KR20060039317A

KR20060039317A - 아스퍼질러스 니듈란스로부터 분리한 신규 펩타이드 및이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20060039317A
Application number: KR1020040088456A
Authority: KR
Inventors: 함경수; 박윤경; 곽지선; 박성철
Original assignee: 학교법인조선대학교
Priority date: 2004-11-02
Filing date: 2004-11-02
Publication date: 2006-05-08
Also published as: KR100625875B1; WO2006080625A1

Abstract

본 발명은 신규 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 구체적으로는 곰팡이 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)로부터 분리 정제한 항균 및 항진균용 신규 펩타이드인 니듈린(Nidulin) 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 신규 펩타이드인 니듈린은 항균 및 항진균 활성이 우수하고 독성이 없으므로 항균제, 항진균제 뿐 아니라 인체에 무해한 농약, 식품방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있다.

항생제, 농약, 의약품

Description

아스퍼질러스 니듈란스로부터 분리한 신규 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물{Novel peptide isolated from Aspergillus nidulans and phamaceutical composition containing the same}

도 1은 RP-HPLC(Reverse Phase-high performance liquid chromatography)를 이용하여 신규 펩타이드인 니듈린(Niduline)을 분리, 정제한 결과를 나타낸 그래프이고,

도 2a는 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)로부터 분리, 정제한 신규 펩타이드인 니듈린(Niduline)의 SDS-PAGE 사진이고, 도 2b는 서열번호 1로 기재되는 신규 펩타이드인 니듈린(Niduline)의 아미노산 서열을 나타낸 그림이고,

도 3은 신규 펩타이드인 니듈린(Niduline)을 첨가한 배지에 진균류인 캔디다 알비칸스(Candida albicans)를 배양하여 신규 펩타이드인 니듈린의 항진균 활성을 가시화한 그림이고,

도 4는 신규 펩타이드인 니듈린(Niduline)을 첨가한 배지에 박테리아인 스타 필로코코스 아우레어스(Staphylococcus aureus)를 배양하여 신규 펩타이드인 니듈린의 항균 활성을 가시화한 그림이다.

본 발명은 신규 펩타이드 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 곰팡이 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)로부터 분리 정제한 항균 및 항진균용 신규 펩타이드인 니듈린(Nidulin) 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다.

세균의 감염은 인간의 질병에서 가장 흔하고 치명적인 원인 중의 하나이다. 플레밍(fleming)이 1929년에 페니실린(penicillin)을 발견한 이래, 자연계로부터 항균물질을 분리하여 세균 감염을 치료하는 항생제를 개발하기 위한 연구가 계속되어 왔다.

항생제라는 용어는 토양의 시료로부터 미생물 분리작업을 거쳐 스트렙토마이신(streptomycin)을 발견한 미국의 selman a. waksman이 다른 미생물의 발육이나 대사를 저해하는 물질을 '항생제(antibiotics)'라고 부를 것을 미국 세균학회에 제안함으로써 탄생하였다. 일반적인 항생물질은 미생물이 생산하는 화학적 물질로서 낮은 농도로도 다른 미생물의 생육을 저해하는 물질로 정의되나, 미생물로부터 분 리한 것과 더불어 미생물의 생산물이 화학적으로 합성이 가능한 경우나 미생물 생산물로부터 화학적으로 유도체를 만드는 경우까지 포함한다. 더 나아가 미생물의 발육이나 대사 뿐 아니라 암세포의 발육 또는 대사를 저해하는 경우도 포함한다.

한편, 질병치료에 사용되는 항생제의 경우에 지금까지 많은 종류의 항생물질이 발견ㆍ개발되어 널리 사용되고 있으나, 점차 항생제에 내성이 생긴 병원성 미생물이 출현하고 그 수가 증가하고 있는 실정이다.

항생제에 대한 내성(tolerance)은 항생제에 대한 저항성(resistance)과는 구별되는 현상인데, 1970년대에 뉴모코커스(Pneumococcus sp.)에서 최초로 발견이 되었다(Tomasz et al., Nature, 227; 138-140, 1970). 내성을 보이는 종은 통상적인 농도의 항생제 존재 하에서는 성장을 멈추지만 죽지는 않는데 이는 항생제가 세포벽 합성 효소를 저해할 때 세균 자체의 오토라이신(autolysin) 등과 같은 자가분해(autolytic) 효소의 활성이 일어나지 않기 때문인 것으로 알려져 있다.

작용 기작의 측면에서 내성은 크게 두 가지 경로로 이루어지는데, 첫 번째는 모든 세균에 있어서 성장속도가 감소할 때 일어나는 외형적(phenotypic) 내성이며(Tuomanen E., Revs. Infect. Dis., 3; S279-S291, 1986), 두 번째는 특정 세균에서 일어나는 돌연변이에 의한 유전적인 내성이다. 두 가지 경우 모두 오토라이신 활성의 하부조절(down regulation)이 일어난다는 것이 공통점인데, 이러한 하부조절은 외형적인 내성의 경우에는 일시적이며, 돌연변이가 일어난 유전적인 내성의 경우에는 영구적이다. 가장 간단한 유전적인 내성의 경우는 오토라이신 효소에 결 손이 일어나는 것이나, 임상적으로 효소의 결손에 의해 내성을 가지는 균주가 발견된 적은 없으며, 오히려 오토라이신의 활성을 조절함으로써 내성을 가지는 예가 주로 보고되고 있다(Tuomanen et al., J. infect. Dis., 158; 36-43, 1988).

세균이 여러 가지 항생제에 대하여 내성을 가지는 것은 임상적으로 대단히 중요한데, 이는 내성 세균을 박멸하는 것이 불가능하게 되면 임상적인 감염에서 항생제 치료의 효용이 떨어지기 때문이다(Handwerger and Tomasz, Rev. Infec. Dis., 7; 368-386, 1985). 아울러, 내성이 생기면 항생제 치료에도 불구하고 살아남는 균주가 생기고 이러한 균주는 항생제에 저항성을 가지는 새로운 유전 요소를 획득해서 항생제의 존재 하에서도 계속 성장하게 되므로 내성은 항생제에 대한 저항성이 생기게 되는 선행조건이 된다.

현재 페니실린(penicillin) 및 메티실린(methicillin)계 항생제 내성 균주 즉, MRSA(methicillin resistant staphylococcus), MRSE(MethicillinResistant Staphylococcus epidermidis) 등에 대한 강력한 항생제로서 반코마이신(VANCOMYCIN), 테이코플라닌(TEICOPLANIN)이 개발되어 그 사용이 계속 증가되어 왔다. 그러나 과도한 사용으로 인하여 최후의 항생제로 불리는 반코마이신마저 이에 내성을 지닌 병원성 세균인 엔테로코사이(enterococci)가 발견되고 있으며, 엔테로코쿠스 패칼리스(Enterococcus faecalis), 마이코박테리움 투버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis) 및 슈도모나스 에루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 등은 지금까지 알려진 모든 항생제에 대한 내성을 나타내고 있다(Stuart B. Levy, Scientific American, 46-53, 1998). 따라서 항생제 내성 및 저항성을 가지는 세균을 사멸할 수 있는 신규한 항생제의 개발이 절실히 필요하다.

이에, 본 발명자들은 진균류인 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)의 배지에서 신규 펩타이드인 니듈린(Niduline)을 분리, 정제하여 항균 및 항진균 활성 여부를 관찰한 결과 강력한 항생 활성을 나타내는 것을 관찰하여 항균제, 항진균제 뿐 아니라 생물 농약, 식품 방부제, 화장품 및 의약품 보존제로 유용하게 이용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 항균 및 항진균용 신규 펩타이드인 니듈린(Nidulin) 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 펩타이드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 펩타이드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 펩타이드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물을 제공한다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 펩타이드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 생물 농약, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제를 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 펩타이드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드를 제공한다.

본 발명자들은 이온 교환 크로마토그래피와 RP(Reverse Phase)-HPLC를 실시하여 아스퍼질러스 니듈런스(Aspergillus nidulans) 배양액으로부터 단백질을 분리하였다. 상기 분리한 단백질은 도 2a 및 b에 나타난 바와 같이 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 17kDa의 분자량을 갖고 있는 펩타이드로 확인되었다. 본 발명자들은 상기 신규 펩타이드를 ‘니듈린(niduline)'이라 명명하였다.

또한, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 펩타이 드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학적 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 니듈린의 항진균 활성 측정을 위하여, 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(C. albicans), 트리코스포론 베이젤라이(T. begelii), 싸카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)에 대한 MTT assay를 실시하였다. 그 결과 본 발명의 신규 펩타이드인 니듈린은 시판되는 항생제인 암포테리신 B 보다는 최저성장억제농도(MIC: minimal inhibitory concentration)가 높지만 강력한 항진균 활성을 가진 멜리틴보다는 2-8배까지 낮은 것을 확인하여 강력한 항진균 활성을 나타냄을 알 수 있었다(표 1 참조). 상기 MTT assay 플레이트를 현미경으로 관찰하여 가시화한 결과 본 발명의 신규 펩타이드인 니듈린을 첨가한 실험군에서만 캔디다 알비칸스의 생육이 억제되어 거의 자라지 않음으로써 본 발명의 니듈린의 항진균 활성을 시각적으로 확인하였다(도 3 참조).

본 발명자들은 신규 펩타이드인 니듈린의 항균 활성 측정을 위하여, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 1621)를 대상으로 관찰한 결과, 도 4에서와 같이 본 발명의 신규 펩타이드인 니듈린을 첨가하지 않은 음성대조군 플레이트에서는 스타필로코커스 아우레우스가 왕성하게 자란 반면 본 발명의 니듈 린을 첨가한 실험군에서는 스타필로커스의 콜로니가 전혀 생기지 않는 것을 관찰함으로써 본 발명의 니듈린의 항균 활성을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 본 발명의 신규 펩타이드인 니듈린이 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여 니듈린의 적혈구 파괴능을 조사한 결과, 본 발명의 니듈린은 세포독성을 나타내지 않는 반면에 양성 대조군으로 사용한 벌독인 멜리틴은 세포 독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있었다(표 2 참조).

상기의 결과로부터, 본 발명의 신규 펩타이드인 니듈린을 유효성분으로 함유하는 약학조성물은 탁월한 항진균 및 항균 효과를 나타낼 뿐만 아니라 세포독성이 없기 때문에 인체에 안전한 항균제, 항진균제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

상기 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 펩타이드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드는 임상투여시에 비경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품제제의 형태로 사용될 수 있다.

즉, 본 발명의 신규 펩타이드 및 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드는 실제로 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.

또한, 본 발명의 신규 펩타이드 및 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드는 생리식염수 또는 유기용매와 같이 약제로 허용된 여러 전달체(carrier)와 혼합하여 사용될 수 있고, 안정성이나 흡수성을 증가시키기 위하여 글루코스, 수크로스 또는 덱스트란과 같은 카보하이드레이트, 아스코르브 산(ascorbic acid) 또는 글루타치온과 같은 항산화제(antioxidants), 킬레이팅 물질(chelating agents), 저분자 단백질 또는 다른 안정화제(stabilizers)들이 약제로 사용될 수 있다.

본 발명의 신규 펩타이드 및 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드의 유효 용량은 0.01 내지 100 ㎎/㎏이고, 바람직하기로는 0.1 내지 10 ㎎/㎏ 이며, 하루 1회 내지 3회 투여될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물에서 본 발명의 신규 펩타이드 및 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드의 총 유효량은 거환(bolus) 형태 혹은 상대적으로 짧은 기간 동안 확산(infusion) 등에 의해 단일 투여량(single dose)으로 환자에게 투여될 수 있으며, 다중 투여량(multiple dose)이 장기간 투여되는 분할 치료 방법 (fractionated treatment protocol)에 의해 투여될 수 있다. 상기 농도는 약의 투여 경로 및 치료 횟수 뿐만 아니라 환자의 나이 및 건강상태 등 다양한 요인들을 고려하여 환자의 유효 투여량이 결정되는 것이므로 이러한 점을 고려할 때, 이 분야의 통상적인 지식을 가진 자라면 본 발명의 신규 펩타이드 및 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드의 약학적 조성물로서의 특정한 용도에 따른 적절한 유효 투여량을 결정할 수 있을 것이다.

아울러, 본 발명은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 신규 펩타이드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 생물 농약, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제를 제공한다.

식품의 방부제, 화장품 보존제 및 의약품 보존제는 식품이나 의약품의 변질, 부패, 변색 및 화학변화를 방지하기 위해 사용되는 첨가물로서 살균제, 산화방지제가 이에 포함되며 세균, 곰팡이, 효모 등 미생물의 증식을 억제하여 식품 및 의약품에서 부패미생물의 발육저지 또는 살균작용을 하는 등의 기능성 항생제도 포함된다. 이러한 식품의 방부제 및 화장품, 의약품 보존제의 이상적인 조건으로는 독성이 없어야 하며, 미량으로도 효과가 있어야 한다. 농작물의 병충해를 박멸하기 위한 농약 역시 해로운 미생물의 증식을 억제하고 인체에 무해하여야 사람이 농약을 살포한 농작물을 안전하게 섭취할 수 있다. 본 발명의 신규 펩타이드인 니듈린 및 이와 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드는 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같이 강력한 항생 활성을 나타내고 독성이 없으므로 생물 농약, 식품의 방부제, 화장품 및 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 아스퍼질러스 니듈런스(Aspergillus nidulans)의 배지로부터 단백질 추출

본 발명자들은 이온 교환 크로마토그래피와 RP(Revers Phase)-HPLC를 실시하여 아스퍼질러스 니듈런스(Aspergillus nidulans) 배양액으로부터 단백질을 분리하였다.

우선 아스퍼질러스 니듈런스(Aspergillus nidulans)를 진탕 배양한 배양액을 여과지(Whatman사, No.2)에 통과시켜 여과한 후 이를 CM(carboxymethyl)-sepharose 컬럼이 장착된 이온 교환 크로마토그래피에 로딩(loading)하였다. 이온 교환 크로마토그래피를 실시하여 얻은 각각의 분획(fraction)을 다시 Shim-pack VP-ODS C18 컬럼(4.6 X 250 mm) particle; 12.0 ± 1.0 nm pore, Shimadzu사)이 장착된 RP(Reverse Phase)-HPLC(High Performance Liquid Chromatography) 에 로딩하였다. 0.1% 트리플로로아세트산(Trifluoroacetic Acid)이 포함된 아세토니트릴(Acetonitrile) 완충용액에서 아세토니트릴 농도를 5%에서 65%까지 분당 2%씩 30 분 동안 증가시켜(linear gradient) 컬럼에 결합된 단백질을 용출한 후, 최대 분획(peak fraction)을 회수하였다(도 1).

<실시예 2> 단백질 전기영동

본 발명자들은 슬랩 젤(slab gel)을 이용하여 Laemmli(Laemmli et al. 1972)의 방법에 따라 <실시예 1>에서 얻은 분획으로 SDS-PAGE(Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)를 실시하였다.

<실시예 1>에서 얻은 단백질 시료와 표준 단백질을 15% 아크릴아마이드 젤(acrylamide gel)에 로딩(loading)하여 전기영동을 실시한 후, 쿠마시 브릴리언트 블루(coomassie brilliant blue) R-250으로 젤을 염색하고, 탈색 완충용액(destaining buffer; MeOH: glacial acetic acid: distilled water = 30: 10: 60)으로 탈색하여 나타나는 단백질의 밴드를 확인하였다.

분자량 표준 단백질로는 분자량이 적은 단백질의 범주에 속하는 66 kDa의 우혈청 알부민(Bovine Serum Albumin), 45 kDa의 오발부민(Chicken Egg Ovalbumin), 36 kDa의 GAPDH(Rabbit Muscle Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase), 29 kDa의 탄산탈수효소(Bovine Erythrocytes Carbonic Anhydrase), 24 kDa의 트립시노겐(Bovine Pancreas Trypsinogen), 20 kDa의 트립신 억제제(Soybean Trypsin Inhibitor), 14.2 kDa의 락타알부민(Bovine Milk α-Lactalbumin, 6.5 kDa의 아프로티닌(Bovine Lung Aprotinin)을 이용하여 단백질의 분자량을 측정하였다(도 2a). 그 결과 아스퍼질러스 니듈런스(Aspergillus nidulans) 배양액에서 분리한 신규 단 백질은 분자량이 14.2 kDa과 20 kDa 사이인 펩타이드임을 확인하였다.

<실시예 3> 아미노산 서열 및 분자량 확인

<실시예 1>에서 분리한 펩타이드를 6N-HCl에 녹인 후 22시간 동안 110℃에서 가수분해하여 건조시켜 아미노산 분석기(amino acid analyzer)로 아미노산 서열을 확인하고 질량 스펙트라(mass spectra)로 분자량을 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 신규 펩타이드는 도 2b에 나타난 바와 같이 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열과 17kDa의 분자량을 갖고 있는 펩타이드로 확인되었다. 본 발명자들은 상기 펩타이드를 ‘니듈린(niduline)'이라 명명하였다.

<실시예 4> 항진균 활성 측정

<4-1> MTT assay 및 현미경 관찰

본 발명의 니듈린의 항진균 활성 측정을 위하여, 병원성 진균인 캔디다 알비칸스(C. albicans), 트리코스포론 베이젤라이(T. begelii), 싸카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)에 니듈린을 첨가한 후, MTT assay를 수행하였다.

96-웰 마이크로 적정 플레이트(96-well microtiter plate)에 캔디다 알비칸스(C. albicans), 트리코스포론 베이젤라이(T. begelii), 싸카로마이세스 세레비지에(S. cerevisiae)를 각각 포함한 YPD 배지를 희석하여 웰당 100 ㎕씩 분주하여 2 X 10³cell/well이 되도록 하였다. 여기에 본 발명의 니듈린, 기존에 강력한 항진 균 활성을 가지고 있는 것으로 알려진 멜리틴(Melittin) 펩타이드(애니젠), 항진균 항생제인 암포테리신 B(Amphotericin B)(Sigma사)을 여러 가지 농도로 각각 첨가하였다. 이를 37℃에서 하룻밤 방치한 후, ELISA(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)로 620nm에서 흡광도를 측정하고 농도별 흡광도 그래프를 작성한 후, 최소성장억제농도(MIC; minimal inhibitory concentration, 흡광도가 나타나지 않는 농도)를 결정하였다.

그 결과, <표 1>에 나타난 바와 같이 본 발명의 니듈린은 시판되는 항생제인 암포테리신 B 보다는 최저성장억제농도(MIC: minimal inhibitory concentration)가 높지만 강력한 항진균 활성을 가진 멜리틴보다는 2-8배까지 낮은 값을 가지므로 강력한 항진균 활성을 나타내는 것을 확인하였다.

Peptide	MIC (μM)
Peptide	*C. albicans*	*T. beigelii*	*S. cerevisiae*
Niduline	3.86	>3.86	>3.86
Melittin	6.25	1.56	25
Amphotericin B	0.48	0.976	0.976

<4-2> 현미경 관찰

<4-1>에서 캔디다 알비칸스(C. albicans)에 아무것도 첨가하지 않은 웰, 본 발명의 니듈린을 첨가한 웰 및 암포테리신 B를 첨가한 웰을 각각 음성대조군(negative control), 실험군 및 양성대조군(positive control)으로 설정하고 이를 현미경으로 관찰하여 가시화하였다.

그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 아무것도 첨가하지 않은 음성대조군에서는 캔디다 알비칸스가 왕성하게 자라났고 본 발명의 니듈린을 첨가한 실험군은 양성대조군과 유사하게 캔디다 알비칸스가 거의 자라지 않았다. 이로써 본 발명의 니듈린의 강력한 항진균 활성을 시각적으로 확인하였다.

<실시예 5> 항균활성 확인

본 발명자들은 생명공학연구소 유전자 은행(Korean Collection for Type Culture, KCTC)으로부터 박테리아인 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus, KCTC 1621)를 분양받아 LB에서 mid-log phase까지 배양하였다. 스타필로코커스 아우레우스를 배양한 배양액 100 ㎕를 LB 플레이트에 골고루 플레이팅(plating) 하고 음성대조군에는 상기 배양액 외에 아무것도 첨가하지 않았고 실험군에는 본 발명의 니듈린을 100 μg 첨가하였다. 이를 37℃에서 16시간 배양한 후 관찰한 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 본 발명의 니듈린을 첨가하지 않은 음성대조군 플레이트에서는 스타필로코커스 아우레우스가 왕성하게 자란 반면 본 발명의 니듈린을 첨가한 실험군에서는 스타필로커스의 콜로니가 하나도 생기지 않았다. 이로써 본 발명의 니듈린이 강력한 항균 활성을 나타냄을 확인하였다.

<실시예 6>니듈린의 세포 독성 측정

본 발명의 니듈린이 세포독성을 나타내는지를 확인하기 위하여, 본 발명자들은 니듈린의 적혈구 파괴능을 조사하였다.

사람의 적혈구를 8%의 농도가 되도록 인산염 완충용액(PBS, pH 7.0)으로 희석하고 여기에 12.5 μM/웰 부터 1/2의 농도로 본 발명의 니듈린을 연속적으로 희석하여 37℃에서 1시간 동안 반응시킨 후, 1,000 g로 원심분리하여 그 상등액 속에 포함된 헤모글로빈 양을, 414 nm 파장에서 흡광도를 측정하여 조사하였다. 세포 파괴 정도를 조사하기 위하여 1% 트리톤 X-100을 사람의 적혈구 세포에 첨가하여 그 상등액의 흡광도를 측정하였고, 1% 트리톤 X-100의 세포 파괴능을 100%로 하여 이를 각 항균 접합 펩타이드의 적혈구 파괴능과 비교하여 하기 수학식 1에 따라 계산하였다.

상기 식에서, 흡광도 A는 414 nm 파장에서 니듈린 용액의 흡광도, 흡광도 B는 414 nm 파장에서 PBS의 흡광도 그리고 흡광도 C는 414 nm 파장에서 1% 트리톤 X-100의 흡광도를 나타낸다.

상기 식에 의한 적혈구 파괴능의 결과를 하기 표 2에 나타내었다.

니듈린의 용혈활성 측정

μM	12.5	6.25	3.125	1.56	0.78	0.39	0.195	0.097
HP(2-20)	0	0	0	0	0	0	0	0
니듈린	0	0	0	0	0	0	0	0
멜리틴	100	100	95	93	31	0	0	0
마가이닌	100	100	92	90	29	0	0	0

그 결과, 본 발명의 니듈린은 세포독성을 거의 나타내지 않는 반면에, 양성 대조군으로 사용한 멜리틴 펩타이드와 마가이닌 펩타이드는 세포독성이 매우 높게 나타남을 알 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명의 신규 펩타이드인 니듈린은 유해 곰팡이들과 세균에 있어서 탁월한 항생효과를 나타내었으므로 이를 이용한 약학적 조성물은 항균제, 항진균제 뿐 아니라 농약, 식품방부제, 화장품 보존제 의약품 보존제로 유용하게 사용될 수 있다.

<110> chosun univ <120> Protein isolated from Aspergillus nidulans and phamaceutical composition containing the same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Aspergillus nidulans <400> 1 Ser Ser Ala Lys Ser Met Met Val Ala Asn Thr Gln Trp Thr Ile Thr 1 5 10 15 Ser Leu Lys Arg 20

Claims

서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 펩타이드인 니듈린(niduline) 또는 상기 펩타이드의 아미노산 서열과 95% 이상 상동성을 갖는 펩타이드.
제 1항에 있어서 상기 펩타이드는 아스퍼질러스 니듈란스(Aspergillus nidulans)로부터 유래한 것을 특징으로 하는 펩타이드.
제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항진균용 약학적 조성물.
제 3항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 캔디다 알비칸스(Candida albicans), 트리코스포론 베이젤리(Trichosporon begelii), 싸카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae)에 대하여 항진균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 항균용 약학적 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 약학적 조성물은 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus)에 대하여 항균 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
제 1항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 생물 농약, 식품 방부제, 화장품 보존제 또는 의약품 보존제.