas modalidades, el tejido canceroso puede expresar diferencialmente (por ejemplo, puede mostrar la sobrerregulación o desregulación de) el TFF3. Como se utiliza en este documento, la frase "expresado diferencialmente" se refiere generalmente a un polipéptido o polinucleótido que es expresado a niveles más altos o más bajos en células cancerosas, por ejemplo, el ARNm se encuentra a niveles de al menos aproximadamente 25%, de al menos aproximadamente 50% a aproximadamente 75%, al menos aproximadamente 90%, al menos aproximadamente 95%, al menos aproximadamente 1.5 veces, al menos aproximadamente 2 veces, al menos aproximadamente 5 veces, al menos aproximadamente 10 veces o al menos aproximadamente 50 veces o más, diferentes (por ejemplo, más altos o más bajos) en una célula cancerosa en comparación con una célula del mismo tipo que no es cancerosa (célula normal) . Se puede hacer la comparación entre dos tejidos, por ejemplo, si uno está utilizando la hibridación in situ u otro método de ensayo que permita algún grado de discriminación entre los tipos de células en el tejido. También se puede hacer la comparación entre células removidas de su fuente de tejido. El TFF3 es un gen el cual se ha mostrado que es expresado diferencialmente en cánceres de colon, mama, próstata y otros cánceres. En algunas modalidades, la expresión diferencial se observa más alta que la expresión normal . Los métodos para determinar los polipéptidos · y polinucleótidos que son expresados diferencialmente en ciertas células se describen adicionalmente en la publicación de solicitud de patente norteamericana No: 20020192699 y la patente norteamericana No. 6,476,207. Los productos génicos que son expresados diferencialmente en células cancerosas de próstata se describen en el documento norteamericano número de serie 10/310,673. Como se utiliza en este documento, el término "aproximadamente" se refiere a +/-10% de un valor. Polipéptidos del TFF3 El "TFF3" o los "polipéptidos del TFF3" , como se utiliza en este documento, se refieren a proteínas (polipéptidos) o fragmentos de las mismas que son sustancialmente homologas al factor trefoil 3 humano (SEC ID NOS: 1-4, GenBak gi:4507453, Q07654, NP_003217, AAH17859, BAA95531, BAB13731) . Los polipéptidos contemplados por la invención incluyen aquellos codificados por los polinucleotidos del TPF3 descritos (SEC ID NOS: 5-8, GenBank gi:4507452, BC017859, AF432265) , así como también ácidos nucleicos que, en virtud de la degeneración del código genético, no son idénticos en cuanto a su secuencia con los polinucleotidos del TFF3 descritos. De esta manera, la invención incluye dentro de su alcance un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene la secuencia de cualquiera de las secuencias de polinucleotidos proporcionadas en este documento, o una variante de las mismas. En algunas modalidades, el TFF3 comprende una secuencia de aminoácidos de las SEC ID NOS: 1-4. En algunas modalidades preferidas, el TFF3 comprende una secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2. Los términos "polipéptidos" y "proteína" se utilizan intercambiablemente y se refieren a una forma polimérica de aminoácidos de cualquier longitud, la cual puede incluir aminoácidos codificados y no codificados, aminoácidos modificados química o bioquímicamente o derivados y polipéptidos que tienen estructuras principales, modificadas de péptidos . El término incluye proteínas de fusión que incluyen, pero no están limitadas a, proteínas de fusión con una secuencia de aminoácidos heteróloga, fusiones con secuencias líderes heterólogas y homologas, con o sin residuos de metionina N-terminales; proteínas etiquetadas inmunológicamente; y similares. El término también incluye un "péptido" el cual es un polipéptido que es de 2 a aproximadamente 30 aminoácidos de longitud. Los polipéptidos pueden referirse tanto a un polipéptido de longitud completa que es codificado por el polinucleótido citado (tal como un polinucleó ido del. TFF3) , el polipéptido codificado por el gen representado por el polinucleótido citado, así como también porciones o fragmentos de los mismos. Los "polipéptidos" también incluyen variantes de las proteínas de origen natural, donde estas variantes son homologas o sustancialmente similares a la proteína de origen natural y pueden originarse de la misma especie o de especies diferentes a la proteína de origen natural (por ejemplo, especie humana, de murino o alguna otra especie que exprese naturalmente el polipéptido citado, usualmente una especie mamífera) . En general, los polipéptidos variantes del TFF3 tienen una secuencia que tiene al menos aproximadamente 80%, usualmente al menos aproximadamente 90% y más usualmente al menos aproximadamente 95% de identidad de secuencia o más, es decir 96%, 97%, 98% o 99% de identidad de secuencia con un polipéptido expresado diferencialmente descrito en este documento, que puede medir por medio de BLAST utilizando, por ejemplo, parámetros por omisión. Los polipéptidos -variantes pueden ser glicosilados de manera natural o no natural, es decir el polipéptido tiene un patrón de glicosilación que difiere del patrón de glicosilación encontrado en la protexna correspondiente de origen natural . La invención también incluye homólogos de los polipéptidos del TFF3 (o fragmentos de los mismos) donde los homólogos son aislados de otras especies, el TFF3 glicosilado de origen natural incluye aquellos producidos por células normales o neoplásicas, las cuales pueden exhibir diferentes patrones de glicosilación, es decir otras especies animales o vegetales, donde estos homólogos, usualmente especies de mamíferos, por ejemplo roedores, tales como ratones, ratas; animales domésticos, por ejemplo caballos, vacas, perros, gatos; y humanos. Por w omólogos" se indica un polipéptido que tiene al menos aproximadamente 35%, usualmente al menos aproximadamente 40% y más usualmente al menos aproximadamente 60% de identidad de secuencia de aminoácidos con una proteína particular identificada anteriormente, donde la identidad de secuencia se determina utilizando el algoritmo BLAST con, por ejemplo, parámetros por omisión. En general, los polipéptidos del TFF3 de la invención principal se proporcionan en un ambiente que no es de origen natural, por ejemplo, se separan de su ambiente de origen natural. En ciertas modalidades, la proteína principal está presente en una composición que es enriquecida por la proteína en comparación con un control. Como tal, se proporciona un polipéptido purificado, con lo cual wpurificado" se refiere a que la proteína está presente en una composición que está sustancialmente libre de otros polipéptidos, con lo cual "sustancialmente libre" se refiere a que menos de aproximadamente 90%, usualmente menos de aproximadamente 60% o más usualmente menos de 50% de la composición está compuesta de otros polipéptidos. También dentro del alcance de la invención están las variantes; las variantes de polipéptidos incluyen mutantes, fragmentos y fusiones. Las mutantes pueden incluir sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos. Las sustituciones de aminoácidos pueden ser sustituciones conservadoras de aminoácidos o sustituciones para eliminar los aminoácidos no esenciales, tal como para alterar un sitio de glicosilación, un sitio de fosforilación o un sitio de acetilación o para minimizar el plegamiento incorrecto por la sustitución o supresión de uno o más residuos de cisteína que no son necesarios para la función. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas que conservan la carga general, hidrofobicidad/hidrofilicidad y/o volumen estérico del aminoácido sustituido. Las variantes pueden diseñarse para retener o para tener una actividad biológica mejorada de una región particular de la proteína (por ejemplo, un dominio funcional y/o donde el polipéptido es un miembro de una familia de proteínas, una región asociada con una secuencia consensual) . La selección de alteraciones de aminoácidos para la producción de variantes puede basarse en la accesibilidad (interior contra exterior) del aminoácido (véase, por ejemplo, Go y colaboradores, Int. J. Peptíde Protein Res. (1980) 15:211), la termoestabilidad del polipéptido variante (véase, por ejemplo, Querol y colaboradores, Prot. Eng. (1996) 9:265 el cual es incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad) , los sitios de glicosilación deseados (véase, por ejemplo, Olsen y Thomsen, <J. Gen. Microbiol. (1991) 137:579), conexiones de disulfuro deseadas (véase, por ejemplo, Clarke y colaboradores, Biochemistry (1993) 32:4322; y Wakarchuk y colaboradores, Protein Eng. (1994) 7:1379) , sitios de enlace de metales deseados (véase, por ejemplo, Toma y colaboradores, Biochemistry (1991) 30:97, y Haezerbrouck y colaboradores, Protein Eng. (1993) 5:643), y sustituciones deseadas con bucles de prolina (véase, por ejemplo, Masul y colaboradores, Appl. Env. Mícrobiol . (1994) 6?:3579, el cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad) . Las muteínas suprimidas en cisteína pueden producirse como se describe en la patente norteamericana No. 4,959,314, la cual es incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad. Las variantes también pueden incluir fragmentos de los polipéptidos descritos en este documento, en particular fragmentos biológicamente activos y/o fragmentos que corresponden a dominios funcionales . Los fragmentos de interés serán típicamente de al menos aproximadamente 10 aminoácidos a al menos aproximadamente 15 aminoácidos de longitud, al menos aproximadamente 50 aminoácidos de longitud y pueden ser tan largos como de 300 aminoácidos de longitud o más, y en algunas modalidades no se exceden aproximadamente 1000 aminoácidos de longitud, donde el fragmento tendrá un tramo de aminoácidos que es idéntico a un polipéptido codificado por un polinucleótido que tiene una secuencia de cualquiera de las secuencias de polinucleotidos proporcionadas en este documento o un homólogo de las mismas. Las variantes de proteínas descritas en este documento son codificadas por polinucleotidos que están dentro del alcance de la invención. El código genético puede utilizarse para seleccionar los codones apropiados para construir las variantes correspondientes. En particular, los fragmentos incluirán aquellos que contienen los dominios o epítopos específicos de la proteína del TFF3. Polinucleotidos del TFF3 En algunas modalidades, la presente invención se refiere a la inhibición o la detección de un polinucleótido del TFF3 que codifica el TFF3 el cual es expresado diferencialmente en algunos cánceres, tal como, por ejemplo, cáncer de próstata, mama, ovario o colon. En algunas modalidades, el TFF3 es codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de las SEC ID NOS : 5-8. En algunas modalidades preferidas, el TFF3 es codificado por un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de la SEC ID NO: 7. El alcance de la invención con respecto a las composiciones de polinucleotidos que son útiles en los métodos descritos en este documento incluye, pero no está limitado a, los polinucleotidos que tienen una secuencia expuesta en cualquiera de las secuencias de polinucleotidos proporcionadas en este documento (por e emplo, SEC ID NO: 2) ; los polinucleotidos obtenidos a partir de materiales biológicos descritos en este documento u otras fuentes biológicas (particularmente fuentes humanas) por medio de la hibridación bajo condiciones rigurosas (particularmente condiciones de alta rigurosidad) ; los genes que corresponden a los polinucleotidos proporcionados; las variantes de los polinucleótidos proporcionados y sus genes correspondientes, particularmente aquellas variantes que retienen una actividad biológica del producto génico codificado (por ejemplo, una actividad biológica adscrita a un producto génico que corresponde a los polinucleótidos proporcionados como resultado de la asignación del producto génico a una(s) famili (s) de proteínas y/o la identificación de un dominio funcional que está presente en el producto génico) . Otras composiciones de ácido nucleico contempladas por y que se encuentran dentro del alcance de la presente invención serán fácilmente aparentes para una persona de experiencia ordinaria en el campo cuando se proporcionan con la descripción de este documento. El "polinucleótido" y el "ácido nucleico" utilizados en este documento con referencia a los ácidos nucleicos de la composición no se propone que sean limitantes en cuanto a la longitud o estructura del ácido nucleico a menos que se indique específicamente. Los polinucleótidos del TFF3 pueden ser expresados en tejidos cancerosos humanos, tal como tejido humano de próstata, mama o colon. Las composiciones de ácido nucleico descritas en este documento de interés particular comprenden una secuencia expuesta en cualquiera de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en este documento o una secuencia de identificación de las mismas. Una "secuencia de identificación" es una secuencia contigua de residuos de al menos aproximadamente 10 nt a aproximadamente 20 nt de longitud, usualmente de al menos aproximadamente 50 nt a aproximadamente 100 nt de longitud, que identifica únicamente una secuencia de polinucleótido, por ejemplo, que exhibe menos de 90%, usualmente menos de aproximadamente 80% a aproximadamente 85% de identidad de secuencia con cualquier secuencia de nucleótidos contigua de más de aproximadamente 20 nt. De esta manera, las composiciones de ácido nucleico principales incluyen los ADNcs o ARNms de longitud completa que incluyen una secuencia de identificación de nucleótidos contiguos de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en este documento. Los polinucleótidos útiles en los métodos descritos en este documento también incluyen polinucleótidos que tienen una similitud de secuencia o una identidad de secuencia con el ADN nativo del TFF3. Esto incluye las secuencias 5' y 3' no traducidas, asociadas, secuencias promotoras e intensificadoras y secuencias en orientación en sentido positivo o antisentido. Los ácidos nucleicos que tienen similitud de secuencia son detectados por medio de la hibridación bajo condiciones de baja rigurosidad, por ejemplo, a 50°C y 10XSSC (solución salina 0.9 M/citrato de sodio 0.09 ) y permanecen enlazados cuando se sujetan al lavado a 55°C en 1XSSC. La identidad de secuencia puede determinarse por medio de la hibridación bajo condiciones rigurosas, por ejemplo, a 50°C o más y 0.1XSSC (solución salina 9 mM/citrato de sodio 0.9 mM) . Los métodos y las condiciones de hibridación son bien conocidos en el campo, véase, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,707,829. Los ácidos nucleicos que son sustancialmente idénticos a las secuencias de polinucleótidos proporcionadas, por ejemplo variantes alélicas, versiones alteradas genéticamente del gen, etcétera, se enlazan a las secuencias de polinucleótidos proporcionadas bajo condiciones de hibridación rigurosas. Utilizando sondas, particularmente sondas etiquetadas de las secuencias de ADN, uno puede aislar genes homólogos o relacionados. La fuente de genes homólogos puede ser cualquier especie, por ejemplo especies de primates, particularmente humanos; roedores, tales como ratas y, ratones; caninos, felinos, bovinos, ovinos, equinos, levadura, nemátodos, etcétera. En una modalidad, la hibridación se realiza utilizando al menos 15 nucleótidos contiguos (nt) de al menos una de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en este documento. Es decir, cuando al menos 15 nt contiguos de una de las secuencias de polinucleótidos descritas se utilizan como una sonda, la sonda se hibridizará preferiblemente con un ácido nucleico que comprende la secuencia complementaria, permitiendo la identificación y la recuperación de los ácidos nucleicos que se hibridizan de manera única con la sonda seleccionada. Las sondas de más de una secuencia de polinucleótido proporcionada en este documento pueden hibridizarse con el mismo ácido nucleico si el ADNc del cual se derivaron corresponde a un ARWm. Se pueden utilizar sondas de más de 15 nt, por ejemplo las sondas ' de un tamaño dentro del rango de aproximadamente 18 nt, 25 nt, 50 nt, 75 nt o 100 nt, pero en general aproximadamente 15 nt representan una secuencia suficiente para la identificación única. Los polinucleótidos contemplados por la invención también incluyen variantes de origen natural de las secuencias de nucleótidos (por ejemplo, variantes degeneradas, variantes alélicas, etcétera) . Las variantes de los polinucleótidos contemplados por la invención son identificadas por medio de la hibridación de variantes putativas con secuencias de nucleótidos descritas en este documento, preferiblemente por medio de la hibridación bajo condiciones rigurosas. Por ejemplo, al utilizar condiciones de lavado apropiadas, las variantes de los polinucleótidos descritos en este documento pueden identificarse donde la variante alélica exhibe al menos aproximadamente 25-30% de desigualdades de pares de bases (pb) con relación a la sonda de polinucleótido seleccionada. En general, las variantes alélicas contienen de aproximadamente 15 a aproximadamente 25% de desigualdades de pb y pueden contener tan escasamente como aún aproximadamente 5-15% o aproximadamente 2-5% o aproximadamente 1-2% de desigualdades de pb, así como también una desigualdad de pb. La invención también incluye homólogos que corresponden a las secuencias de polinucleótidos del TFF3 proporcionadas en este documento, donde la fuente de genes homólogos puede ser cualquier especie de mamífero, por ejemplo especies de primates, particularmente humanos; roedores, tales como ratas; caninos, felinos, bovinos, ovinos, equinos, levadura, nemátodos, etcétera. Entre las especies de mamíferos, por ejemplo, un humano y un ratón, los homólogos tienen generalmente una similitud de secuencia sustancial con el gen del TFF3 o una porción del mismo, tal como por ejemplo al menos 75% de identidad de secuencia, al menos 90%, al menos 95%, 96%, 97%, 98% o 99% entre secuencias de nucleótidos. La similitud de secuencia se calcula en base a una secuencia de referencia, la cual puede ser un subconj nto de una secuencia más grande, preferiblemente la secuencia de codificación extracelular, por ejemplo como una configuración conservada, parte de la región de codificación, región flanqueadora, etcétera. Una secuencia de referencia tendrá usualmente al menos aproximadamente 18. nt contiguos de longitud, más usualmente al menos aproximadamente 30 nt de longitud y se puede extender a la secuencia completa que está siendo comparada. Los algoritmos para los análisis de secuencias son conocidos en el campo, tal como BLA.ST con espacios utilizando parámetros por omisión, descrito en Altschul y colaboradores, Nucleic Acids Res. (1997) 25:3389-3402.. En general, las variantes de los polinucleótidos del TFF3 descritas en este documento tienen una identidad de secuencia mayor que al menos aproximadamente 65%, preferiblemente al menos aproximadamente 75%, más preferiblemente al menos aproximadamente 85% y puede ser mayor que al menos aproximadamente 90%, 95%, 96%,. 98%, 99% o más , determinada por medio del algoritmo de búsqueda de homología Smíth-Waterman que es implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) . Un método ejemplar' para calcular el porcentaje de identidad es el algoritmo Smith-Waterman, que utiliza los siguientes: identidad de secuencia de ADW global mayor que 65% determinada por medio del algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman que es implementado en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) utilizando una búsqueda de espacios afín con los siguientes parámetros de búsqueda: penalizacion por apertura de espacio, 12; y penalizacion por extensión de espacio, 1. Los ácidos nucleicos principales pueden ser ADNcs o ADNs genómicos, así como también fragmentos de los mismos, particularmente fragmentos que. codifican un producto génico biológicamente activo y/o que son útiles en los métodos descritos en este documento (por ejemplo, en el dignostico, como un identificador único de un gen de interés expresado diferencialmente, etcétera) . El término "ADNc" utilizado en este documento se propone para incluir todos los ácidos nucleicos que comparten la disposición de los elementos de secuencia encontrados en especies de ARNm maduras, nativas, donde los elementos de secuencia son exones y regiones no codificadoras 3' y 5'. Normalmente, las especies de ARNm tienen exones contiguos, con los intrones intermedios, cuando están presentes, que son removidos por medio del empalme de ARN nuclear, para crear un marco de lectura abierto continuo que codifica un polipéptido. Las especies de ARNm también pueden existir con tanto exones como intrones, donde los intrones pueden ser removidos por medio del empalme alternativo. Además, se debe observar que las diferentes especies de AR ms codificadas por la misma secuencia genómica pueden existir en niveles variantes en una célula y la detección de estos diversos niveles de especies de ARNm puede ser indicativa de la expresión diferencial del producto génico, codificado en la célula. Una secuencia genómica de interés comprende el ácido nucleico. que está presente entre el codón de iniciación y el codón de detención, como se define en las secuencias listadas, inclusive todos los intrones que están presentes normalmente en un cromosoma nativo. Puede incluir además las regiones no traducidas 3' y 5' que se encuentran en el ARNm maduro. Puede incluir además secuencias reguladoras de la transcripción y la traducción específicas, tales como promotores, intensificadores, etcétera, que incluyen aproximadamente 1 kb, pero posiblemente más, del ADN genómico flanqueador en el extremo ya sea 5' como 3' de la región transcrita. El ADN genómico puede aislarse como un fragmento de 100 kpb o más pequeño; y puede ser sustancial ente libre de una secuencia croirDsómica flanqueadora . El ADN genómico que flanquea la región codificadora, ya sea 3' como 5', o las secuencias reguladoras internas que se encuentran algunas veces en los intrones contienen secuencias requeridas para la expresión específica de la etapa o específica del estado de enfermedad del tejido apropiado.

Los ácidos nucleicos de la invención principal pueden codificar todos o una parte de los polipéptidos principales del TFF3 o pueden comprender secuencias no codificadoras, por ejemplo de la región no codificadora 5' o 3' del gen. Como se observa, estos ADNs o AKNs pueden estar en una orientación en sentido positivo o antisentido. Los fragmentos de doble cadena o de cadena individual pueden obtenerse de la secuencia de ADN al sintetizar químicamente los oligonucleótidos de acuerdo con métodos convencionales, por medio de la digestión de enzimas de restricción, por medio de la amplificación de PCR, etcétera. Los polinucleótidos aislados y fragmentos de polinucleótidos que están contemplados por la invención comprenden al menos aproximadamente 10, aproximadamente 15, aproximadamente 20, aproximadamente 35, aproximadamente 50, aproximadamente 100, de aproximadamente 150 a aproximadamente 200, de aproximadamente 250 a aproximadamente 300 o aproximadamente 350 nt contiguos seleccionados del polinucleótido proporcionado en este documento. Para la mayor parte, los fragmentos serán de al menos 15 nt, usualmente de al menos 18 nt o 25 nt y hasta al menos aproximadamente 50 nt contiguos de longitud o más. En algunas modalidades, las moléculas de polinucleótidos comprenden una secuencia contigua de al menos 12 nt seleccionados de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en este documento.

Las sondas de oligonucleótidos especificas para los polinucleótidos del TFF3 pueden generarse utilizando las secuencias de polinucleótidos del TFF3 descritas en este documento. Las sondas son preferiblemente fragmentos de al menos aproximadamente 12 nt, 15 nt, 16 nt, 18 nt, 20 nt, 22 nt, 24 nt o 25 nt de una secuencia contigua, correspondiente de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en este documento y pueden ser menores de 2 kb, 1 kb, 0.5 kb, 0.1 kb o 0.05 kb de longitud. Las sondas pueden sintetizarse químicamente o pueden generarse a partir de polinucleótidos más grandes utilizando enzimas de restricción. Las sondas pueden etiquetarse, por ejemplo, con una marca radioactiva, biotinilada o fluorescente. Preferiblemente, las sondas se diseñan en base a una secuencia de identificación de cualquiera de las secuencias de polinucleótidos proporcionadas en este documento. Más preferiblemente, las sondas se diseñan en base a una secuencia contigua de uno de los polinucleótidos principales que permanecen desenmascarados después de la aplicación de un programa de enmascaramiento para enmascarar la baja complejidad (por ejemplo XBLAST) para la secuencia, es decir, uno seleccionaría una región no enmascarada indicada por los polinucleótidos fuera de los tramos poli-n de la secuencia enmascarada que es producida por el programa de enmascaramiento.

Los polinucleótidos del TFF3 de la invención principal pueden aislarse y obtenerse con una pureza sustancial, generalmente en una forma diferente de un cromosoma intacto. Típicamente, los polinucleótidos, ya sea como ADN s ARN, pueden obtenerse sustancialmente libres de otras secuencias de ácido nucleico de origen natural, que son generalmente al menos aproximadamente 50%, usualmente al menos aproximadamente 90% puras y son típicamente "recombinantes" , por ejemplo, flanqueadas por uno o más nucleótidos con los cuales no están asociadas normalmente en un cromosoma de origen natural . Los polinucleótidos del TFF3 descritos en este documento pueden proporcionarse como una molécula lineal o dentro de una molécula circular y pueden proporcionarse dentro de moléculas de replicación de manera autónoma (vectores) o dentro de moléculas sin secuencias de replicación. La expresión de los polinucleótidos puede regularse por sí misma o por otras secuencias reguladoras que son conocidas en el campo. Los polinucleótidos pueden introducirse en las células hospedantes, adecuadas utilizando una variedad de técnicas disponibles en el campo, tal como la transferencia de ADN mediada por policationes de transíerrina, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados , transferencia de ADN mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex revestidas con ADN, fusión de protoplastos , infección viral, electroporación, pistola de genes, transfección mediada por fosfato de calcio y similares. Las composiciones de ácido nucleico descritas en este documento se pueden utilizar para, por ejemplo, producir polipéptidos (los cuales pueden utilizarse para obtener anticuerpos anti-TFF3) como sondas para la detección del ARMm en muestras biológicas (por ejemplo, extractos de células humanas) para generar copias adicionales de los polinucleótidos, para generar ribozimas y oligonucleótidos antisentido y como sondas de ADN de cadena individual o como oligonucleótidos formadores de cadenas triples. Las sondas descritas en este documento pueden utilizarse para, por ejemplo, determinar la presencia o ausencia de cualquiera de los polinucleótidos proporcionados en este documento o variantes de los mismos en una muestra. Estos y otros usos se describen en detalle adicional a continuación. El término "superponer" , utilizado en este documento, se refiere a la región de secuencia compartida por más de un polinucleótido u oligonucleótido . Por ejemplo, un oligonucleótido que se superpone a un oligonucleótido adicional tiene una región de secuencia que corresponde sustancialmente a una región de secuencia en el oligonucleótido adicional. En algunas modalidades, la superposición puede ser de al menos aproximadamente 3, al menos aproximadamente 4, al menos aproximadamente 5, al menos aproximadamente 6, al menos aproximadamente 7, al menos aproximadamente 8, al menos aproximadamente 9, al menos aproximadamente 10, al menos aproximadamente 15, al menos aproximadamente 20, al menos aproximadamente 50, al menos aproximadamente 100 o más nucleotidos de longitud. Agentes Neutralizantes Los métodos y artículos de preparación de la presente invención utilizan o incorporan un agente neutralizante del TFF3 que modula la actividad o expresión del TFF3 en las células. Como se utiliza en este documento,-el término "modular" se refiere a un cambio en la calidad o cantidad de un gen, proteína o cualquier molécula que esté dentro, fuera o sobre la superficie de una célula. El cambio puede ser un incremento o una disminución en la expresión o nivel de una molécula. El término "modula" también incluye cambiar la calidad o cantidad de una función/actividad •biológica tal como, por ejemplo, la proliferación, secreción, adherencia, apoptosis, señalización de célula a célula y similares. En algunas modalidades, la modulación de la actividad o expresión puede ser mayor que aproximadamente 10%, mayor que aproximadamente 20%, mayor que aproximadamente 30%, mayor que aproximadamente 40% o mayor que aproximadamente 50%. Se contempla en este documento una variedad de agentes neutralizantes, tales como moléculas pequeñas, péptidos, anticuerpos, moléculas antisentido, ribozimas, moléculas de iARN y similares. Moléculas Pequeñas El agente neutralizante puede comprender una molécula pequeña que está fusionada opcionalmente a, o conjugada con, un agente citotóxico (tales como aquellos descritos- en este documento) . Las bibliotecas de moléculas pequeñas pueden seleccionarse contra el TFF3 o células que expresan el TPF3 a fin de identificar una molécula pequeña que se una a ese antígeno. La molécula pequeña puede seleccionarse adicionalmente por sus propiedades antagonistas o neutralizantes y/o puede conjugarse con un agente citotóxico de acuerdo con métodos bien conocidos. Péptidos El agente neutralizante también puede ser un péptido generado por medio del diseño racional o por medio de la exhibición de fagos (véase, por ejemplo, el documento WO 98/35036) . En una modalidad, la molécula de la selección puede ser un "imitador de CDR" o análogo de anticuerpo diseñado en base a los CDRs de un anticuerpo. Mientras que estos péptidos pueden ser antagonistas por sí mismos, el péptido puede fusionarse opcionalmente a un agente citotóxico para adicionar o intensificar propiedades antagonistas del péptido. Los péptidos pueden comprender de 2 a aproximadamente 20, de 2 a aproximadamente 15 o de 2 a aproximadamente 10 aminoácidos.

Oligonucleótidos Antisentido En ciertas circunstancias, puede ser deseable modular (por ejemplo, disminuir) la cantidad del TFF3 expresado en una célula. De esta manera, en otro aspecto de la presente invención, los oligonucleótidos antisentido del TFF3 pueden elaborarse y se puede utilizar un método para disminuir el nivel de expresión del TFF3 por una célula que comprende administrar uno o más oligonucleótidos antisentido del TFF3. Por la frase "oligonucleótidos antisentido del TFF3" se hace referencia a oligonucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos' que interactúa a través del apareamiento de bases con una ¦ secuencia de ácido nucleico complementaria que está involucrada en la expresión del TFF3 de tal manera que se reduce la expresión del TFF3. Preferiblemente, la secuencia de ácido nucleico específica que está involucrada en la expresión del TFF3 es una molécula de ADN genomico o molécula de ARNm que codifica el TFF3. Esta molécula de ADN genomico puede comprender regiones reguladoras del gen del TFF3 y/o la secuencia codificadora para la proteína madura del TFF3. El término "complementario" en el contexto de los oligonucleótidos antisentido del TFF3 y los métodos para los mismos significa suficientemente complementario para que esta secuencia permita la hibridación con esa secuencia en una célula, es decir, bajo condiciones fisiológicas. Los oligonucleótidos antisentido del TFF3 comprenden preferiblemente una secuencia que contiene de aproximadamente 8 a aproximadamente 100 nucleótidos y más preferiblemente los oligonucleótidos antisentido comprenden de aproximadamente 15 a aproximadamente 30 nucleótidos o de aproximadamente 18 a aproximadamente 26 nucleótidos. Los oligonucleótidos antisentido del TFF3 también pueden contener una variedad de modificaciones que confieren resistencia a la degradación nucleolítica tales como, por ejemplo, uniones internucleósidos modificadas [Uhlmann y Peyman, Chemical Reviews 90:543-548 (1990); Schneider y Banner, Tetrahedron Lett. 31:335, (1990)], bases de ácido nucleico modificadas como se describe en la patente 5,958,773, y patentes descritas en la misma, y/o azúcares y similares. La descripción adicional de oligonucleótidos modificados se proporciona infra. Cualquier modificación o variación de la molécula antisentido que se sepa en el campo que es altamente aplicable a la tecnología antisentido está incluida dentro del alcance de la invención. Estas modificaciones incluyen la preparación de uniones que contienen fósforo como se describe en las patentes norteamericanas Nos: 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361; 5,625,050 y 5,958,773. La descripción adicional de oligonucleótidos modificados se proporciona infra.

Los compuestos antisentido de la invención pueden incluir bases modificadas. Los oligonucleótidos antisentido de la invención también pueden modificarse al unir químicamente el oligonucleótido a una o más porciones o conjugados para mejorar la actividad, la distribución celular o captación celular del oligonucleótido antisentido. Estas porciones o conjugados incluyen lipidos, tales como colesterol, ácido cólico, tioéter, cadenas alifáticas, fosfolípidos , poliaminas, polietilenglicol (PEG) , porciones de palmitilo y otros como se describe en, por ejemplo, las patentes norteamericanas: 5,514,758, 5,565,552, 5,567,810, 5,574,142, 5,585,481, 5,587,371, 5,597,696 y 5,958,773. La descripción adicional de bases modificadas y conjugados de oligonucleótidos antisentido se proporciona infra. En la técnica antisentido, se puede llevar a cabo un cierto grado de experimentación de rutina para seleccionar las moléculas antisentido óptimas para objetivos particulares. En su diseño, la molécula antisentido puede ser fijada como un objetivo para una porción accesible, o expuesta, de la molécula de ARN objetivo. Los niveles de ARNm en la célula pueden medirse de manera rutinaria en células tratadas y de control por medio de la transcripción inversa del ARNm y el ensayo de los niveles de ADNc . El efecto biológico puede determinarse de manera rutinaria al medir el crecimiento o viabilidad de la célula como es conocido en el campo.

La medición de la especificidad de la actividad antisentido por medio del ensayo y el análisis de los niveles de ADNc es un método reconocido en el campo para validar los resultados antisentido. Por ejemplo, el ARN de células tratadas y de control puede ser transcrito inversamente y las poblaciones de ADNc resultantes pueden analizarse (Branch, A. D., T.I.B.S. 23:45-50 (1998)). Las moléculas antisentido de la presente invención incluyen oligonucleótidos que son complementarios para regiones o porciones de un polinucleótido del TFF3 , tal como un ácido nucleico que tiene una secuencia de nucleótidos de las SEC ID NOS: 5-8. Algunos oligonucleótidos antisentido ejemplares que pueden reducir, solos o en combinación, la expresión del TFF3 en células incluyen aquellos que tienen las secuencias proporcionadas en la tabla 1 a continuación o fragmentos de las mismas.

Tabla 1: Oligonucleótidos antisentido, ejemplares del TFP3 La especificidad y sensibilidad del antisentido han sido aprovechadas por aquellas personas de experiencia en el campo para usos terapéuticos . Los oligonucleótidos antisentido se han empleado como porciones terapéuticas en el tratamiento de estados de enfermedad en animales y en el hombre. Los oligonucleótidos antisentido han sido administrados de manera segura y efectiva a humanos y actualmente se están llevando a cabo numerosos ensayos clínicos. Se establece de esta manera que los oligonucleótidos pueden ser modalidades terapéuticas útiles que también pueden ser útiles en regímenes para el tratamiento de células, tejidos y mamíferos, inclusive humanos.

Algunos ejemplos de compuestos antisentido que son útiles en esta invención incluyen los oligonucleótidos que contienen estructuras principales modificadas o uniones internucleósidos no naturales. Los oligonucleótidos que tienen estructuras principales modificadas incluyen aquellos que retienen un átomo de fósforo en la estructura principal y aquellos que no tienen un átomo de fósforo en la estructura principal . Para propósitos de esta especificación, y como es referido algunas veces en el campo, los oligonucleótidos modificados que no tienen un átomo de fósforo en su estructura principal internucleósidos también pueden considerarse que son oligonucleósidos . Las estructura ' principales , modificadas, ejemplares de oligonucleótidos incluyen, por ejemplo, fósforotioatos, fósforotioatos quirales, fósforoditioatos, fosfotriésteres, aminoalquilfosfotriésteres, fosfonatos de metilo y otros fosfonatos de alquilo que incluyen 3 ' -alquilen-fosfonatos y fosfonatos quirales, fosfinatos, fosforamidatos que incluyen 3'-amino-fosforamidato y aminoalquilfosforamidatos, tionofosforamidatos, tiono-alquilfosfonatos, tiono-alquilfosfotriésteres y borano-fosfatos que tienen uniones 3' -5' normales, análogos unidos a 2' -5' de estos y aquellos que tienen polaridad invertida en donde los pares adyacentes de unidades de nucleósidos son unidos de 3 '-5' a 5' -3' o de 2' -5' a 5' -2'. Las diversas sales, sales mezcladas y formas de ácidos libres también están incluidas.

Las patentes norteamericanas, representativas que enseñan la preparación de las uniones que contienen fósforo anteriores incluyen, pero no están limitadas a, las patentes norteamericanas Nos: 3,687,808; 4,469,863; 4,476,301; 5,023,243; 5,177,196; 5,188,897; 5,254,423; 5,276,019; 5,278,302; 5,286,717; 5,321,131; 5,399,676; 5,405,939; 5,453,496; 5,455,233; 5,466,677; 5,476,925; 5,519,126; 5,536,821; 5,541,306; 5,550,111; 5,563,253; 5,571,799; 5,587,361 y 5,625,050. Algunas estructuras principales, modificadas, ejemplares de oligonucleótidos que no incluyen un átomo de fósforo en las mismas tienen estructuras principales que están formadas por uniones internucleósidos de alquilo o cicloalquilo de cadena corta, uniones internucleósidos de heteroátomos mezclados y de alquilo o cicloalquilo o una o más uniones internucleósidos, heteroatómicas o heterociclicas de cadena corta. Estas incluyen aquellas que tienen uniones de morfolino (formadas en parte de la porción de azúcar de un nucleósido) ; estructuras principales de siloxano; estructuras principales de sulfuro, sulfóxido y sulfona; estructuras principales de formacetilo y tioformacetilo; estructuras principales de metilenformacetilo y tioformacetilo; estructuras principales que contienen alqueno; estructuras principales de sulf mato estructuras principales de metilenimino y metilenhidrazino; estructuras principales de sulfonato y sulfonamida; estructuras principales de amida; y otras que tienen partes mezcladas de componentes de N, O, S y CH2. Las patentes norteamericanas, ' representativas que enseñan la preparación de los oligonucleósidos anteriores incluyen, pero no están limitadas a, las patentes norteamericanas Nos: 5,034,506; 5,166,315; 5,185,444; 5,214,134; 5,216,141; 5,235,033; 5,264,562; 5,264,564; 5,405,938; 5,434,257; 5,466,677; 5,470,967; 5,489,677; 5,541,307; 5,561,225; 5,596,086; 5,602,240; 5,610,289; 5,602,240; 5,608,046; 5,610,289; 5,618,704; 5,623,070; 5,663,312; 5,633,360; 5,677,437 y 5,677,439. En otros miméticos de oligonucleótidos , tanto el azúcar como la unión internucleósidos , es decir, la estructura principal, de las unidades de nucleótidos son remplazados por grupos novedosos . Las unidades de bases pueden mantenerse para la hibridación con un compuesto objetivo de ácido nucleico, apropiado. Uno de estos compuestos oligoméricos, un mimético de oligonucleótido que ha mostrado tener excelentes propiedades de hibridación, es referido como un ácido nucleico peptídico (PNA por sus siglas en inglés) . En los compuestos de PNA, la estructura principal de azúcar de un oligonucleótido es remplazada por una estructura principal que contiene amida, en particular una estructura principal de aminoetilglicina. Las nucleobases son retenidas y son enlazadas directa o indirectamente a los atoraos de nitrógeno aza de la porción de amida de la estructura principal. Las patentes norteamericanas, representativas que enseñan la preparación de los compuestos de PNA incluyen, pero no están limitadas a, las patentes norteamericanas Nos: 5,539,082; 5,714,331 y 5,719,262, cada una de las cuales es incorporada en este documento a manera de referencia. Una enseñanza adicional de los compuestos de PNA puede encontrarse en Nielsen y colaboradores, Science, 1991, 254, 1497-1500. En las modalidades adicionales de la invención se encuentran los oligonucleótidos con estructuras principales de fósforotioato y los oligonucleósidos con estructuras principales de heteroátomos, tales como aquellos proporcionados en la patente norteamericana No. 5,489,677 y en la patente norteamericana No. 5,602,240. También se proporcionan oligonucleótidos que tienen estructuras principales de morfolino de la patente norteamericana No. 5,034,506 referida anteriormente. Los oligonucleótidos modificados también pueden contener una o más porciones de azúcar sustituidas . Por ejemplo, los oligonucleótidos pueden comprender una de las siguientes en la posición 2': OH; F; O-, S- o N-alquilo; O-, S- o N-alquenilo; O-, S- o N-alquinilo; u O-alquil-O-alquilo, en donde alquilo, alquenilo y alquinilo pueden ser alquilo de 1 a 10 átomos de carbono o alquenilo y alquinilo de 2 a 10 átomos de carbono sustitüidos o no sustituidos. También se pueden hacer modificaciones similares a otras posiciones en el oligonucleótido, particularmente la posición 3' del azúcar en el nucleótido terminal 3' o en los oligonucleotidos unidos a 2 '-5' y la posición 5' del nucleótido terminal 5'. Los oligonucleotidos también pueden tener miméticos de azúcar, tales como porciones de ciclobutilo en lugar del azúcar de pentofuranosilo . Las patentes norteamericanas, representativas que enseñan la preparación de estas estructuras de azúcar modificadas incluyen, pero no están limitadas a, las patentes norteamericanas Nos: 4,981,957; 5,118,800; 5,319,080; 5,359,044; 5,393,878; 5,446,137; 5,466,786; 5,514,785; 5,519,134; 5,557,811; 5,576,427; 5,591,722; 5,597,909; 5,610,300; 5,627,053; 5,639,873; 5,646,265; 5,658,873; 5,670,633 y 5,700,920, cada una de las cuales se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. Los oligonucleotidos también pueden incluir modificaciones o sustituciones de nucleobases (frecuentemente referidas en el campo simplemente como "bases" ) . Como se utiliza en este documento, las nucleobases "no modificadas" o "naturales" incluyen las bases de purina, adenina (A) y guanina (G) y las bases de pirimidina, timina (T) , citosina (C) y uracilo (U) . Las nucleobases modificadas incluyen otras nucleobases sintéticas y naturales, tales como 5-metilcitosina (5-me-C) , 5-hidroximetil- , citosina, xantina, hipoxantina, 2-aminoadenina, 6-metilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-propilo y otros derivados de alquilo de adenina y guanina, 2-tiouracilo, 2-tiotimina y 2-tiocitosina, 5-halouracilo y citosina, 5-propinil-uracilo y citosina, 6-azo-uracilo, citosina y timina, 5-uracilo (pseudouracilo) , 4-tiouracilo, 8-halo, 8-amino, 8-tiol, 8-tioalquilo, 8-hidroxilo y otras adeninas y guaninas 8-sustituidas, 5-halo particularmente 5-bromo, 5-trifluorometilo y otros uracilos y citosinas 5-sustituidos, 7-metilguanina y 7-metiladenina, 8-azaguanina y 8-azaadenina, 7-desazaguanina y 7-desazaadenina y 3-desazaguanina y 3-deazaadenina . Las patentes norteamericanas, representativas que enseñan la preparación de las ciertas nucleobases modificadas que se observaran anteriormente, asi como también otras nucleobases modificadas incluyen, pero no están limitadas a, la patente norteamericana No. 3,687,808 observada anteriormente, así como también las patentes norteamericanas Nos. 4,845,205; 5,130,302; 5,134,066; 5,175,273; 5,367,066; 5,432,272; 5,457,187; 5,459,255; 5,484,908; 5,502,177; 5,525,711; 5,552,540; 5,587,469; 5,594,121; 5,596,091; 5,614,617; 5,681,941 y 5,750,692, cada una de las cuales se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad.

Otra modificación de los oligonucleótidos de la invención incluye unir químicamente al oligonucleótido una o más porciones o conjugados que mejoren la actividad, distribución celular o captación celular del oligonucleótido. Estas porciones incluyen, pero no están limitadas a, porciones de lípidos tal como una porción de colesterol, ácido cólico, un tioéter, por ejemplo hexil-S-tritiltiol, un tiocolesterol , una cadena alifática, por ejemplo residuos de dodecandiol o undecilo, un fosfolípido, por ejemplo di- exadecil-rac-gricerol o 1 , 2-di-0-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato de trietil- monio, una poliamina o una cadena de polietilenglicol o ácido adamantano-acético, una porción de palmitilo o una porción de octadecilamina o exilamino-carbonil-oxicolesterol . Las patentes norteamericanas, representativas que enseñan la preparación de estos conjugados de oligonucleótidos incluyen, pero no están limitadas a, las patentes norteamericanas Nos. 4,828,979; 4, 948, 882 ; 5,218,105; 5, 525, 465; 5,541,313; 5,545,730 5,552,538; 5,578,717; 5,580,731; 5,580, 731; 5,591,584 5,109,124; 5, 118 , 802 ; 5,138,045; 5, 14, 077; 5,486,603 5,512,439; 5,578,718; 5, 608,046; 4,587,044; 4, 605,735 4, 667, 025; 4,762,779; 4, 789, 737; 4, 824, 941; 4, 835,263 4,876,335; 4,904,582; 4,958,013; 5, 082, 830; 5, 112, 963 5,214,136; 5, 082, 830 ; 5,112,963; 5,214,136; 5, 245, 022 5,254,469; 5,258,506; 5, 262, 536; 5,272,250; 5,292,873 5,317,098; 5,371,241; 5,391,723; 5,416,203; 5,451,463; 5,510,475; 5,512,667; 5,514,785; 5,565,552; 5,567,810; 5,574,142; 5,585,481; 5,587,371; 5,595,726; 5,597,696; 5,599,923; 5,599,928 y 5,688,941 cada una de las cuales es incorporada en este documento a manera de referencia. No es necesario que todas las posiciones en un compuesto dado sean modificadas uniformemente y de hecho se pueden incorporar más de una de las modificaciones mencionadas anteriormente en un compuesto individual o aún en un nucleosido individual dentro de un oligonucleótido. La presente invención también incluye compuestos antisentido que son compuestos quiméricos. Los compuestos antisentido "quiméricos" , o "quimeras" en el contexto de esta invención, son compuestos antisentido, particularmente oligonucleótidos , los cuales contienen dos o más regiones químicamente distintas, cada una hecha de al menos una unidad monomérica, es decir, un nucleótido en el caso de un compuesto de oligonucleótido. Estos oligonucleótidos contienen típicamente al menos una región en donde el oligonucleótido es modificado para conferir al oligonucleótido resistencia incrementada- a la degradación de nucleasa, captación celular incrementada y/o afinidad de enlace incrementada para el ácido nucleico objetivo. Una región adicional del oligonucleótido puede servir como un substrato para enzimas capaces de escindir los híbridos de ARN:ADN o ARN:ARN. A manera de ejemplo, la RNasa H es una endonucleasa celular la cual escinde la cadena de ARN de un duplo de ARN:ADN. Por lo tanto, la activación de RNasa H da por resultado la escisión del objetivo de ARN, aumentando en gran medida grandemente con lo cual la eficacia de la inhibición en el oligonucleótido de la expresión de genes. Consecuentemente, a menudo se pueden resultados comparables con oligonucleótidos más cortos cuando se utilizan oligonucleótidos quiméricos, en comparación con desoxioligonucleótidos de fósforotioato que hibridizan la misma región objetivo. La escisión del objetivo de ARN puede detectarse rutinariamente' por medio de la electroforesis de gel y, si es necesario, técnicas de hibridación de ácido nucleico asociadas que son conocidas en el campo. Los compuestos antisentido, quiméricos de la invención pueden formarse como estructuras compuestas de dos o más oligonucleótidos, oligonucleótidos modificados, oligonucleósidos y/o miméticos de oligonucleótidos como se describiera anteriormente. Estos compuestos también han sido referidos en el campo como híbridos o "gapmers" (oligonucleótidos antisentido, quiméricos) . Las patentes norteamericanas, representativas que enseñan la preparación de estas estructuras híbridas incluyen, pero no están limitadas a, las patentes norteamericanas Nos. 5,013,830; 5,149,797; 5,220,007; 5,256,775; 5,356,878; 5,403,711; 5,491,133; 5,565,350; 5,623,065; 5,652,355; 5,652,356 y 5,700,922, cada una de las cuales es incorporada en este documento a manera de referencia en su totalidad. Los compuestos antisentido que se utilizan de acuerdo con esta invención pueden elaborarse de manera conveniente y rutinaria a través de la técnica bien conocida de síntesis de fase sólida. El equipo para esta síntesis es vendido por varios proveedores que incluyen, por ejemplo, Applied Biosystems (Foster City, Calif.). Cualquier otro medio para esta síntesis que sea conocido en el campo puede emplearse adicional o alternativamente. Es bien conocido el uso de técnicas similares para preparar oligonucleótidos tales como fósforotioatos y derivados alquilados. Los compuestos antisentido de la invención pueden ser sintetizados in vitro. Los compuestos de la invención también pueden mezclarse, encapsularse, conjugarse o de otra manera asociarse con otras moléculas, estructuras de moléculas o mezclas de compuestos, como por ejemplo liposomas, moléculas fijadas como objetivos por receptores, formulaciones orales, rectales, tópicas u otras formulaciones, para ayudar en la captación, distribución y/o absorción. Las patentes norteamericanas, representativas que enseñan la preparación de estas formulaciones de auxiliares en la captación, distribución y/o absorción incluyen, pero no están limitadas a, las patentes norteamericanas Nos. 5,108, 921 5,354,844; 5,416,016; 5,459,127 5,521,291 5,543, 158 5,547,932; 5,583,020; 5,591,721 4,426,330 4,534, 899 5,013,556; 5,108,921; 5,213,804 5,227,170 5,264, 221 5,356,633; 5,395,619; 5,416,016 5,417,978 5,462,854 5,469,854; 5,512,295; 5,527,528 5,534,259 5,543, 152 5,556,948; 5,580,575 y 5,595,756, cada una de las cuales es incorporada en este documento a manera de referencia . Los compuestos antisentido de la invención incluyen además cualquiera de las sales, esteres o sales de estos esteres farm céuticamente aceptables o cualquier otro compuesto el cual, con la administración a un animal, inclusive un humano, es capaz de proporcionar (directa o indirectamente) el metabolito biológicamente activo o un residuo del mismo. Por consiguiente, por ejemplo, la descripción también se dirige a profármacos y sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos antisentido de la invención, sales farmacéuticamente aceptables de estos profármacos y otros bioequivalentes . Los compuestos antisentido de la presente invención pueden utilizarse para diagnósticos, tratamientos terapéuticos, profilaxis y como reactivos y equipos de investigación. Para los tratamientos terapéuticos, un animal, preferiblemente un humano, que se sospecha que tiene una enfermedad o trastorno el cual puede ser tratado por medio de la modulación de la expresión del TFP3 es tratado al administrarle los compuestos antisentido de acuerdo con esta invención. Los compuestos de la invención pueden utilizarse en composiciones farmacéuticas al adicionar una cantidad efectiva de un compuesto antisentido a un diluyente o portador adecuado, farmacéuticamente aceptable. El uso de los compuestos antisentido y los métodos de la invención también pueden ser profilácticamente útil, por ejemplo, para impedir o retardar la formación o metástasis de tumores, por ejemplo. Los compuestos antisentido de la invención son útiles para la investigación y los diagnósticos, debido a que estos compuestos se hibridizan con ácidos nucleicos que codifican el TFF3 , haciendo posible que la intercalación y otros ensayos sean construidos fácilmente para explotar este hecho. La hibridación de los oligonucleótidos antisentido de la invención con un ácido nucleico que codifica el TFF3 puede detectarse por medios conocidos en el campo. Estos medios pueden incluir la conjugación de una enzima al oligonucleótido, el radioetiquetado del oligonucleótido o cualquier otro medio de detección adecuado. Los equipos que utilizan estos medios de detección para detectar el nivel de TFF3 en una muestra también se pueden preparar. La presente invención también incluye composiciones y formulaciones farmacéuticas que incluyen los compuestos antisentido de la invención. En algunas modalidades, las composiciones que contienen moléculas antisentido se pueden preparar y se pueden formular como emulsiones. Las emulsiones son sistemas típicamente heterogéneos de un líquido dispersado en otro en la forma de gotitas que exceden usualmente 0.1 µp? de diámetro. Las emulsiones son frecuentemente sistemas bifásicos que comprenden dos fases de líquidos inmiscibles que son mezclados íntimamente y dispersados entre sí. En general, las emulsiones pueden ser ya sea de agua en aceite ( /o, por sus siglas en inglés) o de la variedad de aceite en' agua (o/w, por sus siglas en inglés) . Cuando una fase acuosa es dividida finamente en o dispersada como gotitas diminutas en una fase oleosa, voluminosa, la composición resultante es llamada una emulsión de agua en aceite (w/o) . Alternativamente, cuando una fase oleosa es dividida finamente en y dispersada como gotitas diminutas en una fase acuosa, voluminosa, la composición resultante es llamada una emulsión de aceite en agua (o/w) . Las emulsiones pueden contener componentes adicionales además de las fases dispersadas y el fármaco activo que pueden estar presentes como una solución ya sea en la fase acuosa, la fase oleosa o por sí mismas como una fase separada. Los excipientes farmacéuticos, tales como emulsionantes, estabilizadores, tintes y antioxidantes también pueden estar presentes en emulsiones como sea necesario. Las emulsiones farmacéuticas también pueden ser múltiples emulsiones que están comprendidas de más de dos fases tal como, por ejemplo, en el caso de las emulsiones de aceite en agua en aceite (o/w/o', por sus siglas en inglés) y de agua en aceite en agua ( /o/w, por sus siglas en inglés) . Estas formulaciones complejas proporcionan frecuentemente ciertas ventajas que no son proporcionadas por las emulsiones binarias, simples. Las emulsiones múltiples en las cuales las gotitas de aceite individuales de una emulsión de o/w encierran pequeñas gotitas de agua constituyen una emulsión de w/o/w. De igual manera, un sistema de gotitas de aceite encerradas en glóbulos de agua estabilizadas en una fase oleosa, continua proporciona una emulsión de o/w/o. En otra modalidad relacionada, los métodos y las composiciones de la invención pueden contener una o más moléculas antisentido, particularmente oligonucleótidos, fijadas como objetivo para un primer ácido nucleico y uno o más compuestos antisentido adicionales fijados como objetivo a un segundo objetivo de ácido nucleico. Dos o más compuestos combinados pueden utilizarse juntos o secuencialmente . En algunas modalidades, al menos uno de los ácidos nucleicos fijados como objetivo codifica el TFP3. Ríbozirnas El agente neutralizante también puede ser una ribozima que, por ejemplo, inhibe la expresión del TFF3. Las ribozimas son moléculas de AR típicamente catalíticas con actividad ribonucleica que son capaces de aclarar un ácido nucleico de cadena individual, tal como un ARNm, para el cual tienen una región complementaria. Debido a que una ribozima es una enzima, una molécula de ribozima individual puede escindir muchas moléculas del ARN objetivo. Además, la ribozima es típicamente un inhibidor altamente específico, con la especificidad de inhibición que depende no únicamente del mecanismo de apareamiento de bases del enlace al ARN objetivo, sino también del mecanismo de escisión del ARN objetivo. Las moléculas de ribozima diseñadas para escindir catalíticamente las transcripciones de ARNm de genes objetivo también se pueden utilizar para impedir la traducción del ARN de gen objetivo y, por lo tanto, la expresión del producto génico objetivo. (Véase, por ejemplo, el documento WO 90/11364 y Sarver y colaboradores, 1990, Science 247, 1222-1225) . Las ribozimas pueden diseñarse para hibridizar varios sitios en el ARN objetivo. Los brazos de enlace pueden ser complementarios para el sitio objetivo, tal como un polinucleótido del TFF3. Las ribozimas pueden ser sintetizadas químicamente. Los métodos sintéticos, ejemplares pueden seguir el procedimiento para la síntesis normal de ARN como se describe en Usman y colaboradores, 1987 J. Am. Chem. Soc, 109, 7845-7854 y en Scaringe y colaboradores, 1990 Nucleic Acids Res., 18, 5433-5441 y pueden hacer uso de grupos comunes, protectores y de acoplamiento de ácido nucleico, tales como dimetoxitritilo en el extremo 5' y osforamiditas en el extremo 3 ' . Los rendimientos de acoplamiento gradual promedio pueden ser >98%. Las ribozimas de tipo horquilla también pueden ser sintetizadas en dos partes e hibridizadas para reconstruir la ribozima activa (Chowrira y Burke, 1992 Nucleic Acids Res., 20, 2835-2840). Las ribozimas pueden ser modificadas para mejorar la estabilidad por medio de la modificación con grupos resistentes a nucleasa, por ejemplo, 2'-amino, 2'-C-alilo, 2'-flouro, 2 ' -o-metilo, 2'-H (véase, por ejemplo, Usman y Gedergren, 1992 TIBS 17, 34, el cual es incorporado en este documento a manera de referencia) . Las ribozimas pueden purificarse por métodos conocidos en el campo, tales como la electroforesis de gel o por medio de la cromatografía líquida de alta presión (CLAP) . La actividad de ribozima puede optimizarse al sintetizar químicamente las ribozimas con modificaciones que impiden su degradación por las ribonucleasas del suero (véase por ejemplo, Eckstein y colaboradores, WO 92/07065; Perrault y colaboradores, Wature, 1990, 344:565; Pieken y colaboradores, Science 1991, 253:314; Usman y Cedergren, Trends in Biochem. Sci . 1992, 17:334; Usman y colaboradores, WO 93/15187; y Rossi y colaboradores, WO 91/03162 y patente norteamericana No. 5,652,094, cada una de las cuales es incorporada en este documento a manera de referencia y las cuales describen diversas modificaciones químicas que se pueden hacer a las porciones de azúcar de las moléculas de ARN enzimáticas. De esta manera, las ribozimas (por ejemplo, ribozima de tipo horquilla, cabeza de martillo o ARNasa P, asi como también una minizima (McCall, M. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 89:5710-5714) u otra molécula de ARN catalítica) se pueden utilizar para aclarar catalíticamente las transcripciones del TFF3 para inhibir con lo cual la traducción del ARNm del TFF3. Una ribozima que tiene especificidad por el TFF3 puede diseñarse en base a la secuencia de nucleótidos del TFF3 , por ejemplo, una secuencia de ADN del TFF3 humano proporcionada en este documento o un polinucleotido relacionado. Las técnicas para sintetizar las ribozimas se describen en Cech y colaboradores, patentes norteamericanas Nos. 4,987,071 y 5,116,742. Alternativamente, el ARNm del TFF3 puede utilizarse para seleccionar un ARN catalítico que tiene una actividad ribonucleica específica de una agrupación de moléculas de ARN. (Véase, por ejemplo, Bartel y Stostak, J. W., J. Biol . Chem. 1251:1411-1418 (1993) ) . Alternativamente, la expresión de TFF3 puede ser inhibida al fijar como objetivo las secuencias de nucleótidos que son complementarias para la región reguladora del TFF3 (promotor, intensificador) para formar estructuras de tres hélices que impiden la transcripción en las células objetivo. (Véase, por ejemplo, Helene y colaboradores, Annal . NY Acad. Sci. 660:27-36 (1992) ) . De acuerdo con algunas modalidades, el agente neutralizante es una ribozima de tipo cabeza de martillo. Se cree que las ribozimas de tipo cabeza de martillo escinden los ARNms en ubicaciones dictadas por las regiones flanqueadoras que forman pares de bases complementarios con el ARNm objetivo. Una característica del uso de ribozimas de tipo cabeza de martillo es que el ARNm objetivo tiene la siguiente secuencia de dos bases: 5'-UG-3'. La construcción y la producción de ribozimas de tipo cabeza de martillo son bien conocidas en el campo y se describen en Myers, 1995, Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Nueva York, (véase especialmente la FIGURA 4, página 833) y en Haseloff y Gerlach, 1988, Nature, 334:585-591. De acuerdo con algunas modalidades, la ribozima es diseñada de manera que el sitio de reconocimiento de escisión esté localizado cerca del extremo 5' del ARNm de gen objetivo, por ejemplo, para incrementar la eficacia y minimizar la acumulación intracelular de las transcripciones de ARNm no funcionales. Las ribozimas de la presente invención también incluyen endorribonucleasas de ARN (posteriormente "ribozimas de tipo Cech") tal como la ribozima que se encuentra naturalmente en Tetrahymena thermophila (conocida como el ARN de IVS o L-19 IVS) y la cual ha sido descrita extensivamente por Thomas Cech y colaboradores (Zaug y colaboradores, 1984, Science, 224:574-578; Zaug y Cech, 1986, Science, 231: 470-475; Zaug y colaboradores, 1986, Nature, 324:429-433; solicitud de patente internacional publicada No. O 88/04300 por University Patents Inc.; Been y Cech, 1986, Cell, 47:207-216) . Las ribozimas de tipo Cech tienen típicamente un sitio activo de ocho pares de bases que se hibridiza con una secuencia de ARN objetivo después de que toma lugar la escisión del AR objetivo. Las ribozimas se' pueden adicionar directamente o pueden formar complejos con lípidos catiónicos, pueden empacarse dentro de liposomas o de otra manera pueden suministrarse a células objetivo. El ARN o complejos de ARN pueden administrarse localmente a tejidos relevantes ex vivo, o in vivo a través de la inyección, inhalación de aerosol, bomba de infusión o dispositivo "stent" , con o sin su incorporación en biopolimeros . Las ribozimas pueden administrarse a células por medio de una variedad de métodos conocidos para aquellas personas que están familiarizadas con el campo, inclusive, pero no restringido a, el encapsulamiento en liposomas, por medio de la ionoforesis o por medio de la incorporación en otros vehículos, tales como hidrogeles, ciclodextrinas, nanocápsulas biodegradables y microesferas bioadhesivas. Para algunas indicaciones, las ribozimas pueden suministrarse directamente ex vivo a células o tej idos con o sin los vehículos mencionados anteriormente. Alternativamente, la combinación de ARN/vehículo puede suministrarse localmente por medio de la inyección directa o por medio del uso de un catéter, bomba de infusión o dispositivo ¾stent" . Otras rutas de suministro incluyen, pero no están limitadas a, el suministro intravascular, intramuscular, subcutáneo o inyección a las articulaciones, inhalación de aerosol, oral (en forma de tabletas o pildoras) , tópico, sistémico, ocular, intraperitoneal y/o intratecal . Las descripciones más detalladas del suministro y administración de ribozimas se proporcionan en Sullivan y colaboradores, documento WO 94/02595, el cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad. Otro medio para acumular altas concentraciones de ribozima(s) dentro de células puede incluir la incorporación de las secuencias codificadoras de ribozimas en un vector de expresión de ADN. La transcripción de las secuencias de ribozimas puede conducirse desde un promotor para la ARN polimerasa I (pol I) , ARN polimerasa II (pol II) o AR polimerasa III (pol III) eucarióticas . Las transcripciones de los promotores de pol II o pol III serán expresadas a altos niveles en todas las células; los niveles de un promotor de pol II dado en un tipo de célula dado dependerán de la naturaleza de las secuencias reguladoras de genes (intensificadores, silenciadores, etcétera) que están presentes cerca. También se pueden utilizar promotores de ARN polimerasa procariotica, con la condición que la enzima ARN polimerasa procariotica sea expresada en las células apropiadas (Elroy-Stein, O. y Moss, B . , 1990, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 87, 6743-7; Gao, X. y Huang; L., 1993, Nucleic Acids Res., 21, 2867-72; Lieber, A. y colaboradores, 1993, Methods Enzymol . , 217, 47-66; Zhou, Y. y colaboradores, 1990, Mol. Cell. Biol . , 10, 4529-37). Varios investigadores han demostrado que las ribozimas expresadas de estos promotores pueden funcionar en células de mamífero (por ejemplo (Kashani-Sabet , M. y colaboradores, 1992, Antisense Res. Dev., 2, 3-15; Ojwang, J. O. y colaboradores, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 89, 10802-6; Chen, C. J. y colaboradores, 1992, Nucleic Acids Res., 20, 4581-9; Yu, . y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 90, 6340-4; L'Huillier, P. J. y colaboradores, 19921, EMBO J. , 11, 4411-8; Lisziewicz, J. y colaboradores, 1993, Proc. Nati. Acad. Sci. E.U.A., 90, 8000-4)). Las unidades de transcripción de ribozima anteriores pueden incorporarse en una variedad de vectores para la introducción en células de mamífero, inclusive, pero no restringido a, vectores de ADN de pl smido, vectores de ADN viral (tal como vectores de adenovirus o adeno-asociados) o vectores de ARN viral (tales como vectores retrovirales, de virus del bosque Semliki, de virus Sindbis) . De acuerdo con algunas modalidades, una unidad de transcripción que expresa una ribozima de tipo horquilla que escinde el ARN objetivo (por ejemplo, AR m del TFF3) puede insertarse en un vector de ADN de plásmido o un vector viral de ADN de adenovirus o adeno-asociado . Ambos vectores virales se han utilizado para transferir genes al pulmón y ambos vectores pueden conducir a una expresión transitoria de genes (Zabner y colaboradores, 1993 Cell 75, 207; Cárter, 1992 Curr. Opin. Biotech. 3, 533) . El vector de adenovirus es suministrado como partxculas adenovirales, recombinantes . El ADN puede suministrarse solo o en complejos con vehículos (como se describe para el ARN anterior) . El ADN, los complejos de ADN/vehículo o las partxculas de adenovirus recombinantes pueden administrarse localmente al sitio de tratamiento, por ejemplo a través del uso de un catéter de inyección, dispositivo "stent" o bomba de infusión o se adicionan directamente a las células o tejidos ex vivo. Moléculas de iARN La interferencia de ARN (iARN) es un mecanismo inactivador de genes conservados desde el punto de vista evolutivo, descubierto originalmente en estudios del nemátodo Caenorhabditis elegans (Lee y colaboradores, Cell 75:843 (1993); Reinhart y colaboradores, Nature 403:901 (2000)). Se cree que el mecanismo es desencadenado al introducir AR dc (ARN de doble cadena) en células que expresan la maquinaria molecular apropiada, lo cual degrada entonces el ARNm endógeno, correspondiente. El mecanismo incluye la conversión del ARNdc en ARNs cortos que dirigen las ribonucleasas a los objetivos de ARNm homólogos (summarized, Ruvkun, Science 2294:797 (2001), el cual se incorpora en este documento a manera de referencia) . Este proceso está relacionado con la defensa normal contra virus y la movilización de transposones. El tratamiento con ARNdc se ha convertido en un método más común para analizar los organismos con funciones genéticas . La interferencia de ARN o "iARN" es un término acuñado inicialmente por Fire y colaboradores para describir la observación que el ARN de doble cadena (ARNdc) puede bloquear la expresión de genes cuando se introduce en gusanos (Fire y colaboradores, (1998) Nature 391, 806-811) . La molécula de iARN utilizada para llevar a cabo la modulación mediada por la iARN de la expresión de genes puede comprender una o más cadenas del ribonucleotido polimerizado . Puede incluir una variedad de modificaciones, tales como aquellas descritas anteriormente para las moléculas antisentido, inclusive modificaciones para la estructura principal de fosfato-azúcar, el azúcar o la nucleobase para mejorar la estabilidad o afinidad de enlace. Por ejemplo, las uniones de fosfodiéster del ARN natural pueden modificarse para incluir al menos un heteroátomo de nitrógeno o azufre. Las modificaciones en la estructura del ARN pueden ajustarse para permitir la inhibición genética, específica mientras que se evita una respuesta de pánico general en algunos organismos, la cual es generada por el AR dc . De igual manera, las bases pueden modificarse para bloquear la actividad de la adenosina-desaminasa. Él ARN puede producirse enzimáticamente o por medio de la síntesis orgánica, parcial/total. Cualquier ribonucleótido modificado puede incorporarse en el ARN por medio de la síntesis enzimática u ¦ orgánica in vitro . Una molécula de iARN puede ser una molécula de ARNdc. El tamaño de la molécula de iARN que se puede utilizar varía de acuerdo con el tamaño del polinucleótido principal cuya expresión debe suprimirse y es suficientemente grande para ser efectiva en la reducción de la expresión del polinucleótido principal en una célula. Generalmente, el ARN es de al menos aproximadamente 10 a aproximadamente 15 nucleótidos de longitud. En ciertas aplicaciones, el ARN es menor que aproximadamente 20, 21, 22, 23, 24 o 25 nucleótidos de longitud. En otros casos, el ARN es de al menos aproximadamente 50, 100, 150 o 200 nucleótidos de longitud. El ARN puede ser más largo aún en otras ciertas aplicaciones, tal como al menos aproximadamente 300, 400, 500 o 600 nucleótidos. Típicamente, el ARN es menor que aproximadamente 3000 nucleótidos. El tamaño óptimo para cualquier polinucleótido principal, particular puede ser determinado por una persona de experiencia ordinaria en el campo sin experimentación indebida al variar el tamaño del ARN en una forma sistemática y al determinar si el tamaño seleccionado es efectivo para interferir con la expresión del polinucleótido principal. ' La molécula de iARN puede introducirse en una cantidad que permita el suministro de al menos una copia por célula. Las dosis más altas (por ejemplo, de al menos 5, 10, 100, 500 o 1000 copias por célula) del material de doble cadena pueden producir una inhibición m s efectiva; las dosis más bajas también pueden ser útiles para aplicaciones específicas . La inhibición es específica de la secuencia ya que las secuencias de nucleótidos que corresponden a la región del duplo del ARN son fijadas como objetivo para la inhibición genética. Se introduce suficiente ARN en el tejido para causar un cambio detectable en la expresión de un gen objetivo (asumiendo que el gen candidato está siendo expresado de hecho en la célula dentro, de la cual se introduce el ARN) utilizando metodologías de detección disponibles. De esta manera, en algunos casos, se introduce suficiente ARN para lograr de al menos aproximadamente 5 a aproximadamente 10% de reducción en la expresión del gen candidato en comparación con una célula en la cual no se introduce el AR . En otros casos, la inhibición es de al menos aproximadamente 20, 30, 40 o 50%. En todavía otros casos, la inhibición es de al menos aproximadamente 60, 70, 80, 90 o 95%. La expresión en algunos casos es inhibida completamente de manera esencial a niveles indetectables . La cantidad de ARN introducido depende de varios factores tales como el modo de administración utilizado, el tamaño del ARN, el número de células en las cuales se administra el ARN y la edad y tamaño de un animal si el ARNdc se introduce en un animal . Una cantidad apropiada puede ser determinada por aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo al administrar inicialmente el ARN en varias concentraciones diferentes, por ejemplo. En ciertos casos cuando se introduce el ARN en un cultivo celular, la cantidad de ARN introducido en las células puede variar de aproximadamente 0.5 a aproximadamente 3 µ por 10s células. Está disponible una variedad de opciones para detectar la interferencia de la expresión del gen candidato (es decir, para detectar la inactivación del gen candidato) . En general, la inhibición en la expresión es detectada al percibir una disminución en el nivel de la proteína codificada por el gen candidato, al determinar el nivel de ARNm transcrito del gen y/o al detectar un cambio en el fenotipo asociado con la expresión del gen candidato.

El AR que contiene una secuencia de nucleótidos sustancialmente idéntica a una porción del gen objetivo (por ejemplo, un polinucleotido del TFF3) puede utilizarse para la inhibición del ARN. Las secuencias de ARN con inserciones, supresiones y mutaciones de puntos, individuales con relación a la secuencia objetivo también pueden ser efectivas para la inhibición. De esta manera, la identidad de secuencia, como es bien sabido en el campo, puede optimizarse por medio de los algoritmos de comparación y alineamiento de secuencias y al calcular el porcentaje de diferencia entre las secuencias de nucleótidos por medio de, por ejemplo, el algoritmo Smith-Waterman que es implementado en el programa para computadora BESTFIT utilizando parámetros por omisión (por ejemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group) . En algunas modalidades, las identidades de secuencia pueden ser mayores que 90% o aún aproximadamente 100%, entre el ARN inhibidor y la porción del gen objetivo. Alternativamente, la región del duplo del ARN puede definirse funcionalmente como una secuencia de nucleótidos que es capaz de hibridizarse con una porción de la transcripción del gen objetivo (por ejemplo NaCl 400 mM, PIPES 40 mM pH 6.4, EDTA 1 mM, hibridación a 50 °C o 70°C durante 12-16 horas; seguido por el lavado) . La longitud de las secuencias de nucleótidos de ARN puede ser de al menos aproximadamente 15, 20, 25, 50, 100, 200, 300 o 400 bases.

Como se describe en este documento, no se requiere 100% de identidad de secuencia entre el ARN y el gen objetivo para practicar la presente invención. De esta manera, la invención tiene la ventaja de ser capaz de tolerar variaciones de secuencias que podrían esperarse debido a la mutación genética, polimorfismo de cepas o divergencia evolucionaría. Sin embargo, de acuerdo con algunas modalidades, existe 100% de identidad de secuencia entre el ARN inhibidor y la parte del gen objetivo. Adicionalmente, el ARN que tiene más de aproximadamente 70%, 80%, 90% o 95% de identidad de secuencia se puede utilizar en la presente invención y, de esta manera, se pueden tolerar variaciones de secuencia que se podrían esperar debido a la mutación genética, polimorfismo de cepas o divergencia evolucionaría. El ARN puede sintetizarse ya sea in vivo o in vitro. La polimerasa de ARN endógena de la célula puede mediar la transcripción in vivo o la ARN polimerasa clonada puede utilizarse para la transcripción in vivo o in vitro. Para la transcripción de un transgen in vivo o una construcción de expresión, se puede utilizar una región reguladora (por ejemplo, promotor, intensificador, inactivador, donador y receptor de empalmes, poliadenilación) para transcribir la cadena de ARN (o cadenas) . La inhibición puede fijarse como objetivo por medio de la transcripción especifica en un órgano, tejido o tipo de célula; la estimulación de una condición ambiental (por ejemplo, infección, tensión, temperatura, inductores químicos) ; y/o el diseño de la transcripción a una etapa de desarrollo o edad. Las cadenas de ARN pueden ser poliadeniladas opcionalmente; las cadenas de ARN pueden ser capaces opcionalmente de traducirse en un polipeptido por un aparato de traducción de la célula. El ARN puede sintetizarse adicionalmente de manera química o enzimática por medio de reacciones manuales o automatizadas. El ARN puede sintetizarse por una ARN polimerasa celular o una ARN polimerasa de bacteriófago (por ejemplo, T3 , T7, SP6) . El uso y la producción de una construcción de expresión son conocidos en el campo (véase, por ejemplo, el documento WO 97/32016; las patentes norteamericanas Nos. 5,593,874, 5,698,425, 5,712,135, 5,789,214 y 5,804,693). Si se sintetiza químicamente o por medio de la síntesis enzimática in vatro, el ARN puede purificarse antes de la introducción en la célula. Por ejemplo, el ARN puede purificarse a partir de una mezcla por medio de la extracción con un solvente o una resina, la precipitación, electroforesis , cromatografía o una combinación de los mismos. Alternativamente, el ARN puede utilizarse sin o con un mínimo de purificación para evitar las pérdidas debido al procesamiento de muestras . El ARN puede secarse para el almacenamiento o puede disolverse en una solución acuosa. La solución puede contener amortiguadores o sales para promover la hibridación y/o la estabilización de las cadenas dobles. De acuerdo con la presente invención, el ARN que tiene una secuencia similar a o que es sustancialmente idéntico a una región de la secuencia del polinucleótido del TFF3 puede utilizarse para modular la expresión del polipéptido del TFF3 en células tal como por via de un mecanismo de interferencia de ARN. Las regiones de secuencias fijadas como objetivo pueden seleccionarse de acuerdo con cualquiera de los criterios descritos anteriormente para la modulación antisentido de la expresión del TFF3. En algunas modalidades, el ARN puede incluir una secuencia que sea sustancialmente idéntica con o sustancialmente complementaria para cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. El ARN también puede tener una secuencia que se superponga a una porción de la secuencia que corresponde a cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19, o el complemento. El ARN puede administrarse a un organismo o un paciente como se describe en este documento para la. administración de moléculas antisentido. De acuerdo con algunas modalidades, el ARN puede introducirse directamente en la célula (es decir, intracelularmente) ; o puedé introducirse extracelulármente en una cavidad, espacio intersticial, en la circulación de un organismo, puede introducirse oralmente o puede introducirse al bañar un organismo en una solución que contiene el ARN. Los métodos para la introducción oral incluyen el mezclado directo del ARN con un alimento del organismo, así como también planteamientos diseñados en los cuales una especie que se utiliza como alimento es diseñada para expresar el ARN, entonces son alimentados al organismo que es afectado. También se pueden utilizar métodos físicos para introducir ácidos nucleicos, por ejemplo, la inyección directamente en la célula o la inyección extracelular en el organismo. La circulación vascular o extravascula , el sistema sanguíneo o linfático, el floema, las raíces y el fluido cerebroespinal son sitios donde se puede introducir el ARN. Un organismo transgénico que expresa el ARN a partir de una construcción recombinante puede producirse al introducir la construcción en un cigoto, una célula madre embriónica u otra célula multipotente que se deriva del organismo apropiado. Los métodos físicos para introducir ácidos nucleicos incluyen la inyección de una solución que contiene el ARN, el bombardeo por partículas cubiertas por el ARN, la inmersión de la célula o el organismo en una solución del ARN o la electroporacion de membranas celulares en presencia del ARN. Una construcción viral empacada en una partícula viral puede realizar tanto la introducción eficiente de una construcción de expresión en la célula como la transcripción del ARN codificado por la construcción de expresión. Se pueden utilizar otros métodos conocidos en el campo para introducir ácidos nucleicos, a células, tal como el transporte de portadores mediado por lípidos, transporte mediado por productos químicos, tal como fosfato de calcio y similares. De esta manera, el ARN puede introducirse junto con componentes que realizan una o más de las siguientes actividades: mejoramiento de la captación de ARN por la célula, promoción de la hibridación de las cadenas dobles, estabilización de las cadenas hibridizadas o de otra manera el incremento de la inhibición del gen objetivo. La inhibición de la expresión de un gen objetivo puede ser verificada al observar o detectar una ausencia o disminución observable en el nivel de proteína codificada por un gen objetivo (esto se puede detectar por ejemplo por medio de un anticuerpo especifico u otras técnicas conocidas para aquellas personas expertas) y/o un producto de ARNm de un gen objetivo (esto puede detectarse por ejemplo por medio de estudios de hibridación) y/o un fenotipo asociado con la expresión del gen. En el contexto de un tratamiento médico, la verificación de la inhibición de la expresión de un gen objetivo se puede llevar a cabo al observar un cambio en la condición de la enfermedad de un sujeto, tal como una reducción en los síntomas, remisión, un cambio en el estado de la enfermedad y así sucesivamente . De acuerdo con algunas modalidades, el cambio en el estado de enfermedad puede ser un crecimiento de tumor disminuido, volumen de tumor reducido, motilidad reducida de células, invasibilidad reducida de células y similares. Preferiblemente, la inhibición es específica, es decir, la expresión del gen objetivo es inhibida sin manifestar efectos sobre otros genes de la célula. La cantidad de AR administrado a un mamífero para la inhibición efectiva de genes puede variar de acuerdo con una amplia variedad de factores, que incluyen la ruta de administración, la edad, tamaño y condición del mamífero, el gen que debe ser inhibido, la enfermedad o trastorno a tratarse y así sucesivamente . De acuerdo con algunas modalidades, el ARNdc puede administrarse para proporcionar de 0.1 a 400 pg, preferiblemente de 1 a 40 pg y más preferiblemente de 1 a 20 pg en cada célula. Los métodos para utilizar la iARN, ya sea la adición o transcripción exógena in vivo, son conocidos en el campo (véase Schubiger y Edgar, Methods in Cell Biology (1994) 44:697-713 y la solicitud del PCT WO 99/32619, respectivamente, cada uno de los cuales es incorporado en este documento a manera de referencia) . Por ejemplo, en C. elegans, se ha mostrado que la iARN inactiva un gen supresor de tumores en células precursoras, vulvares (Lu y Horvitz, Cell (1998) 95:981-991, el cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad) .

Los métodos para reducir o suprimir la expresión de ciertos productos génicos utilizando la iARN se proporcionan adicionalmente en la patente norteamericana No. 6,506,559 y la publicación de solicitud de patente norteamericana No. 20030027783 (relacionada con la inhibición de la expresión de genes en mamíferos) , cada una de las cuales es incorporada a manera de referencia en su totalidad. Anticuerpos El agente neutralizante también puede ser una inmunoglobulina, tal como un anticuerpo o un fragmento del mismo que se enlaza a una proteína del TFF3. Las inmunoglobulinas incluyen tanto anticuerpos como otras moléculas similares a anticuerpos que carecen de especificidad de antígenos. Los polipéptidos de la última clase son producidos, por ejemplo, a niveles bajos por el sistema linfático y a niveles incrementados por mielomas . Los "anticuerpos e inmunoglobulinas nativos" son glicoproteínas usualmente eterotetraméricas de aproximadamente 150,000 daltons, compuestas de dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Cada cadena ligera está unida a una cadena pesada por un enlace de dísulf ro covalente, mientras que el número de uniones de disulfuro varía entre las cadenas pesadas de diferentes isotipos de inmunoglobulinas. Cada cadena pesada y ligera también tiene conexiones de disulfuro intracadena separadas regularmente . Cada cadena pesada tiene en un extremo un dominio variable (VH) seguido por una variedad de dominios constantes . Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier especie de animal vertebrado pueden asignarse a uno de los dos tipos claramente distintos, llamados kappa y la bda, en base a las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos intactos pueden asignarse a diferentes "clases" . Cada cadena ligera tiene un dominio variable en un extremo (VL) y un dominio constante en su otro extremo; el domino constante de la cadena ligera está alineado con el primer dominio constante de la cadena pesada y el dominio variable de la cadena ligera está alineado con el dominio variable de la cadena pesada. Se cree que los residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas (Chothia y colaboradores J. Mol. Biol . 186:651 (1985; Novotny y Haber, Proc. Nati. Acad. Sci . E.U.A. 30 82:4592 (1985); Chothia y colaboradores, Nature 342:877-883 (1989)). El término "anticuerpo" se utiliza en el sentido más amplio y cubre los anticuerpos policlonales y monoclonales ensamblados completamente, asi como también fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a antígenos (por ejemplo, Fab' , F' (ab)2, Fv, anticuerpos de cadenas individuales, diacuerpos) . El término "anticuerpo monoclonal" utilizado en este documento se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. A continuación se presenta una descripción de las técnicas ejemplares para la producción de los agentes neutralizantes de anticuerpos utilizados de acuerdo con la presente invención. Se dice que los anticuerpos se "enlazan específicamente" si: 1) exhiben un nivel de umbral de actividad de enlace y/o 2) no reaccionan significantemente de manera cruzada con moléculas de polipéptidos relacionadas, conocidas. La afinidad de enlace de un anticuerpo puede ser determinada f cilmente por una persona de experiencia ordinaria en el campo, por ejemplo, por medio del análisis Scatchard (Scatchard, Aun. NY Acad. Sci. 51: 660-672, 1949). En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención se enlazan al TFF3 al menos 103, más preferiblemente al menos 104, más preferiblemente al menos 105 y aún más preferiblemente al menos 10s veces más que otras proteínas relacionadas con el TFF3.

En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención no se enlazan específicamente a (o reconocen) moléculas de polipeptidos relacionadas, conocidas, por ejemplo, si se unen al polipéptido del TFF3 pero no a polipéptidos relacionados, conocidos utilizando un análisis de inmunotransferencia Western estándar (Ausubel y colaboradores) . En algunas modalidades, los anticuerpos pueden seleccionarse contra polipéptidos relacionados, conocidos para aislar una población de anticuerpos que se enlace específicamente a los polipéptidos del TFF3. Por ejemplo, los anticuerpos específicos para los polipéptidos del TFF3 fluirán a través de una columna que comprende los polipéptidos de la familia del TFF3 (con la excepción del TFF3) adheridos a una matriz insoluble bajo condiciones de amortiguamiento apropiadas. Esta selección permite el aislamiento de anticuerpos policlonales y monoclonales que no reacción de manera cruzada con polipéptidos estrechamente relacionados (Antibodies : A Laboratory Manual, Harlow and Lañe (eds.), Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1988; Current Protocole in Immunology, Cooligan y colaboradores (eds.), National Institutes of Health, John Wiley and Sons, Inc., 1995) . La selección y el aislamiento de anticuerpos específicos son bien conocidos en el campo (véase, Fundamental Immunology, Paul (eds.), Raven Press, 1993; Getzoff y colaboradores, Adv. in Immunol . 43: 1-98, 1988; Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, Goding, J. W. (eds.), Academic Press Ltd., 1996; Benjamin y colaboradores, Ann. Rev. Immunol . 2:67-101, 1984). Los ejemplos representativos de estos ensayos incluyen: inmunoelectroforesis concurrente, radioinmunoensayo (RIA, por sus siglas en inglés) , radioinmunoprecipitación, ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA, por sus siglas en inglés) , ensayo de inmunotransferencia de manchas o inmunotransferencia Western, ensayo de inhibición o competencia y ensayo de intercalación. En algunas modalidades, los anticuerpos " de la presente invención tienen al menos aproximadamente 1000 veces y al menos aproximadamente 10,000 veces más afinidad por el TFF3 que por miembros de la familia relacionados, conocidos. En algunas modalidades,. la afinidad de enlace de un anticuerpo de la presente invención es menor que aproximadamente 1 x 105 Ka, menor que aproximadamente 1 x 104 Ka y preferiblemente menor que 1 x 103 Ka por un polipéptido relacionado diferente del TFF3. Anticuerpos Policlonales Los anticuerpos policlonales pueden producirse en animales por medio de múltiples inyecciones subcutáneas (se) , intraperitoneales (ip) o intramusculares (im) del antígeno relevante y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunógena en la especie a ser · inmunizada, por ejemplo, hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero, tiroglobulina de bovino o inhibidor de tripsina de semilla de soya utilizando un agente bifuncional o derivatizante , por ejemplo, éster de maleimidobenzoil-sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , glutaraldehído, anhídrido succínico, S0C12 o R1N=C=NR, donde R y R1 son grupos alquilo diferentes. Los animales son inmunizados contra el antígeno, conjugados inmunógenos o derivados al combinar, por ejemplo, 100 pg de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples sitios. Un mes después, los animales son reforzados con 1/5 a 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en adyuvante completo de Freund por medio de la inyección subcutánea en múltiples sitios. De siete a 14 días después, los anímales son sangrados y el suero se somete a ensayo por el título de anticuerpo. Los animales son reforzados hasta que el título se nivela. Preferiblemente, el animal es reforzado con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con diferente proteína y/o a través de un reactivo de reticulación diferente. Los conjugados también pueden elaborarse en cultivos de células recombinantes como fusiones de proteínas. También, los agentes de agregación tales como alumbre se utilizan de manera adecuada para mejorar la respuesta inmune. Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales se obtienen a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por posibles mutaciones de origen natural que pueden estar presentes en cantidades menores. De esta manera, el modificador "monoclonal" indica que el carácter del anticuerpo no es una mezcla de anticuerpos discretos. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales pueden elaborarse utilizando el método de hibridoma que fue descrito primero por Kohler y colaboradores, Nature, 256:495 (1975), o pueden elaborarse por medio de métodos de ADN recombinante (patente norteamericana No. 4,816,567) . En el método de hibridoma, un ratón u otro animal hospedante apropiado, tal como un conejo o un hámster, es inmunizado como se describiera anteriormente en este documento para producir linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se enlazarán específicamente a la proteina utilizada para la inmunización. Alternativamente, los linfocitos pueden ser inmunizados in vitro. Los linfocitos entonces son fusionados con células de mieloma utilizando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hlbridoma [Goding, Monoclonal Antibodies : Principies and Practice, páginas 59-103 (Academic Press, 1986)]. Las células de hibridoma preparadas de esta manera son sembradas y desarrolladas en un medio de cultivo adecuado que contiene preferiblemente una o más sustancias que inhiben el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parentales, no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma parentales carecen de la enzima hipoxantina-guanina-fosforibosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas incluirá típicamente la hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , sustancias que impiden el crecimiento de células deficientes de HGPRT. Las células de mieloma ejemplares son aquellas que se fusionan eficientemente, que soportan la producción estable a alto nivel de un anticuerpo por las células productoras de anticuerpos, seleccionadas y que son sensibles a un medio tal como el medio HAT, que incluye líneas de células de mieloma tales como líneas de células de mieloma de murino, inclusive aquellas derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles de Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California EUA y las células SP-2, NZO o X63-Ag8-653 disponibles de American Type Culture Collection, Rockville, Maryland EUA. Las líneas de células de mieloma humano y heteromieloma humano de ratón también han sido descritas para la producción de anticuerpos monoclonales humanos [Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) ; Brodeur y colaboradores, Monoclonal Antibody Production Techniq es and Applications, páginas 51-63 (Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1987)]. El medio de cultivo en el cual se desarrollan las células de hibridoma se somete a ensayo por la producción de anticuerpos monoclonales que tienen la especificidad necesaria, por ejemplo por medio de un ensayo de enlace in vitro tal como el ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) o el radioinmunoensayo (RIA) . La localización de las células que expresan el anticuerpo puede detectarse por medio de FACS . Después, los clones de hibridoma pueden ser subclonados al limitar los procedimientos de dilución y el crecimiento por medio de métodos estándar (Goding, Monoclonal Antíbodies: Principies and Practice, Academic Press (1986) páginas 59-103) . Los medios de cultivo adecuados para este propósito incluyen, por ejemplo, el medio DMEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden desarrollarse in vivo como tumores asciticos en un animal . Los anticuerpos monoclonales que son secretados por los subclones son separados adecuadamente del medio de cultivo, fluido ascitico o suero por medio de procedimientos de purificación de inmunoglobulina convencionales, tales como, por ejemplo, proteína A-Sepharose1, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis de gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla fácilmente y es secuenciado utilizando procedimientos convencionales {por ejemplo, por medio del uso de sondas de oligonucleótidos que son capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de murino) . Las células de hibridoma sirven como una fuente de este ADN. Una vez aislado, el ADN puede colocarse en vectores de expresión, los cuales entonces son transfectados en células hospedantes tales como células de E. coli, células COS de simio, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de mieloma que no producen de otra manera una proteína de inmunoglobulina, para obtener la síntesis de los anticuerpos monoclonales en las células hospedantes, recombinantes . Los artículos de revisión sobre la expresión recombinante en bacterias del ADN que codifica el anticuerpo incluyen Skerra y colaboradores, Curr. Opinión in Imm nol., 5:256-262 (1993) y Phickthun, Immnol. Revs. , 130:151-188 (1992). En las modalidades adicionales, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos son aislados de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas utilizando las técnicas descritas en McCafferty y colaboradores, Nature, 348:552-554 (1990). Clackson y colaboradores, Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y colaboradores, J. Mol. Biol . , 222:581-597 (1991), describen el aislamiento de anticuerpos de murino y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las publicaciones subsecuentes describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (rango de n ) al entremezclar cadenas ( arks y colaboradores, BiolTechnology, 10:779-783 (1992) el cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad) , así como también la infección combinatoria y la recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y colaboradores, Nuc. Acids. Res., 21:2265-2266 (1993) el cual es incorporado en este texto a manera de referencia en su totalidad) . De esta manera, estas técnicas son alternativas viables para las técnicas de hibridomas de anticuerpos monoclonales, tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales. El ADN también puede modificarse, por ejemplo, al sustituir la secuencia de codificación para dominios constantes, humanos de cadenas pesadas y ligeras en lugar de las secuencias homologas de murino (patente norteamericana No. 4,816,567; Morrison y colaboradores, Proc. Nati Acad. Sci. EUA, 81:6851 (1984) la cual se incorpora en este documento a manera de referencia en su totalidad) o al unir covalentemente a la secuencia de codificación de inmunoglobulina toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido diferente de inmunoglobulina.

Típicamente, estos polipéptidos diferentes de inmunoglobul na son sustituidos por los dominios constantes de un anticuerpo o son sustituidos por los dominios variables de un sitio de combinación de antígenos de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente, quimérico que comprende un sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad por un antígeno y otro sitio de combinación de antígenos que tiene especificidad por un antígeno diferente. Adicionalmente, los anticuerpos recombinantes contra el TFF3 pueden producirse en animales transgénicos , por ejemplo, como se describe en diversas patentes. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes pueden expresarse en animales transgénicos, por ejemplo roedores, como se describe en cualquiera de las patentes norteamericanas Nos. 5,877,397, 5,874,299, 5,814,318, 5,789,650, 5,770,429, 5,661,016, 5,633,425, 5,625,126, 5,569,825, 5,545,806, 6,162,963, 6,150,584, 6,130,364, 6,114,598, 6,091,001, 5,939,598. Alternativamente, los anticuerpos recombinantes pueden expresarse en la leche de animales transgénicos como se describe en las patentes norteamericanas Nos. 5,849,992 o 5,827,690. Anticuerpos Humanizados Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos han sido descritos en el campo. Preferiblemente, un anticuerpo humanizado tiene uno o más residuos de aminoácidos que son introducidos en el mismo a partir de una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos son referidos f ecuentemente como residuos "importados", los cuales se toman típicamente de un dominio variable importado" . La humanización puede realizarse esencialmente siguiendo el método de Winter y colaboradores (Jones y colaboradores, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y colaboradores, Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y colaboradores, Science, 239:1534-1536 (1988)), al sustituir las secuencias de regiones hipervariables por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente norteamericana No. 4,816,567) en donde sustancialmente menos de un dominio variable, humano, intacto ha sido sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son típicamente anticuerpos humanos en los cuales algunos residuos de regiones hipervariables y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. La selección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, a utilizarse en la elaboración de los anticuerpos humanizados afecta la antigenicidad . De acuerdo con el método comúnmente llamado "el más adecuado" , la secuencia del dominio variable de un anticuerpo de roedor es seleccionada contra la biblioteca completa de secuencias de dominios variables, humanas, conocidas. La secuencia humana que está mas cercana a aquella del roedor entonces es aceptada como la región de estructura humana (F , por sus siglas en inglés) para el anticuerpo humanizado (Sims y colaboradores, J. Immunol, 151:2296 (1993); Chothia y colaboradores, J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). Otro método utiliza una región de estructura particular derivada de la secuencia consensual de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo particular de cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura puede utilizarse para varios anticuerpos humanizados, diferentes (Cárter y colaboradores, Proc- Nad. Acad. Sci. EUA, 89:4285 (1992); Presta y colaboradores, J. Immunol, 151:2623 (1993)). Los anticuerpos pueden ser humanizados con la retención de la alta afinidad por el antígeno y las otras propiedades biológicas, favorables. Para alcanzar este objetivo, de acuerdo con algunas modalidades, los anticuerpos humanizados se preparan por medio de un procedimiento de análisis de las secuencias parentales y varios productos humanizados, conceptuales utilizando modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales son comúnmente disponibles y son familiares para aquellas personas expertas en el campo. Están disponibles programas de computadora .que ilustran y exhiben probables estructuras conformacionales , tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas, seleccionadas. La inspección de estas exhibiciones permite el análisis del probable papel de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata a unirse a su antígeno. De esta manera, los residuos de FR pueden seleccionarse y combinarse de las secuencias receptoras e importadas de manera que se obtenga la característica deseada del anticuerpo, tal como una afinidad incrementada por el (los) antígeno(s) objetivo(s). En general, los residuos de región hipervariable están involucrados directa y más sustancialmente en la influencia del enlace a antígenos. Anticuerpos Humanos Como una alternativa para la humanización, se pueden generar anticuerpos humanos . Como se describiera anteriormente, se conoce la producción de anticuerpos, particularmente anticuerpos humanos en animales transgenicos. Por ejemplo, se pueden producir animales transgenicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, con la inmunización, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de la producción de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la supresión de homocigotos del gen de la región que une las de cadenas pesadas de anticuerpos (JH, por sus siglas en inglés) en ratones mutantes, quiméricos y de línea germinal da por resultado la inhibición completa de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes de inmunoglobulina de línea germinal humanos en estos ratones mutantes de línea germinal dará por resultado la producción de anticuerpos humanos con la prueba de antígenos. Véase, por ejemplo Jakobovits y colaboradores, Proc. Mad. Acad. Sel. EUA, 90:2551 (1993); Jakobovits y colaboradores, Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y colaboradores, Year in Immuno. , 7:33 (1993) y las patentes norteamericanas Nos. 5,591,669, 5,589,369 y 5,545,807. Alternativamente, la tecnología de exhibición de fagos (McCafferty y colaboradores, Nature 348:552-553 (1990) el cual es incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad) puede utilizarse para producir anticuerpos humanos y fragmentos de anticuerpos in vitro, a partir de los repertorios de genes de dominio variable (V) de inmunoglobulina de donadores no inmunizados. De acuerdo con esta técnica, los genes de dominio V de anticuerpos son clonados dentro del marco en un gen de proteína de revestimiento ya sea mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, tal como M13 o fd y son exhibidos como fragmentos de anticuerpos funcionales sobre la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia de ADM de cadena individual del genoma del fago, las selecciones basadas en las propiedades funcionales del anticuerpo también dan por resultado la selección del gen que codifica el anticuerpo que inhibe esas propiedades. De esta manera, el fago imita algunas de las propiedades de la célula B. La exhibición de fagos puede realizarse en una variedad de formatos; para su revisión véase, por ejemplo, Johnson, Kevin S. y Chiswell, David J. , Current Opinión in Structural Biology 3:564-571 (1993). Varias fuentes de segmentos de genes V pueden utilizarse para la exhibición de fagos. Clackson y colaboradores, Nature, 352:624-628 (1991), aisló una matriz diversa de anticuerpos anti-oxazolona de una biblioteca combinatoria, aleatoria, pequeña de genes V derivados de bazos de ratones inmunizados. Se puede construir un repertorio de genes V a partir de donadores humanos no inmunizados y los anticuerpos para una matriz diversa de antígenos (inclusive antígenos del propio organismo) sew pueden aislar esencialmente siguiendo las técnicas descritas por Marks y colaboradores, J. Mol. Biol . 222:581-597 (1991) o Griffith y colaboradores, EMBO J. 12:725-734 (1993). Véase también, las patentes norteamericanas Nos. 5,565,332 y 5,573,905. Los anticuerpos humanos también pueden ser generados por células B activadas in vitro (véase las patentes norteamericanas Nos. 5,567,610 y 5,229,275).

Fragmentos de Anticuerpos Se han desarrollado diversas técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente, estos fragmentos fueron derivados por via de la digestión proteolitica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y colaboradores, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y colaboradores, Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos también pueden producirse directamente por medio de células hospedantes, recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse a partir de las bibliotecas de fagos de anticuerpos descritas anteriormente. Alternativamente, los fragmentos Fab'-SH pueden recuperarse directamente de E. coli y acoplarse químicamente para formar los fragmentos P(ab')2 [Cárter y colaboradores, Bio/Technology 10:163-167 (1992) el cual es incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad] . De acuerdo con otro planteamiento, los fragmentos F(ab')2 pueden aislarse directamente de cultivo de células hospedantes, recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán aparentes para el practicante experto. En otras modalidades, el anticuerpo de la selección es un fragmento Fv de cadena individual (scFv) . Véase el documento WO ' 93/16185; la patente norteamericana No. 5,571,894 y la patente norteamericana No. 5,587,458. El fragmento de anticuerpo también puede ser ' un ^anticuerpo lineal" , por ejemplo, como se describe en la patente norteamericana No. 5,641,870, por ejemplo. Estos fragmentos de anticuerpo lineales pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . Además, los ácidos nucleicos que codifican los fragmentos de anticuerpos identificados en las bibliotecas de exhibición de fagos pueden ser clonados, secuenciados y diseñados para ser parte del ácido nucleico que codifica y puede expresar un anticuerpo de tamaño completo de cualquier isotipo. Anticuerpos Biespecíficos Los métodos para elaborar anticuerpos biespecíficos son conocidos en el campo. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa se basa en la co-expresión de dos pares de cadenas pesadas-cadenas ligeras de inmunoglobulina, donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein y colaboradores, Nature, 305:537-539 (1983) el cual es incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad) . Debido a la clasificación aleatoria de cadenas ligeras y pesadas de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una mezcla potencial de 10 diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales solo una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta, la cual puede realizarse por medio de pasos de cromatografía de afinidad, es preferiblemente difícil de realizar y los rendimientos de productos son bajas. Los procedimientos similares se describen en el documento O 93/08829 y en Traunecker y colaboradores, EMBO J, 10:3655-3659 (1991). De acuerdo con un planteamiento diferente, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de enlace deseadas (sitios de combinación de anticuerpos-antígenos) se fusionan con secuencias de dominio constante de inmunoglobulina . La fusión es preferiblemente con un dominio constante de cadena pesada de inmunoglobulina, que comprende al menos parte de la bisagra, CH2 , y las regiones CH3. En algunas modalidades, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para el enlace de cadenas ligeras está presente en al menos una de las fusiones. Los ADNs que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina y, si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, son insertados en vectores de expresión separados y son co-transfectados en un organismo hospedante adecuado. Esto proporciona gran flexibilidad en el ajuste de las proporciones mutuas de los tres fragmentos de polipéptidos en modalidades cuando las relaciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizadas en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación para dos o las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas de polipéptidos en relaciones iguales da por resultado altos rendimientos o cuando las relaciones no son de importancia particular. En algunas modalidades, los anticuerpos biespecificos contienen una cadena pesada de inmunoglobuli a híbrida con una primera especificidad de enlace en un brazo y un par de cadenas pesadas-cadenas ligeras de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de enlace) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespeclfico, deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulinas no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en solo una mitad' de la molécula biespecifica proporciona una forma de separación fácil. Este planteamiento se describe en el documento O 94/04690. Para detalles adicionales sobre la generación de anticuerpos biespecíficos véase, por ejemplo, Suresh y colaboradores, Methods in Enzymology, 121:210 (1986) . De acuerdo con otro planteamiento descrito en la patente norteamericana No. 5,731,168, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos puede " diseñarse para maximizar el porcentaje de heterodímeros que son recuperados del cultivo de células recombinantes . En algunas modalidades, la interfaz comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpo. En este método, una o más cadenas laterales, pequeñas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula de anticuerpo son reemplazadas por cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensativas de tamaño idéntico o similar con la(s) caden (s) lateral(es) grande (s) son creadas en la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales, grandes de aminoácidos por cadenas más pequeñas (por ejemplo alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar el rendimiento del heterodímero sobre otros productos finales no deseados, tales como homodímeros . Los anticuerpos biespecíficos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado puede acoplarse a avidita, el otro a biotina. Estos anticuerpos han sido propuestos, por ejemplo, para fijar como objetivo las células del sistema inmune hacia las células no deseadas (patente norteamericana No. 4,676,980) y para el tratamiento de la infección por VIH (documento O 91/00360 y documento 92/200373) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden elaborar utilizando cualquier método de reticulación conveniente. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en el campo y se describen en la patente norteamericana No. 4,676,980, junto con una variedad de técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos biespecíficos de fragmentos de anticuerpos también han. sido descritas en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos pueden prepararse utilizando una unión química. Brennan y colaboradores, Science, 229:81 (1985), describen un procedimiento en donde los anticuerpos intactos son escindidos proteolíticamente para generar los fragmentos F(ab')2- Estos fragmentos son reducidos en presencia del agente formador de complejos de ditiol, arsenita de sodio, para estabilizar los ditioles vecinos e impedir la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos Fab' generados entonces se convierten a derivados de tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados de Fab' -TNB entonces es reconvertido al Fab' -tiol por medio de la reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equivalente del otro derivado de Fab' -TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. El progreso reciente ha facilitado la recuperación directa de los fragmentos Fab'-SH a partir de E. coli, los cuales se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby y colaboradores, J. Exp. Med. , 175:217-225 (1992), describen la producción de una molécula F(ab')2 de anticuerpo biespecífico completamente humanizada. Cada fragmento Fab' fue secretado por separado a partir de E. coli y se sujetó al acoplamiento químico dirigido in vitro para formar el anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico formado de esta manera fue capaz de enlazarse a células que sobreexpresaban el receptor ErbB2 y células T humanas normales, así como también de desencadenar la actividad lítica de linfocitos citotóxicos humanos contra objetivos de tumores de mama humanos. También se han descrito varias técnicas para elaborar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecíficos directamente de un cultivo de células recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecí icos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y colaboradores, J. Immunol., 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos de cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Pab' de dos anticuerpos diferentes por medio de la fusión de genes . Los homodímeros de anticuerpos se redujeron a la región de bisagra para formar monómeros y entonces se oxidaron nuevamente para formar los heterodímeros de anticuerpos. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpos. La tecnología de iacuerpos" descrita por Hollinger y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA, 90:6444-6448 (1993), ha proporcionado un mecanismo alternativo para la elaboración de fragmentos de anticuerpos biespecíficos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) por medio de un conector el cual es muy corto para permitir el apareamiento entre dos dominios en la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento son forzados a aparearse con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento, formando con lo cual dos sitios de unión de antígenos. También se ha reportado otra estrategia para elaborar fragmentos de anticuerpos biespecífieos por medio del uso de los dímeros Fv de cadena individual (sFv) . Véase Gruber y colaboradores, J. Iiomunol., 152:5368 (1994) . Los anticuerpos con más de dos valencias están contemplados. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecíficos . Tutt y colaboradores J. Immunol . 147:60 (1991) . Conjugados y Otras Modificaciones del Agente Neutralizante Los agentes neutralizantes que se utilizan en los métodos o que están incluidos en los artículos de preparación en este documento pueden conjugarse opcionalmente con un agente citotóxico o terapéutico. Los ejemplos incluyen agentes quimioterapéuticos . Estos agentes quimioterapéuticos pueden tener una eficacia establecida en el tratamiento de un cáncer particular. Los conjugados de un agente neutralizante y una o más toxinas de moléculas pequeñas, tales como una caliqueamicina, maitansina (patente nor eamericana No. 5,208,020), un tricoteno y CC1065 también están contemplados en este documento. De acuerdo con algunas modalidades, el agente neutralizante es conjugado con una o más moléculas de maitansina (por ejemplo de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 moléculas de maitansina por molécula de agente neutralizante) . La maitansina puede convertirse, por ejemplo, a May-SS-Me, la cual puede reducirse a May-SH3 y puede hacerse reaccionar con un agente neutralizante modificado (Chari y colaboradores Cáncer Research 52:127-131 (1992) ) para generar un conjugado de maitansinoide-agente neutralizante . Alternativamente, el agente neutralizante es conjugado con una o más moléculas de caliqueamiciña. La familia de antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir rupturas de ADN de doble cadena en concentraciones sub-picomolares . Los análogos estructurales de la caliqueamicina también son conocidos. (Hinman y colaboradores Cáncer Research 53:3336-3342 (1993) y Lode y colaboradores Cáncer Research 58:2925-2928 (1998)) . Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de la mismas que se pueden utilizar incluyen la cadena de difteria- A, fragmentos activos no ligantes de la toxina de difteria, la · cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricino A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica charantia, cursina, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos . Véase, por ejemplo el documento WO 93/21232. La presente invención además contempla un agente neutralizante conjugado con un compuesto que tiene actividad nucleolítica (por ejemplo una ribonucleasa o una AND endonucleasa tal como desoxirribonucleasa; DNasa) . Está disponible una variedad de isótopos radiactivos para la producción de agentes neutralizantes, radioconj gados . Los ejemplos incluyen Y90, At211, Reias, Re1SB, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu. Los conjugados del agente neutralizante y el agente citotóxico se pueden elaborar utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales , tales como propionato de N-succinimidil-3- (2-píridilditiol) (SPDP) , ciclohexano-1-carboxilato de succinimidil-4- (N-maleimidometilo) , iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (tal como HCl de dimetil -adipimidato) , esteres activos (tal como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (tal como glutareldeido) , compuestos de bis-azido (tal como hexanodiamina de bis- (p-azidobenzoilo) ) , derivados de bis-diazonio (tal como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilendiamina) , diisocianatos (tal como 2 , 6-diisocianato de tolieno) y compuestos de flúor bis-activo (tal como 1, 5-difluoro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede preparase como se describe en Vitetta y colaboradores, Science 238:1098 (1987). El ácido triaminpentaacético de 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno etiquetado con carbono-14 (MX-DTPA) es un agente formador de quelatos ejemplar para la conjugación del radionucleótido con el agente neutralizante. Véase, por ejemplo, el documento WO 94/11026. El conector puede ser un "conector escindible" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede utilizar un conector lábil al ácido, conector sensible a peptidasa, conector de dimetilo o conector que contiene disulfuro (Cha i . y colaboradores, Cáncer Research 52:127-131 (1992)). Alternativamente, una proteína de fusión que comprende el agente neutralizante y un agente citotóxico pueden elaborarse, por ejemplo, por medio de técnicas recombinantes o síntesis de péptidos . En algunas modalidades, el agente neutralizante puede conjugarse con un "receptor" (tal como estreptavidina) para la utilización en la fijación como objetivo previa del tumor en donde el conjugado de agente neutralizante-receptor se administra al paciente seguido por la remoción del conjugado no enlazado de la circulación utilizando un agente de aclaramiento y luego la administración de un "ligando" (por ejemplo avidina) el cual es conjugado con un agente citotóxico {por ejemplo un radíonucleótido) . LOES agentes neutralizantes de la presente invención también se pueden conjugar con una enzima activadora del profármaco, la cual convierte un profármaco (por ejemplo un agente quimioterapéutico de peptidilo, véase el documento WO81/01145) a un fármaco anticáncer activo. Véase, por ejemplo, el documento WO 88/07378 y la patente norteamericana No. 4,975,278. El componente enzimático de estos conjugados incluye cualquier enzima capaz de actuar sobre un profármaco de manera tal que lo convierta en su forma citotóxica, más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, pero no están limitadas a, fosfatasa alcalina que es útil para convertir los profármacos que contienen fosfato en fármacos libres; arilsulf tasa que es útil para convertir los profármacos que contienen sulfato en fármacos libres; citosina-desaminasa que es útil para convertir la 5-fluorocitosina no toxica en el fármaco anticáncer, 5-fluorouracilo; proteasas, tal como serratia-proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (tales como las catepsinas B y L) , que son útiles para convertir los profármacos que contienen péptidos en fármacos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, que son útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes de D-aminoácidos; enzimas de escisión de carbohidratos, tales como ß-galactosidasa y neuraminidasa que son útiles para convertir los profármacos glicosilados en fármacos libres; (3-lactamasa que es útil para convertir los fármacos derivados con (3-lactamas en fármacos libres; y penicilina-amidasas , tales como penicilina-V-amidasa o penicilina-G-amidasa, que son útiles para convertir los fármacos derivados en sus nitrógenos de amina con grupos fenoxiacet ilo o fenilacet ilo , respectivamente, en fármacos libres. Alternativamente, los anticuerpos con actividad enzimática, también conocidos en el campo como "abzymas" , se pueden utilizar para convertir los profármacos de la invención en fármacos activos, libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328:457-458 (1987)). Los conjugados de agente neutralizante-abzyma se pueden preparar como se describe en este documento para el suministro de la abzyma a una población de células tumorales. Las enzimas pueden enlazarse covalentemente al agente neutralizante del TFF3 por medio de técnicas bien conocidas en el campo, tal como el uso de reactivos de reticulación heterobifuncionales descritos anteriormente. Alternativamente, las proteínas de fusión que comprenden al menos la región de enlace de antígenos de un agente neutralizante de la invención unidas a al menos una porción funcionalmente activa de una enzima de la invención pueden construirse utilizando técnicas de ADN recombinante que son bien conocidas en el campo [véase por ejemplo, Neuberger y colaboradores, Nature, 312:604-608 (1984)]. Otras modificaciones del agente neutralizante están contempladas en este documento. Por ejemplo, el agente neutralizante puede unirse a uno de una variedad de polímeros no proteináceos , por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol , polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. Los agentes neutralizantes descritos en este documento también pueden formularse como liposomas. Los liposomas que contienen el agente neutralizante se preparan por medio de métodos conocidos en el campo, tal como se describe en Epstein y colaboradores, Pro . Mad. Acad. Sel. EUA, 82:3688 (1985); Hwang y colaboradores, Proc. Nati Acad. Sci. EUA, 77:4030 (1980); patentes norteamericanas Nos. 4,485,045 y 4,544,545 y el documento W097/38731. Los liposomas con tiempo de circulación aumentado se describen en la patente norteamericana No. 5,013,556. Los liposomas particularmente útiles pueden generarse por medio del método de evaporación de fase inversa con una composición de lípidos que comprende fosfatidilcolina, colesterol y fosf tidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) . Los liposomas son extruidos a través de filtros de tamaño de poro definido para producir liposoma con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' de un anticuerpo de la presente invención pueden conjugarse con los liposomas descritos en Martin y colaboradores, J. Biol. Chem. 257:286-288 (1982) , por vía de una reacción de intercambio de disulfuro. Un agente guimioterapéutico está contenido opcionalmente dentro del liposoma. Véase Gabizon y colaboradores, J. Nacional Cáncer Inst .81 (19) 1484 (1989). La(s) modificació (es) de secuencias de aminoácidos de los agentes neutralizantes de proteínas o péptidos descritos en este documento están contempladas. Por ejemplo, puede ser deseable mejorar la afinidad de enlace y/u otras propiedades biológicas del agente neutralizante. Las variantes de secuencias de aminoácidos del agente neutralizante se preparan al introducir cambios de nucleótidos apropiados en el ácido nucleico del agente neutralizante o por medio de la síntesis de péptidos. Estas modificaciones incluyen, sin limitación, supresiones de y/o inserciones en y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del agente neutralizante. Se hace cualquier combinación de supresión, inserción y sustitución para llegar a la construcción formal, con la condición que la construcción final posea las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos posteriores a la traducción del agente neutralizante, tal como cambio del número o la posición de sitios de glicosilación.

Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del agente neutralizante que son ubicaciones para la mutagenesis es llamado "mutagenesis de exploración de alanina" como se describe por Cunning am y Wells, Science, 244:1081-1085 (1989). En este punto, se identifica un residuo o grupo de residuos objetivo {por ejemplo, residuos cargados tales como arg, asp, his, lys y glu) y son reemplazados por un aminoácido neutro o de carga negativa (más preferiblemente alanina o polialanina) para afectar la interacción de los aminoácidos con un antígeno. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestran sensibilidad funcional con las sustituciones entonces son refinadas al introducir variantes adicionales u otras variantes en, o para, los sitios de sustitución. De esta manera, mientras que el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos es predeterminado, la naturaleza de la mutación per se no necesita ser predeterminada. Por ejemplo,- para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, la mutagenesis de exploración o aleatoria de ala es conducida en un codón o región objetivo y las variantes de agentes neutralizantes expresadas son seleccionadas por la actividad deseada. Las inserciones de secuencias de aminoácidos incluyen fusiones amino- y/o carboxilo-terminales que varían en la longitud de un residuo para polipeptidos que contienen cien o más residuos, asi como también inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos individuales o múltiples. Los ejemplos de inserciones terminales incluyen un agente neutralizante con un residuo de metionilo N-terminal o el agente neutralizante fusionado . con un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de la molécula del agente neutralizante incluyen la fusión a la terminación N o C del agente neutralizante de una enzima o un polipéptido que incrementa el periodo de vida promedio en el suero del agente neutralizante . Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula del agente neutralizante reemplazado por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución de los agentes neutralizantes de anticuerpos incluyen las regiones hipervariables , pero también están contempladas las alteraciones de F . Las modificaciones sustanciales en las propiedades biológicas del agente neutralizante se realizan al seleccionar sustituciones que difieren significantemente en su efecto sobre el mantenimiento de (i) la estructura de la estructura principal del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación de lámina o hélica, (ii) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio objetivo o (iii) el volumen de la cadena lateral. Los residuos de origen natural se dividen en grupos basados en las propiedades comunes de las cadenas laterales : hidrófobos: norleucina, met, ala, val, leu, ile; hidrofílicos neutros: cys, ser, thr; ácidos: asp, glu; básicos: asn, gln, his, lys, arg residuos que influyen en la orientación de cadenas: gly, pro; y aromáticos: trp, tyr, phe . Las sustituciones no conservadoras ajustarán el intercambio de un miembro de una de estas clases por otra clase. Las sustituciones conservadoras incluyen el intercambio de aminoácidos dentro de la misma clase. Cualquier residuo de cisteína que no esté involucrado en el mantenimiento de la conformación apropiada del agente neutralizante también puede sustituirse generalmente por serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula e impedir la reticulación aberrante. A la inversa, el (los) enlace (s) de cisteína puede adicionarse al agente neutralizante para mejorar su estabilidad (particularmente donde el agente neutralizante es un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv) . En algunas modalidades, un tipo de variante de sustitución incluye sustituir uno o más residuos de regiones hipervariables de un anticuerpo parental . Generalmente, la(s) variante (s) resultante (s) seleccionada para el desarrollo adicional tendrá propiedades biológicas mejoradas con relación al anticuerpo parental del cual se generan. Una manera conveniente para generar estas variantes de sustitución es la maduración de afinidad utilizando la exhibición de fagos. En resumen, varios sitios de regiones hipervariables (por ejemplo, los sitios 6-7) son mutados para generar todas las sustituciones de amino posibles en cada sitio. Las variantes de anticuerpos generadas de esta manera son exhibidas en una forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones con el producto de gen III de M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes de fagos exhibidos entonces se seleccionan por su actividad biológica {por ejemplo, afinidad de enlace) como se describe en este documento. A fin de identificar los sitios candidatos de región hipervariable para la modificación, la mutagénesis de exploración de alanina puede realizarse para identificar los residuos de región hipervariable que contribuyen significantemente al enlace de antígenos . Alternativamente, o además, puede ser benéfico analizar una estructura cristalina del complejo de antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y el antígeno. Estos residuos de contacto y los residuos vecinos son candidatos para la sustitución de acuerdo con las técnicas elaboradas en este documento. Una vez que se generan estas variantes, el panel de variantes se sujeta a la selección como se describe en este documento y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos relevantes pueden seleccionarse para el desarrollo adicional . Otro tipo de variante de aminoácido del agente neutralizante descrito en este documento altera el patrón de glicosilación original del agente neutralizante. Por "alterar" se indica suprimir una o más porciones de carbohidratos encontradas en el agente neutralizante y/o adicionar uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el agente neutralizante. La glicosilación de polipéptidos es típicamente ya sea enlazada a N o enlazada a 0. Enlazada a N se refiere a la unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un residuo de asparagina. Las secuencias tripeptídicas asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. De esta manera, la presencia de cualquiera de estas secuencias tripeptídicas en un polipéptido crea un sitio de glicosilación potencial. La glicosilación unida a 0 se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido idroxiamino, más comúnmente serina o treonína, aunque también se puede utilizar 5-hidroxiprolina o 5- idroxilisina . La adición de sitios de glicosilación al agente neutralizante se realiza al alterar la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias tripeptídicas descritas anteriormente (para los sitios de glicosilación unidos a N) . La alteración también se puede hacer por medio de la adición de, o sustitución por, uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del agente neutralizante original (para los sitios de glicosilación unidos a O) . Las moléculas de ácido nucleico que codifican las variantes de secuencias de aminoácidos del agente neutralizante se preparan por medio de una variedad de métodos conocidos en el campo. Estos métodos incluyen, pero no están limitados a, el aislamiento de una fuente natural (en el caso de variantes de secuencias de aminoácidos de origen natural) o la preparación por medio de la mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida al sitio) , mutagénesis de PCR y mutagénesis de casetes de una variante preparada al principio o una versión no variante del agente neutralizante . En algunas modalidades, puede ser deseable modificar el agente neutralizante de la invención con respecto a la función efectora, por ejemplo para mejorar la citotoxicidad mediada por células dependiente de antígenos (ADCC, por sus siglas en inglés) y/o la citotoxicidad dependiente de complementos (CDC, por sus siglas en inglés) del agente' neutralizante. Esto puede lograrse al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe de un agente neutralizante de anticuerpo. Alternativa o adicionalmente, el (los) residuo (s) de cisteína puede introducirse en la región Fe, permitiendo con lo cual la formación de enlaces de difulsuro intercadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener una capacidad de internalización mejorada y/o citotoxicidad eliminadora de células mediada por complementos y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos incrementada (ADCC) . Véase Carón y colaboradores, J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992) . Los anticuerpos homodiméricos con actividad antitumoral mejorada también pueden prepararse utilizando reticuladores heterobifuncionales , como se describe en olff y colaboradores, Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Alternativamente, se puede diseñar un anticuerpo que tenga regiones Fe dobles y con lo cual pueda tener capacidades mejoradas de lisis de complementos y ADCC. Véase Stevenson y colaboradores Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989) . Para incrementar el período de vida promedio en el suero del agente neutralizante, se puede incorporar un epítopo de enlace de receptores de salvamento en el agente neutralizante (especialmente un fragmento de anticuerpo) como se describe en, por ejemplo, la patente norteamericana No. 5,739,277. Como se utiliza en este documento, el término "epitopo de enlace de receptores de salvamento" se refiere a un epíopo de la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgGl, IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de incrementar el período de vida promedio en el suero in vivo de la molécula de IgG. La presente invención también proporciona selecciones para identificar anticuerpos anti-TFF3 que tienen propiedades terapéuticas o de diagnóstico deseadas. Las selecciones pueden incluir ensayos que identifican anticuerpos anti-TFF3, los cuales afectan la proliferación y/o adherencia de células tumorales, actividad de ADCC o CDC, ensayos anti-apoptóticos, ensayos de verificación del ciclo de vida y ensayos in vivo en animales no humanos, transgénicos, por ejemplo ratones y otros roedores. También, la presente invención contempla selecciones para identificar anticuerpos que se unen a porciones deseadas de la proteína como se describiera supra y los cuales poseen propiedades deseadas, por ejemplo bloquean el enlace de calcio, bloquean la formación de dímeros, bloquean la formación de cadenas y/o interfieren con el alineamiento de dominios del TFF3. Estos anticuerpos pueden identificarse por poblaciones de anticuerpos proporcionados contra la proteína del TFF3 o fragmentos de la misma.

Otras Formas de Agentes Neutralizantes Los agentes neutralizantes también pueden estar en la forma de un profármaco. El término "profármaco" se refiere a un agente terapéutico que se prepara en una forma inactiva que se convierte a una forma activa (es decir, un fármaco) dentro del cuerpo o las células del mismo por medio de la acción de enzimas endógenas u otros productos químicos y/o condiciones. En particular, las versiones de profármaco de los agentes neutralizantes que contienen ácido nucleico (tales como oligonucleótidos antisentido, ribozimas y moléculas de iARN y similares) se pueden preparar como derivados de SATE [fosfato de (S-acetil-2 -tioetilo) ] de acuerdo con los métodos descritos en el documento WO 93/24510 o en el documento WO 94/26764 y en la patente norteamericana No. 5,770,713. • Los agentes neutralizantes también pueden estar en la forma de sales farmacéuticamente aceptables. El término "sales farmacéuticamente aceptables" se refiere a sales fisiológica y farmacéuticamente aceptables de los compuestos de la invención: es decir, sales que retienen la actividad biológica deseada del compuesto parental y que no conceden efectos toxicológicos indeseados al mismo. Para los agentes neutralizantes que contienen ácido nucleico (por ejemplo, oligonucleótidos antisentido, ribozimas, moléculas de iARN y similares) algunos ejemplos de las sales farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitadas a, (a) sales formadas con cationes tales como sodio, potasio, amonio, magnesio, calcio, poliaminas tales como espermina y espermidina, etcétera; (b) sales de adición de ácido formadas con ácidos inorgánicos, por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico y similares; (c) sales formadas con ácidos orgánicos, tales como, por ejemplo ácido acético, ácido oxálico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido glucónico, ácido cítrico, ácido málico, ácido ascórbico, ácido benzoico, ácido tánico, ácido palmítico, ácido algínico, ácido poliglutámico, ácido naftalensulfónico, ácido metanosulf nico, ácido p-toluensulfónico, ácido naftalendisulfónico, ácido poligalaturónico y similares; y (d) sales formadas a partir de aniones elementales, tales como cloro, bromo y yodo. Construcciones de Polinucleótidos Las moléculas de polinucleótidos que codifican el TFP3 , un fragmento del TFF3 o un agente neutralizante del TFF3 tal como un anticuerpo pueden insertarse en una construcción de polinucleotido, tal como una construcción de )N o ARN. Las moléculas de polinucleótidos de la invención pueden utilizarse, por ejemplo, en una construcción de expresión para expresar la totalidad o una porción de una proteína, variante, proteína de fusión o anticuerpo de cadena individual en una célula hospedera. Una construcción de expresión comprende un promotor que es funcional en una célula hospedera seleccionada. El artífice experto puede seleccionar fácilmente un promotor apropiado a partir del gran número de promotores específicos para el tipo de célula que son conocidos y utilizados en el campo. La construcción de expresión también puede contener un terminador de transcripción que es funcional en la célula hospedera. La-construcción de expresión comprende un segmento de polinucleotido que codifica la totalidad o una porción de la proteína deseada. El segmento · de polinucleotido está localizado corriente abajo del promotor. La transcripción del segmento de polinucleotido inicia en el promotor. La construcción de expresión puede ser lineal o circular y puede contener secuencias, si se desea, para la replicación autónoma. Células Hospedantes Una construcción de expresión que codifica el TFF3 o un agente neutralizante del TFF3 pueden introducirse en una célula hospedera. La célula hospedera que comprende la construcción de expresión puede ser cualquier célula procariótica o eucariótica adecuada. Los sistemas de expresión en bacterias incluyen aquellas que se describen en Chang y colaboradores, Nature 275:615 (1978); Goeddel y colaboradores, Nature 281:544 (1979); Goeddel y colaboradores, Nucleic Acids Res. 8:4057 (1980); EP 36,776; U.S. 4,551,433; deBoer y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Scí. EÜA 80:21-25 (1983) y Siebenlist y colaboradores, Cell 20:269 (1980) . Los sistemas de expresión en la levadura incluyen aquellos descritos en Hinnnen y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 75:1929 (1978) ; Ito y colaboradores, J. Bacteriol 153: 163 (1983); Kurtz y colaboradores, Mol Cell. Biol. 6:142 (1986); Kunze y colaboradores, J. Basic Microbiol. 25:141 (1985); Gleeson y colaboradores, J". Gen. Microbiol . 132:3459 (1986), Roggenkamp y colaboradores, Mol. Gen. Genet. 202:302 (1986); Das y colaboradores, J Bacteriol. 158:1165 (1984);· 'De Louvencourt y colaboradores, J Bacteriol. 154:737 (1983), Van den Berg y colaboradores, Bio/Technology 8:135 (1990); Kunze y colaboradores, J. Basic Microbiol. 25:141 (1985); Cregg y colaboradores, Mol. ' Cell. Biol. 5:3376 (1985); U.S. 4,837,148; U.S. 4,929,555; Beach y Nurse, tature 300:706 (1981); Davidow y colaboradores, Curr. Genet. 10:380 (1985); Gaillardin y colaboradores, Curr. Genet. 10:49 (1985); Ballance y colaboradores, Biochem. Biophys. Ees. Coliman. 112:284-289 (1983); Tilburn y colaboradores, Gene 26: 205-22 (1983); Yelton y colaboradores, Proc Nati Acad, Scí. EÜA 81:1470-1474 (1984); Kelly y Hynes, EMBO J. 4:475479 (1985); EP 244,234 y WO 91/00357. La expresión de genes heterologos en insectos puede realizarse como se describe en la U.S. 4,745,051; Friesen y colaboradores (1986) "The Regulation of Baculovirus Gene Expression" en: THE MOLECULAR BIOLOGY OF BACULOVIRUSES ( . Doerfler, ed.); EP 127,839; EP 155,476; Vlak y colaboradores, J. Gen. Vlrol. 69:765-776 (1988); Miller y colaboradores, Ann. Rev. Microbiol. 42:177 (1988); Carbonell y colaboradores, Gene 73:409 (1988); Maeda y colaboradores, Nature 315:592-594 (1985); Lebacq-Verheyden y colaboradores, Mol. Cell Biol. 8:3129 (1988); Smith y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci . EUA 82:8404 (1985); Miyajima y colaboradores, Gene 58:273 (1987) y Martin y colaboradores, DNA 7:99 (1988). Las numerosas cepas y variantes de baculovirus y las células hospedantes de insecto permisibles, correspondientes se describen en Luckow y colaboradores Bio/Technology (1988) 6: 47-55, Miller y colaboradores, en GENETIC ENGINEERING (Setlow, J.K. y colaboradores, eds . ) , Vol. 8, páginas 277-279 (Plenum Publishing, 1986) y Maeda y colaboradores, Nature, 315 -..592-594 (1985). La expresión en mamíferos puede realizarse como se describe en Dijkema y colaboradores, EMBO J". 4:761 (1985); Gormanetal, Proc. Nati. Acad. Sci. EUA 79:6777 (1982b); Boshart y colaboradores, Cell 41:521 (1985) y U.S. 4,399,216. Otras características de expresión en mamíferos pueden facilitarse como se describe en Ham y Wallace, Meth Enz. 58:44 (1979); Barnes y Sato, Anal. Biochem. 102:255 (1980); U.S. 4,767,704; U.S. 4,657,866; U.S. 4,927,762; U.S. 4,560,655; documento WO 90/103430, documento WO 87/00195 y U.S. RE 30, 985. Las construcciones de expresión pueden introducirse en las células hospedantes utilizando cualquier técnica conocida en el campo. Estas técnicas incluyen la transferencia de ADN mediada por policationes de transferrina, transfección con ácidos nucleicos desnudos o encapsulados , fusión celular mediada por liposomas, transporte intracelular de perlas de látex revestidas con ADN, fusión de protoplastos , infección viral, electroporación, "pistola de genes" y transfección mediada por fosfato de calcio. Formulaciones Farmacéuticas Las formulaciones terapéuticas de los agentes neutralizantes del TFF3 de acuerdo con la presente invención pueden prepararse para el almacenamiento al mezclar un agente neutralizante que tiene el grado deseado de pureza con portadores, excipientes o estabilizadores opcionalmente, farmacéuticamente aceptables {Remington' Pharmaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen amortiguadores tales como fosfato, -citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (tales como cloruro de octadecildiraetilbencil-amonio; cloruro de hexametonio; cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; alcohol fenólico, butilico o bencílico; alquil-parabenos tales como metil- o propil-parabeno; catecol; resorcinol ; ciclohexanol ; 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente 10 residuos) ; proteínas, tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos tales como polivinilpirrolidona ; aminoácidos, tales como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina, monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes formadores de guelatos tales como EDTA; azúcares tales como sacarosa, manitol, trealosa o sorbitol; contraiones formadores de sales, tales como sodio; complejos de metales (por ejemplo, complejos de Zn-proteína) y/o surfactantes no iónicos tales como TWEENMR, PLURONICS11® o polietilenglicol (PEG) . Los portadores, excipientes o estabilizadores aceptables' no interfieren además con la actividad del agente neutralizante. Las formulaciones también pueden contener más de un compuesto activo. En algunas modalidades los compuestos activos tienen actividades complementarias que no se afectan de manera adversa entre sí. Por ejemplo puede ser deseable proporcionar además un agente citotóxico, agente quimioterapéutica» o citosina. La cantidad efectiva de estos otros agentes depende de la cantidad de agente neutralizante que está presente en la formulación, el tipo de tratamiento del cáncer y otros factores descritos anteriormente . Estos se utilizan generalmente en las mismas dosificaciones y con las rutas de administración utilizadas en este documento anteriormente o de aproximadamente 1 a 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora. Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por medio de técnicas de coacervación o por medio de la polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de poli (metilmetacilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármaco coloidal (por ejemplo liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones, nano-partículas y nano-cápsulas) o en macroemulsiones. Estas técnicas se escriben en Remington's Phaxwaceutical Sciences 16a edición, Osol, A. Ed. (1980) . También se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos, sólidos que contienen el agente neutralizante, matrices que están en la forma de artículos conformados, por ejemplo películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación- sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o alcohol poli (vinílico) ) , polilactidas (patente norteamericana No. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, tal como LUPRON DEPOT101 (microesferas inyectables que están compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- (-) -3-hidroxibutírico . En algunas modalidades, la administración puede ser a través del uso de composiciones farmacéuticas, inyectables, estériles. Como se utiliza en este documento, la frase "composición farmacéutica inyectable" , o variantes de la misma, se refiere a las composiciones farmacéuticas que satisfacen los requerimientos USP, para los productos "inyectables", es decir estériles, libres de pirógenos y materiales particulados y que poseen valores específicos de pH e isotonicidad. La esterilización de formulaciones de solución puede realizarse por medio de la filtración a través de membranas de filtración estériles. Tratamiento con el Agente Neutralizante El tratamiento o prevención del cáncer puede efectuarse al administrar una cantidad terapéuticamente efectiva de un agente neutralizante del TFF3 a un mamífero (por ejemplo, un humano) que sufre o está predispuesto al cáncer. De igual manera, los métodos para reducir el volumen del tumor, para disminuir la velocidad del crecimiento del tumor y/o para impedir el crecimiento del tumor pueden llevarse a cabo por medios similares. Los términos "tratamiento" , tratando" , "tratar" y similares se utilizan en este documento para referirse generalmente a la obtención de un efecto farmacológico y/o fisiológico deseado. El efecto puede ser profiláctico en términos de impedir completa o parcialmente una enfermedad o síntoma de la misma y/o puede ser terapéutico en términos de-una estabilización o curación parcial o completa para una enfermedad y/o efecto adverso atribuible a la enfermedad. El "tratamiento", utilizado en este documento, cubre cualquier tratamiento de una enfermedad en un mamífero, particularmente un humano, e incluye: (a) prevenir que la enfermedad o síntoma ocurran en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad o síntoma pero que aún no se ha diagnosticado que la tiene; (b) inhibir el síntoma de enferaiedad, es decir detener su desarrollo, o aliviar el síntoma de la enfermedad, es decir causar la regresión de la enfermedad o síntoma, tal coo cáncer de colon u otro cáncer del sistema digestivo, por ejemplo cáncer de estómago o hígado o cáncer de mama, ovario o próstata. Los términos . "individual" , "sujeto", "hospedante" y "paciente" se utilizan de manera intercambiable y se refieren a cualquier sujeto mamífero para el cual se desea el dignostico, tratamiento o terapia, particularmente humanos.

Otros sujetos pueden incluir ganado vacuno, perros, gatos, cobayos, conejos, ratas, ratones, caballos y similares. Una composición que comprende un agente neutralizante del TFF3, por ejemplo un anticuerpo, péptido, ' molécula antisentido, molécula de iAR , ribozima o molécula pequeña puede formularse, dosificarse y administrarse en una forma consistente con la buena práctica médica. Por ejemplo, el agente neutralizante del TFF3 es un humano, anticuerpo anti-TFF3 quimérico o humanizado scFv, fragmento de anticuerpo, péptido o molécula pequeña que inhibe la actividad del TFF3 ; o un oligonucleótido antisentido, molécula de iARN o ribozima que inhibe la expresión del TFF3. Los factores para la consideración en este contexto incluyen el cáncer particular que es tratado, el mamífero particular que es tratado, la condición clínica del paciente individual, la causa de la enfermedad o trastorno, el sitio de suministro del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos para los practicantes médicos. La cantidad terapéuticamente efectiva del agente neutralizante a administrarse puede ser gobernada por estas consideraciones . La cantidad terapéuticamente efectiva de un agente neutralizante es una cantidad suficiente para mejorar o disminuir los síntomas asociados con una enfermedad o trastorno en un paciente tratado con el agente neutralizante.

En algunas modalidades, una cantidad terapéuticamente efectiva es una cantidad de agente neutralizante que puede disminuir los síntomas del cáncer, tal como al impedir el crecimiento del tumor, disminuir la velocidad del tumor, reducir el volumen del tumor, reducir la invisibilidad de la célula cancerosa, inhibir la migración, adherencia y/o proliferación de células cancerosas y similares . Los métodos para determinar una cantidad terapéuticamente efectiva y para evaluar los efectos terapéuticos de un agente neutralizante son conocidos en el campo y se describen adicionalmente en este documento. Una cantidad terapéuticamente efectiva que es administrada parenteralmente por dosis puede estar, por ejemplo, en el rango de aproximadamente 0.1 a 30 mg/kg de peso corporal del paciente al día, con el rango inicial, típico de agente neutralizante utilizado que está en el rango de aproximadamente 2 a 10 mg/kg. Sin embargo, como se observa anteriormente estas cantidades sugeridas de agente neutralizante pueden sujetarse a una gran cantidad de discreción terapéutica. Un factor en la selección de una dosis y programa apropiados es el resultado obtenido, como se indicara anteriormente. Por ejemplo, las dosis relativamente mas altas pueden ser necesarias inicialmente para el tratamiento de enfermedades progresivas y agudas . Para obtener los resultados más eficaces, dependiendo de la enfermedad o el trastorno, el agente neutralizante se administra tan pronto como a la primera señal, diagnosis, aparición u ocurrencia de la enfermedad o trastorno como sea posible o durante las remisiones de la enfermedad o trastorno. El agente neutralizante puede administrarse por cualquier medio adecuado, inclusive la administración parenteral, subcutánea, intraperitoneal, intrapulmonar e intranasal y, si se desea para el tratamiento anmunosupresivo local, intralesión. Las infusiones parenterales incluyen la administración intramuscular, intravenosa, intraarterial , intraperitoneal o subcutánea. Además, el agente neutralizante puede administrarse adecuadamente por medio de la infusión de impulsos, por ejemplo, con dosis decrecientes del agente neutralizante. Preferiblemente, la dosificación se proporciona por medio de inyecciones, más preferiblemente inyecciones intravenosas o subcutáneas, dependiendo en parte si la administración es breve o crónica. Uno puede administrar otros compuestos, tales como agentes citotóxicos, agentes ' quimioterapéuticos , agentes inmunosupresivos y/o citosinas con los agentes neutralizantes de este documento. La administración combinada incluye la coadministración, utilizando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica individual y la administración conservadora en cualquier orden, en donde preferiblemente hay un periodo de tiempo mientras que ambos agentes activos (o todos) ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Existen numerosos planteamientos en el campo para insertar un ácido nucleico, tal como una molécula antisentido, molécula de iARN o ribozima (contenida opcionalmente en un vector) en las células de paciente; in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo, el ácido nucleico puede inyectarse directamente en el paciente, usualmente en el sitio donde el agente neutralizante es requerido. Para el tratamiento ex vivo, las células del paciente son removidos, el ácido nucleico se introduce en esas células aisladas y las células modificadas son administradas al paciente ya sea directamente o, por ejemplo, son encapsuladas dentro de membranas porosas, las- cuales son implantadas en el paciente (véase, por ejemplo, las patentes norteamericanas Nos. 4,892,538 y 5,283,187). Existe una variedad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables . Las técnicas varían dependiendo si el ácido nucleico es transferido dentro de las células cultivadas ín vitro o in vivo en las células del hospedante propuesto. Las técnicas adecuadas para la transferencia del ácido nucleico a las células de mamífero in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación de fosfato de calcio, etcétera. Un vector utilizado comúnmente para el suministro ex vivo del gen es un retrovirus . Los ácidos nucleicos también pueden administrarse por medio del suministro hidrodinámico (inyección intravascular de presión incrementada) . Un ejemplo de la técnica de transferencia de ácido nucleico in vivo incluye la transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus de Herpes simple I o virus adeno-asociados) y sistemas basados en lípidos (los lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo) . En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que fije como objetivo las células objetivo, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de la superficie celular o la célula objetivo, un ligando para un receptor en la célula objetivo, etcétera. Donde se emplean liposomas, las proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con la endocitosis puede utilizarse para fijar como objetivo y/o para facilitar la captación, por ejemplo proteínas de cápside o fragmentos de las mismas tropicales para un tipo de célula particular, anticuerpos para proteínas que se someten a la internalización en la ciclación y proteínas que fijan como objetivo la localización intracelular y mejoran el período de vida promedio intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptores es descrita, por ejemplo, por u y colaboradores, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987) y Wagner y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. EÜ7A 87:3410-3414 (1990). De acuerdo con la presente invención, el tratamiento también puede incluir la terapia de combinación. Como se utiliza en este documento, la "terapia de combinación" significa que el paciente en necesidad de un fármaco es tratado o se le administra otro fármaco para la enfermedad, en conjunto con un agente neutralizante. Esta terapia de combinación puede ser una terapia secuencial donde el paciente es tratado primero con uno o más fármacos y luego el otro, o dos o más fármacos se administran simultáneamente. Algunos fármacos ejemplares que pueden utilizarse en la terapia de combinación incluyen agentes quimioterapéuticos (cisplatina, doxirrubicina, danurrubicina, tamoxifeno, taxol, metotrexato, etcétera) , inhibidores de aromatasa, la administración de inhibidores de la angiogénesis, agentes inmunomoduladores específicos y no específicos, modificadores . de respuestas biológicas (BRMs, ¦ por sus siglas en inglés) , factores estimuladores de colonia' (CSFs, por sus siglas en inglés) , interferones, interleucinas, vacunas de células tumorales autólogas, hormonas y similares. Preferiblemente, los fármacos u otros agentes administrados en combinación no interfieren con la actividad terapéutica del agente neutralizante. En algunas modalidades, la administración de un agente neutralizante puede combinarse con tratamientos tradicionales; contra el cáncer. Preferiblemente, el tratamiento tradicional contra el cáncer no interfiere con o reduce la efectividad del agente neutralizante. Algunos tratamientos tradicionales, ejemplares para el cáncer incluyen la cirugía (inclusive, por ejemplo, criocirugía, cirugía de resección segmentaria, prostatectomía radical, tumorectomía, mastectomía, etcétera) , quimioterapia, terapia de radiación (por ejemplo, terapia de radiación interna, terapia de radiación de haz externa) , braquiterapia (por ejemplo, suministro de radiación directamente al sitio del tumor original y disminución del tiempo de radiación utilizando un catéter individual para realizar una terapia de cáncer de mama) , terapia de ablación hormonal (reducción de niveles de hormonas) y similares. La presente invención proporciona además métodos para reducir el volumen del tumor, para reducir la velocidad del crecimiento volumen del tumor y/o para prevenir el crecimiento del tumor al poner en contacto el tumor con un agente neutralizante del TFF3. El contacto se puede llevar a cabo, por ejemplo, in vivo donde el tumor es expuesto a un agente neutralizante del TFF3 por cualquier medio adecuado. Por ejemplo, el tumor puede · inyectarse directamente o revestirse con una composición que contiene un agente neutralizante del TFF3 o un sujeto o paciente que tiene el tumor puede administrarse con un agente neutralizante del · TFF3. Las relaciones de volumen y crecimiento del tumor pueden medirse fácilmente por medio de métodos conocidos en el campo . Adicionalmente, los efectos fisiológicos del TFF3 (tales como TFF3 sobreexpresado) en un tejido o una célula pueden modularse por medio de la administración de un agente neutralizante del TFF3 a un paciente o al poner en contacto las células con un agente neutralizante del TFF3. Varios efectos fisiológicos debido a la expresión del TFF3 son descritos anteriormente en este documento e incluyen, por ejemplo, motilidad celular incrementada (por ejemplo, capacidad de migración) y resistencia a la apoptosis. La motilidad, migración e invasibilidad potencial de las células pueden valorarse por medio de un ensayo que incluye herir una placa confluente de células y medir la migración de las células dentro de la herida (por ejemplo, ya sea por la microscopía de video de periodos de tiempo o por el tiempo para el llenado en la herida) . Otros dos ensayos hacen uso de filtros transpocillos, en los cuales las células se colocan en la parte superior de un inserto transpocillo, poroso y se cuenta el número de células que migran al pocilio del fondo o sobre el lado inferior de un filtro revestido con fibronection. Estos dos últimos ensayos son una modificación del ensayo de "cámara Boyden" . Los ensayos transpocillos pueden modificarse adicionalmente para medir la quimiotáxis (al colocar un quimioatrayente en el pocilio del fondo) , quimiocinesis (al colocar un producto químico inductor de la motilidad en tanto los pocilios de la parte superior como del fondo) y la invasión (al revestir el pocilio con una matriz extracelular reconstituida, tal como matrigel) . La apoptosis o la resistencia a la misma pueden medirse por medio de cualquier ensayo de citotoxicidad general. Muchos métodos son conocidos en el campo, tales como morfología celular, apariencia del diagrama de bandas de escalas de ADN de 180 pb característico en geles de agarosa, el ensayo de etiquetado del extremo libre por dUTP mediado por TdT (TUNEL, por sus sigla en inglés) , citometría de flujo, ensayo ELISA de fragmentos de ADN y cambios en las propiedades biofísicas de la membrana celular. La familia de caspasas de las cisteína-proteasas también han sido identificadas como mediadores comunes de la ruta de suicido celular y los ensayos para la actividad de caspasa se han adicionado al arsenal de métodos utilizados para detectar la apoptosis . Un ensayo de fuga de lactato-deshidrogenasa (LDH) también se puede utilizar para detectar o medir la apoptosis. Los equipos para llevar a cabo muchos de estos métodos están comercialmente disponibles . Las células, tales como aquellas que expresan diferencialmente el TFF3 , se pueden poner en contacto con un agente neutralizante del TFF3 in vit.ro, in vivo o ex vivo. El contacto se puede llevar a cabo por medio de cualquiera de los métodos de formulación/administración descritos en este documento o, por ejemplo, al exponer las células a un medio que contiene un agente neutralizante del TFF3. Por ejemplo, las células se pueden lavar, incubar o suspender en una solución o medio de agar durante una cantidad de tiempo suficiente para que el agente neutralizante del TFF3 penetre al menos parcialmente la membrana celular y/o entre en contacto con un polipéptido del TFF3 o polinucleótido del TFF3 en la célula. Formulación, Dosificación, Conposiciones Farmacéuticas las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden adininistrar de una variedad de formas dependiendo si se desea el tratamiento local o sistémico y del área a tratarse, la administración puede ser tópica (inclusive oftálmica y a las membranas mucosas, inclusive suministro vaginal y rectal) , pulmonar, por ejemplo, por medio de la inhalación o insuflación de polvos o aerosoles, inclusive por un nebulizador; intratecal, intranasal, epidérmica y transdérmica) , oral o parenteral . La administración parenteral incluye la inyección o infusión intravenosa, intraarterial , subcutánea, intraperitoneal o intramuscular; o la administración intracraneal, por ejemplo, intratecal o intraventricular . Las composiciones y formulaciones farmacéuticas para la administración tópica pueden incluir parches transdérmicos , ungüentos, lociones, cremas, geles, gotas, supositorios, pulverizaciones, líquidos y polvos. Los portadores farmacéuticos convencionales, las bases acuosas, en polvo u oleosas, los agentes espesadores y similares pueden ser necesarios o deseables. Los condones revestidos, guantes y similares también pueden ser útiles. Las composiciones y formulaciones para la administración oral incluyen polvos o granulos, suspensiones o soluciones en medios acuosos o no acuosos, cápsulas, sobrecitos o tabletas. Los agentes espesadores, agentes saborizantes, diluyentes, emulsionantes, auxiliares de dispersión y sustancias aglutinantes pueden ser deseables. Las composiciones y formulaciones para la administración parenteral, intratecal o intraventricular pueden incluir soluciones acuosas, estériles que también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados tales como, pero no limitados a, mej oradores de la penetración, compuestos portadores y otros portadores o excipientes farmacéuticamente aceptables. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención incluyen, pero no están limitadas a, soluciones, emulsiones y formulaciones que contienen liposomas. Estas composiciones pueden generarse a partir de una variedad de componentes que incluyen, pero no están limitados a, líquidos preformados, sólidos autoemulsionantes y semisólidos autoemulsionantes.

Las formulaciones farmacéuticas de la presente invención, las cuales pueden presentarse convenientemente en una forma de dosificación unitaria, pueden prepararse de acuerdo con técnicas convencionales que son bien conocidos en la industria farmacéutica. Estas técnicas incluyen el paso que consiste en poner en asociación los ingredientes activos con el (los) portador (es) o excipiente (s) farmacéutico (s) . En general, las formulaciones se preparan al poner en asociación de manera uniforme e íntima los ingredientes activos con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos y luego, si es necesario, dar forma al producto. Las composiciones de la presente invención pueden formularse en cualquiera de muchas formas de dosificación posibles tales como, pero no limitadas a, tabletas, cápsulas, comprimidos, jarabes líquidos, geles suaves, supositorios y enemas. Las composiciones de la presente invención también pueden formularse como suspensiones en medios acuosos, no acuosos o mezclados. Las suspensiones acuosas pueden contener además sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores. En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas pueden formularse y utilizarse como espumas. Las espumas farmacéuticas incluyen formulaciones tales como, pero no limitadas a, emulsiones, microemulsiones, cremas, geles y liposomas . Mientras que son básicamente similares en su naturaleza, estas formulaciones varían en los componentes y la consistencia del producto final. La preparación de estas composiciones y formulaciones es conocida generalmente para aquellas personas expertas en el campo farmacéutico y de formulación y puede aplicarse a la formulación de las composiciones de la presente invención. Un "portador farmacéutico" o "excipiente" es un solvente farmacéuticamente aceptable, agente de suspensión o cualquier otro vehículo farmacológicamente inerte para el suministro de uno o más ácidos nucleicos a un animal . El excipiente puede ser líquido o sólido y se selecciona, teniendo en mente la manera de administración planeada, para proporcionar el volumen deseado, consistencia, etcétera, cuando se combina con un ácido nucleico y los otros componentes para una composición farmacéutica dada. Los portadores f rmacéuticos típicos incluyen, pero no están limitados a, agentes aglutinantes (por ejemplo, almidón de maíz pregel tinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropil-metilcelulosa, etcétera) ; materiales de relleno (por ejemplo, lactosa y otros azúcares, celulosa microcristalina, pectina, gelatina, sulfato de calcio, etil-celulosa, poliacrilatos o fosfato ácido de calcio, etcétera) ; lubricantes (por ejemplo, estearato de magnesio, talco, sílice, dióxido de silicio coloidal, ácido esteárico, estearatos metálicos, aceites vegetales hidrogenados, almidón de maíz, polietilenglicoles , benzoato de sodio, acetato de sodio, etcétera) ; desintegrantes (por ejemplo, almidón, glicolato de almidón sódico, etcétera) y agentes humectantes (por ejemplo, lauril-sulfato de sodio, etcétera) . El excipiente orgánico o inorgánico, farmacéuticamente aceptable que es adecuado para la administración no parenteral, el cual no reacciona de manera perniciosa con ácidos nucleicos también se puede utilizar para formular las composiciones de la presente invención. Los portadores adecuados, farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no están limitados a, agua, soluciones salinas, alcoholes, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilasa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares . Las formulaciones para la administración tópica de los ácidos nucleicos pueden incluir soluciones acuosas tanto estériles como no estériles, soluciones no acuosas en solventes comunes tales como alcoholes o soluciones de los ácidos nucleicos en bases oleosas ya sea líquidas o sólidas. Las soluciones también pueden contener amortiguadores, diluyentes y otros aditivos adecuados. Se pueden utilizar excipientes orgánicos o inorgánicos, farmacéuticamente aceptables que son adecuados para una administración que no es parenteral, los cuales no reaccionan de manera perniciosa con los ácidos nucleicos. Los excipientes adecuados, farmacéuticamente aceptables incluyen, pero están limitados a, agua, soluciones salinas, alcohol, polietilenglicoles, gelatina, lactosa, amilosa, estearato de magnesio, talco, ácido silícico, parafina viscosa, hidroximetilcelulosa, polivinilpirrolidona y similares . Las composiciones de la presente invención pueden contener adicionalmente otros componentes adjuntos que se encuentran convencionalmente en las composiciones farmacéuticas, en sus niveles de uso establecidos en el campo. De esta manera, por ejemplo, las composiciones pueden contener materiales f rmacéuticamente activos, compatibles, adicionales tales como, por ejemplo, antipruriginosos , astringentes, anestésicos locales o agentes antiinflamatorios, b pueden contener materiales adicionales que son útiles en la formulación fisiológica de varias formas de dosificación de las composiciones de la presente invención, tales como tintes, agentes saborizantes , conservadores, antioxidantes , opacificantes, agentes espesadores y estabilizadores. Sin embargo, estos materiales, cuando se adicionan, no deben interferir indebidamente con las actividades biológicas de los componentes de las composiciones de la presente invención. Las formulaciones pueden esterilizarse y, si se desea, mezclarse con agentes auxiliares, por ejemplo lubricantes, conservadores, estabilizadores, agentes humectantes, emulsionantes, sales para influir en la presión osmótica, amortiguadores, colorantes, saborizantes y/o sustancias aromáticas y similares, los cuales no interactúan de manera perniciosa con el (los) ácido (s) nucleico (s) de la formulación. Las suspensiones acuosas pueden contener sustancias que incrementan la viscosidad de la suspensión que incluyen, por ejemplo, carboximetilcelulosa de sodio, sorbitol y/o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizadores : Algunas modalidades de la invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden: (a) uno o más compuestos antisentido y (b) uno o más de otros agentes quimioterapéuticos que funcionan por medio de un mecanismo que no es antisentido. Los ejemplos de estos agentes quimioterapéuticos incluyen, pero no están limitados a, fármacos anticáncer, tales como daunorrubicina, dactinomicina, doxorrubicina, bleomicina, mitomicina, mostaza nitrogenada, clorambucilo, melfalano, ciclofosfamida, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina (CA) , 5-fluorouracilo (5-FU) , floxuridina (5-FUdR) , metotrexato (MTX) , colchicina, vincristina, vinblastina, etoposida, teniposida, cisplatina y dietilestilbestrol (DES) . Véase, generalmente, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15a Ed., Berkow y colaboradores, eds . , 1987, Rahway, N.J., páginas 1206-1228) . Los fármacos anti-inflamatorios que incluyen, pero no están limitados a, fármacos antiinflamatorios no esferoidales y corticosteroides , y los fármacos antivirales que incluyen, pero no están limitados a, ribivirina, vidarabina, aciclovir y ganciclovir, también se pueden combinar en composiciones de la invención. Véase, generalmente, The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 15a Ed. , Berkow y colaboradores, eds., 1987, Rahway, N.J., páginas 2499-2506 y 46-49, respectivamente) . Otros agentes quimioterapéuticos que no son antisentido también están dentro del alcance de esta invención. Dos o más compuestos combinados se pueden utilizar juntos o secuencialmente . Diagnosis, Prognosis, Evaluación de la Terapia (Agentes de Supervisión de la Terapia) y Manejo del Cáncer Los polinucleótidos del TFF3 descritos en este documento, así como también sus productos génicos, son de interés adicional como marcadores genéticos o bioquímicos (por ejemplo, en la sangre o tejidos) que pueden detectar los primeros cambios a lo largo de la via de carcinogénesis y/o para supervisar la eficacia de varias terapias e invenciones preventivas. Por ejemplo, el nivel de expresión del TPF3 puede ser indicativo de un pronostico más pobre y por lo tanto asegura una quimioterapia o radioterapia más agresiva para un paciente o viceversa. La correlación de las características específicas del tumor, secundarias, novedosas con la respuesta al tratamiento y el resultado en pacientes puede definir los indicadores de pronóstico que permiten el diseño de una terapia a la medida en base al perfil molecular del tumor. Estas terapias incluyen la fijación como objetivo de anticuerpos, agentes neutralizantes (por ejemplo, moléculas pequeñas) y terapia génica. La determinación de la expresión del TTF3 y la comparación de un perfil del paciente •con expresión conocida en tejido normal y las variantes de la enfermedad pueden permitir una determinación del mejor tratamiento posible para un paciente, tanto en términos de especificidad del tratamiento como en términos de nivel de bienestar del paciente. Los marcadores de tumores secundarios, tales como la expresión de polinucleótidos , también se pueden utilizar para clasificar mejor, y de esta manera diagnosticar y tratar, las diferentes formas y estados de enfermedad del cáncer. Dos clasificaciones utilizadas ampliamente en la oncología que pueden beneficiarse de la identificación de los niveles de expresión de los genes que corresponden a los polinucleótidos descritos en este documento son la clasificación por etapas del trastorno canceroso y la graduación de la naturaleza del tejido canceroso.

La medición de la expresión del TFF3 puede ser útil para supervisar a los pacientes que tienen o que son susceptibles al cáncer para detectar los eventos potencialmente malignos a un nivel molecular antes de que sean detectables a un nivel morfológico notorio. Además, los polinucleótidos del TFP3 , así como también los genes que corresponden a estos polinucleótidos, pueden ser útiles como agentes de supervisión de la terapia, por ejemplo, para evaluar la efectividad de la terapia utilizando los polinucleótidos o sus productos génicos codificados para evaluar, por ejemplo, la carga de tumor en el paciente antes, durante y después de la terapia. Además, un polinucleotido identificado como que corresponde a un gen que es expresado diferencialmente en un tipo de cáncer también puede tener implicaciones para el desarrollo o riesgo de desarrollo de otros tipos de cánceres, por ejemplo, donde un polinucleotido representa un gen expresado diferencialmente a través de varios tipos de cánceres. De esta manera, por ejemplo, la expresión de un polinucleotido que corresponde a un gen que tiene implicaciones clínicas para el cáncer de colon metastático también puede tener implicaciones clínicas para el cáncer de estómago o cáncer de endometrio. Clasificación por Etapas La clasificación por etapas es un proceso utilizado por los médicos para describir que tan avanzado se encuentra el estado del cáncer en un paciente y la clasificación por etapas ayuda al médico a determinar un pronostico, a planear un tratamiento y a evaluar los resultados de este tratamiento. Los sistemas de clasificación por etapas varían con los tipos de cáncer, pero incluyen generalmente el siguiente sistema WTNM" .- el tipo de tumor, indicado por T; si el cáncer se ha diseminado de manera metastática a nodulos linfáticos cercanos, indicado por N y si el cáncer se ha diseminado de manera metastática a partes más distantes del cuerpo, indicado por M. Generalmente, si un cáncer solo es detectable en el área de la lesión primaria sin haberse extendido a ningún nodulo linfático es llamado Etapa I. Si se ha extendido solo a los nodulos linfáticos más cercanos, es llamado Etapa II. En la Etapa III, el cáncer se ha extendido generalmente a los nodulos linfáticos en proximidad estrecha con el sitio de la lesión primaria. Los cánceres que se han extendido a una parte distante del cuerpo, tal como el hígado, huesos, cerebro .u otro sitio, son la Etapa IV, la etapa más avanzada. Los polinucleotidos descritos en este texto pueden facilitar el afinamiento del proceso de clasificación por etapas al identificar marcadores para la agresividad de un cáncer, por ejemplo el potencial metastático, así como también la presencia en diferentes áreas del cuerpo. De esta manera, un cáncer de Etapa II con un polinucleótido que significa un cáncer con alto potencial metastático puede utilizarse para cambiar un tumor de Etapa II limítrofe a un tumor de Etapa III, justificando una terapia más agresiva. A la inversa, la presencia de un polinucleótido que significa un potencial metastático más bajo permite una clasificación por etapas más conservadora de un tumor . Graduación de los Cánceres El grado es un término utilizado para describir que tan estrechamente se asemeja un tumor al tejido normal de su mismo tipo. La apariencia microscópica de un tumor se utiliza para identificar el grado de tumor en base a parámetros tales como morfología celular, organización celular y otros marcadores de diferenciación. Como regla general, el grado de un tumor corresponde a su tasa de crecimiento o agresividad, siendo que los tumores no diferenciados o de alto grado son generalmente más agresivos que los tumores bien diferenciados o de bajo grado. Las siguientes guías se utilizan generalmente para graduar los tumores: 1) el grado GX no puede evaluarse; 2) Gl bien diferenciado; G2 moderadamente bien diferenciado; 3) G3 pobremente diferenciado; 4) G4 no diferenciado. Los polinucleótidos contemplados por la invención pueden ser especialmente valiosos en la determinación del grado del tumor, ya que no únicamente pueden ayudar en la determinación del estado de diferenciación de las células de un tumor sino que también pueden identificar factores diferentes de la diferenciación que son valiosos para determinar la agresividad de un tumor, tal como el potencial metastático. Detección del Cáncer Los patrones de expresión del TFF3 se pueden utilizar para detectar el cáncer, particularmente cáncer de colon, mama y próstata, en un sujeto. El cáncer colorrectal es uno de los neoplasmas más comunes en humanos y quizás la forma más frecuente de neoplasia hereditaria. La prevención y detección temprana son factores clave en el control y curación del cáncer colorrectal . El cáncer colorrectal comienza como pólipos, los cuales son pequeños crecimientos benignos de células que se forman sobre el recubrimiento interior del colon. Durante un período de varios años, algunos de estos pólipos acumulan mutaciones adicionales y se vuelven cancerosos. Se han identificado múltiples trastornos de cáncer colorrectal familiar, los cuales se resumen como sigue: 1) poliposis adenomatosa familiar (FAP, por sus siglas en inglés); 2) síndrome de Gardner; 3) cáncer de colon sin poliposis hereditario (HNPCC, por sus siglas en inglés) y 4) cáncer colorrectal familiar en judíos Ashkenazi. La expresión de los polinucleótidos apropiados puede utilizarse en el dignostico, prognosis y manejo del cáncer. La detección del cáncer puede determinarse utilizando los niveles de expresión de la secuencia del ¦ TFF3 sola o en combinación con otros genes . La determinación de la naturaleza agresiva y/o el potencial metastático de un cáncer de colon puede determinarse al comparar los niveles de uno o más productos génicos de los genes que corresponden a los polinucleótidos descritos en este documento y al comparar los niveles totales de otra secuencia que se sabe que varía en el tejido canceroso, por ejemplo, la expresión de p53, DCC, ras, FAP (véase, por ejemplo, Fearon ER y colaboradores, Cell (1990) 61 (5) : 759 ; Hamilton SR y colaboradores, Cáncer (1993) 72:957; Bodmer y colaboradores, Nat Genet. (1994) 4(3):21?,· Fearon ER, ñnn N Y Acad Sci. (1995) 768:101) . Por ejemplo, el desarrollo del cáncer puede detectarse al examinar el nivel de expresión del TFF3 que corresponde a los polinucleótidos descritos en este documento con los niveles de los oncogenes {por ejemplo ras) o los genes supresores de tumores (por ejemplo, FAP o p53) . De esta manera, la expresión de los polinucleótidos marcadores, específicos se puede utilizar para discriminar entre tejido de colon normal y canceroso, para discriminar entre cánceres con células de diferente origen, para discriminar entre cánceres con diferentes proporciones metastáticas potenciales, etcétera. Para una revisión de los marcadores del cáncer, véase, por ejemplo, Hanahan y colaboradores (2000) Cell 100:57-70, el cual es incorporado en este documento a manera de referencia en su totalidad.

Tratamiento del Cáncer La invención proporciona métodos para inhibir el crecimiento de células cancerosas y/o para modular la adherencia, migración y/o metástasis de cánceres caracterizados por la expresión del TFF3. Los ejemplos de los mismos incluyen cánceres digestivos, tales como cáncer de colon, cáncer estomacal (gástrico) y cáncer hepático y otros cánceres, tales como cáncer pulmonar, cáncer mamario, cáncer ovárico y cáncer prostático. En algunas modalidades, el cáncer muestra una expresión diferencial del TFF3. En las modalidades adicionales, el TFF3 · es sobrerregulado en el cáncer. En modalidades todavía adicionales, el cáncer es diferente del cáncer de colon y en otras modalidades, el cáncer es diferente del cáncer prostático. La invención incluye el tratamiento de cualquier cáncer donde la administración de un agente neutralizante del TFF3 module (por ejemplo, inhiba) al menos una de la proliferación de células cancerosas, migración de células cancerosas, adherencia y/o metástasis de células cancerosas. Como se muestra en los ejemplos, se ha demostrado que los agentes neutralizantes del TFF3 inhiben la adherencia de células cancerosas e inhiben la proliferación de células cancerosas . La inhibición de la adherencia puede tener un efecto modulador sobre la metástasis al inhibir la capacidad de una célula cancerosa para adherirse a y desarrollar un tumor en un sitio diferente del tumor original. En general, los métodos comprenden poner en contacto una célula cancerosa con una sustancia que modula (1) la expresión de un polinucleótido que corresponde al TFF3 ; o (2) un nivel de y/o una actividad de un polipéptido del TFF3. Los métodos proporcionan una disminución de la expresión del TFF3 en una célula cancerosa o una disminución del nivel de y/o una disminución de una actividad del TFF3. Esta inhibición puede dar por resultado una proliferación, migración y/o adherencia disminuidas de las células cancerosas, un crecimiento reducido del tumor, un volumen reducido del tumor, invasibilidad reducida del tumor y similares. La "reducción del crecimiento de tumores o células cancerosas" incluye, pero no está limitada a, la reducción en la proliferación de células cancerosas (o tumorales) y la reducción en la incidencia que una célula no cancerosa se vuelva una célula cancerosa. Si se ha logrado una reducción en el crecimiento de células cancerosas esto se puede determinar fácilmente utilizando cualquier ensayo conocido, inclusive, pero no limitado a, la incorporación de [¾] -timidina; el conteo del número de células durante un periodo de tiempo; la detección y/o medición de un marcador asociado con el cáncer de colon (por ejemplo, CEA, CA19-9 y LASA) y similares. La presente invención proporciona en particular métodos para tratar el cáncer asociado con el TFF3 , tal como cáncer de colon, cáncer mamario y/o cáncer prostático, que comprenden administrar a un individuo en necesidad de los mismos una sustancia que reduce el crecimiento de células cancerosas, en una cantidad suficiente para reducir el crecimiento de células cancerosas y para tratar el cáncer. Si una sustancia, o una cantidad específica de la sustancia, es efectiva en el tratamiento del cáncer en pacientes esto se puede evaluar utilizando cualquiera de una variedad de ensayos de diagnóstico conocidos para el cáncer, inclusive, pero no limitado a, sigmoidoscopía , proctoscopía, examen rectal, colonoscopia co biopsia, estudios radiográficos de contraste, exploraciones de CAT, angiografia y detección de un marcador de tumor asociado con el cáncer de colon en la sangre del individuo. La sustancia puede administrarse sistémica o localmente. La administración local puede ser útil en el tratamiento, por ejemplo, de un tumor sólido. Diagnóstico y Otros Métodos que Incluyen la Detección del TFF3 La presente invención proporciona métodos para utilizar los agentes neutralizantes del TFP3 , polipéptidos del TFF3 y polinucleótidos del TFF3 descritos en este documento para propósitos de diagnóstico y otros métodos. En las modalidades especificas no limitantes, los métodos son útiles para la detección de células cancerosas asociadas con el TFF3 , tales como células cancerosas de colon, mama, ovario, gástricas y de próstata, para facilitar el dignostico del cáncer y la gravedad de un cáncer (por ejemplo, grado de tumor, carga de tumor y similares) en un sujeto, para facilitar una determinación de el pronostico de un sujeto y para evaluar la sensibilidad del sujeto a la terapia (por ejemplo, al proporcionar una medida del efecto terapéutico a través de, por ejemplo, la evaluación de la carga del tumor durante o después de un régimen quimioterapéutico) . La detección puede basarse en la detección de niveles del TFF3 en una célula, por ejemplo, células cancerosas de colon y/o la detección de un polipéptido del TFF3 en una célula cancerosa. Los métodos de detección de la invención pueden conducirse in vxt.ro o ±n vivo, en células aisladas o en tejidos completos o un fluido corporal, por ejemplo sangre, plasma, suero, orina y similares) . Por consiguiente, la presente invención proporciona métodos para detectar el TFF3 en una muestra biológica y para detectar la presencia de cáncer en una muestra biológica al poner en contacto la muestra y detectar la evidencia de la expresión diferencial del TFF3 en la muestra. La evidencia puede estar en la forma de un enlace entre el agente neutralizante del TFF3 y el TFF3 en la muestra. Numerosos métodos para detectar y medir el nivel de unión son conocidos en el campo e incluyen, por ejemplo, ensayos basados en ELISA y similares . Los niveles de enlace pueden compararse contra muestras estándar para indicar si la expresión del TFF3 es más baja o más alta que en una muestra normal. En algunas modalidades, la detección de la expresión del TFF3 más alta que lo normal indica la presencia de cáncer. La presente invención proporciona además métodos para determinar la susceptibilidad de un paciente a un agente neutralizante del TFF3 al detectar la evidencia de expresión diferencial del TFF3 en una muestra de cáncer del paciente. Como se utiliza en este documento, el término "susceptible" puede describir pacientes para quienes la administración de un agente neutralizante del TFF3 es un método aceptable de tratamiento, es decir, el término describe pacientes quienes es probable que respondan positivamente al tratamiento con un agente neutralizante del TFF3. Los pacientes con cáncer que son susceptibles a los métodos de tratamiento de la presente invención pueden exhibir una expresión diferencial del TFF3 , por ejemplo, en tejido enfermo, en comparación con pacientes quienes no serían susceptibles al tratamiento. Los métodos de detección de la presente invención pueden proporcionarse como parte de un equipo. De esta manera, la invención proporciona además equipos para detectar la presencia y/o el nivel de un TFF3 expresado en una célula cancerosa {por ejemplo, por la detección de un ARm codificado por el gen de interés expresado diferencialmente) y/o un polipéptido codificado con lo cual, en una muestra biológica. Los procedimientos utilizando estos equipos pueden ser realizados por laboratorios clínicos, laboratorios experimentales, practicantes médicos o individuos privados. Los equipos de la invención para detectar un polipéptido codificado por un polinucleótido que es expresado diferencialmente en una célula cancerosas de colon comprenden una porción que se enlaza específicamente al polipéptido, la cual puede ser un anticuerpo específico, molécula antisentido, molécula de iARN, ribozima o molécula pequeña. Los equipos de la invención para detectar un polinucleótido que es expresado diferencialmente en una célula cancerosa comprenden una porción que se hibridiza específicamente con este polinucleótido. El equipo puede proporcionar opcionalmente componentes adicionales que son útiles en el procedimiento, inclusive, pero no limitados a, amortiguadores, reactivos de desarrollo, etiquetas, surfactantes de reacción, medios para detección, muestras de control, estándares, instrucciones e información interpretativa. Detección de un Polipéptido del TFF3 en una Célula Cancerosa En algunas modalidades, se proporcionan métodos para detectar el cáncer asociado con el TFF3 al detectar una sobreexpresión de una célula de TFF3. Cualquiera de una variedad de métodos conocidos pueden utilizarse para la detección, inclusive, pero no limitado a, el inmunoensayo, utilizando un anticuerpo específico para el polipéptido codificado, por ejemplo, por medio del ensayo inmunoabsorbente enlazado a enzimas (ELISA) , radioinmunoensayo (RIA) y similares; y ensayos funcionales para el polipéptido' codificado, por ejemplo actividad de enlace o actividad enzimática. Por ejemplo, un ensayo inmunofluorescente puede realizarse sobre células sin aislar primero el polipéptido codificado. Las células son fijadas primero sobre un soporte sólido, tal como un portaobjetos de microscopio o pocilio de microtítulo. Este paso de fijación puede permeabilizar la membrana celular. La permeabilizacion de la membrana celular permite que se enlace el anticuerpo especifico para el polipéptido. Después, las células fijadas son expuestas a un anticuerpo específico para el polipéptido codificado. Para incrementar la sensibilidad del ensayo, las células fijadas pueden exponerse además a un segundo anticuerpo, el cual está etiquetado y se enlace al primer anticuerpo, el cual es especifico para el polipéptido codificado. Típicamente, el anticuerpo secundario es etiquetado de manera detectable, por ejemplo, con un marcador fluorescente. Las células que expresan el polipéptido codificado serán etiquetadas de manera fluorescente y serán visualizadas fácilmente bajo el microscopio. Véase, por ejemplo, Hashido y colaboradores (1992) Biochem. Biophys . Res. Co m. 187:1241-1248. Como será fácilmente aparente para el artífice de experiencia ordinaria con la lectura de la presente especificación, los métodos de detección y otros métodos descritos en este documento pueden variarse fácilmente. Estas variaciones están dentro del alcance propuesto de la invención. Por ejemplo, en el esquema de detección anterior, la sonda para el uso en la detección puede ser inmovilizada sobre un soporte sólido y la muestra de prueba puede ponerse en contacto con la sonda inmovilizada. El enlace de la muestra de prueba con la sonda, entonces puede detectarse de una variedad de formas, por ejemplo, al detectar una etiqueta detectable que está enlazada a la muestra de prueba para facilitar la detección de .los complejos de muestra de prueba-sonda inmovilizada. La presente invención proporciona además métodos para detectar la presencia de y/o para medir un nivel del polipéptido del TFF3 en una muestra biológica, utilizando un anticuerpo específico para el TFF3. Los métodos comprenden generalmente: a) poner en contacto la muestra con un anticuerpo específico para un TFF3 ; y b) detectar el enlace entre el anticuerpo y las moléculas de la muestra. La detección del enlace específico del anticuerpo específico para el TFF3 , cuando se compara con un control adecuado, es una indicación que el TFF3 está presente en la muestra. Los controles adecuados incluyen una muestra que se sabe que no contiene el TFF3 ; y una muestra en contacto con un anticuerpo no específico para el polipéptido codificado, por ejemplo un anticuerpo anti-idiotipo . Una variedad de métodos para detectar las interacciones de anticuerpo específico-antigeno son conocidos en el campo y se pueden utilizar en el método, inclusive, pero no limitado a, los métodos inmunohistológicos estándar, inmunoprecipitación, inmunoensayo de enzimas y radioinmunoensayo . En general, el anticuerpo específico será etiquetado de manera detectable, ya sea directa o indirectamente. Las etiquetas directas incluyen radioisótopos; enzimas cuyos productos son detectables (por ejemplo, luciferasa, galactosidasda y similares); etiquetas fluorescentes (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, ficoeritrina y similares) ; metales emisores de fluorescencia, por ejemplo 152Eu, u otros de la serie lantanida, unidos al anticuerpo a través de grupos de quelación de metales, tales como EDTA; compuestos quimiolumini scentes , por ejemplo, luminol, isoluminol, sales de acridinio y similares; compuestos bioluminiscentes , por ejemplo luciferina, aequorina (proteína fluorescente verde) y similares. El anticuerpo puede unirse (acoplarse) a un soporte insoluble, tal como una placa de poliestireno o una perla. Las etiquetas indirectas incluyen los segundos anticuerpos específicos para anticuerpos específicos para el polipéptido codificado ("primer anticuerpo específico"), en donde el segundo anticuerpo es etiquetado como se describiera anteriormente; y miembros de pares de enlace específicos, por ejemplo, biotina-avidina y similares. La muestra biológica puede ponerse en contacto con y ser inmovilizada en un soporte sólido o portador, tal como nitrocelulosa, que sea capaz de inmovilizar células, partículas de células o proteínas solubles. El soporte entonces puede lavarse con amortiguadores adecuados, seguido por el contacto con un primer anticuerpo específico ue es etiquetado de manera detectable. Los métodos de detección son conocidos en el campo y serán seleccionados como sea apropiado para la señal emitida por la etiqueta detectable. La detección se realiza generalmente en comparación- con controles adecuados y con estándares apropiados . En algunas modalidades, los métodos se adaptan para el uso in vivo, por ejemplo, para localizar o identificar sitios donde están presentes las células cancerosas asociadas con el TFF3. En estas modalidades, una porción etiquetada de manera detectable, por ejemplo, un anticuerpo, que es específico para el TFF3 administrado a un individuo (por ejemplo, por medio de la inyección) y las células etiquetadas se localizan utilizando técnicas de formación de imágenes estándar, inclusive, pero no limitado a, la formación de imágenes de resonancia magnética, exploración de tomografía computarizada y similares. De esta manera, las células que expresan el TTF3 son etiquetadas diferencialmente .

Detección de un Polinucleotido del TFF3 en una Célula Cancerosa Se proporcionan métodos para detectar una célula cancerosa del TFF3 al detectar la expresión en la célula de una transcripción del TTF3 en una célula cancerosa. Se puede utilizar cualquiera de una variedad de métodos conocidos para la detección, inclusive, pero no limitado a, la detección de una transcripción por medio de la hibridación con un polinucleotido que se hibridiza con un polinucleotido del TFF3; la detección de una transcripción por medio de una reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores de oligonucleótidos específicos; hibridación in si tu de una célula utilizando una sonda de un polinucleotido que se hibridiza con un gen que es expresado diferencialmente en una célula cancerosa de colon. Los métodos pueden utilizarse para detectar y/o medir los niveles de ARNm del gen del TFF3 expresado en una célula cancerosa. En algunas modalidades, los métodos comprenden: a) poner en contacto una muestra con un polinucleotido del TFF3 bajo condiciones que permitan la hibridación; y b) detectar la hibridación, si existe. La detección de la hibridación diferencial, en comparación con un control adecuado, es una indicación de la presencia en la muestra de un polinucleotido que es expresado diferencialmente en una célula cancerosa. Los controles apropiados incluyen, por ejemplo, una muestra que se sabe que no contiene un polinucleotido del TFF3. Las condiciones que permiten la hibridación son conocidas en el campo. La detección también puede realizarse por medio de cualquier método conocido, inclusive, pero no limitado a, la hibridación in si tu, PCR (reacción en cadena de la polimerasa) , RT-PCR (PCR de transcripción inversa) y "Northern" o ARN "Blotting" o combinaciones de estas técnicas, utilizando un polinucleotido etiquetado de manera adecuada. Una variedad de etiquetas y métodos de etiquetado para los nucleótidos son conocidos en el campo y se pueden utilizar ¦ en los métodos de ensayo de la invención. La hibridación especifica puede determinarse por medio de la comparación con controles apropiados. Los polinucleótidos que comprenden generalmente al menos 12 nt contiguos de los polinucleótidos del TFF3 proporcionados en este documento, pueden utilizarse para una variedad de propósitos, tales como sondas para la detección de y/o medición de, los niveles de transcripción de un polinucleotido que es expresado diferencialmente en una célula cancerosa de colon. Una sonda que se hibridiza específicamente con un polinucleotido descrito en este documento debe proporcionar una señal de detección al menos 5, 10 o 20 veces más alta que la hibridación de fondo proporcionada con otras secuencias no relacionadas. Se debe observar que la "sonda" utilizada en este documento se propone para referirse a una secuencia de polinucleótido utilizada para detectar un producto génico del TFF3 en una muestra de prueba. Como se apreciará fácilmente por el artífice de experiencia ordinaria, la sonda puede etiquetarse de manera detectable y ponerse en contacto con, por ejemplo, una disposición que comprende polinucleótidos inmovilizados que se obtienen de una muestra de prueba (por ejemplo, ARNm) . Alternativamente, la sonda puede inmovilizarse sobre una matriz y la muestra de prueba puede etiquetarse de manera detectable. Estas y otras variaciones de los métodos de la invención están dentro de la experiencia en el campo y están dentro del alcance de la invención. Las sondas de nucleótidos se pueden utilizar para detectar la expresión de un gen- que corresponde al nucleótido proporcionado. En los ensayos Norhtern Blot, el ARNm es separado electroforáticamente y puesto en contacto con una sonda. Una sonda es detectada como la hibridación a una especie de ARNm de un tamaño particular. La cantidad de hibridación puede cuantificarse para determinar las cantidades relativas de expresión, por ejemplo bajo una condición particular. Se utilizan sondas para la hibridación in situ con las células para detectar la expresión. Las sondas también se pueden utilizar in vivo para la detección de diagnóstico de secuencias de hibridación. Las sondas son etiquetadas típicamente con un isótopo radioactivo. Otros tipos de etiquetas detectables pueden. utilizarse como cromóforos, fluoróforos y enzimas. Otros ejemplos de ensayos de hibridación de nucleótidos se describen en el documento O 92/02526 y la patente norteamericana No. 5,124,246. La PCR es otro medio para detectar pequeñas cantidades de ácidos nucleicos objetivo (véase, por ejemplo Mullis y colaboradores Meth. Enzymol. (1987) 155:335; las patentes norteamericanas Nos. 4,683,195 y 4,683,202). Dos nucleótidos de polinucleótido cebador que se hibridizan con los ácidos nucleicos objetivo se utilizan para cebar la reacción. Los cebadores pueden comprender una secuencia •dentro o 3' y 5' con respecto a los polinucleótidos descritos en este documento Alternativamente , si los cebadores son 3' y 5' con respecto a estos polinucleótidos, no es necesario hibridizarlos a éstos o los complementos. Después de la amplificación del objetivo con una polimerasa termoestable, los ácidos nucleicos objetivo, amplificados pueden detectarse por medios conocidos en el campo, por ejemplo, la inmunotransferencia Southern. El ARNm o el ADNc también pueden detectarse por medio de técnicas de inmunotransferencia tradicionales (por ejemplo, inmunotransferencia Southern, inmunotransferencia Northern, etcétera) descritas en Sambrook y colaboradores, Molecular Cloning: A Laboratory Manual" (Nueva York, Cold Spring Harbor Laboratory, 1989) (por ejemplo, sin amplificación de la PCR) .

En general, el ARNm o el ADNc generados a partir del ARNm utilizando una enzima polimerasa pueden purificarse y separarse utilizando la electroforesis de gel y transferirse a un soporte sólido, tal como nitrocelulosa . El soporte sólido es. expuesto a una sonda etiquetada, lavado para remover cualquier sonda no hibridizada y se detectan los duplos que contienen la sonda etiquetada. Los métodos que utilizan la amplificación de PCR pueden realizarse sobre el ADN de una célula individual, aunque es conveniente utilizar al menos aproximadamente 105 células. El uso de la reacción en cadena de la polimerasa se describe en Saiki y colaboradores (1985) Science 239:487 y una revisión de las técnicas actuales se puede encontrar en Sambrook y colaboradores Molecular Cloning: A L boratory Manual, CSH Press 1989, páginas 14.2-14.33, cada uno de los cuales es incorporado en este documento a manera de referencia. Una etiqueta detectable puede incluirse en la reacción de amplificación. Las etiquetas detectables, adecuadas incluyen fluorocromos {por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC) , rodamina, Rojo Texas, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM) , 2' ,T -dimetoxi-4' , 5' -dicloro-6-carboxifluoresceína, 6-carboxi-X-rodamina (ROX) , 6-carboxi-2' ,4' ,T ,4, 7-hexaclorofluoresceína (HEX) , 5-carboxifluoresceína (5-FAM) o ?,?,?' ,?' -tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA) ) , etiquetas radioactivas, (por ejemplo 32P, 35S, 3H, etcétera) y similares. La etiqueta puede ser un sistema de dos etapas, donde los polinucleotidos son conjugados con biotina, haptenos, etcétera, que tienen una molécula de unión de alta afinidad, por ejemplo, avidita, anticuerpos específicos, etcétera, donde la molécula de unión es conjugado con una etiqueta detectable. La etiqueta puede conjugarse con uno p ambos cebadores. Alternativamente, la acumulación de nucleótidos utilizados en la amplificación es etiquetada, para incorporar la etiqueta en el producto de la amplificación. M r ces Las matrices de polinucleotidos proporcionan una técnica de alto rendimiento que puede someter a ensayo un gran número de polinucleotidos o polipéptidos en una muestra. Esta tecnología puede utilizarse como una herramienta para someter a prueba la expresión diferencial. Una variedad de métodos para producir matrices, así como también variaciones de estos métodos, son conocidos en el campo y se contemplan para el uso en la invención. Por ejemplo, se pueden crear matrices al puntear sondas de polinucleotidos sobre un substrato (por ejemplo, vidrio, nitrocelulosa, etcétera) en una matriz bi-dimensional o una matriz que tiene sondas enlazadas. Las sondas pueden enlazarse al substrato ya sea por enlaces covalentes o por interacciones no específicas, tales como interacciones hidrófobas. Las muestras de polinucleotidos pueden etiquetarse de manera detectable (por ejemplo, utilizando etiquetas radioactivas o fluorescentes) y entonces hibridizarse con las sondas. Los polinucleotidos de doble cadena, que comprenden los polinucleotidos de muestra etiquetados que están enlazados a polinucleótidos de sonda, pueden detectarse una vez que la porción no enlazada de la muestra es eliminada por lavado. Alternativamente, los polinucleótidos de la muestra de prueba pueden inmovilizarse en la matriz y las sondas pueden etiquetarse de manera detectable. Las técnicas para construir matrices y los métodos para utilizar estas matrices se describen en, por ejemplo, Schena y colaboradores, (1996) Proc Nati Acad Sci EUA. 93 (20) :10614-9; Schena y colaboradores, (1995) Science 270 (5235) :467~70; Shalon y colaboradores, (1996) Genome Res. 6(7):639-45, patente norteamericana No. 5,807,522, EP 799 897; O 97/29212; WO 97/27317; EP 785 280; WO 97/02357; patente norteamericana No. 5,593,839; patente norteamericana No. 5,578,832; EP 728 520; patente norteamericana No. 5,599,695; EP 721 016) patente norteamericana No. 5,556,752; WO 95/22058 y patente norteamericana No. 5,631,734. Las matrices pueden utilizarse, por ejemplo, para examinar la expresión diferencial de genes y pueden utilizarse para determinar la función de los genes. Por ejemplo, se pueden utilizar matrices para detectar la expresión diferencial de un gen del TFF3 , donde la expresión es comparada entre una célula de prueba y una célula de control (por ejemplo, células cancerosas y células normales) . Por ejemplo, la alta expresión de un mensaje particular en una célula cancerosa, la cual no se observa en una célula normal correspondiente, puede indicar un producto génico específico del cáncer. Los usos ejemplares de matrices se describen adicionalmente en, por ejemplo, Pappalarado y colaboradores, Sem. Radiation Oncol . (1998) 8:217 y Ramsay Nature Bíotechnol . (1998) 16:40. Además, muchas variaciones sobre los métodos de detección que utilizan estas matrices están dentro de la experiencia en el campo y dentro del alcance de la presente invención. Por ejemplo, preferiblemente que inmovilizar la sonda en un soporte sólido, la muestra de prueba puede inmovilizarse en un soporte sólido que entonces se pone en contacto con la sonda. Artículos de la Preparación En otras modalidades de la invención, se proporciona un artículo de la preparación que contiene un agente neutralizante del TFF3 que es útil para el tratamiento de las enfermedades o trastornos descritos en este documento. El artículo de la preparación comprende un recipiente y una etiqueta o un inserto de empaque sobre o asociado con el recipiente. Los recipientes adecuados incluyen, por ejemplo, botellas, frasquitos, jeringas, etcétera. Los recipientes pueden estar formados de una variedad de materiales tales como vidrio o plástico. El recipiente retiene o contiene una composición que es efectiva para tratar la enfermedad o trastorno de la selección y puede tener un orificio de acceso estéril (por ejemplo el recipiente puede ser una bolsa de solución intravenosa o un frasquito que tiene un tapón perforable por una aguja de inyección hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un agente neutralizante del TFF3 , tal como una molécula antisentido del TFF3 , molécula de iAR , ribozima, molécula pequeña o anticuerpo. La etiqueta o inserto del paquete indica que la composición se utiliza para tratar a un paciente que tiene o está predispuesto al cáncer, por ejemplo, cáncer de colon, mama o próstata. El artículo de la preparación puede incluir además un segundo recipiente que tiene un amortiguador diluyente farmacéuticamente aceptable, tal como agua bacteriostática para inyección (BWFI) , solución salina amortiguada con fosfato, solución de Ringer y solución de dextrosa. Además, puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, inclusive otros amortiguadores, diluyentes, filtros, agujas y jeringas. ' Los detalles adicionales de la invención son ilustrados por los siguientes ejemplos no limitantes. Las descripciones de todas las citas en la especificación se incorporan expresamente en este documento a manera de referencia en su totalidad.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos se emplean para proveer a aquellas personas de experiencia ordinaria en el campo con una descripción completa y la descripción sobre como elaborar y utilizar la presente invención y no se proponen para limitar el alcance de lo que los inventores consideran como su invención ni se proponen para representar que los siguientes experimentos son todos o los únicos experimentos realizados. Se han hecho esfuerzos para asegurar la precisión con respecto a los números utilizados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etcétera) pero se deben considerar algunos errores y desviaciones experimentales. A menos que se indique de otra manera, las partes son partes en peso, el peso molecular es peso molecular . promedio en peso, la temperatura está en °C y la presión está en o cerca de la presión atmosférica. Ejemplo 1: Fuente dé Materiales Biológicos Los . materiales biológicos utilizados en los experimentos que condujeron a la presente invención se describen a continuación. Fuente de Muestras de Tejido de Pacientes Los tejidos normales y cancerosos se colectaron de pacientes utilizando las técnicas de microdisección de captura de rayos láser (LCM, por sus siglas en inglés) , técnicas que son bien conocidas en el campo (véase, por ejemplo, Ohyama y colaboradores (2000) Biotechniques 29:530-6; Curran y colaboradores (2000) Mol. Pathol. 53:64-8; Suarez-Quian y colaboradores (1999) Biotechniques 26:328-35; Simone y colaboradores (1998) Trends Genet 14:272-6; Conia y colaboradores (1997) J. Clin. Lab. Anal, 11:28-38; Emmert-Buck y colaboradores (1996) Science 274:998-1001). La tabla 2 a continuación proporciona información acerca de cada paciente del cual se aislaron las muestras de tejido de próstata, inclusive: 1) la "la identificación (ID) del Paciente", la cual es un número asignado al paciente para propósitos de identificación; 2) el "Tipo de Tejido"; y 3) el "Grado Gleason" del tumor. La histopatología de todos los tumores primarios indicó que el tumor fue adenocarcinoma .

Tabla 2. Datos de Paciente sobre la Próstata ID del Grado ID del Grado Tipo de Tejido Tipo de Tejido paciente Gleason I Paciente Gleason 93 Cáncer de Próstata 3+4 391 Cáncer de Próstata 3+3 94 Cáncer de Próstata 3+3 420 Cáncer de Próstata 3+3 95 Cáncer de Próstata 3+3 425 Cáncer de Próstata 3+3 96 Cáncer de Próstata 3+3 428 Cáncer de Próstata 4+3 97 Cáncer de Próstata 3+2 431 Cáncer de Próstata 3+4 100 Cáncer de Próstata 3+3 I492 Cáncer de Próstata 3+3 Ejemplo 2: Detección de la Expresión Diferencial Utilizando Matrices Las sondas de ADNc se prepararon a partir del ARN total aislado de las células del paciente descritas anteriormente en el ejemplo 1. Puesto que la LC proporciona el aislamiento de tipos de células específicos para proporcionar una muestra celular sustancialmente homogénea, ésta proporcionó una muestra de ARN similarmente pura. El ARN total se transcribió primero de manera inversa en ADNc utilizando un cebador que contenía un promotor de ARN polimerasa T7, seguido por la síntesis de ADN de la segunda hebra. El ADNc entonces se transcribió in vitro para producir el ARN antisentido utilizando la expresión mediada por el promotor T7 (véase, por ejemplo, Luo y colaboradores (1999) Nature Med 5:117-122) y el ARN antisentido entonces se convirtió en ADNc. El segundo conjunto de ADNcs se transcribió nuevamente in vitro, utilizando el promotor T7, para proporcionar el ARN antisentido. Opcionalmente, el ARN se convirtió nuevamente en ADNc, permitiendo hasta un tercer periodo de amplificación mediada por T7 para producir más ARN antisentido. De esta manera, el procedimiento proporcionó dos o tres períodos de transcripción in vitro para producir el ARN final utilizado para el etiquetado fluorescente . Las sondas fluorescentes se generaron al adicionar primero ARN de control a la mezcla de 7ARN antisentido y producir el ADNc etiquetado de manera fluorescente del material de partida de ARN. Los ADNcs etiquetados de manera fluorescente que se prepararon a partir de la muestra de ARN tumoral se compararon con los ADNcs etiquetados de manera fluorescente que se prepararon a partir de una muestra de ARN de células normales. Por ejemplo, las sondas de ADNc de las células normales se etiquetaron con el tinte fluorescente Cy3 (verde) y las sondas de ADNc que se prepararon a partir de las células tumorales se etiquetaron con el tinte fluorescente Cy5 (rojo) y viceversa. Cada matriz utilizada tuvo un esquema espacial idéntico y conjunto de puntos de control. Cada micromatriz se dividió en dos áreas, cada área que tenía una matriz con, en cada mitad, doce agrupaciones de 32 x 12 puntos, para un total de aproximadamente 9,216 puntos en cada matriz. Las dos áreas fueron punteadas idénticamente, lo cual proporciona al menos dos duplicados de cada clon por matriz. Los polinucleótidos para el uso en las matrices se obtuvieron a partir de tanto fuentes públicamente disponibles como a partir de bibliotecas de ADNc generadas a partir de líneas celulares seleccionadas y los tejidos de pacientes descritos anteriormente . Los productos de PCR de aproximadamente 0.5 · kb a 2.0 · kb amplificados a partir de estas fuentes fueron punteados sobre la matriz utilizando un aplicador puntual Molecular Dinamics Gen IIIMR de acuerdo con las recomendaciones del paciente. La primera hilera de cada una de las 24 regiones en la matriz tuvo aproximadamente 32 puntos de control, que incluyen 4 puntos de control negativos y 8 polinucleótidos de prueba. Los polinucleótidos de prueba se clavaron en cada muestra antes de la reacción de etiquetado con un rango de concentraciones de 2-600 pg/portaobj etos y relaciones de 1:1. Para cada diseño de matriz se hibridizaron dos portaobjetos con las muestras de prueba etiquetadas de manera inversa en la reacción de etiquetado. Esto proporciona aproximadamente cuatro mediciones por duplicado de cada clon, dos de un color y dos de otro color, para cada muestra. El ensayo de expresión diferencial se realizó al mezclar cantidades iguales de sondas de células tumorales y células normales del mismo paciente.' Las matrices se hibridizaron previamente por medio de la incubación durante aproximadamente 2 horas a 60 °C en 5X SSC/SDS 0.2%/EDTA lmM y luego se lavaron tres veces en agua y dos veces en isopropanol . Después de la hibridación previa de la matriz, la mezcla de sondas entonces se hibridizó con la matriz bajo condiciones de alta rigurosidad (durante toda la noche a 42 °C en formamida 50%, 5X SSC y SDS 0.2%. después de la hibridación, la matriz se lavó a 55°C tres veces como sigue: 1) primer lavado en IX SSC/SDS 0.2%; 2) segundo lavado en 0.1X SSC/SDS 0.2%; y 3) tercer lavado en 0.1X SSC.

Las matrices entonces se exploraron por la fluorescencia verde y roja utilizando un explorador de rayos láser de doble color/detector Molecular Dynamics Generation Ulm' Las imágenes se procesaron utilizando el programa para computadora BioDiscovery Autogen y los datos de cada conjunto de exploraciones se normalizaron para proporcionar una relación de la expresión con relación a la expresión normal . Los datos de los experimentos de micromatrices se analizaron de acuerdo con los algoritmos descritos en la solicitud norteamericana no. de serie 60/252,358, presentada el 20 de Noviembre de 2000 por E.J. Moler, M.A. Boyle y F.M. Randazzo, y titulada "Precisión and accuracy in cDNA microarray data", solicitud que se . incorpora específicamente en este documento a manera de referencia. El experimento se repitió, esta vez etiquetando las dos sondas con el color opuesto a fin de realizar el ensayo en ambas "direcciones de color" . Cada experimento se repitió algunas veces con dos portaobjetos más (uno en cada dirección de color) . La fluorescencia del nivel para cada secuencia en la matriz se expresó como una relación del promedio geométrico de 8 puntos repetidos/gen de las cuatro matrices o 4 puntos repetidos/gen de 2 matrices o alguna otra permutación. · Los datos se normalizaron utilizando los controles positivos, clavados que estaban presentes en cada área duplicada y la precisión de esta normalización se incluyó en la determinación final de la trascendencia de cada diferencial . La intensidad de fluorescencia de cada punto también se comparó con los controles negativos en cada área duplicada para determinar que puntos han detectado niveles de expresión significantes en cada muestra. Un análisis estadístico de las intensidades de fluorescencia se aplicó a cada conjunto de puntos duplicados para evaluar la precisión y trascendencia de cada medición diferencial, dando por resultado una prueba de valor p de la hipótesis de nulidad que no existe diferencial en el nivel de expresión entre las muestras de tumor y normales de cada paciente. Durante el análisis inicial de las micromatrices , la hipótesis se aceptó si p > 10-3 y la relación diferencial se estableció a 1.000 para esos puntos. Todos los otros puntos tienen una diferencia significante en la expresión entre la muestra de tumor y normal . Si la muestra de tumor tiene una expresión detectable y la muestra normal no la tiene, la relación es truncada a 1.000 puesto que el valor para la expresión en la muestra normal sería cero y la relación no sería un valor matemáticamente útil (por ejemplo, infinidad) . Si la muestra normal tiene una expresión detectable y el tumor no la tiene, la relación es truncada a 0.001, puesto que el valor para la expresión en la muestra de tumor sería cero y la relación no sería un valor matemáticamente útil . Estas ultimas dos situaciones son referidas en este documento como "activación/desactivación".

Ejemplo 3: Expresión de TFP3 en Células Sobrerregulación del ARNm del TFF3 en el cáncer Las células cancerosas y las células normales, adyacentes de muestras de tumor se recolectaron por medio de Laser-Capture Micro-DissectionMR de cada muestra de cáncer del paciente (véase el ejemplo 1 para la fuente de las muestras dé tejido) . Las sondas etiquetadas se prepararon a partir del ARN de cada muestra y se utilizaron para sondear fragmentos de micromatrices de ADNc (véase el ejemplo 2) . Cada fragmento de micromatriz se hibridizó simultáneamente con las sondas normales y de cáncer para un paciente individual (las sondas normales y de cáncer se etiquetaron con diferentes reactivos fluorescentes) . El nivel de expresión se determinó como una relación de la expresión en células cancerosas sobre la expresión en células normales para cada muestra de paciente. La tabla 3 indica el porcentaje de pacientes en los cuales la relación de expresión en células epiteliales cancerosas sobre la células epiteliales normales es mayor que 2 veces (>2x) , mayor que cinco veces (>5x) o menor que una mitad (<0.5x), en al menos 20% de los pacientes sometidos a prueba.

Tabla 3 : Sobrerregulación del ARNm del TFP3 en el cáncer Expresión en Tejido Normal del TFF3 La expresión del ARNm del TFF3 en tejido completo (por ejemplo, muestras no disectadas con captura de rayos láser, que representan de esta manera todos los tipos de células en la muestra de tejido), tanto normal (N) como con cáncer (C) , se determinó por la PCR cuantitativa en tiempo real. Los resultados se muestran en la figura 1 y los valores son normalizados con HPRT en el tejido total. Los valores para el nivel de expresión del ARNm en el eje y son números relativos que utilizan HPRT como el control de normalización. Las muestras de cáncer representan acumulaciones de muestras de tumor de 8 pacientes individuales (véase el ejemplo 1 para la fuente de los materiales biológicos) . La nomenclatura ¾3+3" se refiere al grado Gleason 6 y ??4+3" se refiere al grado Gleason 7. También se observa que en el pulmón normal (como en el colon) , el TFF3 es expresado por células calciformes y secretado con moco (véase, por ejemplo, Ara. J. Respir. Crit. Care Med. , 1999, 159, 1330).

Detección Inmunohistogaímica (IHC) del TFF3 en Pacientes con Cáncer Las secciones de muestras de tejido (# total de tejidos) para pacientes individuales con cáncer de mama, colon, ovario y próstata (CA) y las contrapartes de tejido normal (NL) se tiñeron con anticuerpos policlonales de conejo purificados por inmunoafinidad para el TFF3 humano. Además, se tiñeron las muestras para varios órganos normales, vitales. El número de muestras gue fueron negativas (-) y positivas (+) por la presencia del TFF3 se proporcionan en la tabla 4, asi como también el porcentaje de las muestras positivas del TFF3 en cada categoría.

Tabla 4 : Resumen IHC Categoría de Tejido # Total de Muestras (-) Muestras (+) % de Muestras Tejidos Positivas CA de Mama 77 21 56 72.7% NL de Mama 20 15 5 25.0% CA de Colon 45 16 29 64.4% NL de Colon 32 1 31 96.9% CA de Ovario 31 25 6 19.4% NL de Ovario 25 25 0 0.0% CA de Próstata 67 24 43 64.2% NL de Próstata 18 17 1 5.6% NL Adrenal. 4 0 4 100.0% NL de Cerebro 8 8 0 0.0% NL de Corazón 10 10 0 0.0% NL de Riñon 7 6 1 14.3% NL de Hígado 8 8 0 0.0% NL de Páncreas 7 7 0 0.0% Expresión del TFF3 en Líneas de Células La expresión del ARNm del TFF3 en ciertas lineas de células se determinó por medio de la PCR cuantitativa en tiempo real. Los resultados se proporcionan en la figura 2. Los valores para el nivel de expresión son números relativos utilizando ß-actina como el control de normalización. Se debe observar también que el eje y es una escala logarítmica, lo que indica que la expresión del TFF3 varió en las lineas de células por márgenes muy grandes. Las líneas de células incluyeron BUVEC (células endoteliales del cordón umbilical humano) , BMEC-1 (células endoteliales microvasculares del cerebro) , Dul45 (células de carcinoma prostético humano) , PC3 (células de carcinoma prostático humano) , LnCap (células de carcinoma prostático humano) , MDAPca2B (células de carcinoma prostático humano) , 22rVl (células de carcinoma prostático humano) , HPV7 (células de carcinoma prostático humano) , HPV10 (células de carcinoma prostático humano) , R PE-1 (células epiteliales de próstata humano) , RWPE-2 (células epiteliales de próstata humano, malignas), PrEC (células epiteliales de próstata humano) , NIH 3T3 (fibroblastos) , HT29 (carcinoma de colon humano) , S 620 (carcinoma de colon humano) , Colo320 (carcinoma de colon humano) , MDA231 (cáncer de mama) , MDA435 (cáncer de mama) , y MCF7 (cáncer de mama) . Ejemplo 4: Regulación Antisentido de la Expresión de Genes La expresión de los genes expresados difereneraímente que son representados por los polinucleótidos en células cancerosas puede analizarse utilizando la tecnología de inactivación de genes antisentido para confirmar el papel y la función del producto génico en la tumorigénesis, por ejemplo, en la promoción de un fenotipo metastático . Una variedad de oligonucleótidos diferentes que son complementarios para el ARNm generado por los genes expresados diferencialmente que se identifican en este documento pueden diseñarse como oligonucleótidos antisentido, potenciales y someterse a prueba por su capacidad para suprimir la expresión de los genes. Los conjuntos de oligómeros antisentido que son específicos para cada uno de los objetivos candidatos se diseñan utilizando las secuencias de los polinucleótidos correspondientes a un gen expresado diferencialmente y el programa para computadora HYBsimulator versión 4 (disponible para Windows SB/Windows"11 o para Power Macintosh, R Ature, Inc. 1003 Health Sciences Road, West, Irvine, CA 92612 EUA) . Los factores que se consideran cuando se diseñan oligonucleótidos antisentido incluyen: 1) la estructura secundaria de los oligonucleótidos; 2) la estructura secundaria del gen objetivo; 3) la especificidad sin hibridación cruzada o con un mínimo de hibridación cruzada con otros genes expresados; 4) la estabilidad; 5) la longitud y 6) el contenido de GC terminal. El oligonucleótido antisentido se diseña de manera que se hibridizará con su secuencia objetivo bajo condiciones de alta rigurosidad a temperaturas fisiológicas (por ejemplo, una temperatura óptima para las células en el cultivo para proporcionar la hibridación en la célula, por ejemplo aproximadamente 37°C) , pero con una formación mínima de homodímeros . Utilizando los conjuntos de oligómeros y el programa HYBsimulator, se diseñan de tres a diez oligonucleótidos antisentido y sus controles inversos y se sintetizan para cada transcripción de AR m candidato, transcripción que se obtiene a partir del gen que corresponde a la secuencia de polinucleótido objetivo que es de interés. Una vez sintetizados y cuantificados , los oligómeros son seleccionados por su eficacia de inactivación de genes de transcripción en un panel de líneas de células cancerosas. La eficacia de la inactivación de genes es determinada al analizar los niveles de ARNm utilizando una cuantificación en un sistema Light Cycler™. Los oligómeros que dieron por resultado el nivel más ' alto de inactivación de genes de transcripción, en donde el nivel fue de al menos aproximadamente el 50%, de preferencia aproximadamente 80-90%, gasta 95% o más hasta un mensaje indetectable, se seleccionan para el uso en un ensayo de proli eración basado en células, un ensayo de crecimiento independiente del anclaje y un ensayo de apoptosis. La capacidad de cada oligonucleótido antisentido diseñado para inhibir la expresión de genes puede someterse a prueba a través de la transfección en las células de carcinoma de próstata LNCaP, PC3 , 22Rvl, MDA-PCA-2b o DÜ1 5. Para cada mezcla de transfección, se prepara una molécula portadora (tal como una molécula de lipido, derivado de lipido, molécula similar a un lipido, molécula de colesterol, derivado de colesterol o molécula similar al colesterol) en una concentración de trabajo de 0.5 mM en agua, es sonicada para producir una solución uniforme y filtrada a través de una membrana de PVDF 0.45 µp?. El oligonucleótido antisentido o de control entonces se prepara en · una concentración de trabajo de 100 µ? en agua estéril Millipore" . El oligonucleótido se diluye además en OptiMEMM (Gibco/BRL) , en un tubo MicrofugeMR, a 2 µ? o aproximadamente 20 µg de oligómeros/ml de OptiME ™1. En un tubo Microfuge™1 separado, la molécula portadora, típicamente en la cantidad de aproximadamente 1.5-2 nmol de portador/pg de oligonucleótido antisentido, se diluye en el mismo volumen de OptiMEM^ utilizado para diluir el oligonucleótido . El oligonucleótido antisentido, diluido se adiciona inmediatamente al portador diluido y se mezcla al ascender y descender en una pipeta. El oligonucleótido se adiciona a las células a una concentración final de 30 nM. El nivel del ARNm objetivo que corresponde a un gen objetivo de interés en las células transfectadas es cuantificado en las líneas de células cancerosas utilizando la máquina de PCR en tiempo real Roche LightCycler^ o la máquina PerkinElmer Gene¾mpm. Los valores para el ARNm objetivo son normalizados contra un control interno [por ejemplo, beta-actina) . Para cada reacción de 20 µ?, el ARN extraído (generalmente 0.2-1 µg total) se coloca en un tubo de microcentrífuga estéril de 0.5 o 1.5 mi y se adiciona agua para un volumen total de 12.5 µ?. A cada tubo se adicionan 7.5 µ? de una mezcla de amortiguador/enzima, preparada al mezclar (en el orden listado) 2.5 µ? de ¾0, 2.0 µ? de amortiguador de reacción 10X, 10 µ? de oligonucleótido de dT (20 pmol), 1.0 µ? de mezcla de dNTP (10 mM cada una), 0.5 µ? de RNAsin" (20u) (Ambion, Inc., Hialeah, FL) y 0.5 µ? de transcriptasa inversa LV (5Ou) (Ambion, Inc.). Los contenidos se mezclan al ascender y descender en una pipeta y la mezcla de reacción se incuba a 42 °C durante 1 hora. Los contenidos de cada tubo se centrifugan antes de la amplificación. Una mezcla de amplificación se prepara al mezclar en el siguiente orden: amortiguador de PCR II IX, MgCl2 3 mM, 140 µ? de cada dNTP, 0.175 pmol de cada oligonucleótido, 1:50,000 dil de SYBR GreenMR, 0.25 mg/ml de BSA, 1 unidad de polimerasa Tag y H20 para 20 µ?. (El amortiguador de PCR II está disponible en una concentración 10X de Perkin-Elmer, Norwalk, CT) . En la concentración IX, éste contiene Tris 10 mM pH 8.3 y Cl 50 mM. SYBR GreenMR (Molecular Probes, Eugene, OR) es un tinte que es fluorescente cuando se enlaza al ADN de doble hebra. Como el producto de PCR de doble cadena se produce durante la amplificación, la fluorescencia de SYBR Greenffi incrementa. A cada alícuota de 20 µ? de la mezcla de amplificación se adicionan 2 µ? ' de la plantilla RT y la amplificación se lleva a cabo de acuerdo con los protocolos estándar. Los resultados son expresados como el porcentaje de disminución en la expresión del producto génico correspondiente con relación a las células no transfectadas , células transfectadas únicamente con el vehículo (células transfectadas con una imitación) o células transfectadas con oligonucleotidos de control inversos. Ejemplo 5: Modulación Antisentido de la Expresión del TFF3 Oligonucleotidos Antisentido Los diversos oligonucleotidos antisentido (AS) se diseñaron, se prepararon y se sometieron a prueba por su capacidad para modular los niveles de ARNm del TFF3 en células SW620 (una línea de células cancerosas de colon que expresa altos niveles del TFF3) .de acuerdo con los procedimientos expuestos en el ejemplo 4. Los oligonucleotidos se proporcionan en la tabla 1, supra. Los oligonucleotidos antisentido con un grado relativamente alto de actividad de supresión incluyeron aquellos que tenían las SEC ID NOS: 9, 10, 15, 16, 17 y 18. Para cada uno de éstos, se sintetizó un oligonucleótido con la secuencia inversa para el uso como un control (RC) para mostrar la especificidad antisentido. Supresión del ARNm del TFF3 Utilizando AS La efectividad de los oligonucleótidos antisentido del TFF3 se sometió a prueba al transfectar cada oligonucleótido en células SW620 y al medir los niveles restantes del ARNm del TFF3 aproximadamente 16 horas después de la transíección, utilizando la PCR cuantitativa en tiempo real . La figura 3 representa los resultados de una selección inicial de los oligonucleótidos AS que corresponden a las SEC ID NOS: 9-18. Los oligonucleótidos AS que corresponden al la SEC ID NOS: 9 y 10 parecieron ser los más efectivos. Los oligonucleótidos AS diseñados como el control 1 y el control 2 representan las secuencias AS relevantes y sirven como controles para evaluar la supresión específica de ARNm del TFF3. Las figuras 4 y 5 representan los resultados de una comparación de los oligonucleótidos AS que corresponden a las SEC ID NOS: 9, 10 y 15 contra sus controles inversos (RC) . Como se puede observar, los oligonucleótidos AS parecieron actuar con la especificidad deseada. La figura 6 representa además la efectividad de los oligonucleótidos AS que corresponden a las SEC ID NOS: 10, 15, 17 y 18 en la supresión de la expresión de ANm del TFF3. El termino "UT" representa las células SW620 no transfectadas . Ejemplo 6: Efecto de la Expresión sobre la Proliferación El efecto de la expresión de genes sobre la inhibición de la proliferación celular puede evaluarse en líneas de células cancerosas de mama metastáticas (MDA-MB-231 ("231")); las células de carcinoma colorrectal de colon SW620; células SKOV3 (una línea de células de carcinomas ovárico-humano) ; o las células de cáncer de próstata LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b o DU145. Las células se colocan a aproximadamente 60-80% de confluencia en charolas de 96 pocilios. El oligonucleótido de control antisentido o inverso es diluido a 2 µ? en OptiME ^. El oligonucleótido-OptiMEM*® entonces se puede adicionar a un vehículo de suministro, vehículo de suministro que puede seleccionarse para ser optimizado por el tipo de célula particular a utilizarse en el ensayo. La mezcla de oligonucleótido/vehículo de suministro entonces se diluye adicionalmente en un medio con suero en las células . La concentración final del oligonucleótido para todos los experimentos puede ser de aproximadamente 300 riM..

Los oligonucleótidos antisentido se preparan como se describiera anteriormente (véase los ejemplos 4 y 5) . Las células son transfectadas durante toda la noche a 37°C y la mezcla de transfección se reemplaza por un medio fresco a la mañana siguiente. La transfección se lleva a cabo como se describiera anteriormente en los ejemplos 4 y 5. Aquellos oligonucleótidos antisentido que dan por resultado la inhibición de la proliferación de las células S 620 indican que el gen correspondiente juega un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en células cancerosas de colon. Aquellos oligonucleótidos antisentido que inhiben la proliferación de las células SK0V3 representan genes que juegan un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en células cancerosas de mama. Aquellos oligonucleótidos antisentido que dan por resultado la inhibición de la proliferación de las células MDA-MB-231 indican que el gen correspondiente juega un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en células cancerosas de ovario. Aquellos oligonucleótidos antisentido que inhiben la proliferación en las células LNCaP, PC3, 22Rvl, DA-PCA-2b o DU145 representan genes que juegan un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en células cancerosas de próstata.

Ejemplo 7: Inducción de la Muerte Celular con la Depleción de Polipeptidos por la Depleción del ARNm A fin de evaluar el efecto de la depleción de un mensaje objetivo con la muerte celular, las células LNCaP , PC3 , 22Rvl, MDA-PCA-2b o DU145 u otras células derivadas de un cáncer de interés pueden trans fectarse para ensayos de proliferación. Para el efecto citotóxico en presencia de cisplatina (cis) , se sigue el mismo protocolo pero- las células se dejan en presencia de fármaco 2 µ? . Cada día, la citotoxicidad es supervisada al medir la cantidad de enzima LDH liberada en el medio debido al daño de la membrana. La actividad de LDH se mide utilizando el equipo Cytotoxicity Detection itMR de Roche Molecular Biochemicals . Los datos se proporcionan como una relación de LDH liberada en el medio contra la LDH total que está presente en el pocilio en el mismo punto de tiempo y tratamiento (rLDH/tLDH) . Un control positivo utilizando los oligonucleótidos de control antisentido e inversos para BCL2 (un gen anti- poptótico conocido) es incluido; la pérdida del mensaje para BCL2 conduce a un incremento en la muerte celular en comparación con el tratamiento con el oligonucleótido de control (citotoxicidad de fondo debido a la transíección) .

Ejemplo 8t Actividad Citotoxica Anti-Proliferativa del Antisentido del TFF3 Efectos en Células Cancerosas Los efectos citotóxicos y anti-proliferativos de los oligonucleótidos antisentido del TFF3 se sometieron a prueba en las células SW620 de acuerdo con los procedimientos de los ejemplos 6 y 7 en diferentes puntos de tiempo después de la transfeccion de los oligonucleótidos AS y RC (ejemplos 4 y 5) . La citotoxicidad se determinó al medir la relación de LDH (lactato-deshidrogenasa) liberada en los medios de cultivo sobre la LDH total . La proliferación fue indicada por los niveles de LDH en células adherentes, intactas. Como un control positivo, el antisentido específico de Bcl-2 también se transfectó. Bcl-2 es una proteína anti-apoptótica, conocida y la expresión bloqueada de este gen da por resultado la apoptosis incrementada. Los resultados se muestran en la figura . Los efectos citotóxicos también se observaron en células de cáncer de próstata (Pca2B) en diferentes condiciones de cultivo. Los resultados se muestran en la figura 8. Los resultados similares se obtuvieron para las líneas de células cancerosas de próstata CU45 y 22Rvl. Un. efecto más débil se observó en las células PC3 y LNCaP. Un oligonucleótido antisentido que se sabe que inhibe la expresión del TFF3 y su secuencia inversa sirven como controles.

Células Normalss Los fibroblastos normales (MRC9) y las células epiteliales de mama normales (184B5) que no expresaban el TFF3 se utilizaron como células de control para someter a prueba los efectos citotóxicos no específicos de los oligonucleótidos AS. Los resultados se representan en la figura 9. Estos resultados indican que los efectos de AS del TFF3 son específicos para las células que expresan el TFF3 y no debido a la toxicidad general de los oligonucleótidos AS. Ejemplo 9: Efecto de la Expresión de Genes sobre la Migración Celular El efecto" de la expresión de genes sobre la inhibición de la migración celular puede evaluarse en las células cancerosas de próstata LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b o DU145 utilizando ensayos de enlace de células endoteliales estáticas, ensayos de enlace de células endoteliales no estáticas, y ensayos de transmigración. Para el ensayo de enlace de células endoteliales estáticas, los oligonucleótidos antisentido se preparan como se describiera anteriormente (véase los ejemplos 4 y 5) . Dos días antes del uso, las células cancerosas de próstata (CaP) se colocan y se transfectan con un oligonucleótido antisentido como se describiera anteriormente (véase los ejemplos 4 y 5) . Un día antes del uso, el medio es reemplazado por medio fresco y el día del uso, el medio es reemplazado por medio fresco, que contiene CMFDA verde CellTracker"11 2 µ? (Molecular Probes, Inc.) y las células son incubadas durante 30 minutos. Después de la incubación, el medio de CaP es reemplazado por medio fresco (sin CMFDA) y las células son incubadas durante 30-60 minutos adicionales. Las células CaP son separadas utilizando CMF PBS/EDTA 2.5 mM o tripsina, son centrifugadas y suspendidas nuevamente en DMEM/BSA 1%/HEPES 10 mM, pH 7.0. Finalmente, las células CaP son contadas y suspendidas nuevamente a una concentración de lxl0e células/ml. Las células endoteliales (EC) son colocadas en placas de 96 pocilios a 40-50% de confluencia 3 días antes del uso. El día del uso, las células EC son lavadas IX con PBS y 50? de DMDM/BSA 1%/HEPES lOmM pH 7 se adicionan a cada pocilio. A cada pocilio entonces se adicionan 50K (50?) de células CaP en DMEM/BSA 1%/HEPES lOmM pH 7. Las placas se incuban durante 30 minutos adicionales y se lavan 5X con PBS que contiene Ca++ y Mg++. Después del lavado final, se adicionan 100 µL de PBS a cada pocilio y la fluorescencia es leída en un lector de placas destinado a la medición de fluorescencia (Ab492/Em 516 nm) . Para el ensayo de enlace de células endoteliales no estáticas, las células CaP se preparan como se describiera anteriormente . Las células EC se colocan en placas de 24 pocilios a 30-40% de confluencia 3 días antes del uso. El día del uso, un subconjunto de células EC es tratado con citosina durante 6 horas, luego lavado 2X con PBS . A cada pocilio entonces se adicionan 150-200K de células CaP en DMEM/BSA 1%/HEPES lOm pH 7. Las placas se colocan en un agitador giratorio (70 RPM) durante 30 minutos y entonces se lavan 3X con PBS que contiene Ca++ y Mg++. Después del lavado final, se adicionan 500 µ?,, de PBS a cada pocilio y la fluorescencia es leída en un .lector de placas destinado a la medición de fluorescencia (Ab492/Em 516 nm) . Para el ensayo de trans-migración, las células CaP se preparan como se describiera anteriormente con los siguientes cambios. El día del uso, el medio de CaP es reemplazado por medio fresco que contiene CMFDA verde CellTracker"11 5 µ? (Molecular Probes, Inc.) y las células son incubadas durante 30 minutos. Después de la incubación, el medio de CaP es reemplazado por medio fresco (sin CMFDA) y las células son incubadas durante 30-60 minutos adicionales. Las células CaP son separadas utilizando CMF PBS/EDTA 2.5 mM o tripsina, son centrifugadas y suspendidas nuevamente en el medio EGM-2-MV. Finalmente, las células CaP son contadas y suspendidas nuevamente a una concentración de lxlO6 células/ml. Las células EC son colocadas en trans-pocillos FluorBlokMR (BD Biosciences) a 30-40% de confluencia 5-7 días antes del uso. El medio es reemplazado por medio fresco 3 días antes del uso y el día del uso. A cada trans-pocillo entonces se adicionan 50 de células CaP etiquetadas. 30 minutos antes de la primera lectura de fluorescencia, se adicionan 10 µg de FITC-dextrano (10K MW) a las células EC colocadas en el filtro. La fluorescencia entonces se lee en múltiples puntos de tiempo en un lector de placas destinado a la medición de fluorescencia (Ab492/Em 516 nra) . Aquellos oligonucleótidos antisentido que dan por resultado la inhibición del enlace de las células cancerosas de próstata LNCaP, PC3 , 22Rvl, DA-PCA-2b o DU145 con las células endoteliales indican que el gen correspondiente juega probablemente un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en las células cancerosas de próstata. Aquellos oligonucleótidos antisentido que dan por resultado la inhibición de la transmigración de células endoteliales por las células cancerosas de próstata LNCaP, PC3, 22Rvl, DA-PCA-2b o DU145 indican que el gen correspondiente juega probablemente un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en las células cancerosas de próstata. Ejemplo 10: Efecto de la Expresión de Genes Sobre la Formación de Colonias El efecto de la expresión de genes sobre la formación de colonias de las células SW620, células SKOV3 , células MD-MBA-231, células LNCaP, células PC3 , células 22Rvl, células MDA~PCA-2b y células DU145 puede someterse a prueba en un ensayo de agar suave . Los ensayos de agar suave son conducidos al establecer primero una capa de fondo de 2 mi de agar 0.6% en medios colocados recientemente dentro de algunas horas de la estratificación sobre las células . La capa de células se forma sobre la capa de fondo al remover las células transfectadas como se describiera anteriormente de las placas utilizando tripsina 0.05% y lavando dos veces en los medios . Las células son contadas en un contador CoulterMR y suspendidas nuevamente a 10s por mi en los medios . Las alícuotas de 10 µ? son colocadas con los medios en placas de 96 pocilios (para verificar el conteo con ST1) o son diluidas adicionalmente para el ensayo en agar suave. Se colocan 2000 células en 800 µ? de agar 0.4% en pocilios de duplicado sobre la capa de fondo de agar 0.6%. Después de que el agar de la capa celular se solidifica, se adicionan gota a gota en la parte superior 2 mi de los medios y el oligonucleótido de control antisentido o inverso (producido como se describiera en el ejemplo 3) se adiciona sin vehículo de suministro . Los medios frescos y los oligonucleótidos se adicionan cada 3-4 días. Se forman colonias en 10 días a 3 semanas. Los campos de colonias son contados a simple vista. Los valores de metabolismo st-1 pueden utilizarse para compensar las pequeñas diferencias en el número de células inicial . Los campos más grandes pueden explorarse para el registro visual de las diferencias.

Aquellos oligonucleótidos antisentido que dan por resultado la inhibición de la formación de colonias de las células SW620 indican que el gen correspondiente juega un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en las células cancerosas de colon. Aquellos oligonucleótidos antisentido que inhiben la formación de colonias en células SK0V3 representan genes que juegan un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en las células cancerosas de mama. Aquellos oligonucleótidos antisentido que dan por resultado la inhibición de formación de colonias de las células MDA-MB-231 indican que el gen correspondiente juega un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en las células cancerosas de ovario. Aquellos oligonucleótidos antisentido que inhiben la formación de colonias en las células LNCaP, PC3, 22Rvl, MDA-PCA-2b o DU145 representan genes que juegan un papel principal en la producción o mantenimiento del fenotipo canceroso en las células cancerosas de próstata. Ejemplo 11: Inhibición Antisentido del Crecimiento de Células Cancerosas Independiente del Anclaje La línea de células cancerosas de próstata MDA Pca-2b fue transfectada con un oligonucleótido antisentido del TFF3 (como se indica en la figura 10; véase los ejemplos 4 y 5 para la descripción de la preparación antisentido) . Mil o 500 células por pocilio (como se indica en la figura 10) se cultivaron en una placa de 96 pocilios y se desarrollaron en suspensión durante 7 días en medios que contenían agar suave. El crecimiento de las colonias de células en agar suave se midió por la incorporación de azul Alamar por las células. Los resultados indican que tanto los oligonucleótidos AS de control (C79-7) como AS del TFF3 (pero no los oligonucleótidos RC respectivos) inhibieron significantemente el crecimiento de esta línea de células cancerosas de próstata independiente del anclaje. Los resultados similares se obtuvieron para la línea de células cancerosas de próstata PC3. Ejemplo 12: Análisis Funcional de Productos Génicos que son Expresados Diferencialmente en Cáncer de Próstata en los Pacientes Los productos génicos (tal como el TFF3) de secuencias de un gen expresado diferencialmente en células cancerosas pueden analizarse adicionalmente para confirmar el papel y la función del producto génico en la tumorigénesis , por ejemplo, en la promoción o inhibición del desarrollo de un fenotipo metastático. Por ejemplo, la función de los productos génicos que corresponden a los genes identificados en este documento puede evaluarse al bloquear la función de los productos génicos en la célula. Por ejemplo, donde el producto génico es secretado o asociado con una membrana de la superficie celular, los anticuerpos bloqueadores pueden generarse y adicionarse a las células para examinar el efecto sobre el fenotipo celular en el contexto de, por ejemplo, la transformación de la célula a un fenotipo canceroso, particularmente metastático. A fin de generar anticuerpos, se selecciona un clon que corresponde a un producto génico seleccionado y se obtiene una secuencia que representa una secuencia de codificación parcial o completa. El clon resultante es expresado, el polipéptido producido es aislado y los anticuerpos son generados. Los anticuerpos entonces se combinan con células y se evalúa el efecto sobre la tumo igénesis . Donde el producto génico de los genes expresados diferencialmente que son identificados en este documento exhibe una homologxa de secuencia con una proteína de función conocida (por ejemplo, con una cinasa o proteasa específica) y/o con una familia de proteínas de función conocida (por ejemplo, contiene un dominio u otra secuencia consensual presente en una familia de proteasas o en una familia de cinasas) , entonces el papel del producto génico en la tumorigénesis , así como también la actividad del producto génico, pueden examinarse utilizando moléculas pequeñas que inhiben o que mejoran la función de la proteína o familia de proteínas correspondiente. Los ensayos funcionales, adicionales incluyen, pero no están limitados necesariamente a, aquellos que analizan el efecto de la expresión del gen correspondiente con el ciclo celular y la migración celular. Los métodos para realizar estos ensayos son bien conocidos en el campo. Ejemplo 13: Ensamblaje de Secuencias Contig y Caracterización Adicional de los Genes Las secuencias de los polinucleótidos proporcionados en la presente invención (por ejemplo, TFF3) pueden utilizarse para ' extender la información de secuencia del gen al cual corresponden los polinucleótidos (por ejemplo, un gen o AKNm codificado por el gen, que tiene una secuencia del polinucleótido descrito en este documento) . Esta información de. secuencia expandida puede utilizarse a su vez para caracterizar adicionalmente el gen correspondiente, lo cual a su vez proporciona información adicional acerca de la naturaleza del producto génico (por ejemplo, la función normal del producto génico) . La información adicional puede servir para proporcionar evidencia adicional del uso del producto génico como un objetivo terapéutico y para proporcionar una guía adicional en cuanto a los tipos de agentes que pueden modular su actividad. En un ejemplo, una secuencia contig es ensamblada utilizando una secuencia de un polinucleótido de la presente invención, la cual está presente en un clon. Una secuencia "contig" es una secuencia contigua de nucleótidos que es ensamblada de secuencias de ácido nucleico que se superponen (por ejemplo, que comparten o son sustancialmente similares) a la. información de secuencia. Las secuencias de ESTs públicamente disponibles (etiquetas de secuencias expresadas) las secuencias de varios clones de varias bibliotecas de ADNc sintetizadas en Chiron pueden utilizarse en el ensamblaje de secuencias contig. La secuencia contig es ensamblada utilizando el programa para computadora Sequencher, versión 4.05, de acuerdo con las instrucciones del fabricante y se produce un alineamiento de compendio de las secuencias contiguas. La información de secuencia obtenida en el ensamblaje de secuencias contig entonces se puede utilizar para obtener una secuencia consensual derivada de la secuencia contig utilizando el programa Sequencher. La secuencia consensual se utiliza como una secuencia de averiguación en una búsqueda TeraBLASTN del índice DGTI DoubleTwist Gene Index (DoubleT ist , Inc., Oakland, CA) ,. el cual contiene toda la secuencia EST y no redundante en las bases de datos públicas. A través del ensamblaje de secuencias contig y el uso de los programas para computadora de búsqueda de homología, la información de secuencia proporcionada en este documento puede extenderse fácilmente para confirmar un gen o confirmar un gen previsto, que tiene la secuencia de los polinucleótidos descrita en la presente invención. Además, la información obtenida puede utilizarse para identificar la función del producto génico del gen correspondiente a los polinucleótidos descritos en este documento. Mientras que no es necesaria para la práctica de la invención, la identificación de la función del gen correspondiente puede proporcionar una guía en el diseño de productos terapéuticos que fijan como objetivo el gen para modular su activad y para la modular el fenotipo canceroso (por ejemplo, para inhibir la metástasis, la proliferación y similares") . Ejemplo 14: Prueba la -vivo de los Agentes Neutralizantes del TFF3 Los agentes neutralizantes del TFF3 pueden someterse a prueba por la actividad antitumoral en modelos animales de acuerdo con procedimientos conocidos en el campo para la evaluación pre-clínica de candidatos de fármacos. Los modelos animales adecuados incluyen ratones TRAMP (disponibles de NCI-Frederick Mouse Models of Human Cáncer Consortium Repository or The Jackson Laboratory) para el cáncer de próstata y ratones Min (disponibles de The Jackson Laboratory) para el cáncer de colon. Los modelos animales para otros cánceres son bien conocidos en el campo.

Ejemplo 15: Epítopos del TFF3 Los epítopos lineales del TFF3 para el reconocimiento y preparación de anticuerpos se pueden identificar por medio de cualquiera de los numerosos métodos conocidos en el campo. Algunos métodos ejemplares incluyen sondear la capacidad de enlace a anticuerpos de los péptidos derivados de las secuencia de aminoácidos del antigeno. El enlace puede evaluarse al utilizar los métodos BIACORE o ELISA. Otras técnicas incluyen exponer las bibliotecas de péptidos sobre un soporte sólido, plano ( w fragmento" ) a anticuerpos y detectar el enlace a través de cualquiera de múltiples métodos utilizados en la selección de fase sólida. Adicionalmente , la exhibición de fagos puede utilizarse para seleccionar una biblioteca de péptidos con la selección de ios epítopos después de varios periodos de selección y aislamiento biológicos. Los agentes neutralizantes de anticuerpos adecuados de acuerdo con la presente invención pueden reconocer epítopos lineales o conformacionale s o combinaciones de los mismos . La tabla 5 a continuación proporciona regiones del TFF3 que han sido identificadas como epítopos lineales que son adecuados para el reconocimiento por los anticuerpos anti-TFF3.

Tabla 5 Ejemplo 16: Los Anticuerpos Policlonales Contra el TFF3 Inhiben el Crecimiento de Células Tumorales A. Generación de Anticuerpos Policlonales Los conejos albinos de Nueva Zelanda se anestesiaron y se inmunizaron en el dia 0 y el dia 28 utilizando un vector de expresión de ADN que codifica el TFF3 humano. Específicamente, para cada inmunización, 0.6 mg del vector de expresión de ADN se inyectaron intramuscularmente por conejo y se aplicó brevemente una corriente eléctrica suave al sitio de inyección para estimular la captación del ADN por las células musculares en el área. Los conejos entonces se reforzaron mensualmente por medio de la inyección intramuscular de la proteína del TFF3 humano recombinante que es emulsionada ya sea en el adyuvante MF-59 o el adyuvante de Freund incompleto. Las muestras de sangre se tomaron 14 días después de cada inmunización y el suero generado de las muestras de sangre se sometió a prueba en un ensayo ELISA para determinar el título de la respuesta de anticuerpos contra la proteína del TFF3 humano recombinante. Los sueros entonces se fraccionaron por medio de la cromatografía sobre una columna de proteína A a fin de purificar el componente de anticuerpo de IgG en cada muestra. B. Ensayo de Proliferación de Células S 620 A fin de someter a prueba si los anticuerpos policlonales de conejo podrían afectar la supervivencia de células cancerosas, las diluciones en serie de las IgGs purificadas que se obtuvieron de los conejos inmunizados se adicionaron a la línea de células cancerosas (SW620) que habían mostrado por medio de la inmunotransferencia Western que secretaban la proteína del TFF3. Para esta prueba, las células SW620 se sembraron primero en placas de 96 pocilios ¦ en una densidad de 600 células/pocilio en un medio de crecimiento que contenía suero bovino fetal 10% (FBS) . Veinticuatro horas después (día 0) , el medio se removió y se adicionó medio de crecimiento fresco que contenía FBS 1% y varias concentraciones de las IgGs de conejos inmunizados o pre-inmunes . Cada concentración de IgG se sometió a prueba en pocilios por cuadruplicado. En el día 4, el medio se removió nuevamente de las placas y el medio fresco gue contenia FBS 1% y alícuotas de la fracción de IgG respectiva se adicionó nuevamente a los pocilios. El número relativo de células en cada pocilio se medió en los días 0, 1, 4, 5, 6 y 7 utilizando el "Ensayo de Proliferación de Células en una Solución de Título de Células" (Promega) . Los resultados de una prueba de este tipo se muestran en la figura 11 para los anticuerpos de IgG obtenidos de uno de los conejos inmunizados (conejo 707) . La gr fica compara- la cantidad de proliferación detectada en el día 7 en pocilios que contenían IgG tomada del conejo ya sea antes de la primera inmunización ("pre-inmune" ) o después de varios periodos de inmunización ("Día inmune 156") . Los pocilios que contenían la IgG del "Día inmune 156" mostraron una proliferación menos significante que aquellos que contenían la IgG "pre-inmune" . Mientras que la presente invención ha sido descrita con referencia a las modalidades específicas de la misma, debe ser entendido por aquellas personas expertas en el campo que se pueden hacer varios cambios y los equivalentes pueden ser sustituidos sin apartarse del espíritu y alcance verdaderos de la invención. Además, se pueden hacer muchas modificaciones para adaptar una situación, material, composición de material, proceso, paso o pasos del proceso particulares al objetivo, espíritu y alcance de la presente invención. Se propone que todas estas modificaciones estén dentro del alcance de las reivindicaciones anexas a este documento . Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (1)

1. REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .- 1. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o prevención del cáncer. 2. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente neutralizante del TFF3 comprende un ácido nucleico. 3. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, en donde el cáncer es cáncer de mama, colon, próstata, ovario o gástrico. 4. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde el TFF3 es expresado diferencialmente en células del cáncer. 5. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente neutralizante comprende una molécula antisentido . 6. El uso de conformidad con la reivindicación 5, en donde la molécula antisentido comprende o se superpone a una secuencia de cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. 7. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente neutralizante comprende una molécula de iARN. 8. El uso de conformidad con la reivindicación .7, en donde la molécula de iARN comprende o se suerpone a una secuencia que corresponde a cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. 9. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el agente neutralizante del TFF3 comprende un anticuerpo que se une específicamente al TFF3. 10. El uso de conformidad con la reivindicación 1, en donde el cáncer no es cáncer de colon o próstata. 11. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en · la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer, el medicamento es utilizado en combinación con un tratamiento tradicional contra el cáncer. 12. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde el tratamiento tradicional contra el cáncer es la quimioterapia. 13. El uso de conformidad con la reivindicación 11, en donde el tratamiento tradicional contra el cáncer es la terapia de ablación hormonal . 1 . El uso de conformidad con la reivindicación 13, en donde la hormona es un androgeno. 15. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la modulación de la apoptosis en una célula. 16. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la célula es de un mamífero. 17. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la célula es cancerosa. 18. El uso de conformidad con la reivindicación 15, en donde la célula es una célula de mama, próstata, colon, ovario o gástrica. 19. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la inhibición del crecimiento del tumor o para la reducción de volumen del tumor . 20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque el tumor comprende células en las cuales el TFF3 es expresado diferencialmente . 21. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la modulación de al menos un efecto fisiológico asociado con. la expresión del TFF3 en una célula. 22. El uso de conformidad con la reivindicación 21, en donde el efecto fisiológico es la motilidad celular incrementada o la resistencia a la apoptosis. 23. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la inhibición de la migración, adherencia o proliferación de una célula. 24. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la reducción de la invasibilidad de una célula cancerosa. 25. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la modulación de la expresión del TFF3 en una célula. 26. Un método para detectar el TFF3 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con un agente neutral zante del TFF3 y detectar el enlace entre el agente neutralizante y el TFF3 en la muestra. 27. Un método para detectar la presencia de cáncer en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: poner en contacto la muestra biológica con un agente neutralizante del TFF3 y detectar la evidencia de expresión diferencial del TFF3 en la ¦ muestra biológica, en donde la evidencia de expresión diferencial del TFF3 es indicativa de la presencia de cáncer. 28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque la detección comprende comparar los resultados del contacto con un control . 29. Un método para determinar la susceptibilidad de un paciente a un agente neutralizante del TFF3, caracterizado porque comprende detectar la evidencia de expresión diferencial del TFF3 en la muestra de cáncer del paciente, en donde la evidencia de expresión diferencial del TFF3 es indicativa de la susceptibilidad del paciente al agente neutralizante del TFF3. 30. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la evidencia de la expresión diferencial del TFF3 es la sobrerregulación del TFF3 en la muestra de cáncer del paciente . 31. El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque la muestra de cáncer del paciente es de tejido de mama, próstata, colon, ovario o gástrico. 32. Un método para valorar el progreso del cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende comparar la expresión del TFF3- en el paciente en un primer punto de tiempo con la expresión del TFF3 en un segundo punto de tiempo, en donde la expresión incrementada del TFF3 en el segundo punto de tiempo con relación al primer punto de tiempo es indicativa del progreso del cáncer. 33. El método de conformidad con la reivindicación 30 , caracterizado porgue la expresión incrementada del TFF3 es una expresión incrementada de al menos aproximadamente 25%. 34. Un método para detectar un riesgo incrementado ' de metástasis de un cáncer en un paciente, caracterizado porque comprende cortparar la expresión del TFF3 en el paciente en un primer punto de tiempo con la expresión del ' TFF3 en un segundo punto de tiempo, en donde la expresión incrementada del TFF3 en el segundo punto de tiempo con relación al primer punto de tiempo es indicativa de un riesgo incrementado de metástasis . 35. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-34, caracterizado porque el agente neutralizante del TFF3 comprende una etiqueta detectable. 36. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-35, caracterizado porque el agente neutralizante del TFF3 comprende una radioetiquet . 37. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 11-36, en donde el agente neutralizante del TFF3 comprende un anticuerpo, ácido nucleico, molécula antisentido o molécula de iARN. 38. Una molécula antisentido, caracterizada porque modula la expresión del TFF3. 39. La molécula antisentido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque la molécula antisentido comprende o se superpone a una secuencia de cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. 40. La molécula antisentido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizada porque comprende cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. 41. Una molécula de iARN, caracterizada porque modula la expresión del TFF3. 42. La molécula de iARN de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque la molécula de iARN comprende o se superpone a una secuencia de cualquiera de las SEC ID NOS: 5-19. 43. Una composición, caracterizada porque comprende una molécula antisentido de conformidad con la reivindicación 38 y un portador farmacéuticamente aceptable. 44 . Una composición, caracterizada porque comprende una molécula de iARN de conformidad con la reivindicación 43 y un portador farmacéuticamente aceptable . 45 . Un anticuerpo anti-TFF3 aislado, caracterizado porque reconoce al menos una región de la secuencia del TFF3 que corresponde a las SEC ID NOS : 20, 21, 22, 23 , 24, 25, 26, 27 o 28 . 46. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque es producido por medio del procedimiento que comprende : a) sintetizar una biblioteca de anticuerpos en un fago; b) seleccionar y aislar la biblioteca contra una muestra al poner en contacto el fago con una composición que comprende al menos una región de la secuencia del TFF3 que corresponde a las SEC ID NOS : 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 o 28 ; c) aislar el fago que se enlaza a la composición, en donde el anticuerpo tiene la capacidad para enlazarse a al menos una región de la secuencia del TFF3 que corresponde a las SEC ID NOS : 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27 o 28 con una afinidad de enlace de al menos 108 1/ ; y d) analizar el fago aislado para determinar una secuencia que codifica una secuencia de aminoácidos a la cual se enlaza al menos una región de la secuencia del TFF3 que corresponde a las SEC ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24 , 25, 26, 27 o 28. 47 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque es un anticuerpo monoclonal . 48. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45 , caracterizado porque es un anticuerpo policlonal . 49. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque es un anticuerpo quimérico. 50 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque es un anticuerpo humanizado. 51. El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45, caracterizado porque es un anticuerpo de cadena individual . 52 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45 , caracterizado porque es un fragmento Fab . 53 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45 , caracterizado porque es etiquetado . 54 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 53 , caracterizado porque la etiqueta es una enzima, radioisótopo o fluoróforo . 55 . El anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45 , caracterizado porque la afinidad de enlace del anticuerpo es menor que aproximadamente 1 x 105 a para un polipéptido diferente del TFF3 . 56. Una célula aislada, caracterizada porque produce el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45. 57 . Un hibridoma, caracterizado porque produce el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45 . 58 . Una composición, caracterizada porque comprende el anticuerpo anti-TFF3 de conformidad con la reivindicación 45 y un portador farmacéuticamente aceptable. 59. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer, en donde el agente neutralizante es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45. 60. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención del cáncer, el medicamento es utilizado en combinación con un tratamiento tradicional contra el cáncer, en donde el agente neutralizante del TFF3 es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45. 61. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el tratamiento tradicional contra el cáncer, es la quimioterapia. 62. El uso de conformidad con la reivindicación 60, en donde el tratamiento tradicional contra el cáncer es la terapia de ablación hormonal . 63. El uso de conformidad con la reivindicación 62, en donde la hormona es un andrógeno. 6 . El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la inducción de la apoptosis, en donde el agente neutralizante es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45. 65. El método de conformidad con la reivindicación 64, caracterizado porque la célula es de un mamífero. 66. El uso de conformidad con la reivindicación 64, en donde la célula es cancerosa. 67. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la reducción de volumen del tumor, la prevención de crecimiento del tumor o la inhibición de crecimiento del tumor, en donde el agente neutralizante del TFF3 es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45. 68. El uso de. conformidad con la reivindicación 67, en donde el tumor comprende células en las cuales el TFF3 es expresado diferencialmente. 69. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la modulación de al menos un efecto fisiológico asociado con la expresión del TFF3 en una célula, en donde el agente neutralizante del TFF3 es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45. 70. El uso de conformidad con la reivindicación 69, en donde el efecto fisiológico es la motilidad celular incrementada o la resistencia a la apoptosis. 71. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la inhibición de la migración, adherencia o proliferación de una célula, en donde el agente neutralizante del TFF3 es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45. 72. El uso de un agente neutralizante del TFF3 en la preparación de un medicamento para la reducción de invasibilidad de un cáncer, en donde el agente neutralizante del TPF3 es el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45. 73. Un método para detectar el TFF3 en una muestra biológica, caracterizado porque comprende poner en contacto la muestra con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45 y detectar el enlace entre el agente neutralizante y el TFF3 en la muestra. 74. El método de conformidad con la reivindicación 73, caracterizado porque el agente neutralizante del TFF3 comprende una etiqueta detectable. 75. Un método para detectar la presencia de cáncer en una muestra biológica, caracterizado porque comprende: poner en contacto la muestra biológica con el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45 y detectar la evidencia de expresión diferencial del TFF3 en la muestra biológica, en donde la evidencia de expresión diferencial del TFF3 es indicativa de la presencia de cáncer. 76. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque la detección comprende comparar los resultados del contacto con un control . 77. El método de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado porque el agente neutralizante del TFF3 comprende una etiqueta detectable. 78. Un polipéptido aislado, caracterizado porque comprende tres o menos secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEC ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28. 79. El péptido de conformidad con la reivindicación 78, caracterizado porque el polipéptido es de aproximadamente 8 a aproximadamente 80 aminoácidos de longitud. 80 . El péptido de conformidad con la reivindicación 78 , caracterizado porque el polipéptido se enlaza específicamente a un anticuerpo anti-TPP3 . 81 . Un método para utilizar un anticuerpo para detectar la expresión diferencial del TFF3 en una muestra , caracterizado porque comprende : a) combinar el anticuerpo de conformidad con la reivindicación 45 con la muestra baj o condiciones , las cuales permiten -la formación de complej os de anticuerpo : FF3 ; b) medir la cantidad de los complej os ; y c) comparar la cantidad de los complej os a un control , en donde los niveles elevados de complej o en la muestra indican la expresión diferencial del TFF3 . 82 . Un fragmento , caracteri zado porque lleva epítopos aislados del polipéptido de las SEC ID NOS : 1-4 . 83 . El fragmento que lleva epítopos de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque consiste entre aproximadamente 6 y aproximadamente 20 aminoácidos contiguos de las SEC ID NOS : 1-4 . 8 . El fragmento que lleva epítopos de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque consiste de aproximadamente 10 aminoácidos contiguos de las SEC ID NOS : 1-4. 85. El fragmento que lleva epítopos de conformidad con la reivindicación 82, caracterizado porque consiste entre aproximadamente 6 y aproximadamente 20 arriinoácidos contiguos de la SEC ID NO: 2. 86. El fragmento que lleva epítopos de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque consiste de aproximadamente 10 aminoácidos contiguos de la SEC ID NO: 2. 87. El fragmento que lleva epí opos de conformidad con la reivindicación 83, caracterizado porque comprende las SEC ID NOS: 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 o 28. 88. Un anticuerpo anti-TFF3 aislado, caracterizado porque se obtiene por medio de la inmunización de un sujeto con el fragmento que lleva epxtopos de conformidad con la reivindicación 83. 89. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende el anticuerpo de ' conformidad con la reivindicación 45 y un portador farmacéuticamente aceptable. 90. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 89, caracterizada porque el anticuerpo neutraliza el TFF3. 91. Un método para generar un anticuerpo para el · tratamiento del cáncer, caracterizado porque comprende identificar un anticuerpo que se enlaza a y que neutraliza el TFF3 y expresar el anticuerpo en una célula hospedera de expresión recombinante . 92. Una composición farmacéutica, caracterizada porque comprende un anticuerpo que se enlaza a y que neutraliza el TFF3, en donde el anticuerpo se genera utilizando una célula hospedera, recombinante y un portador farmacéuticamente aceptable. 93. La composición farmacéutica de conformidad con la reivindicación 92, caracterizada porque la célula hospedera, recombinante se selecciona del grupo que consiste de células de ovario de hámster' chino, células de mieloma y células hospedantes, bacterianas.