KR20060032534A - 신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착활성 저해제를 포함하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물 및 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착활성을 저해하는 물질을 선별하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착 활성을 저해하여 염증성 질환을 치료할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 후보물질이 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착활성을 저해하는지 여부를 확인함으로써 용이하게 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물을 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
FEX-2 단백질, 염증성 질환, 림프구

Description

신규한 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물{Novel pharmaceutical composition for preventing or treating diseases or disorders associated with inflammation}
도 1은 인간 FEX-2 단백질의 각 도메인을 도시화한 모식도이다.
도 2는 인간 FEX-2 단클론 항체를 이용하여 인간 비장조직, L/FEX-2 세포 및 L/Mock 세포에서 FEX-2 단백질의 발현을 웨스턴 블롯 분석법으로 측정한 결과이다.
도 3은 인간 FEX-2 단클론 항체를 이용하여 L/Mock 세포와 L/FEX-2 세포의 표면에서 FEX-2 단백질의 발현을 FACS(Fluoresence Activated Cell Sorter)로 분석한 결과이다.
도 4는 L/FEX-2 세포 표면에서의 FEX-2 단백질의 발현을 표면 바이오틴화 분석법으로 측정한 결과이다(-: 첨가하지 않음, +: 첨가함).
도 5는 인간 비장조직에서 인간 FEX-2 다클론 항체를 이용하여 면역조직염색을 수행한 결과이다(a: 대조군, b: 실험군).
도 6a는 L/Mock 세포와 L/FEX-2 세포에서 림프구의 부착 정도를 현미경으로 관찰한 사진이다(a: L/Mock 세포, b: L/FEX-2 세포, 화살표: 림프구).
도 6b는 L/Mock 세포와 L/FEX-2 세포에서 림프구의 부착 정도를 나타낸 그래 프이다.
도 7은 인간 FEX-2 단클론 항체가 L/FEX-2 세포에 대한 림프구의 부착활성을 저해하는 정도를 나타낸 그래프이다.
도 8은 여러 종류의 이가 양이온이 L/FEX-2 세포에 대한 림프구의 부착 활성에 미치는 영향을 나타낸 그래프이다.
도 9는 여러 종류의 인테그린에 대한 기능 저해 항체들이 L/FEX-2 세포에 대한 림프구의 부착 활성을 저해하는 정도를 나타낸 그래프이다.
β1: 항-β1 항체 처리, αLβ2: 항-αL 항체 처리
αMβ2: 항-αM 항체 처리, αXβ2: 항-αX 항체 처리
도 10a는 인간 FEX-2 단백질을 네 개의 소단위체로 구분한 모식도를 나타낸 것이다.
도 10b는 인간 FEX-2 단백질의 네 개의 소단위체의 FEX-2에 대한 림프구의 부착 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
Nus-U1: FEX-2 단백질의 첫 번째 소단위가 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
Nus-U2: FEX-2 단백질의 두 번째 소단위가 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
Nus-U3: FEX-2 단백질의 세 번째 소단위가 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
Nus-U4: FEX-2 단백질의 네 번째 소단위가 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
도 11a는 인간 FEX-2 단백질의 소단위체 중 세 번째 부분(Nus-U3)을 다시 세 부분으로 구분한 모식도이다.
도 11b는 인간 FEX-2 단백질의 Nus-U3를 세 부분으로 나누어 제조한 폴리펩 타이드의 FEX-2에 대한 림프구의 부착 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
Nus-U3: FEX-2 단백질의 세 번째 소단위가 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
Nus-EGF3: FEX-2 단백질의 세 번째 EGF-유사 반복 도메인이 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
Nus-Fas5: FEX-2 단백질의 다섯 번째 fas-1 도메인이 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
Nus-Fas6: FEX-2 단백질의 여섯 번째 fas-1 도메인이 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
도 12는 인간 FEX-2 단백질의 Nus-U3를 세 부분으로 나누어 제조한 폴리펩타이드의 처리 농도에 따른 FEX-2에 대한 림프구의 부착 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
Nus-Unit: FEX-2 단백질의 세 번째 소단위가 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
Nus-EGF: FEX-2 단백질의 세번째 EGF-유사 반복 도메인이 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
Nus-Fas: FEX-2 단백질의 5번째 fas-1 도메인이 Nus 단백질 뒤에 붙어 있는 것
도 13은 FEX-2 단백질 내의 7개의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 의한 FEX-2에 대한 림프구의 부착 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
도 14는 결핵균 단백질인 mpt70과 mpt83내의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 의한 FEX-2에 대한 림프구의 부착 저해 정도를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 신규한 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명은 FEX-2 단백질과 림프구의 부착 저해제를 포함하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 및 FEX-2 단백질과 림프구의 부착을 저해하는 물질을 선별하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 치료 또는 예방용 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
염증은 백혈구가 병원체의 침입으로부터 조직을 보호하고 조직손상에 의해 발생하는 조직 파편을 제거하기 위한 일련의 반응을 말한다. 상기 백혈구는 림프구, 단구 및 과립구(호중구, 호산구 및 호염구)로 분류된다.
한편, 염증반응(inflammation reaction)이 일어나기 위한 중요한 과정 중 하나는 순환계로부터 염증 진행 부위 또는 상처 부위로 백혈구가 이동되는 것이다. 상기 백혈구의 이동은 모세관후세정맥(postcapillary venule)에서 백혈구가 내피세포와 상호작용을 하는 다단계의 과정을 거쳐 일어난다. 즉, 백혈구는 일련의 포획(sequential capture), 롤링(rolling) 및 부착(firm adhesion) 단계에 이어 인접한 내피세포사이를 통과하는 과정(transmigration)을 거쳐서 혈관 외의 부위로 이동하게 된다(Muller, W. A. et al., Lab. Invest. 82:521-533, 2002). 상기와 같은 과 정을 거쳐 백혈구는 내피세포에 부착한 다음 세포 표면을 이동하여 세포내 접합부(intracellular junction)를 통해 염증 진행 부위 또는 상처 부위로 이동할 수 있게 된다(Harlan J. M., Blood, 65:513-525, 1985).
한편, 상기와 같은 염증 반응이 부적절하게 조절되는 경우에는 많은 종류의 염증성 질환이 유발된다. 주요 염증성 질환으로는 감염성 비염, 알레르기성 비염, 만성 비염, 급성 부비동염 및 만성 부비동염 등과 같은 비염 및 부비동염; 급성화농성 중이염 및 만성화농성 중이염 등과 같은 중이염; 세균성 폐렴, 기관지 폐렴, 대엽성 폐렴, 레지오렐라 폐렴 및 바이러스성 폐렴 등과 같은 폐렴; 급성 또는 만성 위염;, 감염성 소장결장염, 크론씨 병(Crohn's disease), 특발성 궤양성 대장염, 위막성 대장염 등과 같은 장염; 화농성 관절염, 결핵성 관절염, 퇴행성 관절염 및 류마티스 관절염 등과 같은 관절염; 및 당뇨성 안질환 등이 있다.
세포부착분자(cell adhesion molecule, CAM)는 염증반응에서 백혈구의 혈관내피세포 부착을 매개한다고 알려져 있다. 한편, 상기 세포부착분자는 백혈구의 혈관 내피세포 부착을 매개하는 작용 외에도 특정 조직의 구조를 유지하거나 기능하도록 하는데 있어서 필수적이며 인체의 항상성(homeostasis)을 유지하는데 중요한 역할을 한다(Edelman, G.M., Annu. Rev Cell Bio., 2:81-116, 1986; Gumbiner, B.M., Cell, 84:345-357, 1996).
지금까지 알려진 세포부착분자로는 캐드해린(cadherin), 인테그린(integrin), 셀렉틴(selectin) 및 면역글로불린 세포부착분자(immunoglobulin superfamily cell adhesion molecule, IgCAM) 등이 있다(Humphries, M.J. et al., Trends Cell Biol., 8:78-83, 1998). 이중에서 셀렉틴은 혈소판 또는 내피세포에 대한 백혈구의 부착을 개시하는 칼슘 이온 의존성 세포막 결합 렉틴 패밀리로 알려져 있으며(Lasky, Science 258: 964-969, 19992), 백혈구에서 발현되는 L-셀렉틴, 시토킨 활성 내피세포에서 발현되는 E-셀렉틴 및 트롬빈 활성 혈소판 및 내피세포에서 발현되는 P-셀렉틴의 3종류로 구분된다. 최근에는 상기 셀렉틴과 같이 백혈구의 내피세포 부착을 매개하여 염증을 유발하는 세포부착분자의 활성을 저해하는 물질을 개발하여 항염증제로 사용하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다.
대한민국특허 공개공보 제2004-0039440호에는 셀렉틴 매개 염증 억제제가 개시되어 있으며, 대한민국특허 제371784호에는 염증 질환의 치료를 위한 L-셀렉틴과 특이적으로 반응하는 인간화된 항체가 개시되어 있다.
한편, fas-1 도메인은 포유류, 곤충, 섬게, 식물, 효모 및 세균을 포함하는 여러 종의 분비 단백질 또는 막 단백질에서 발견되는 매우 보존적인 서열이다(Kawamoto T. et al., Biochim. Biophys, Acta, 288-292, 1998). fas-1 도메인은 약 110 내지 140개의 아미노산으로 구성되며, 특히 상동성이 높은 약 10개의 아미노산으로 구성된 매우 보존적인 두 개의 부분(H1 및 H2)을 포함하고 있다(Kawamoto, T. et al., Biochim. Biophys. Acta. , 288292, 1998). fas-1 도메인을 포함하는 단백질에는 βig-h3, 페리오스틴(periostin), 파스시클린 I(fasciclin I), 섬게 HLC-2(sea urchin HLC-2), 알갈-CAM(algal-CAM) 및 마이코박테리움 MPB70 (mycobacterium MPB70) 등이 있다(Huber, O. et al., EMBO J., 4212-4222, 1994; Matsumoto, S. et al., J. Immunol., 281-287, 1995; Takeshita, S. et al., Biochem. J., 271-278, 1993; Wang, W. C. et al., J. Biol. Chem., 1448-1455, 1993). 상기 단백질 중 βig-h3, 페리오스틴(periostin), 파스시클린 I(fasciclin I)은 4개의 fas-1 도메인을 가지며, HLC-2는 2개, 그리고 MPB70은 오직 1개의 fas-1 도메인을 가지고 있다. fas-1 도메인을 포함하는 단백질들의 생물학적 기능이 정확하게 규명된 것은 아니지만, 몇몇 단백질들이 세포부착분자(cell adhesion molecule)로서 작용함이 보고되었다. 그 중에서 βig-h3은 섬유아세포와 상피세포에, 페리오스틴은 골아세포에, 그리고 파스시클린 I은 신경세포의 부착을 매개하는 것으로 보고 된 바 있다(LeBaron, R. G. et al., J. Invest. Dermatol., 844-849, 1995; Horinchi, K. et al., J. Bone Miner. Res., 1239-1249, 1999; Wang, W. C. et al., J. Biol. Chem., 1448-1455, 1993). 또한 알갈-CAM은 조류 볼복스(volvox)의 배(embryos)에 존재하는 세포부착분자임이 규명된 바 있다(Huber, O. et al., EMBO J., 4212-4222, 1994).
상술한 바와 같이, fas-1 도메인을 포함하는 몇몇 단백질들이 세포부착분자로서 작용한다는 사실이 규명되기는 하였으나, fas-1 도메인을 포함하는 모든 종류의 단백질이 세포부착 활성을 나타내는 것은 아니다.
이에 본 발명자들은 새로운 염증관련 질환의 치료제를 연구하던 중, 내피세포에 존재하는 FEX-2 단백질이 림프구의 부착을 매개하는 새로운 세포부착분자라는 사실을 발견하고 이를 기초로 하여 염증성 질환의 예방 또는 치료에 사용될 수 있는 상기 FEX-2 단백질과 림프구의 부착 저해제를 스크리닝함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 FEX-2 단백질과 림프구의 부착 저해제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 후보물질이 FEX-2 단백질과 림프구의 부착을 저해하는지 여부를 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 FEX-2 단백질과 림프구의 부착 저해제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 후보물질이 FEX-2 단백질과 림프구의 부착을 저해하는지 여부를 측정하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 염증성 질환 치료용 약학적 조성물은 FEX-2 단백질과 림프구의 부착 저해제를 포함하는 것을 특징으로 한다.
상기에서 FEX-2 단백질은 포유동물로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간, 랫트 및 마우스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다. 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간 FEX-2 단백질 또는 서열번호 15로 표시되는 마우스 FEX-2 단백질일 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 인간 FEX-2 단백질일 수 있다.
본 발명자들은 fas-1 도메인을 포함하는 단백질들이 세포부착분자에서 발견된다는 사실을 기초로 하여 fas-1 도메인을 포함하는 부분적인 인간 cDNA를 공지된 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 검색하고 이 중에서 아직까지 그 특성이 규명되지 않은 세 개의 cDNA를 선발하였다. 상기 cDNA를 기초로 하여 프라이머를 디자인한 후 인간 비장으로부터 추출한 총 RNA를 주형으로 하고 상기에서 디자인된 프라이머로 RT-PCR 및 5' RACE PCR을 수행함으로써 fas-1 도메인을 포함하는 인간 유전자를 새롭게 클로닝하였다(실시예 1 참조).
상기 본 발명자들이 합성한 유전자는 7개의 fas-1 도메인, 23개의 EGF-유사 도메인, 1개의 X-링크 도메인 및 1개의 막횡단 도메인을 가지고 있었다(도 1 참조). 상기와 같은 도메인 구조를 근거로 하여 상기 유전자를 FEX-2로 명명하고 상기 유전자 서열을 진뱅크에 등록하였다(AY311388). 인간 FEX-2의 전체 염기서열은 서열번호 1에 나타낸 바와 같다.
본 발명자들은 본 발명에서 제조한 재조합 FEX-2 단백질이 세포부착분자로서 작용하는지를 확인하기 위하여 먼저, FEX-2가 세포 표면에서 발현되는지 여부를 조사하였다.
이를 위해 본 발명자들은 인간 FEX-2 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제조하고 마우스 섬유아세포인 L세포에 형질전환한 다음 이를 L/FEX-2라 명명하였다(실시예 1 참조). 그 다음 인간 FEX-2에 대한 다클론 항체 및 단클론 항체를 각각 제조하고, 상기 항체가 인간 비장 조직 및 L/FEX-2 세포에서 FEX-2의 발현을 검출할 수 있는지 여부를 면역블롯법으로 조사하였다(실시예 2 참조). 그 결과, 본 발명의 FEX-2 항체가 인간 비장 조직 및 L/FEX-2 세포에서 발현되는 FEX-2 단백질을 특이적으로 검출할 수 있음을 확인하였다(도 2 참조).
이에 본 발명자들은 상기 FEX-2에 특이적인 항체를 이용하여 L/FEX-2 세포의 표면에 FEX-2가 발현되는지 여부를 FACS 분석법과 바이오틴화법으로 조사하였다(실시예 3 참조). 그 결과, L/FEX-2 세포 표면에 FEX-2가 발현됨을 확인할 수 있었다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명자들은 FEX-2가 어느 조직에서 발현되는지 여부를 조사하기 위하여, 여러 인간 조직에서 FEX-2의 발현 여부를 인간 FEX-2 다클론 항체를 이용한 면역조직화학염색법으로 조사하였다(실시예 4 참조). 그 결과, FEX-2가 인간비장의 동모양(sinusoidal) 혈관 내피세포에서 발현됨을 확인하였다(도 5 참조). 또한, 간장과 림프절의 동모양(sinusoidal) 혈관 내피세포에서도 FEX-2가 발현됨을 확인하였다(결과 미도시). 이로부터, FEX-2가 혈관 내피세포에서 발현되어 혈액 내에 존재하는 세포와 상호 작용할 수 있을 것으로 추정하였다.
이에 본 발명자들은 FEX-2 단백질이 발현되도록 형질전환된 L/FEX-2 세포에 림프구가 부착하는 활성이 있는지 여부를 조사하였다(실시예 5 참조). 그 결과, 대조군 세포에 비해 L/FEX-2 세포의 표면에 많은 수의 림프구가 부착함을 확인할 수 있었다(도 6a 및 도 6b 참조).
또한, 본 발명자들은 L/FEX-2 세포에 림프구가 부착하는 것이 FEX-2 단백질에 의한 것인지를 확인하기 위하여 항-FEX-2 항체의 존재 하에 상기 L/FEX-2 세포에 림프구가 부착하는지 여부를 조사하였다(실시예 6 참조). 그 결과, L/FEX-2 세포에 림프구의 부착이 항-FEX-2 항체에 의해 특이적으로 저해됨을 확인할 수 있었다(도 7 참조).
따라서, 본 발명자들은 상기 실험 결과로부터 FEX-2가 림프구의 부착을 매개하는 세포부착분자로서 기능한다는 새로운 사실을 확인할 수 있었다. 나아가, 본 발명자들은 세포부착분자로서의 FEX-2의 특성을 보다 구체적으로 조사하기 위하여 상기 FEX-2에 대한 세포 표면 수용체를 동정하였다.
이를 위해 본 발명의 일 실시예에서는 FEX-2에 대한 림프구의 부착에 있어서 망간, 마그네슘 및 칼슘 이온이 미치는 영향을 조사하였다(실시예 7 참조). 그 결과, 림프구의 FEX-2에 대한 세포 부착은 망간 이온에 의해 가장 높게 촉진됨을 확인할 수 있었고 그 다음으로는 마그네슘 이온에 의해 촉진됨을 확인할 수 있었으며, 칼슘 이온에 의해서는 촉진되지 않았다(도 8 참조). 이로부터 FEX-2에 대한 세포 표면 수용체는 리간드와의 작용에 있어서 상기의 2가 양이온을 필요로 함을 알 수 있었으며, 이는 세포부착활성에 있어서 리간드에 결합하는 인테그린 수용체의 특징과 일치했다.
이에 본 발명자들은 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 매개하는 인테그린 수용체를 동정하였다(실시예 7 참조). 그 결과, αLβ2 인테그린 및 αMβ2 인테그린이 FEX-2와 상호작용하여 림프구의 부착에 관여함을 확인할 수 있었다(도 9 참조).
상기 실험 결과로부터, 본 발명자들은 FEX-2가 혈관 내피세포에 존재하며 림프구의 αLβ2 인테그린 또는 αMβ2 인테그린의 상호작용을 통해 상기 FEX-2에 림프구가 부착하는 활성이 있음을 처음으로 규명할 수 있었다.
나아가 본 발명자들은 상기 FEX-2의 어느 부분이 림프구의 부착과 직접적인 관련이 있는지를 보다 구체적으로 조사하고, 림프구의 부착과 관련된 FEX-2의 일부분을 포함하는 폴리펩타이드가 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 억제하는 저해제로서 사용될 수 있는지를 조사하였다.
이를 위해, 본 발명의 일 실시예에서 상기 FEX-2 단백질을 네 개의 소단위체로 나누어 각각의 재조합 단백질을 제조하고(도 10a 참조), 상기 소단위체와 림프구를 전배양한 후 FEX-2를 발현하는 L/FEX-2 세포에 림프구를 첨가하여 배양하고 FEX-2에 대한 림프구의 부착 정도를 조사하였다(실시예 <8-1> 참조). 그 결과, 상기 소단위체와 림프구를 전배양한 후 L/FEX-2 세포에 림프구를 첨가한 경우에 모두 FEX-2에 대한 림프구의 부착이 크게 저해됨을 확인할 수 있었다(도 10b 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 FEX-2 단백질의 소단위체중 세 번째에 속하는 Nus-U3를 다시 세부분으로 구분하여 FEX-2의 세 번째 EGF-유사 반복 도메인을 포함하는 폴리펩타이드(Nus-EGF3)와 FEX-2의 각각 다섯 번째 및 여섯 번째 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드(Nus-Fas5, Nus-Fas6)를 각각 제조하고(도 11a 참조), 상기 폴리펩타이드와 림프구를 전배양한 후 L/FEX-2 세포에 림프구를 첨가하여 FEX-2에 대한 림프구의 부착 정도를 조사하였다(실시예 8 참조). 그 결과, fas-1 도메인을 포함하는 Nus-Fas5 및 Nus-Fas6 폴리펩타이드와 림프구를 전배양한 경우에는 L/FEX-2 세포에 대한 림프구의 부착이 억제되는 것으로 나타났으나 EGF-유사 반복 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 경우에는 림프구의 부착을 저해하는 활성을 나타내지 않았다(도 11b 참조).
또한, 본 발명의 일 실시예에서는 상기 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 농도별로 처리하여 림프구를 전배양한 후 L/FEX-2 세포에 림프구를 첨가하여 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착정도를 조사한 결과(실시예 9 참조), 상기 폴리펩타이드의 처리 농도가 증가할수록 FEX-2에 대한 림프구의 부착 저해 정도가 증가하는 것으로 나타났다(도 12 참조).
이에 본 발명자들은 상기 실험 결과로부터 림프구를 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드와 전배양한 경우에 상기 fas-1 도메인 부분이 림프구에 부착하여 L/FEX-2 세포에 의해 발현되는 FEX-2 단백질과 경쟁적으로 작용함을 알 수 있었다. 따라서, FEX-2 단백질의 fas-1 도메인 부분에 림프구가 부착되며 상기 fas-1 도메 인을 포함하는 폴리펩타이드는 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착을 저해할 수 있는 저해제로서 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
나아가, 본 발명자들은 인간 FEX-2 단백질 내에 포함된 7개의 fas-도메인을 포함하는 폴리펩타이드 및 상기 인간 FEX-2 단백질 이외에 다른 종류의 단백질인 결핵균 단백질 mpt83과 mpt70내의 fas-도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착을 저해할 수 있는지를 조사하였다(실시예 10 참조). 그 결과, FEX-2 단백질에 포함된 7개의 fas-도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 모두 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 저해하는 활성을 가지고 있음을 확인할 수 있었다(도 13). 또한, 결핵균의 단백질인 mpt83과 mpt70 내의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 역시 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 저해하는 활성을 가지며, 상기 림프구 부착 저해 활성은 폴리펩타이드의 처리 농도에 의존적인 것으로 나타났다(도 14 참조).
상술한 바와 같이 본 발명에서는 FEX-2가 혈관 내피세포에 존재하며 림프구의 αLβ2 인테그린 또는 αMβ2 인테그린의 상호작용을 통해 상기 FEX-2에 림프구가 부착하는 활성이 있음을 최초로 규명하였다. 나아가, 본 발명에서는 상기 FEX-2에 대한 림프구의 부착활성이 항-FEX-2 항체 또는 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드에 의해 저해됨을 알 수 있었다.
한편, 염증반응은 림프구가 혈관 내피세포에 부착한 후 염증 부위로 이동함 으로써 일어나며, 혈관 내피세포에 존재하는 세포부착분자에 대한 림프구의 부착활성을 저해하게 되면 림프구의 염증부위로의 이동을 저해하여 염증반응을 저해할 수 있게 된다(Ulbrich, H. et al., Trends Pharmacol. Sci. 24:640-647, 2003; Harlan, J. M. et al., Crit. Care Med. 30(5 Suppl):S214-219, 2002; van Assche, G. et al., Inflamm. Bowel Dis. 8:291-300, 2002). 그러므로 혈관 내피세포에 존재하는 세포부착분자인 FEX-2에 대한 림프구 부착활성의 저해는 염증부위로의 림프구 이동을 저해하여 염증반응을 억제할 수 있게 된다.
따라서, 본 발명의 염증질환 치료용 약학적 조성물은 유효성분으로서 FEX-2 단백질과 림프구의 부착 저해제를 포함할 수 있다. 본 발명에서 FEX-2 단백질과 림프구의 부착 저해제는 FEX-2 단백질과 림프구의 부착을 저해할 수 있는 활성이 있거나 또는 상기 FEX-2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 활성이 있는 것을 말한다.
FEX-2 단백질과 림프구의 부착을 저해하는 활성을 가진 것으로는 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 펩타이드, 폴리펩타이드, 단백질, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제일 수 있다. 바람직하게는, fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 항-FEX-2 항체일 수 있다.
본 발명에서 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 포유동물로부터 유래된 것일 수 있으며, 바람직하게는 인간, 랫트 및 마우스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 어느 하나로부터 유래된 것일 수 있다. 본 발명의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드는 종래 fas-1 도메인을 포함하고 있는 것으로 알려진 모든 종류의 단백질로부터 유래된 fas-1 도메인을 모두 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명의 fas-1 도메인은 당업계에 공지된 단백질 서열 검색 데이터베이스, 예컨대 NCBI Entrez(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/), EMBL-EBI(http://www.ebi.ac.uk/) 또는 SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)를 통해 검색되는 fas-1 도메인을 모두 사용할 수 있다.
본 발명에서는 바람직하게 FEX-2, mpt70, mpt83, βig-h3, 페리오스틴 및 FEX-1으로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질로부터 유래된 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 사용될 수 있다. 보다 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 기재되는 인간 FEX-2의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 13 및 서열번호 14로 표시되는 결핵균 단백질 mpt70 및 mpt83으로부터 유래된 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 15 내지 서열번호 21로 기재되는 마우스 FEX-2의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 및 서열번호 22 내지 서열번호 25로 기재되는 랫트 FEX-2의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 26 내지 서열번호 29로 기재되는 인간 βig-h3의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 30 내지 서열번호 33으로 기재되는 마우스 βig-h3의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 34 또는 서열번호 35로 기재되는 랫트 βig-h3의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 36 내지 서열번호 39로 기재되는 인간 페리오스틴의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 40 내지 서열번호 43으로 기재되는 마우스 페리오스틴의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 44 내지 서열번호 47로 기재되는 랫트 페리오스틴의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 48 내지 서열번호 54로 기재되는 인간 FEX-1의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 55 내지 서열번호 60으로 기재되는 마우스 FEX-1의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드, 서열번호 61 내지 서열번호 66으로 기재되는 랫트 FEX-1의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 가장 바람직하게는 서열번호 1 내지 서열번호 12로 기재되는 인간 FEX-2의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 서열번호 13 및 서열번호 14로 기재되는 mpt83 및 mpt70의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드를 사용할 수 있다. 아울러, 본 발명에는 fas-1 도메인 함유 단백질로부터 유래된 fas-1 도메인 하나 또는 2개 이상의 조합을 사용할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드의 범위로는 fas-1 도메인의 기능적 동등물 및 이들의 염이 포함된다. 상기에서 '기능적 동등물'이란 본 발명에 따른 fas-1 도메인과 실질적으로 동등한 생리 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 말한다. 즉, 본 발명의 폴리펩타이드와 실질적으로 동등한 생리활성을 나타내는 한 아미노산 서열뿐 아니라 구조학적으로 동일 또는 유사한 폴리펩타이드도 본 발명의 범위에 포함된다. 상기에서 '실질적으로 동등한 생리 활성'이란 림프구가 세포부착분자인 FEX-2에 부착하는 것을 저해하는 활성을 말한다. 보다 구체적으로 림프구의 인테그린 αLβ2 또는 αMβ2와 상호작용하여 상기 림프구가 FEX-2에 부착하는 것을 저해하는 활성을 말한다.
또한, 본 발명의 기능적 동등물의 범위에는 본 발명에 따른 폴리펩타이드의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩타이드의 화학 구조가 변형된 폴리펩타이드 유도체가 포함된다. 예를 들어, 폴리펩타이드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위해 구조가 변경된 폴리펩타이드가 포함될 수 있다.
본 발명의 폴리펩타이드는 당업계에 공지된 화학적 합성(Creightion, Proteins; Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman and Co., NY, 1983)에 의해 용이하게 제조될 수 있다. 대표적인 방법으로는 이에 한정되는 것은 아니지만, 액체 또는 고체상 합성법, 단편 응축법, F-MOC 또는 T-BOC 화학법 등이 있다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, 1997; A Practical Approach, Athert on & Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, 1989).
또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 유전공학적 방법에 의해 제작될 수 있다. 즉, 통상적인 방법에 따라 상기 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 서열을 제조한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 제조할 수 있다. 다른 방법으로 당업계에 공지된 표준 방법에 의해, 예컨대, 자동 DNA 합성기(Biosearch 또는 Applied Biosystems 사에서 판매하는 것)를 사용하여 DNA 서열을 합성할 수도 있다. 제조된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)(예: 프로모터, 인핸서 등)을 포함하는 벡터에 삽입 시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주세포를 형질전환시킨다. 생성된 형질전환체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건 하에서 배양하여, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 의해 코딩된 실질적으로 순수한 폴리펩타이드를 회수한다. 상기 회수는 당업계에 공지된 방법(예컨대, 크로마토그래피)을 이용하여 수행할 수 있다. 상기에서 '실질적으로 순수한 폴리펩타이드'라 함은 본 발명에 따른 폴리펩타이드가 숙주세포로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다. 본 발명의 폴리펩타이드 합성을 위한 유전공학적 방법은 다음의 문헌을 참고할 수 있다: Maniatis et al., Molecular Cloning; A laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982; Sambrook et al., supra; Gene Expression Technology, Method in Enzymology, Genetics and Molecular Biology, Method in Enzymology, Guthrie & Fink (eds.), Academic Press, San Diego, Calif, 1991; 및 Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:12073-12080, 1990.
본 발명에서 항-FEX-2 항체는 다클론 항체 또는 단클론 항체일 수 있다. 본 발명의 항체는 FEX-2 단백질을 항원으로 하여 면역학 분야에서 널리 알려져 있는 통상의 방법으로 제조할 수 있다.
다클론 항체는 말, 소, 염소, 양, 개, 닭, 칠면조, 토끼, 마우스 또는 랫트와 같은 여러 온혈 동물로부터 당해 분야의 통상적인 기술 중의 하나를 사용할 수 있다. 즉, 항원을 복막내, 근육내, 안내 또는 피하 주사를 통해 동물을 면역시킨 다. 상기 항원에 대한 면역성은 보조제, 예를 들어 프로운트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 사용하여 증가시킬 수 있다. 부스터(booster) 면역처리에 따른 다음, 혈청의 소형 샘플을 수집하고 목적하는 항원에 대한 반응성을 시험한다. 동물의 역가가 일단 항원에 대한 이의 반응성의 관점으로 정체 상태에 도달하면, 다량의 다클론 면역혈청을 1주 마다의 출혈 또는 동물을 방혈시킴으로써 수득할 수 있다.
단클론 항체도 공지된 기술을 사용하여 생성시킬 수 있다(Kennettm McKearn, and Bechtol(eds.), Monoclonal Antibodies, Hybridomas; A New Dimension in Biological Analyses, Plenum Press, 1980). 단클론 항체는 FEX-2 단백질을 면역원으로 하여 동물을 면역화시키고, 면역화된 동물의 비장세포를 골수종 세포와 융합하여 하이브리도마를 생성하고, FEX-2 단백질을 선택적으로 인식하는 하이브리도마를 선별하며, 선별한 하이브리도마를 배양하고, 하이브리도마의 배양액으로부터 항체를 분리함으로써 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 단클론 항체는 FEX-2 단백질을 선택적으로 인식하는 항-FEX-2 항체를 생산하는 상기의 하이브리도마를 동물에 주입하고, 주입 후 일정기간이 지난 다음 회수한 동물의 복수로부터 분리함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서 제조한 인간 FEX-2 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 5G3는 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학원 유전자원센터 유전자은행(KCTC)에 2004년 5월 21일자로 기탁번호 KCTC-10639BP로 기탁하였다.
또한, 상기 FEX-2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 억제할 수 있는 활성을 가진 물질로는 상기 유전자의 전사를 억제하거나 단백질로의 번역을 억제할 수 있는 물질을 말한다. 상기에서 유전자 발현 억제는 유전자 발현을 완전히 정지시키는 것 뿐 만 아니라 발현이 감소되도록 하는 것도 포함된다.
상술한 바와 같은 유전자의 발현을 억제하는 활성을 가진 물질로는 특정의 내재성 유전자의 발현을 억제할 수 있는 안티센스 분자가 가장 대표적이다. 안티센스 분자가 표적 유전자의 발현을 억제하는 작용으로는 삼중쇄 형성에 의한 전사개시 저해, RNA 폴리머라제에 의해 국부적인 개상 루프 구조가 만들어진 부위에서 하이브리드 형성에 의한 전사 억제, 합성이 진행되고 있는 RNA에서 하이브리드 형성에 의한 전사 저해, 인트론과 엑손과의 접합접에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, 스플라이소좀 형성 부위에서 하이브리드 형성에 의한 스플라이싱 억제, mRNA와의 하이브리드 형성에 의한 핵으로부터 세포질로의 이행 억제, 번역 개시인자 결합 부위에서 하이브리드 형성에 의한 번역개시 억제 등이 있다. 이들은 전사, 스플라이싱 또는 번역 과정을 저해하여 표적 유전자의 발현을 억제한다.
본 발명에 사용되는 안티센스 분자는 상기의 어느 작용으로든지 표적 유전자의 발현을 억제해도 좋다. 대표적인 안티센스 분자로는 3중제, 리보자임(ribozyme), RNAi, 또는 안티센스 핵산 등이 포함된다. 3중제는 이중 나선 DNA 주변을 감아 3 본쇄 나선을 형성하도록 함으로써 전사 개시가 억제되도록 한다(Maher et al., Antisense Res. and Dev., 1(3):227, 1991; Helene, C., Anticancer Drug Design, 6(6):569, 1991).
리보자임은 1 본쇄 RNA를 특이적으로 절단하는 능력을 보유한 RNA 효소이다. 리보자임은 표적 RNA 분자 내 특정 뉴클레오티드 서열을 인식하여 부위특이적으로 절단시킴으로써 표적 유전자의 단백질 발현을 억제한다(Cech, J. Amer. Med. Assn., 260:3030, 1998; Sarver et al., Science 247:1222-1225, 1990).
RNAi(RNA interference)는 염기서열 특이적으로 작용하는 헤어핀 형태의 소분자의 RNA를 사용하여 전사 수준 혹은 전사 후 수준에서 유전자 발현을 억제시키는 방법이다(Mette et al., EMBO J., 19: 5194-5201, 2000). 상기 RNAi 방법에 사용되는 소분자 RNA는 표적 유전자와 상동성을 가지는 이중가닥 RNA 분자이다.
상기에서 RNA 분자를 제조하는 방법으로는 공지된 화학적 합성 방법 및 효소적 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, RNA 분자의 화학적 합성은 문헌에 개시되어 있는 방법을 사용할 수 있으며(Verma and Eckstein, Annu. Rev. Biochem. 67, 99-134, 1999), RNA 분자의 효소적 합성은 T7, T3 및 SP6 RNA 폴리머라제와 같은 파아지 RNA 폴리머라제를 이용하는 방법이 문헌에 개시되어 있다(Milligan and Uhlenbeck, Methods Enzymol. 180:51-62, 1989).
안티센스 핵산은 표적 mRNA 분자와 적어도 일부분이 상보적인 DNA 또는 RNA 분자를 말한다(Weintraub, Scientific American, 262:40, 1990). 세포 내에서, 안티센스 핵산은 이에 상응하는 mRNA와 혼성화되어 2본쇄 분자를 형성함으로써 표적 유전자의 mRNA 해독을 저해하여 단백질 발현을 억제한다(Marcus-Sakura, Anal. Biochem., 172:289, 1988). 상기 안티센스 핵산은 특히 본 발명의 FEX-2의 발현을 억제하는 억제제로 유용하게 사용될 수 있다. 상기 안티센스 핵산은 바람직하게는 올리고뉴클레오타이드 형태로서 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법에 의해 제조할 수 있다. 상기 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 화학 합성법, 예를 들어 문헌(Tetrahedron Lett., 1991, 32, 30005-30008)에 기재된 바와 같이 아세토니트릴 중에서 테트라에틸티우람 디술파이드로 황화시키는 포스포아미다이트 화학과 같은 방법에 의해 매우 용이하게 제조할 수 있다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투 여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다.
상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 화합물 또는 추출물의 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 폴리펩타이드를 포함하는 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 성인을 기준으로 할 때 통상적으로 1회 투여시 10 ㎍ 내지 10 ㎎의 유효용량으로 하루에 수 차례 반복 투여될 수 있다.
상기와 같이 제조된 본 발명의 약학적 조성물은 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다. 상기에서 '염증성 질환'으로는 체내의 염증 반응 자체 또는 상기 염증 반응에 의해 유발되는 모든 질환이 포함된다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 염증, 염증성 장 질환, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 봉 소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 중이염, 폐렴, 위염, 낭포성 섬유증, 졸중, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염(테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthrosis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 등이 포함된다.
또한, 본 발명은 FEX-2 단백질과 림프구와의 부착을 저해하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 것을 특징으로 한다.
보다 구체적으로, 후보물질이 FEX-2를 발현하는 세포와 특이적으로 작용하는 경우 본 발명은 (a) FEX-2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포와 후보물질을 함께 전배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 전배양한 형질전환된 세포에 림프구를 첨가하여 추가 배양하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환된 세포에 대한 림프구의 부착 정도를 측정하여 상기 후보물질이 림프구의 부착을 저해하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
또한, 후보물질이 림프구와 특이적으로 작용하는 경우 (a) 림프구를 후보물질과 함께 전배양하는 단계;
(b) 상기 (a) 단계에서 전배양한 림프구를 FEX-2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포에 첨가하여 추가 배양하는 단계; 및
(c) 상기 형질전환된 세포에 대한 림프구의 부착 정도를 측정하여 상기 후보물질이 림프구의 부착을 저해하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.
상기에서 후보물질은 FEX-2 단백질과 림프구의 부착활성에 영향을 주는 것으로서, 예를 들면, 펩타이드, 폴리펩타이드, 펩타이드 모조물, 화합물 및 생물제제 등이 포함될 수 있다.
FEX-2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되는 세포는 특별히 한정되지는 않으나, 세포부착분자가 존재하지 않는 세포인 것이 바람직하다. 본 발명에서 예시된 것으로는 마우스 섬유아세포인 L 세포가 있다. 상기 마우스의 L 세포 이외에도 중국 햄스터 난소 세포 CHO, 마우스 육종 세포 S180 및 드로소필라(Drosophila) S2 세포를 사용할 수 있다.
상기에서 FEX-2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터는 공지된 FEX-2 유전자 서열로부터 공지의 방법으로 cDNA를 제조하고 상기 cDNA를 적합한 벡터에 클로닝함으로써 용이하게 제조할 수 있다. 본 발명에서 예시된 발현 벡터로는 pcDNA-Fex2가 있다.
상기에서 림프구는 형광색소로 표지된 것이 바람직하다. 상기 형광색소로는 세포막으로의 확산을 통해 염색되며 형광현미경으로 확인이 가능한 모든 종류의 형광색소를 사용할 수 있다.
상기 형질전환된 세포에 대한 림프구의 부착 정도는 형광현미경과 광학현미경으로 형질전환 세포에 부착된 림프구의 수를 계수하여 측정하거나 또는 형질전환 세포와 림프구를 함께 배양한 후 상기 세포를 세포 용해완충액으로 용해시켜 수득한 용해액(lysate)내의 형광의 양을 정량함으로써 측정할 수 있다.
상기에서 현미경을 이용하여 부착된 림프구의 수를 계수하는 경우에는 형질전환된 세포와 림프구를 함께 배양한 후 부착되지 않은 림프구를 세척하여 제거하고 무작위로 정한 10군데의 현미경으로 관찰하여 부착된 림프구의 수를 계수한 다음 평균을 구하는 방법을 사용할 수 있다.
상기 세포 용해액 내의 형광의 양을 측정하는 경우에는 형질전환 세포와 림프구를 함께 배양한 후 부착되지 않은 림프구를 세척하여 제거하고 세포 용해완충액을 가하여 수득한 세포 용해액의 형광의 양을 형광 마이크로플레이트 리더(fluorescent microplate reader)로 측정하는 방법을 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예들은 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
인간 FEX-2 cDNA의 클로닝
<1-1> 발현 벡터의 제조
fas-1 도메인을 포함하는 신규한 세포부착분자를 동정하기 위하여 fas-1 도메인을 포함하는 서열을 진뱅크(Genbank)와 셀레라 게노믹스(Celera genomics)의 뉴클레오타이드 데이터베이스에서 검색하였다. 그 결과, 특징이 규명되지 않은 인간의 부분적인 cDNA 클론(FLJ00112, DZKZp434E0321, CD44-like precursor FELL)이 검색되었다. 상기의 전체 길이 cDNA 서열은 RT-PCR과 5' RACE PCR에 의해 인간 비장 세포로부터 제조하였다.
먼저, 상기에서 fas-1 도메인을 포함하고 있는 것으로 검색된 3 종류의 인간 비장의 부분적인 cDNA 클론를 기초로 하여 2쌍의 프라이머(서열번호 67 내지 서열번호 70)를 디자인하였다(표 1). 인간의 비장으로부터 추출한 RNA 2μg을 주형으로 하고 상기에서 디자인한 각각의 프라이머 쌍을 사용하여 역전사효소 중합효소연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행함으로써 fas-1 도메인을 포함하는 단백질의 부분적인 cDNA를 2 부분으로 나누어서 수득 하였다. 상기에서 PCR 반응은 PCR 시스템(Expand high fidelity PCR system, Roche)을 사용하여 95℃에서 2분간 반응시킨 후 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 30회 반복하여 수행하였다. 그 결과, 3.6kb와 2.0kb의 증폭 산물을 각각 수득하였다. 상기 증폭 산물 중 3.6kb cDNA를 제한효소 ClaI 및 SacI(TaKaRa) 로 절단한 다음 pBluescript-KS(+)(Stratagene) 벡터의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터'pBS-Fex23'를 제조하였다. 또한, 상기 증폭 산물 중 2.0kb cDNA를 제한효소 SacI 및 HindⅢ(TaKaRa)로 절단한 다음 pET-29b벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 자리에 T4 리가제(ligase, Invitrogen)를 사용하여 삽입함으로써 재조합 벡터를'pET-Fex45'를 제조하였다. 그 다음 상기 두개의 cDNA 염기서열을 합치기 위해 pET-FEX45를 EcoRⅠ으로 잘라서 수득한 단편을 크레나우(klenow) 효소로 처리하여 블런트(blunt) 단편으로 제조한 다음 이를 다시 SacⅠ으로 잘라서 상기 재조합 벡터 PET-Fex23의 동일한 제한효소자리에 클로닝하여 재조합 벡터 'pET-Fex2345'를 제조하였다.
fas-1 도메인을 포함하는 cDNA 의 5' 말단은 하기와 같은 방법으로 제조하였다. 인간의 비장으로부터 수득한 RNA를 표 1에 나타낸 프라이머(서열번호 71)로 증폭하여 cDNA를 제조하고 상기 cDNA를 주형으로 하여 표 1에 나타낸 프라이머(서열번호 72 및 서열번호 73)와 5' RACE system(5' RACE system for Rapid Amplification of cDNA Ends version 2.0, Invitrogen)에서 제공하는 어댑터 프라이머를 사용하여 제조자가 지시하는 방법에 따라 5' RACE PCR을 수행하여 증폭 산 물을 수득하였다. 그 다음 상기 증폭 산물을 염기서열 분석기(Applied Biosystems AB13700)에서 분석하여 FEX-2의 5' 말단의 염기서열을 밝혀낸 후 상기 5'말단 염기서열을 기초로 하여 프라이머를 제조하였다. 인간의 비장으로부터 추출한 RNA 2μg을 주형으로 하고 상기의 5' 말단 염기서열을 기초로 디자인한 프라이머 쌍(서열번호 74 및 서열번호 75)을 사용하여 역전사효소 중합효소연쇄반응(reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR)을 수행함으로써 2.5kb의 5' 말단 cDNA를 수득하였다. 상기 증폭산물을 제한효소 EcoRI 및 ClaⅠ(TaKaRa)으로 절단하여 pBluescript-KS(+)벡터(Stratagene)의 동일한 제한효소 위치에 삽입함으로써 재조합 벡터'pBS-Fex1'를 제조하였다. 완전한 염기서열을 발현벡터에 클로닝하기위해 우선 상기에서 제조한 pET-Fex2345를 KpnⅠ과 HindⅢ로 잘라서 pcDNA3.1(-)/Myc-His 벡터(Invitrogen)의 동일한 제한효소 위치에 삽입하여 'pcDNA-Fex45'를 제조하였다. 또한, 다시 pET-Fex2345를 BamHⅠ과 KpnⅠ으로 잘라서 pcDNA-Fex45의 동일한 제한효소 위치에 삽입하여 'pcDNA-Fex2345'를 제조한 후 마지막으로 상기 pBS-Fex1을 EcoRⅠ과 ClaⅠ으로 잘라서 pcDNA-Fex2345의 동일한 제한효소 위치에 삽입하여 완전한 염기서열을 클로닝하였다.
상기에서 제조된 플라스미드를 염기서열 분석기(Applied Biosystems AB13700)에서 분석한 후 염기서열은 진뱅크(GenebankTM accession number AY311388)에 등록하였고 상기에서 제조된 FEX-2의 완전한 염기서열을 포함하는 발현 벡터를 'pcDNA-Fex2'라 명명하였다.
상기 염기서열 분석 결과로부터 추정된 아미노산 서열은 스캐빈저 수용체 FEX-2(Scavenger receptor FEX-2)(Adachi H. et al., J. Biol. Chem. 277:34264-34270, 2002)와 히알루로난 수용체 스타빌린-2(encocytic hyaluronan receptor Stabilin-2)(Politz O. et al., Biochem J. 362:155-164, 2002)와 거의 동일한 것으로 나타났으며 그들의 도메인 구조는 7개의 fas-1 도메인, 23개의 EGF-유사 도메인, 1개의 X-링크 도메인 및 1개의 막횡단 도메인을 가지고 있었다(도 1).
Fex-2 클로닝에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
Fex23 센스 5'-tgc ccc atc gat gtg atg aaa c-3' 67
Fex23 안티센스 5'-caa aca aga gct ccc gct gca caa t-3' 68
Fex45 센스 5'-gca gcg gga gct ctt gtt tga cct g-3' 69
Fex45 안티센스 5'-ccc gtc caa gct tgc aca gtg tcc t-3' 70
RACE-GSP-1 안티센스 5'-tcc cag ctt act cag tgg cca ggc-3' 71
RACE-GSP-2 안티센스 5'-cag gcc cat cat att tgc aca ctg tag ac-3' 72
RACE-GSP-3 안티센스 5'-agt taa ttt ggc agg ggt cca cag gc-3' 73
Fex1 센스 5'-aag gca ggt ctc acc tat ctc ctg g-3' 74
Fex1 안티센스 5'-tca caa atg cat gtc ccg ttg c-3' 75
<1-2> L 세포의 형질전환
상기 실시예 <1-1>의 발현 벡터 pcDNA-Fex2로 마우스 섬유아세포인 L 세포(ATCC CCL-1, 동경대학의 생물물리학과 다케치 박사로부터 제공받음)를 형질전환하였다. 상기 L 세포를 10% 열불활성화 FBS, 페니실린G 및 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 배양하였다. 상기 마우스 L 세포는 대표적인 세포부착 물질인 캐드해린이 발현되지 않는 세포주로써 세포 부착 활성을 연구하는데 보편적으로 사용되는 세포이다(Nose, A. Cell 54:993-1001, 1988).
상기 L 세포를 재조합 벡터 pcDNA-Fex2로 형질전환하기 위하여 리포펙타민(Lipofectamine, Invitrogen)을 사용하였으며 제조자가 지시하는 방법에 따라 형질전환하였다. 형질전환한 후 48시간에 G418(400 μg/ml)을 처리하여 10 내지 12일 동안 배양하면서 저항성을 나타내는 각각의 콜로니를 분리하였다. 상기와 같은 방법으로 형질전환된 세포를 L/FEX-2로 명명하였다. 음성 대조군(L/Mock)으로는 FEX-2 유전자가 포함되지 않은 벡터인 pcDNA3.1(-)/Myc-His로 형질전환한 세포를 사용하였다.
<실시예 2>
FEX-2에 대한 다클론 항체와 단클론 항체의 제조
<2-1> 인간 FEX-2에 대한 다클론 항체의 제조
인간 FEX-2에 대한 다클론 항체를 제조하기 위해서 인간 FEX-2의 전체 아미노산 서열(서열번호 1)중에서 아미노산 554번부터 655번에 해당하는 염기서열을 포함하는 cDNA와 아미노산 2188번부터 2551번에 해당하는 염기서열을 포함하는 cDNA를 PCR 증폭하여 제조하였다. 상기 cDNA는 실시예 <1-1>의 pcDNA-Fex2 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머(서열번호 76 내지 서열번호 79)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 수득하였다(표 2). PCR 반응조건은 95℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30 초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 25회 반복 수행하였다. 아미노산 554번부터 655번에 해당하는 염기서열을 포함하는 증폭 산물은 제한효소 SalI 및 HindⅢ(TaKaRa)로 절단하여 pET-29b벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 위치에 각각 삽입하였으며, 아미노산 2188번부터 2551번에 해당하는 염기서열을 포함하는 증폭 산물은 제한효소 BamHI 및 XhoI(TaKaRa)로 절단하여 pET28a 벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 위치에 삽입하였다.
항원으로 사용된 재조합 단백질의 제조에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
hFex2-5 센스 5'-caa atg tgt cga cct cca ctt cca g-3' 76
hFex2-5 안티센스 5'-ccc gtc caa gct tgc aca gtg tcc t-3' 77
hFex2-2 센스 5'-ata agg atc cac cat ttt tgt tcc aa-3' 78
hFex2-2 안티센스 5'-aat aac tcg aga ctg gga atg aga ac-3' 79
상기에서 제조된 발현 벡터를 각각 'pET-FEX2-5'와 'pET-FEX2-2'라 명명하고 상기 벡터로 대장균 BL21 DE3를 형질전환하였다. 형질전환된 대장균을 50g/ml 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 LB 배지에서 배양한 다음 재조합 단백질의 발현을 유도하기 위하여, 배양액의 흡광도가 600nm에서 0.5-0.6이 되었을 때, 1mM IPTG (isopropyl--D-(-)-thiogalactopyranoside)를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 추가로 배양하였다. 이후, 발현된 단백질을 공지의 방법에 따라 정제하였다(Kim, J.-E. et al., J. Cell. Biochem., 77:169-187, 2000). 먼저, 상기 형질전환 대장균의 배양액을 원심분리하여 세포를 수득한 후, 용해 완충용액(50 mM Tris-HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1 mM PMSF, 0.5 mM DTT)에 재현탁하였다. 상기 세포 현탁액을 초음파로 분쇄한 다음 봉입체(inclusion body) 형태로 발현된 단백질은 8M 요산 변성완충액으로 용해시켰고, 변성된 단백질들을 Ni-NTA 수지(resin, Qiagen)를 이용하여 정제하였다. 상기 재조합 단백질을 200mM 이미다졸(imidazole) 용액에서 용리한 다음, 50mM 염화나트륨을 포함한 20mM 트리스-염산 완충액 내에서 고농도에서 저농도 요산으로 차례로 투석하여 정제하였다. 상기 정제된 재조합 단백질을 SDS-PAGE에 의하여 확인하였다(결과 미도시).
상기에서 제조된 두 종류의 재조합 단백질(200 μg/ml)을 각기 다른 토끼에 주사하여 항체를 제조하였다. 즉, 상기 재조합 단백질 1 ml씩을 동일한 양의 완전 프로운트 면역증강제(complete Freund's adjuvant)와 혼합하여 주사하고 그 다음에는 상기 재조합 단백질을 동일한 양의 불완전 프로운트 면역증강제(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 2주에 한번씩 8주간 토끼에 피하 주사하였으며, 항체가 생성된 후 채혈하였다. 채혈 후 실온에서 2시간 정도 방치한 다음 4℃에서 1000×g로 30분간 원심분리하여 항혈청을 분리하였다. 상기 항혈청을 단백질 A 세파로즈(Protein A Sepharose, Amersham Pharmacia) 비드를 사용하여 제조자가 지시하는 방법에 따라 정제함으로써 면역글로불린 분획을 수득하였다.
<2-2> 인간 FEX-2에 대한 단클론 항체의 제조
인간의 FEX-2에 대한 단클론 항체를 제조하기 위해서 인간 FEX-2의 전체 아미노산 서열(서열번호 1) 중 아미노산 1173번부터 1727번에 해당하는 염기서열을 포함하는 cDNA를 제조하였다. 상기 cDNA는 상기 실시예 <1-1>의 pcDNA-fex2 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머(서열번호 80 및 서열번호 81)를 사용하여 PCR을 수행함으로써 수득하였다(표 3). PCR은 95℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 25회 반복수행하였다. 상기 증폭된 산물을 제한효소 BamHI 및 XhoI(TaKaRa)로 절단하여 pET43.1a벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 자리에 삽입하였다.
항원으로 사용된 재조합 단백질의 제조에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
hFex2-4E5 센스 5'-aaa aag gat cca cag tgt ttg ctc c-3' 80
hFex2-4E5 안티센스 5'-ttt tac tcg aga ctt ttg gga gat agc-3' 81
상기에서 제조된 발현 벡터를 'pET-4E5'라 명명한 다음 단백질 발현과 분리는 <2-1>에서의 방법과 동일한 방법으로 수행하였다. 단클론 항체의 제조는 다이노나사(Dinona Inc., Seoul, Korea)에 의뢰하여 제조하였다. 즉, 상기에서 제조된 재조합 단백질 20μg을 6 마리의 쥐에 2주 간격으로 면역접종하여 양성의 하이브리도마 클론(clone 5G3)을 수득하고 이를 쥐의 복강에 주입시켜 복수로 채취함으로써 단클론 항체를 얻었다. 상기에서 수득한 하이브리도마 5G3은 부다페스트 조약하의 국제기탁기관인 한국생명공학원 유전자원센터 유전자은행(KCTC)에 2004년 5월 21일자로 기탁번호 KCTC-10639BP로 기탁하였다.
상기 단클론 항체의 아형(isotype)은 이소스트립 마우스 단클론항체 이소타이핑 키트(IsoStrip mouse monoclonal antibody isotyping kit, Roche)를 사용하여 확인하였다. 그 결과, 본 발명의 단클론 항체의 아형은 IgG1 람다 체인(lambda chain)으로 확인되었다.
<2-3> 인간 FEX-2 단클론 항체를 이용하여 인간 비장 조직 및 L/FEX-2 세포에서 FEX-2 단백질의 발현 측정
상기 실시예 <2-2>에서 제조한 인간 FEX-2에 대한 단클론 항체5G3가 인간 비장 조직에서 발현되는 FEX-2 단백질을 검출할 수 있는지의 여부를 웨스턴 블롯 분석에 의해 측정하였다. 또한, 상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포에서 인간 FEX-2 단백질이 발현되는지 여부도 웨스턴 블롯 분석으로 측정하였다. 대조군으로는 L/Mock 세포를 사용하였다.
먼저, 인간 비장조직 0.5mg에 세포용해완충액 5ml를 첨가하고 얼음 위에서 조직분쇄기(tissue homogenizer)로 분쇄한 후 얼음 위에서 1시간 동안 방치하여 세포 용해물을 수득하였다. 또한, L/FEX-2 세포와 대조군인 L/Mock 세포를 PBS로 여러 번 세척한 후 세포용해완충액을 첨가하여 용해시킨 다음 상기 세포 용해물을 4℃에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 용해성 단백질이 존재하는 상층액을 수득하였다. 이후, 단백질의 농도를 정량분석하기 위하여, BSA을 정량 기준단백질로 이용하여 브래드포드 어세이(Bradford assay; BioRad, Hercules, CA)를 수행하였 다. 상기에서 제조한 비장 조직, L/FEX-2 세포 및 L/Mock에서 추출한 단백질 시료 30μg을 6% SDS를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. 겔 상의 단백질을 전기이동법을 이용하여 니트로셀룰로스 막에 이동시켰다. 막으로 이동된 단백질과 5% 탈지분유용액을 1시간 동안 반응시켜 비특이적 단백질 결합을 차단하였다. 이후, 항 FEX-2 단클론 항체(5G3)를 TBST(50mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20) 용액에 희석해서 냉장 상태에서 16시간 이상 니트로셀룰로스 막과 결합반응시켰다. 반응이 완료된 후, 막을 TBST 용액으로 3회 세척하였다. 이후, 다시 HRP-결합 2차 항체(HRP-결합-항-마우스 IgG; Santa Cruz사, CA주, 미국)를 첨가하여 상온에서 1시간 결합 반응시켰다. 막을 다시 3회 세척한 후, 화학발광용액인 ECL 1㎖을 첨가하여 항원-항체 반응이 일어난 부위를 형광으로 가시화하고, X-ray 필름으로 감광하였다.
실험 결과, 인간 비장 세포의 경우 약 270kDa 및 약 200kDa 크기의 밴드가 검출되었으며, L/FEX-2에서도 동일한 크기의 밴드가 검출되었다(도 2). 상기 실험 결과로부터 인간 FEX-2에 대한 단클론 항체가 실제로 비장조직 및 L/FEX-2 세포의 FEX-2와 특이적으로 반응함을 확인할 수 있었다.
<실시예 3>
L/FEX-2 세포표면에서 FEX-2 발현 여부 확인
<3-1> FACS 분석
상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포의 표면에서 FEX-2가 발현되는지 확인하기 위하여 실시예 <2-3>에서 제조한 FEX-2에 특이적인 인간 단클론 항체(5G3)를 이용하여 FACS 분석을 수행하였다.
L/FEX-2 세포가 완전히 배양된(confluent) 플레이트에 0.25% 트립신 및 0.05% EDTA를 함유하는 PBS 완충액을 처리하여 플레이트 표면으로부터 세포를 떼어내었다. 세포를 PBS 버퍼로 2회 세척한 후 다시 PBS 버퍼에 재현탁하였다. 세포 현탁액에 항-FEX-2 단클론 항체(5G3)를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 배양하였다. 10 ㎍/㎖의 FITC와 결합된 이차 토끼-항마우스 IgG 항체(Santa Cruz Biotechnology, Inc., CA)를 첨가하여 4℃에서 1시간 동안 세포를 더욱 배양시킨 후, 5 와트(watt) 레이저가 장착된 유세포 분석기(flow cytometer FACS Calibur system, Becton Dickinson, San Jose, CA)를 이용하여 488nm에서 분석하였다. 대조군으로는 상기 항-FEX-2 단클론 항체 대신 마우스 면역글로불린을 사용하였다.
실험 결과, L/FEX-2 세포의 표면에 FEX-2가 발현되는 것을 확인할 수 있었다. 반면, L/Mock 세포 표면에는 FEX-2가 발현되지 않음을 확인할 수 있었다(도 3).
<3-2> 표면 바이오틴화 분석(surface biotinylaion assay)
L/FEX-2 세포 표면에 FEX-2가 발현되는지 여부를 더욱 규명하기 위해 표면 바이오틴화 분석을 수행하였다. 상기 실시예 <1-2>의 L/FEX-2 세포를 차가운 인산 완충액(pH 8.0)으로 3회 세척하였다. 그 다음 상기 세포를 인산완충액으로 2.5× 107세포/ml의 농도가 되도록 현탁한 후 설포-NHS-LS-바이오틴(Pierce) 1mg을 첨가하고 실온에서 30분간 반응시켰다. 대조군에는 바이오틴을 첨가하지 않았다. 상기 반응물에 면역침전완충액(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 1% Triton X-100, 1mM CaCl2, 1mM MgCl2와 단백질 분해 효소 저해제 혼합물(Roche)이 포함되어 있음, pH 7.4)을 가하여 용해시킨 다음 상기 세포 용해물을 4℃에서 12,000rpm으로 10분간 원심분리하여 용해성 단백질이 존재하는 상층액을 수득하였다. 비드와의 비특이적인 반응을 감소시키기 위해 상기 세포 용해물을 G 단백질 비드(protein G beads)에 넣고 4℃에서 2시간 동안 반응시킨 후 비드를 제거하였다. 여기에 실시예 <2-1>의 FEX-2 다클론 항체가 결합된 G 단백질 세파로스 매트릭스와 4℃에서 밤새 반응시켜 면역침전하였다. 상기 비드를 3회 세척한 후 20㎕ 시료 완충액을 첨가하여 끓인 다음 6% SDS를 포함하는 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기영동하였다. 겔 상의 단백질을 전기이동법을 이용하여 니트로셀룰로스 막에 이동시켰다. 막으로 이동된 단백질과 5% 탈지분유용액을 1시간 동안 반응시켜 비특이적 단백질 결합을 차단하였다. 이후, 항 FEX-2 항체를 TBST 용액(50mM Tris-HCl, pH 7.6, 150 mM NaCl, 0.1% Tween 20)에 희석하여 냉장 상태에서 16시간 이상 니트로셀룰로스 막과 결합 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 막을 TBST 용액으로 3회 세척하였다. 이후, HRP-결합-항-토끼 IgG 항체(Santa Cruz.사, CA주, 미국)를 첨가하여 상온에서 1시간 결합 반응시켰다. 막을 다시 3회 세척한 후, 화학발광용액인 ECL 1㎖를 첨가하여 항원-항체 반응이 일어난 부위를 형광으로 가시화하고, X-레이 필름으로 감광시켰다. 또한, 상기 니트로셀룰로스막을 항 FEX-2 항체와 반응시키지 않고 HRP-결합-스트렙타비딘과 상온에서 1시간 결합반응을 시킨 후, 화학발광용액인 ECL 1㎖를 첨가하여 항원-항체 반응이 일어난 부위를 형광으로 가시화하고, X-레이 필름으로 감광시켰다.
실험 결과, 바이오틴을 처리하지 않은 대조군에서는 FEX-2 항체에 의해 면역 침전된 FEX-2 단백질이 FEX-2 항체에 의해서 검출되었지만 스트렙타비딘에 의해서는 검출되지 않았다. 반면, 바이오틴을 처리한 군에서는 항 FEX-2 항체와 스트렙타비딘에 의해 FEX-2 단백질이 모두 검출되었다(도 4).
상기 실험결과로부터 세포 표면에 존재하는 FEX-2 단백질이 바이오틴을 처리함으로써 바이오틴화된 다음 이것이 FEX-2 항체가 결합된 비드에 의해 면역침전된 후 항 FEX-2 항체 및 스트렙타비딘에 의해 검출될 수 있음을 알 수 있었으며, 바이오틴을 처리하지 않은 경우에는 FEX-2 단백질의 바이오틴화가 유발되지 않아 스트렙타비딘에 의해서는 검출되지 않음을 알 수 있었다. 따라서 FEX-2 단백질이 L/FEX-2의 세포 표면에 존재함을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
면역조직화학염색법에 의한 FEX-2가 발현되는 조직의 동정
FEX-2의 발현 양상을 조사하기 위하여 인간의 간장, 비장, 췌장, 심장, 고환, 폐, 림프절, 난소, 피부 및 부신 등의 20여종의 조직(경북대학교 병리학교실에 서 수득함)에서 실시예 <2-1>에서 제조한 인간 FEX-2 다클론 항체를 사용하여 면역조직화학염색을 실시하였다. 우선 각 조직을 3.7% 파라포름알데하이드에 넣고 실온에서 밤새도록 굳힌 후 조직을 5㎛ 간격으로 잘랐다. 그 다음 자이렌과 알코올에 각각 5분정도 담근 후 내재적인 퍼록시다아제의 활성을 억제하기위해 0.5% 과산화수소를 10분간 처리하였다. 비특이적인 반응을 차단하기 위하여 각 조직 단편을 50 mM NH4Cl에 30분간 둔 후 차단 용액(1×PBS, 1% BSA, 0.05% 사포닌 및 0.2% 젤라틴)을 가한 후 4℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 상기 인간 FEX-2 다클론 항체와 4℃에서 밤새도록 결합반응시켰다. 반응이 완료된 후 조직을 세척하고 다시 HRP-결합 2차 항체를 첨가하여 반응시켰다. 조직을 다시 3회 세척한 후, 화학반응시약을 첨가하여 항원-항체 반응이 일어난 부분을 발색으로 가시화하였다. 대조군으로는 항원과 전배양시킨 항체를 사용하였다.
실험 결과, FEX-2 단백질은 인간 비장의 정맥굴(venous sinus)에서 발현되는 것을 관찰할 수 있었다(도 5). 또한, FEX-2 단백질은 림프절의 상악동(maxillary sinus)과 간장의 동모양 혈관(sinusoid)에서도 발현되는 것으로 나타났다(결과 미도시). 이로부터 FEX-2는 동모양(sinusoidal) 내피세포에서 발현되어 혈액 내의 세포와 상호작용을 할 것으로 추정할 수 있었다.
<실시예 5>
FEX-2와 림프구의 부착 활성 조사
FEX-2와 림프구의 부착 활성을 조사하기 위하여, 혈액으로부터 피콜(Ficoll) (Pharmacia Biotech) 그래디언트 원심분리법을 사용하여 말초혈액 림프구(peripheral blood lymphocytes)를 분리하였다(Johnson-Leger C.A. et al., Blood, 100, 2479-2486, 2002). 상기 실시예 <1-2>에서 제조한 L/FEX-2 세포와 대조군인 L/Mock 세포를 DMEM 배지가 포함된 12-웰 플레이트에서 완전히(confluent) 배양한 후 여기에 1×105개의 DiI 형광색소(Molecular Probe)로 표지시킨 림프구를 첨가한 다음 37℃에서 30분간 배양하였다. 그 후 동일한 배지로 3회 세척하고 HMMF(high magnification fields, ×400)하에서 임의로 선택한 10군데를 광학현미경으로 관찰하여 L/FEX-2 세포에 부착된 림프구의 수를 계수하였다.
실험 결과, FEX-2를 발현하는 L/FEX-2 세포에는 대조군인 L/Mock 세포에 비해 많은 수의 림프구가 부착됨을 확인하였다(도 6a 및 도 6b).
<실시예 6>
FEX-2 단클론 항체에 의한 FEX-2에 대한 림프구 부착 저해
상기 실시예 5에서 L/FEX-2세포에 림프구가 부착되는 것이 FEX-2에 의한 것인지를 확인하기 위하여, FEX-2에 특이적인 항체가 상기 L/FEX-2 세포에 림프구가 부착되는 것을 억제하는지 여부를 조사하였다.
먼저, 상기 실시예 1의 L/FEX-2세포를 35 mm 플레이트에 배양한 후 상기 실시예 <2-2>의 FEX-2 단클론 항체(5G3)를 첨가하여 37℃에서 30분 동안 전배양하였다. 이후, 전배양된 세포에 DiI 형광색소(Molecular Probe)로 표지시킨 림프구를 첨가하여 30분 동안 37℃에서 배양하고 L/FEX-2에 림프구가 부착되는지 여부를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 조사하였다. 대조군(control)으로 상기 FEX-2 단클론 항체를 대신하여 면역글로불린G를 사용하였다.
실험 결과, L/FEX-2 세포 표면에 림프구가 부착되는 활성은 FEX-2 단클론 항체에 특이적으로 저해됨을 확인할 수 있었다(도 7).
<실시예 7>
인테그린 수용체의 동정
<7-1> 이가 양이온에 의한 림프구와 FEX-2의 부착 활성 변화 조사
림프구의 세포부착을 매개하는 인테그린 수용체는 이가 양이온을 필요로 한다. 상기와 같은 특징에 기초하여 림프구가 FEX-2에 부착하는 활성이 Mn2+, Mg2+ 및 Ca2+에 의해 영향 받는지 여부를 조사하였다. 이를 위해 칼슘과 마그네슘이 없는 HBSS(Hank's Balanced Salt Solution)에 CaCl2, MgCl2 및 MnCl2을 각각 2 mM 씩 첨가하였다. 상기 이가 양이온이 함유된 용액을 상기 실시예 5의 L/FEX-2와 림프구의 배양시 첨가하여 배양하고 실시예 5와 동일한 방법으로 L/FEX-2 세포에 부착된 림프구의 수를 계수하였다.
실험 결과, Mn2+를 첨가한 경우 L/FEX-2에 부착하는 림프구의 활성이 가장 크게 촉진됨을 확인할 수 있었고, 그 다음으로는 Mg2+에 의해 촉진됨을 확인할 수 있었다. Ca2+에 의해서도 림프구 부착 활성이 촉진되었으나 대조군과 유의적인 차이를 나타내지 않았다(도 8).
<7-2> 림프구와 FEX-2 부착에 관여하는 인테그린 수용체의 동정
림프구와 FEX-2의 부착에 관여하는 인테그린 수용체를 동정하기 위하여 인테그린의 기능을 특이적으로 저해하는 여러 가지 항체를 이용하여 세포부착 저해 분석을 수행하였다.
여러 종류의 인테그린-특이적 단클론 항체(Chemicon, International Inc, Temecula, CA) 10μg/ml을 1 ㎖의 배양 용액에서 3×105 세포/ml 농도의 림프구와 37℃에서 30분간 각각 전배양시켰다. 본 실험에 사용된 항체는 다음과 같다: P5D2 (β1 에 대한 항체), 25.3(αL에 대한 항체), Bear1(αM에 대한 항체) 및 3.9(αX에 대한 항체). 이때, 대조군으로는 상기 인테그린-특이적 단클론 항체 대시 정상 쥐의 면역글로불린과 함께 전배양한 것을 사용하였다. 이후, 배양된 L/FEX-2 세포에 상기에서 각각의 항체와 전배양한 림프구를 첨가한 후 37℃에서 30분간 추가로 배양하였다. 부착된 세포는 상기 실시예 5와 동일한 방법에 따라 정량하였다.
실험 결과, FEX-2에 대한 림프구의 부착은 αL 인테그린 및 αM 인테그린에 대한 항체에 의해 특이적으로 저해된 반면, αX, β1 인테그린에 대한 항체에 의해서는 저해되지 않았다(도 9).
따라서, 림프구들은 αLβ2 인테그린과 αMβ2 인테그린을 통하여 FEX-2 단백질을 가진 세포에 부착한다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 8>
FEX-2 단백질의 결실 돌연변이 재조합체에 의한 FEX-2에 대한 림프구 부착 저해
<8-1> FEX-2 네 개의 소단위체에 의한 FEX-2에 대한 림프구 부착 저해
FEX-2의 세포외 부분을 네 개의 소단위체인 Nus-U1, Nus-U2, Nus-U3 및 Nus-U4로 구분하였다(도 10a). 상기에서, Nus-U1, Nus-U2 및 Nus-U3는 각각 매우 유사한 구조를 가지고 있다. 구체적으로 상기 Nus-U1, Nus-U2 및 Nus-U3는 한 개의 EGF-유사 반복 도메인과 두 개의 fas-1 도메인을 갖는다. Nus-U4는 EGF-유사 반복 도메인, fas-1 도메인 및 X-링크 도메인을 각각 한 개씩 갖는다.
재조합 단백질 Nus-U1, Nus-U2, Nus-U3 및 Nus-U4를 제조하기 위하여, FEX-2 단백질(서열번호 1)의 66-655, 691-1268, 1303-1883, 및 1913-2449 아미노산을 코딩하는 각각의 cDNA 절편들을 상기 실시예 <1-1>의 pcDNA-fex2 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머(서열번호 82 내지 서열번호 89)로 PCR 증폭함으로써 수득하였 다(표 4). PCR은 95℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 25회 반복 수행하였다. 상기 증폭된 산물은 각각 제한효소 BamHI(TaKaRa) 및 XhoI(TaKaRa)로 절단하고, 절단된 산물을 pET-43.1a 벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 자리에 삽입하였다. 상기에서 제조된 발현 벡터를 'pET-U1', 'pET-U2', 'pET-U3' 및 'pET-U4'라 명명하였다. 상기 발현 벡터를 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 대장균에 형질전환한 후 단백질의 발현을 유도하고 분리 및 정제함으로써 재조합 단백질 Nus-U1, Nus-U2, Nus-U3 및 Nus-U4를 제조하였다.
Nus-U1, Nus-U2, Nus-U3 및 Nus-U4의 cDNA를 제조하기 위한 프라이머
프라이머 서열 서열번호
Nus-U1 센스 5'-aaa aag gat ccg tag ggg ttc gag att g-3' 82
Nus-U1 안티센스 5'-aat aac tcg aga ctg gga gga atg aga ac-3' 83
Nus-U2 센스 5'-aaa aag gat cca act ctg agc cca cag-3' 84
Nus-U2 안티센스 5'-aaa tac tcg agt gac tga att tcc aga act ttt ccc-3' 85
Nus-U3 센스 5'-aaa aag gat ccg aga aga gga gat gc-3' 86
Nus-U3 안티센스 5'-ttt tac tcg aga cta tca atc agc aga c-3' 87
Nus-U4 센스 5'-aaa atg gat cca ggt gga gta aac caa ag-3' 88
Nus-U4 안티센스 5'-aaa tag aat tct cag ggt gct ttt aaa ggc-3' 89
상기 재조합 단백질 Nus-U1, Nus-U2, Nus-U3 및 Nus-U4가 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 억제하는지를 조사하기 위하여, DiI 형광 색소로 표지시킨 림프구에 상기 재조합 단백질 Nus-U1, Nus-U2, Nus-U3 및 Nus-U4를 각각 10μM씩 첨가하여 37℃에서 30분 동안 전배양하였다. 이후, FEX-2를 발현하는 L/FEX-2세포에 전배양 된 림프구를 첨가하여 30분 동안 37℃에서 배양하고 L/FEX-2에 림프구가 부착되는지 여부를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 조사하였다. 대조군(control)으로 Nus 단백질을 사용하였다.
실험 결과, 재조합 단백질 Nus-U1, Nus-U2, Nus-U3 및 Nus-U4와 림프구를 전배양한 경우 FEX-2에 대한 림프구의 부착이 크게 저해됨을 확인할 수 있었다(도 10b).
<8-2> 재조합 단백질 Nus-EGF3, Nus-Fas5 및 Nus-Fas6의 FEX-2에 대한 림프구 부착 저해
상기 실시예 <8-1>의 소단위체 중에서 Nus-U3를 보다 세분화하여 Nus-EGF3, Nus-Fas5 및 Nus-Fas6를 각각 제조하고, 상기 재조합 단백질이 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 저해하는지를 조사하였다. 상기 Nus-EGF3는 FEX-2 단백질에서 세 번째 EGF-유사 반복 도메인을 포함하는 폴리펩타이드이며, Nus-Fas5 및 Nus-Fas6는 각각 다섯번째와 여섯번째 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드이다(도 11a).
상기 FEX-2 단백질의 결실 돌연변이체인 Nus-EGF3, Nus-Fas5 및 Nus-Fas6를 각각 제조하기 위하여, FEX-2 단백질의 1301-1596, 1631-1727 및 1778-1883 아미노산을 코딩하는 cDNA의 각 절편을 상기 실시예 <1-1>의 pcDNA-FEX2를 주형으로 하고 하기의 프라이머(서열번호 90 내지 서열번호 95)를 사용하여 PCR 증폭함으로써 수득하였다(표 5). PCR은 95℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 25회 반복수행하였다. 상기 증폭된 산물은 각각 제한 효소 BamHI(TaKaRa) 및 XhoI(TaKaRa)로 절단하고 절단된 산물을 pET-43.1a벡터(Novagen)의 동일한 자리에 삽입하였다. 상기에서 제조된 각각의 발현 벡터를 'pET-EGF3', 'pET-Fas5' 및 'pET-Fas6'이라 명명한 다음 이를 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 대장균에 형질전환하고 단백질의 발현을 유도하여 재조합 단백질 Nus-EGF3, Nus-Fas5 및 Nus-Fas6를 각각 제조하였다.
Nus-EGF3, Nus-Fas5 및 Nus-Fas6의 cDNA를 제조하기 위한 프라이머
프라이머 서열 서열번호
Nus-EGF3 센스 5'-aaa aag gat ccg aga aga gga gat gc-3' 90
Nus-EGF3 안티센스 5'-aaa aac tcg agt cag gat tta cct gcc gc-3' 91
Nus-Fas5 센스 5'-ttt tag gat cca ctg ttt ttg cac c-3' 92
Nus-Fas5 안티센스 5'-ttt tac tcg aga ctt ttg gga gat agc-3' 93
Nus-Fas6 센스 5'-ttt tag gat cca ctc tct tct ggc c-3' 94
Nus-Fas6 안티센스 5'-ttt tac tcg aga cta tca atc agc aga c-3' 95
상기 재조합 단백질 Nus-EGF3, Nus-Fas5 및 Nus-Fas6가 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 억제하는지를 조사하기 위하여, DiI 형광 색소로 표지시킨 림프구에 상기 재조합 단백질 Nus-U3, Nus-EGF3, Nus-Fas5 및 Nus-Fas6를 각각 10μM 첨가하여 37℃에서 30분 동안 전배양하였다. 이후, FEX-2를 발현하는 L/FEX-2세포에 전배양된 림프구를 첨가하여 30분 동안 37℃에서 배양하고 L/FEX-2에 림프구가 부착되는지 여부를 상기 실시예 5와 동일한 방법으로 조사하였다. 대조군(control)으로 Nus 단백질을 사용하였다.
실험 결과, fas-1 도메인을 포함하는 Nus-Fas5 및 Nus-Fas6 폴리펩타이드를 첨가한 경우에는 림프구의 부착이 크게 저해됨을 확인할 수 있었다. 그러나, EGF-유사 도메인을 포함한 재조합 단백질을 첨가한 경우에는 림프구 부착에 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다(도 11b).
<실시예 9>
fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 첨가 농도에 따른 림프구 부착 저해
상기 실시예 8과 동일한 방법으로 림프구 부착 저해 정도를 조사하되, 상기 실시예 8에서 제조한 Nus-U3, Nus-EGF3 및 Nus-Fas5의 첨가 농도를 0.1, 1, 10 μM로 달리하여 실험하였다.
실험 결과, fas-1 도메인을 포함하는 재조합 단백질의 첨가 농도가 증가할 수록 림프구 부착이 억제됨을 확인할 수 있었다. 반면, EGF-유사 도메인을 포함하는 재조합 단백질은 첨가농도가 증가할수록 림프구 부착활성이 약간 증가하는 것으로 나타났으나 크게 영향을 주지 않음을 확인할 수 있었다(도 12).
<실시예 10>
여러 가지 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 FEX-2에 대한 림프구 부착 저해 활성
<10-1> FEX-2 단백질 내 fas-1 도메인의 FEX-2에 대한 림프구 부착 저해
FEX-2 단백질 내에 포함된 모든 fas-1 도메인이 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 저해하는 활성이 있는지를 조사하였다.
상기 FEX-2 단백질 내에 포함된 모든 fas-1 도메인의 재조합 단백질들을 제조하기 위하여, pcDNA-Fex2 DNA를 주형으로 하고 하기의 프라이머를 사용하여(서열번호 96 내지 서열번호 105) PCR을 수행함으로써 FEX-2 아미노산 406번-508번, 554번-655번, 1030번-1130번, 1173번-1268번 및 2356번-2449번을 각각 코딩하는 cDNA의 절편을 수득하였다(표 6). PCR 반응 조건으로는 95℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 25회 반복수행하였다. 7번째 Fas-1 도메인을 제외한 상기 증폭된 FEX-2 단백질의 Fas-1 도메인을 각각 제한효소 BamHI(TaKaRa) 및 XhoI(TaKaRa)로 절단하고 pET-43.1a벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 자리에 삽입하였다. 상기 증폭된 FEX-2 단백질의 7번째 Fas-1 도메인은 제한효소 BamHI(TaKaRa) 및 EcoRI(TaKaRa)로 절단하고 pET-43.1a벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 자리에 삽입하였다. 상기에서 제조된 발현 벡터를 각각 'pET-Fas1', 'pET-Fas2', 'pET-Fas3', 'pET-Fas4' 및 'pET-Fas7' 이라 명명하고 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 대장균에 형질전환한 다음 단백질의 발현을 유도하여 재조합 단백질 Nus-Fas1, Nus-Fas2, Nus-Fas3, Nus-Fas4 및 Nus-Fas7을 각각 제조하였다.
FEX-2 단백질 내 fas-1 도메인의 cDNA 제조에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
Nus-Fas1 센스 5'-aaa aag gat cca cgg tgc tgt tac c-3' 96
Nus-Fas1 안티센스 5'-aaa aac tcg aga ctt aac ttg tcc atg gct c-3' 97
Nus-Fas2 센스 5'-ata agg atc cac cat ttt tgt tcc aa-3' 98
Nus-Fas2 안티센스 5'-aat aac tcg aga ctg gga gga atg aga ac-3' 99
Nus-Fas3 센스 5'-ttt acg gat cca ctg tcc tcg tgc ctt c-3' 100
Nus-Fas3 안티센스 5'-ttt aac tcg aga ctt tgt ggg acc agc-3' 101
Nus-Fas4 센스 5'-aaa aag gat cca cag tgt ttg ctc c-3' 102
Nus-Fas4 안티센스 5'-aaa tac tcg agt gac tga att tcc aga act ttt ccc-3' 103
Nus-Fas7 센스 5'-ttt aag gat cca ccc tct ttg tgc cac-3' 104
Nus-Fas7 안티센스 5'-aaa tag aat tct cag ggt gct ttt aaa ggc-3' 105
상기에서 제조된 Nus-Fas1, Nus-Fas2, Nus-Fas3, Nus-Fas4 및 Nus-Fas7과 상기 실시예 <8-2>에서 제조된 Nus-Fas5 및 Nus-Fas6가 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 저해하는지를 실시예 <8-2>와 동일한 방법으로 조사하였다.
실험 결과, FEX-2 내에 존재하는 모든 fas-1 도메인을 포함하는 재조합 단백질에 의해 림프구 부착이 크게 저해됨을 확인할 수 있었다(도 13).
<10-2> 결핵균 단백질의 fas-1 도메인의 FEX-2에 대한 림프구 부착 저해
결핵균의 단백질인 mpt83과 mpt70 내의 fas-1 도메인이 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 억제하는지를 조사하였다. 이를 위해 먼저, 마이코박테리움 튜버쿨로시스(M. Tuberculosis)의 RNA을 주형으로 하고 하기의 프라이머(서열번호 106 내지 서열번호 109)를 사용하여(표 7) RT-PCR을 수행함으로써 mpt70 단백질의 130번-256번 아미노산을 코딩하는 cDNA 절편과 mpt83 단백질의 123번-218번 아미노산을 코딩하는 cDNA 절편을 수득하였다. 상기에서 결핵균으로부터 RNA의 추출은 트리졸(Trizol, Invitrogen)을 사용하여 제조자의 지시대로 수행하였으며. PCR 반응은 95℃에서 2분 반응하고 94℃에서 30초, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안의 반응을 25회 반복수행하였다. 상기에서 증폭된 mpt70 단백질 및 mpt83 단백질의 fas-1 도메인을 각각 제한효소 BamHI(TaKaRa)와 XhoI로 절단하고 pET-28a벡터(Novagen)의 동일한 제한효소 자리에 삽입하였다. 상기에서 제조된 발현 벡터를 각각 'pET-mpt70' 및 'pET-mpt83'이라 명명하고 상기 실시예 <2-1>과 동일한 방법으로 대장균에 형질전환한 다음 단백질의 발현을 유도하여 재조합 단백질 Nus-mpt70 및 Nus-mpt83을 각각 제조하였다.
결핵균 단백질 내 fas-1 도메인의 cDNA 제조에 사용된 프라이머
프라이머 서열 서열번호
Nus-mpt70 센스 5'-aaa aag gat cca cgg tgt tcg cac-3' 106
Nus-mpt70 안티센스 5'-aaa atc tcg agt cac gga ggc att agc-3' 107
Nus-mpt83 센스 5'-aat tag gat cca ccg ttt tcg ccc-3' 108
Nus-mpt83 안티센스 5'-aaa atc tcg agt cac ggg ggc atc ag-3' 109
상기에서 제조된 Nus-mpt70과 Nus-mpt83이 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 저해하는지를 실시예 <8-2>와 동일한 방법으로 조사하였다. 이때, 상기 Nus-mpt70과 Nus-mpt83을 각각 0.1, 1, 10 μM의 농도로 첨가하였다.
실험 결과, 결핵균의 단백질인 mpt83과 mpt70 내의 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드의 경우에도 FEX-2에 대한 림프구의 부착을 억제하는 것으로 나타났다. 또한, 상기 폴리펩타이드의 첨가 농도가 증가할수록 림프구 부착 저해 정도가 증가됨을 확인할 수 있었다(도 14).
<적용예 1> 관절염
관절염은 자가면역 이상이 원인이지만 병이 진행되면서 관절 사이의 활액강에 생긴 만성 염증에 의해 연골이 파괴된다. 관절염에는 감염성 관절염, 퇴행성 관절염, 류마티스성 관절염, 대퇴골두 무혈성 괴사, 강직성 척추염, 선천성 기형에 의한 관절염 등 여러 종류가 있으나 원인을 불문하고 병이 진행하는 과정에서 활액강에 만성염증이 생긴다고 알려져 있다. 이때, 종류에 따라 염증반응이 일차적, 이차적으로 생겨 연골을 파괴하여 병의 진행에 중요한 역할을 하며, 이때 백혈구가 내피세포와의 상호작용을 통해 관절 내로 들어오는 것이 중요한 병리기전으로 작용한다고 보고된 바 있다(Haskard D. O. Curr. Opin. Rheumatol. 7:229-34, 1995). 관절염의 치료는 원인에 따른 치료보다는 통증을 억제하는 것과 염증 현상을 억제하여 관절이나 근육 등의 파괴속도를 최대한 늦추고 기능 소실을 최소화하는 것을 우선으로 한다. 따라서 본 발명의 약학적 조성물은 관절염의 진행 방지와 치료에 대단히 효과적이다.
<적용예 2> 당뇨성 안질환
당뇨성 안질환은 실명을 초래할 수 있는 당뇨병의 주요 합병증의 하나로 혈당조절 정도와는 상관없이 유병기간이 길어지면 발생한다. 최근 당뇨병의 치료법이 향상됨에 따라 당뇨병 환자의 수명이 연장되면서 당뇨망막병증도 병행하여 증가 하는 추세에 있다. 따라서 당뇨망막병증은 서구에서는 물론 우리나라에서도 성인 실명의 가장 큰 원인이 되고 있다. 당뇨성 망막증을 가진 환자에서 세포부착물질이 증가되어 있으며, 이러한 부착물질에 의해 백혈구증체증(leukostasis), 비관류(non-perfusion), 혈관누출(vascular leakage) 및 내피세포의 손상 등을 일으킨다고 보고된 바 있다(Miyamoto K. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96:10836-41, 1999; Joussen A. M. Am. J. Pathol. 158:147-52, 2001; Barouch F. C. Invest Ophthalmol. Vis. Sci. 41(5):1153-8, 2000). 특히, 당뇨성 망막증과 같은 당뇨성 안질환에 있어서 부착성 백혈구에 의한 염증반응이 중요한 역할을 한다고 보고 된 바 있다(Joussen A. M. FASEB J. 18:1450-1452, 2004). 따라서 본 발명의 약학적 조성물이 당뇨성 안질환의 예방 및 치료에 대단히 효과적이다.
<적용예 3> 염증
염증이란 국소적인 손상에 대한 혈관이 있는 살아있는 조직의 반응으로 감염, 외상 등 여러 요인에 의해 생길 수 있지만 원인과 반응 조직의 차이에 상관없이 거의 유사한 변화를 나타낸다. 이 변화에는 혈류의 증가, 혈관벽의 투과성 증가, 백혈구의 침윤이 있는데 이 모든 변화에 세포 부착물질이 관여한다고 보고된 바 있다(Jackson, J. R. et al., FASEB, J. 11:457-465, 1997). 염증이라는 것은 손상에 대한 수복 기전이므로 해로운 반응은 아니지만 과다하게 일어나거나, 자가면역의 경우와 같이 부적절하게 일어날 경우 염증 변화 자체로 조직의 손상과 변형을 초래할 수 있다. 이러한 과하거나 부적절한 염증 반응을 조절하는데 있어 본 발명의 염증반응 억제용 조성물이 효과적이다.
이상 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착 활성을 저해하여 염증성 질환을 예방 및 치료할 수 있는 효과가 있다. 또한, 본 발명에 따른 스크리닝 방법은 후보물질이 FEX-2 단백질에 대한 림프구의 부착활성을 저해하는지 여부를 확인함으로써 염증성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 용이하게 스크리닝할 수 있는 효과가 있다.
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel pharmaceutical composition for preventing or treating diseases or disorders associated with inflammation <130> NP04-0020 <160> 109 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2551 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(2551) <223> human FEX-2 <400> 1 Met Met Leu Gln His Leu Val Ile Phe Cys Leu Gly Leu Val Val Gln 1 5 10 15 Asn Phe Cys Ser Pro Ala Glu Thr Thr Gly Gln Ala Arg Arg Cys Asp 20 25 30 Arg Lys Ser Leu Leu Thr Ile Arg Thr Glu Cys Arg Ser Cys Ala Leu 35 40 45 Asn Leu Gly Val Lys Cys Pro Asp Gly Tyr Thr Met Ile Thr Ser Gly 50 55 60 Ser Val Gly Val Arg Asp Cys Arg Tyr Thr Phe Glu Val Arg Thr Tyr 65 70 75 80 Ser Leu Ser Leu Pro Gly Cys Arg His Ile Cys Arg Lys Asp Tyr Leu 85 90 95 Gln Pro Arg Cys Cys Pro Gly Arg Trp Gly Pro Asp Cys Ile Glu Cys 100 105 110 Pro Gly Gly Ala Gly Ser Pro Cys Asn Gly Arg Gly Ser Cys Ala Glu 115 120 125 Gly Met Glu Gly Asn Gly Thr Cys Ser Cys Gln Glu Gly Phe Gly Gly 130 135 140 Thr Ala Cys Glu Thr Cys Ala Asp Asp Asn Leu Phe Gly Pro Ser Cys 145 150 155 160 Ser Ser Val Cys Asn Cys Val His Gly Val Cys Asn Ser Gly Leu Asp 165 170 175 Gly Asp Gly Thr Cys Glu Cys Tyr Ser Ala Tyr Thr Gly Pro Lys Cys 180 185 190 Asp Lys Pro Ile Pro Glu Cys Ala Ala Leu Leu Cys Pro Glu Asn Ser 195 200 205 Arg Cys Ser Pro Ser Thr Glu Asp Glu Asn Lys Leu Glu Cys Lys Cys 210 215 220 Leu Pro Asn Tyr Arg Gly Asp Gly Lys Tyr Cys Asp Pro Ile Asn Pro 225 230 235 240 Cys Leu Arg Lys Ile Cys His Pro His Ala His Cys Thr Tyr Leu Gly 245 250 255 Pro Asn Arg His Ser Cys Thr Cys Gln Glu Gly Tyr Arg Gly Asp Gly 260 265 270 Gln Val Cys Leu Pro Val Asp Pro Cys Gln Ile Asn Phe Gly Asn Cys 275 280 285 Pro Thr Lys Ser Thr Val Cys Lys Tyr Asp Gly Pro Gly Gln Ser His 290 295 300 Cys Glu Cys Lys Glu His Tyr Gln Asn Phe Val Pro Gly Val Gly Cys 305 310 315 320 Ser Met Thr Asp Ile Cys Lys Ser Asp Asn Pro Cys His Arg Asn Ala 325 330 335 Asn Cys Thr Thr Val Ala Pro Gly Arg Thr Glu Cys Ile Cys Gln Lys 340 345 350 Gly Tyr Val Gly Asp Gly Leu Thr Cys Tyr Gly Asn Ile Met Glu Arg 355 360 365 Leu Arg Glu Leu Asn Thr Glu Pro Arg Gly Lys Trp Gln Gly Arg Leu 370 375 380 Thr Ser Phe Ile Ser Leu Leu Asp Lys Ala Tyr Ala Trp Pro Leu Ser 385 390 395 400 Lys Leu Gly Pro Phe Thr Val Leu Leu Pro Thr Asp Lys Gly Leu Lys 405 410 415 Gly Phe Asn Val Asn Glu Leu Leu Val Asp Asn Lys Ala Ala Gln Tyr 420 425 430 Phe Val Lys Leu His Ile Ile Ala Gly Gln Met Asn Ile Glu Tyr Met 435 440 445 Asn Asn Thr Asp Met Phe Tyr Thr Leu Thr Gly Lys Ser Gly Glu Ile 450 455 460 Phe Asn Ser Asp Lys Asp Asn Gln Ile Lys Leu Lys Leu His Gly Gly 465 470 475 480 Lys Lys Lys Val Lys Ile Ile Gln Gly Asp Ile Ile Ala Ser Asn Gly 485 490 495 Leu Leu His Ile Leu Asp Arg Ala Met Asp Lys Leu Glu Pro Thr Phe 500 505 510 Glu Ser Asn Asn Glu Gln Thr Ile Met Thr Met Leu Gln Pro Arg Tyr 515 520 525 Ser Lys Phe Arg Ser Leu Leu Glu Glu Thr Asn Leu Gly His Ala Leu 530 535 540 Asp Glu Asp Gly Val Gly Gly Pro Tyr Thr Ile Phe Val Pro Asn Asn 545 550 555 560 Glu Ala Leu Asn Asn Met Lys Asp Gly Thr Leu Asp Tyr Leu Leu Ser 565 570 575 Pro Glu Gly Ser Arg Lys Leu Leu Glu Leu Val Arg Tyr His Ile Val 580 585 590 Pro Phe Thr Gln Leu Glu Val Ala Thr Leu Ile Ser Thr Pro His Ile 595 600 605 Arg Ser Met Ala Asn Gln Leu Ile Gln Phe Asn Thr Thr Asp Asn Gly 610 615 620 Gln Ile Leu Ala Asn Asp Val Ala Met Glu Glu Ile Glu Ile Thr Ala 625 630 635 640 Lys Asn Gly Arg Ile Tyr Thr Leu Thr Gly Val Leu Ile Pro Pro Ser 645 650 655 Ile Val Pro Ile Leu Pro His Arg Cys Asp Glu Thr Lys Arg Glu Met 660 665 670 Lys Leu Gly Thr Cys Val Ser Cys Ser Leu Val Tyr Trp Ser Arg Cys 675 680 685 Pro Ala Asn Ser Glu Pro Thr Ala Leu Phe Thr His Arg Cys Val Tyr 690 695 700 Ser Gly Arg Phe Gly Ser Leu Lys Ser Gly Cys Ala Arg Tyr Cys Asn 705 710 715 720 Ala Thr Val Lys Ile Pro Lys Cys Cys Lys Gly Phe Tyr Gly Pro Asp 725 730 735 Cys Asn Gln Cys Pro Gly Gly Phe Ser Asn Pro Cys Ser Gly Asn Gly 740 745 750 Gln Cys Ala Asp Ser Leu Gly Gly Asn Gly Thr Cys Ile Cys Glu Glu 755 760 765 Gly Phe Gln Gly Ser Gln Cys Gln Phe Cys Ser Asp Pro Asn Lys Tyr 770 775 780 Gly Pro Arg Cys Asn Lys Lys Cys Leu Cys Val His Gly Thr Cys Asn 785 790 795 800 Asn Arg Ile Asp Ser Asp Gly Ala Cys Leu Thr Gly Thr Cys Arg Asp 805 810 815 Gly Ser Ala Gly Arg Leu Cys Asp Lys Gln Thr Ser Ala Cys Gly Pro 820 825 830 Tyr Val Gln Phe Cys His Ile His Ala Thr Cys Glu Tyr Ser Asn Gly 835 840 845 Thr Ala Ser Cys Ile Cys Lys Ala Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Thr Leu 850 855 860 Cys Ser Glu Met Asp Pro Cys Thr Gly Leu Thr Pro Gly Gly Cys Ser 865 870 875 880 Arg Asn Ala Glu Cys Ile Lys Thr Gly Thr Gly Thr His Thr Cys Val 885 890 895 Cys Gln Gln Gly Trp Thr Gly Asn Gly Arg Asp Cys Ser Glu Ile Asn 900 905 910 Asn Cys Leu Leu Pro Ser Ala Gly Gly Cys His Asp Asn Ala Ser Cys 915 920 925 Leu Tyr Val Gly Pro Gly Gln Asn Glu Cys Glu Cys Lys Lys Gly Phe 930 935 940 Arg Gly Asn Gly Ile Asp Cys Glu Pro Ile Thr Ser Cys Leu Glu Gln 945 950 955 960 Thr Gly Lys Cys His Pro Leu Ala Ser Cys Gln Ser Thr Ser Ser Gly 965 970 975 Val Trp Ser Cys Val Cys Gln Glu Gly Tyr Glu Gly Asp Gly Phe Leu 980 985 990 Cys Tyr Gly Asn Ala Ala Val Glu Leu Ser Phe Leu Ser Glu Ala Ala 995 1000 1005 Ile Phe Asn Arg Trp Ile Asn Asn Ala Ser Leu Gln Pro Thr Leu Ser 1010 1015 1020 Ala Thr Ser Asn Leu Thr Val Leu Val Pro Ser Gln Gln Ala Thr Glu 1025 1030 1035 1040 Asp Met Asp Gln Asp Glu Lys Ser Phe Trp Leu Ser Gln Ser Asn Ile 1045 1050 1055 Pro Ala Leu Ile Lys Tyr His Met Leu Leu Gly Thr Tyr Arg Val Ala 1060 1065 1070 Asp Leu Gln Thr Leu Ser Ser Ser Asp Met Leu Ala Thr Ser Leu Gln 1075 1080 1085 Gly Asn Phe Leu His Leu Ala Lys Val Asp Gly Asn Ile Thr Ile Glu 1090 1095 1100 Gly Ala Ser Ile Val Asp Gly Asp Asn Ala Ala Thr Asn Gly Val Ile 1105 1110 1115 1120 His Ile Ile Asn Lys Val Leu Val Pro Gln Arg Arg Leu Thr Gly Ser 1125 1130 1135 Leu Pro Asn Leu Leu Met Arg Leu Glu Gln Met Pro Asp Tyr Ser Ile 1140 1145 1150 Phe Arg Gly Tyr Ile Ile Gln Tyr Asn Leu Ala Asn Ala Ile Glu Ala 1155 1160 1165 Ala Asp Ala Tyr Thr Val Phe Ala Pro Asn Asn Asn Ala Ile Glu Asn 1170 1175 1180 Tyr Ile Arg Glu Lys Lys Val Leu Ser Leu Glu Glu Asp Val Leu Arg 1185 1190 1195 1200 Tyr His Val Val Leu Glu Glu Lys Leu Leu Lys Asn Asp Leu His Asn 1205 1210 1215 Gly Met His Arg Glu Thr Met Leu Gly Phe Ser Tyr Phe Leu Ser Phe 1220 1225 1230 Phe Leu His Asn Asp Gln Leu Tyr Val Asn Glu Ala Pro Ile Asn Tyr 1235 1240 1245 Thr Asn Val Ala Thr Asp Lys Gly Val Ile His Gly Leu Gly Lys Val 1250 1255 1260 Leu Glu Ile Gln Lys Asn Arg Cys Asp Asn Asn Asp Thr Thr Ile Ile 1265 1270 1275 1280 Arg Gly Arg Cys Arg Thr Cys Ser Ser Glu Leu Thr Cys Pro Phe Gly 1285 1290 1295 Thr Lys Ser Leu Gly Asn Glu Lys Arg Arg Cys Ile Tyr Thr Ser Tyr 1300 1305 1310 Phe Met Gly Arg Arg Thr Leu Phe Ile Gly Cys Gln Pro Lys Cys Val 1315 1320 1325 Arg Thr Val Ile Thr Arg Glu Cys Cys Ala Gly Phe Phe Gly Pro Gln 1330 1335 1340 Cys Gln Pro Cys Pro Gly Asn Ala Gln Asn Val Cys Phe Gly Asn Gly 1345 1350 1355 1360 Ile Cys Leu Asp Gly Val Asn Gly Thr Gly Val Cys Glu Cys Gly 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tuberculosis <220> <221> DOMAIN <222> (1)..(96) <223> fas-1 domain of mpt83 <400> 14 Thr Val Phe Ala Pro Thr Asn Ala Ala Phe Asp Lys Leu Pro Ala Ala 1 5 10 15 Thr Ile Asp Gln Leu Lys Thr Asp Ala Lys Leu Leu Ser Ser Ile Leu 20 25 30 Thr Tyr His Val Ile Ala Gly Gln Ala Ser Pro Ser Arg Ile Asp Gly 35 40 45 Thr His Gln Thr Leu Gln Gly Ala Asp Leu Thr Val Ile Gly Ala Arg 50 55 60 Asp Asp Leu Met Val Asn Asn Ala Gly Leu Val Cys Gly Gly Val His 65 70 75 80 Thr Ala Asn Ala Thr Val Tyr Met Ile Asp Thr Val Leu Met Pro Pro 85 90 95 <210> 15 <211> 2559 <212> PRT <213> mouse <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(2559) <223> mouse FEX-2 <400> 15 Met Ala Arg Ser Lys Leu Leu Leu Gly Lys Leu Leu Pro Leu Ile Leu 1 5 10 15 Ile Phe Leu Gly Leu Leu Val Gln Asn Ala Cys Ser Pro Thr Glu Ala 20 25 30 Pro Glu Leu Thr Lys Arg Cys Asp Lys Lys Ser Thr Leu Thr Ile Lys 35 40 45 Thr Glu Cys Gln Ser Cys Ser Val Asn Ile Ala Val Lys Cys Pro Asp 50 55 60 Gly Tyr Ile Lys Ile Thr Asn Gly Thr Val Gly Val Arg Asp Cys Arg 65 70 75 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Claims (15)

  1. FEX-2 단백질과 림프구의 부착 저해제를 포함하는 염증성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 FEX-2 단백질이 포유동물로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 FEX-2 단백질이 서열번호 1 또는 서열번호 15로 표시되는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  4. 제1항에 있어서, 상기 저해제가 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드 또는 항-FEX-2 항체임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 상기 저해제가 3중제, 리보자임(ribozyme), FEX-2 mRNA 표적 분자에 대해 상동성을 가지는 이중가닥 RNA 및 FEX-2 유전자의 안티센스 핵산으 로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  6. 제4항에 있어서, 상기 fas-1 도메인이 포유동물로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 상기 포유동물은 사람, 랫트 및 마우스로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  8. 제4항에 있어서, 상기 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 FEX-2, mpt70, mpt83, βig-h3, 페리오스틴 및 FEX-1로 이루어진 그룹 중에서 선택된 단백질로부터 유래된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  9. 제4항에 있어서, 상기 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 서열번호 1 내지 서열번호 66으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  10. 제9항에 있어서, 상기 fas-1 도메인을 포함하는 폴리펩타이드가 서열번호 1 내지 서열번호 14로 이루어진 그룹 중에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  11. 제4항에 있어서, 상기 항-FEX-2 항체가 다클론 또는 단클론 항체임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  12. 제11항에 있어서, 상기 단클론 항체는 하이브리도마(기탁번호 KCTC 10639BP)에 의해 생성되는 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환이 염증, 염증성 장 질환, 당뇨성 안질환, 복막염, 골수염, 봉소염, 뇌막염, 뇌염, 췌장염, 외상 유발 쇼크, 기관지 천식, 비염, 부비동염, 중이염, 폐렴, 위염, 장염, 낭포성 섬유증, 졸중, 기관지염, 세기관지염, 간염, 신장염, 관절염, 통풍, 척추염, 라이터 증후군, 결절성 다발동맥염, 과민성 혈관염, 루게닉 육아종증, 류마티스성 다발성근육통, 관절 세포 동맥염, 칼슘 결정 침착 관절병증, 가성 통풍, 비-관절 류마티즘, 점액낭염, 건초염, 상과염( 테니스 엘보), 신경병증성 관절 질환(Charcot's joint), 출혈성관절증(hemarthro sis), 헤노흐-쉔라인 자반병, 비후성 골관절병증, 다중심성 세망조직구종, 수르코일로시스(surcoilosis), 혈색소증, 겸상 적혈구증 및 기타 혈색소병증, 고지단백혈증, 저감마글로불린혈증, 부갑상선기능항진증, 말단거대증, 가족성 지중해열, 베하트 병, 전신성 홍반성 루푸스, 재귀열, 건선, 다발성 경화증, 패혈증, 패혈성 쇼크, 급성 호흡곤란 증후군, 다발성 장기부전, 만성 폐쇄성 폐질환(chronic obstructive pulmonary disease), 급성 폐손상(acute lung injury) 및 기관지 폐 형성장애(broncho-pulmonary dysplasia) 그룹 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 약학적 조성물.
  14. (a) FEX-2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포와 후보물질을 함께 전배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 전배양한 형질전환된 세포에 림프구를 첨가하여 추가 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환된 세포에 대한 림프구의 부착 정도를 측정하여 상기 후보물질이 림프구의 부착을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
  15. (a) 림프구와 후보물질을 함께 전배양하는 단계;
    (b) 상기 (a) 단계에서 전배양한 림프구를 FEX-2 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 세포에 첨가하여 추가 배양하는 단계; 및
    (c) 상기 형질전환된 세포에 대한 림프구의 부착 정도를 측정하여 상기 후보물질이 림프구의 부착을 억제하는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 염증관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물의 스크리닝 방법.
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